ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Μεταβολισμός της βιομηχανικής γλυκερόλης σε ελαιογόνους Ζυγομύκητες και συσσώρευση αποθεματικών λιπιδίων υπό μη-ασηπτικές συνθήκες ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Άννα Μουστόγιαννη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Οκτώβριος 2014

2 ΕΓΚΡΙΣΗ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γεώργιος Αγγελής, Χρήστος Γεωργίου, Σεραφείμ Παπανικολάου, Καθηγητής Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Γεώργιος Αγγελής, Καθηγητής Ο Επιβλέπων Καθηγητής Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης (Διδακτορικής Διατριβής) από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ- ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του έργου με τίτλο MicroOil- Έρευνα σε ελαιογόνους μικροοργανισμούς και ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών διεργασιών, της δράσης ΑΡΙΣΤΕΙΑ που υλοποιείται στα πλαίσια του ΕΣΠΑ- Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Εκπαίδευσης και Δια Βίου Μάθησης, και χρηματοδοτείται από το Ελληνικό κράτος ( Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων και Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας- ΓΓΕΤ) και την Ευρωπαϊκή Ένωση. Καταρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Γιώργο Αγγελή για την επίβλεψη, την εμπιστοσύνη και τις πολύτιμες συμβουλές που μου έδωσε κατά την εκπόνηση της εργασίας αυτής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης τον Καθηγητή κ. Χρήστο Γεωργίου και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Σεραφείμ Παπανικολάου για τη συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τη μεταδιδακτορική ερευνήτρια Δρ. Ειρήνη- Εύα Τριανταφυλλίδου καθώς και την υποψήφια διδάκτορα κα Σταματία Μπέλλου, για τη βοήθεια, την καθοδήγηση και τις πολύτιμες συμβουλές τους, οι οποίες έπαιξαν καταλυτικό ρόλο στην ολοκλήρωση της ερευνητικής μου εργασίας. Επίσης, ευχαριστώ το μεταπτυχιακό φοιτητή κ. Παναγιώτη Μιζεράκη και τις φοιτήτριες κα Σύνθια Χατζηκωτούλα, κα Ειρήνη Τσιλιγκάκη, κα Βέρα Κομπότη, κα Στέλλα Παυλίδου, κα Μαριάννα Ντούρου και κα Πηνελόπη Ρεντούμη, κα Μαρία Κοθρή, κα Κατερίνα Λαμπρινού, κα Αλεξάνδρα Δασκαλάκη καθώς και το παλαιότερο μέλος του εργαστηρίου κ. Δημήτρη Μπέλλο. Ένα θερμό ευχαριστώ οφείλω στους φίλους μου για τη συμπαράσταση και στήριξή τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τις φίλες μου Μαρία, Τζέσικα και Άννα καθώς και το Γιάννη για τη στήριξη και την κατανόησή τους. Το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στους γονείς μου, Δημήτρη και Σταυρούλα και την αδερφή μου Βασιλική για την υπέρμετρη συμπαράσταση, βοήθεια και στήριξή τους καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου και της ζωής μου γενικότερα. Τέλος, θα ήθελα να αφιερώσω την εργασία αυτή στο πρότυπό μου, τη Δρ Άννα Μακρή, θεωρώντας τον εαυτό μου τυχερό που τη γνώρισα. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η βιομηχανική γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα και ενέργειας Βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον των ελαιογόνων μικροοργανισμών Φυσιολογία των ελαιογόνων μικροοργανισμών Βιοσύνθεση λιπιδίων από τους ελαιογόνους μικροοργανισμούς Βιοσύνθεση λιπαρών οξέων από τους ελαιογόμους μικροοργανισμούς Ζυγομύκητες Αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων Σκοπός ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Μικροοργανισμοί Συνθήκες καλλιέργειας Σύσταση θρεπτικού μέσου καλλιέργειας Καλλιέργειες σε φιάλες σε ασηπτικές και μη- ασηπτικές συνθήκες Καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα Προσδιορισμός βακτηριακών κυττάρων Προσδιορισμός ξηρής βιομάζας Ποσοτική εκχύλιση μικροβιακών λιπιδίων Προσδιορισμός συγκέντρωσης γλυκερόλης Μεθυλεστεροποίηση Αέρια χρωματογραφία (GC) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Καλλιέργεια Ζυγομυκήτων σε βιομηχανική γλυκερόλη υπό μη ασηπτικές συνθήκες Καλλιέργεια του μύκητα Thamnidium elegans σε θρεπτικό υλικό που περιέχει διάφορες αντιβακτηριακές ουσίες Καλλιέργεια του μύκητα Thamnidium elegans σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας υπό μη ασηπτικές συνθήκες Σύσταση των ολικών λιπιδίων του μύκητα Thamnidium elegans σε λιπαρά οξέα ΣΥΖΗΤΗΣΗ

5 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Καλλιέργεια του μύκητα Thamnidium elegans σε θρεπτικό υλικό που περιέχει διάφορες αντιβακτηριακές ουσίες

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Λόγω της αύξησης των τιμών του αργού πετρελαίου, τα τελευταία χρόνια η παραγωγή βιοντίζελ (biodiesel) έχει αποκτήσει μεγάλο ενδιαφέρον. Η χρήση των φυτικών ελαίων ως πρώτη ύλη στη βιομηχανία παραγωγής βιοντίζελ έχει πολλά μειονεκτήματα. Επομένως, το ενδιαφέρον των ερευνητών έχει στραφεί στη χρήση των SCO (ελαίων μονοκύτταρων οργανισμών), ως μία εναλλακτική πρώτη ύλη. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, η βιομηχανική γλυκερόλη μετατράπηκε σε SCO από διάφορα στελέχη ελαιογόνων Ζυγομυκήτων, οι οποίοι καλλιεργήθηκαν υπό μηασηπτικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας εκλεκτικά, περιοριστικά ως προς την πηγή αζώτου θρεπτικά μέσα καλλιέργειας, τα οποία ανέστειλαν τη βακτηριακή αύξηση. Όταν οι μύκητες Thamnidium elegans, Mortierella ramanniana, Mortierella isabellina, Zygorhynchus moelleri, Mucor sp. και Cunninghamella echinulatα καλλιεργήθηκαν σε ph6 υπό μη-ασηπτικές συνθήκες, ήταν ικανοί να παράγουν 1,2-4,1 g/l βιομάζα και να συνθέτουν 17,5-49,3% wt/wt λιπίδια επί της ξηρής τους βιομάζας. Τα επίπεδα σύνθεσης της βιομάζας ήταν ~50% χαμηλότερα από εκείνα που επιτεύχθηκαν όταν οι Ζυγομύκητες καλλιεργήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες. Διάφορες αντι-βακτηριακές ουσίες (αιθέρια έλαια, αντιβιοτικά) χρησιμοποιήθηκαν ώστε να επιτευχθεί υψηλότερη συσσώρευση βιομάζας και λιπιδίων από τους Ζυγομύκητες. Σε ph5, ο μύκητας M. ramanniana παρήγαγε 4,4 g/l βιομάζα που περιείχε 22% wt/wt λιπίδια, ενώ ο μύκητας T. elegans παρήγαγε 3,4 g/l βιομάζα που περιείχε 45% wt/wt λιπίδια επί της ξηρής τους βιομάζας. Όταν προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας αιθέριο έλαιο θυμαριού, 4,8 g/l βιομάζα συντέθηκαν από το μύκητα Τ. elegans που περιείχαν 42,6% wt/wt λιπίδια. Επιπλέον, όταν προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας αντιβιοτικά και αιθέριο έλαιο, ο μύκητας T. elegans ήταν ικανός να παράγει 7,9 g/l βιομάζα που περιείχε 31,5 % wt/wt λιπίδια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και ο πληθυσμός των βακτηρίων ανέστειλε την αύξηση των μυκήτων, η συσσώρευση των λιπιδίων δεν επηρεάστηκε από την παρουσία των βακτηρίων στο μέσο καλλιέργειας, συγκρινόμενα με αποτελέσματα πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες (control). Ως εκ τούτου, αναπτύχθηκε μια διεργασία δύο σταδίων στις κωνικές φιάλες και στο βιοαντιδραστήρα, κατά την οποία η αύξηση του μύκητα πραγματοποιήθηκε υπό 6

7 ασηπτικές συνθήκες (1 ο στάδιο) και ακολούθησε η συσσώρευση των λιπιδίων που πραγματοποιήθηκε υπό μη-ασηπτικές συνθήκες (2 ο στάδιο). Στο 2 ο στάδιο, προστέθηκε στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας αιθέριο έλαιο θυμαριού ως αντιβακτηριακή ουσία. Από αυτή τη διεργασία, υψηλές ποσότητες λιπιδίων συσσωρεύτηκαν μέσα στο μυκήλιο του μύκητα, με απόδοση που έφτασε περίπου 13% wt/wt μικροβιακού ελαίου ανά καταναλωθείσα γλυκερόλη. 7

8 ABSTRACT Biodiesel production has gained much interest during last years as an alternative fuel source, which arises from the escalating prices of petroleum fuels. The use of plant oils as feedstock for the biodiesel manufacture has many drawbacks, thus the interest has turned to single cell oil (SCO) as an alternative. In this thesis, raw glycerol was converted into SCO by oleaginous Zygomycetes, cultivated under nonaseptic conditions, using selective nitrogen limited media that inhibit the bacterial growth. Thamnidium elegans, Mortierella ramanniana, Mortierella isabellina, Zygorhynchus moelleri, Mucor sp. and Cunninghamella echinulata, cultivated at ph6 under non-aseptic conditions, were able to produce g/l of biomass and synthesized % wt/wt of lipids in their biomass. These accumulation levels in biomass were ~50% lower compared to those achieved when Zygomycetes grown under aseptic conditions. Various anti-bacterial compounds, including essential oils and antibiotics were used in order to achieve a higher biomass and lipid accumulation. At ph5, M. ramanniana produced 4.4 g/l biomass containing 22% wt/wt lipids in their biomass, while T. elegans produced 3.4 g/l biomass containing 45% wt/wt of lipids. When thyme essential oil was added into the growth medium, T. elegans produced 4.8 g/l biomass containing 42.6% wt/wt lipids. Furthermore, with the addition of antibiotics together with essential oil into the medium, the production of SCO was further improved with T. elegans being able to produce 7.9 g/l of biomass containing 31.5% wt/wt lipids. The obtained data showed that although bacterial populations inhibited the fungal growth, lipid accumulation remained unaffected by the presence of bacteria in the growth medium compared to control experiments (conducted under aseptic conditions). Therefore, a two-stage process was developed in both flasks and bioreactor, in which growth was performed under aseptic conditions (1 st stage) followed by lipid accumulation performed under non-aseptic conditions (2 nd stage) in the presence of thyme essential oil as an antibacterial agent. Large amounts of lipids 8

9 were accumulated inside the mycelia, yielding around 13% wt/wt of oil per glycerol consumed. 9

10 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Η βιομηχανική γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα και ενέργειας Η γλυκερόλη είναι μια απλή αλκοόλη που μπορεί να παραχθεί είτε μέσω των μικροβιακών ζυμώσεων, ή μέσω της χημικής σύνθεσης από πετρελαιοχημικές πρώτες ύλες. Επιπρόσθετα, παράγεται ως παραπροϊόν στις βιομηχανίες παραγωγής αλκοόλης και σαπωνοποιίας ( Barbirato et al., 1998; Papanikolaou et al., 2000). Στην τελευταία περίπτωση, κατά την υδρόλυση των λιπών, η γλυκερόλη παράγεται ως παραπροϊόν, διεργασία η οποία τείνει να εκλείψει λόγω της αντικατάστασης των σαπώνων με άλλα απορρυπαντικά (Wang et al., 2001; da Silva et al., 2009). To βιοντίζελ παράγεται μέσω της μετεστεροποίησης λιπαρών υλών με αιθανόλη ή μεθανόλη σε αλκαλικό περιβάλλον με χρησιμοποιούμενους καταλύτες το ΝaΟΗ ή το ΚΟΗ (Εικόνα 1.1). Η γλυκερόλη αποτελεί παραπροϊόν της αντίδρασης αυτής και παράγεται σε ποσοστό 10% v/v επί του παραγόμενου εστέρα (Papanikolaou et al., 2004; Mu et al., 2006). Παγκόσμια, ως λιπαρές ύλες για την παραγωγή βιοντίζελ χρησιμοποιούνται κυρίως φυτικά και ζωικά έλαια καθώς και χαμηλού κόστους έλαια, όπως τα χρησιμοποιημένα μαγειρικά έλαια ( Yuste & Dorado, 2006). Στην Ευρώπη χρησιμοποιείται κυρίως έλαιο ελαιοκράμβης, ενώ σε άλλες περιοχές (ΗΠΑ, Βραζιλία) χρησιμοποιούνται έλαια από σόγια, ηλίανθο, κ.α. 10

11 Εικόνα 1.1: Αντίδραση μετεστεροποίησης ενός τριγλυκεριδίου με αιθανόλη, με χρησιμοποιούμενο καταλύτη το NaOH ( da Silva et al., 2009). Η αύξηση των τιμών του αργού πετρελαίου και η μείωση των ενεργειακών αποθεμάτων σε συνδυασμό με τα περιβαλλοντικά προβλήματα που προκαλούνται κατά τη χρήση του, έστρεψαν το ενδιαφέρον των ερευνητών στη χρήση του βιοντίζελ ως μια ανανεώσιμη, οικολογική και εναλλακτική πηγή ενέργειας. Η αύξηση της παραγωγής βιοντίζελ έχει ως αποτέλεσμα τη ραγδαία μείωση της τιμής της γλυκερόλης που παράγεται ως παραπροϊόν (Deckwer, 1995; Dharmadi et al., 2006), ενώ οι βιομηχανίες παραγωγής βιοντίζελ αντιμετωπίζουν προβλήματα στη διαχείρισή της (Willke & Vorlop, 2004; Dharmadi et al., 2006). Οι λόγοι αυτοί οδηγούν στην ανάγκη ανεύρεσης τρόπων αξιοποίησης της βιομηχανικής γλυκερόλης μέσω βιοτεχνολογικών διεργασιών για την παραγωγή προϊόντων με υψηλή προστιθέμενη αξία. Επιπρόσθετα, η αξιοποίηση της βιομηχανικής γλυκερόλης θα μειώσει σημαντικά το κόστος παραγωγής του βιοντίζελ, καθιστώντας το περισσότερο ανταγωνιστικό έναντι των ορυκτών καυσίμων. Σήμερα, η γλυκερόλη χρησιμοποιείται σε διάφορες εφαρμογές όπως είναι τα καλλυντικά, τα τρόφιμα, τις βαφές, τον καπνό, στις αυτοκινητοβιομηχανίες, τις φαρμακοβιομηχανίες, τις βιομηχανίες δέρματος και υφασμάτων, κ.α. Μια πολλά υποσχόμενη εφαρμογή είναι η βιομετατροπή της σε υψηλής προστιθέμενης αξίας προϊόντα μέσω των μικροβιακών ζυμώσεων (da Silva et al., 2009). 11

12 1.2. Βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον των ελαιογόνων μικροοργανισμών Ως ελαιογόνοι χαρακτηρίζονται οι μικροοργανισμοί που έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν μικροβιακά λιπίδια σε ποσοστό μεγαλύτερο του 20% wt/wt επί της ξηρής τους βιομάζας (Ratledge, 1994). Σύμφωνα με έναν πιο ακριβή ορισμό, ελαιογόνοι καλούνται οι μικροοργανισμοί που μπορούν οικονομικά να εκχυλιστούν και να πωληθούν (Ratledge, 1994). Ο όρος έλαιο μονοκύτταρων οργανισμών (Single Cell Oil, SCO), χρησιμοποιείται στη διεθνή βιβλιογραφία για να περιγράψει τα μικροβιακά λιπίδια, κατ αντιστοιχία με τον όρο πρωτεΐνη μονοκύτταρων οργανισμών (Single Cell Protein, SCP), ο οποίος χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη μικροβιακή πρωτεΐνη. Οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί μπορεί να είναι κυρίως ζύμες και μύκητες (Woodbine, 1959) αλλά και βακτήρια, καθώς και αυτότροφα φωτοσυνθέτοντα μικροφύκη (Bajpai & Bajpai, 1993). Τα SCO αποτελούν τις κύριες πηγές πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (Polyunsaturated Fatty acids, PUFA), τα οποία έχουν ιδιαίτερο φαρμακευτικό και διατροφικό ενδιαφέρον (Čertik & Shimizu, 1999). Πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, όπως είναι το αραχιδονικό και το γ-λινολενικό οξύ (GLA), είναι μεγάλου βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος και η παραγωγή τους πραγματοποιείται σε βιομηχανική κλίμακα. Επιπρόσθετα, τα SCO μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή υποκατάστατων του βουτύρου κακάο ( Moreton, 1985). Το βούτυρο- κακάο αποτελείται από παλμιτικό, στεατικό και ελαϊκό οξύ σε ίσες ποσότητες, ένας συνδυασμός που σπάνια μπορεί να βρεθεί στη φύση. Μέχρι στιγμής έχει βρεθεί ότι ορισμένα στελέχη ζυμών αν καλλιεργηθούν σε ειδικές συνθήκες, μπορούν να παράγουν λιπίδια τα οποία έχουν παρόμοια σύσταση με αυτήν του βουτύτου κακάο (Davies, 1988; Ykema et al., 1989; Hassan et al., 1994). Το βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον των ελαιογόνων μικροοργανισμών έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια διότι τα SCO μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή βιοντίζελ, εναλλακτικά των φυτικών ελαίων και ζωικών λιπών ( Li et al., 2007; Fakas et al., 2008; Peng & Chen 2008). Ωστόσο, η παραγωγή των μικροβιακών λιπιδίων παραμένει ακόμα μια ακριβή διεργασία, κυρίως λόγω του ενεργειακού κόστους που απαιτείται κατά την αποστείρωση και του κόστους των υποστρωμάτων που χρησιμοποιούνται ως πηγή άνθρακα και ενέργειας για την καλλιέργεια των μικροοργανισμών. 12

13 Οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί, έχουν σημαντικό βιομηχανικό και οικολογικό ενδιαφέρον λόγω της ικανότητας τους να βιομετατρέπουν διάφορα γεωργοβιομηχανικά απόβλητα και παρα- ή υπο- προϊόντα με χαμηλό ή/ και μηδενικό κόστος σε SCO, που μπορούν να αξιοποιηθούν είτε στην παραγωγή PUFAs ή στην παραγωγή βιοντίζελ (Fakas et al., 2008; Economou et al., 2010,2011; Chatzifragkou et al., 2011; Bellou et al., 2012, 2014; Fontanille et al., 2012) Φυσιολογία των ελαιογόνων μικροοργανισμών Το έναυσμα για την έναρξη της συσσώρευσης των λιπιδίων δίνεται όταν από το μέσο καλλιέργειας εξαντληθεί κάποιο απαραίτητο συστατικό, συνήθως το άζωτο. Στην περίπτωση αυτή, λόγω του ότι το άζωτο αποτελεί απαραίτητο συστατικό για τη βιοσύνθεση των νουκλεϊκών οξέων και των πρωτεϊνών, σταματά ο πολλαπλασιασμός των μικροβιακών κυττάρων και κατ επέκταση σταματά η σύνθεση της κυτταρικής βιομάζας. Ωστόσο, η πηγή άνθρακα συνεχίζει να αφομοιώνεται και με τη δράση των κατάλληλων ενζύμων μετατρέπεται σε αποθεματικά λιπίδια. Εκτός από το άζωτο έχουν χρησιμοποιηθεί και άλλοι περιοριστικοί παράγοντες, με περιορισμένη επιτυχία, όπως είναι το θείο, ο φωσφόρος, το μαγνήσιο και ο σίδηρος ( Gill & Ratledge, 1977; Granger et al., 1993; Hassan et al., 1996). Οι περιορισμοί αυτοί μπορεί να οφείλονται στην αρνητική επίδραση και σε άλλες φυσιολογικές λειτουργίες του κυττάρου, εκτός από τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων (Ratledge, 1994). Η συσσώρευση των λιπιδίων είναι μια διεργασία που επιτελείται κυρίως σε δύο διακριτά στάδια (Εικόνα 1.2): - Κατά το πρώτο στάδιο, όλα τα θρεπτικά συστατικά βρίσκονται σε ποσότητες ικανές να καλύψουν όλες τις μεταβολικές ανάγκες του μικροοργανισμού με αποτέλεσμα την ισόρροπη αύξησή του ( balanced growth). - Στο δεύτερο στάδιο ξεκινά η ελαιογόνος φάση, όταν κάποιο θρεπτικό συστατικό εξαντληθεί από το μέσο καλλιέργειας. Η φάση αυτή διαρκεί μέχρι την εξάντληση από το μέσο καλλιέργειας της πηγής άνθρακα ή κάποιου άλλου συστατικού απαραίτητου για τη διεργασία αυτή ή μέχρις ότου το ποσοστό των συσσωρευμένων λιπιδίων φτάσει μία μέγιστη τιμή η οποία εξαρτάται από τον κάθε μικροοργανισμό. 13

14 Όταν από το μέσο καλλιέργειας εξαντληθεί η πηγή άνθρακα, τότε ο μικροοργανισμός αποδομεί και καταναλώνει τα συσσωρευμένα λιπίδια και ο ρυθμός της κατανάλωσής του εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών. Ειδικότερα, αν υπάρχει έλλειψη και σε άλλα θρεπτικά συστατικά εκτός του άνθρακα, τότε ο ρυθμός αποδόμησης των λιπιδίων είναι αργός και εξυπηρετεί κυρίως τις ανάγκες συντήρησης του μικροβιακού κυττάρου. Αντίθετα, αν υπάρχει έλλειψη μόνο της πηγής άνθρακα, η αποδόμηση των λιπιδίων είναι ταχεία, εξαρτώμενη από τον ρυθμό που καταναλώνονται τα προϊόντα της αποδόμησης, τα οποία χρησιμοποιούνται για την παραγωγή νέας βιομάζας (Holdsworth & Ratledge, 1988). Εικόνα 1.2: Κινητική της συσσώρευσης μικροβιακών λιπιδίων (Fakas et al., 2007, τροποποιημένο). Συντομογραφίες: x (g/l)- ξηρή βιομάζα, L/x*100 (%)- ποσοστό λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας, x f (g/l)- βιομάζα ελεύθερη λιπιδίων Βιοσύνθεση λιπιδίων από τους ελαιογόνους μικροοργανισμούς Όλοι οι μικροοργανισμοί είναι απαραίτητο να συνθέσουν μια ελάχιστη ποσότητα λιπιδίων με σκοπό να εφοδιάσουν τις μεμβράνες τους και άλλες δομές, καθώς και για διάφορους λειτουργικούς σκοπούς. Ωστόσο ένας μικρός αριθμός μικροοργανισμών έχει την ικανότητα να συσσωρεύει λιπίδια με τη μορφή τριγλυκεριδίων σε ποσοστό μεγαλύτερο του 20% wt/wt επί της ξηρής τους βιομάζας, 14

15 τα οποία λειτουργούν ως αποθεματικό υλικό (storage material). H ικανότητα αυτή εντοπίζεται κυρίως σε ορισμένα είδη ζυμών και μυκήτων καθώς επίσης και σε ένα μικρό ποσοστό μικροφυκών. Αντίθετα, τα βακτήρια γενικά αντί για τριγλυκερίδια συσσωρεύουν πολυαλκανοϊκά οξέα σαν αποθεματικό υλικό. Για να επιτευχθεί η συσσώρευση των λιπιδίων από έναν ελαιογόνο μικροοργανισμό είναι απαραίτητο ο μικροοργανισμός αυτός να καλλιεργηθεί σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου. Όταν εξαντληθεί το άζωτο από το μέσο καλλιέργειας, ο μικροοργανισμός συνεχίζει να αφομοιώνει την πηγή άνθρακα με αποτέλεσμα τη σύνθεση λιπιδίων υπό μορφή τριγλυκεριδίων, τα οποία υπάρχουν σε μορφή λιποσωματίων μέσα στο κύτταρο. Αντίθετα, όταν ένας μηελαιογόνος μικροοργανισμός καλλιεργηθεί σε συνθήκες πενίας αζώτου, ο άνθρακας συνεχίζει να αφομοιώνεται προς το σχηματισμό πολυσακχαριτών (γλυκογόνο, γλυκάνες, μαννάνες κ.ά.). Απαραίτητη προϋπόθεση για την ελαιογένεση είναι αφενός η συνεχής παροχή στο κυτταρόπλασμα με ακετυλο-coa που είναι απαραίτητο μόριο για τη βιοσύνθεση λιπαρών οξέων, καταλυόμενων μέσω της συνθάσης των λιπαρών οξέων ( fatty acid synthetase, FAS) και αφετέρου η ικανότητα του κυττάρου να παράγει NADPH σε μεγάλες ποσότητες, το οποίο απαιτείται για τη βιοσύνθεση λιπαρών οξέων. Ο σχηματισμός του ακετυλο-coa στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς αποδίδεται στη διάσπαση του κιτρικού οξέος, μια αντίδραση που καταλύεται από την παρουσία του ενζύμου ATP- κιτρική λυάση (αντίδραση 1). Κιτρικό CoA ΑTP ακετυλο CoA οξαλοξικ ό ADP Pi (αντίδραση 1) Για να σχηματιστεί το ακετυλο-coa είναι απαραίτητο το κιτρικό οξύ να είναι άμεσα διαθέσιμο στο κυτταρόπλασμα διότι εκεί πραγματοποιείται η βιοσύνθεση των λιπιδίων. Το κιτρικό οξύ συντίθεται μέσω του κύκλου των τρικαρβοξυλικών οξέων (TCA) στο μιτοχόνδριο του κυττάρου και έπειτα από την εξάντληση της πηγής αζώτου εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Ειδικότερα, σε συνθήκες πενίας αζώτου παρατηρείται παρεμπόδιση της ισοκιτρικής αφυδρογονάσης με αποτέλεσμα τη διακοπή του ΤCA κύκλου. Στη συνέχεια οι μικροοργανισμοί αποδομούν τη μονοφωσφορική αδενοσίνη (monophosphate- AMP), αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο απαμινάση της ΑΜP με σκοπό να εξοικονομήσουν άζωτο (αντίδραση 2). AMP IMP NH3 15

16 Όπου ΙΜP η μονο- φωσφορική ινοσίνη. ( αντίδραση 2) Έχει βρεθεί ότι η ενεργότητα της απαμινάσης του AMP σε συνθήκες πενίας αζώτου είναι πέντε φορές υψηλότερη συγκρινόμενη με την ενεργότητα εκείνη όταν υπάρχει άζωτο στο μέσο καλλιέργειας. Η παρεμπόδιση της ισοκιτρικής αφυδρογονάσης έχει ως συνέπεια τη συσσώρευση ισοκιτρικού και στη συνέχεια κιτρικού οξέος (μέσω της ισορροπίας της ακονιτάσης) στο μιτοχόνδριο. Όταν το κιτρικό φτάσει σε μια ορισμένη συγκέντρωση η οποία είναι χαρακτηριστική για τον κάθε μικροοργανισμό, εξέρχεται μέσω ενός συστήματος εκροής (με ταυτόχρονη είσοδο μηλικού οξέος) στο κυτταρόπλασμα. Εκεί παρουσία της ATP-κιτρικής λυάσης διασπάται σε ακετυλο-coa και οξαλοξικό οξύ. Το ακετυλο-coa χρησιμοποιείται για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων, ενώ το οξαλοξικό οξύ μετατρέπεται μέσω της μηλικής αφυδρογονάσης σε μηλικό. Το μηλικό οξύ εισέρχεται στο μιτοχόνδριο αντισταθμίζοντας τις απώλειες που προέρχονται από την εκροή του κιτρικού στο κυτταρόπλασμα. Η παρουσία της ATP-κιτρικής λυάσης δεν είναι αρκετή για την ολοκλήρωση της βιοσύνθεσης των λιπιδίων, καθότι έχει βρεθεί ότι μικροοργανισμοί μη-ικανοί να συσσωρεύουν λιπίδια επιδεικνύουν δραστηριότητα ATP-κιτρικής λυάσης. Αυτό αποδεικνύει ότι πιθανόν να είναι απαραίτητα και άλλα ένζυμα για τη διεργασία της ελαιογένεσης. Για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων έχει βρεθεί ότι είναι απαραίτητη η παρουσία NADPH, συνένζυμα που απορροφώνται σε μεγάλες ποσότητες κατά τη διεργασία της σύνθεσης των λιπαρών οξέων. Γεννήτρια NADPH στα κύτταρα των ελαιογόνων μικροοργανισμών αποτελεί ο κύκλος του μηλικού οξέος (αντίδραση 3). Μηλικ ό NADP πυροσταφυλικό CO 2 NADPH (αντίδραση 3) Ενεργότητα του μηλικού ενζύμου έχει βρεθεί στους περισσότερους ελαιογόνους μικροοργανισμούς για τους οποίους έχει προταθεί μια ολοκληρωμένη μεταβολική οδός που συνδυάζει τη δραστηριότητα της ATP- κιτρικής λυάσης και της συνθάσης των λιπαρών οξέων (FAS). Τελικά, τα παραγόμενα λιπαρά οξέα εστεροποιούνται στο μόριο της γλυκερόλης, σχηματίζοντας τριγλυκερίδια και μέσω του ενδοπλασματικού δικτύου 16

17 διακινούνται για να σχηματίσουν λιποσωμάτια ( Ratledge, 2004). Η διαγραμματική απεικόνιση της βιοχημείας της συσσώρευσης των λιπιδίων φαίνεται στην Εικόνα 1.3. Εικόνα 1.3: Βιοσύνθεση των λιπιδίων στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς (Ratledge, 2004, τροποποιημένο). Ένζυμα: 1: πυροσταφυλική καρβοξυλάση, 2: μηλική αφυδρογονάση, 3: μηλικό ένζυμο, 4: πυροσταφυλική αφυδρογονάση, 5: κιτρική συνθάση, 6: ΑΤP- κιτρική λυάση, 7: τρανσλοκάση κιτρικού- μηλικού. 17

18 1.5. Βιοσύνθεση λιπαρών οξέων από τους ελαιογόνους μικροοργανισμούς Τα πρώτα λιπαρά οξέα που σχηματίζονται σε όλους σχεδόν τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και σε ορισμένα βακτήρια είναι το παλμιτικό (C16:0) και το στεατικό οξύ (C18:0). Αυτά είναι τα κορεσμένα λιπαρά οξέα, από τα οποία προκύπτουν τα διάφορα κορεσμένα και ακόρεστα λιπαρά οξέα μεγάλης αλειφατικής αλυσίδας, μέσω της δράσης των αποκορεσμασών (desaturases) και ελονγκασών ( elongases). Τα ακόρεστα λιπαρά οξέα μπορούν να συντεθούν είτε μέσω της αερόβιας ή μέσω της αναερόβιας αναβολικής οδού. Κατά τη σύνθεση των PUFA εμπλέκονται ένζυμα που είναι προσδεμένα στις βιολογικές μεμβράνες και κατά τον αερόβιο αναβολισμό το σύστημα αποκορεσμασών (desaturation system) που εμπλέκεται αποτελείται από τρεις πρωτεΐνες: την κυτοχρωμική NAD(P)H b5 ρεδουκτάση, την κυτοχρωμική b5 και την τελική κυανοευαίσθητη αποκορεσμάση. Επίσης, υπάρχουν τρεις τύποι αποκορεσμασών, οι ακυλο- CoA αποκορεσμάσες, οι ακυλο- ACP αποκορεσμάσες και οι ακυλο- λιπιδιακές αποκορεσμάσες (Čertik & Shimizu, 1999). Γενικά, το στεαροϋλο- CoA ή το στεαροϋλο- ACP χρησιμοποιούνται ως υπόστρωμα για την εισαγωγή του πρώτου διπλού δεσμού προς σχηματισμό των ελαοϋλο- CoA ή των ελαοϋλο- ΑCP αντίστοιχα. Η περαιτέρω προσθήκη διπλών δεσμών λαμβάνει χώρα στο ενδοπλασματικό δίκτυο, αφού πρώτα τα μονοακόρεστα ελαοϋλο- CoA ή ελαοϋλο- ACP που έχουν εστεροποιηθεί στα φωσφολιπίδια και κυρίως στη φωσφατιδυλ- χολίνη, καταλύονται από αποκορεσμάσες προς τον σχηματισμό περισσότερο ακόρεστων παραγώγων (Kates et al., 1984; Jackson et al., 1998). Εκτός από την ανωτέρω διαδικασία σχηματισμού PUFAs, είναι δυνατόν να συμβεί απ ευθείας μετατροπή του ακυλο-coa στο αντίστοιχο PUFA, διαδικασία που επίσης πραγματοποιείται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (Kates et al., 1984). Κατά την αερόβια μεταβολική οδό που λαμβάνει χώρα στα ευκαρυωτικά κύτταρα και ορισμένα βακτήρια, εισάγεται ο πρώτος διπλός δεσμός στη θέση 9 των κορεσμένων λιπαρών οξέων ( C16:0 και C18:0) και σχηματίζεται το παλμιτελαϊκό ( Δ9 C16:1) και το ελαϊκό οξύ ( Δ9 C18:1), τα οποία είναι τα πιο κοινά μονοακόρεστα λιπαρά οξέα στους μικροοργανισμούς. Έπειτα, στο ελαϊκό οξύ προστίθεται διπλός δεσμός στη θέση 12 και σχηματίζεται το λινελαϊκό οξύ ( Δ9,12 C18:2). Με περαιτέρω προσθήκη ενός διπλού δεσμού στη θέση 15 σχηματίζεται το α- λινολενικό οξύ ( Δ9,12,15 C18:3). Αυτά τα τρία λιπαρά οξέα ( Δ9 C18:1, Δ9,12 C18:2 και Δ9,12,15 C18:3) 18

19 αποτελούν τα πρόδρομα μόρια από τα οποία προκύπτουν τα ω 3, ω 6 και ω 9 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Τα επόμενα στάδια για το σχηματισμό των PUFA είναι η προσθήκη διπλών δεσμών από τη Δ6 αποκορεσμάση, η οποία ακολουθείται από επιμηκύνσεις της αλειφατικής αλυσίδας και στη συνέχεια από αποκορεσματοποιήσεις για να δώσει τελικά τα C20 και C22 PUFA (Εικόνα 1.4). Τα PUFA της ω 9 οικογένειας συντίθενται όταν στο ελαϊκό οξύ επιδράσει η Δ6 αποκορεσμάση, έπειτα πραγματοποιηθεί επιμήκυνση της αλειφατικής αλυσίδας και στη συνέχεια επίδραση της Δ5 αποκορεσμάσης, για να παραχθεί τελικά το εικοσατριενοϊκό οξύ. Αντίθετα τα PUFA της ω 6 οικογένειας σχηματίζονται όταν από το λινελαϊκό οξύ, μέσω αποκορεσμώσεων (Δ6, Δ5, Δ4) και επιμηκύνσεων της αλειφατικής αλυσίδας, προκύπτουν το GLA, το αραχιδονικό, το εικοσιδυοτετρανοϊκό και τελικά το εικοσιδυοπεντενοϊκό-ω6 (DPA-ω 6). Τέλος, στους μικροοργανισμούς υπάρχουν δύο εναλλακτικές οδοί για τη βιοσύνθεση των ω 3 λιπαρών οξέων. Κατά την πρώτη οδό, η οποία είναι ανεξάρτητη της θερμοκρασίας, από το α-λινολενικό οξύ προκύπτουν τα EPA, DPA-ω 3 και εικοσιδυοεξενοϊκό (DHA) λιπαρά οξέα. Κατά τη δεύτερη οδό, η οποία εξαρτάται από τη θερμοκρασία, πραγματοποιείται μετατροπή των ω 6 λιπαρών οξέων στα αντίστοιχα ω 3. Σε αυτή τη μετατροπή συμμετέχουν δύο πιθανά ένζυμα, οι Δ15 και Δ17 αποκορεσμάσες (ω 3 - αποκορεσμάσες). 19

20 Εικόνα 1.4: Βιοσυνθετικές οδοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων στους μικροοργανισμούς (Čertik & Shimizu, 1999, τροποποιημένο). ΜΑ, εικοσατριενοϊκό οξύ; GLA, γ- λινολενικό οξύ; DGLA, διομο-γ-λινελαϊκό οξύ; ΑΑ, αραχιδονικό οξύ; DPA, εικοσιδυπενταενοϊκό οξύ; ALA, α- λινολενικό οξύ; ETA, εικοσιτετρανοϊκό οξύ; EPA, εικοσαπεντανοϊκό οξύ; DHA, εικοσιδυενοϊκό οξύ; ΕL, ελονγκάση; Δ4, Δ5, Δ6, Δ9, Δ12, Δ15, Δ17, αποκορεσμάσες. Όταν ολοκληρωθεί η διαδικασία αποκορεσμού, ακολουθεί η διακίνηση των νεοσυντιθέμενων PUFA, από τα φωσφολιπίδια σε άλλα κυτταρικά λιπίδια. Πολλοί μικροοργανισμοί συσσωρεύουν μεγάλα ποσά PUFA ως αποθεματικά λιπίδια υπό τη μορφή τριγλυκεριδίων, τα οποία σχηματίζονται από 3- φωσφορική γλυκερόλη και ακυλο-coa, μέσω μιας διαδικασίας που είναι γνωστή ως βιοσυνθετική οδός Kennedy. Στην οδό Kennedy εμπλέκονται τα ένζυμα, ακυλοτρανσφεράση της 3- φωσφορικής γλυκερόλης, ακυλοτρανσφεράση του λισοφωσφατιδικού, φωσφατάση του φωσφατιδικού και ακυλοτρανσφεράση της διακυλ-γλυκερόλης (Jackson et al., 1998; Pillai et al., 1998). 20

21 Οι αλειφατικές αλυσίδες εστεροποιούνται στα φωσφολιπίδια όπου και τροποποιούνται. Έπειτα, τα λιπαρά οξέα από τα φωσφολιπίδια διατίθενται προς το σχηματισμό τριγλυκεριδίων. Αρχικά πραγματοποιείται ανταλλαγή ακυλίων μεταξύ της δεξαμενής ακυλο- CoA και φωσφολιπιδίων (κυρίως της φωσφατιδυλχολίνης) μέσω μιας ειδικής ακυλοτρανσφεράσης. Τα νεοσυντιθέμενα PUFA- CoA εμπλουτίζουν τη δεξαμενή των ακυλο-coa, λειτουργώντας ως δότες ακυλίων για το σχηματισμό τριγλυκεριδίων μέσω της οδού Kennedy. Σύμφωνα με ένα δεύτερο μηχανισμό σχηματισμού τριγλυκεριδίων, παράγονται διγλυκερίδια, από πρόδρομα φωσφατιδυλ-χολίνης μέσω της δράσης της φωσφοροτρανσφεράσης της CDPχολίνης, και στη συνέχεια διατίθενται προς το σχηματισμό τριγλυκεριδίων Ζυγομύκητες Το φύλο Zygomycota αποτελείται από δύο κλάσεις, τη μεγάλη σε έκταση και σπουδαιότητα κλάση Zygomycetes και την κλάση Trichomycetes. Η κλάση Zygomycetes συγκροτείται από 900 είδη περίπου. Πολλά από τα είδη της κλάσης αυτής παρουσιάζουν σημαντικό ερευνητικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον, καθότι χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία, την περιβαλλοντική τεχνολογία και τη γεωργία. Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζουν για τη Μικροβιολογία τροφίμων, καθότι ορισμένα είδη είναι αλλοιογόνα τροφίμων, και την Ιατρική, αφού ορισμένα είδη είναι παθογόνα για τον άνθρωπο. Τα μέλη της κλάσης Zygomycetes χαρακτηρίζονται από την παραγωγή απλοειδούς, συχνά άφθονου μυκηλίου, το οποίο συνήθως στερείται σέπτων (εγκάρσιων διαφραγμάτων). Σέπτα μπορεί να δημιουργούνται συχνά στη βάση των σποριαγγείων, των γαμεταγγείων και των ηλικιωμένων ή τραυματισμένων υφών. Οι μύκητες της κλάσης αυτής πολλαπλασιάζονται αγενώς κατά κανόνα με σποριαγγειοσπόρια, σπόρια που δε διαθέτουν αυτόνομη κίνηση και παράγονται εντός χαρακτηριστικών, πολυπύρηνων συνήθως σποριαγγείων. Τα σποριάγγεια φέρονται επί εξειδικευμένων υφών, των σποριαγγειοφόρων. Όσον αφορά την εγγενή αναπαραγωγή, οι μύκητες της κλάσης αυτής πολλαπλασιάζονται με ζυγοσπόρια, τα οποία είναι δομές που φέρουν παχιά τοιχώματα και χαρακτηρίζουν την κλάση, παρόλο που παράγονται από ορισμένα μόνο γένη (Αγγελής, 2007). 21

22 Η κλάση Zygomycetes περιλαμβάνει τις τάξεις Mucorales, Dimargatirales, Kickxellales, Endogonales, Gomales, Entomophthorales, Zoopagales και Harperalles (Αγγελής, 2007). Οι μύκητες Mortierella ramanniana και Mortierella isabellina ανήκουν στην τάξη Mortierellales, ενώ οι μύκητες Thamnidium elegans, Zygorhynchus moelleri, Cunninghamella echinulata και Mucor sp. ανήκουν στην τάξη Mucorales, η οποία είναι η πολυπληθέστερη τάξη του φύλου Zygomycota. Οι μύκητες της τάξης αυτής παρουσιάζουν ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον λόγω της ικανότητάς τους να καλλιεργούνται σε διάφορα βιομηχανικά και γεωργοβιομηχανικά υποστρώματα χαμηλού ή/και μηδενικού κόστους και να παράγουν αποθεματικά λιπίδια, τα οποία είτε είναι κατάλληλα να διοχετευτούν στη βιομηχανία παραγωγής βιοντίζελ ή είναι πλούσια σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, προσδίδοντάς τους διατροφική και φαρμακευτική αξία (Fakas et al., 2008; Economou et al., 2010; 2011; Chatzifragkou et al., 2011; Bellou et al., 2012; 2014; Fontanille et al., 2012; Klempova et al., 2013; Zikou et al., 2013) Αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων Τα αιθέρια έλαια είναι φυσικά σύμπλοκα ενώσεων με ισχυρή οσμή και παράγονται ως δευτερογενείς μεταβολίτες από διάφορα αρωματικά φυτά που ευδοκιμούν σε θερμές περιοχές, όπως είναι οι τροπικές χώρες και οι χώρες της Μεσογείου. Είναι υγρά, πτητικά, διαυγή, σπάνια έγχρωμα και λιποδιαλυτά (διαλύονται σε οργανικούς διαλύτες με χαμηλότερη πυκνότητα από αυτή του νερού). Συντίθενται από όλα τα τμήματα του φυτού (άνθη, φύλλα, φλοιό, ρίζα, κ.α.) και αποθηκεύονται σε εκκριτικά και επιδερμικά κύτταρα ή σε αδενικά τριχώματα. Όσον αφορά τη σύστασή τους, τα αιθέρια έλαια αποτελούνται από φυσικά σύμπλοκα διαλυμάτων, τα οποία περιέχουν περίπου συστατικά σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Συνήθως, δύο ή τρία από τα συστατικά βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις, ενώ όλα τα υπόλοιπα υπάρχουν σε ίχνη. Κύρια συστατικά των αιθέριων ελαίων είναι κυρίως τερπένια και τερπενοειδή αλλά και άλλες αρωματικές και αλειφατικές ενώσεις μικρού μοριακού βάρους ( Bakkali et al., 2008). Τα αιθέρια έλαια, λόγω της σύστασης τους είναι γνωστά για την αντιμικροβιακή τους δράση ενάντια σε βακτήρια, ιούς και μύκητες (Hammer et al., 22

23 1999; Bakkali et al., 2008; Pinto et al., 2009; Sánchez-González et al., 2010) και η ιδιότητά τους αυτή συνδέεται με τον φυσιολογικό τους ρόλο, αφού συμμετέχουν στην προστασία του φυτού από τους φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς (Mahmoud & Croteau, 2002). Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων συνήθως οφείλεται στην ουσία εκείνη που βρίσκεται σε υψηλότερη συγκέντρωση στο έλαιο. Έχει παρατηρηθεί ότι η αντιμικροβιακή δράση του κύριου συστατικού του ελαίου μπορεί να ρυθμίζεται από την παρουσία άλλων συστατικών του που βρίσκονται σε πολύ μικρές ποσότητες. Ο συνδυασμός των διαφόρων συστατικών έχει συνεργητική δράση, αυξάνοντας την αντιμικροβιακή ιδιότητα του αιθέριου ελαίου (Franzios et al., 1997; Santana- Rios et al., 2001; Hoet et al., 2006). Επιπρόσθετα, έχει παρατηρηθεί ότι η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων έναντι της αύξησης των βακτηρίων αυξάνεται, όταν τα αιθέρια έλαια συνδυάζονται με διάφορα κοινά αντιβιοτικά (Fadli et al., 2012). Λόγω της μεγάλης ποικιλίας των συστατικών τους, τα αιθέρια έλαια δεν έχουν ειδικούς στόχους στο κύτταρο που θα του προκαλέσουν λύση. Ως τυπικά λιπόφιλα μόρια που είναι, διαπερνούν το κυτταρικό τοίχωμα και την κυτταροπλασματική μεμβράνη, διαταράσσουν τα διάφορα στρώματα των πολυσακχαριτών, των λιπαρών οξέων και των φωσφολιπιδίων και με αυτό τον τρόπο αυξάνουν τη διαπερατότητα των μεμβρανών. Στα βακτήρια, η διαπερατότητα των μεμβρανών σχετίζεται με την απώλεια ιόντων και τη μείωση του δυναμικού της μεμβράνης, την κατάρρευση της αντλίας των πρωτονίων και την εξάντληση των αποθεμάτων ATP (Knobloch et al., 1989; Sikkema et al., 1994; Bakkali et al., 2008). Επιπρόσθετα, τα αιθέρια έλαια είναι πιθανόν να αυξάνουν το ιξώδες του κυτταροπλάσματος (Gustafson et al., 1998) και να καταστρέφουν τα λιπίδια και τις πρωτεΐνες (Ultee et al., 2002; Burt, 2004). Η καταστροφή του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρικής μεμβράνης οδηγεί στη διαρροή των μακρομορίων του βακτηριακού κυττάρου και τελικά στη λύση του (Cox et al., 2000; Lambert et al., 2001). Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα αιθέρια έλαια προκαλούν εκπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης, μειώνοντας το μεμβρανικό δυναμικό. Επίσης, επηρεάζουν τα κανάλια των ιόντων ασβεστίου και άλλων ιόντων και μειώνουν το ph, επιδρώντας (όπως και στα βακτήρια) στην αντλία πρωτονίων και στη διαθεσιμότητα του ATP. Η ρευστότητα των μεμβρανών αλλάζει και οι μεμβράνες γίνονται ασυνήθιστα διαπερατές, προκαλώντας διαρροή του κυττοχρώματος C, διαφόρων 23

24 ελεύθερων ριζών, πρωτεϊνών και ιόντων ασβεστίου και τελικά το κύτταρο οδηγείται στον κυτταρικό θάνατο μέσω της απόπτωσης και της νέκρωσης. Σήμερα, περίπου 3000 αιθέρια έλαια είναι γνωστά και 300 περίπου από αυτά έχουν ιδιαίτερο εμπορικό ενδιαφέρον λόγω της αντιμικροβιακής τους ιδιότητας. Συγκεκριμένα, τα αιθέρια έλαια ή μερικά συστατικά τους χρησιμοποιούνται ευρέως στη φαρμακευτική, τη γεωργία και την οδοντιατρική. Επίσης χρησιμοποιούνται από τις βιομηχανίες αρωμάτων και καλλυντικών και ως πρόσθετα και συντηρητικά από τη βιομηχανία τροφίμων (Bakkali et al., 2008; Burt, 2004). 24

25 1.8. Σκοπός Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μιας διεργασίας, κατά την οποία διάφορα στελέχη Ζυγομυκήτων καλλιεργήθηκαν υπό μη-ασηπτικές συνθήκες σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας που περιείχε βιομηχανική γλυκερόλη ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας και διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες ( αιθέρια έλαια, αντιβιοτικά). Αναλυτικότερα, εξετάστηκε κατά πόσο οι μη-ασηπτικές συνθήκες επηρεάζουν την αύξηση των ελαιογόνων Ζυγομυκήτων και τη συσσώρευση των αποθεματικών λιπιδίων. Επίσης μελετήθηκε αν τα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν στο μέσο καλλιέργειας έναντι της αποστείρωσης ανέστειλαν την αύξηση των βακτηρίων και αν επηρέασαν την αύξηση των Ζυγομυκήτων. Τέλος μελετήθηκε αν τα αιθέρια έλαια επηρέασαν τη σύσταση των αποθεματικών λιπιδίων των Ζυγομυκήτων. Η αξιοποίηση της βιομηχανικής γλυκερόλης μέσω της βιομετατροπής της σε αποθεματικά λιπίδια υπό μη-ασηπτικές συνθήκες, πέραν του ότι είναι σημαντικού περιβαλλοντικού ενδιαφέροντος, συνδέεται άμεσα με τη βιωσιμότητα της βιομηχανίας παραγωγής βιοντίζελ. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, ανθεκτικά στελέχη ελαιογόνων Ζυγομυκήτων είναι δυνατόν να συσσωρεύσουν λιπίδια υπό μηασηπτικές συνθήκες με στόχο τη χρησιμοποίησή τους στη βιομηχανία παραγωγής βιοντίζελ. 25

26 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Μικροοργανισμοί Ως βιολογικό υλικό χρησιμοποιήθηκαν οι Ζυγομύκητες Cunninghamella echinulata ATHUM 4411, Mortierella isabellina ATHUM 2935, Mortierella ramanniana MUCL 9235, Mucor sp. LGAM 365, Thamnidium elegans CCF 1465, Zygorhynchus moelleri MUCL Οι μικροοργανισμοί διατηρούνταν σε PDA στους 7±1 ο C και η ανανέωσή τους γινόταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα (περίπου κάθε μήνα) Συνθήκες καλλιέργειας Σύσταση θρεπτικού μέσου καλλιέργειας Οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε θρεπτικό μέσο που περιείχε ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας βιομηχανική γλυκερόλη (35 ή 50 g/l) και ήταν περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου. Η βιομηχανική γλυκερόλη (περιείχε 2% μονογλυκερίδια, διγλυκερίδια και ελεύθερα λιπαρά οξέα, 3% NaCl, 0,1 % μεθανόλη και 3% νερό) προήλθε από τη βιομηχανία παραγωγής βιοντίζελ (ΠΑΥΛΟΣ Ν. ΠΕΤΤΑΣ ΑΒΕΕ, Πάτρα, Ελλάδα). Ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκαν α) 0,5 g/l εκχύλισμα ζύμης μαζί με 0,5 και 1 g/l (NH 4 ) 2 SO 4 και β) 1 g/l εκχύλισμα ζύμης μαζί με 2 g/l (NH 4 ) 2 SO 4 σε ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Επιπρόσθετα, το θρεπτικό μέσο ήταν εμπλουτισμένο με 7 g/l KH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, Steignheim, Germany), 2 g/l Na 2 HPO 4 (Scharlau, Barcelona, Spain), 1,5 g/l MgSO4 H2O (Scharlau), 0,1 g/l CaCl2 2H2O (Carlo Erba, Rodano, Italy), 0,08 g/l FeCl3 6H2O (BDH, England), 0,001 g/l ZnSO4 7H2O (Merck, Darmstadt, Germany), 0,0001 g/l CuSO4 5H2O (BDH, Poole, England), 0,0001 g/l Co(NO3)3 H2O (Merck), 0,0001 g/l MnSO4 5H2O (Fluka, Steinheim, Germany). Ως αντιβακτηριακοί παράγοντες χρησιμοποιήθηκαν αιθέρια έλαια πορτοκαλιού (Citrus sinensis) σε συγκεντρώσεις από 0,5-5 g/l και 0,008 και 0,03 g/l αιθέριο έλαιο θυμαριού (Thymus vulgaris). 26

27 Μίγμα αντιβιοτικών που περιείχε 0,03 g/l αμπικιλλίνη (Sigma- Aldrich) και 0,03 g/l χλωραμφενικόλη (Sigma- Aldrich) προστέθηκαν στο μέσο. Το ph του μέσου καλλιέργειας ρυθμιζόταν στα 4±0,1, 5±0,1 και 6±0,1 με προσθήκη διαλυμάτων NaOH και HCl 4M Καλλιέργειες σε φιάλες σε ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες Οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε κωνικές φιάλες των 250 ml Erlenmeyer που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού. Στις καλλιέργειες που πραγματοποιούνταν υπό ασηπτικές συνθήκες, το θρεπτικό μέσο αποστειρωνόταν στους 121 o C, υπό πίεση 1 atm για 20 min. Αντίθετα, στις καλλιέργειες που πραγματοποιούνταν υπό μη-ασηπτικές συνθήκες, το θρεπτικό μέσο δεν αποστειρωνόταν. Πριν την προσθήκη του θρεπτικού στις φιάλες, οι φιάλες πλένονταν με αιθανόλη ( 75% v/v καθαρότητας) για να μειωθεί με αυτόν τον τρόπο η αρχική μόλυνση. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε μια διεργασία που περιελάμβανε δύο στάδια. Κατά το πρώτο στάδιο, προστέθηκε στις φιάλες 50 ml θρεπτικού υλικού και στη συνέχεια αφού οι φιάλες αποστειρώθηκαν και εμβολιάστηκαν, επωάστηκαν για 120 h. Κατά το δεύτερο στάδιο, στις καλλιέργειες προστέθηκαν επιπλέον 50 ml μη αποστειρωμένου θρεπτικού υλικού που περιείχε γλυκερόλη και αιθέριο έλαιο θυμαριού και η διεργασία αυτή έλαβε χώρα σε μη-ασηπτικές συνθήκες. Οι φιάλες και στις δύο περιπτώσεις (ασηπτικές και μη- ασηπτικές συνθήκες) εμβολιάστηκαν με 2, 4 και 8 ml εναιωρήματος σπορίων του μύκητα που περιείχαν περίπου 1,8 10 6, 3, και 7, σπόρια αντίστοιχα. Για την παραγωγή των σπορίων, οι μύκητες καλλιεργήθηκαν σε σωλήνες καλλιέργειας που περιείχαν 39 g/l θρεπτικό υλικό PDA σε κεκλιμένο επίπεδο. Μετά τον εμβολιασμό τους επωάστηκαν σε επωαστικό θάλαμο στους 28 o C για περίπου 7 ημέρες. Μετά την επώαση και κατ επέκταση τη σποριογονία τους, προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα καλλιέργειας 10 ml αποστειρωμένο και απιονισμένο νερό και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανακίνηση για περίπου 1 min σε αναδευτήρα vortex για να ελευθερωθούν τα σπόρια. Η μέτρηση των σπορίων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου τύπου Neubauer (Poly- Optic, Bad Blankenburg, Germany). 27

28 Οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο (Zhicheng ZHWY-211C), σε θερμοκρασία 28 o C και ανάδευση 180 rpm Καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα Το στέλεχος T. elegans καλλιεργήθηκε σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας τύπου New Brunswick, BioFlo/CelliGen 115, ενεργού όγκου 1,5 l και ολικού όγκου 3 l με δυνατότητα ελέγχου όλων των παραμέτρων μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή, προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η αύξησή του σε μη-ασηπτικές συνθήκες. Αρχικά, η καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε κλειστό σύστημα και σε μηασηπτικές συνθήκες. Πριν την προσθήκη του μη αποστειρωμένου θρεπτικού μέσου, έγιναν πλύσεις του κάδου με αιθανόλη 75%. Στη συνέχεια προστέθηκαν 1250 ml μη αποστειρωμένου θρεπτικού υλικού. Τα συστατικά του θρεπτικού υλικού είχαν υπολογιστεί σε τελικό όγκο 1500 ml, συνυπολογίζοντας με αυτό τον τρόπο την αραίωση από την προσθήκη του εμβολίου. Ο εμβολιασμός έγινε με 250 ml εναιωρήματος σπορίων. Οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία 28±0,1 o C, υπό ανάδευση που κυμαινόταν από rpm και αερισμό 1,5 vvm ώστε να επιτευχθούν αερόβιες συνθήκες. Το ph της καλλιέργειας ρυθμιζόταν αυτόματα στο 4±0,1 με την προσθήκη 1 M NaOH (Merck). Έπειτα, στον ίδιο βιοαντιδραστήρα πραγματοποιήθηκε μια διεργασία δύο σταδίων, το πρώτο στάδιο πραγματοποιήθηκε σε ασηπτικές συνθήκες και το δεύτερο σε μη-ασηπτικές. Κατά το πρώτο στάδιο ο κάδος με το θρεπτικό υλικό αποστειρώθηκαν στους 121 o C για 20 min και εμβολιάστηκε με 80 ml εναιωρήματος σπορίων ενώ κατά το δεύτερο στάδιο προστέθηκαν 70 g/l βιομηχανική γλυκερόλη και 0,03 g/l αιθέριο έλαιο θυμαριού Προσδιορισμός βακτηριακών κυττάρων Τα βακτηριακά κύτταρα που αναπτύχθηκαν κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες στις καλλιέργειες σε φιάλες και στο βιοαντιδραστήρα προσδιορίστηκαν με τη βοήθεια 28

29 αιματοκυτταρόμετρου τύπου Neubauer και εκφράστηκαν μέσω του δεκαδικού λογάριθμου των βακτηριακών κυττάρων Προσδιορισμός ξηρής βιομάζας Η συλλογή της βιομάζας πραγματοποιήθηκε με διήθηση υπό κενό μέσω ηθμού τύπου Whatman No 1. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν αρκετές πλύσεις με απιονισμένο νερό και μια πλύση με αιθανόλη 75%, στη συνέχεια συλλέχθηκε σε υάλινο φιαλίδιο τύπου Mc Cartney και αφού τοποθετήθηκε στους 80 o C προς ξήρανση, προσδιορίστηκε το βάρος της σε ζυγό ακριβείας τύπου Κern ABS Ποσοτική εκχύλιση μικροβιακών λιπιδίων Η ξηρή βιομάζα αφού ομογενοποιήθηκε, εκχυλίστηκε εις τριπλούν σε εκχυλιστικό μέσο CHCl 3 /CH 3 OH, 2:1 (v/v), (FOLCH, Folch et al., 1957). Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε για 12 h σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια έγινε διήθηση της βιομάζας μέσω ηθμού Whatman No 1. Το εκχύλισμα συλλέχθηκε σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη, οι διαλύτες απομακρύνθηκαν μέσω περιστροφικού εξατμιστήρα (Rotavapor R-210) υπό κενό και σε θερμοκρασία 39 o C, και μετά την απομάκρυνση των διαλυτών τα ολικά ενδοκυτταρικά λιπίδια ζυγίστηκαν σε ζυγό ακριβείας Προσδιορισμός συγκέντρωσης γλυκερόλης Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της γλυκερόλης έγινε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC), Dionex Ultimate 3000, σε στήλη Aminex HPX-87H, διαστάσεων 300mm 7,8 mm (Bio- rad) και θερμοκρασία 55 o C. Η ανίχνευση της γλυκερόλης έγινε μέσω ανιχνευτή δείκτη διάθλασης (R.I. detector). Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε H 2 SO 4 0,004 Ν, με ροή 0,9 ml/min. Το προς ανάλυση δείγμα συλλέχθηκε από το υπόστρωμα της καλλιέργειας, διηθήθηκε μέσω 29

30 ηθμού τύπου Whatman, με μέγεθος πόρων 0,2 μm και 20 μl χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση Μεθυλεστεροποίηση Για να προσδιοριστεί η σύσταση των μικροβιακών λιπιδίων σε λιπαρά οξέα, απαιτείται η μετατροπή τους στους αντίστοιχους μεθυλεστέρες. Η αντίδραση της μεθυλεστεροποίησης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ΑFNOR (1954). Αναλυτικά, σε 100 mg ολικών λιπιδίων προστέθηκαν 10 ml μεθοξείδιο του νατρίου που περιείχε φαινολοφθαλεΐνη ως δείκτη ph και το μίγμα θερμάνθηκε μέχρι ήπιου βρασμού. Μετά το πέρας 20 min, προστέθηκε διάλυμα υδροχλωρικής μεθανόλης μέχρι το ph του μίγματος να γίνει όξινο (αλλαγή χρώματος του μίγματος από ερυθρό σε λευκό) και ο βρασμός συνεχίστηκε για άλλα 20 min. Η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη νερού και οι μεθυλεστέρες των λιπαρών οξέων παρελήφθησαν με την προσθήκη 7 ml εξανίου Αέρια χρωματογραφία (GC) Οι μεθυλεστέρες των λιπαρών οξέων αναλύθηκαν σε αέριο χρωματογράφο Agilent 7890A, ο οποίος ήταν εξοπλισμένος με στήλη HP-88 (J & W Scientific) διαστάσεων 60m 0.32mm και ανιχνευτή FID. Η θερμοκρασία του συστήματος εξαέρωσης και του ανιχνευτή ήταν 280 o C, ενώ αυτή του φούρνου ήταν 200 o C. Ως φέρον αέριο χρησιμοποιήθηκε το ήλιο με ροή 1 ml/min και η κάθε ανάλυση διήρκησε 16 min. Η ταυτοποίηση των λιπαρών οξέων έγινε με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων μεθυλεστέρων. 30

31 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Καλλιέργεια Ζυγομυκήτων σε βιομηχανική γλυκερόλη υπό μη-ασηπτικές συνθήκες Η ικανότητα των ελαιογόνων Ζυγομυκήτων C. echinulata, M. isabellina, M. ramanniana, Mucor sp., T. elegans και Z. moelleri να μετατρέπουν τη βιομηχανική γλυκερόλη σε βιομάζα πλούσια σε λιπίδια υπό μη-ασηπτικές συνθήκες εξετάστηκε και οι αποδόσεις τους συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες εκείνων που πραγματοποιήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες (Πίνακας 3.1). Τα δεδομένα αυτά προήλθαν από πειράματα κατά τα οποία οι μύκητες καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου (αρχικός λόγος C/N~ 111), με μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας τη βιομηχανική γλυκερόλη (50 g/l), σε ph6. Από όλα τα στελέχη που εξετάστηκαν, η πιο ικανοποιητική αύξηση και συσσώρευση λιπιδίων τόσο στις ασηπτικές όσο και στις μη-ασηπτικές συνθήκες πραγματοποιήθηκε από τους μύκητες M. ramanniana και T. elegans. Ειδικότερα, κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες, τα βακτήρια έφτασαν σε υψηλά επίπεδα, ενώ στην πλειοψηφία των στελεχών που εξετάστηκαν, η παραγόμενη βιομάζα ήταν περίπου 50% μικρότερη από αυτήν που παρήχθη κατά τις ασηπτικές συνθήκες. Αντίθετα, τα λιπίδια ξεπέρασαν το 30% wt/wt επί της ξηρής τους βιομάζας, δεν επηρεάστηκαν από τη βακτηριακή μόλυνση και σε κάποιες περιπτώσεις κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες συσσωρεύτηκαν περισσότερα λιπίδια σε σχέση με τις ασηπτικές συνθήκες. Σε όλες τις περιπτώσεις σχεδόν 26 g/l από την αρχική γλυκερόλη έμεινε ακατανάλωτη. 31

32 Πίνακας 3.1: Αύξηση των μυκήτων M. isabellina, C. echinulata, Z. moelleri, M. ramanniana, T. elegans, Mucor sp. σε βιομηχανική γλυκερόλη και συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας υπό ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες. Ασηπτικές Συνθήκες Μη-Ασηπτικές Συνθήκες Χρόνος(h) X (g/l) L/X% Glol (g/l) X (g/l) L/X% Glol (g/l) log(cells/ml ) ,3±0,0 8,3±0,0 45,6±0,0 1,2±0,0 31,9±0,0 39,1±0,0 6,7±0,0 M. isabellina ,9±0,2 11,5±2,5 ΔΠ 1,7±0,1 28,8±5,2 36,6±3,8 7,3±0,1 ATHUM ,2±0,1 16,2±2,9 41,5±0,5 1,7±0,1 29,6±0,2 33,0±6,2 7,4±0, ,9±0,0 8,3±0,0 39,4±0,0 1,7±0,0 21,2±0,0 32,2±0,0 6,6±0,0 C.echinulata ,9±0,3 25,6±1,8 32,3±3,2 2,0±0,1 28,0±2,9 33,9±1,8 7,3±0,2 ATHUM ,3±0,5 30,7±3,5 ΔΠ 1,1±0,1 24,4±3,0 24,3±0,3 7,5±0, ,8±0,0 14,2±0,0 38,0±0,0 1,7±0,0 25,6±0,0 ΔΠ 6,7±0,0 Z. moelleri ,7±0,0 16,9±0,9 38,3±0,6 2,0±0,1 29,3±2,1 27,6±6,3 7,3±0,0 MUCL ,4±1,0 13,9±2,7 ΔΠ 1,7±0,3 26,7±2,7 28,0±2,6 7,5±0,0 M ,2±0,0 20,2±0,0 34,2±0,0 1,1±0,0 29,9±0,0 36,4±0,0 6,7±0,0 ramanniana ,9±0,3 32,9±1,6 32,2±3,8 3,2±0,6 44,7±1,3 23,3±1,2 7,3±0,0 MUCL ,4±0,3 31,2±0,1 29,3±1,8 3,6±0,5 44,6±4,7 26,2±3,7 7,3±0, ,0±0,1 23,2±0,3 45,0±0,8 1,2±0,3 24,1±0,0 42,8±0,0 6,7±0,5 T. elegans ,4±0,2 43,9±1,2 35,4±1,0 3,0±0,0 35,0±1,0 ΔΠ 7,1±0,0 CCF ,4±0,2 46,3±0,2 33,3±1,5 3,2±0,1 32,4±1,1 36,0±1,0 7,1±0, ,8±0,0 15,7±0,0 27,4±1,1 1,1±0,0 17,5±0,0 42,9±0,0 6,4±0,0 Mucor sp ,7±0,3 15,6±2,4 28,1±0,2 1,6±0,1 20,4±3,0 34,5±0,1 6,9±0,0 LGAM ,4±0,1 22,9±5,2 26,5±0,7 2,0±0,0 19,3±3,3 31,6±0,8 7,0±0,2 Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 2 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 ο C και σε 180 rpm, ph 6, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου 0,5 g/l. Συντομογραφίες: X, g/l- ολική βιομάζα, L/X, %- ποσοστό των ολικών λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας, Glol, g/l- συγκέντρωση γλυκερόλης, log(cell/ml)- δεκαδικός λογάριθμος των βακτηριακών κυττάρων ανά ml καλλιέργειας, ΔΠ- δεν προσδιορίστηκε. 32

33 Στη συνέχεια οι μύκητες M. ramanniana και Τ. elegans καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά υλικά με χαμηλότερο αρχικό ph υπό μη-ασηπτικές συνθήκες, επιτρέποντας με αυτό τον τρόπο την αύξηση των μυκήτων και παρεμποδίζοντας την αύξηση των βακτηρίων. Ποσοτικά δεδομένα για την αύξηση και τη συσσώρευση των στελεχών αυτών καλλιεργούμενων σε θρεπτικό υλικό περιοριστικό ως προς την πηγή αζώτου ( αναλογία C/N~ 111), σε ph5 υπό ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες φαίνονται στον Πίνακα 3.2. Κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες, ενώ και οι δύο μύκητες αυξήθηκαν περίπου το ίδιο, παράγοντας περίπου 4 g/l βιομάζα, ο T. elegans συσσώρευσε υψηλότερο ποσοστό λιπιδίων (42,6% wt/wt επί της ξηρής βιομάζας), παρά το γεγονός ότι η αύξηση των βακτηρίων παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα. Και για τα δύο στελέχη έμειναν ακατανάλωτα περίπου 30 g/l γλυκερόλη. Στέλεχος M. ramanniana MUCL 9235 Πίνακας 3.2: Αύξηση των μυκήτων M. ramanniana και T. elegans σε βιομηχανική γλυκερόλη και συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας σε ph5 υπό ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες. Ασηπτικές Συνθήκες Χρόνος (h) X (g/l) L/X% ,3±0,6 21,9±0,4 36,1±6,0 1,4±0,5 28,3±1,2 6,3±0,0 41,6±1,2 Τ. elegans CCF ,7±0,4 36,1±4,6 32,9±1,7 3,1±0,3 41,6±1,6 6,6±0,1 38,7±0, ,4±0,1 48,6±0,6 30,5±1,0 4,1±0,3 42,5±1,1 6,9±0,0 36,4±1,2 Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 2 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 ο C και σε 180 rpm, ph5, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειικού αμμωνίου 0,5 g/l. Συντομογραφίες: X, g/l- ολική βιομάζα, L/X, %- ποσοστό των ολικών λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας, Glol, g/l- συγκέντρωση γλυκερόλης, log(cell/ml)- δεκαδικός λογάριθμος των βακτηριακών κυττάρων ανά ml καλλιέργειας. Μη-Ασηπτικές Συνθήκες Glol log(cells/ (g/l) X (g/l) L/X% ml) Glol (g/l) ,0±0,8 17,3±0,0 46,6±1,0 1,1±0,8 18,9±0,0 6,5±0,2 44,7±1, ,8±0,6 15,6±1,7 35,3±3,0 3,0±0,4 19,6±1,9 6,5±0,1 35,9±2, ,3±0,0 20,5±0,9 32,7±0,2 3,8±0,7 18,6±3,4 6,5±0,1 34,4±0,4 33

34 Έπειτα, ο μύκητας T. elegans καλλιεργήθηκε σε θρεπτικά υλικά περιοριστικά ως προς την πηγή αζώτου με διαφορετική αναλογία C/N (67,3 και 111,3) και σε ph 4 και 5, υπό ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες (Πίνακας 3.3). Κατά τις μη ασηπτικές συνθήκες, η μέγιστη συσσώρευση των λιπιδίων ήταν 48,7% επί της ξηρής βιομάζας και παρατηρήθηκε όταν ο μύκητας T. elegans καλλιεργήθηκε στο θρεπτικό υλικό με ph5 και C/N αναλογία ~67,3, παρόλο που η αύξηση του μύκητα ήταν σημαντικά μικρότερη από αυτήν κατά τις ασηπτικές συνθήκες. ph C/N 4 5 Πίνακας 3.3: Αύξηση του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε βιομηχανική γλυκερόλη και αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου 0,5 και 1 g/l, σε ph4 και 5, υπό ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες. Χρόνος (h) Ασηπτικές συνθήκες X (g/l) L/X% ,0±0,4 17,1±4,2 37,28±1,1 1,1±0,4 25,4±4,6 44,79±0,9 6,0±0,1 111, ,9±0,4 26,2±4,4 39,60±4,1 3,2±0,3 38,3±4,3 36,79±1,8 6,3±0, ,3±0,1 50,5±0,3 ΔΠ 4,3±0,3 45,8±0,5 30,12±2,7 6,8±0, ,9±0,3 35,0±10,1 36,28±1,1 1,4±0,5 30,5±5,7 38,43±4,2 5,7±0,3 67, ,4±1,2 29,0±7,4 25,60±4,6 3,5±0,3 27,6±0,4 31,33±0,7 5,7±0, ,4±0,8 39,3±5,4 15,73±1,9 6,0±0,9 19,0±2,5 23,90±3,9 6,0±0, ,3±0,6 21,9±0,4 46,55±1,0 1,4±0,5 28,3±1,2 44,65±1,8 6,3±0,0 111, ,7±0,4 36,1±4,6 35,27±2,6 3,1±0,3 41,6±1,6 35,89±2,7 6,6±0, ,6±0,1 51,3±2,1 31,13±1,7 4,2±0,2 43,8±0,2 34,44±0,3 6,9±0, ,7±0,7 24,6±6,9 42,57±0,0 1,2±0,4 24,7±5,8 21,60±0,1 6,8±0,2 67, ,8±1,4 34,9±6,4 30,55±7,4 3,1±0,2 33,9±6,5 22,39±3,1 7,2±0, ,3±0,0 52,0±1,5 15,85±0,5 3,2±0,2 48,7±3,7 12,46±0,1 7,3±0,1 Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 2 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 ο C και σε 180 rpm, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου 0,5 και 1g/l. Συντομογραφίες: X, g/l- ολική βιομάζα, L/X, %- ποσοστό των ολικών λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας, Glol, g/l- συγκέντρωση γλυκερόλης, log(cell/ml)- δεκαδικός λογάριθμος των βακτηριακών κυττάρων ανά ml καλλιέργειας. Glol (g/l) Μη-Ασηπτικές Συνθήκες X (g/l) L/X% Glol (g/l) log(cells /ml) 34

35 3.2. Καλλιέργεια του μύκητα Thamnidium elegans σε θρεπτικό υλικό που περιέχει διάφορες αντιβακτηριακές ουσίες. Στον Πίνακα 3.4 φαίνεται η επίδραση του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού στην αύξηση και στην συσσώρευση λιπιδίων του μύκητα T. elegans και στην αύξηση των βακτηρίων κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες όταν ο μύκητας T. elegans καλλιεργήθηκε υπό ασηπτικές και μη-ασηπτικές συνθήκες σε θρεπτικά υλικά που περιείχαν από 0-1 g/l αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού. Από τα αποτελέσματα του Πίνακα 3.4 φαίνεται ότι ο μύκητας είχε τη βέλτιστη αύξηση κατά τις μη ασηπτικές συνθήκες όταν στο θρεπτικό υλικό προστέθηκε 0,5 g/l αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού ενώ η Εικόνα 3.1 δείχνει την κινητική αύξησης της ολικής βιομάζας (Χ, g/l), της συσσώρευσης των λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας (L/X, %), της κατανάλωσης της γλυκερόλης (Glol, g/l) και της αύξησης των βακτηρίων ( log(cells/ml)) του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε θρεπτικό υλικό με 0,5 g/l αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού υπό μηασηπτικές συνθήκες. Στην περίπτωση αυτή, η αύξηση του μύκητα ήταν 4,1 g/l, περίπου 50% μικρότερη από την αντίστοιχη κατά τις ασηπτικές συνθήκες (Βλ. Παράρτημα, Εικόνα 7.1) και η αύξηση των βακτηρίων δεν παρεμποδίστηκε από την παρουσία του αιθέριου ελαίου. Ωστόσο, κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες, η συσσώρευση των λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας παρέμεινε υψηλή, φτάνοντας τα 52,4% wt/wt επί της ξηρής βιομάζας. 35

36 Πίνακας 3.4: Αύξηση του μύκητα T. elegans και συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας σε θρεπτικό που περιέχει βιομηχανική γλυκερόλη και αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού υπό μη-ασηπτικές συνθήκες. Μη-Ασηπτικές Συνθήκες Χρόνος (h) Α.Ε.Π. (g/l) X (g/l) L/X% Glol (g/l) log(cells/ ml) 0 2,2±0,7 23,2±4,3 23,6±1,9 7,0±0,0 0,5 1,5±0,2 27,5±0,6 35,6±0,0 7,3±0,0 1 1,0±0,0 40,1±0,0 27,9±0,0 7,5±0,0 0 3,4±0,0 45,0±0,0 12,4±0,0 7,2±0,0 0,5 4,1±0,0 48,3±0,0 22,4±0,0 7,4±0,0 1 0,9 ±0,0 52,4±0,0 14,5±0,0 7,4±0,0 Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 2 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 ο C και σε 180 rpm, ph5, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου 1 g/l, αρχικές συγκεντρώσεις Α.Ε.Π. 0-5 g/l. Συντομογραφίες: X, g/l- ολική βιομάζα, L/X, %- ποσοστό των ολικών λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας, Glol, g/l- συγκέντρωση γλυκερόλης, log(cell/ml)- δεκαδικός λογάριθμος των βακτηριακών κυττάρων ανά ml καλλιέργειας, ΔΑ- δεν ανιχνεύτηκε, Α.Ε.Π.- αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού. 36

37 Εικόνα 3.1: Κινητική της αύξησης της ολικής βιομάζας (Χ, g/l), της συσσώρευσης των ολικών λιπιδίων (L/X, %) και της κατανάλωσης της γλυκερόλης (Glol, g/l) του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε βιομηχανική γλυκερόλη και αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού και κινητική της αύξησης των βακτηρίων εκφρασμένης σε log(cells/ml) υπό μη-ασηπτικές συνθήκες. Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 2 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 o C και σε 180 rpm, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου 1 g/l, ph5, αρχική συγκέντρωση Α.Ε.Π. 0,5 g/l. Οι Εικόνες 3.2 & 3.3 δείχνουν κινητικές της αύξησης, της συσσώρευσης λιπιδίων και της κατανάλωσης της γλυκερόλης του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου υπό μη-ασηπτικές συνθήκες σε θρεπτικό υλικό που περιείχε 0,03 g/l αιθέριο έλαιο θυμαριού. Όταν οι καλλιέργειες εμβολιάστηκαν με 4 ml εναιωρήματος σπορίων του μύκητα (Εικόνα 3.2), η παραγόμενη βιομάζα ήταν 4,4 g/l και η συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας ήταν 42,6%. Με την αύξηση του όγκου του εμβολίου του μύκητα, από 4 σε 8 ml (Εικόνα 3.3), η αύξηση του μύκητα ήταν 4,8 g/l και η συσσώρευση των λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας ήταν 33,1%. Σε αντίστοιχα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες (Βλ. Παράρτημα, Εικόνα 7.2 & 7.3), η παραγόμενη βιομάζα ήταν κατά περίπου 35% υψηλότερη, συγκρινόμενη με αυτήν κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες. 37

38 Εικόνα 3.2: Κινητική της αύξησης της ολικής βιομάζα; (X, g/l), της συσσώρευσης των ολικών λιπιδίων (L/X, %) και της κατανάλωσης της γλυκερόλης (Glol, g/l) του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε βιομηχανική γλυκερόλη και αιθέριο έλαιο θυμαριού και κινητική της αύξησης των βακτηρίων εκφρασμένης σε log(cells/ml) υπό μη-ασηπτικές συνθήκες. Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 4 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 o C και σε 180 rpm, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου 1 g/l, ph5, αρχική συγκέντρωση A.Ε.Θ. 0,03 g/l. 38

39 Εικόνα 3.3: Κινητική της αύξησης της ολικής βιομάζα (X, g/l), της συσσώρευσης των ολικών λιπιδίων (L/X, %) και της κατανάλωσης της γλυκερόλης (Glol, g/l) του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε βιομηχανική γλυκερόλη και αιθέριο έλαιο θυμαριού και κινητική της αύξησης των βακτηρίων εκφρασμένης σε log(cells/ml) υπό μη-ασηπτικές συνθήκες. Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 8 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 o C και σε 180 rpm, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειικού αμμωνίου 1 g/l, ph5, αρχική συγκέντρωση A.Ε.Θ. 0,03 g/l. Στη συνέχεια, με σκοπό την παρεμπόδιση της αύξησης των βακτηρίων, ο μύκητας T. elegans καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υλικό που περιείχε ως αντιβακτηριακές ουσίες αιθέριο έλαιο θυμαριού (0,008 g/l) και μίγμα αντιβιοτικών (αμπικιλλίνη και χρωραμφενικόλη, 0,003 g/l) υπό μη-ασηπτικές συνθήκες και η κινητική της αύξησης του μύκητα, της συσσώρευσης των λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας, της κατανάλωσης της γλυκερόλης και της αύξησης των βακτηρίων κατά τις μη-ασηπτικές συνθήκες καλλιέργειας φαίνονται στην Εικόνα 3.4. H μέγιστη τιμή της βιομάζας του μύκητα ήταν 7,9 g/l και η συσσώρευση των λιπιδίων ήταν 31,5% επί της ξηρής βιομάζας, ενώ η αύξηση των βακτηρίων παρέμεινε σταθερή μέχρι το τέλος της καλλιέργειας. Παρόμοια αύξηση και συσσώρευση λιπιδίων παρατηρήθηκε όταν ο μύκητας καλλιεργήθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες ( Βλ. Παράρτημα, Εικόνα 7.4). 39

40 Εικόνα 3.4: Κινητική της αύξησης της ολικής βιομάζας (X, g/l), της συσσώρευσης των ολικών λιπιδίων ( L/X, %) και της κατανάλωσης της γλυκερόλης ( Glol, g/l) του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε βιομηχανική γλυκερόλη, αιθέριο έλαιο θυμαριού και μίγμα αντιβιοτικών υπό μη-ασηπτικές συνθήκες. Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 8 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 o C και σε 180 rpm, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 50 g/l, αρχική συγκέντρωση θειικού αμμωνίου 1 g/l, ph5, αρχική συγκέντρωση Α.Ε.Θ. 0,008 g/l, αρχική συγκέντρωση αμπικιλλίνης 0,03 g/l, αρχική συγκέντρωση χλωραμφενικόλης 0,03 g/l. Επιπροσθέτως, στοχεύοντας στην αύξηση του μύκητα αλλά και στη βελτιστοποίηση της συσσώρευσης των λιπιδίων του, πραγματοποιήθηκαν επιπλέον πειράματα, κατά τα οποία η σύνθεση της βιομάζας πραγματοποιήθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες (οι φιάλες περιείχαν θρεπτικό υλικό με μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας 35 g/l βιομηχανική γλυκερόλη και εμβολιάστηκαν με 4 ml εναιώρημα σπορίων του μύκητα Τ. elegans). Ύστερα από 120 h καλλιέργειας, μη αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό που περιείχε 200 g/l βιομηχανική γλυκερόλη και 0,03 g/l αιθέριο έλαιο θυμαριού προστέθηκε στις φιάλες. Στην Εικόνα 3.5 φαίνεται η κινητική της αύξησης του μύκητα, της συσσώρευσης των λιπιδίων του και της κατανάλωσης της γλυκερόλης. Στο τέλος της επώασης η αύξηση του μύκητα ήταν 8,2 g/l και η συσσώρευση των λιπιδίων του επί της ξηρής βιομάζας ήταν 48,4%. 40

41 Εικόνα 3.5: Κινητική της αύξησης της ολικής βιομάζας ( X, g/l), της συσσώρευσης των ολικών λιπιδίων ( L/X, %) και της κατανάλωσης της γλυκερόλης του μύκητα T. elegans καλλιεργούμενου σε βιομηχανική γλυκερόλη και αιθέριο έλαιο θυμαριού σε μία διεργασία δύο σταδίων, υπό ασηπτικές (1 ο στάδιο) και μη-ασηπτικές συνθήκες (2 ο στάδιο). Συνθήκες καλλιέργειας: αύξηση σε 250 ml κωνικές φιάλες που περιείχαν 50 ml αποστειρωμένου θρεπτικού υλικού και εμβολιάστηκαν με 4 ml εναιωρήματος σπορίων, επώαση σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο στους 28 ο C και σε 180 rpm για 120 h υπό ασηπτικές συνθήκες, αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 35 g/l, αρχική συγκέντρωση θειικού αμμωνίου 2 g/l, αρχική συγκέντρωση εκχυλίσματος ζύμης 1 g/l, έπειτα από τις 120 h καλλιέργειας οι ασηπτικές συνθήκες μετατράπηκαν σε μη ασηπτικές με την προσθήκη 50 ml μη αποστειρωμένου θρεπτικού υλικού που περιείχε 200 g/l βιομηχανική γλυκερόλη και 0,03 g/l Α.Ε.Θ Καλλιέργεια του μύκητα Thamnidium elegans σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας υπό μη-ασηπτικές συνθήκες. Η Εικόνα 3.6 δείχνει την κινητική αύξησης της ολικής βιομάζας, της συσσώρευσης των λιπιδίων, την κατανάλωση της γλυκερόλης και την αύξηση των βακτηρίων, όταν ο μύκητας Τ. elegans καλλιεργήθηκε υπό μη-ασηπτικές συνθήκες, υπό την παρουσία αιθέριου ελαίου θυμαριού (0,03 g/l) ως αντιβακτηριακή ουσία σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας. Το αρχικό ph της καλλιέργειας ήταν 5 και μετά το πέρας 24 h της αύξησης, ρυθμίστηκε στο 4, με στόχο να περιοριστεί η αύξηση των βακτηρίων. Υπό αυτές τις συνθήκες, η μέγιστη τιμή της βιομάζας ήταν 41