Βιοχημεία ΙΙ. 1. Stryer 2. Lehniger Wikipedia!!!!

Transcript

1 Βιοχημεία ΙΙ 1. Stryer 2. Lehniger Wikipedia!!!! 1

2 Η πορεία του μαθήματος Μέρος 1 ο Ροή και ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας DNA RNA Πρωτείνες ες 1. Μεταγραφή Κ28 2. Μετάφραση Κ29 5. Βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων K25 4. Αντιγραφή και επιδιόρθωση DNA, Κ27 3. Γονιδιακή Ρύθμιση Κ31 Μέρος 2 ο Απόκριση στο περιβάλλον-μηχανισμοί σηματοδότησης 6. Μοριακή σηματοδότηση Κ15 7. Μεμβράνες Κ12 8. Μεμβρανική μεταφορά Κ Αισθητικά συστήματα K Ολοκλήρωση μεταβολισμού μ K30 9. Βιογένεση μεμβρανικών λιπιδίων K26 2

3 K. 28 RNA Transcription and Splicing 3

4 Σύνθεση RNA Μεταγραφή Η διεργασία μεταφοράς- μεταγραφής της αλληλουχίας DNA σε αλληλουχία RNA Κομβικό σημείο ρύθμισης της γενετικής πληροφορίας (Εξηγείστε!!!!)???? 4 RNA structure

5 Η αλληλουχία DNA δεν περιέχει μόνο πληροφορία για πρωτεϊνικές δομές. Προσδίδει και στο RNA τρισδιάστατη δομή και λειτουργικότητα, (trnas, rrnas, snrnas..) 5 Θυμηθείτε DNA vs RNA!!!

6 DNA vs RNA DNA RNA Πυρηνικό DNA Μιτοχονδριακό DNA mrna: αγγελιοφόρο trna: μεταφορικό DNA χλωροπλαστών rrna: ριβοσωμικό..κλπλ Το DNA δεν εγκαταλείπει Το RNA συντίθεται και ποτέ το οργανίδιο στο οποίο ανήκει (πυρήνας, μιτοχόνδριο κλπ) Συντίθεται (αντιγράφεται) κατά την S φάση του κυτταρικού κύκλου Σταθερότητα ωριμάζει στον πυρήνα και μετακινείται στο κυτταρόπλασμα Συντίθεται ανεξάρτητα του κυτταρικού κύκλου Νουκλεόλυση στο κυτταρόπλασμα /πυρήνα DNA: Δεόξυ-ριβόζη, Θυμίνη (T) RNA: Ριβόζη, Ουρακίλη (U) 6 Ρυθμός μεταγραφής

7 Η αλληλουχία DNA καθορίζει όχι μόνο τη δομή (RNA/πρωτείνη), αλλά και τον ρυθμό μεταγραφής μέσω Cis - στοιχείων στους υποκινητές/προαγωγούς 7 Ποιος συνθέτει RNA?

8 1. Η σύνθεση RNA καταλύεται από RNA πολυμεράσες, που, πολυμερίζουν ριβονουκλεοτίδια με επεξεργασημότητα/συνέχεια / H RNA πολυμεράση δεν χρειάζεται εκκινητή (primer) 8 Συντήρηση

9 Παρά τις διαφορές στις «συνοδευτικές ς υπομονάδες»,, η κεντρική δομή της προκαρυωτικής και ευκαρυωτικής RNA πολυμεράσης είναι συντηρημένη Ο πυρήνας του ενζύμου συνίσταται από τις υπομονάδες α, β, β που συγκροτούνται με τη στοιχειομετρία: α2 β β. Μια επιπλέον υπομονάδα, η «σ» συμβάλλει στην αναγνώριση του προαγωγού. 9 Ποια η θεμελιώδης αντίδραση σύνθεσης RNA?

10 Η θεμελιώδης αντίδραση σύνθεσης RNA H P H P H P H 5 N N N NH NH 2 1ο ΝΤΡ 3 H H NH H P H P H P H 5 N 2ο ΝΤΡ H H H P H P H P H 5 N N NH N NH 2 Ένα ιόν Mg++ παραμένει συνδεδεμένο με το ένζυμο, ενώ ένα δεύτερο εισέρχεται με τον τριφωσφoρικό νουκλεοζίτη και αποχωρεί με το πυροφωσφoρικό H P H H H H P H H P H P H H H H P N H 3 P P P H H H H H 5 NH Δινουκλεοτίδιο NH 2 N N 3ο ΝΤΡ Προαγωγός Πυροφωσφατάση: η αντίδραση καθίσταται Μη αντιστρεπτή (ευνοείται θερμοδυναμικά) H H 10

11 2. H RNA πολυμεράση αρχίζει να μεταγράφει με ακρίβεια σε συγκεκριμένα σημεία που καθορίζονται από-και περιέχονται σε ειδικές αλληλουχίες DNA που προηγούνται των γονιδίων (προαγωγός-promoter, cis-στοιχεία). Τμήμα E. Coli DNA Κωδική περιοχή Coding region RNA γονίδιο 2 3 γονίδιο γονίδιο γονίδιο προαγωγέας promoter RNA Κλώνος-εκμαγείο RNA

12 Αλληλουχία προκαρυωτικού προαγωγέα Στοίχιση πολλαπλών αλληλουχιών αποκαλύπτει αλύ τον προκαρυωτικό προαγωγό (Promoter, cisστοιχεία) ) RNA γονίδιο 2 3 γονίδιο γονίδιο γονίδιο RNA RNA 12 Footprinting

13 Οι τεχνικές α) της ηλεκτροφορητικής υστέρησης (gel retardation/ mobility shift), και β) της αποτύπωσης (footprinting) αποκαλύπτουν την ειδική δέσμευση πρωτεϊνών (trans-παράγοντες) σε συγκεκριμένη αλληλουχία DNA α) β) + Κd Συσχετίστε τη συγγένεια δέσμευσης in vitro με την και «ισχύ» του προαγωγού in vivo 13 Ποιός αναγνωρίζει τον προαγωγό? σ

14 Ο προαγωγός αναγνωρίζεται απο την υπομονάδα «σ» Το ολοένζυμο της βακτηριακής RNA πολυμεράσης συγκροτείται από τις υπομονάδες α, β, β και σ με τη στοιχειομετρία: α 2 β β σ. Διαφορετικές περιοχές της υπομονάδας σ δεσμεύονται στις αλληλουχίες -10 και -35 οδηγώντας το ολοένζυμο στη σωστή θέση έναρξης Η υπομονάδα σ αποδεσμεύεται από το ολοένζυμο μετά τη σύνθεση 9-10n και επανασυνδέεται σε νέο ολοένζυμο Η υπομονάδα «σ» δρά καταλυτικά, ενώ το ολοένζυμο δρά με επεξεργαστικότητα!!! 14 σ70, σ32, σ54

15 Εναλλακτικές υπομονάδες «σ», σ 70, σ 32, σ 54, χρησιμοποιούνται σε ιδιαίτερες κατηγορίες προαγωγών που περιέχουν διαφορετικά cis- στοιχεία και αποκρίνονται σε φυσιολογικώς διακριτά ερεθίσματα σ 70 σ 32 σ 54 Στοιχίστε τις σ70, σ32, σ54!!!! 15 φυσαλίδα μεταγραφής

16 4. Ξετύλιγμα του DNA και μεταγραφική επιμήκυνση Α) Η RNA πολυμεράση ξετυλίγει ~17 ζεύγη βάσεων του DNA και η φυσαλίδα μεταγραφής που σχηματίζεται μετακινείται προς το 3 του κωδικεύοντος κλώνου ΟΗ Β) Πολυμερίζει ~50 n/sec (200 φορές αργότερα από την DNA πολυμεράση), με πιστότητα ~1:10 4 λάθη (10 5 περισσότερα από την DNA πολυμεράση) Γ) Στερείται εξο-νουκλεολυτικής / διορθωτικής δράσης!! 16 τερματισμός

17 5. Οι μεταγραφόμενη περιοχή του εκμαγείου DNA προσδίδει στο RNA, προσοχή στο RNA!!!, σήματα τερματισμού Α. Η απλούστερη περιοχή τερματισμού είναι παλίνδρομη GC περιοχή που σχηματίζει δίκλωνη δομή ακολουθούμενη από ΑU περιοχή Η πρωτείνη nusa δεσμεύεται στη δίκλωνη δομή και παύει προσωρινά το σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών Το υβρίδιο RNA-DNA διασπάται (λόγω της ΑU περιοχής?) και η δίκλωνη δομή του DNA αποκαθίσταται Η Η RNA πολυμεράση απελευθερώνεται από το DNA 17 Τι είναι η πρωτεΐνη ρ?

18 Β. Μηχανισμός τερματισμού της μεταγραφής από την εξαμερή πρωτεΐνη ρ Η εξαμερής ρ κινείται στο νεοσυντιθέμενο RNA Όταν πλησιάσει τη φυσαλίδα μεταγραφής δρα ως RNA-DNA ελικάση και διασπά το υβρίδιο RNA-DNA Περιέχει περιοχή πρόσδεσης στο RNA και περιοχή υδρόλυσης ΑΤΡ Τα λειτουργικά σήματα τερματισμού βρίσκονται και αναγνωρίζονται στο νέο-συντιθέμενο RNA και όχι στο DNA!! 18 Κύκλος μεταγραφής

19 Προαγωγός Κύκλος προκαρυωτικής μεταγραφής 19 Τροποποιήσεις

20 Στους προκαρυώτες, τα πρόδρομα μόρια του trna και rrna διασπώνται και τροποποιούνται χημικά, σε αντίθεση με τα mrnas που μεταφράζονται καθώς μεταγράφονται Πρωτογενές μεταγράφημα rrna και trna στην E. coli Η Ριβονουκλεάση ΙΙΙ υδρολύει το πρωτογενές RNA σε 16S, 23S και 5S rrna (ενδο-) Η Ριβονουκλεάση Ρ δημιουργεί το σωστό 5 - άκρο στα πρόδρομα trnas (περιέχει καταλυτικά ενεργό μόριο RNA-Ριβοένζυμο) ζ Altman and Cech, Nobel Prize in Chemistry, 1989 ) Tροποποίηση βάσεων και ριβόζης στο rrna Προσθήκη CCA στο 3 άκρο των trnas 20 Αντιβιοτικά

21 Άναστολείς της προκαρυωτικής ρ μεταγραφής ως αντιβιοτικά Ριφαμπικίνη (Streptomyces) : αναστέλλει το σχηματισμό των 1-2 πρώτων φωσφοδιεστερικών δεσμών φράσσοντας τον δίαυλο που περνάει το DNA-RNA υβρίδιο Ανθεκτικές μεταλλάξεις στην β υπομονάδα εξασθενούν την δέσμευση ριφαμπικίνης στην RNA πολυμεράση. Ακτινομυκίνη D (Streptomyces) : παρεμβολή στο δίκλωνο DNA (interacalation) αναστολή μεταγραφικής επιμήκυνσης 21 Σύνοψη προκ. μεταγραφής Το πρώτο αντιβιοτικό με αντικαρκινική δράση

22 Χαρακτηριστικά της προκαρυωτικής μεταγραφής 1. H RNA πολυμεράση αναγνωρίζει με ακρίβεια μέσω της υπομονάδας «σ» συγκεκριμένα σημεία μεταγραφικής έναρξης (προαγωγός-cis-στοιχεία). 2. Η RNA πολυμεράση ξετυλίγει το εκμαγείο DNA (φυσαλίδα μεταγραφής) και πολυμερίζει ριβονουκλεοτίδια με επεξεργασιμότητα Ο πολυμερισμός συνίσται σε πυρηνόφιλη προσβολή του 5 α-ρ του νεοεισερχόμενου ε ο νουκλεοτιδίου από την 3 -ΟΗ του προηγούμενου ού ο 4. H RNA πολυμεράση αποσυνδέεται από το DNA από διεργασίες που προκαλούνται από αλληλουχίες τερματισμού στο RNA που συντίθεται Η συχνότητα της μεταγραφικής έναρξης από τη RNA πολυμεράση μπορεί να ελέγχεται, δηλ. να ενεργοποιείται ή να καταστέλλεται από trans μεταγραφικούς παράγοντες που δεσμεύονται σε παραπλήσιες cis- αλληλουχίες 22 eukaryotes

23 Μεταγραφή σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς Βασικές διαφορές ευκαρυωτικής και προκαρυωτικής μεταγραφής 23 Τοπικός διαχωρισμός

24 1. Η ευκαρυωτική μεταγραφή και μετάφραση είναι τοπικά διαχωρισμένες Συζευγμένη ρύθμιση Μεταγραφής μετάφρασης Διαφορετικές δυνατότητες ρύθμισης κατά την επεξεργασία και μεταφορά!!! 24 μονοκιστρονικά

25 2. Τα ευκαρυωτικά mrnas είναι μονο-κιστρονικά 25 Pol I, II, III

26 3. Η ευκαρυωτική μεταγραφή πραγματοποιείται από τρείς RNA πολυμεράσες, RNA pol I, II, III, που διακρίνονται μεταξύ τους λειτουργικά, τοπολογικά και φαρμακολογικά: Θυμηθείτε!!!! H Pol II είναι μοναδική ως προs την επαναλαμβανόμενη καρβοξυ τελική αλληλουχία (CTD): (YSPTSPS)n, που υπόκειται σε ρυθμιστικές φωσφορυλιώσεις Cis TATA Κυκλικό 8-πεπτίδιο 26

27 4. Η κάθε RNA πολυμεράση (Ι, ΙΙ ή ΙΙΙ) αναγνωρίζει γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες που δεσμεύονται ειδικά σε cis στοιχεία στους αντίστοιχους προαγωγούς Προαγωγοί τύπου ΙΙ περιέχουν το στοιχείο ΤΑΤΑΑ που αναγνωρίζεται από την πρωτείνη ΤΒP (TFIID), ενώ έπεται η δέσμευση του TFIIB ng Bendin 27 ΤFIIE TFIIH

28 5. Η RNA pol II με δεσμεύεται στον προαγωγό σε συνδυασμό με γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες TFIIB ΤΒP TFIID 28 P- CTD crearance

29 ..και απο-δεσμεύεται από αυτούς κινούμενη πρός το 3 άκρο του γονιδίου CTD Phosphorylation 29 Trans ενεργοποιητές

30 6. Απομακρυσμένες cis ρυθμιστικές θέσεις (enhancers) αναγνωρίζονται από trans μεταγραφικούς ενεργοποιητές που διεγείρουν τη μεταγραφική έναρξη αλληλεπιδρώντας λ με τη «μεταγραφική ή συσκευή» 30 Ωρίμανση

31 7. Τα ευκαρυωτικά μεταγραφήματα υφίστανται ποικίλες τροποποιήσεις Ωρίμανση του RNA RNA Processing 31

32 Τα μεταγραφήματα και των τριων ευκαρυωτικών πολυμερασών υφίστανται ειδική επεξεργασία α. Τα προ-trnas υπόκεινται σε: Απομάκρυνση αλληλουχίας οδηγού (leader) Εκτομή ιντρονίου (splicing) Aντικατάσταση της 3 αλληλουχίας από την αλληλουχία CCA 45S 32

33 β. Το ευκαρυωτικό πρόδρομο rrna (45S) υφίσταται υδρόλυση και χημικές τροποποήσεις βάσεων 33 cap

34 γ. Τα ευκαρυωτικά πρωτογενή mrnas, σε αντίθεση με τα προκαρυωτικά, αποκτούν ένα 5 -κάλυμμα/cap και μια 3 -πολυ-α ουρά 34

35 5 -κάλυμμα (cap) 7-Me G συνδεδεμένη με το πρώτο νουκλεοτίδιο του RNA μέσω 5-5 τριφωσφορικού δεσμού 35

36 Πώς προστίθεται το κάλυμμα?? 1. Υδρόλυση της γ- φωσφορικής ομάδας 2. Προσθήκη G μέσω 5-5 τριφωσφορικού δεσμού 3. Μεθυλίωση του Ν7 G 4. Ρίβο-μεθυλίωση Ποιος ο ρόλος του καλύμματος?? 36 poly Α

37 δ. Το 3 άκρο των ευκαρυωτικών πρo-mrnas υδρολύεται και κατόπιν προστίθεται αλληλουχία πολυ(α) Ποιος ο ρόλος της πολυ-αδενυλίωσης?? RNA decay 37 κορδιισεπίνη

38 Η κορδισεπίνη (3 -δεοξυαδενοσίνη) αναστέλλει τη σύνθεση πολυ(α) σε χαμηλές συγκεντρώσεις και τη σύνθεση RNA σε υψηλές συγκεντρώσεις 38 Σύνοψη

39 Βασικές διαφορές ευκαρυωτικής και προκαρυωτικής μεταγραφής Η ευκαρυωτική μεταγραφή και μετάφραση είναι διαχωρισμένες τοπικά και χρονικά, και τα ευκαρυωτικά mrnas είναι μονοκιστρονικά. Η ευκαρυωτική μεταγραφή πραγματοποιείται από τρείς διακριτές RNA πολυμεράσες RNA pol I, II, III με πολλαπλές συνοδευτικές υπομονάδες και γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Οι ευκαρυωτικοί προαγωγοί φέρουν πολλαπλά cis ρυθμιστικές στοιχεία που αναγνωρίζονται από αντίστοιχους trans μεταγραφικούς παράγοντες. Τα μεταγραφήματα και των τριων ευκαρυωτικών πολυμερασών υπόκεινται, σύγχρονα με τη μεταγραφή, σε τροποποιήσεις : προσθήκη 5 - κάλυμματος/cap, προσθήκη 3 -πολυ-α, και εκτομή ιντρονίων/μάτισμα, 39 splicing

40 Μάτισμα του RNA RNA splicing 40 εξόνια και τα ιντρόνια

41 Εξόνια και ιντρόνια Όλα σχεδόν τα ευκαρυωτικά γονίδια αποτελούνται από εναλλασσόμενες αλληλουχίες εξονίων και ιντρονίων Πρωτείνη L S T G M Ώριμο mrna Μετάφραση ATG CTA CGG AGG ACA GCA Πρωτογενές Μεταγράφημα Μάτισμα ATG CTA CGG // ---AG GUAAGUGATAACTAA--//--TCAG G ACA GCA --- // -- DNA Μεταγραφή ~50bp-10kbp 41 εναλλακτικό μάτισμα

42 Εναλλακτικό μάτισμα Διαφορετικοί συνδυασμοί θέσεων ματίσματος μπορεί να δημιουργούν πρωτεϊνικά προϊόντα με διαφοροποιημένη δομή, λειτουργία και συχνά, ιστο-ειδικότητα Πρωτογενές Μεταγράφημα mrna 1 μύες mrna 2 εγκέφαλος mrna 3 ήπαρ 42 Tί καθορίζει τις ακριβείς θέσεις ματίσματος??

43 Οι θέσεις ματίσματος καθορίζονται από «ομόφωνες» αλληλουχίες Κάθε ιντρόνιο αρχίζει με GU και τελειώνει σε AG Το προηγούμενο εξόνιο τελειώνει με AG και το επόμενο αρχίζει με G n από την θέση ματίσματος 3 βρίσκεται η θέση διακλάδωσης (Α) Ώριμο mrna Πρωτογενές Μεταγράφημα ATG CTA CGG AGG ACA GCA Μάτισμα ATG CTA CGG // ---AG GUAAGUG----/ //----YNYRAΥΥΥ----ΥΥΝCAG ΥΥΝCAG G ACA GCA --- // -- ~20-50n Θέση διακλάδωσης Θέση ματίσματος 5 Θέση ματίσματος 3 Eκτροπές ματίσματος που προκαλούνται από μεταλλάξεις ευθύνονται για γενετικές ασθένειες (~15%) 43 Με ποιό μηχανισμό ματίζεται ένα πρόδρομο mrna?

44 Μηχανισμός ματίσματος Δύο τρανσ εστεροποιήσεις!!! Αντίδραση τρανσ-εστεροποίησης 44 1η τρανσ-εστεροποίηση

45 1η αντίδραση τρανσ-εστεροποίησης 1η Η 2-ΟΗ της Α-διακλάδωσης εστεροποιείται με την Ρ ομάδα της 5 θέσης ματίσματος δημιουργώντας έναν νέο 2-5 φωσφοδιεστερικό δεσμό και ένα νέο ελεύθερο 3 ΟΗ στο άκρο του ανοδικού εξονίου 45

46 2η αντίδραση τρανσ-εστεροποίησης 2η Το ελεύθερο 3 ΟΗ στο άκρο του ανοδικού εξονίου εστεροποιείται με την Ρ της 3 θέσης ματίσματος δημιουργώντας έναν νέο 3-5 φωσφοδιεστερικό δεσμό μεταξύ των δυο εξονίων και έναν ελεύθερο βρόγχο (lariat structure) ιντρονίου. Ποιό το ενεργειακό κόστος της αντίδρασης ματίσματος? 46 Ποια ενζυμική ενεργότητα καταλύει την αντίδραση ματίσματος?

47 Mικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεινικά σωμάτια / snrnps καταλύουν την αντίδραση ματίσματος 1. Το U2 συνδέεται στην διακλάδωση, ενώ το U1 snrna δεσμεύεται και ζευγαρώνει με την 5 θέση ματίσματος: 2. Συγκροτείται το σωμάτιο ματίσματος (Splicesome) : Proteins + U1, U2, U4, U5, U6 snrnas (<300n) 3. Καταλυτική λειτουργία των U6 και U2 snrnas Έκθεση της Α της διακλάδωσης 47

48 Καταλυτικά RNAs 1. Sn RNAs 2. Ριβονουκλεάση P (trna) 3. Αντίστροφη μεταγραφάση Αυτομάτισμα Ένα RNA ματίζει τον εαυτό του χωρίς τη συμβολή πρωτεινών 1. rrna στα tetrahymena 2. mt mrnas στο yeast 4. Ριβόσωμα 48 Co-transcriptional processing

49 Τα mrnas τροποποιούνται ενόσω μεταγράφονται (Capping, poly A, splicing), και ως ριβονουκλεο-πρωτεινικά σύμπλοκα (RNP- υποδοχείς πυρηνικής εξόδου) διαπερνούν τους πυρηνικούς πόρους και οδεύουν προς την μεταφραστική συσκευή 49

50 Ασκήσεις 1-7, σελ , 15, 16, 18, σελ

51 Τα Ιντρόνια μπορεί να προσδίδουν σε γονίδια τεράστια μεγέθη 3 exons, 2000 noucleotides 26 exons, Τεράστια μεγέθη!! 51