ΧΡΩΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΜΩΝ. κοπός κοπός της άσκησης είναι η γνωριμία διαφόρων τεχνικών χρώσης.

Transcript

1 ΧΡΩΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΜΩΝ κοπός κοπός της άσκησης είναι η γνωριμία διαφόρων τεχνικών χρώσης. Γενικά Οι περισσότερες χρώσεις στηρίζονται στην αρχή, ότι ορισμένα κυτταρικά συστατικά αφομοιώνουν καλύτερα τις χρωστικές ουσίες από άλλα. Έτσι δύνεται η δυνατότητα της μελέτης του σχήματος και των ανατομικών χαρακτηριστικών του κυττάρου και της διαφοροποίησης των μικροοργανισμών. Οι χρώσεις διακρίνονται σε θετικές και αρνητικές, θετική είναι εκείνη κατά την οποία η χρωστική ουσία αντιδρά με τα συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος. Αντίθετα στην αρνητική χρώση η χρωστική ουσία δεν αντιδρά με τα συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος, αλλά σχηματίζει ένα ίζημα γύρω από τα κύτταρα έτσι ώστε στο μικροσκόπιο να φαίνονται λαμπερά και αχρωμάτιστα ενώ το υπόλοιπο πεδίο να έχει σκουρότερο χρώμα. Οι αρνητικές χρώσεις χρησιμοποιούνται κυρίως για τη μελέτη των σπειροχαιτών, των συστατικών του κυττάρου και του ελύτρου που δεν χρωματίζονται εύκολα με θετικές χρώσεις. Βάση της σύστασης του χρωστικού διαλύματος χωρίζονται οι θετικές χρωστικές σε απλές και σε σύνθετες ή χρώσεις διαφοροποίησης. τις απλές χρώσεις ο μικροοργανισμός χρωματίζεται μόνο με μία χρωστική ουσία, ενώ στις σύνθετες ή διαφοροποίησης χρωματίζεται με περισσότερα του ενός χρωστικά διαλύματα. Οι σύνθετες χρωστικές χρησιμοποιούνται για την διαφοροποίηση μικροοργανισμών (π.χ. Gram +, Gram - ) ή για την διαφοροποίηση των συστατικών του κυττάρου (π.χ. τοίχωμα, πυρηνική ουσία, έγκλειστα σπόρια). Ανάλογα με τον τρόπο δράσης διακρίνονται οι χρώσεις σε: 1. Άμεσες στις οποίες η χρωστική επιδρά απευθείας με το κύτταρο και έμμεσες για τις οποίες χρειάζεται ένα πρόστυμμα. Προστύμματα είναι ενώσεις που απαιτούνται ως «ενδιάμεσα» για την χρώση κυτταρικών συστατικών, όταν αυτά δεν παρουσιάζουν καμία χημική συγγένεια με την χρωστική ουσία. Με την βοήθεια τους σχηματίζεται ένα σταθερό χρωματισμένο σύμπλοκο, το οποίο είναι ανθεκτικό στους παράγοντες αποχρωματισμού. Προστύμματα είναι: α) Οξειδωτικές ενώσεις (χρωμικό οξύ, νιτρικό οξύ, Lugol s solution κ.α.) β) τυπτηρίες (στυπτηρία σιδήρου και καλίου) γ) Σαννίνη 2. Προοδευτικές στις οποίες η χρωστική απαιτείται να επιδράσει για αρκετό χρόνο στο κύτταρο, ώστε να επιτευχθεί το επιθυμητό αποτέλεσμα και παλινδρομικές στις οποίες υπερχρωματίζεται το κύτταρο και στην συνέχεια αποχρωματίζεται με κατάλληλο διαλύτη. τις περιπτώσεις που κατά την επίδραση του χρωστικού διαλύματος στα κυτταρικά στοιχεία μεταβάλλεται το αρχικό χρώμα αυτού ομιλούμε για μεταχρωματισμό. Σο φαινόμενο αυτό οφείλεται σε χημική αντίδραση της Π. ΜΙΡΕΛΗ 30

2 μεταχρωματικής χρωστικής με συστατικά του κυττάρου με αποτέλεσμα να προκύπτει μία νέα ένωση με διαφορετικές ιδιότητες. Μεταχρωματικές χρωστικές είναι κυρίως μπλε ή ιώδεις ουσίες, όπως το μπλε της ανιλίνης, η σαφρανίνη, το ουδέτερο κόκκινο κ.α., που μετά την αντίδραση μετατρέπονται σε κόκκινες ενώσεις. Σα κυτταρικά συστατικά, τα οποία εμφανίζουν μεταχρωματισμό ονομάζονται χρωμοτρόπια και είναι θειικοί εστέρες μεγάλου μοριακού βάρους και τα άλατα τους με πολυσακχαρίτες. Παράδειγμα χρωμοτροπίου είναι η χρωματίνη, που βρίσκεται στο κύτταρο πολλών βακτηρίων, μυκήτων και φυκιών. A. Προετοιμασία παρασκευάσματος για χρώση Για τα παρασκευάσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν μικροοργανισμοί που αναπτύχθηκαν είτε σε ζωμό είτε σε στερεά υποστρώματα. Από υγρή καλλιέργεια μεταφέρεται μετά από ανακίνηση ασηπτικά μια σταγόνα πάνω σε αντικειμενοφόρο πλακά, ενώ από στερεή αφαιρείται με κρίκο εμβολιασμού μία αποικία από το υπόστρωμα και αναμιγνύεται με μία σταγόνα αποστειρωμένου νερού πάνω στην αντικειμενοφορο πλάκα. Και στις δυο περιπτώσεις επιστρώνεται καλά η πλάκα και αφήνεται να στρώσει σε θερμοκρασία δωματίου η θερμαντική πλακά. Η μονιμοποίηση του παρασκευάσματος επιτυγχάνεται με πέρασμα της κάτω πλευράς της αντικειμενοφόρου τρεις φορές από την μπλέ φλόγα του λύχνου Bunsen. Μετά την ψύξη είναι το παρασκεύασμα έτοιμο για χρώση. τα με πάρα πολύ υψηλή συγκέντρωση σε μικροοργανισμούς όπως π.χ. είναι η ενεργή ιλή, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και χωρίς προηγούμενη καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό και μεταχειρίζονται όπως στην περίπτωση του ζωμού. Α. Χρώση με μπλέ του μεθυλενίου Η χρώση με μπλε του μεθυλενίου δίνει την δυνατότητα να γίνει διάκριση μεταξύ ζωντανών και νεκρών κυττάρων ενός μικροοργανισμού. τα νεκρά κύτταρα μπορεί η χρωστική λόγου της καταστραμμένης μεμβράνης του κυτταροπλάσματος να διεισδύσει μέσα στο κυτταρόπλασμα ενώ τα ζωντανά συνήθως δεν εμφανίζουν αυτή την διαπερατότητα. Τπάρχουν όμως και περιπτώσεις, που ανάλογα με την ηλικία των κυττάρων και τις οσμωτικές συνθήκες να παρατηρείται και χρώση μερικών ζωντανών κυττάρων. Τδατικό διάλυμα μπλε του μεθυλενίου Σρινάτριο άλας του κιτρικού οξέος Σα δύο διαλύματα αναμιγνύονται σε αναλογία 1:1 και φυλάγονται σε σκοτεινό μέρος Saccharomyces cerevisae Ανάμιξη του χρωστικού διαλύματος με υγρή καλλιέργεια ζυμών σε αναλογία 1:1 Π. ΜΙΡΕΛΗ 31

3 Καταμέτρηση στο φωτεινό πεδίο με μεγέθυνση x Δίνεται η ποσοστιαία αναλογία των ζωντανών και νεκρών κυττάρων στο δείγμα μετά από καταμέτρηση τουλάχιστον 20 οπτικών πεδίων. Β. Χρώση Gram Η χρώση Gram χρησιμοποιείται για την μελέτη της μορφολογίας του κυττάρου, την παρουσία ενδοκυτταρικών εγκλείστων και για ταξινομικούς σκοπούς. Διάλυμα crystal violet Διάλυμα Lugol s iodine Αλκοόλη 95% Carbol fuchsin Μικτό δείγμα βιολογικού καθαρισμού Προετοιμάζεται μία αντικειμενοφόρος πλάκα με μόνιμο παρασκεύασμα Κάλυψη του παρασκευάσματος με διάλυμα crystal violet για 1 λεπτό Απομάκρυνση του crystal violet ξεπλένοντας με διάλυμα Lugol s και σταθεροποίηση για ένα λεπτό Ξέπλυμα με νερό βρύσης. Αποχρωματισμός του παρασκευάσματος 3 φορές εναλλάξ με αλκοόλη 95% και νερό βυθίζοντας και ανακινώντας κάθε φορά την πλάκα στο υγρό για περίπου 30 δευτερόλεπτα Ξέπλυμα με νερό βρύσης και απομάκρυνση της περίσσειας νερού με τίναγμα της αντικειμενοφόρου πλάκας Μεταχρωματισμός του παρασκευάσματος με διάλυμα Carbol fuchsin για περίπου 30 δευτερόλεπτα. Ξέπλυμα με νερό βρύσης και στέγνωμα της αντικειμενοφόρου πλάκας μεταξύ φύλλων διηθητικού χαρτιού. Εξέταση στο φωτεινό πεδίο του μικροσκοπίου με μεγέθυνση x Οι μικροοργανισμοί ταξινομούνται σε Gram θετικούς και Gram αρνητικούς. τους Gram θετικούς μικροοργανισμούς λογού του διπλού κυτταρικού τοιχώματος το σύμπλοκο από χρωστική και ιώδιο δεν μπορεί να απομακρυνθεί ξανά από το κύτταρο και έτσι εμφανίζονται μπλε-ιώδεις. ' αντίθεση οι Gram αρνητικοί μικροοργανισμοί με απλό τοίχωμα αποχρωματίζονται με την αλκοόλη και μεταχρωματίζονται ρόδινοι εξαιτίας του Carbol fuchsin. Π. ΜΙΡΕΛΗ 32

4 Γ. Χρώση σπορίων Ορισμένα βακτήρια, όπως από τα γένη Bacillus και Clostridium και οι ζύμες παράγουν ενδοσπόρια και αντέχουν σε υψηλές θερμοκρασίες, σε έλλειψη νερού και σε χημικά απολυμαντικά. Είναι επίσης ανθεκτικά στις συνηθισμένες χρωστικές με αποτέλεσμα στη χρώση Gram τα σπόρια να παραμένουν αχρωμάτιστα, ενώ τα κύτταρα να χρωματίζονται με την χρωστική Crystal violet. Τδατικό διάλυμα Malachite green 5% Τδατικό διάλυμα Eosin 5% ή Safranine 0,5% Saccharomyces cerevisae Προετοιμασία ενός μόνιμου παρασκευάσματος περνώντας για την μονιμοποίηση τουλάχιστον 10 φορές από την φλόγα του λύχνου. Κάλυψη της ανπκειμενοφόρου πλάκας με Malachite green και θέρμανση μέχρι την δημιουργία ατμού. υνέχιση της θέρμανσης για τουλάχιστον 5 λεπτά με παράλληλη προσθήκη χρωστικής. Ξέπλυμα της πλάκας με νερό βρύσης. Μεταχρωματισμός με διάλυμα Eosin για 2 λεπτά ή με διάλυμα Safranine για 1 λεπτό. Ξέπλυμα με νερό βρύσης και στέγνωμα μεταξύ φύλλων διηθητικού χαρτιού. Εξέταση στο μικροσκόπιο. Σα σπόρια χρωματίζονται πράσινα, ενώ τα βλαστικά κύτταρα χρωματίζονται ρόδινα. Δ. Χρώση Neisser Ορισμένα βακτηρία αποθηκεύουν μέσα στο κυτταρόπλασμα εφεδρικές ουσίες σε μορφή κόκκων, που αποτελούνται κυρίως από πολυσακχαρίτες λιπίδια, θειούχες ενώσεις και πολυφωσφορικά άλατα. Η διάκριση των κόκκων αυτών με κοινό μικροσκόπιο επιτυγχάνεται μονάχα μετά από χρώση κατά Neisser οπότε χρωματίζονται μπλε-μαύροι. Διάλυμα Methylene blue Αλκοολικό διάλυμα crystal violet 10% Τδατικό διάλυμα chrysoidin Τ 1% Σα διαλύματα Methylene blue και crystal violet αναμιγνύονται σε αναλογία 2:1 (η ανάμιξη πρέπει να γίνεται κάθε φορά εκ νέου). Π. ΜΙΡΕΛΗ 33

5 Μικτό δείγμα βιολογικού καθαρισμού Προετοιμασία ενός μόνιμου παρασκευάσματος. Κάλυψη με το φρέσκο μίγμα Methylene blue και crystal violet για 15 δευτερόλεπτα και στην συνέχεια απομάκρυνση της χρωστικής από το παρασκεύασμα. Κάλυψη με διάλυμα chrysoidin για 45 δευτερόλεπτα. Ξέπλυμα της πίσω πλευράς της ανντικειμενοφόρας πλάκας με νερό βρύσης. τέγνωμα του παρασκευάσματος μεταξύ φύλλων διηθητικού χαρτιού Μικροσκοπική εξέταση σε φωτεινό πεδίο με μεγέθυνση x. Νηματοειδή βακτήρια που είναι αρνητικά κατά Neisser χρωματίζονται ανοιχτά καφέ έως κίτρινα και διακρίνονται με δυσκολία, ενώ τα θετικά νηματοειδή περιέχουν σκουρόχρωμους κόκκους ή είναι πλήρως χρωματισμένα μπλε-μαύρα. Π. ΜΙΡΕΛΗ 34