ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΣΥΝΕΔΡΙΟΥ: ΕΦΗ ΜΠΟΤΟΥΛΑ

Transcript

1 1

2 ΔΙΟΙΚΗΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ Πρόεδρος: Ψαρρά Κατερίνα Αντιπρόεδρος: Κρούπης Χρήστος Γενικός Γραμματέας: Χαλιάσος Αλέξανδρος Αναπλ. Γεν. Γραμματέας: Σπυροπούλου Διακουμή Παναγιώτα Ταμίας: Μπότουλα Έφη Μέλη: Λόη Βασιλική, Κώνστα Ευγενία ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΣΥΝΕΔΡΙΟΥ: ΕΦΗ ΜΠΟΤΟΥΛΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Πρόεδρος: Κρούπης Χρήστος Μέλη: Βογιατζάκης Ευαγγελος Καράμπαμπα Φωτεινή Καρίκας Γιώργος Καψιμάλη Βιολέττα Κολιάκος Γιώργος Κολιός Γιώργος Λεϊμονή Ειρήνη Λιάκος Παναγιώτης Λιανίδου Ευρύκλεια Μπαϊρακτάρη Ελένη Παπασωτηρίου Ιωάννης Ρίζος Δημήτρης Σπυρόπουλος Βασίλης Σπυροπούλου Παναγιώτα Τσατσάνης Χρήστος Χριστόπουλος Θεόδωρος Ψαχούλια Χριστίνα ΟΡΓΑΝΩΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αθανασιάδης Θεόφιλος Δήμα Κλεάνθη Καρακαλούσος Πέτρος Κώνστα Εύη Λόη Βασιλική Μοίρα Λία Ματσάγγος Σπύρος Ρίζου Μυρτώ 2

3 12 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, Πολεμικό Μουσείο Αθήνα Αγαπητοί Συνάδελφοι Η Ελληνική Εταιρία Κλινικής Χημείας Κλινικής Βιοχημείας, οργανώνει το 12 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, που θα διεξαχθεί στην Αθήνα στο Αμφιθέατρο του Πολεμικού Μουσείου, στις 7 και 8 Νοεμβρίου Το Συνέδριο απευθύνεται σε όλους όσους απασχολούνται σε Διαγνωστικά ή Ερευνητικά Εργαστήρια και Κέντρα, με αντικείμενο την Κλινική Χημεία και γενικότερα την Εργαστηριακή Ιατρική. Σκοπός του Συνεδρίου είναι η παρουσίαση των ερευνητικών δραστηριοτήτων και επιτευγμάτων των συναδέλφων, στα Νοσοκομεία, στα Ερευνητικά Ιδρύματα και στα ΑΕΙ της χώρας μας, καθώς και η συνεχής ενημέρωσή μας, στις σύγχρονες τεχνολογίες και μεθόδους, που αφορούν στην in vitro Διαγνωστική Τεχνολογία. Μέσα από αυτή την παρουσίαση των νεώτερων εξελίξεων, το δημιουργικό διάλογο, τον προβληματισμό και την ανταλλαγή απόψεων, το Συνέδριο φιλοδοξεί να συμβάλει στη δημιουργία μιας σφαιρικής αντίληψης των συναδέλφων, γύρω από τις συνεχώς αναδυόμενες νέες τεχνολογικές και αναλυτικές τάσεις, στο ευρύτερο γνωστικό μας αντικείμενο. Όμως, αυτή πρέπει να συνδυαστεί και με την ανάγκη για περαιτέρω εξειδίκευση, ιδιαίτερα για τους νέους συναδέλφους, που προσπαθούν εντατικά να ενταχθούν και αυτοί, οργανικά και επαγγελματικά, στη σύγχρονη Εργαστηριακή Ιατρική. Σας προσκαλούμε λοιπόν να συμμετέχετε ενεργά, είτε παρουσιάζοντας το επιστημονικό σας έργο, είτε με τη δημιουργική παρουσία σας, συμβάλλοντας έτσι στην επιτυχία του Συνεδρίου. Με εκτίμηση, Η Πρόεδρος Ε. Μπότουλα 3

4 12 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, Πολεμικό Μουσείο Αθήνα Επιστημονικό Πρόγραμμα Πέμπτη 06/11/ :00-22:00 Προσυνεδριακή ημερίδα υπό την αιγίδα του Πανεπιστημίου Αθηνών και της Ελληνικής Εταιρίας Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας στο κτήριο «Κωστής Παλαμάς» (οδός Ακαδημίας 48) «Ημερίδα για τα 20 χρόνια λειτουργίας του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Κλινικής Χημείας του Χημικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών» Παρασκευή, 07/11/ :00-09:30 Εγγραφές 09:30-11:00 Προφορικές ανακοινώσεις Προεδρείο: Ανδριανή Γρηγοράτου, Ελένη Μπαϊρακτάρη ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙΝΟΤΟΜΩΝ REAL-TIME qpcr ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ COL11A1 mrna ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΙΣΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Καραγλάνη Μ., Τούμπουλης Ι., Γούτας Ν., Πουμπουρίδου Ν., Βλαχοδημητρόπουλος Δ., Βασίλαρος Σ., Ρίζος Ι., Κρούπης Χ. mrna ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PALB2 ΚΑΙ ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΟΥ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΟΝ ΣΠΟΡΑΔΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ Πουμπουρίδου N., Acha-Sagredo A., Γούτας N., Βλαχοδημητρόπουλος Δ., Λιανίδου E., Βασίλαρος Σ., Λιλόγλου T., Κρούπης Χ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΕΤΡΑΠΛΗΣ ΠΟΣΟΤΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (RT-qPCR) ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ER, PR, HER-2 ΚΑΙ EGFR ΣΕ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (CTCs) ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ Στρατή A., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E. 4

5 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PIK3CA ΣΤΑ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ Mάρκou A., Φάρκωνα Σ., Σχίζα Χ., Ευσταθίου Α., Κουνέλλη Σ., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E. ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ mirnas ΣΕ CTC, CELL FREE DNA ΚΑΙ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΟΥΣ ΠΡΩΤΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΣΤΑΤΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΜΑΣΤΟΥ Mάρκou A., Zαβρίδου M., Σουρβίνου I., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E. ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ SOX17 ΣΕ CTC, CELL FREE DNA ΚΑΙ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΟΥΣ ΠΡΩΤΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Χειμωνίδου M., Στρατή A., Μαλάμος Ν., Γεωργούλιας Β., Λιανίδου E. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΩΝ mir-155 ΚΑΙ mir-146a ΜΕ ΑΝΔΡΙΚΗ ΥΠΟΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ Δερμιτζάκη Ε., Bobjer J., Κατρινάκη Μ., Rastkhani H., Λυρώνη Κ., Μαργιωρής Α.Ν., Giwercman L.Y., Giwercman A., Τσατσάνης Χ. ΕΠΙΔΡΑΣΗ Zn ΣΤΟ ΛΙΠΙΔΑΙΜΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΠΟΝΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΤΗΝ Ηsp70 ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ 1 H-NMRΛέκκας Π., Κωσταρά Χ., Μπαϊρακτάρη Ε., Δεληγιάννης Ι., Ζερικιώτης Σ., Τζάλλας Χ., Αγγελίδης Χ., Βεζυράκη Π., Καλφακάκου Β. 11:00-11:30 Διάλειμμα - Καφές 11:30-13:30 Στρογγυλό Τραπέζι «Αναδυόμενες νέες και παλιές λοιμώξεις» Προεδρείο: Ευάγγελος Βογιατζάκης, Παναγιώτα Σπυροπούλου Ιός Ebola Σωτήρης Τσιόδρας Μοριακή διάγνωση φυματίωσης και γονοτυπικός έλεγχος αντοχής στα αντιφυματικά φάρμακα Παναγιώτης Ιωαννίδης Νέα δεδομένα για τον ιό MERS Σιμόνα Καράμπελα Ιός West Nile Βασίλειος Ζευγώλης 13:30-15:00 Μεσημεριανή Διακοπή Ελαφρύ γεύμα 15:00-17:00 Στρογγυλό Τραπέζι «Μοριακή Διαγνωστική» Προεδρείο: Χρήστος Κρούπης, Ευρύκλεια Λιανίδου Next Generation Sequencing Αγγελική Απέσσου Non-Invasive Prenatal Diagnostics (NIPD) Φένια Τσόπλου Ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων στον καρκινικό ιστό και επιλογή στοχευμένης θεραπείας Γεώργιος Νασιούλας 5

6 Υγρή Βιοψία: Κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα, κυκλοφορούν DNA, κυκλοφορούντα mirnas: το τέλος της βιοψίας? Εφαρμογές και προβληματισμοί Ευρύκλεια Λιανίδου 17:00-17:45 Δορυφορική Διάλεξη με την ευγενική χορηγία της Εταιρείας LERIVA Προεδρείο: Ευγενία Κώνστα, Ανδρέας Κολιοπάνος Αυτοματοποίηση στο σύγχρονο κλινικό εργαστήριο Ιωάννης Βαμβουκάκης 17:45-18:15 Διάλειμμα Καφές 18:15-18:30 Έναρξη Χαιρετισμοί Προεδρείο: Κατερίνα Ψαρρά, Έφη Μπότουλα 18:30-18:45 Ομιλία Αφιέρωμα στη ζωή και το έργο του καθηγητή Κ. Σεφεριάδη Ελένη Μπαϊρακτάρη 18:45-19:30 Εναρκτήρια Ομιλία Προεδρείο: Bernard Gouget, Αλέξανδρος Χαλιάσος Vitamin D and pathophysiology of bone Howard Morris 19:30: Μουσική Εκδήλωση με τη Μαντώ Παναγιωτάκη στο τραγούδι και τον Όθωνα Παναγιωτάκη στο πιάνο. 20:30 Δεξίωση Σάββατο, 08/11/ :30-11:00 Προφορικές ανακοινώσεις Προεδρείο: Βασιλική Λόη, Φωτεινή Καράμπαμπα ΜΕΛΕΤΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝ ΛΟΙΜΩΞΗ ΑΠΟ CLOSTRIDIUM DIFFICILE Γρηγοράτου Α., Μπελεσιώτου Ε., Μελπίδου Α., Μπάρκα, Περιβολιώτη Ε., Πρατικάκη Μ., Πάντζιου Χ., Νέπκα Μ., Ψαρουδάκη Ζ., Ιωαννίδου Σ. ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΛΙΠΟΚΑΛΙΝΗΣ-2 (NGAL) ΕΙΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΑΥΞΗΜΕΝΑ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΚΑ ΚΑΙ ΔΡΕΠΑΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ: ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Παπασωτηρίου Ι., Βοσκαρίδου Ε., Μαργέλη Α., Κοτρώτσου Α., Κυριακοπούλου Δ., Nwagha T., Ποζιόπουλος Χ., Καττάμης Α. Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΟΥ ΔΙΑΛΥΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ ΠΛΑΣΜΙΝΟΓΟΝΟΥ ΤΥΠΟΥ ΟΥΡΟΚΙΝΑΣΗΣ (supar) ΣΕ ΤΕΛΕΙΟΜΗΝΑ ΝΕΟΓΝΑ ΜΕ ΛΟΙΜΩΞΗ Η ΣΗΨΗ: ΜΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Σιαχανίδου Τ., Μαργέλη Α., Τσιρογιάννη Χ., Χαρώνη Σ., Γιαννάκη Μ., Βαβουράκης Ε., Χαρισιάδου Α., Παπασωτηρίου Ι. 6

7 ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΥΠΟ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗΜπρακούλια Β., Αγγελίδης Η., Γρηγοράτου Α., Μελπίδου Α., Πρατικάκη Μ., Πολίτου Δ, Ιωαννίδου Σ., Λιανίδου Ε. ΈΛΕΓΧΟΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΥΝ ΑΝΤΙΕΠΙΛΗΠΤΙΚΑ Αγγελίδης Η., Μπρακούλια Β., Γρηγοράτου Α., Μελπίδου Α., Πάντζιου Χ., Ιωαννίδου Σ., Λιανίδου Ε. ΤΑ ΧΑΜΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ DICKKOPF-1 ΣΕ ΠΑΧΥΣΑΡΚΑ ΠΑΙΔΙΑ ΔΕΙΧΝΟΥΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΑΝΟΝΙΚΗΣ Wnt ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ Παπασωτηρίου I., Τέρπος E., Γαλάνη Α., Κανακά-Gantenbein Χ., Χρούσος Γ. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΚΡΑΙΟΥ ΦΥΣΙΚΟΥ STRESS ΣΤΑ ΚΥΚΛΟΦΟΡΟΥΝΤΑ ΒΛΑΣΤΙΚΑ/ΠΡΟΓΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΩΝ: ΠΙΘΑΝΕΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΡΟΕΚΤΑΣΕΙΣ Παπασωτηρίου I., Σκενδέρη K., Tσιρώνη Μ., Γαλάνη Α., Χρούσος Γ., Γουσέτης E. ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΛΙΠΩΔΟΥΣ ΙΣΤΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΟΣΤΙΚΗΣ ΑΝΑΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΣΕ ΝΟΡΜΟΒΑΡΗ ΚΑΙ ΠΑΧΥΣΑΡΚΑ ΚΟΡΙΤΣΙΑ Παπασωτηρίου I., Kanaka-Gantenbein X., Maργέλη A., Γαλάνη Α., Χρούσος Γ., Τέρπος E. 11:00-11:30 Διάλειμμα-καφές 11:30-12:30 Στρογγυλό Τραπέζι «Bone turnover markers; Biochemistry and Clinical Utility» Προεδρείο: Κωνσταντίνος Μακρής, Δημήτρης Ρίζος Νέοι βιοχημικοί δείκτες: από την ανακάλυψη στη χρήση τους στη κλινική πράξη Κωνσταντίνος Μακρής The biochemistry of bone turnover markers Howard Morris Ο ρόλος των βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού στη διαχείριση της οστεοπόρωσης Συμεών Τουρνής 12:30-13:30 Στρογγυλό Τραπέζι «S-100 ως Βιοδείκτης» Προεδρείο: Χριστίνα Ψαχούλια, Ιωάννης Παπασωτηρίου Η πρωτεΐνη S100B Χριστίνα Ψαχούλια Η πρωτεΐνη S100B στην εγκεφαλική βλάβη Στέφανος Κορφιάς Πρωτεΐνη S100B και κύηση υψηλού κινδύνου Αγγελική Παπαδημητρίου 13:30-14:15 Δορυφορική Διάλεξη με την ευγενική χορηγία της Εταιρείας ABBOTT Προεδρείο: Ειρήνη Λεϊμονή, Βασίλης Παπαδημητρόπουλος New developments in Cardiology High Sensitivity Troponin I Lieselotte Lennartz 14:15-15:30 Μεσημεριανή Διακοπή- Ελαφρύ γεύμα 7

8 15:30-17:00 Στρογγυλό Τραπέζι «Point of care Testing (POCT)» Προεδρείο: Βιολέττα Καψιμάλη, Βασίλης Σπυρόπουλος Παρακλίνια μηχανήματα: παρόν και μέλλον, κατευθυντήριες οδηγίες, σχέση με το εργαστήριο Κλεάνθη Δήμα The Promises and Pitfalls of POCT in Molecular Diagnostics Sam Murray Ανασκόπηση και προοπτικές της χρήσης Κβαντικών Κηλίδων (Quantum Dots) στην in vitro Διαγνωστική Βασίλης Σπυρόπουλος 17:00-18:00 Στρογγυλό Τραπέζι «Επαγγελματικά θέματα» Προεδρείο: Γιώργος Καρίκας, Χρήστος Τσατσάνης Προτεινόμενη ταξινόμηση για τα in Vitro Διαγνωστικά Χρήστος Κρούπης Νέος Κανονισμός για τα in Vitro Διαγνωστικά. Αλλαγές και προκλήσεις για τη βιομηχανία και τους εργαστηριακούς επιστήμονες Χρύσανθος Μητρόπουλος Το μέλλον του επαγγέλματός μας: Κλινική Χημεία ή Ειδικευμένος/η στην Εργαστηριακή Ιατρική; Η νέα Ευρωπαϊκή οδηγία για τα επαγγελματικά δικαιώματα Δημήτριος Ρίζος 18:00-19:30 Στρογγυλό Τραπέζι «Present and future challenges for Laboratory Medicine» Προεδρείο: Bernard Gouget, Αλέξανδρος Χαλιάσος Verification of in vitro medical diagnostics (IVD) metrological traceability: Responsibilities and strategies in the EU context Mauro Panteghini m-health - New Horizons for Health and Laboratory Medicine Bernard Gouget P4 Medicine: Predictive, Preventive, Personalized and Participatory. A new trend in Laboratory Medicine Maurizio Ferrari 19:30-20:00 Κλείσιμο συνεδρίου Απονομή βραβείων Κατερίνα Ψαρρά, Έφη Μπότουλα 8

9 Διαλέξεις ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ ΚΑΙ ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΦΥΜΑΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Π. Ιωαννίδης Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων (ΕΚΑΜ), Μικροβιολογικο Εργαστήριο, Νοσοκομείο "Σωτηρία" Στις αρχές του 21 ου αιώνα η φυματίωση παραμένει ένα από τα κυριότερα λοιμώδη νοσήματα. Το 2012 υπήρχαν παγκοσμίως 8,6 εκατομμύρια νέα περιστατικά και ~1,3 εκατομμύρια θύματα, με συνέπεια η φυματίωση να αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου από μολυσματικό νόσημα, μετά το AIDS [1]. Περίπου το 1/3 του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί από τον βάκιλο Μycobacterium tuberculosis (MΤΒ), που παραμένει όμως στην συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων υπό τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήματος (λανθάνουσα νόσος). Ο βάκιλος μπορεί να ενεργοποιηθεί και να οδηγήσει σε ενεργό νόσο, με την πτώση του ανοσοποιητικού συστήματος και αυτό μπορεί να συμβεί φυσιολογικά με την γήρανση ή λόγω παθολογικών καταστάσεων όπως η ΗΙV λοίμωξη, ορισμένες κακοήθειες, ο διαβήτης ή αλλά παθολογικά αίτια, αλλά και εξ' αιτίας παραγόντων που υποβαθμίζουν το επίπεδο ζωής. Ιστορικά η φυματίωση έχει συνδεθεί με την φτώχεια, και κατά συνέπεια, η τρέχουσα οικονομική κρίση, ενέχει κινδύνους αναζωπύρωσης της, ακόμη και σε χώρες ή περιοχές με χαμηλό επιπολασμό της νόσου [2]. Στην χώρα μας, τα επίσημα στοιχεία, με βάση τα καταγεγραμμένα κρούσματα, δείχνουν χαμηλό επιπολασμό της νόσου. Όμως αυτό δεν πρέπει να αποτελεί στοιχείο εφησυχασμού, γιατί: α) υπάρχει, σημαντικό ποσοστό υποδήλωσης, που εκτιμάται ότι μπορεί να αγγίζει ακόμη και το 80% [3], β) γιατί υπάρχουν ήδη καταγεγραμμένα ανησυχητικά δεδομένα για τις επιπτώσεις της οικονομικής κρίσης σε άλλα νοσήματα, όπως η λοίμωξη από τον ιό HIV [4] και γ) η χώρα αποτελεί πύλη εισόδου προς την Ε.Ε. μεταναστών από περιοχές με υψηλό επιπολασμό της νόσου. Σημαντικό πρόβλημα για την αντιμετώπιση της νόσου αποτελεί η ανάδειξη και διασπορά πολυανθεκτικών (MDR-TB: αντοχή στα κυρία αντιφυματικά φάρμακα ριφαμπικίνη και ισονιαζίδη) και υπερ-ανθεκτικών (XDR-TB: με επιπρόσθετη αντοχή και στα δευτερεύοντα αντιφυματικά κινολόνες και αμινογλυκοσίδες/κυκλικά πεπτίδια) στελεχών του βακίλου. Οι μορφές αυτές της νόσου αποτελούν ιδιαίτερη πρόκληση για το σύστημα υγείας, λόγω της υψηλού κόστους μακροχρόνιας θεραπείας, την ανάγκη νοσηλείας σε ειδικές συνθήκες (ατομικούς θαλάμους 9

10 αρνητικής πίεσης), αλλά και την ίδια την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, ιδιαίτερα για ασθενείς με XDR-TB. Η αντοχή του βακίλου της φυματίωσης, οφείλεται σε χρωμοσωμικές μεταλλάξεις σε διαφορετικούς γενετικούς τόπους, για τα διάφορα φάρμακα. Οι μεταλλάξεις αυτές, που συμβαίνουν τυχαία, επιλέγονται και συσσωρεύονται, λόγω ελλιπούς αγωγής ή μη συμμόρφωσης στην θεραπευτική αγωγή, που είναι πολυφαρμακευτική και πολύμηνη και απαιτεί συνεχή ιατρική/νοσηλευτική παρακολούθηση για την πιστή τήρηση της. Η έξαρση της εμφάνισης τέτοιων μορφών της νόσου παρατηρείται σε χώρες που αντιμετώπισαν ή αντιμετωπίζουν σημαντικά προβλήματα στο υγειονομικό τους σύστημα. Αρχικά υπήρχε η εκτίμηση ότι οι μεταλλάξεις που συνδέονται με αντοχή μειώνουν το προσαρμοστικότητα (fitness) των στελεχών και ως εκ τούτου τη μολυσματικότητα και την διασπορά τους. Σήμερα, όμως είναι σαφές ότι συγκεκριμένες μεταλλάξεις ή συνδυασμοί τους δεν μειώνουν την προσαρμοστικότητα λόγω εμφάνισης και επιλογής αντισταθμιστικών μεταλλάξεων [5]. Η εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης στηρίζεται σε συνδυασμό διαφορετικών μεθοδολογιών, που αναπτύσσονται σε βάθος χρόνου μιας και η ανάπτυξη του βακίλου στην καλλιέργεια, μπορεί να απαιτήσει έως και 40 ημέρες. Αν μάλιστα συνυπολογιστεί και ο έλεγχος της φαρμακευτικής αντοχής με την μέθοδο της καλλιέργειας, το διάστημα μπορεί να φτάσει έως και τις 60 ημέρες. Ο χρόνος αυτός είναι πολύτιμός - ιδιαίτερα σε περιπτώσεις MDR/XDR-TB - τόσο για τον ασθενή όσο και για τον έλεγχο της διασποράς της νόσου. Το μεγάλο πλεονέκτημα των μοριακών τεχνικών είναι η ταχύτητα και η υψηλή ευαισθησία τους, που σε συνδυασμό με την μεγάλη διαγνωστική ακρίβεια και επαναληψιμότητα, τις καθιστούν πολύτιμες για τη διάγνωση, ταυτοποίηση, αλλά και τον έλεγχο της ευαισθησίας του M. tuberculosis στα αντιφυματικά φάρμακα μέσω της ανίχνευσης γενετικών μεταλλάξεων. Ο ΠΟΥ έχει πρόσφατα υιοθετήσει μια σειρά από αυτές τις διαγνωστικές προσεγγίσεις (μέθοδοι ανάστροφου υβριδισμού, Gene Xpert MTB/RIF) [6]. Ωστόσο, ακόμη και οι μέθοδοι που θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως "παρά τη κλίνη" προσεγγίσεις, συνιστάται να χρησιμοποιούνται ενταγμένες στον διαγνωστικό αλγόριθμο, στον οποίο η κλασική διαγνωστική προσέγγιση με την καλλιέργεια, παραμένει η μέθοδος αναφοράς τόσο για την ανίχνευση όσο και για τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα [7]. Η εφαρμογή των μεθόδων πρέπει να γίνεται από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό με διακριβωμένο εξοπλισμό και να εφαρμόζεται τόσο Εσωτερικός όσο και Εξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας, ο οποίος για το ΕΚΑΜ παρέχεται από το 2010, από τον Οργανισμό Instand e.v, με 10

11 άριστα αποτελέσματα, στo πλαίσιο του Ευρωπαίκού Δικτύου Εργαστηρίων Φυματίωσης (ERLN- TB). Στην επιδημιολογική διερεύνηση της φυματίωσης, η γενετική ανάλυση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, αφού ο δημιουργία του γενετικού αποτυπώματος των επιμέρους στελεχών παρέχει την δυνατότητα της ομαδοποίησης τους με βάση τον βαθμό της συγγένειας τους. Η μοριακή επιδημιολογία έχει αποκαλύψει την ύπαρξη μεγάλων οικογενειών στελεχών του ΜΤΒ, με κυρίαρχη μεν παρουσία σε συγκεκριμένες περιοχές, αλλά και παγκόσμια διασπορά από την αρχική γεωγραφική/πληθυσμιακή αφετηρία τους. Ιδιαίτερα ανησυχητική είναι η παγκόσμια διασπορά στελεχών της οικογένειας Beijing που φαίνεται να εμφανίζουν αυξημένη μολυσματικότητα και παθογένεια, ενδογενή αντοχή σε αντιφυματικά φάρμακα και συνδέονται με επιδημίες MDR-TB κυρίως στις χώρες της Α. Ευρώπης και της Άπω Ανατολής. Τα MDR-TB στελέχη της οικογένειας αυτής, ενδεχόμενα να αποτελούν μια πηγή καλά προσαρμοσμένων, ιδιαίτερα μολυσματικών και παθογόνων στελεχών, με τους αντίστοιχούς κινδύνους που αυτό συνεπάγεται [8]. Κάποια από αυτά τα στελέχη, με αφετηρία τις χώρες της Βαλτικής, εμφανίζουν πλέον ενεργή διασπορά στο σύνολο της ευρωπαϊκής ηπείρου. Επιπρόσθετα η μοριακή επιδημιολογία, στις χώρες στις οποίες είναι ενταγμένη στο σύστημα ενεργού διερεύνησης της νόσου, έχει αναδειχθεί σε σημαντικό εργαλείο για την αποκάλυψη επιδημικών εξάρσεων, την εύρεση της αλυσίδας της μετάδοσης και την λήψη προληπτικών μέτρων, αλλά και για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των αντιφυματικών προγραμμάτων [9]. Όπως και σε άλλα πεδία, η μοριακή γενετική επαναστατικοποίησε τόσο την διάγνωσή όσο και την επιδημιολογική διερεύνηση της φυματίωση τα τελευταία χρόνια. Η ανάπτυξή των νέων μεθοδολογιών που κάνουν πολύ εύκολη και οικονομικά προσιτή την ανάγνωση όλου του γενετικού υλικού των οργανισμών, δίνει ήδη σημαντικά δεδομένα τόσο στην αποκάλυψή της γενετικής βάσης των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του βακίλου όσο και στην λεπτομερέστερη επιδημιολογική διερεύνηση. Η εφαρμογή της στην καθ' ημέρα πράξη θα επαναστατικοποιήση περεταίρω και την καθημερινότητα της διάγνωσης. Βιβλιογραφία 1. WHO: Global Tuberculosis Control M J van der Werf, J Giesecke, M Sprenger "Can the economic crisis have an impact on tuberculosis in the EU/EEA?" Eurosurveillance, (2012) v. 17, Iss. 12, 11

12 3. Lytras T, Spala G, Bonovas S, Panagiotopoulos T (2012) Evaluation of Tuberculosis Underreporting in Greece through Comparison with Anti-Tuberculosis Drug Consumption. PLoS ONE 7(11): e doi: /journal.pone ΚΕΕΛΠΝΟ: ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΤΗΣ HIV ΛΟΙΜΩΞΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ(ΕΩΣ 31/10/2012) I. Comas, S. Borrell, A. Roetzer, G. Rose, B. Malla, M. Kato-Maeda, J. Galagan, S. Niemann & S. Gagneux "Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerase genes" Nature Genetics, 44, , (2012), doi: /ng World Health Organization. Policy statement. Molecular line probe assay for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant (MDR) TB. Geneva, Helb D, Jones M, Story E, Boehme C, Wallace E, Ho K, Kop J, Owens MR, Rodgers R, Banada P et al. (2010) Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near- Patient Technology. J Clin Microbiol. 48: European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis. Beijing/ W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance. Emerg Infect Dis (2006), 12: H. van Deutekom, P. Supply, P. E. W. de Haas, E. Willery, S. P. Hoijng, C. Locht, R. A. Coutinho and D. van Soolingen "Molecular Typing of Mycobacterium tuberculosis by Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit- Variable-Number Tandem Repeat Analysis, a More Accurate Method for Identifying Epidemiological Links between Patients with Tuberculosis" J Clin Microbiol. 2005, 43(9):

13 ΝΕΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΓΙΑ ΤΟΝ ΙΟ MERS Σιμόνα Καράμπελα Διεθύντρια ΕΣΥ, Μικροβιολογικό εργαστήριο, ΝΝΘΑ «Η Σωτηρία» Οι κοροναιοί είναι μία μεγάλη ομάδα ιών, παθογόνων για τον άνθρωπο και τα ζώα. Οι ανθρώπινοι κοροναιοί όπως NL63, 229E, OC43, HKUI1 εμφανίζονται σε όλο τον κόσμο και προκαλούν ένα σημαντικό ποσοστό του συνόλου των κρυολογημάτων με συμπτώματα από ήπια έως σοβαρά. Οι περισσότεροι από τους ιούς αυτούς προέκυψαν με μετάδοση από νυχτερίδες. Περιλαμβάνουν όμως και τους ιούς υψηλής παθογονικότητας SARS-CoV και στελέχη MERS-CoV, ιοί με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα, κυρίως στους ηλικιωμένους. Το 2012, ένας νέος κοροναιός που προκαλεί μία σοβαρή λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος, εμφανίστηκε στην περιοχή της Μέσης Ανατολής. Τον Μάρτιο του 2012, σε μία μονάδα εντατικής θεραπείας, αναφέρθηκε σοβαρή λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού σε 11 ασθενείς από τους οποίους 10 ήταν εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας. Δεν βρέθηκε αιτιολογικός παράγοντας εκείνη τη στιγμή. Μισό χρόνο αργότερα, αυτή η μικροεπιδημία συνδέθηκε με μία άλλη περίπτωση, σε ένα ασθενή στη Jeddah της Σουηδικής Αραβίας. Αφορούσε ένα 60χρονο άνδρα, που τελικά έχασε τη ζωή του ως συνέπεια οξείας αναπνευστικής λοίμωξης και νεφρικής ανεπάρκειας, μετά από 10 ημέρες νοσηλείας. Άλλος ασθενής, 49 χρονών από το Κατάρ που νοσηλεύθηκε στο Ηνωμένο Βασίλειο ήταν παρόμοια περίπτωση, την ίδια εποχή. Επιδημιολογικά στοιχεία Έως τις 22 Μαιού 2014, ο ΠΟΥ ανακοίνωσε 665 εργαστηριακά επιβεβαιωμένα κρούσματα της λοίμωξης με MERS-CoV στον άνθρωπο, με 205 θανάτους ( Όλες αυτές τις περιπτώσεις συνδέονται άμεσα ή έμμεσα με τη περιοχή της Μέσης Ανατολής. Οι περιπτώσεις στo Ηνωμένο Βασίλειο, Γαλλία, Γερμανία, Ιταλία, Ισπανία, Τυνησία επίσης συνδέονται με τη Μέση Ανατολή. Στην Ελλάδα, τον Απρίλιο του 2014, το Υπουργείο Υγείας ανακοινώνει το πρώτο εργαστηριακά επιβεβαιωμένο κρούσμα MERS-CoV. 2/3 του συνόλου των περιπτώσεων αφορούν άνδρες (σχέση άνδρες/γυναίκες 1/7) και ο μέσος όρος ηλικίας είναι 49 ετών. Από το 2012 έως σήμερα, 111 (17%) περιπτώσεις αφορούν εργαζόμενους σε υπηρεσίες υγείας. 13

14 Στο 75% των περιπτώσεων, οι ασθενείς είχαν τουλάχιστον 1 υποκειμενική παθολογική νόσο. Κλινική εκδήλωση λοίμωξης από MERS-CoV Ο μέσος χρόνος επώασης επιβεβαιώθηκε ότι είναι 5,2 ημέρες, με διάστημα εμπιστοσύνης από 1,9 έως 14,7 ημέρες Οξεία σοβαρή αναπνευστική λοίμωξη με πυρετό, βήχα, δύσπνοια Μυαλγίες Συχνά γαστρεντερικά συμπτώματα με διάρροια, εμέτους, κοιλιακό άλγος Επιπλοκές με οξεία νεφρική ανεπάρκεια, πολυοργανική ανεπάρκεια, ARDS, διαταραχές πήξης αίματος Άτυπη κλινική εικόνα στους ανοσοκατασταλμένους Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός του MERS-CoV Η ταυτοποίηση έγινε με την τεχνική της ανάστροφης μεταγραφής PCR. Ενισχύθηκε ένα μικρό τμήμα μίας εξαιρετικά διατηρημένης περιοχής του γονιδίου RNA- η εξαρτώμενη RNA πολυμεράση και έτσι αποκαλύφθηκε ο νέος ανθρώπινος κοροναιός. Η φυλογενετική ανάλυση της αλληλουχίας των αμινοξέων με εκείνα των γνωστών κοροναιών, έδειξε ότι ο MERS-CoV μαζί με CoV νυχτερίδας HKUA4 και HKUA5 ανήκουν στην υποομάδα 2c της γραμμής Betacoronavirus (υποοικογένεια Coronavirinae). Είναι ο πρώτος ιός αυτής της γραμμής που μολύνει άνθρωπο. Ο ιός στην αρχή πήρε το όνομα HCoV-EMC/2012 (GenBank:JX869059), μετονομάστηκε αργότερα σε MERS-CoV μετά από διαβούλευση με την ομάδα μελέτης της Διεθνούς Επιτροπής Ταξινόμησης των ιών. Το γονιδίωμα του MERS-CoV αποτελείται από νουκλεοτίδια και 10 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs). Είναι μονόκλονος θετικής κατεύθυνσης RNA ιός. Το γονιδίωμα του κωδικοποιεί δομικές και μη δομικές πρωτεΐνες. Διάσπαρτες μεταξύ και εντός των δομικών πρωτεϊνών, υπάρχουν πέντε βοηθητικές πρωτεΐνες μοναδικές για το MERS-CoV που δεν έχουν καμία ομολογία με της γνωστές ιικές πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες κάποιου ξενιστή, εκτός από αυτών των νυχτερίδων γνωστές ως HKU4, HKU5. Ζωονοσογόνος μετάδοση Επειδή οι περισσότεροι ανθρώπινοι κοροναιοί υπεύθυνοι για τα κοινά κρυολογήματα, αρχικά προέκυψαν με τη μετάδοση από νυχτερίδες σε άλλα είδη ζώων και με δεδομένη τη φυλογενετική σχέση των MERS-CoV με άλλους κοροναιούς νυχτερίδας όπως HKUA4 και HKUA5, το πιο πιθανό 14

15 είναι ότι και ο MERS-CoV προήλθε από νυχτερίδες, ωστόσο χρειάζεται περαιτέρω έρευνα. Απόδειξη ότι οι νυχτερίδες είχαν παίξει το πρωταρχικό ρόλο ως ξενιστές για MERS-CoV προκύπτει και από μελέτες σχετικά με τον υποδοχέα που χρησιμοποιεί ο MERS-CoV στις νυχτερίδες. Η διπεπτιδυλοπεπτιδάση 4 DPP4 εκφράζεται στο κατώτερο αναπνευστικό σύστημα του ανθρώπου και δρα ως λειτουργικός υποδοχέας μόλυνσης για MERS-CoV, υπογραμμίζοντας την ιδέα ότι ο ιός θα μπορούσε να διασχίσει το φράγμα των ειδών και από τις νυχτερίδες να μολύνει τον άνθρωπο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η άμεση επαφή του ανθρώπου με νυχτερίδες ή με τις εκκρίσεις τους είναι σπάνια, οι ενδιάμεσοι ξενιστές ευαίσθητοι στο MERS-CoV μπορεί να εμπλέκονται στην μετάδοση του ιού στον άνθρωπο. Ανάλυση υπολειμμάτων βασικών αμινοξέων του υποδοχέα DPP4 αποκαλύπτει ότι, οι καμήλες και οι κατσίκες είναι πιο πιθανόν να είναι σε θέση να χρησιμοποιούν τον DPP4 λειτουργικό υποδοχέα για την είσοδο του MERS-CoV στα κύτταρα, σε σύγκριση με άλλα ζώα. Επίσης, ορολογικές μελέτες σε δείγματα από διάφορα είδη ζώων παρέχουν ενδείξεις για την παρουσία αντισωμάτων αντι-mers-cov στις καμήλες. Μην ξεχνάμε ότι οι καμήλες χρησιμοποιούνται ευρέως σε αρκετές χώρες, επίσης σε αγώνες, σε διαγωνισμούς ομορφιάς περίοδο κατά την οποία φυλάσσονται σε ομάδες, δημιουργώντας συνθήκες ευνοϊκές για την εξάπλωση του ιού. Απτές αποδείξεις για την διαδρομή της μετάδοσης του ιού από ζώα σε άνθρωπο ακόμα απουσιάζουν. Δεν είναι ξεκάθαρο ακόμα εάν οι καμήλες ακόμα και μολυσμένες παίζουν ρόλο στη μετάδοση του ιού στον άνθρωπο. Επίσης, δεν είναι σαφές εάν ό ιός εισάγεται πολλές φορές μέσω ζωονοσογόνου μετάδοσης ή εάν η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο είναι η κινητήρια δύναμη για τη εξάπλωση του ιού. Μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο Η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο έχει αναφερθεί σε αρκετές ομαδικές περιπτώσεις στη Γαλλία, Ηνωμένο Βασίλειο, Ιταλία, Ιορδανία, Τυνησία, Σαουδική Αραβία, Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα, και Κατάρ. Η μετάδοση αφορά μέλη της ίδιας οικογένειας ή εργαζόμενους σε μονάδες υγείας. Η εξάπλωση του ιού μεταξύ της οικογένειας ή εντός νοσοκομειακών μονάδων καταδεικνύει ότι η μετάδοση γίνεται μέσω σταγονιδίων ή στενής επαφής με τους αρρώστους. Οι διαφορές στην έκφραση του υποδοχέα της άνω ή κάτω αναπνευστικής οδού θα μπορούσε δυνητικά να εξηγήσει τη περιορισμένη μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο. Πάντως, φαίνεται ότι η μετάδοση ευνοείται από την ανοσοκαταστολή ή από την παρουσία μίας υποκείμενης νόσου όπως ο διαβήτης. 15

16 Επιτήρηση της λοίμωξης Το CDC ορίζει: 1. Ασθενής υπό παρακολούθηση- άτομο με οξεία αναπνευστική λοίμωξη (πυρετός, βήχα), υποψία για πνευμονία ή ARDS βάση κλινικής ή ακτινολογικής εικόνας ΚΑΙ ιστορικό ταξιδιού από την Αραβική Χερσόνησο ή γειτονικές χώρες εντός 14 ημερών 2. Άτομο που αναπτύσσει σοβαρή οξεία νόσο του κατώτερου αναπνευστικού εντός 14 ημερών μετά από ταξίδι από Αραβικές ή γειτονικές χώρες και δεν ανταποκρίνεται στην θεραπεία 3. Άτομα που αναπτύσσουν σοβαρή νόσο του κατωτέρου αναπνευστικού τα οποία είχαν στενή επαφή με συμπτωματικό ταξιδιώτη που παρουσίασε πυρετό και οξεία λοίμωξη του αναπνευστικού εντός 14 ημερών μετά το ταξίδι από Αραβικές ή γειτονικές χώρες. Στενή επαφή ορίζονται τα μέλη της οικογένειας, οι εργαζόμενοι σε υπηρεσίες υγείας και σχετίζονται με τον ασθενή ή άτομα που παραμένουν στο ίδιο μέρος (επισκέπτης, συγκάτοικος ή ασθενής συνταξιδιώτης). Νοσοκομειακή αντιμετώπιση Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της ΠΟΥ, η πρόληψη και ο έλεγχος λοίμωξης σε υγειονομικές μονάδες απαιτεί την εφαρμογή μέτρων ελέγχου, απαιτεί διοικητικά, μηχανικά και περιβαλλοντικά μέτρα, αλλά βέβαια και χρήση μέτρων ατομικής προστασίας. 1. Απαραίτητη απομόνωση σε μονόκλινο θάλαμο επαρκώς αεριζόμενο, πάντα με κλειστή πόρτα. 2. Η μετακίνηση του ασθενή θα γίνεται μόνο για τελείως απαραίτητες εξετάσεις 3. Απαγορεύεται η επίσκεψη μη εξουσιοδοτημένων ατόμων αλλά και η είσοδος ιατρικού και νοσηλευτικού προσωπικού θα πρέπει να είναι σημαντικά περιορισμένη. 4. Τήρηση των κανόνων υγιεινής χεριών, ατομικών μέτρων προστασίας από το νοσηλευτικό προσωπικό (γάντια, ποδιά, γυαλιά και μάσκες υψηλής προστασίας πχ Ν95 με φίλτρο) και αποφυγή άμεσης επαφής με τις σωματικές εκκρίσεις του ασθενή. Εργαστηριακή διάγνωση ΔΕΙΓΜΑΤΑ: δείγματα του ανώτερου και κατώτερου αναπνευστικού (ρινοφαρυγγικό επίχρισμα, πτύελα, βρογχικές εκκρίσεις, BAL), οροί, κόπρανα, ιστοί 16

17 ΜΕΘΟΔΟΙ: Το FDA έχει δώσει την έγκριση για τεχνική: Novel coronavirus 2012 real-time reverse transcription-pcr assay για δείγματα του αναπνευστικού, αίμα και κόπρανα. Επίσης, γίνεται αναζήτηση αντισωμάτων αντι MERS-CoV στον ορό Που βρισκόμαστε τώρα; Ο συνολικός αριθμός παραμένει σε σχετικά χαμηλά επίπεδα. Ωστόσο δεν είναι λόγος εφησυχασμού γιατί ήδη ο ιός έχει εξαπλωθεί στην Ευρώπη και πιθανόν να εξαπλωθεί σε όλο τον κόσμο. Η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο έχει παρατηρηθεί τόσο στο οικογενειακό περιβάλλον όσο και στο νοσοκομειακό, όχι μόνο στα άτομα με κάποια υποκειμενική νόσο αλλά και σε υγιή Όπως και άλλοι κοροναιοί, ο MERS-CoV μπορεί να υποστεί μεταλλάξεις και να προσαρμοστεί καλύτερα ενισχύοντας έτσι τη μεταδοτικότητα και την αναπαραγωγή του. Τα θεραπευτικά μετρά μπορεί να χρειαστεί να συνδυαστούν με μέτρα για τον περιορισμό εμφάνισης και εξάπλωσης του MERS-CoV μεταξύ των ενδιάμεσων ξενιστών. Η ταχεία ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων είναι πρώτη προτεραιότητα, όμως προς το παρόν δεν υπάρχει συγκεκριμένη θεραπεία ή εμβόλιο. Η κλινική εμπειρία από το SARS CoV, δείχνει ότι μία σειρά από παρεμβάσεις, που περιλαμβάνει αντιρετροικά φάρμακα όπως ριμπαβιρίνη με ή χωρίς κορτικοστεροειδή, ιντερφρόνη άλφα με κορτικοστεροειδή, ριμπαβιρίνη με λοπιναβίρ και ριτοναβίρ μπορεί να βελτιώσουν την έκβαση της νόσου με μείωση της θνησιμότητας, αλλά ακόμη τα στοιχεία δεν είναι πειστικά. 17

18 IΟΣ ΤΟΥ ΔΥΤΙΚΟΥ ΝΕΙΛΟΥ (WEST NILE VIRUS) Βασίλης Ζευγώλης, Βιοχημικός, PhD Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας (Ε.ΚΕ.Α) Γενικά χαρακτηριστικά Ο ιός του Δυτικού Νείλου (ΔΝ) εντοπίστηκε για πρώτη φορά, το 1937, στην επαρχία του Δυτικού Νείλου της Ουγκάντα, απ όπου και πήρε το όνομά του. Πρόκειται για αρμποιό που ανήκει στο γένος Flavivirus της οικογένειας Flaviviridae. Στην οικογένεια αυτή περιλαμβάνονται διάφοροι ιοί μεταξύ των οποίων ο ιός του Δάγγειου πυρετού, ο ιός της Ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας και ο ιός του Kίτρινου πυρετού. Το σχήμα του ιού του ΔΝ είναι σφαιρικό (διάμετρος περίπου 50 nm) με σχετικά λεία πρωτεινικής φύσης επιφάνεια ενώ το γονιδίωμα του ιού είναι RNA απλής αλύσου θετικής πολικότητας που καλύπτεται από 20εδρικό καψίδιο που περιβάλλεται από φάκελο. Οσον αφορά τις γενετικές παραλλαγές του ιού του ΔΝ, τα μέχρι σήμερα παθογόνα στελέχη ανήκουν σε δύο διακριτούς εξελικτικούς κλάδους του ιού, τον κλάδο 1 (lineage 1) και τον κλάδο 2 (lineage 2). Αν και προς το παρόν, μόνον αυτοί οι δύο εξελικτικοί κλάδοι είναι αποδεκτοί με τη φυλογενετική ανάλυση, φαίνεται ότι υπάρχουν τρεις ακόμη κλάδοι που δεν έχουν ταξινομηθεί ακόμη φυλογενετικά. Ο ιός μεταδίδεται μέσω νύγματος από μολυσμένα κουνούπια, κυρίως του είδους Culex. Στη φύση τη δεξαμενή (reservoir) του ιού αποτελούν τα άγρια και οικόσιτα πτηνά από τα οποία μέσω κουνουπιών-διαβιβαστών (vectors) πραγματοποιείται η μετάδοση του ιού προς τους ανθρώπους, τα ιπποειδή, άλλα θηλαστικά ή σπονδυλωτά που θεωρούνται αδιέξοδοι ξενιστές (dead-endhosts) καθώς ο τίτλος του ιού στο αίμα τους, κατά τη διάρκεια της ιαιμίας, είναι χαμηλός και δεν επαρκεί για τη μόλυνση των κουνουπιών. Λιγότερο συχνός τρόπος μετάδοσης είναι μέσω μετάγγισης μολυσμένου αίματος, ενώ έχουν παγκοσμίως αναφερθεί μεμονωμένα περιστατικά μετάδοσης μέσω μεταμόσχευσης, από τη μητέρα στο έμβρυο, με το θηλασμό, με το χειρισμό άρρωστων ζώων ή μολυσμένων δειγμάτων από άτομα που δουλεύουν σε εργαστηριακό περιβάλλον Επιδημιολογία του ιού του ΔΝ Από το 1937 που ο ιός απομονώθηκε για πρώτη φορά μέχρι το 1999, είχαν αναφερθεί σποραδικά κρούσματα στην Αφρική και στην Ευρώπη. Η πρώτη μεγάλη έξαρση της νόσου παρατηρήθηκε στην 18

19 Νέα Υόρκη το 1999, με επακόλουθο την εξάπλωση του ιού σε πολλές πολιτείες των ΗΠΑ ενώ στη συνέχεια περιγράφονται κρούσματα στην Ασία, στη Βόρεια Αφρική, στη Λατινική Αμερική αλλά και πρόσφατα στην Ευρώπη. Πρόσφατα έχουν αναφερθεί επιδημίες ή μεμονωμένα κρούσματα στη Ρουμανία, Ουγγαρία, Πορτογαλία και Ρωσία. Το καλοκαίρι-φθινόπωρο 2010 εμφανίσθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα επιδημία λοίμωξης από τον ιό του ΔΝ στην περιοχή της Κεντρικής Μακεδονίας με 262 εργαστηριακά επιβεβαιωμένα κρούσματα από τα οποία τα 191 παρουσίασαν νευρολογικά συμπτώματα ενώ κατέληξαν 35 όπως φαίνεται από τα στοιχεία του ΚΕΕΛΠΝΟ (Πίνακας 1). Έκτοτε, καταγράφονται ετησίως -κάθε καλοκαίρι και φθινόπωρο- κρούσματα της λοίμωξης από τον ιό του Δυτικού Νείλου στην Ελλάδα, σε ανθρώπους και ζώα. Το 2011 ο ιός εξαπλώθηκε νοτιότερα στη Θεσσαλία και στην Αττική ενώ τα επόμενα έτη και μέχρι σήμερα καταγράφηκαν κρούσματα στην Ανατολική Μακεδονία και Θράκη (κυρίως στις Περιφερειακές Ενότητες Ξάνθης και Καβάλας, πέριξ του Νέστου ποταμού), στη Δυτική Ελλάδα, όπως και σε ορισμένα νησιά. Πίνακας 1: Αριθμός δηλωθέντων κρουσμάτων λοίμωξης από ιό του Δυτικού Νείλου, με και χωρίς προσβολή του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) ανά έτος, Ελλάδα, (Τα στοιχεία για το έτος 2014 αφορούν περίοδο μέχρι ) Έτος Κρούσματα λοίμωξης από τον ιό του ΔΝ Με προσβολή του ΚΝΣ* Χωρίς προσβολή του ΚΝΣ Θάνατοι κρουσμάτων Σύνολο κρουσμάτων * εγκεφαλίτιδα ή/και μηνιγγίτιδα ή/και οξεία χαλαρή παράλυση Πηγή: ΚΕΕΛΠΝΟ Κλινική εικόνα Ο χρόνος επώασης της νόσου υπολογίζεται σε 2-15 ημέρες. Στην πλειονότητα των λοιμώξεων ( 80%) των ατόμων που μολύνονται από τον ιό, δεν εκδηλώνεται κανένα απολύτως σύμπτωμα ενώ 19

20 20% των λοιμώξεων εμφανίζουν ήπια κλινικά συμπτώματα όπως ήπια πυρετική συνδρομή με ή χωρίς εξάνθημα, και σε ορισμένες περιπτώσεις λεμφαδενοπάθεια, συμπτώματα που διαρκούν λιγότερο από μια εβδομάδα. Μικρό ποσοστό (< 1%) των ατόμων που μολύνονται από τον ιό του ΔΝ, κυρίως ηλικιωμένα και ανοσοκατασταλμένα άτομα ή άτομα με επιβαρυμένο ιστορικό λόγω υποκείμενων νοσημάτων, θα εμφανίσουν σοβαρή κλινική εικόνα με συμμετοχή του κεντρικού νευρικού συστήματος (μηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα, οξεία χαλαρή παράλυση). Η θνησιμότητα στα περιστατικά με νευρολογική συνδρομή ανέρχεται στο 10%. Εργαστηριακή διάγνωση Η εργαστηριακή διάγνωση των λοιμώξεων από τον ιό του ΔΝ βασίζεται κυρίως σε ορολογικές εξετάσεις στο αίμα ή/και στο ΕΝΥ. Η ανίχνευση ειδικών IgM αντισωμάτων στο ΕΝΥ με ανοσοενζυμικές μεθόδους και με τεχνικές ανοσοφθορισμού αποτελεί εργαστηριακά επιβεβαιωμένη λοίμωξη από τον ιό του ΔΝ. Ακόμη, η απομόνωση του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες ή σε πειραματόζωα αποτελεί μια κλασική εργαστηριακή μέθοδο διάγνωσης και εφαρμόζεται σε εργαστήρια αναφοράς. Όσον αφορά τον έλεγχο των αιμοδοτών εφαρμόζεται μοριακός έλεγχος με τεχνικές ΝΑΤ (Nucleic Acid Testing) όπως είναι η PCR (Polymerase Chain Reaction) και η TMA (Transcription Mediated Amplification) σε μικροδεξαμενές δειγμάτων ή σε μοναδιαίες αιμοδοσίες. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι ορολογικές τεχνικές παρουσιάζουν διάφορα προβλήματα (π.χ. διασταυρούμενες αντιδράσεις με άλλους φλαβοιούς) ενώ ταυτόχρονα υπάρχουν μολυσματικοί ασυμπτωματικοί δότες με ιαιμία και απουσία αντισωμάτων που μπορούν να μεταδώσουν τον ιό. Από την άλλη πλευρά η διαγνωστική αξία των μεθόδων μοριακού ελέγχου είναι κάπως περιορισμένη λόγω της ελαττωμένης και σύντομης ιαιμίας στον άνθρωπο. Στη χώρα μας από το 2010 που εμφανίστηκε πρώτη φορά ο ιός του ΔΝ εφαρμόζεται εργαστηριακός έλεγχος με τεχνικές ΝΑΤ σε αιμοδότες που διαμένουν ή επισκέπτονται ενδημικές περιοχές σε συνδυασμό με μέτρα αποκλεισμού αιμοδοτών, έτσι ώστε να μη δημιουργείται πρόβλημα στην επάρκεια αίματος και στην ασφάλεια της μετάγγισης. Τα αποτελέσματα των ελέγχων αυτών μέχρι σήμερα παρουσιάζονται στον πίνακα 2. 20

21 Μέτρα πρόληψης για τη μετάδοση της λοίμωξης από τον ιό του ΔΝ Τα σημαντικότερα μέτρα που εφαρμόζονται διεθνώς για την πρόληψη της λοίμωξης από τον ιό του ΔΝ είναι: -Η επιδημιολογική επιτήρηση -το συστηματικό και έγκαιρο πρόγραμμα καταπολέμησης των κουνουπιών και -η ενημέρωση του κοινού για την προστασία από τα κουνούπια. Για την προστασία των μεταγγίσεων το Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας σε συνεργασία με το ΚΕΕΛΠΝΟ και άλλους εμπλεκόμενους φορείς θεσπίζει μέτρα (Οδηγία 2004/33/ΕΚ Π.Δ. 138/2005) για την προστασία των μεταγγιζόμενων ασθενών που είναι -καθορισμός της περιόδου κυκλοφορίας του ιού και των ενδημικών περιοχών. -αναβολή πληθυσμιακών αιμοληψιών από ενδημικές περιοχές -αποκλεισμός των αιμοδοτών που διαμένουν ή επισκέπτονται ενδημικές περιοχές για 28 ημέρες σε συνδυασμό με εφαρμογή μοριακού ελέγχου στα πλαίσια της διασφάλισης της επάρκειας αίματος -αποκλεισμός από την αιμοδοσία ατόμων μολυσμένων από τον ιό τουλάχιστον 4 μήνες από την διάγνωση της νόσου Πίνακας 2. Αιμοδοσία και ιός του ΔΝ (Τα στοιχεία για το έτος 2014 αφορούν περίοδο μέχρι ) Περίοδος μετάδοσης 2010 Περίοδος μετάδοσης 2011 Περίοδος μετάδοσης 2012 Περίοδος μετάδοσης 2013 Περίοδος μετάδοσης 2014 Αρ. Ελεγμένων μονάδων αίματος WNV-RNA Θετικές Μετάδοση με μετάγγιση Κόστος ελέγχου

22 ΙΟΣ EBOLA Σωτήρης Τσιόδρας Αναπλ. Καθηγητής Παθολογίας-Λοιμωξιολογίας, Αττικό Παν/κό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών και Λοιμωξιολόγος ΚΕΕΛΠΝΟ Η νόσος από τον ιό Έμπολα είναι μια σπάνια, σοβαρή και συχνά θανατηφόρα ιογενής λοίμωξη η οποία προσβάλλει ανθρώπους αλλά και άλλα θηλαστικά (πχ πίθηκοι, γορίλλες, χιμπατζήδες, φρουτοφάγες νυχτερίδες ). Η νόσος είναι γνωστή από το 1976 και κατά καιρούς εμφανίζεται με επιδημικά κύματα σε χώρες της Αφρικής όπως η Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό, η Αγκόλα και το Σουδάν. Ο ιός μπορεί να μεταδοθεί μετά από άμεση επαφή με το αίμα ή με τα βιολογικά υγρά ενός προσβεβλημένου ασθενούς ή ζώου (κυρίως πίθηκοι ή οι φρουτοφάγες νυχτερίδες - σε χώρες της Αφρικής - οι οποίες και θεωρούνται μια από τις κύριες αποθήκες του ιού στην φύση). Δεν έχει τεκμηριωθεί αερογενής μετάδοση της νόσου. Οι άνδρες επιζώντες είναι σε θέση να μεταδώσουν τη νόσο μέσω του σπέρματος επί σχεδόν δύο μήνες. Τα συμπτώματα συνήθως εμφανίζονται δύο μέρες έως και τρεις εβδομάδες μετά την επαφή με τον ιό και περιλαμβάνουν πυρετό, μυαλγίες, κεφαλαλγία, συμπτώματα από το γαστρεντερικό σύστημα όπως ναυτία, εμετό και διάρροια και αιμορραγική διάθεση. Δεν υπάρχει ειδική θεραπεία για την νόσο η οποία συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά θνητότητας που φτάνουν έως και το 70-90% Επιδημία ιογενούς αιμορραγικού πυρετού από τον ιό Ebola είναι σε εξέλιξη σε 3 χώρες της Δυτικής Αφρικής από τα τέλη του Η επιδημία ανακοινώθηκε για πρώτη φορά στη Γουινέα της Δυτικής Αφρικής στις αρχές του Τα κύρια κράτη που πλήττονται είναι η Σιέρα Λεόνε, η Γουϊνέα και η Λιβερία. Έχουν εξαχθεί κρούσματα σε άλλες χώρες όπως η Νιγηρία όπου υπήρξε και μικρή τοπική μετάδοση της νόσου, η Σενεγάλη, το Μαλί, η Ισπανία και οι ΗΠΑ. Μέχρι τις 19 Οκτωβρίου είχαν αναφερθεί επιβεβαιωμένα κρούσματα συμπεριλαμβανομένων θανάτων, στην προσβεβλημένη περιοχή της Αφρικανικής Ηπείρου. Η πλειονότητα των κρουσμάτων είναι ενήλικες ηλικίας ετών. Από τον έλεγχο επιβεβαιωμένων εργαστηριακά κρουσμάτων με PCR, διαπιστώθηκε η γονιδιακή ομοιότητα του στελέχους σε ποσοστό 98%, με το στέλεχος που προκάλεσε την επιδημία από ιό Ebola στη Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό το

23 Το σημαντικότερο μέτρο περιορισμού της τρεχούσης επιδημίας είναι ο έλεγχος της διασποράς σε τοπικό επίπεδο στις 3 Αφρικανικές χώρες Σιέρα Λεόνε, Γουϊνέα και Λιβερία. Στρατηγικές προληπτικού ελέγχου εξόδου από τις 3 προσβεβλημένες χώρες έχουν υιοθετηθεί ενώ κάποιες χώρες εφαρμόζουν και στρατηγικές ελέγχου εισόδου πιθανών κρουσμάτων από τις 3 Αφρικανικές χώρες. Λόγω της εξαγωγής κρουσμάτων σε άλλες χώρες υπάρχει μια παγκόσμια ανησυχία για περαιτέρω εξάπλωση του ιού. 23

24 ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΕΑΣ (NEXT GENERATION SEQUENCING) Απέσσου Αγγελική, Παπαδοπούλου Ειρήνη, Αγιαννιτόπουλος Κωνσταντίνος, Μεταξά-Μαριάτου Βασιλική, Τσιριγώτη Αγγελική, Νασιούλας Γεώργιος Genekor ΙΑΕ, Λ. Σπάτων 52, Γέρακας, Αθήνα Εισαγωγή Από το 1977 μέχρι και σήμερα η αλληλούχιση κατά Sanger μας δίνει διαρκώς πολύτιμες πληροφορίες σε όλους τους τομείς της βιολογίας και θεωρείται μέθοδος αναφοράς όσον αφορά την επαναληψημότητα (πιστότητα) των ευρημάτων. Ένα από τα μεγαλύτερα επιτεύγματά της ήταν το Human Genome Project που ολοκληρώθηκε το Παρόλα αυτά, για αυτό το μεγάλο εγχείρημα χρειάστηκαν 11 χρόνια και η ανάγκη για νέες τεχνολογίες που θα επισπεύδουν το διάβασμα πολλών δειγμάτων παράλληλα έγινε αισθητή. Η αλληλούχιση κατά Sanger θεωρείται ως η πρώτης γενιάς τεχνολογία. Τα τελευταία χρόνια, μία νέα γενιά αναλυτών, αυτοί της μαζικής παράλληλης αλληλούχισης (massive parallel sequencing) ή αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing) έχει έρθει για να καλύψει τα κενά της αλληλούχισης κατά Sanger όσον αφορά την ταχύτητα, κόστος και ευαισθησία 2. Αλληλούχιση Επόμενης Γενεάς Η πρώτη εμπορικά διαθέσιμη τεχνολογία μαζικής παράλληλης αλληλούχισης ήρθε ήδη το 2005 από τη Roche σε συνεργασία με την 454 Genome Sequencing. Ακολούθησαν γρήγορα άλλες εταιρίες όπως η Illumina με την πλατφόρμα SOLEXA GA, η Life Technogies με το SOLID, η Helicos BioSciences με το Heliscope, κ.α. Όλες αυτές οι πλατφόρμες ήταν μηχανήματα μαζικής παραγωγής αλληλουχιών σε πολύ μεγάλη κλίμακα με το αντίστοιχο κόστος με αποτέλεσμα να περιορίζονται σε ερευνητικά κέντρα. Συνέβαλαν και συνεχίζουν να συμβάλλουν σημαντικά σε διάφορες ειδικότητας της έρευνας όπως η μεταγενωμική, de-novo αλληλούχιση, de-novo transcriptomics, ιολογία, «κλείσιμο» κενών αλληλούχισης από τεχνολογίες μικρότερων μηκών (genome finishing), διάβασμα απρόσιτων περιοχών του γονιδιώματος (π.χ. επαναλήψεις). Στο τέλος του 2009, η Roche / 454 Life Sciences ανακοίνωσε την δημιουργία της πρώτης «μικρού μεγέθους» πλατφόρμας (Bench Top Sequencer), γνωστή ως GS Junior System. Η πλατφόρμα αυτή βασίζεται στις ίδιες αρχές με το μεγαλύτερο μηχάνημα της ίδιας εταιρίας αλλά σε μικρότερη 24

25 κλίμακα, κάνοντας τη συμβατή με τη χρήση της σε μικρότερα εργαστήρια τόσο ερευνητικά όσο και διαγνωστικά. Ως αποτέλεσμα, δημοσιεύσεις που αφορούσαν στην χρήση της τεχνολογίας αυτής στη διάγνωση δεν άργησαν να παρουσιαστούν 3-5. Παράλληλα, όλο και περισσότερες ομάδες εργασίας δημοσιεύουν κατευθυντήριες οδηγίες ως προς τη χρήση της αλληλούχισης επόμενης γενεάς στην διάγνωση 6-8. Σύντομα άλλες κατασκευάστριες εταιρίες όπως η Illumina και η Life Technologies, κατασκεύασαν αντίστοιχες Bench Top πλατφόρμες, την MiSeq και Ion Torrent, αντίστοιχα. Η Illumina μάλιστα προχώρησε και ένα βήμα παραπέρα και το Νοέμβριο του 2013 καθιέρωσε την πρώτη πλατφόρμα MiSeqDx, με την έγκριση του FDA για χρήση στην κλινική διάγνωση της κυστικής ίνωσης. Επίσης η Roche ανακοίνωσε συνεργασία με την Pacific Biosciences στην δημιουργία νέας τεχνολογία που βασίζεται στην αλληλούχιση μονών μορίων DNA σε πραγματικό χρόνο (Single Molecule Real Time SMRT Sequencing) και αναμένεται να παρουσιάσει νέο όργανο για κλινική χρήση με κλινικές εφαρμογές αλληλούχισης. Κάθε πλατφόρμα έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της. Για παράδειγμα η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται από την πλατφόρμα της ROCHE επιτρέπει την γρηγορότερη αλληλούχηση μεγαλύτερων τμημάτων DNA, δηλ. περισσότερες από 450 βάσεις σε αντίθεση με τις 100 βάσεις της ILLUMINA. Η τεχνολογία της ILLUMINA είναι πιο επιρρεπής σε λάθη αντικατάστασης ενώ αυτή της ROCHE σε ψευδείς προσθήκες και ελλείμματα ιδίως σε περιοχές με ομοπολυμερή. Η επιλογή λοιπόν της πλατφόρμας που θα χρησιμοποιηθεί εξαρτάται αποκλειστικά από τα ερωτήματα τα οποία στοχεύει ο κάθε ερευνητής να απαντήσει. Τεχνικά χαρακτηριστικά της τεχνολογίας Ο συγκεντρωτικός ορισμός Next Generation Sequencing (NGS) περιλαμβάνει μία σειρά μεθόδων που μπορούν να ομαδοποιηθούν ως προετοιμασία του δείγματος προς ανάλυση, αλληλούχιση και απεικόνιση. Η χρήση ενός μοναδικού συνδυασμού συγκεκριμένων πρωτοκόλλων σε κάθε στάδιο διαφοροποιεί τις πλατφόρμες και καθορίζει τα δεδομένα που παράγονται με την κάθε μία και κατ επέκταση την ιδανικότερη για την κάθε εφαρμογή. Παρ όλα αυτά, όλες οι εμπορικά διαθέσιμες πλατφόρμες βασίζονται σε κάποια κοινά χαρακτηριστικά 9. 25

26 1. Σε όλες τις πλατφόρμες τα δείγματα προς αλληλούχιση ενισχύονται (πολλαπλασιάζονται) με τη χρήση πολυμεράσης μετά από τη δέσμευση τους σε μία στερεή επιφάνεια (γυάλινο πλακάκι ή μικροσφαιρίδιο). Η ενίσχυση αυτή είναι απαραίτητη ώστε οι αντιδράσεις αλληλούχισης να παράγουν αρκετό σήμα ούτος ώστε να είναι ανιχνεύσιμες από το οπτικό σύστημα της πλατφόρμας. 2. Η αλληλούχιση στις πλατφόρμες αυτές πραγματοποιείται ως μία καλά οργανωμένη σειρά επαναλαμβανόμενων βημάτων, τα οποία λαμβάνουν χώρα και καταγράφονται αυτόματα. Ο τρόπος που αυτό επιτυγχάνεται, διαφέρει από πλατφόρμα σε πλατφόρμα, τονίζοντας την εκπληκτική καινοτομία στην χημεία, μοριακή βιολογία και μηχανική η οποία απαιτείται για να λάβουμε τις πληροφορίες της αλληλουχίας από τις εκατοντάδες μορίων DNA παράλληλα. Ασχέτως των λεπτομερειών της κάθε πλατφόρμας, η αλληλούχιση επόμενης γενεάς διακρίνεται από αυτήν κατά Sanger από το γεγονός ότι οι πληροφορίες παράγονται σταδιακά από βάση σε βάση και όχι από τον ηλεκτροφοριτικό διαχωρισμό και ανίχνευση των ήδη πραγματοποιημένων αντιδράσεων. 3. Σε κάθε περίπτωση, ο όγκος των πληροφοριών που παράγονται κατά την αλληλούχιση είναι πάρα πολύ μεγάλος. Η έμφαση στην ανάλυση λοιπόν έχει μετακινηθεί από την παραγωγή των πληροφοριών στην ανάλυση τους. Το γεγονός αυτό έχει δημιουργήσει την ανάγκη για νέα εργαλεία βιοπληροφορικής 10, τα οποία να συνδυάζουν τις ακόλουθες ιδιότητες: a. Αρχική ανάλυση για καθορισμό των πληροφοριών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω ανάλυση (απόρριψη αλληλουχιών κακής ποιότητας, αλληλουχίες που υπάρχουν εις διπλούν κ.α.) b. Στοίχιση των αλληλουχιών που προκύπτουν με το γονιδίωμα αναφοράς c. Σύγκριση και αξιολόγηση των αλληλουχιών με το γονιδίωμα αναφοράς d. Ταχύτητα Συμπεράσματα Τα τελευταία δέκα χρόνια, η ανάλυση του γενετικού υλικού έχει προχωρήσει με τεράστια βήματα στην χρήση τεχνολογίας επόμενης γενεάς αλληλούχισης σε ερευνητικό επίπεδο με σκοπό να απαντήσει πληθώρα ερωτημάτων που προέκυψαν από τη χαρτογράφηση του ανθρώπινου (και άλλων) γονιδιώματος. Η χρήση της τεχνολογίας αυτής μεταφέρεται με ταχύτατους ρυθμούς και στην κλινική πρακτική, όπου εφαρμόζεται όλο και περισσότερο τόσο για την ταχύτερη διάγνωση κληρονομούμενων νοσημάτων με γνωστή αιτιολογία, για την ανάλυση πολλών γονιδίων 26

27 παράλληλα σε σύνδρομα με επικαλυπτόμενο φαινότυπο, όσο και στην ογκολογική διάγνωση με σκοπό την στοχευμένη θεραπεία. Βιβλιογραφία 1. Lander ES et al (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409: Metzker ML (2010) Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 11: Haack TB, Haberberger B, Frisch EM, Wieland T, Iuso A, Gorza M, Strecker V, Graf E, Mayr JA, Herberg U, Hennermann JB, Klopstock T, et al. (2012) Molecular diagnosis in mitochondrial complex I deficiency using exome sequencing. J Med Genet 49: Shanks ME, Downes SM, Copley RR, Lise S, Broxholme J, Hudspith KA, Kwasniewska A, Davies WI, Hankins MW, Packham ER, Clouston P, Seller A, et al. (2012) Next-generation sequencing (NGS) as a diagnostic tool for retinal degeneration reveals a much higher detection rate in early-onset disease. Eur J Hum Genet 21: Vissers LE, de Ligt J, Gilissen C, Janssen I, Steehouwer M, de VP, van LB, Arts P, Wieskamp N, del RM, van Bon BW, Hoischen A, et al. (2010). A de novo paradigm for mental retardation. Nat Genet 42: Marjan M. Weiss, Bert Van der Zwaag, Jan D. H. Jongbloed, Maartje J. Vogel, Hennie T. Brüggenwirth, Ronald H. Lekanne Deprez, Olaf Mook, Claudia A. L. Ruivenkamp, Marjon A. van Slegtenhorst, Arthur van den Wijngaard, Quinten Waisfisz, Marcel R. Nelen and Nienke van der Stoep (2013) Best Practice Guidelines for the Use of Next-Generation Sequencing Applications in Genome Diagnostics: A National Collaborative Study of Dutch Genome Diagnostic Laboratories. Human Mutation 34: Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, Berg JS, Brown KK, Deignan JL, Friez MJ, Funke BH, Hegde MR, Lyon E; Working Group of the American College of Medical Genetics and Genomics Laboratory Quality Assurance Committee (2013) ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing. Genet Med. 15: Lacroix L, Boichard A, André F, Soria JC (2014) Genomes in the clinic: the Gustave Roussy Cancer Center experience. Curr Opin Genet Dev. 24: Mardis ER (2011) A decade s perspective on DNA sequencing technology. Nature 470: Nielsen R, Paul JS, Albrechtsen A, Song YS (2011) Genotype and SNP calling from next-generation sequencing data. Nat Rev Genet. 12:

28 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΣ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ [Non-invasive prenatal testing (NIPT), or diagnosis (NIPD)] Φένια Παναγιώτα Τσόπλου Μοριακή Βιολόγος, GeneDiagnosis Ο προγεννητικός έλεγχος αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα της σύγχρονης γυναικολογίας. Στα πλαίσια του μια νέα εξέταση που αναπτύσσεται ταχύτατα τα τελευταία χρόνια, δίνει τη δυνατότητα της μη επεμβατικής λήψης εμβρυϊκού γενετικού υλικού. Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος (NIPT/NIPD) παρέχει τη δυνατότητα υπολογισμού του κινδύνου ανευπλοειδιών των χρωμοσωμάτων 21, 13, 18, ή χρωμοσωμικών ανωμαλιών που συνδέονται με το φύλο, στο έμβρυο. Οι έως σήμερα διαδεδομένες επεμβατικές μέθοδοι της αμνιοπαρακέκτησης και της λήψης τροφοβλάστης, έχουν μικρό κίνδυνο αποβολής, περίπου 1%. Αντίθετα για την υλοποίηση του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, απαιτείται η λήψη περιφερικού αίματος από τη μητέρα και η μελέτη σε αυτό, του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA(cffDNA). Οι πρώτες προσπάθειες για μη επεμβατική διάγνωση αφορούσαν την απομόνωση ακέραιων κυττάρων του εμβρύου που κυκλοφορούν στο αίμα της μητέρας. Η σπανιότητα των κυττάρων αυτών καθώς και η δυνατότητα τους να παραμένουν στην κυκλοφορία ακόμη και μετά από προηγούμενες κυήσεις, σε συνδυασμό με τη δυσκολία απομόνωσης τους, δεν ευνόησε τη χρησιμοποίηση τους. Στη συνέχεια το ενδιαφέρον των ερευνητών εστιάσθηκε στο ελεύθερο εμβρυϊκό DNA, το οποίο ανιχνεύεται στην κυκλοφορία αίματος της μητέρας πολύ νωρίς κατά την κύηση και η συγκέντρωση του αυξάνει κατά τη διάρκεια της. Στην εγκυμοσύνη, μετά από τη 10η εβδομάδα, το 4% - 10%, του ελεύθερου DNA προέρχεται από το έμβρυο. Αποτελείται από μικρά τμήματα, η πλειονότητα των οποίων έχει μέγεθος <200 bp, αποτέλεσμα αποπτωτικής διαδικασίας τροφοβλαστικών κυττάρων του πλακούντα. Το cffdna απομακρύνεται από την μητρική κυκλοφορία, μέσα στην πρώτη ώρα μετά τη γέννηση του εμβρύου. Το σχετικά μικρό ποσοστό του συγκρινόμενο με το αυτό της μητέρας, αποτελεί έως σήμερα ένα από τα προβλήματα του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου. Σήμερα οι κύριες χρωμοσωμικές ανωμαλίες αλλά και άλλα γενετικά νοσήματα είναι εφικτό να ανιχνευθούν μέσω εξέτασης του cffdna στο αίμα της μητέρας. Χρησιμοποιείται επίσης στον καθορισμό του φύλου του εμβρύου, πληροφορία πολύ σημαντική σε περιπτώσεις κυήσεων με 28

29 αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης φυλοσύνδετου νοσήματος, ή σε κυήσεις με γνωστό οικογενειακό ιστορικό. Άλλη σημαντική εφαρμογή της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός του συστήματος RhD του εμβρύου, σε γυναίκες RhD αρνητικές. Τέλος, η μέθοδος εφαρμόζεται σε ορισμένες περιπτώσεις μονογονιδιακών νοσημάτων πατρικής προέλευσης. Η ευαισθησία και η ειδικότητα του NIPT τεστ είναι έως σήμερα- χαμηλότερη από αυτή των επεμβατικών μεθόδων. Η ευαισθησία του ελέγχου αναφορικά με την τρισωμία 21 είναι περίπου 99,5%, ενώ για τις άλλες κοινές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (τρισωμία 13 και 18) κυμαίνεται σε χαμηλότερα ποσοστά, ανάλογα πάντα με την επιλεγόμενη μεθοδολογία που εφαρμόζεται. Σε κάθε περίπτωση κρίνεται αναγκαία, η πλήρης ενημέρωση των γυναικών για τους περιορισμούς του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, όπως για παράδειγμα, τον μη έλεγχο όλων των χρωμοσωμάτων του εμβρύου, την πιθανότητα μη έκδοσης αποτελέσματος, την αδυναμία εφαρμογής του τεστ σε περιπτώσεις πολλαπλής κυοφορίας και τη μικρή αλλά υπαρκτή πιθανότητα έκδοσης ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος είναι μια σύγχρονη και ταχύτατα αναπτυσσόμενη μεθοδολογία, που δεν φέρει κανένα κίνδυνο για το έμβρυο, και απαιτεί συνεχή ενημέρωση και εναρμόνιση με τις διεθνείς οδηγίες. 29

30 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟ ΙΣΤΟ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ. Γεώργιος Νασιούλας Ph.D. Επιστημονικός Διευθυντής Genekor Γεώργιος Νασιούλας, Ειρήνη Παπαδοπούλου, Αγγελική Απέσσου, Βασιλική Μεταξά-Μαριάτου, Αγγελική Τσιριγώτη, Κωνσταντίνος Αγιαννιτόπουλος. GENEKOR I.A.E. Λεωφόρος Σπάτων 52, Γέρακας, Αθήνα. Η πρόοδος στην ανάλυση του γενετικού προφίλ του όγκου οδήγησε στην ανάπτυξη σκευασμάτων που στοχεύουν σε συγκεκριμένα μόρια που εμπλέκονται στη καρκινογένεση. Η αποτελεσματικότητα αυτών των φαρμάκων συχνά διαφέρει ανάλογα με την ύπαρξη ή όχι μεταλλαγών σε γονίδια που κωδικοποιούν για τις πρωτεΐνες-στόχους ή για πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο ίδιο ενδοκυτταρικό μονοπάτι. Αυτού του είδους η στοχευόμενη θεραπευτική προσέγγιση καθιστά αναγκαία την μοριακή ανάλυση του όγκου με σκοπό την επιλογή ασθενών με αυξημένη πιθανότητα ανταπόκρισης στη θεραπεία. Τα τελευταία χρόνια ο αυξανόμενος αριθμός γονιδίων με εμπλοκή στην ανταπόκριση σε στοχευμένη θεραπεία οδήγησε στη ανάπτυξη νέων μοριακών τεχνικών όπως η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (ΝGS), με στόχο την ταυτόχρονη ανάλυση μεγαλύτερου αριθμού μεταλλαγών και κατά συνέπεια τον ακριβέστερο μοριακό χαρακτηρισμό του όγκου. Καρκίνος του Παχέος Εντέρου Τα δύο κύρια ενδοκυτταρικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από τον υποδοχέα EGFR είναι το μονοπάτι KRAS/RAF/MEK/ERK1/2, το οποίο ελέγχει τη μεταγραφή γονιδίων, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, καθώς και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και το μονοπάτι PI3K/PTEN/AKT, το οποίο ενεργοποιεί έναν καταρράκτη αντιαποπτωτικών σημάτων και σημάτων επιβίωσης. Έχει αποδειχτεί ότι μεταλλαγές στα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες KRAS και NRAS, που ρυθμίζονται από τον EGFR, απομονώνουν το RAS/RAF/MEK/ERK1/2 μονοπάτι από τον υποδοχέα του και καθιστούν τους αναστολείς του EGFR αναποτελεσματικούς 1. Οι μεταλλαγές στα ΚRAS, και NRAS παρατηρούνται σε περίπου 50% των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου 2. Είναι γνωστό ότι ασθενείς με αυτές τις μεταλλαγές δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με τα αντι- EGFR αντισώματα cetuximab (Erbitux, Merck), και panitumumab (Vectibix, Amgen). Αν και τα ποσοστά ανταπόκρισης των ασθενών χωρίς μεταλλαγές στα RAS είναι πολύ καλύτερες, είναι γνωστό ότι κάποιοι από αυτούς δε θα ανταποκριθούν στη θεραπεία. Αυτό υποδεικνύει ότι 30

31 υπάρχουν και άλλοι μηχανισμοί ανθεκτικότητας στους αναστολείς του EGFR. Μεταλλαγές στο τρίτο γονίδιο της οικογένειας RAS για παράδειγμα το HRAS, μεταλλαγές στο BRAF καθώς και στο γονίδιο PIK3CA θα μπορούσαν να ευθύνονται για τη μη ανταπόκριση σε ένα ποσοστό των φυσιολογικών για KRAS, NRAS ασθενών. Μεταλλαγές στο γονίδιο BRAF που είναι μέλος της οικογένειας γονιδίων RAF παρατηρούνται σε περίπου 10% των ασθενών. Θεωρούνται αρνητικός προγνωστικός δείκτης. Επιπλέον υπάρχουν μελέτες που αναφέρουν ότι έχει και προβλεπτική αξία 3. Η ύπαρξη μεταλλαγών στο γονίδιο PIK3CA παρατηρείται σε περίπου 10-15% των όγκων από ασθενείς με καρκίνο του εντέρου. Το γονίδιο PIK3CA κωδικοποιεί μια λιπιδική κινάση που εμπλέκεται στο EGFR- ρυθμιζόμενο σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/PTEN/AKT. Αν και δεν είναι ακόμα ξεκάθαρο, οι πρώτες μελέτες δείχνουν ότι σχετίζονται με ανθεκτικότητα σε EGFR moab 4. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου παρατηρείται συχνά το φαινόμενο της μικροδορυφορικής γενετικής αστάθειας (MSI Microsatellite Instability). Πρόκειται για μικρές αλλαγές στην αλληλουχία του DNA που συμβαίνουν κατά την αντιγραφή, και είναι συνήθως προσθήκες ή απαλοιφές μίας ή δυο νουκλεοτιδικών βάσεων. Το φαινόμενο είναι πιο συχνό σε περιοχές του γονιδιώματος που περιλαμβάνουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA με μικρή μονάδα επανάληψης, από μία έως τέσσερις βάσεις και είναι γνωστές ως μικροδορυφορικές (Microsatellite) περιοχές 5. Η ανεύρεση μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI High) είναι καλός προγνωστικός δείκτης. Ταυτόχρονα χαρακτηρίζει και το κληρονομούμενο καρκινικό σύνδρομο Lynch σε ποσοστό που φθάνει το 90%, ενώ συναντάται και στο 10%-15% των σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου και του ορθού. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι MSI όγκοι, σποραδικοί ή κληρονομούμενοι, είναι λιγότερο επιθετικοί από τους υπολοίπους, σχετίζονται λιγότερο με μακρινές μεταστάσεις ή μεταστάσεις σε λεμφαδένες και έχουν διαφορετική ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία, αφού είναι λιγότερο ευαίσθητοι σε αναστολείς της τοποϊσομεράσης και στη 5- FU. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα Στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (ΜΜΚΠ) η ανάπτυξη φαρμάκων σήμερα έχει επικεντρωθεί στις στοχευμένες θεραπείες. Η πιο κοινές σωματικές μεταλλαγές στον ΜΜΚΠΤ βρίσκονται στα γονίδια EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) and KRAS Kirsten-RAS. Το γονίδιο EGFR είναι από τα πρώτα μόρια που χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία ως στόχος μοριακών θεραπειών. Η χορήγηση των πρώτων αναστολέων της τυροσινικής κινάσης αποδείχθηκε ότι 31

32 αυξάνει την ανταπόκριση καθώς και την επιβίωση σε ασθενείς με μεταλλαγές στην περιοχή τυροσινικής κινάσης του γονιδίου EGFR (εξώνια 18-21) (Gefitinib Erlotinib) 6. Ο αριθμός των σωματικών μεταλλαγών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προβλεπτικοί δείκτες ανταπόκρισης σε στοχευμένη θεραπεία συνεχώς αυξάνεται. Η αναδιάταξη EML4-ALK θεωρείται ένας χρήσιμος διαγνωστικός μοριακός δείκτης στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καθώς και πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός στόχος. Ασθενείς με αυτή την αναδιάταξη (2-7%) δεν επωφελούνται από θεραπεία με EGFR αναστολείς της κινάσης τυροσίνης (EGFR TKIs). Αναδιατάξεις του ALK ή του ROS1 είναι δείκτες ανταπόκρισης στη θεραπεία με Crizotinib 7. Επιπλέον για την επιλογή ασθενών για στοχευόμενη θεραπεία μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι μεταλλαγές στο γονίδιο BRAF, μεταλλαγές στο HER2, αναδιατάξεις στο γονίδιο RET καθώς και επαύξηση του γονιδίου MET και ο κατάλογος συνεχώς αυξάνεται 7,8. Στρωματικοί όγκοι (Gastro Intestinal Tumors, GIST) Οι στρωματικοί όγκοι (GIST) είναι μεσεγχυματογενείς όγκοι. Η διάγνωσή τους βασίζεται στην έκφραση του διαμεμβρανικού υποδοχέα κινάσης τυροσίνης ΚΙΤ (tyrosine kinase receptor, KIT). αφού το 95% των GIST εκφράζουν το αντίσωμα CD 117. Στο 80-85% των περιπτώσεων παρατηρούνται επίσης μεταλλαγές στο γονίδιο ckit (εξώνια 9, 11, 13 και 17) οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την συνεχή ενεργοποίηση του υποδοχέα. Επιπλέον στο 10-15% των ασθενών χωρίς μεταλλαγές στο ΚΙΤ παρατηρούνται μεταλλαγές στο γονίδιο του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης PDGFRA (εξώνια 12, 14, 18) 9. Η ανταπόκριση σε στοχευμένη θεραπεία με imatinib εξαρτάται από τον τύπο μεταλλαγής. Το μεγαλύτερο ποσοστό ανταπόκρισης παρατηρείται σε ασθενείς με μεταλλαγές στο εξώνιο 11 του ΚΙΤ, ενώ η ύπαρξη μεταλλαγών στο εξώνιο 9 υποδηλώνει ενδιάμεση ανταπόκριση και καθιστά αναγκαία τη χορήγηση διπλής δόσης του φαρμάκου. Επιπλέον υπάρχουν μεταλλαγές στο ΚΙΤ/PDGFRA που προσδίδουν ανθεκτικότητα στο φάρμακο και μπορεί να παρατηρούνται τόσο στον πρωταρχικό όγκο, πριν τη χορήγηση του φαρμάκου, ή να εμφανίζονται μετά από χορήγηση φαρμάκου (δευτερεύουσες μεταλλαγές) 10. Μελάνωμα Σε πολλούς τύπους μελανώματος, μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη BRAF στο μονοπατι της MAPK διακόπτει τη φυσιολογική ρύθμιση των κυττάρων και προωθεί την αυξημένη παραγωγή κυττάρων. Περίπου το 50% των ασθενών με μεταστατικό μελάνωμα φέρουν μια μεταλλαγή ενεργοποίησης στο γονίδιο BRAF 11. Θεραπευτικά σκευάσματα ενάντια στο μεταλλαγμένο BRAF (vemurafenib, debrafenib) σχετίζονται με αυξημένη επιβίωση σε ασθενείς με μεταστατικό μελάνωμα. Επιπλέον 32

33 σωματικές μεταλλαγές στο γονίδιο KIT παρατηρούνται σε 2-6% των περιπτώσεων κακοήθους μελανώματος. Η ύπαρξη μεταλλαγών ενεργοποίησης του KIT αυξάνουν την ανταπόκριση στο imatinib 12. Καρκίνος εγκεφάλου και Γλοιώματα Το γονίδιο MGMT (Ο 6 -μεθύλ-γουανινο-dna μεθυλοτρανσφεράση)) βρίσκεται στο χρωμόσωμα 10q26. Το προϊόν του είναι ένα ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA που αναστέλλει το θάνατο των καρκινικών κυττάρων από αλκυλιωτικούς παράγοντες. Υψηλά επίπεδα αυτού του ενζύμου στους όγκους προκαλούν ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία με αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως 1,3- bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU), procarbazine, streptozotocin και temozolomide 12. Η ενεργότητα του ΜGMT ελέγχεται από ένα υποκινητή. Η μεθυλίωση του υποκινητή καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου στον καρκίνο και τα κύτταρα δεν παράγουν πια ΜGMΤ. Τα επίπεδα της MGMT διαφέρουν ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου και μπορεί να διαφέρουν επίσης και μεταξύ όγκων του ίδιου τύπου. Για παράδειγμα, στο 30% των γλοιωμάτων υπάρχει έλλειψη του MGMT. Αυτή η έλλειψη του ενζύμου μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών όγκων στους αλκυλιωτικούς παράγοντες (όπως το temozolomide). Το γονίδιο MGMT συνήθως δεν παρουσιάζει μεταλλάξεις ή ελλείψεις. H έλλειψη του MGMT προκαλείται κυρίως μέσω μεθυλίωσης. Θεωρείται καλός προγνωστικός δείκτης. Το υλικό για την ανεύρεση σωματικών μεταλλαγών Το καλύτερο υλικό που έχει σήμερα η επιστημονική είναι τα μπλοκ παραφίνης (Formalin Fixed Paraffin Embedded Tissue). Με αυτή την τεχνολογία ο καρκινικός ιστός διερευνάται, διατηρείται και μεταφέρεται αναλλοίωτος De Roock W, Claes B, Bernasconi D, et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol 2010;11(8): Douillard JY, Oliner KS, Siena S, et al. Panitumumab-FOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer. N Engl J Med 2013;369(11):

34 3. Negru S, Papadopoulou E, Apessos A, Stanculeanu DL,et al. KRAS, NRAS and BRAF mutations in Greek and Romanian patients with colorectal cancer: a cohort study. BMJ Open May 23;4(5) 4. Edmonston TB, Cuesta KH, Burkholder S, et al. Colorectal carcinomas with high microsatellite instability: Defining a distinct immunologic and molecular entity with respect to prognostic markers Hum Pathol Dec;31(12): Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F, et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res Mar 1;69(5): Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors:guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. Arch Pathol Lab Med. 137(6): , Korpanty GJ, Graham DM, Vincent MD, Leighl NB. Biomarkers That Currently Affect Clinical Practice in Lung Cancer: EGFR, ALK, MET, ROS-1, and KRAS. Front Oncol Aug 11;4: Mazières J, Peters S, Lepage B, Cortot AB, et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation: epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol Jun 1;31(16): O'Brien KM, Orlow I, Antonescu CR, Ballman K, McCall L, DeMatteo R, Engel LS. Gastrointestinal stromal tumors, somatic mutations and candidate genetic risk variants. PLoS One. Apr 18;8(4), von Mehren M, Randall RL, Benjamin RS, Boles S, Bui MM, Casper ES et al. Gastrointestinal stromal tumors, version J Natl Compr Canc Netw Jun;12(6): Ascierto PA, Kirkwood JM, Grob J-J, et al. The role of BRAF V600 mutation in melanoma. Journal of Translational Medicine. 2012;10, article Curtin JA, Busam K, Pinkel D, Bastian BC. Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma.journal of Clinical Oncology. 2006;24(26): Hegi ME, Liu L, Herman JG, Stupp R, et al. Correlation of O6-methylguanine methyltransferase (MGMT) promoter methylation with clinical outcomes in glioblastoma and clinical strategies to modulate MGMT activity.j Clin Oncol Sep 1;26(25):

35 CIRCULATING TUMOR CELLS AS A REAL TIME LIQUID BIOPSY: ISOLATION AND DETECTION SYSTEMS, MOLECULAR CHARACTERIZATION AND CLINICAL APPLICATIONS Evi S. Lianidou Analysis of Circulating Tumor Cells lab, Lab of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Athens, 15771, Greece. Key words: circulating tumor cells, CTC, liquid biopsy, breast cancer, molecular characterization, individualized treatment. ABSTRACT Detection of Circulating Tumor Cells (CTC) in peripheral blood can serve as a "liquid biopsy" approach and has thus emerged lately as one of the hottest fields in cancer research. The clinical significance of CTC has been evaluated in many types of solid cancers, and the CTC enumeration test in metastatic breast, colorectal and prostate cancer has been cleared by the FDA almost a decade ago. CTC molecular characterization has a strong potential to be translated into individualized targeted treatments. A variety of analytical systems are continuously been developed for CTC isolation, detection and molecular characterization. The main strategies are based on their separation from peripheral blood mononuclear cells based on CTC density, size and electric charges and protein expression on the cell surface of CTC. A variety of microfluidics and filtration devices has been developed and are currently under evaluation for selection and enumeration of CTCs. CTC detection and molecular characterization systems are mainly based on protein and image-based approaches like classical immunocytochemistry, the FDA cleared CellSearch system, and immunofluorescence, and molecular assays based on the nucleic acid analysis in CTCs like RT-qPCR, multiplex RT-qPCR, and next generation sequencing technologies. Quality control and standardization of CTC isolation, detection and molecular characterization methodologies is very important for the incorporation of CTCs into prospective clinical trials testing their clinical utility. 35

36 CTC molecular characterization at the single cell level holds considerable promise for the identification of therapeutic targets and resistance mechanisms in CTCs as well as for the stratification of patients and real-time monitoring of systemic therapies. This lecture will be mainly focused on the analytical systems for CTC isolation, enumeration, and detection and the clinical applications of CTC in many types of solid cancer. We also discuss the potential of the molecular characterization of CTC as a liquid biopsy in individualized therapy. 36

37 VITAMIN D AND PATHOPHYSIOLOGY OF BONE HA Morris School of Pharmacy and Medical Sciences, University of South Australia, and Chemical Pathology, SA Pathology, Adelaide, South Australia The well characterised endocrine pathway of vitamin D metabolism and its activities are solely responsible for vitamin D regulation of plasma calcium and phosphate homeostasis under control of serum 1,25-dihydroxyvitamin D, the biologically active metabolite of vitamin D. This pathway protects against the metabolic bone disease of osteomalacia in adults or rickets in children. The critical level for serum 25-hydroxyvitamin D to maintain adequate serum 1,25-dihydroxyvitamin D is 20 nmol/l (8 ng/ml). In contrast a large body of data demonstrate that an adequate vitamin D status protects against osteoporosis, improving bone mineral density and reducing the risk of fracture. This evidence extends to the relationship between serum 25-hydroxyvitamin D and bone mineral density and reduction of fracture risk. Serum levels of 1,25-dihydroxyvitamin D do not relate to osteoporosis nor does administration of 1,25-dihydroxyvitamin D reduce the risk of fracture. Bone cells metabolise 25-hydroxyvitamin D to 1,25-dihydroxyvitamin D to elicit biological responses including osteoblast maturation, reducing bone resorption, and enhancing mineral retention in bone. Such actions protect against bone loss and reduce the risk of fracture in the elderly. The critical level for serum 25-hydroxyvitamin D for optimising the health of the skeleton is approximately 75 nmol/l (30 ng/ml). This example from calcium and bone mineral homeostasis of two critical levels for serum 25-hydroxyvitamin D to protect against either osteomalacia or osteoporosis arises from the synthesis of 1,25-dihydroxyvitamin D in different organs, the kidney and skeleton respectively. These organs have different capacities to induce expression of the enzyme 25-hydroxyvitamin D-1-hydroxylase (CYP27B1) to different levels. 37

38 ΝΕΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ: ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΣΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΡΑΞΗ Μακρής Κωνσταντίνος Βιολόγος, Βιοχημικό τμήμα Νοσοκομείο ΚΑΤ Οι βιοδείκτες χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική για να περιγράψουν τόσο φυσιολογικές, όσο και παθολογικές καταστάσεις. Μπορούν επίσης να έχουν προγνωστική διαγνωστική ή και προβλεπτική ικανότητα. Πριν την διάγνωση μιας νόσου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για πληθυσμιακούς προληπτικούς ελέγχους και για την εκτίμηση του κινδύνου εκδήλωσης ενός νοσήματος. Κατά τη διάγνωση μπορούν να μας δώσουν πληροφορίες για το στάδιο της νόσου την βαρύτητα και ακόμη να βοηθήσουνε στην επιλογή της πιο κατάλληλης θεραπείας. Κατά την διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής να μας δώσουν σημαντικές πληροφορίες για την αποτελεσματικότητα της θεραπευτικής αγωγής την ανάγκη για συμπληρωματική θεραπεία η την αναζωπύρωση της νόσου. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο στην ιατρική και κάθε χρόνο πολλοί νέοι πιθανοί βιοδείκτες προτείνονται. Σημαντικές εξελίξεις στην βασική έρευνα (γενωμική, πρωτεωμική και στην μοριακή παθολογία) τα τελευταία χρόνια έχουν αναδείξει πληθώρα υποψήφιων βιοδεικτών οι οποίοι δυνητικά θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην κλινική πράξη. Ωστόσο, μόνο λίγοι από αυτούς καταλήγουν να χρησμοποιούνται σε περιβάλλον κλινικής έρευνας, και ακόμη πολύ λιγότεροι έχουν εγκριθεί για χρήση στην καθημερινή κλινική πράξη. Για να γίνει αυτό απαιτείται η αρκετά επίπονη και πολλές φορές μακροχρόνια διαδικασία της επικύρωσης του βιοδείκτη. Η επικύρωση συνεπάγεται αφενός μεν την επίδειξη μιας σύνδεσης με μια σχετική κλινική παράμετρο ή διαδικασία, και αφετέρου μια ισχυρή και κατάλληλη μέθοδο ανάλυσης. 38

39 THE BIOCHEMISTRY OF BONE TURNOVER MARKERS HA Morris School of Pharmacy and Medical Sciences, University of South Australia, and Chemical Pathology, SA Pathology, Adelaide, South Australia Biochemical markers of bone turnover (BTM) offer a means for assessing two major clinical questions. Can baseline levels of BTM predict the rate of bone loss or future fracture risk? Can BTM be used to monitor the response to treatments for osteoporosis? Assays for numerous BTM are readily available on automated clinical chemistry analysers and point-of-care devices including 7 assays to assess bone formation and 8 assays to assess bone resorption. Despite a long history of use there is still considerable debate as to their clinical utility. A position paper published by the IOF-IFCC-IOF Working Group on Bone Marker Standards for Osteoporosis recommended that in future clinical trials serum β-ctx be used to assess bone resorption and serum PINP be used to assess bone formation. These are well characterised analytes, demonstrate high bone specificity, are measurable in serum and are available on more than one manufacturers automated platform. One meta-analysis has recently been published indicating a statistically significant but clinically small prognostic indication that increased serum β-ctx increases the risk of fracture in postmenopausal women. Currently two automated assays are available for serum β-ctx and current data suggest that their values are not compatible. In this metaanalyses data from both assays were combined. A consequence of these recommendations is the need to harmonize the assays for BTMs. A second working group (IOF-IFCC WG-Standardisation of Bone marker Assays) aims to undertake these projects. 39

40 ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΟΣΤΙΚΗΣ ΕΝΑΛΛΑΓΗΣ Δρ. Συμεών Τουρνής Ενδοκρινολόγος,ΕΕΠΜΣ, ΕΚΠΑ, Νοσοκομείο ΚΑΤ Μετά την ολοκλήρωση της σκελετικής ανάπτυξης και την απόκτηση της κορυφαίας οστικής μάζας, ο οστίτης ιστός παραμένει μεταβολικά ενεργός με τη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής. Υπολογίζεται οτι εντός ενός έτους το 28% του σπογγώδους και το 4% του φλοιώδους οστού αντικαθίσταται από νέο, ενώ εντός 10 ετών το σύνολο του σκελετού έχει αντικατασταθεί. Η οστική ανακατασκευή είναι απαραίτητη τόσο για την επιδιόρθωση των μικροκακώσεων και με τον τρόπο αυτό τη διατήρηση της ακεραιότητας του σκελετού όσο και για την ομοιοστασία του ασβεστίου. Την τελευταία 20ετία η ανακάλυψη και η εισαγωγή στην κλινική πράξη των βιοχημικών δεικτών οστικής εναλλαγής (ΒΔΟΕ), οι οποίοι είναι περισσότερο ειδικοί για τον οστίτη ιστό κατέστησε δυνατή τη μη επεμβατική μελέτη των μεταβολικών νοσημάτων των οστών. Οι ΒΔΟΕ αφορούν σε ένζυμα και μη ενζυμικά πεπτίδια τα οποία παράγονται από τους οστεοβλάστες και τους οστεοκλάστες ή αποτελούν ουσίες που παράγονται κατά το σχηματισμό και την αποδόμηση του κολλαγόνου τύπου Ι. Για πρακτικούς λόγους, οι ΒΔΟΕ διακρίνονται σε δείκτες οστικής παραγωγής και δείκτες οστικής απορρόφησης. Παρόλα αυτά σε άλλοτε άλλο βαθμό, οι βιοχημικοί δείκτες μπορεί να αντικατοπτρίζουν μεταβολές τόσο στην παραγωγή όσο και στην απορρόφηση, ενώ ορισμένοι από αυτούς, ιδιαίτερα οι παλαιότεροι, ανευρίσκονται και σε άλλους ιστούς με αποτέλεσμα η τιμή τους να μεταβάλλεται και από εξωσκελετικές παθολογικές καταστάσεις. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι ΒΔΟΕ δεν ειδικοί για μια συγκεκριμένη πάθηση και συγκεκριμένη περιοχή του σκελετού, αλλά αντικατοπτρίζουν μεταβολές στον οστικό μεταβολισμό συνολικά, ανεξάρτητα από την υποκείμενη αιτία. Η τιμή τους εξαρτάται από τη συχνότητα ενεργοποίησης των κύκλων οστικής ανακατασκευής και από το συνολικό ποσό του οστού που απορροφάται και παράγεται σε κάθε κύκλο οστικής αναδόμησης. Σήμερα προτείνεται ο προσδιορισμός στον ορό του PINP ως δείκτη οστικής παραγωγής και του CTX ως δείκτη οστικής απορρόφησης. Σε κλινικό επίπεδο, παρότι παραμένει το πρόβλημα της προτυποποίησης των βιοχημικών δεικτών, ο προσδιορισμός τους μπορεί να είναι χρήσιμος στην πρόγνωση της απώλειας οστικής πυκνότητας και καταγμάτων, στην παρακολούθηση ασθενών υπό αγωγή με αντικαταβολικούς και αναβολικούς παράγοντες για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας και της συμμόρφωσης, ενώ η μελέτη των μεταβολών τους μπορεί να βοηθήσουν στην κατανόηση του μηχανισμού δράσης νέων θεραπειών ή συνδυασμού αυτών. 40

41 Η ΠΡΩΤΕÏΝΗ S100Β Χριστίνα Ψαχούλια Διδάκτωρ Χημικός, Βιοχημικό Τμήμα, ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός» Εισαγωγή Η πρωτεΐνη S100B ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών S100, η οποία περιλαμβάνει πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους (μεταξύ 9 και 12 ΚDa), που δεσμεύουν ιόντα ασβεστίου και οφείλουν την ονομασία τους, στην ικανότητά τους να είναι 100% διαλυτές στο κορεσμένο θειϊκό αμμώνιο, σε ουδέτερο ph (ph=7). Μέχρι τώρα έχουν εντοπιστεί περισσότερες από δεκαεννέα S100 πρωτεΐνες, που τοποθετήθηκαν στην οικογένεια αυτή, λόγω ομολογίας στην αλληλουχία των αμινοξέων (από 25-65%) και λόγω ομοιότητας βασικών δομικών χαρακτηριστικών. Υπάρχει μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον για τις S100 πρωτεΐνες και τη σχέση τους με διάφορες κακοήθεις νόσους, καθόσον αποδεικνύεται ότι αυτές οι πρωτεΐνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και στη μεταστατική ικανότητα του όγκου, αλληλεπιδρώντας με πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων μεταλλοπρωτεϊνών, κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, P53, Jab 1, Cox-2, BRCA 1. Οι S100 πρωτεΐνες ευρίσκονται με τη μορφή ομο- ή έτερο διμερών και με μοριακό βάρος 21KDa, και απαρτίζονται από δύο ανοσολογικά ξεχωρστές υπομονάδες, τις α και β αλυσίδες. Ως S100B αναφέρονται: το ομοδιμερές S100ββ και το ετεροδιμερές S100αβ. Είναι ειδική κυτταροπλασματική πρωτεΐνη δέσμευσης Ca2+ και εκφράζεται κατά προτεραιότητα στα αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, κύτταρα Schwann, και στα επενδυματικά κύτταρα του νευρικού ιστού. Έχει ανιχνευτεί και μέσα στους ίδιους τους νευρώνες καθώς και σε μεγάλη ποικιλία κυττάρων εκτός νευρικού συστήματος, όπως μελανοκύτταρα, κύτταρα Langerhans του δέρματος, χονδροκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα στα όργανα του λεμφικού συστήματος και σε λιποκύτταρα. Κωδικοποιείται από γονίδια του χρωμοσώματος 21 και είχε προταθεί να συμπεριληφθεί στον προγεννητικό έλεγχο, αλλά μέχρι στιγμής δεν έχει επικρατήσει. Τα επίπεδα της σε ενήλικα άτομα είναι ανεξάρτητα του φύλου και της ηλικίας. Ο χρόνος ημίσειας ζωής της πρωτεΐνης κυμαίνεται από 30 λεπτά έως και 2 ώρες, με τα βιβλιογραφικά δεδομένα να ποικίλουν και να φέρουν επικρατέστερο το χρόνο των 30 λεπτών. Μεταβολίζεται και απεκκρίνεται από τους νεφρούς και έχει μετρηθεί σε πολλά βιολογικά υγρά, όπως στον ορό του αίματος, στο ΕΝΥ, στο αμνιακό υγρό, στα ούρα και στο μητρικό γάλα. 41

42 Στον πίνακα (1) φαίνονται οι ασθένειες στις οποίες παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης S100B. Περισσότερο έχουν μελετηθεί οι μεταβολές των επιπέδων της, στις παθήσεις του ΚΝΣ και στο μελάνωμα. ΑΙΜΑ Σχιζοφρένια Κατάθλιψη και διπολική διαταραχή Σκλήρυνση κατά πλάκας Έντονη σωματική άσκηση (αθλητές) Αγχώδεις καταστάσεις Καρδιοχειρουργικά περιστατικά Ανάνηψη μετά από καρδιακή ανακοπή Υποξεία Αιμορραγικό shock Μελάνωμα Περιγεννητική ασφυξία Κύηση (ειδικές καταστάσεις) Κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις ΕΝΥ Σχιζοφρένια Κατάθλιψη και διπολική διαταραχή Όγκοι εγκεφάλου Σκλήρυνση κατά πλάκας Creutzfeldt-jakob Νόσος Alzheimer ΟΥΡΑ Περιγεννητική ασφυξία στα τελειόμηνα Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλική αιμορραγία Αγχώδεις καταστάσεις ΑΜΝΙΑΚΟ ΥΓΡΟ Ενδομήτριος θάνατος Συγγενείς ανωμαλίες ΚΝΣ Τρισωμία 21 Δίδυμη κύηση ΜΗΤΡΙΚΟ ΓΑΛΑ Ωρίμαση του μητρικού γάλακτος Πίνακας 1: Ασθένειες στις οποίες παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης S100B 42

43 Η πρωτεΐνη S100B στο μελάνωμα Το μελάνωμα είναι μία κακοήθης νόσος δυσμενούς πρόγνωσης, με μικρό αλλά διαρκώς αυξανόμενο ποσοστό επιπολασμού στον ευρωπαϊκό πληθυσμό. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της S100, στα κακοήθη νεοπλασματικά κύτταρα μελανώματος με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών S100, προτάθηκε το 1982 και εφαρμόζεται ευρέως από εικοσιπενταετίας, για τη διάγνωση του κακοήθους μελανώματος. Από την πρώτη δημοσίευση της αξιολόγησης της κλινικής σημασίας του προσδιορισμού των επιπέδων της S100B στον ορό του αίματος ασθενών με μελάνωμα, που πραγματοποιήθηκε το 1995 και από τις μελέτες που ακολούθησαν, αποδείχθηκε η χρησιμότητα αυτού του προσδιορισμού και σήμερα έχει καθιερωθεί με βάση τα ευρωπαϊκά πρωτόκολλα, ως βιοδείκτης παρακολούθησης ασθενών με μελάνωμα και εφαρμόζεται πλέον ευρύτατα. Η S100B είναι ο μόνος ανεξάρτητος προγνωστικός βιοδείκτης για ασθενείς με δερματικό μελάνωμα σταδίων I-III, και έχει αποδειχτεί ότι ασθενείς που παρακολουθούνται και με αυτό το δείκτη, έχουν μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης έναντι αυτών που παρακολουθούνται μόνον με απεικονιστικές μεθόδους. Οι τιμές της S100B στον ορό, συσχετίζονται άμεσα με το στάδιο της νόσου και ειδικά σε μεταστατικό μελάνωμα, αυξημένες τιμές S100B συνδέονται με λιγότερο χρόνο ελεύθερο νόσου και λιγότερο συνολικό χρόνο επιβίωσης, καθώς έχει διαπιστωθεί ότι η πρωτεΐνη S100B επάγει την εξέλιξη της νόσου, αφού αλληλεπιδρά με το p53 και ρυθμίζει αρνητικά την κατασταλτική λειτουργία του επί του όγκου. Σταθερά αυξανόμενες τιμές της S100B κατά την τακτική χρονική παρακολούθηση ασθενών υποδεικνύουν επιδείνωση της ασθένειας και η αύξηση προηγείται πέντε έως είκοσι τρεις εβδομάδες της ύπαρξης άλλων στοιχείων μεταστατικής εξάπλωσης. Στο 72% ασυμπτωματικών ασθενών με αυξανόμενες τιμές S100B, εντοπίστηκε υποτροπή της ασθένειας με PET-CT. Η μείωση των τιμών μετά από οποιαδήποτε θεραπευτική αγωγή αποτελεί μέτρο της επιτυχίας της και μη ανιχνεύσιμα επίπεδα με τις προαναφερόμενες μεθόδους, υποδεικνύουν ύφεση. Ο εκτιμώμενος συνολικός χρόνος επιβίωσης ασθενών με τιμές S100B<0,15μg/L είναι σημαντικά μεγαλύτερος από το χρόνο επιβίωσης ασθενών με τιμές S100B>0,15μg/L, ανεξάρτητα από το στάδιο της νόσου και όταν οι τιμές S100B είναι >0,6μg/L πενταπλασιάζεται ο κίνδυνος θανάτου. 43

44 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1..Donato R1, Cannon BR, Sorci G, et al. Functions of S100 proteins Curr Mol Med Jan;13(1): Harpio R1, Einarsson R. S100 proteins as cancer biomarkers with focus on S100B in malignant melanoma. Clin Biochem Jul;37(7):512-8.Review 3. Salama I1, Malone PS, Mihaimeed F, Jones JL. A review of the S100 proteins in cancer. Eur J Surg Oncol Apr;34(4): Epub 2007 Jun Korfias S, Stranjalis G, Papadimitriou A, Psachoulia C, Daskalakis G, Antsaklis A, Sakas DE. Serum S- 100B protein as a biochemical marker of brain injury: a review of current conceptscurr Med Chem. 2006;13(30): Review 5. Stamataki E1, Stathopoulos A, Garini E, Kokkoris S, Glynos C, Psachoulia C, Pantziou H, Nanas S, Routsi C. Serum S100B protein is increased and correlates with interleukin 6, hypoperfusion indices, and outcome in patients admitted for surgical control of hemorrhage. Shock Oct;40(4): Smit LH, Korse CM, Bonfrer JM. Comparison of four different assays for determination of serum S- 100B.Int J Biol Markers Jan-Mar;20(1): Alber B1, Hein R, Garbe C, Caroli U, Luppa PB Multicenter evaluation of the analytical and clinical performance of the Elecsys S100 immunoassay in patients with malignant melanoma. Clin Chem Lab Med. 2005;43(5): Astrand R, Undén J, Romner B. Clinical use of the calcium-binding S100B protein.methods Mol Biol. 2013;963: doi: / _23. Review. 9. Brandner S, Thaler C, Buchfelder M, Kleindienst A. Brain-derived protein concentrations in the cerebrospinal fluid: contribution of trauma resulting from ventricular drain insertion. J.Neurotrauma Jul 1;30(13): Simone Mocellin,*, Giorgio Zavagno anddonato Nitti. The prognostic value of serum S100B in patients with cutaneous melanoma: A meta-analysis International Journal of Cancer. 15 November 2008 Volume 123, Issue 10, pages Gogas H, Eggermont AM, Hauschild A, Hersey P, Mohr P, Schadendorf D, Spatz A, Dummer R.Biomarkers in melanoma.ann Oncol Aug;20 Suppl 6:vi Peric B, Zagar I, Novakovic S, Zgajnar J, Hocevar M.Role of serum S100B and PET-CT in follow-up of patients with cutaneous melanoma.bmc Cancer Aug 2;11:328 44

45 Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ S-100B ΣΤΗΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΗ ΒΛΑΒΗ Στέφανος Ι. Κορφιάς Νευροχειρουργός, Λέκτορας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, Θεραπευτήριο «Ο Ευαγγελισμός» ΕΙΣΑΓΩΓΗ Νευρολογικά γεγονότα όπως τραύμα, αιμορραγία, ισχαιμία κ.ά. προκαλούν πρωτοπαθή βλάβη στα νευρικά και γλοιακά κύτταρα. Αυτή σε συνδυασμό με δευτερογενή επεισόδια απότοκα υποξίας, υπότασης, επιληπτικών κρίσεων, σήψης ή πυρετού μπορεί να προκαλέσουν δυσμενή αποτελέσματα στην εγκεφαλική λειτουργία και την τελική νευρολογική έκβαση του ασθενούς. Η διάγνωση και η αξιολόγηση της εγκεφαλικής βλάβης πραγματοποιείται με κλινικές μεθόδους (νευρολογική εξέταση, κλίμακα κώματος Γλασκώβης για το επίπεδο συνείδησης, αντίδραση των κορών των οφθαλμών, κλίμακα έκβασης Γλασκώβης) καθώς και με νευρο-απεικονιστικούς μεθόδους (αξονική μαγνητική τομογραφία, διακρανιακό Doppler, PET). Επιπλέον η ηλεκτρονευροφυσιολογία (προκλητά δυναμικά εγκεφαλικού στελέχους, σωματοαισθητικά / σωματοκινητικά δυναμικά, ηλεκτροεγκεφαλογράφημα), η αιμοδυναμική παραμέτρηση (καταγραφή της αρτηριακής πίεσης και του σφαγιτιδικού κορεσμού) και η επεμβατική νευροπαραμέτρηση (ενδοκράνια πίεση, πίεση εγκεφαλικής άρδευσης, εγκεφαλικό ιστικό οξυγόνο, μικροδιάλυση) αποτελούν επιπλέον εργαλεία για παραμέτρηση της εγκεφαλικής λειτουργίας και την πρόγνωση της κλινικής πορείας του ασθενούς. Παρόλα αυτά οι ανωτέρω μέθοδοι συχνά αποδεικνύονται μη επαρκείς στην αξιολόγηση και στην ποσοτικοποίηση της βαρύτητας της αρχικής καθώς και της εξελισσόμενης δευτερογενούς εγκεφαλικής βλάβης και κατά συνέπεια δεν είναι δυνατόν να ληφθούν εγκαίρως αποτελεσματικά θεραπευτικά μέτρα και να γίνει πρόγνωση της τελικής έκβασης. Το πρόβλημα γίνεται ακόμη πιο εμφανές σε κωματώδεις ασθενείς υπό την επήρεια βαρβιτουρικών, με τραύματα στο προσωπικό κρανίο, προϋπάρχουσες βλάβες της κόρης των οφθαλμών, σοβαρές εξωκράνιες βλάβες και ανεπαρκείς κλινικές και εργαστηριακές πληροφορίες. Γίνεται εμφανές ότι η έγκαιρη διάγνωση της επικείμενης νευρολογικής επιδείνωσης αποτελεί κύρια πρόκληση στην καθημερινή κλινική πράξη. Σε αντιστοιχία με άλλους βιοχημικούς δείκτες που παρέχουν πληροφορίες για την διάγνωση, τη βαρύτητα, την πορεία και το αποτέλεσμα της θεραπείας άλλων ασθενειών (troponin, PSA, creatinine, CAE, a-fet κ.ά.), ερευνητές τα τελευταία 15 χρόνια ασχολήθηκαν με ειδικούς δείκτες 45

46 εγκεφαλικής βλάβης με σκοπό να διευκολύνουν τη διάγνωση και την παραμέτρηση της νευρολογικής βλάβης. Βιοχημικοί δείκτες όπως η NSE, η LDH 1-3, η CK-BB είχαν προταθεί, αλλά λόγω μειωμένης ειδικότητας και ευαισθησίας η αξιοπιστία του αμφισβητήθηκε. Άλλοι δείκτες όπως η MBP (myelin basic protein) και η GFAP (glial fibrillary acidic protein) έχουν μετρηθεί στo αίμα και έχουν προταθεί ως συμπληρωματικοί δείκτες εγκεφαλικής βλάβης. ΠΡΩΤΕΪΝΗ S-100Β: ΒΙΟΧΗΜΙΑ & ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Ένα πλήθος μελετών έδειξε ότι η πρωτεΐνη S-100B αποτελεί τον πιο ιδανικό βιοχημικό δείκτη εγκεφαλικής βλάβης διότι έχει υψηλή ειδικότητα για τον εγκεφαλικό ιστό, υψηλή ευαισθησία για την εγκεφαλική βλάβη, δεν παρουσιάζει μεταβλητότητα με την ηλικία και το φύλο, εμφανίζεται γρήγορα στον ορό του αίματος μετά από την εγκατάσταση της νευρολογικής βλάβης και παραμένει σταθερή για αρκετό διάστημα χωρίς ανάγκη για άμεση μέτρηση. Η πρωτεΐνη S-100Β ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών με ικανότητα δέσμευσης ασβεστίου και έλαβε το όνομά της από τη διαλυτότητά της σε 100% κορεσμένο διάλυμα θειικού αμμωνίου (Moore 1965). Η S-100 αποτελεί ένα ομο- ή ετερο-διμερές από δύο πρωτεΐνες την S-100 Α και S- 100 Β. Οι τύποι της πρωτεΐνη S-100, S-100 ΑΒ και S-100 ΒΒ περιγράφονται ως S-100Β και παρουσιάζουν ψηλή ειδικότητα για το νευρικό ιστό. Ειδικότερα αφθονούν στο κυτταρόπλασμα των γλοιακών κυττάρων του κεντρικού και του περιφερικού νευρικού συστήματος (αστροκύτταρα και κύτταρα Schwann). Σε πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις εκφράζεται σε μελανοκύτταρα και σε κύτταρα λιπώδους ιστού και χόνδρου. Για τον υπολογισμό της στο αίμα οι περισσότεροι ερευνητές χρησιμοποιούν την μέθοδο ανοσοφωταύγειας Lia-mat Sangtec 100, (AB Sangtec Medical, Bromma, Sweden), η οποία εντοπίζει τη Β υπομονάδα της πρωτεΐνης S-100 με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Το διαγνωστικό όριο της μεθόδου βρίσκεται στα 0,02 μg/l, ενώ τιμές πάνω από 0,5 μg/l θεωρούνται παθολογικές, και μεταξύ 0,15 και 0,5 οριακές. Η πρωτεΐνη S-100Β συμμετέχει σε πλήθος ενδοκυττάριες λειτουργίες, διαμορφώνοντας επιπλέον την κυτταρική μορφολογία, τη νευρολογική ηλεκτρική δραστηριότητα και την ανοσοαντίδραση μέσω της ρύθμισης της λειτουργίας των μικρογλοιακών κυττάρων. Επιπλέον η S-100Β συμμετέχει σε εξωκυττάριες λειτουργίες, αν και ο μηχανισμός έκκρισης από τα γλοιακά κύτταρα προς τον εξωκυττάριο χώρο δεν είναι σαφής. Έχει μάλιστα διατυπωθεί ότι ο η συγκέντρωση της S-100Β στο αίμα εκφράζει το βαθμό ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Σε νανομοριακές 46

47 συγκεντρώσεις η S-100Β φαίνεται να έχει νευροπροστατευτική / νευροτροφική δράση. Αντίθετα σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις παρουσιάζει βλαπτική δράση επάγοντας νευρολογική κυτταρική απόπτωση. Έτσι ασθενείς με σύνδρομο Down, Alzheimer και σχιζοφρένεια παρουσιάζουν υπερέκφραση της πρωτεΐνης S-100Β σε εγκέφαλο και ορό. ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΕΣ ΒΛΑΒΕΣ & S-100Β Α. Βαρειά κάκωση κεφαλής Μετά από βαρειά κρανιοεγκεφαλική κάκωση S-100Β απελευθερώνεται α) άμεσα ως αποτέλεσμα της βλάβης του αιματο-εγκεφαλικού φραγμού και β) το διάστημα που ακολουθεί συνεπεία πιθανής 2ογενούς εγκεφαλικής βλάβης. Οι αρχικές συγκεντρώσεις της S-100Β έχουν βρεθεί να σχετίζονται άμεσα με το επίπεδο συνείδησης του ασθενούς, την αντίδραση των κορών του οφθαλμού κατά την εισαγωγή, τη βαρύτητα των νευροακτινολογικών ευρημάτων (σε αξονική τομογραφία) και την τελική έκβαση των ασθενών. Ειδικότερες τιμές > 2μg/L αποτελούν ισχυρό προγνωστικό δείκτη δυσμενούς έκβασης (θάνατος). Επίσης για κάθε 1μg/L αύξηση της S-100Β κατά την εισαγωγή, η πιθανότητα εγκεφαλικού θανάτου αυξάνεται περισσότερο από 2 φορές. Επιπλέον αυξημένες αρχικές τιμές S-100Β συσχετίστηκαν με διαταραχές της θυρεοειδικής λειτουργίας, ένα έτος μετά την κάκωση κεφαλής. Πρέπει εδώ να διευκρινισθεί ότι η ύπαρξη μικρότερων συγκεντρώσεων της S-100Β κυρίως σε λιπώδη και χόνδρινο ιστό, σε ασθενείς με αμιγές εξωκράνιο τραύμα (ιδιαίτερα σε αυτούς με κοιλιακό ή θωρακικό τραύμα), προκαλεί μικρότερη αλλά υπολογίσιμη αρχική αύξηση των τιμών της στο αίμα, οποίες όμως ελαττώνονται γρήγορα και γίνονται φυσιολογικές 2-3 μέρες μετά την κάκωση. Σε ασθενείς με βαρειά κάκωση κεφαλής και συστηματικό τραύμα, η συμμετοχή της εξωκράνιας S-100Β στη συνολική αύξηση των τιμών της, είναι αμελητέα. Β. Ελαφριά κάκωση κεφαλής Μετά από ελαφριά κάκωση κεφαλής παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της S-100Β που ακολουθείται από γρήγορη πτώσης της. Ιδιαίτερα οι ασθενείς με τιμές > 0,5μg/L παρουσιάζουν αυξημένη πιθανότητα για νευροακτινολογικά ευρήματα, για επίμονο μεταδιασεισικό σύνδρομο και διαταραχή της νευροψυχολογικής λειτουργίας μετατραυματικά. Στην κατηγορία των ασθενών με πολύ ελαφριά κάκωση κεφαλής (επίπεδο συνείδησης 15) χωρίς εξωκράνιο τραύμα, τιμές S-100Β > 0,15μg/L συσχετίσθηκαν με αδυναμία επιστροφής στην εργασία ή τις συνήθεις δραστηριότητες μία εβδομάδα μετά την κάκωση. Ενδεικτικές μελέτες σε ποδοσφαιριστές έδειξαν μικρή αύξηση της 47

48 S-100Β (0,18 μg/l) σχετιζόμενη με τον αριθμό των κεφαλιών αλλά με ταχεία επάνοδο στις φυσιολογικές τιμές. Γ. Αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο εγκεφαλική υποξία Σε ασθενείς με ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο οι τιμές S-100Β σχετίζονται με τον όγκο του ισχαιμικού εγκεφάλου, τη βαρύτητα της νευρολογικής εικόνας και της τελικής έκβασης, με μεγαλύτερες τιμές σε ασθενείς με έμφρακτο μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας ή έσω καρωτίδας. Σε ασθενείς που υφίστανται καρωτιδικό stenting ή ενδαρτηρεκτομή, η αύξηση της S-100Β συσχετίζεται με εμφάνιση μόνιμων νευρολογικών ελλειμμάτων. Επίσης η S-100Β βρέθηκε να συσχετίζεται με εγκεφαλική βλάβη και μετεγχειρητικά νευρολογικά και νευροψυχολογικά ελλείμματα, μετά από επέμβαση καρδιάς με καρδιοαναπνευστική παράκαμψη. Αυξημένες τιμές S-100Β 24 ώρες μετά από εγκεφαλική υποξία, απότοκη καρδιακής ανακοπής, πνιγμού ή οξείας απόφραξης του αεραγωγού, αποτελούν προγνωστικό παράγοντα μη απόκτησης της συνείδησης. Αντιστοίχως η S-100Β αποτελεί προγνωστικό παράγοντα έκβασης της εγκεφαλικής βλάβης σε νεογέννητα με ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια. Αυξημένες τιμές S-100Β αποτελούν εργαλείο ανίχνευσης ενδοκοιλιακής αιμορραγίας σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά και επίσης παρουσιάζονται στο μητρικό αίμα και στο αίμα του ομφάλιου λώρου κατά τον τοκετό σε περιπτώσεις εμβρύων με υπολειπόμενη ενδομήτρια ανάπτυξη (IUGR intrauterine growthretarded foetuses). Δ. Εγκεφαλική υπαραχνοειδής αιμορραγία Στην περίπτωση των ασθενών με αυτόματη υπαραχνοειδή αιμορραγία οι παράγοντες που διαμορφώνουν την έκβαση των ασθενών πέρα από την αρχική αιμορραγία είναι περισσότεροι και με μεγαλύτεροι βαρύτητα: αγγειόσπασμος, υποξία, οίδημα, επαναιμορραγία, υδροκέφαλος, εμβολιστικοί / χειρουργικοί χειρισμοί. Ιδιαίτερα σε κωματώδεις κατεσταλμένους και διασωληνωμένους ασθενείς με ανεπαρκείς κλινικές πληροφορίες, η χρήση βιοχημικών δεικτών έχει επιπρόσθετη σημασία. Μελέτες έδειξαν συσχέτιση μεταξύ της S-100Β ορού και κλινικής / απεικονιστικής βαρύτητας του ασθενούς και της τελικής έκβασής του. Αρχικές τιμές >0,3μg/L διπλασιάζουν τον τελικό κίνδυνο για δυσοίωνη έκβαση (θάνατο). 48

49 Ε. Όγκοι εγκεφάλου Τα μηνιγγιώματα εγκεφάλου είναι κατά βάση καλοήθεις όγκοι, ωστόσο η μετεγχειρητική τους πορεία επιβαρύνεται συχνά από παράγοντες όπως η επιδείνωση του περιεστιακού αγγειογενούς οιδήματος, και η πρόκληση μετεγχειρητικού ενδοκράνιου αιματώματος. Η άμεσα μετεγχειρητική τιμή καθώς και οι επόμενες καθημερινές μετρήσεις της S-100Β ορού βρέθηκε να συσχετίζονται με όγκους μεγαλύτερου μεγέθους (>4 εκ), σε δύσκολη χειρουργικά θέση, που κατά την εξαίρεσή τους υπήρχαν «χειρουργικές δυσκολίες», με αυξημένη πιθανότητα για μετεγχειρητική επιδείνωση συνεπεία αιματώματος ή εγκεφαλικού οιδήματος καθώς και με δυσμενή έκβαση εξαμήνου. Ασθενείς με μετεγχειρητικές τιμές >0.4 μg/l παρουσίασαν 9 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για μετεγχειρητική νευρολογική επιδείνωση και 11 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για δυσμενή έκβαση. Σε μία άλλη μελέτη σε γλοιώματα εγκεφάλου, οι ασθενείς με αυξημένες τιμές της S-100Β ορού βρέθηκαν να έχουν μικρότερη επιβίωση. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από όλα τα ανωτέρω γίνεται σαφές ότι η πρωτεΐνη S-100Β είναι ένας χρήσιμος βιοχημικός δείκτης αξιολόγησης της βαρύτητας της εγκεφαλικής βλάβης και της πρόγνωσης της έκβασης των νευρολογικών ασθενών. Ωστόσο περαιτέρω μελέτες απαιτούνται προκειμένου να καταστεί σαφής ο ακριβής βιοχημικός και νευροφυσιολογικός της ρόλος. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Dimopoulou I, Korfias S, Dafni U, Anthi A, Psachoulia C, Jullien G, Sakas DE, Roussos C. Protein S-100b serum levels in trauma-induced brain death. Neurology, 2003 Mar 25; 60(6): Dimopoulou I, Tsagarakis S, Korfias S, Zervakis D, Douka E, Thalassinos N, Sakas DE, Roussos C. Relationship of thyroid function to post-traumatic S-100b serum levels in survivors of severe head injury: preliminary results. Intensive Care Medicine, 2004 Feb; 30(2): Stranjalis G, Korfias S, Papapetrou C, Kouyialis AT, Boviatsis EJ, Psachoulia C, Sakas DE. 49

50 Elevated serum S-100B protein as a predictor of failure to short-term return to work or activities after mild head injury. Journal of Neurotrauma, 2004 Aug; 21(8): Stranjalis G, Korfias S, Psachoulia C, Boviatsis E, Kouyialis A, Protopappa D, Sakas DE. Serum S-100B as an indicator of early postoperative deterioration after meningioma surgery. Clinical Chemistry, 2005 Jan; 51(1): Korfias S, Stranjalis G, Psachoulia C, Vasiliadis C, Pitaridis M, Boviatsis E, Sakas DE. Slight and short-lasting increase of serum S-100B protein in extracranial trauma. Brain Injury, 2006 Jul; 28(8): Korfias S, G. Stranjalis G, Papadimitriou A, Psachoulia C, Daskalakis G, Antsaklis A, Sakas DE. Serum S-100B protein as a biochemical marker of brain injury: review current concepts. Current Medicinal Chemistry, 2006 Dec; 13(30): Korfias S, Stranjalis G, Boviatsis E, Psachoulia C, Jullien G, Gregson B, Mendelow AD, Sakas DE. Serum S-100B protein: monitoring in patients with severe traumatic brain injury. Intensive Care Medicine, 2007 Feb; 33(2): Stranjalis G, Korfias S, Psachoulia C, Kouyialis A, Sakas DE, Mendelow AD. The prognostic value of serum S-100B protein in spontaneous subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochirurgica, 2007 Mar; 149(3): Korfias S, Papadimitriou A, Stranjalis G, Bakoula C, Daskalakis G, Antsaklis A, Sakas DE. Serum biochemical markers of brain injury. Mini Rev Med Chem, 2009 Feb; 9(2):

51 ΠΡΩΤΕΪΝΗ S-100B ΚΑΙ ΚΥΗΣΗ ΥΨΗΛΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Αγγελική Α. Παπαδημητρίου, Μαιευτήρ-Γυναικολόγος, Διδάκτωρ Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με σκοπό: Α. Τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των εγκύων γυναικών πριν τον τοκετό και τη διερεύνηση της πιθανής συσχετίσεώς τους με το είδος της κύησης (φυσιολογική ή επιπλεγμένη), καθώς και με τους παράγοντες εκείνους που επιβαρύνουν την υγεία της μητέρας (δημογραφικά χαρακτηριστικά εγκύου, φαρμακευτική αγωγή, ιατρικό ιστορικό κ.ά.). Β. Τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών αμέσως μετά τον τοκετό και 24 ώρες μετά από αυτόν και τη διερεύνηση της πιθανής συσχετίσεώς τους με την προωρότητα καθώς και με τους παράγοντες εκείνους που εκφράζουν και παραμετρούν την κατάσταση του εμβρύου / νεογνού και προσδιορίζουν την τελική του έκβαση (NST, δημογραφικά χαρακτηριστικά νεογνού, ανάνηψη, Apgar score, παιδιατρική / νευρολογική εξέταση, σωματομετρικά χαρακτηριστικά, χολερυθρίνη κ.ά.) Γ. Τη διερεύνηση και την απεικόνιση της μεταβολής των συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών μέσα στις πρώτες 24 ώρες μετά τον τοκετό και την αναγνώριση των παραγόντων εκείνων (σχετιζόμενων με την κύηση ή το νεογνό), που την επηρεάζουν με τρόπο στατιστικά σημαντικό. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΣ Συνολικά έγινε λήψη αίματος από 67 έγκυες γυναίκες και 72 νεογνά, από τα οποία τα 33 ήταν άρρενα και 39 θήλεα. Στις έγκυες τα δείγματα αίματος για μέτρηση πρωτεΐνης S-100B λαμβάνονταν την ημέρα του τοκετού (πριν από τον τοκετό) και όσο το δυνατόν πλησιέστερα στην ώρα αυτού. Στα νεογνά τα δείγματα αίματος για μέτρηση πρωτεΐνης S-100B λαμβάνονταν αμέσως μετά τον τοκετό από την ομφαλική φλέβα και 24 ώρες μετά τον τοκετό από περιφερική φλέβα. Τα δείγματα αίματος μητέρων και νεογνών υποβάλλονταν σε φυγοκέντρηση και ο ορός ψύχονταν στους -18 o C και αποθηκεύονταν για ανάλυση. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης S-100B υπολογίζονταν με 51

52 τη μέθοδο ανοσο-χημειο-φωταύγειας της εταιρίας Sangtec (Liaison Sangtec 100, AB Sangtec Medical, Bromma, Sweden). Τιμές άνω του 0,5 μg/l θεωρούνται παθολογικές, αυτές μεταξύ 0,15 και 0,5 μg/l, οριακές, ενώ τιμές κάτω του 0,15 μg/l θεωρούνται φυσιολογικές. Για την αξιολόγηση της S-100B πραγματοποιήθηκε έλεγχος επίδρασης κάθε παράγοντα ξεχωριστά (μονοπαραγοντική ανάλυση) και κάθε παράγοντα ανά ομάδα νεογνών (πρόωρα, πρόωρα IUGR, τελειόμηνα, τελειόμηνα IUGR). Οι παράγοντες που επηρεάζουν στατιστικώς σημαντικά την S-100B συμπεριλήφθηκαν στη πολυπαραγοντική ανάλυση και χρησιμοποιώντας την μέθοδο stepwise και το κριτήριο Akaike βρέθηκε το βέλτιστο μοντέλο. Όλοι οι έλεγχοι ήταν αμφίπλευροι και το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο 5%. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε μέσω του στατιστικού λογισμικού προγράμματος SAS V9.2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αναλύονται ως εξής: Α. Αξιολόγηση της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των εγκύων πριν από τον τοκετό. 1. Έγκυες των οποίων οι κυήσεις κατέληξαν σε πρόωρο τοκετό έχουν αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης S-100B. 2. Έγκυες που λάμβαναν αντιυπερτασική ή άλλου είδους αγωγή (αντιεπιληπτικά, αντιπηκτικά, φάρμακα για θυρεοειδοπάθειες, ινσουλίνη) έχουν αυξημένες τιμές S-100B. 3. Έγκυες με προϋπάρχουσα νόσο όπως σακχαρώδης διαβήτης, επιληψία, θυρεοειδοπάθεια, νοσήματα του γαστρεντερικού (έλκος 12δακτύλου, γαστρίτιδα, χολοκυστοπάθεια), υψηλή μυωπία, είχαν αυξημένες τιμές S-100B έναντι εκείνων με ελεύθερο ιστορικό. 4. Έγκυες που υποβλήθηκαν σε επείγουσα καισαρική τομή είχαν αυξημένες τιμές S-100B. Β1. Αξιολόγηση της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών αμέσως μετά τον τοκετό. 1. Τα πρόωρα IUGR νεογνά ξεκινούν με χαμηλότερες τιμές S-100B αίματος όπως τα τελειόμηνα. 2. Πρόωρα IUGR νεογνά με μεγαλύτερο βάρος έχουν και μεγαλύτερη S-100B. 3. Τα πρόωρα νεογνά έχουν αυξημένες τιμές S-100B έναντι των υπολοίπων ομάδων. 52

53 Β2. Αξιολόγηση της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών 24 ώρες μετά τον τοκετό. 1. Τα νεογνά που δισωληνώθηκαν έχουν μειωμένες τιμές S-100B σε σχέση με αυτά που δεν υποβλήθηκαν σε ανάνηψη ή τους χορηγήθηκε Ο2. 2. Όσο μεγαλύτερη ήταν η ηλικία της μητέρας τόσο μικρότερη ήταν η τιμή της S-100B στα πρόωρα νεογνά. 3. Οι τιμές της S-100B είναι ελαττωμένες σε IUGR νεογνά με μεγαλύτερη περίμετρο κεφαλής. 4. Οι αυξημένες τιμές χολερυθρίνης συσχετίζονται με αυξημένες τιμές S-100B στα πρόωρα νεογνά. 5. Τα πρόωρα IUGR νεογνά έχουν στατιστικά σημαντικά πιο αυξημένες τιμές πρωτεΐνης S-100B έναντι των υπολοίπων ομάδων. Γ. Αξιολόγηση της μεταβολής των επιπέδων της πρωτεΐνης S-100B στο αίμα των νεογνών στο χρόνο. 1. Πρόωρα IUGR νεογνά με αυξημένο βάρος και μήκος έναντι των υπολοίπων, παρουσιάζουν μεγαλύτερη μεταβολή των τιμών της S-100B στο 24ωρο. 2. Οι τιμές της S-100B στο 24ωρο βαίνουν αυξανόμενες με την υπερηχογραφική ηλικία κύησης. 3. Η μεταβολή στο χρόνο της S-100B διαφέρει στατιστικά σημαντικά μεταξύ των νεογνών και παρουσιάζει το μεγαλύτερο βαθμό και ρυθμό αύξησης στα IUGR νεογνά. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Με τα ευρήματα αυτής της μελέτης μπορεί να υποστηριχθεί η άποψη ότι, ο προσδιορισμός των επιπέδων της πρωτεΐνης S-100Β στο αίμα τόσο στις μητέρες όσο και στα νεογνά, μπορεί να αποτελέσει έναν αξιόπιστο βιοχημικό δείκτη ελέγχου της υγείας της μητέρας και των νεογνών και ιδιαίτερα των προώρων IUGR τις πρώτες ημέρες μετά τον τοκετό και συμβάλλει στην έγκαιρη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων (π.χ. χορήγηση κατάλληλης αγωγής στη μητέρα, πρόκληση πρόωρου τοκετού, διενέργεια επείγουσας καισαρικής τομής, εισαγωγή σε ΜΕΝΝ κ.ά.). 53

54 ΠΑΡΑΚΛΙΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ-POCT Eίναι κλινικές εργαστηριακές εξετάσεις που διενεργούνται «παρά τον ασθενή» από κλινικό μη εργαστηριακό προσωπικό. Δήμα Κλεάνθη Επίκ. Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας, Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Εάν τα παρακλίνια μηχανήματα χρησιμοποιούνται σωστά βελτιώνουν την έκβαση της θεραπείας του ασθενούς γιατί δίνουν γρήγορα αποτελέσματα Όταν γίνεται κατάχρηση ή δεν χρησιμοποιούνται σωστά αποτελούν κίνδυνο για τον ασθενή Τα παρακλίνια μηχανήματα δεν αποτελούν απομονωμένη διαδικασία. Πρέπει να ενσωματώνονται στην συνολική φροντίδα του ασθενούς. Δεν αντικαθιστούν το Εργαστήριο, το βοηθούν στη ροή της δουλειάς του και εκείνο τους βοηθά στην δική τους. Η συνεργασία με τους κλινικούς γιατρούς είναι σημαντική για την σωστή αξιολόγηση των παρακλινίων εξετάσεων. Το 1998 οι εξετάσεις των παρακλινίων αποτελούσαν διεθνώς το 25% των IVD Το 2015 οι εξετάσεις των παρακλινίων θα αποτελούν διεθνώς το 31% -50% των IVD Οι δείκτες που συνήθως μετρώνται είναι: Ενέργεια Αγωγιμότητα Σύσπαση Οξεοβασική ισορροπία Oμεόσταση Καρδιακή ισχαιμία Αιμόσταση Σάκχαρο,Hb,Ht,pO2,ΗβΑ1 Κ+, Να+, Μg++,Ca++ Γαλακτικό οξύ ph,po2,tco2,hco3 P, Cl, κρεατινίνη, ουρία,wbc Μυοσφαιρίνη,CK-MB, Pro-BNP Τροπονίνη Ι/Τ, D-Dimer PT, PTT, ACT, Ht,αιμοπετάλια HIV,βHCG, ανάλυση ούρων 54

55 Τα τμήματα που κυρίως χρησιμοποιούν παρακλίνια μηχανήματα είναι : Οι Εντατικές μονάδες σήψη, Αέρια αίματος,σάκχαρο Τα ΤΕΠ Καρδιακοί Δείκτες Τα Χειρουργεία Έλεγχος Γλυκαιμίας, Πήξη Οι Θαλάμους/Κλινικές για διαβητικούς ασθενείς, καρδιολογικούς ασθενείς Τα πλεονεκτήματα των παρακλινίων μηχανημάτων Άμεσα αποτελέσματα-βελτιωμένος χρόνος διεκπεραίωσης(τατ) Μικρός όγκος δείγματος-ευκολότερη λήψη Ελάττωση του προαναλυτικού λάθους Ελάττωση χρόνου παραμονής στα ΤΕΠ ή/και στο Νοσοκομείο Πιο άμεση φροντίδα του ασθενούς Ο ασθενής είναι περισσότερο ικανοποιημένος Ταχύτερη διαχείριση των βαρέως πασχόντων Τα μειονεκτήματα των παρακλινίων μηχανημάτων Μεγαλύτερο κόστος Εκπαίδευση Συντήρηση του ποιοτικού ελέγχου και διασφάλιση ποιότητας ώστε τα αποτελέσματα να είναι αξιόπιστα; Έλεγχος της διαγνωστικής διαδικασία Προαναλυτικό λάθος* 55

56 Άλλα πλεονεκτήματα των παρακλινίων μηχανημάτων 1. Καθόλου σωληνάκια 2. Μετακινούμενα όργανα-εύκολη εγκατάσταση 3. Ασφάλεια 4. Μικρή ποσότητα δείγματος 5. Γρήγορος χρόνος διεκπεραίωσης 6. Καλό συνολικό κόστος 7. Μικρό προαναλυτικό λάθος 8. Εύκολη διαχείριση από τον γιατρό 9.Ενσωμάτωση της εξέτασης στην κλινική διαδικασία Διαπίστευση Η CLIA (clinical laboratory improvement amendment regulations) το 1988 ορίζει ότι για όλες τις εργαστηριακές εξετάσεις ανεξαρτήτως του τόπου διεξαγωγής τους απαιτούνται τα ίδια κριτήρια διαπίστευσης Οι οργανισμοί που δίνουν διαπίστευση είναι CAP, College of American Pathologists, TJC, Joint Comission Oι οργανισμοί που δημιουργούν τα πρότυπα είναι CLSI IFCC Clinical and Laboratory Standard Institute International Federation of Clinical Chemistry Η CLIA ταξινόμησε τις εργαστηριακές εξετάσεις σε 2 κατηγορίες βάσει της πολυπλοκότητας τους Waived Απλές και Ακριβείς με ελάχιστη πιθανότητα λάθους. Ακολουθούνται οι οδηγίες του Κατασκευαστή No waived Μικροσκοσκοπικές, Μεσαίας πολυπλοκότητας, Yψηλής πολυπλοκότητας 56

57 Οι παρακλίνιες εξετάσεις είναι κυρίως waived ή μεσαίας πολυπλοκότητας. Και για τις 2 κατηγορίες απαιτείται διαπίστευση όταν διενεργούνται σε ένα ίδρυμα. Οι χρήστες των παρακλινίων συσκευών είναι υπεύθυνοι για την διεκπεραίωση των δειγμάτων. Το εργαστήριο είναι υπεύθυνο για την διασφάλιση αξιόπιστων αποτελεσμάτων και την γνωστική επάρκεια των χρηστών Μία Πολυκεντρική Επιτροπή (γιατροί, νοσηλευτές, εργαστηριακοί, άτομα της πληροφορικής, άτομα από το γραφείο προμηθειών, άτομα από την επιτροπή λοιμώξεων) εγκαθιστά και επιβλέπει όλα τα προγράμματα των παρακλίνιων εξετάσεων,δημιουργεί διαδικασίες και κανόνες,μελετά τις προτάσεις για νέα παρακλίνια μηχανήματα. Η Επιτροπή των χρηστών που χειρίζονται τις συσκευές διασφαλίζει την καλή χρήση τους. Ο Συντονιστής των παρακλινίων (Point of care coordinator )επιβλέπει όλες τις διαδικασίες. Βασικά χαρακτηριστικά μιας παρακλίνιας συσκευής Αυτόνομη και ευέλικτη Απλή στην χρήση Δείγμα: ολικό αίμα ή ούρα Εύκολη συντήρηση Bar-code για αντιδραστήρια και ορούς ελέγχου Αντιδραστήρια σταθερά σε θερμοκρασία δωματίου Εκτύπωση αποτελεσμάτων Διασύνδεση με LIS Εξυπνο Λογισμικό 57

58 THE WHERE AND WHEN OF POCT Dr Samuel Murray BioMarkers Solutions Ltd, England Our current perception of Point of Care Testing (POCT) is a little obscure principally due to technological advances, inadequacies in guidance and standards, but also on the availability of an increasing number of devices and small home based testing kits. For over a decade homepregnancy tests have been drummed home by Hollywood, however, in todays omics revolution of personalised medicine POCT creates many challenges and potentially many conundrums. Technological and ethical movement from more simplified Home Based Tests (HBT) such as monitoring of blood glucose levels for Diabetes sufferer s re-insulin injection (a common practice in over 13M people, HBT approaching $30B by 2017) to a hand held device that screens for FMF as a routine requirement before nuptials requires several levels of monitoring. These include technological assessment (IVD versus CE Mark status), performance in the field (Point of Care) with current requirements ISO plus ISO (POCT) and local authority approval (EOF). To date there are several smaller low level technology POCT devices available which are in essence HBTs. Regulatory authorities are however going to face several dilemmas and challenges in the immediate future with an underlying series of POCT devices that will significantly challenge regulators with respect to monitoring and ensuring safety in reporting output and quality. After years of external quality assessment programmes for all levels of standard diagnostics (microbiological, biochemical, genetic, etc) both the EU and individuals involved in quality assessment realise the possible level of known dangers, and are foretelling the unknown dangers of a plethora of devices that have as their target not only the POCT market but also the HBT market. The highest threshold for escape from the umbrella of regulation is a thin line between POCT and HBT. Obviously there are merits for several diagnostics flowing into the HBT category, inclusive of high level diagnostics, however, is the technology robust enough for your genome to be read in your local pharmacy? 58

59 ΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΤΩΝ ΚΒΑΝΤΙΚΩΝ ΤΕΛΕΙΩΝ (QUANTUM DOTS) ΣΤΗΝ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ Β. Σπυρόπουλος Καθηγητής Τμήματος Βιοϊατρικής Τεχνολογίας ΤΕΙ Αθήνας 1. Εισαγωγή Κατά τα τελευταία 30 χρόνια, έχουν αναπτυχθεί πολλά είδη «κβαντικών τελειών» (κουκίδων, κηλίδων, quantum dots, QDs) σε διάφορους τομείς εφαρμογής, βασισμένες σε νανοκρυστάλλους από στοιχεία των ομάδων III-V, II - VI, ή IV -VI του περιοδικού πίνακα (π.χ. CdS, CdSe, CdTe κλπ.), που έχουν δώσει εξαιρετικά αποτελέσματα σε Βιοανιχνευτές και στην in νίνο απεικόνιση. Ο προσδιορισμός της κβαντικής τελείας ως περίπτωσης ενός ημιαγωγού, αυστηρά μηδενικής μαθηματικά διάστασης, στην πράξη δεν ισχύει, γιατί η κβαντική τελεία είναι μια δομή με μέγεθος από μερικά νανόμετρα μέχρι μερικές δεκάδες νανόμετρα. Για τον λόγο αυτό οι όροι κηλίδες ή κουκκίδες θα ήταν ακριβέτεροι. Η παρατηρούμενη κυτταροτοξικότητα των υλικών και κυρίως των ιόντων Καδμίου, οδήγησε την Έρευνα στην κατεύθυνση της ανάπτυξης QDs Πυριτίου, Άνθρακα και Γραφενίων συμβατών για την εφαρμογή τους στην Ιατρική και στη Βιολογία. Σε αυτή την εργασία θα εξετάσουμε: Τι είναι οι κβαντικές τελείες και τα τα είδη των «παραδοσιακών» QDs. Tην συγγένεια και τη συνέργειά τους με τις Διόδους LASER. Θα παρουσιάσουμε τις αναδυόμενες QDs Πυριτίου, Άνθρακα και κυρίως Γραφενίων. Θα αναφερθούμε σύντομα στα μεταλλικά Νανοσυμπλέγματα (Nanoclusters), ως μια άλλη εναλλακτική αναδυόμενη λύση Φωτο-φωταύγειας, στην in vitro Διαγνωστική. Θα προσεγγίσουμε την εξέλιξη των Τεχνολογιών αυτών των ιδιαίτερων Νανοδομών και των εφαρμογών τους, όπως εμφανίζεται κυρίως σε Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας. Τέλος, θα προσπαθήσουμε να βγάλουμε κάποια συμπεράσματα για τις μελλοντικές προοπτικές τους στην in vitro Διαγνωστική. 2. Τι είναι οι κβαντικές τελείες; Μια κβαντική τελεία είναι συνήθως ένας νανοκρύσταλλος ημιαγώγιμου υλικού, που είναι αρκετά μικρός, ώστε να εμφανίζονται κβαντομηχανικές ιδιότητες και φαινόμενα. Οι φυσικές ιδιότητες των 59

60 υλικών αυτών είναι ανάμεσα σε αυτές των ευμεγεθών ημιαγωγών και των διακριτών τυπικών «μορίων».. Έχουν μελετηθεί εφαρμογές των QDs σε κρυσταλλοτριόδους, σε ηλιακά κύτταρα, σε LED, σε LASER-διόδων, σε οθόνες κλπ. και οι σχετικές εργασίες εμφανίζονται στις Εικόνες 1-2. Εικόνα 1. Η Eργασία (1981) των Ekimov & Onushchenko [Pis ma Zh. Eksp. Teor. Fiz. 34, No. 6, ]. Εικόνα 2. Ο τίτλος και η Περίληψη της εργασίας των Rosseti, Nakahara & Brus. (1983). [Βλ. ιστότοπο: 60

61 Οι κβαντικές τελείες εντοπίσθηκαν σε στερεή φάση από τον Alexei Ekimov και σε κολλοειδή διαλύματα από τον Louis E. Brus Οι φυσικές ιδιότητες μιας κβαντικής τελείας, έχουν στενή σχέση με το μέγεθος και το σχήμα της. Για παράδειγμα, το χάσμα των ενεργειακών ζωνών σε μια κβαντική τελεία, το οποίο καθορίζει την περιοχή συχνοτήτων του εκπεμπόμενου φωτός, είναι αντιστρόφως ανάλογο προς το μέγεθος της. H συχνότητα του εκπεμπόμενου φωτός αυξάνει καθώς το μέγεθος των κβαντικών τελειών μειώνεται, δηλαδή το χρώμα του φωτός που εκπέμπεται μεταβάλλεται από το κόκκινο προς το κυανούν. Η διέγερση και η εκπομπή των κβαντικών τελειών μπορεί να ελέγχεται με ακρίβεια, δεδομένου ότι το μέγεθος των QDs προσδιορίζεται επακριβώς στην διάρκεια της διαδικασίας παραγωγή τους. Αυτό συμβαίνει, γιατί τα «εξιτόνια» τους περιορίζονται στις τρεις χωρικές διαστάσεις. Το εξιτόνιο είναι ένα ζεύγος ηλεκτρονίου-οπής (ημισωμάτιο), που προκύπτει κατά τη διέγερση ενός ηλεκτρονίου από τη ζώνη σθένους και τη μετάβασή του, στη ζώνη αγωγιμότητας. Σε έναν «κόκκο» ημιαγωγού κρυστάλλου, του οποίου η διάμετρος είναι μικρότερη από το μέγεθος της εξιτονικής ακτίνας του, δηλαδή της απόστασης ανάμεσα στο ηλεκτρόνιο και στην οπή που δημιούργησε, τα εξιτόνια συμπιέζονται, οδηγώντας στο φαινόμενο του «Kβαντικού Εντοπισμού». Ο κβαντικός εντοπισμός συνίσταται στην εμφάνιση διακριτών ενεργειακών σταθμών στη θέση της ζώνης αγωγιμότητας, που οφείλεται στον σχετικά περιορισμένο αριθμό ατόμων, που απαρτίζουν την κβαντική τελεία. Η μετατροπή των συνεχών ζωνών αγωγιμότητας και σθένους, σε διακριτές ενεργειακές στάθμες, ορίζει τη μετάβαση από τον εκτεταμένο ημιαγωγό στην κβαντική τελεία και ερμηνεύει την εξάρτηση του μήκους κύματος (δηλαδή του χρώματος) της εκπεμπομένης ακτινοβολίας αποδιέγερσης των νανοκρυστάλλων ημιαγωγών, από το μέγεθός τους. Στην Εικόνα 3 εμφανίζεται και εξηγείται σχηματικά, το γιατί η τιμή του Ενεργειακού Χάσματος είναι αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος του νανοκρυστάλλου και ταυτόχρονα το γιατί η συχνότητα του εκπεμπόμενου φωτός αυξάνει, καθώς το μέγεθος των κβαντικών τελειών μειώνεται. 61

62 Α Β Γ Εικόνα 3. Α: Τιμές εξιτονικών ακτίνων Bohr για συνήθεις ημιαγωγούς. Β: Εξιτόνιο (Wannier-Mott) σε ημιαγωγό με την απόσταση ηλεκτρονίου-οπής να είναι μεγαλύτερη από τη σταθερά του πλέγματος. Γ: Η εμφάνιση του κβαντικού εντοπισμού και η διαμόρφωση του ενεργειακού χάσματος, σύμφωνα με το μέγεθος του νανοκρυστάλλου της κβαντικής τελείας [Βλ. Α. Φ. Ολζιέρσκυ, Μελέτη και Ανάπτυξη Συστοιχιών Νανοκρυσταλλιτών Ημιαγωγών σε Μήτρα Μονωτικού για Εφαρμογές σε Μνήμες, Διδακτορική Διατριβή, ΕΚΠΑ, Αθήνα 2006]. 62

63 3. LASERs Διόδων (LDs) και Κβαντικών Τελειών (QDs) Μια δίοδος LASER (LD), είναι ένα ηλεκτρικά αντλούμενο LASER ημιαγωγών, στο οποίο το δραστικό μέσον σχηματίζεται από μία p-n επαφή μιας διόδου ημιαγωγού, βρίσκονται σε μια δίοδο εκπομπής φωτός (LED). παρόμοια με αυτές που Η LD είναι ο πιο κοινός τύπος LASER και έχει ένα ευρύτατο φάσμα χρήσεων (επικοινωνίες μέσω οπτικών ινών, αναγνώστες barcode, δείκτες LASER, συσκευές CD / DVD / Blu-ray, εκτύπωση με LASER κλπ.). Number of Patent Documents related with general applications of each LASER type included KTP; 253 Nd:YAG; 1522 Krypton; 219 Ho:YAG; 42 Excimer; 7201 Ruby; 374 Alexandrite; 61 Argon; 1861 CO2; 3275 Copper Vapor; 206 Diode ; Εικόνα 4. Αριστερά: Αριθμός Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας ( ) για διάφορους τύπους LASER με κυρίαρχες τις LDs. [Βλ. B. Spyropoulos, 50 years LASERS: In vitro Diagnostics, Clinical Applications and Perspectives, Clin. Lab. 2011;57, pp ]. Δεξιά: Η πρωτοπόρα Εργασία της ομάδας του R. Hall (1962) Coherent Light emission from GaAs junctions [Βλ. Physical Review Letters, Vol. 9, Nr. 9]. Τα QDs LASERs είναι LASERs ημιαγωγών, που χρησιμοποιούν κβαντικές τελείες ως ενεργό μέσο. Λόγω του «στενού» περιορισμού των φορέων φορτίου σε κβαντικές τελείες, τα QDs LASERs παρουσιάζουν μια ηλεκτρονική δομή, παρόμοια με τα άτομα. Τα QDs LASERs βρίσκονται πιο κοντά στις επιδόσεις των LASERs Αερίων και δεν εμφανίζουν μερικές από τις αρνητικές πτυχές των παραδοσιακών LASERs ημιαγωγών, που βασίζονται π.χ. σε χύδην ημιαγώγιμα υλικά, όπως το εύρος διαμόρφωσης, το κατώφλιο εκπομπής, η σχέση έντασης-θορύβου κλπ. Η ενεργή περιοχή μπορεί επίσης να κατασκευάζεται για να λειτουργεί σε διαφορετικά μήκη κύματος, μεταβάλλοντας το μέγεθος και τη σύνθεση του LASER κβαντικής τελείας, που δεν ήταν διαθέσιμα προηγουμένως. 63

64 Εικόνα 5. Σχηματική απόδοση της δομής των ενεργειακών ζωνών ενός QD-LASER με αυτοοργανούμενες QDs με ορθή πόλωση. Απεικονίζονται σχηματικά τρισδιάστατες συστοιχίες QDs, ευθυγραμμισμένες εγκάρσια, προς την κατεύθυνση της ανάπτυξης των επάλληλων πολλαπλών στρωμάτων τους [Βλ. ]. Γίνεται αμέσως κατανοητή η στενή συγγένεια των LASERs Διόδων (LDs) και των Κβαντικών Τελειών (QDs), τόσο αναφορικά με τις βασικές αρχές της Κβαντικής Φυσικής που διέπουν τις λειτουργίες τους, όσο και με τα πεδία εφαρμογών τους, τα οποία γειτνιάζουν και αλληλοσυμπληρώνονται. Ο συνδυασμός τους υπόσχεται να παράξει σύντομα μικροσκοπικά όργανα, που θα συνδυάζουν μικρο- ή νάνο QD-LASERs, τα οποία θα μπορούν να διεγείρουν δυσάριθμες Κβαντικές Τελείες, κάθε μία από τις οποίες θα μας μεταφέρουν σημαντικές πληροφορίες, για πολλές και μεγάλες ομάδες κρίσιμων και διαφορετικών μεταξύ τους Βιομορίων. Όμως ουδέν καλόν αμιγές κακού Number of QDs related IP-Docs per Publication Year QDs related IP-Docs per year 449 IP-Docs per Year QD-LASER related IP-Docs published vs. Priority Year Priority Year QDs LASERS related IP-Docs 5 2 Εικόνα 6. Η χρονική εξέλιξη των σχετιζόμενων με QDs (Αριστερά) και QD-LASERs (Δεξιά) εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας συναρτήσει της χρονολογίας προτεραιότητας ( ). 64

65 Εικόνα 7. Αριστερά: Η συνθετική διαδικασία παραγωγής μιας από τις νεώτερες QDs, δηλαδή της CdSeTe επί ZnS-SiO2 [He Y, Lu HT, Sai LM, Su YY, Hu M, Fan CH, Huang W, Wang LH (2008) Microwave synthesis of water-dispersed CdTe/CdS/ZnS core-shell-shell quantum dots with excellent photostability and biocompatibility. Adv Mater 20(18): ]. Δεξιά: Δομή μιας πολυδύναμης Κβαντικής Τελείας. Εμφανίζεται το «κάλυμμα» ΤΟΡΟ, ένα εγκιβωτίζον πολυμερές στρώμα, επίτοποι που στοχεύουν όγκους, (όπως Πεπτίδια, Αντισώματα, ή μικρά μόρια αναστολέων) και Πολυαιθυλ. Γλυκόλη (PEG) [X. Gao, Y. Cui, R.M. Levisohn, L.W. Chung and S. Nie, In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots, Nat Biotechnology 22 (2004), ]. 4. QDs Πυριτίου Άνθρακα και Γραφενίων Το Πυρίτιο Οι ανησυχίες για την εξαιρετικά πιθανή τοξικότητα των συμβατικών QDs που περιέχουν μέταλλα, έχουν στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον, στους κολλοειδείς Νανοκρυστάλλους πυριτίου (Si-NCs ) ή σε Κβαντικές τελείες πυριτίου (Si-QDs) με εφαρμογές φθοριζόντων βιο-επισημασμένων παραγόντων. Την τελευταία δεκαετία έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στην κατανόηση της θεμελιώδους Φυσικής και των επιφανειακών ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων Πυριτίου, που βασίζεται στην 65

66 δυνατότητα προετοιμασίας και χαρακτηρισμού κολλοειδών νανοκρυστάλλων Πυριτίου, αδρανοποιημένων πάνω σε κατάλληλες επιφάνειες. Εικόνα 8. Αριστερά: Φάσμα εκπομπής QDs ημιαγωγών ανάλογα με το μέγεθος των Νανοκρυστάλλων [Βλ. π.χ. isplays.aspx]. Δεξιά: Φάσμα εκπομπής QDs Πυριτίου (Si-QDs) [Βλ. π.χ. Xiaoyu Cheng et al. Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 2680 και A. Gupta, M. T. Swihart and H. Wiggers, Adv. Funct. Mater.,2009, 19, ]. Τα διαφορετικά πιθανά εμπόδια (φράγματα) Δυναμικού, επηρεάζουν τις ιδιότητες της Φωτοφωταύγειας (Ρhotoluminescence, PL), συμπεριλαμβανομένων: Των μηκών κύματος της κορυφής της Φωτοεκπομπής, Της κβαντικής απόδοσης (quantum yield QY), Την εμφάνιση των «θυγατρικών κορυφών». Την διάρκεια ζωής Φθορισμού (t). 66

67 Εικόνα 9. Σχηματική αναπαράσταση των βασικών στρατηγικών της τροποποίησης της επιφάνειας των κολλοειδών Κβαντικών Τελειών Πυριτίου, σχηματίζοντας Ομοιοπολικούς Δεσμούς. Από αριστερά: Η επιφάνεια των SiQDs, οι στρατηγικές τροποποίησης της επιφάνειάς τους και παραδείγματα των απομακρυσμένων Μορίων [Xiaoyu Cheng, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, ]. Η απουσία ενός κελύφους ημιαγωγού, μειώνει το βαθμό του «Kβαντικού Εντοπισμού» των Εξιτονίων στον πυρήνα και συνεπώς διευρύνει την κορυφή εκπομπής, όπως φαίνεται στην Εικόνα 8. Αντίθετα με τις συμβατικές κβαντικές τελείες πλέγματος ημιαγωγών, με διάκριση πυρήνα - κελύφους, οι κβαντικές τελείες Πυριτίου (Si-QDs) παρασκευάζονται συνήθως με «τερματική επιφάνεια» Υδρογόνου, Αλογόνου ή Οξείδιων (Βλ. Εικόνα 9). Λόγω της απουσίας στρώματος φραγμού ημιαγωγών (lattice-matched semi-conductor barrier layer), οι επιφανειακές τους ιδιότητες έχουν ιδιαίτερη σημασία στον καθορισμό της Φωτοφυσικής των Si-QDs. Στην πράξη, τα Si-QDs που παρασκευάζονται μέσω μέθοδων κολλοειδών διαλυμάτων, εκπέμπουν κυρίως στην περοχή κυανού πρασίνου, ενώ οι κβαντικές τελείες που εκπέμπουν στο κόκκινο, μπορούν να παρασκευαστούν μέχρι σήμερα, μόνο μέσω μεθόδων υψηλής θερμοκρασίας ή με νανο-χαρακτική (nano-etching). Σε σύγκριση με τα διαθέσιμα πρωτόκολλα παρασκευής Κβαντικών Τελειών με βάση το Kάδμιο, τα αντίστοιχα πρωτόκολλα για τη σύνθεση Si-QDs είναι περιορισμένα και περιλαμβάνουν κυρίως: Μεθόδους φάσης διαλύματος. Σύνθεση μικρογαλακτώματος. Θερμικά επαγόμενη δυσαναλογοποίηση του στερεού Ηydrogen Silsesquioxane (HSQ) σε αναγωγική ατμόσφαιρα. Ο Άνθρακας και τα Γραφένια Ο Άνθρακας είναι ένα άφθονο και φθηνό υλικό και η μοναδική δομή του, έχει ένα πλεονέκτημα σε σχέση με τις καθαρά sp2- (αλλοτροπικές) μορφές του, για την παραγωγή κβαντικών τελειών. Ο κρυσταλλικός άνθρακας εκτοπίζεται οξειδωτικά ευκολώτερα από τις καθαρές δομές sp2-άνθρακα που χρησιμοποιείται, οδηγώντας σε μεγέθους νανομέτρων κβαντικές τελείες Γραφενίου, με άμορφο άνθρακα στις ακμές. Οι κβαντικές τελείες γραφενίου, που απομονώνονται με απόδοση 67

68 μέχρι και 20% από τον άνθρακα, είναι διαλυτές και φθορίζουσες σε υδατικό διάλυμα, υποσχόμενες πολλές Βιοϊατρικές εφαρμογές. Οι τελείες Άνθρακα (Carbon Dots, CDs) είναι μια νέα κατηγορία των Νανοϋλικών του Άνθρακα, με μεγέθη κάτω των 10 nm, που απομονώθηκαν για πρώτη φορά, κατά τη διάρκεια καθαρισμού του μονού τοιχώματος νανοσωλήνων Άνθρακα, μέσω παρασκευαστικής Ηλεκτροφόρησης το 2004 [Xu XY et al. 2004), Electrophoretic analysis and purification of fluorescent single-walled carbon nanotube fragments, J Am Chem Soc 126(40): ]. Όταν το μέγεθος και η δομή του γραφενίου ελέγχονται σωστά, επάγεται φωτοφωταύγεια γραφενίου, με αποτέλεσμα το λεγόμενο Φθορίζον Γραφένιο (FG). Η φωταύγεια του FG εξαρτάται από το μέγεθος, την «πλεγματική βλάβη» και το μήκος κύματος εκπομπής, δηλαδή από παρόμοιους παράγοντες με τις «παραδοσιακές» Κβαντικές Τελείες ημιαγωγών. Επιπλέον, με: Την εξαιρετική χημική σταθερότητα. Την βιοσυμβατότητα. Την χαμηλή τοξικότητα. Την δυνατότητα up-conversion εκπομπών (μετατροπή ενός σήματος σε σήμα υψηλότερης ανάλυσης). Την ευαισθησία στις μεταβολές του ph. Την αντίσταση στη φωτολεύκανση κλπ. τα FGs υπόσχoνται σημαντικές εφαρμογές σε πολλούς τομείς των Βιοεπιστημών. Επιπλέον, τα CDs μπορούν να εμφανίζουν εκπομπή Φωτο-φωταύγεια (PL) στην φασματική περιοχή του εγγύς Υπερύθρου (Νear-infrared, NIR ), περιοχή ιδιαίτερα σημαντική και χρήσιμη στην in vivo Διαγνωστική, λόγω του χαμηλού Αυτοφθορισμού και την υψηλή διαφάνεια των ιστών στην περιοχή του NIR. 68

69 Οι συνθετικές μέθοδοι για την για τη σύνθεση των C-QDs και των G-QDs, κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες, στις top-down και bottom up μεθόδους: Εικόνα 10. Σχηματικό διάγραμμα της ηλεκτροχημικής κατασκευή του Κβαντικών Τελειών Άνθρακα (a) και η υδροθερμική κοπή των οξειδωμένων φύλλων Γραφενίου σε G-QDs (b). Μια μικτή εποξική αλυσίδα αποτελείται από ομάδες ζευγών εποξικών και καρβονυλίων (αριστερά) και μετατρέπεται σε μια πλήρη τομή (δεξιά) στο πλαίσιο της υδροθερμικής επεξεργασίας. [Βλ. Li HT, Kang ZH, Liu Y, Lee S-T (2012) Carbon nanodots: synthesis, properties and applications. J Mater Chem 22: καθώς και το Pan DY, Zhang JC, Li Z, Wu MH (2010) Hydrothermal route for cutting graphene sheets into blue-luminescent graphene quantum dots. Adv Mater 22(6): ]. Οι μέθοδοι top-down συνήθως κάνουν χρήση της εκτομής με LASER και Ηλεκτροχημική οξείδωση, όπου οι C-QDs και G-QDs σχηματίζονται ή αποσπώνται από μια μεγαλύτερη δομή του άνθρακα και μεγαλύτερα φύλλα γραφενίου αντίστοιχα. Οι bottom-up προσεγγίσεις συνήθως αναφέρονται σε μεθόδους Χημείας Διαλυμάτων, κατά τη διάρκεια των οποίων, οι C-QDs και G-QDs σχηματίζονται από μόρια πρόδρομων ουσιών. 69

70 Εικόνα 11. (α) Εικόνα μέσω Μικροσκοπίας Ατομικών Δυνάμεων (AFM) των G-QDs που έχουν εναποτεθεί πάνω σε πρόσφατα υποστρώματα Μαρμαρυγία, (β) Ύψος προφίλ κατά μήκος της γραμμής στο (α) και (γ) Κατανομή Ύψους των G-QDs [Βλ. Minmin Xie et al. Blue and green photoluminescence graphene quantum dots synthesized from carbonfibers, Materials Letters 93 (2013) ]. 5. Νανοσυμπλέγματα Mετάλλων (Metal Nanoclusters, NCs) Πρόσφατες πρόοδοι στην Έρευνα στα Νανοϋλικά έχουν οδηγήσει σε μία νέα κατηγορία μορίων- Βιοανιχνευτών συνδυσμένων με φθορίζοντες ιχνηθέτες, που βασίζονται σε Νανοσυμπλέγματα ευγενών μετάλλων, όπως ο Au και ο Ag κλπ. Ειδικότερα, το μήκος κύματος εκπομπής του μεταλλικού νανο-συμπλέγματος, μπορεί να ρυθμιστεί με την αλλαγή των μορίων-«καλυμάτων», ενώ απαιτείται μια μοναδική φωτεινή πηγή για την ταυτόχρονη διέγερση, όλων των διαφορετικών νανοσυμπλεγμάτων, με παρόμοιο τρόπο που συμπεριφέρονται, οι κβαντικές τελείες ημιαγωγών. Όσον αφορα στη Βιομοριακής σύζευξη και την κατά συνέπεια Βιοϊατρική εφαρμογή της, τα μεταλλικά νανοσυμπλέγματα εκπομπής χρώματος, παράγονται χρησιμοποιώντας τη σύνθεση που βασίζεται στην ήδη υπάρχουσα εμπειρία και με καινοτόμες βελτιώσεις των πρότυπων. Ενδεικτικά χρησιμοποιούνται: Δενδριμερή. Ολιγονουκλεοτίδια. 70

71 Πρωτεΐνες. Πολυηλεκτρολύτες. Πολυμερή. σε συνδυασμό με σύνθεση μονοστρωματικά προστατευμένων Νανοσυμπλεγμάτων (monolayerprotected Νanoclusters, MP-C ή MP-NC). Τα υψηλής ποιότητας Νανοσυμπλέγματα ευγενών μετάλλων, είναι σχετικά Βιοσυμβατά και περισσότερο σταθερά, έναντι της φωτολεύκανσης, σε σύγκριση με τις οργανικές χρωστικές ουσίες και αυτές οι οπτικές ιδιότητες τα καθιστούν κατάλληλα «Φθοριοχρώματα», για Βιοϊατρικές πολυχρωματικές εφαρμογές και εφαρμογές πολυπλεξίας μικροσυστοιχιών, σε αυτόματους Αναλυτές και σε εφαρμογές lab-on-a-chip. Εικόνα 12. Αριστερά: Χαρακτηριστικά Νανοσυμπλέγματα ευγενών μετάλλων σε αύξουσα κλίμακα του μήκους κύματος εκπομπής τους, για τα συγκεκριμένα προστατευόμενα μόρια. Δεξιά: Εικόνα Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου (SEM) του Οξύ (DHLA), καθώς και τέσσερα διακριτά χρώματα εκπομπής Νανοσυμπλεγμάτων φθορίζοντος Χρυσού, με διέγερση από λευκό φώς και από λυχνία UV. [Βλ. Cheng-An J. Lin et al. Review: Synthesis of Fluorescent Metallic Nanoclusters toward Biomedical Application: Recent Progress and Present Challenges, J. Med. Biol. Eng., Vol No ]. 71

72 Εικόνα 13. Σχηματική αναπαράσταση της σύνθεσης του DNA-σταθεροποιουμένου Ag-NC [Βλ. Petty JT, Zheng J, Hud NV, Dickson RM (2004) DNA-templated Ag-Nanoclusterssr formation, J Am Chem Soc 126: ]. 6. Η εξέλιξη της Τεχνολογίας των Κβαντικών Τελειών και των Βιοϊατρικών εφαρμογών τους όπως εμφανίζονται σε δημοσιευμένα Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας. Ο στόχος της παραγράφου αυτής είναι να ανακεφαλαιώσει την εξέλιξη της Τεχνολογίας των Κβαντικών Τελειών, στην in vitro Διαγνωστική (IVD), όπως αυτή αποτυπώνεται σε πρόσφατα σχετικά Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας. Τα πλέον σχετικά Έγγραφα Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας, ανακτήθηκαν κυρίως με την χρήση της on-line μηχανής αναζήτησης esp@cenet του Ευρωπαϊκού Γραφείου Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας (ΕΡΟ). Μέσω της αξιολόγησής τους, επιχειρήθηκε μια πρώτη χαρτογράφηση των αναδυόμενων σχετικών Τεχνολογιών και με τον τρόπο αυτό, καθίσταται δυνατή μια βάσιμη πρόβλεψη των τάσεων και στην αντίστοιχη Αγορά της in vitro Διαγνωστικής, για τα επόμενα χρόνια [Βλ. Β. Spyropoulos et al, In vitro Diagnostics employment of Quantum Dots as depicted in Industrial Property Documents, 22 nd International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC Worldlab 2014), Istanbul, June 2014, in Clin. Chem. Med. Lab. 52 Special Suppl. p. S207]. Οι ακόλουθες διακριτές ομάδες QD-IVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας, που σχετίζονται με τις Κβαντικές Τελείες, που χρησιμοποιούνται σε σημαντικές έρευνες και εφαρμογές στην IVD, ανασύρθησαν και αξιολογήθηκαν και τα αποτελέσματα συνοψίζονται στην Εικόνα B iological Entities or M ethods D ocs N rs Antibodies 91 Antigens 37 Aptam ers 13 Bacteria 17 C ells 227 D N A 54 R N A 8 Im m unoassays 17 Im m unofluorescence 13 Lateral Flow 3 Proteins 65 PC R 8 Viruses 20 Distribution of filed QD related IP-Docs according to Patent Office issuing the Priority Date ( ) KR; 26; 10% JP; 24; 9% CN; 82; 33% GB; 2; 1% TW; 14; 5% DE; 1; 0% US; 80; 31% EP; 9; 3% WO; 21; 8% US EP WO CN JP KR GB TW DE

73 Εικόνα 13. Αριστερά: Αριθμός σχετικών με τη χρήση QDs στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας ανά σημαντική αντίστοιχη Οντότητα ή Μέθοδο. Δεξιά: Κατανομή των σχετικών με τις QDs σύμφωνα με το Γραφείο Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας που απονέμει την Ημερομηνία Προτεραιότητας Number of QDs related IP-Docs per Publication Year QDs related IP-Docs per year 449 I P - D o c s p e r Y e a r Number of QDs and Antibody related IP- Docs per Publication Year Year Number of QDs and Antibody related IP- Docs per Publication Year Εικόνα 14. Αριστερά: Αριθμός σχετικών με τη χρήση QDs στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας ανά έτος ( ). Δεξιά: Αριθμός σχετικών με τη χρήση QDs και Αντισωμάτων στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας ανά έτος ( ) Industrial Property Documents related to Silicon, to Carbon and to Graphene QDs vs. Priority Year of the filed application Number of IP-Docs Year Si QDs Carbon QDs Graphene QDs 73

74 Εικόνα 15. Αριθμός εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας σχετιζομένων με Κβαντικές Τελείες Πυριτίου, Άνθρακα και Γραφενίων, συναρτήσει της Χρονολογίας Προτεραιότητας των κατατεθειμένων Αιτήσεων. Μελετώντας το Γράφημα της Εικόνας 13 (δεξιά) γίνεται σαφές ότι στη Κίνα καταχωρήθηκε το 33% των σχετικών αιτήσεων ενώ στις ΗΠΑ το 31%, καθιστώντας τη Κίνα βαθμιαία την σημαντικώτερη αγορά και Νέων Τεχνολογιών παγκοσμίως. Η Εικόνα 14 δείχνει μια εκθετική ανάπτυξη γενικά της Τεχνολογίας των QDs μετά το 1995, ενώ μετά το 2005, παρατηρείται το ίδιο και στο τομέα της IVD Τεχνολογίας. Όσον αφορά στον εσωτερικό ανταγωνισμό των επιμέρους αναδυομένων Τεχνολογιών QDs, παρατηρούμε ότι η έρευνα στρέφεται σοβαρά τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη QDs, χωρίς βαρέα μέταλλα. Οι QDs Πυριτίου κατακτούν την πρώτη θέση (25%) σε Αιτήσεις σχετικών Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας, οι QDs Ινδίου την δεύτερη (24%), οι «Βιοσυμβατές» QDs Άνθρακα και Γραφενίων καλύπτουν αθροιστικά το 29% των Αιτήσεων, ενώ τέλος το δυνητικά επικίνδυνο, τουλάχιστον στην in vivo Διαγνωστική και Απεικόνιση, Κάδμιο, περιορίζεται στο 12%. Absolute numbers of IP-Docs related in their titles to important QDs-Elements Indium QDs; 50; 24% Gold QDs; 6; 3% Silver QDs; 5; 2% Graphene QDs; 24; 11% Carbon QDs; 38; 18% Gallium QDs; 2; 1% Germanium QDs; 9; 4% Cadmium QDs; 25; 12% Silicon QDs; 51; 25% Graphene QDs Carbon QDs Silicon QDs Cadmium QDs Germanium QDs Gallium QDs Indium QDs Gold QDs Silver QDs 74

75 Εικόνα 16. Αριθμός εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας των οποίων οι τίτλοι σχετίζονται με Στοιχεία που αποτελούν βασικό συστατικό σημαντικών Κβαντικών Τελειών. Numbers of IP-Docs per NCs-type mentioned in their titles and/or abstracts Number of IP-Docs Platinum NCs Gold NCs Silver NCs Metal NCs Other NCs Type of NCs Retrieved NCs in Title NCs in Title or Abstract Εικόνα 17. Αριθμός εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας ανά τύπο Νανοσυμπλεγμάτων Μετάλλων και αναφερομένων στον Τίτλο ή/και στην Περίληψή τους. Η Εικόνα 17 αποκαλύπτει μια γραμμική ανάπτυξη του ερευνητικού ενδιαφέροντος για τα Μεταλλικά Νανοσυμπλέγματα, αλλά και σε περιοχές γύρω από αυτά. Το υψηλότερο κόστος των σπανίων γαιών και των ευγενών μετάλλων, δρα ανασταλτικά γενικώς, ενώ στη περιοχή της Βιοϊατρικής Τεχνολογίας, παρά τα θετικά πειραματικά αποτελέσματα που αναφέρθηκαν προηγουμένως, δεν παρατηρείται κάποια «εκρηκτική» εκθετική τάση, επειδή και τα περισσότερα ευγενή μέταλλα ενέχουν κινδύνους, παρά τις χαμηλές διαγνωστικές και θεραπευτικές συγκεντρώσεις, που χρησιμοποιούνται στις Κλινικές Εφαρμογές. Η χρονική εξέλιξη του αριθμού των εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας, τα οποία αφορούν στα Νανοσυμπλέγματα Mετάλλων, εμφανίζεται στην Εικόνα 18 και παρουσιάζει ένα μικρό τοπικό μέγιστο ( ) και ένα απόλυτο μέγιστο ( ) και στη συνέχεια μια απότομη καθοδική πορεία. 75

76 Η καθοδική αυτή πορεία, συμπίπτει με την απότομη ανοδική πορεία που εμφανίζεται την περίοδο , στις καταχωρήσεις ευρεσιτεχνιών σχετικών με τις «ανταγωνιστικές» Κβαντικές Τελείες Πυριτίου, Άνθρακα και Γραφενίων, πιθανόν γιατί η Βιοσυμβατότητα των τελευταίων, δίνει καλύτερες προοπτικές, στη στοχοθεσία συγγενών ερευνητικών πεδίων. IP-Docs related to Metal Nanostructures vs. Priority Year IP-Docs retrieved Priority Year Priority Year Εικόνα 18. Αριθμός δημοσιευμένων εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας σχετιζόμενων στον τίτλο τους με Καινοτομίες στην Τεχνολογία Νανοσυμπλεγμάτων Μετάλλων. 76

77 7. Συμπεράσματα για τις μελλοντικές προοπτικές στην in vitro Διαγνωστική. 2% 1% Biological Entities or Methods 3% 11% 17% 1% 6% 3% 2% 1% 3% 9% 41% Antibodies Antigens Aptamers Bacteria Cells DNA RNA Immunoassays Immunofluorescence Lateral Flow Proteins PCR Viruses Εικόνα 19. Αριστερά: Μια σχηματική γενικευμένη παρουσίαση των διαφόρων μεθόδων για την παρασκευή των διαφόρων τύπων βιοσυζυγών-qds και εν δυνάμει εφαρμογών τους. [Βλ. Zhu, J.-J., Li, J.-J., Huang, H.-P., Cheng, F.-F., Quantum Dots for DNA Biosensing, Springer Briefs in Molecular Science, 2013, VIII]. Δεξιά: Στον αριθμό σχετικών με τη χρήση QDs στην ΙVD Έγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας προηγείται η σήμανση Κυττάρων (41%) και ακολουθούν τα Αντισώματα (17%) και οι Πρωτεϊνες (11%). Μολονότι βρισκόμαστε στο μέσον ενός «ερευνητικού ανταγωνισμού», τόσο τα Χημικά Τεχνικά Βιολογικά χαρακτηριστικά των Κβαντικών Τελειών Άνθρακα και Γραφενίων, όσο και η δυναμική της Έρευνας τα τελεταία 10 χρόνια, όπως αυτή εκφράστηκε μέσα από το παράδειγμα του Patent Mapping, που παρουσιάστηκε, δείχνουν ότι υπάρχουν δικαιολογημένες προσδοκίες, τα επόμενα χρόνια να έχουμε μια μεγάλης κλίμακας αξιοποίησης των QDs στην ΙVD, ιδιαίτερα στην Κυτταρομετρία Ροής, σε Βιοϊατρικές πολυχρωματικές εφαρμογές και σε εφαρμογές πολυπλεξίας μικροσυστοιχιών. Αν και το Φάσμα εκπομπής των QDs ημιαγωγών υπερέχει έναντι αυτού των Si-QDs (Εικόνα 8) και των QDs Άνθρακα και Γραφενίων (Εικόνα 11), τα υπόλοιπα συγκριτικά πλεονεκτήματά τους, 77

78 παρέχου ένα ισχυρό κίνητρο έντασης της έρευνας στα πεδία αυτά στο άμεσο μέλλον. Είναι βέβαιο ότι στη διάρκεια της επόμενης δεκαετίας, το πεδίο εφαρμογής των QDs θα συνεχίσει να αναπτύσσεται και ο ανταγωνισμός των Τεχνικών, για την κατάκτηση σοβαρού μεριδίου της Αγοράς, θα παραμείνει ζωηρός. Στην in vitro Διαγνωστική θα επιβιώσουν για αρκετά χρόνια τα QDs ημιαγωγών, όμως στην in vivo Διαγνωστική και στην Ιατρική Απεικόνιση, η έρευνα θα ενταθεί, ώστε να περιορισθούν οι κίνδυνοι από το Κάδμιο και άλλα στοιχεία, αλλά και από τα ευγενή μέταλλα, μέσω της αντικατάστασής τους, από πλεον Βιοσυμβατά υλικά. Εικόνα 20. Όσον αφορά στη χώρα που θα παίξει πρωταγωνιστικό ρόλο στον τομέα των QDs στα Νανοσυμπλέγματα, το Patent Mapping δείχνει με βεβαιότητα προς Ανατολάς... 78