Τσορλίνη Χριστοφορίδου Ελένη Βακτηριολογικό Τμήμα Τμήμα Μυκοβακτηριδίου Γεν. Νοσοκομείο «Γ. Παπανικολάου» Θεσσαλονίκης

Transcript

1 Τσορλίνη Χριστοφορίδου Ελένη Βακτηριολογικό Τμήμα Τμήμα Μυκοβακτηριδίου Γεν. Νοσοκομείο «Γ. Παπανικολάου» Θεσσαλονίκης

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σύμφωνα με την ΠΟΥ το 1/3 περίπου του παγκόσμιου πληθυσμού είναι μολυσμένο 9 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις καταγράφονται ετησίως παγκοσμίως 2 εκατομμύρια άτομα περίπου πεθαίνουν κάθε χρόνο συνεπώς Πρωταρχικής σημασίας η ανάπτυξη εθνικών και παγκόσμιων προγραμμάτων ελέγχου μετάδοσης της λοίμωξης

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2 Βασικό εργαλείο στα προγράμματα αυτά είναι οι επιδημιολογικές μελέτες 1. Συμβατικές: έως τα τέλη δεκαετίας 1980 φαινοτυπικά χαρακτηριστικά / κοινωνική επαφή (δημογραφικά στοιχεία) /ιστορικό νόσου (κλινικά εργαστηριακά δεδομένα) πολύ μικρή διακριτική ικανότητα δύσκολο να οριστεί αν δύο στελέχη από διαφορετικούς ασθενείς έχουν την ίδια πηγή μόλυνσης 2. Μοριακές : από 1990 μετά την πλήρη ανάλυση του γονιδιώματος του εργαστ. στελέχους H37Rv

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3 Μοριακή Επιδημιολογία Η επιστήμη που επιτρέπει την κατανόηση της μετάδοσης, της παθογένεσης και της αιτιολογίας μιας μολυσματικής νόσου σε έναν ανθρώπινο πληθυσμό, χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα και ολοένα εξελισσόμενα "γενετικά εργαλεία" Κλειδί στην ανάπτυξη των μοριακών επιδημιολογικών μεθόδων ο πολυμορφισμός του γονιδιώματος του Μtb

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4 Ο Πολυμορφισμός γενώματος βασίζεται: Ύπαρξη επαναλαμβανόμενων στοιχείων DNA Repeat sequences Ως Γενετικοί δείκτες Κάθε μέθοδος παρέχει ειδικό για το στέλεχος γενετικό προφίλ αποτυπώματα (fingerprinting) Έτσι για τη διερεύνηση κρουσμάτων Φυματίωσης ισχύει : 1. Ασθενείς που μολύνθηκαν από την ίδια πηγή έχουν στέλεχος με ίδια γενετικά αποτυπώματα (γονότυπο) και αποτελούν μια ομάδα (cluster) 2. Ασθενείς χωρίς επιδημιολογική σχέση μεταξύ τους έχουν στελέχη με διαφορετικό γονότυπο Μοναδικό

6 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Πολλές μέθοδοι-οι κυριότερες και πιο χρησιμοποιημένες παγκοσμίως: 1) IS RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) πρότυπη μέθοδος με τη μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα 2) MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit) νέα μέθοδο με πολλά πλεονεκτήματα 3) Spoligotyping (Spacer Oligonucleotide Typing) εύκολη με μικρότερη διακριτική ικανότητα

7 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2 IS6110 RFLP Πρότυπη και προτυποποιημένη (gold standard) > στελέχη με διαφορετικά γονοτυπικά αποτυπώματα Στηρίζεται στην ποικιλία του αριθμού των αντιγράφων και των διαφορετικών θέσεων στο γονιδίωμα του Mtb της αλληλουχίας εισδοχής IS6110 (μοναδική για το Mtb complex) δηλαδή στον πολυμορφισμό της αλληλουχίας αυτής (0-26 αντίγραφα) Μεγάλη διακριτική ικανότητα και επαναληψιμότητα Ημιπερίοδος ζωής 3,2 έτη

8 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2 IS6110 RFLP 2 Τεχνική Καλλιέργεια εκχύλιση του χρωμοσωματικού DNA επώαση με περιοριστικό ένζυμο PvuII (στόχος μέσα στην αλληλουχία IS6110) διαχωρισμός DNA σε gel αγαρόζης μεταφορά σε μεμβράνη υβριδισμός με σεσημασμένο με peroxidase ανιχνευτή της IS6110 μέτρηση με χρωματομετρική μέθοδο

9 Outbreak in a facility for AIDS patients DNA fingerprints Restriction fragment length polymorphisms (IS6110 RFLP) Μοναδικό: Ενεργοποίηση λανθάνουσας ΤΒ λοίμωξης Clustered: Πρόσφατη μετάδοση

10 ΗΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑIS6110 ΤΟΥ Μtb

11 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2 IS6110 RFLP 3 Μειονεκτήματα Ακριβή και τεχνικά απαιτητική Χρονοβόρα (απαιτεί ανακαλλιέργειες για εβδομάδες για ικανή ποσότητα DNA) Εργώδης και πολύπλοκη Χαμηλή διακριτική ικανότητα όταν υπάρχουν <6 αντίγραφα της IS6110 αλληλουχίας Όχιπάνταεύκοληησύγκρισηαποτελεσμάτων μεταξύ εργαστηρίων (αναλογικά αποτελέσματα)

12 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 4 MIRU VNTR Μέθοδος πρώτης γραμμής στη μορ. επιδημιολογία PCR μέθοδος που βασίζεται στον αριθμό των διαδοχικών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών που βρίσκονται διάσπαρτες σε συγκεκριμένες πολυμορφικές θέσεις του γενώματος του Mtb. Πολυμορφισμός: αριθμός επαναλήψεων διαφορετικό μήκος αλληλουχίας 41 διαφορετικές τέτοιες περιοχές έχουν αναγνωριστεί στο γένωμα του Mtb (Supply et al, 2000) 12 υπερπολυμορφικές περιοχές, γονοτυποποίηση κλινικών στελεχών

13 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 4 MIRU VNTR 2 Κάθε στέλεχος εκφράζεται ψηφιακά με 12 αριθμούς που αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των επαναλήψεων σε κάθε μια MIRU περιοχή Ο αριθμός των επαναλήψεων σε κάθε μια από τις 12 MIRU θέσεις ανιχνεύεται με 12 μεθόδους PCR και ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη 20 εκατομμύρια περίπου πιθανοί συνδυασμοί των 12 θέσεων

14 Barnes PF, Cave MD. New Engl J Med 2003; 349:1149

15 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 4 MIRU VNTR 3 Πλεονεκτήματα Εύκολη, ταχεία, υψηλή εξειδίκευση, μεγάλη διακριτική ικανότητα Σχεδόν την ίδια διακριτική ικανότητα με την IS6110 Αυτόματη υψηλής απόδοσης ανάλυση πολλών στελεχών Εφαρμόζεται κατευθείαν στην καλλιέργεια του Mtb χωρίς καθαρισμό του DNA, 12 PCR ανά στέλεχος Ψηφιακά αποτελέσματα, εύκολα να εγκατασταθούν και να συγκριθούν με βάσεις δεδομένων Αναγνώριση νέων θέσεων (MIRU loci) σε στελέχη από συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές

16 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 4 MIRU VNTR 4 Μειονεκτήματα 1. Μικρότερη διακριτική ικανότητα από την IS6110-RFLP εκτός όταν < 6 αντίγραφα 2. Βελτίωση με προσθήκη 3 ή και περισσότερων MIRU περιοχών - 15 θέσεις καλύτερη διακριτική ικανότητα

17 Variable number tandem repeats (VNTR), bp MIRU MIRUMIRUM MIRU = mycobacterial interspersed repeat Units MLVA = multiple locus VNTR analysis Sputgiesz RS, et al. J Clin Microbiol 2003; 41:

18 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 3 SPOLYGOTYPING Ευρέως διαδεδομένη PCR μέθοδος που ανιχνεύει πολυμορφισμό (εξαρτώμενο από το στέλεχος) σε spacer DNA αλληλουχίες μέσα στις DR περιοχές του γενώματος του Mtb complex - 43 είδη spacer (ύπαρξη ή όχι) Πλεονεκτήματα : απλή, γρήγορη, υψηλή επαναληψιμότητα, σταθερά αποτελέσματα, έκφραση αποτελεσμάτων σε απλό ψηφιακό μοντέλο βάση δεδομένων (SpolDB) ικανότητα να εκτελείται απευθείας στο κλινικό δείγμα χωρίς προηγούμενη καλλιέργεια Ταυτόχρονη χρήση για ανίχνευση και γονοτυποποίηση

19 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 3 SPOLYGOTYPING 2 Μειονεκτήματα: Χαμηλή διακριτική ικανότητα (στοχεύει σε < 0,1% του γενώματος του Mtb) Απαραίτητη χρήση δευτερογενών μοριακών μεθόδων (γιανααποδειχθείηκλωνικήσχέση μεταξύ διαφορετικών απομονώσεων)

20 SPOLIGOTYPING Barnes PF, Cave MD. New Engl J Med 2003; 349:

21 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ Επιβεβαίωση ή αποκλεισμός πρόσφατης μετάδοσης Ανίχνευση μη ύποπτης μετάδοσης και επιδημιών Φυματίωσης Υπολογισμός της έκτασης πρόσφατης μετάδοσης σε ένα πληθυσμό (δείκτης μετάδοσης) Αποκάλυψη της εμφάνισης συγκεκριμένων στελεχών ή οικογένειας στελεχών σε διαφορετικές περιοχές του κόσμου (Beijing)

22 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ 2 Καθορισμός μετάδοσης στελέχους για την ανίχνευση της πηγής μόλυνσης ισχύει ότι: Στελέχη που επιδεικνύουν ταυτόσημα γονιδιακά αποτυπώματα αναφέρονται συνήθως σαν ομάδα (cluster) και σχετίζονται πιθανόν με πρόσφατη μετάδοση λοίμωξης ενώ Στελέχη των οποίων το προφίλ αποτυπωμάτων είναι μοναδικό αντιπροσωπεύουν πιθανόν ενεργοποίηση λανθάνουσας λοίμωξης που προκλήθηκε στο παρελθόν

23 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ 3 Απαραίτητες προϋποθέσεις 1. Ερμηνεία αποτελεσμάτων μοριακής ανάλυσης σε συνδυασμό με επιδημιολογικά δεδομένα 2. Για αξιόπιστα αποτελέσματα οι μελέτες να αφορούν: μεγάλο αριθμό ασθενών χάνονται οι ομαδοποιημένες περιπτώσεις μεγάλο χρονικό διάστημα δεν προλαβαίνει να εκδηλωθεί η νόσος Το ποσοστό πρόσφατης λοίμωξης σε ένα πληθυσμό σε ανεπτυγμένες χώρες <10% σύμφωνα με CDC-1994

24 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ασθενείς- 65 μοναδικοί /ενεργοποίηση λανθάνουσας ΤΒ; - 39 σε12 ομάδες (2-11στελέχη) πρόσφατη μετάδοση; 37 μήνες Ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για την ύπαρξη ομαδοποιημένου στελέχους: HIV (+) (67% έναντι 31%) μικρότερη ηλικία, χαμηλότερο εισόδημα στέλεχοςμεr σε ένα τουλάχιστον αντιφυματικό (49% έναντι 16%) MDR (24% έναντι 5%) Transmission of Tuberculosis in New York City: An Analysis by DNA Fingerprinting and Conventional Epidemiologic Methods Alland D et al. N Engl J Med 1994; 330 :

25 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΕ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΥ 1. Αξιολόγηση της οδού μετάδοσης επιδημιολογική έξαρση έναντι τυχαίου περιστατικού σε ένα μεγάλο αριθμό περιπτώσεων οδηγίες για μέτρα δημόσιας υγείας για ελάττωση της μετάδοσης της Φυματίωσης 2. Αναγνώριση των ομάδων πληθυσμού σε αυξημένο κίνδυνο για Φυματίωση : HIV, μαύρη φυλή, IV ναρκομανείς, άστεγοι, πρόσφυγες, νοσηλευτικό προσωπικό 3. Αναγνώριση ατόμων σε αυξημένο κίνδυνο για Φυματίωση σε συγκεκριμένες εγκαταστάσεις :

26 Γονοτυπία για Προγράμματα ελέγχου Φυματίωσης άστεγοι πρόσφυγες

27 Γονοτυπία για Προγράμματα ελέγχου Φυματίωσης Φυλακισμένοι

28 Γονοτυπία για Προγράμματα ελέγχου Φυματίωσης Σχολεία, κέντρα ημερήσιας φροντίδας παιδιών

29 Γονοτυπία για Προγράμματα ελέγχου Φυματίωσης Εστίες ηλικιωμένων

30 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ 1. Ανίχνευση εργαστηριακής επιμόλυνσης 2. Διάκριση ενδογενούς υποτροπής ενεργοποίηση λανθάνουσας από εξωγενή επαναμόλυνση 3. Αξιολόγηση μεικτών λοιμώξεων 4. Αξιολόγηση στελεχών με διαφορετικό μοντέλο ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα

31 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ 2 1. Επιβεβαίωση εργαστηριακής επιμόλυνσης ~ 3% των ασθενών δεν έχουν Φυματίωση Επιμόλυνση στο εργαστήριο = επιχρίσματα πτυέλων αρνητικά και μόνο ένα δείγμα με θετική καλλιέργεια. Ασυμφωνία κλινικών και εργαστηριακών Πηγή : μολυσμένα όργανα (βρογχοσκόπιο) ή εργαστηριακή επιμόλυνση των καλλιεργειών *Σοβαρό πρόβλημα δημόσιας υγείας επιμήκυνση παραμονής στο νοσοκομείο και περιττή αντιτβ αγωγή

32 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ 3 2. Διάκριση ενδογενούς υποτροπής από εξωγενή επαναμόλυνση: Η υποτροπή της νόσου ή η ενεργοποίηση λανθάνουσας προκαλείται από το ίδιο στέλεχος που προκάλεσε το πρώτο επεισόδιο Η υποτροπή αντιπροσωπεύει αποτυχία της θεραπείας Η εξωγενής επαναμόλυνση γίνεται με διαφορετικό στέλεχος Mtb

33 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ 4 3. Αξιολόγηση μεικτών λοιμώξεων: μελέτη με MIRU7 θέσεων, 249 ασθενείς με ΤΒ σε νοσοκομείο της Σαγκάης ποσοστό μεικτών λοιμώξεων 5,6% περιπτώσεις με επανάληψη της θεραπείας 15,7% νέες περιπτώσεις 4,1% Μη Beijing στελέχη 12,5% Beijing στελέχη 3,5% Fang R, et al. Tuberculosis (Edinb.) 2008; in press

34 ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΒ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ 5 4. Αξιολόγηση στελεχών με διαφορετική ευαισθησία στα αντιφυματικά φάρμακα ανίχνευση εργαστηριακής μόλυνσης ανάπτυξη αντοχής κατά τη διάρκεια ή μετά την αντιφυματική αγωγή γονοτυποποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν αντοχή (π.χ. puca) αλλαγή θεραπείας μετάδοση στελέχους με αντοχή στα αντιφυματικά γρήγορη ανίχνευση ανθεκτικού στελέχους από ασθενή σε στενή σχέση με άλλο ασθενή που έχει ανθεκτικό Mtb

35 ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΒ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Γονοτυποποίηση επιτήρησης ταχεία real time γονοτυποποίηση όλων των στελεχών σε ρουτίνα Άμεση αναγνώριση επιδημιών άμεση εφαρμογή μέτρων ελέγχου Mtb Αξιολόγηση των εθνικών δικτύων επιτήρησης, σύγκριση αποτελεσμάτων σε παγκόσμιο επίπεδο

36 Μελλοντικοί στόχοι: Τεχνολογία γονοτυποποίησης επόμενης γενιάς θα βασίζεται στην ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος Επιδημιολογική σύγκριση στελεχών σε ένα μόνο στάδιο που θα περιλαμβάνει: 1. καθορισμό του είδους 2. έλεγχο αντοχής στα αντιφυματικά 3. ανίχνευση παθογενετικών παραγόντων

37 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΙΚΑ Συνδυασμός μοριακών μεθόδων καλύτερη διακριτική ικανότητα Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της μοριακής ανάλυσης μαζί με τα δεδομένα της παραδοσιακής επιδημιολογίας αξιόπιστα επιδημιολογικά συμπεράσματα Απαραίτητη η συνεργασία κλινικών, μοριακών επιδημιολόγων, εργαστηριακών και ειδικών στους υπολογιστές Η γενετική ανάλυση στελεχών Mtb πληροφορεί σχετικά με το είδος της διασποράς, τη μολυσματικότητα και την παθογένεια με τελικό στόχο τον αποτελεσματικότερο έλεγχο της Φυματίωσης

38