ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΣΠΑΝΑΚΗΣ ΝΙΚΟΣ

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΣΠΑΝΑΚΗΣ ΝΙΚΟΣ"

Παρθενορή Παππάς
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΣΠΑΝΑΚΗΣ ΝΙΚΟΣ

3 Αρχή λειτουργίας Real-time PCR * Βασίζεται στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του φθορισμού που εκπέμπεται από ειδικά φθοριοχρώματα * Η αρχική αύξηση της ποσότητας του PCR προϊόντος (C T - threshold cycle) συσχετίζεται άμεσα με την αρχική ποσότητα του νουκλεϊκού οξέος που υπάρχει στο δείγμα μας

αρχική αύξηση της ποσότητας του PCR προϊόντος (C T - threshold cycle)

4 PCR Πραγματικού χρόνου Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης μετράται ο φθορισμός που εκπέμπεται από ιχνηθέτες που υβριδίζουν με το παραγόμενο προϊόν της αντίδρασης. Ο φθορισμός που παράγεται σε κάθε κύκλο είναι ανάλογος του πληθυσμού των παραγόμενων αλληλουχιών σε κάθε θερμοδυναμικό κύκλο.

5 5

6 1. halogen tungsten lamp 2b. emission filters 3. intensifier 5. ccd detector 350,000 pixels 2a. excitation filters 4. sample plate 6

8 Τεχνολογίες Real-Time PCR 1. Ιχνηθέτες υβριδισμού-υδρόλυσης (TaqMan) 2. Ιχνηθέτες υβριδισμού (adjacent probes, Beacons, Scorpions) 3. Παράγοντες που προσδένονται σε δίκλωνο DNA (SYBR Green)

10 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Μικρό κόστος Δεν απαιτείται σχεδιασμός ιχνηθέτη ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Μη ειδική ανίχνευση Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πολύπλοκες αντιδράσεις

11 Πότε επιλέγουμε την SYBR Green * Σε αντιδράσεις που δεν απαιτείται ειδικότητα ως προς το προϊόν της αντίδρασης. Π.χ όταν θέλουμε να μετρήσουμε το συνολικό αριθμό διαφορετικών προϊόντων μιας αντίδρασης (amplicons) * Σε αντιδράσεις αρχικής ανίχνευσης προϊόντων (amplicons) πριν από ειδικές αντιδράσεις με ιχνηθέτες * Σε αντιδράσεις ποσοτικοποίησης μόνο όταν έχει προηγουμένως βελτιστοποιηθεί η PCR αντίδραση και είμαστε σίγουροι ότι δεν υπάρχουν μη ειδικά προϊόντα

αρχικής ανίχνευσης προϊόντων (amplicons) πριν από ειδικές αντιδράσεις με ιχνηθέτες * Σε αντιδράσεις ποσοτικοποίησης

12 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑ Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικά φθοριοχρώματα σε πολυπλεκτικές αντιδράσεις ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑ Αυξημένος «θόρυβος» καθώς το φθοριόχρωμα παραμένει συνεχώς ενεργοποιημένο καθ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑ Αυξημένος «θόρυβος» καθώς το φθοριόχρωμα

13 TaqMan Primers * equal Tm ( C) * bases in length * G+C content 30-80% * no runs of four or more Gs (any nucleotide) * no more than two G+C at the 3 end * no G at the 5' end * amplicon size bp (max 400) * span exon-exon junctions in cdna

14 TaqMan Probes FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer & DNA Polymerase 5' exonuclease activity * Tm value 10 0 C higher than primers * runs of identical nucleotides (no consecutive Gs) * G+C content 30-80% * more Cs than Gs * no G at the 5' end

0 C higher than primers * runs of identical nucleotides (no

15 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑ Μεγαλύτερη ειδικότητα Μικρότερος «θόρυβος» καθώς ο ιχνηθέτης δεν φθορίζει συνεχώς ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑ Οι αλληλουχίες από τα κολλώδη άκρα του ιχνηθέτη μπορεί να υβριδίσουν με μη ειδικές αλληλουχίες και να δώσουν ψευδώς θετικό σήμα

αλληλουχίες από τα κολλώδη άκρα του ιχνηθέτη μπορεί να

18 Nigel Walker, NIEHS (www)

23 The five-fold dilution series seems to plateau at the same place even though the exponential phase clearly shows a difference between the points along the dilution series. This reinforces the fact that if measurements were taken at the plateau phase, the data would not truly represent the initial amounts of starting target material.

24 SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 24

25 threshold Ct SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 25

26 ASHI Quarterly

27 Stratagene Application Notes #10 (www)

28 Πολεπλεκτικές Real Time PCR TaqMan: διαφορετικά φθοριοχρώματα για κάθε στόχο (FAM, TET, VIC και JOE)

31 Μειονεκτήματα της ανίχνευσης σε πηκτώματα αγαρόζης * Χαμηλή ακρίβεια * Χαμηλή ευαισθησία * Χαμηλό εύρος < 2 logs * Χαμηλή ανάλυση * Μη αυτοματοποιημένη μέθοδος * Διαχωρισμός μόνο με βάση το μέγεθος * Δεν ποσοτικοποιείται * Η χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο δεν είναι γραμμική

32 Πλεονεκτήματα Real-time PCR * Δεν επηρεάζεται από ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων * Η ενίσχυση παρακολουθείται συνεχώς σε κάθε κύκλο * Δεν υφίσταται καμία διαδικασία μετά το τέλος της αντίδρασης (χαμηλός κίνδυνος επιμολύνσεων) * Πιο σύντομοι θερμοδυναμικοί κύκλοι (30 λεπτά έως 2 ώρες) * Μέτρηση δειγμάτων με μεγάλες διαφορές αρχικού νουκλεϊκού φορτίου (διαφορές ποσότητας μέχρι φορές) * Στις περιπτώσεις RT Real time PCR απαιτούνται 1000 φορές λιγότερα μόρια αρχικού RNA * Αυξημένη ειδικότητα, ευαισθησία και επαναληψιμότητα * Μικρή αύξηση του κόστους σε σχέση με την συμβατική PCR (εκτός του εξοπλισμού)

34 Μειονεκτήματα Real-time PCR * Δεν είναι ιδανική για εφαρμογές multiplex PCR * Απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό * Υψηλό κόστος εξοπλισμού

35 Detection Chemistry Preferences SYBR Green only 31% Fluorescent probes or primers only 36% Both SYBR Green and fluorescent probes or primers 33% Detection Chemistries

36 Commonly Used Fluorescent Probes TaqMan probes 78% Molecular Beacons 19% FRET probes 15% LUX fluorogenic primers 9% MGB Eclipse probes 9% Other 3% Scorpion probes 2% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% Detection Chemistries

37 ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΚΟΣΤΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΥ: περίπου (έναντι των συμβατικών κυκλοποιητών) Κόστος ιχνηθετών (Taqman): Παρόμοιο με αυτό των primers (περίπου 1 /βάση) έως 300 για το φθοριόχρωμα Τα Beacons είναι λίγο ακριβότερα λόγω του μεγαλύτερου μήκους Τα Scorpions είναι αρκετά ακριβότερα και δυσκολότερο να συντεθούν Συνολικό κόστος μιας Real Time PCR (με Taqman) ανά δείγμα: Μια απλή PCR κοστίζει ανά δείγμα: 5-15 ΑΡΑ: περίπου 2πλάσιο με 3πλάσιο κόστος ΑΛΛΑ: πρέπει να αφαιρέσουμε το κόστος της ηλεκτροφόρησης (που δεν πραγματοποιείται στην Real Time PCR) ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΑ: να συνυπολογίσουμε και τα υπόλοιπα πλεονεκτήματα τα οποία τελικώς ΚΟΣΤΙΖΟΥΝ, αφού μέχρι και Ο ΧΡΟΝΟΣ ΕΙΝΑΙ ΧΡΗΜΑ

Σχετικά έγγραφα

Έρευνα Καταναλωτικής Εμπιστοσύνης

Έρευνα Καταναλωτικής Εμπιστοσύνης 1 ΤΥΠΟΣ ΕΡΕΥΝΑΣ97 ΠΕΡΙΟΧΗ ΕΡΕΥΝΑΣ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΔΟΜΗΜΕΝΟΥ ΕΡΩΤΗΜΑΤΟΛΟΓΙΟΥ ΠΕΡΙΟΔΟΣ ΕΡΕΥΝΑΣ 30/10/2012 4/1/2013 ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΤΥΧΑΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ