Polymerase Chain Reaction (PCR) Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης

Transcript

1 Polymerase Chain Reaction (PCR) Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης 1983: σύλληψη της ιδέας, από τον K. Mullis (βραβείο Nobel Χημείας 1993) " Driving up to Mendocino and thinking about an experiment to look at one particular letter of the genetic code, I designed a system in my mind. As I repaired the things I thought could go wrong with it, suddenly I generated something that if I did it over and over again would be PCR. It would go 2, 4, 8, 16, in 30 cycles make as many base pairs from one little region as I had in the whole genome! That was the eureka point. I said holy shit! By putting the triphosphates [DNA building blocks] in there myself, I could do this process over and over and amplify the DNA. I slammed on the brakes and stopped by the side of the road to calculate it out. Jennifer objected groggily to the delay and the light, but I exclaimed I had discovered something fantastic. Unimpressed, she went back to sleep. A couple of miles down the road I stopped again. I realized I could use these bastards, the oligonucleotides [short pieces of DNA], and get the enzymes to reproduce as big a piece as I wanted to. They didn't have to be aimed at just one base pair. Hell, I could do a whole sequence. I realized you can cut the sequence out from a great big molecule. Pretty cool! Just cut, paste, and amplify.» Cetus Corporation sold the patent for PCR to Hoffman-LaRoche for the staggering $300 million - the most money ever paid for a patent. Mullis meanwhile received a $10,000 bonus. 1985: πρώτη δημοσίευση, Science 1985, 230: : θερμοσταθερή DNA πολυμεράση, Science 1988, 239: Thermus aquaticus 1988 σήμερα : συνεχής εξέλιξη στις εφαρμογές και τις δυνατότητες της PCR

2 Forward primer Reverse primer Taq polymerase dntps 1 ος κύκλος: 2 αντίγραφα 4 αλυσίδες DNA: 2 μητρικές 2 νέες ακαθόριστου μήκους

3 2 ος κύκλος: 4 αντίγραφα 8 αλυσίδες DNA 2 μητρικές 4 νέες ακαθόριστου μήκους 2 νέες επιθυμητού μήκους

4 3 ος κύκλος: 8 αντίγραφα 16 αλυσίδες DNA: 2 μητρικές 6 νέες ακαθόριστου μήκους 8 νέες επιθυμητού μήκους

5 4 ος κύκλος: 16 αντίγραφα 32 αλυσίδες DNA: 2 μητρικές 8 νέες ακαθόριστου μήκους 22 νέες επιθυμητού μήκους

6 5 ος κύκλος: 32 αντίγραφα 64 αλυσίδες DNA: 2 μητρικές 10 νέες ακαθόριστου μήκους 52 νέες επιθυμητού μήκους Μετά από: 10 κύκλους 1024 αντίγραφα DNA 25 κύκλους αντίγραφα DNA

7 DNA μήτρα (template template): Συστατικά της αντίδρασης οποιοδήποτε DNA (ολικό χρωμοσωμικό, μιτοχονδριακό, βακτηριακό, πλασμιδιακό) ή cdna από οποιοδήποτε ιστό ή οργανισμό Καθαρότητα Ποσότητα (π.χ. Mamalian DNA - 1 μg, yeast DNA 10 ng, bacterial DNA -1 ng, plasmid DNA -10 pg ανά αντίδραση) Ολιγονουκλεοτίδια-εκκινητέςεκκινητές (primers): Βέλτιστο μήκος βάσεις Περιεκτικότητα σε βάσεις G, C 40-60% Αποφυγή συμπληρωματικών αλληλουχιών μεταξύ των εκκινητών, ειδικά στο άκρο Αποφυγή δευτεροταγών δομών Αποφυγή συμπληρωματικών αλληλουχιών των εκκινητών με μη επιθυμητές αλληλουχίες DNA Απόρριψη των εκκινητών που έχουν ομολογία με ανεπιθύμητες περιοχές άνω του 70% Tm = (A+T)x2oC + (G+C) x4oc (< 20bp) dntps: datp, dctp, dgtp, dttp σε τελική συγκέντρωση 200 μμ το καθένα. MgCl 2 : Ειδικότητα και απόδοση της αντίδρασης Χαμηλή συγκέντρωση Mg2+ : αυστηρό κριτήριο - αυξάνει την ειδικότητα Yψηλή συγκέντρωση Mg2+ : χαμηλό κριτήριο - αυξάνει την απόδοση Συνήθως 0,5-5 mm Προσδιορισμός άριστης συγκέντρωσης DNA-πολυμεράση: Κατά κανόνα Taq DNA polymerase, units Ρυθμιστικό διάλυμα (10X PCR buffer): 100 mm Tris-HCl ph 9 (25 ο C), 500 mm KCl και 1% μη ιονικό απορρυπαντικό Triton X-100 (μπορεί να διαφέρει ανάλογα με την εταιρεία που παρέχει την Taq DNA polymerase)

8 Ειδικότητα PCR: επιλογή κατάλληλων εκκινητών χαμηλή συγκέντρωση Mg2+, dntps, Taq, εκκινητών χαμηλό αριθμό κύκλων αυξημένη θερμοκρασία υβριδισμού Μη ειδικό προϊόν PCR: Μη ειδική σύνδεση εκκινητών υψηλή συγκέντρωση Mg2+ χαμηλή θερμοκρασία υβριδισμού πιθανότητα λάθους της πολυμεράσης(1 στα 10 9 nt in vivo, 2x10 4 nt in vitro) επιμόλυνση από προηγούμενα προϊόντα PCR (χρήση control δείγμα με Η 2 Ο αντί για template) συγκέντρωση Mg2+ - θερμοκρασία annealing Υψηλό κριτήριο Χαμηλό κριτήριο

9 Επιλογή και έλεγχος εκκινητών Forward CR-F -GAGGAGAAGATTGCGACCTCGATGTTGGCTTTAGGTGCCCTAGAGGCGTAGAAGCCTCTAAGGGTGG GTCTGTTCGCCCTTTAAAATCTAACATGAGCTGAGTTCAGAACGGCGTAAGCTAGTTCAGTTTCTATCCT CTTTTAAAAATGAGCTAATTTTGTACGAAAGGACTCTTTCGCTAAAGTAATGCTTTGGCCCAGCCTTGTA ATTACACAAATAATGTTACATGACGAGCTGAGTAACTCATAAAAAGGACTGCCTTTTATGTAAGTGAGGT TGGCTACTAGACTTTACAGGAATATACGCAGATAGTTTCACCTTGAAAAAGAGTGTTGTATCGCGTATAT GAAAGGCCTACCTGAACAACAGAGTAATCCCAGGGGAAAGAGGTGCGAGTCTCGTAAAAAATAGGAATAA AGCTACCTAAAAAATATGGTGTGTAATGTGTGTATATAAGTATACGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAACCGTAAAATGTTTGGGAATAAGGTGTTTCTACACGCTTAGACTCCTTGCCATTGCCTGTGACAGAAG CAATCGCCTCAGTTCCCCTGTTTTTTTACACGTAAAAGTCCCCTGTTGACGCACATGGGAGCCGCCTTAT TAAAATAACTTATAATATAAGTGAAAGCACACCTAATTAGTTTTTATTAGGCATTTATAGTTTATTCAAA ATTTAGGCCCATATGTCACAGATACCTAGCCATACCTCGTTTTAGATTATGCTCTATAGCCTGTAGTAGA Reverse CR-R TAAAGCTCTACAGCTGATAAGCATTTGTCAGAGTCATGTGAGACTTACCCTAATTAGTAAAAAAACA- CR-F: -GTGCCCTAGAGGCGTAGAAGCCTCTAAG- (28 nt) Tm = CR-R: -CTCTGAGAAATGCTTATCAGCTG- (23 nt) Tm = Tm = (A+T) x 2 o C + (G+C) x 4 o C

10 Γ rrnal AAAGCATTAACTATAAAAGATACCCCTAAATGTTTTGTAAAAAGCGGGTCTAAACAAGGATAGTATAAAT AAATTTTAGTACCTTTTGCATAAGGGTTTTTCAAGACAAATTTAAGTATTTAATTTTCCCGAATGAAAGA GC GGG C G C G CCCG G G GAGTTATTTTGTAGAGTTAAAAATCGTGGTAAAGATTTAATTAAATTATAAAATAGCGGCTAGATACTAT TCGCGCTTTTAGATATCTGGTTGGCTTAGAAATATGTGTAAGCATTACCCTTAAATACTTAAGGAGCAAA TTCTTCGGGTTAAGCTGAAAAATGTTAAAATTGACGCCAAGAAAAAAGTTGGTTTTTATAGGCTTTAGAC TAGCCACTAAGCACAAATTTATTTTAACTAAAACCAAGTGGTGGAAAAAATTAATTGGGGTCGTCATTTG CTCTAAGATAAGCCTGTGGTCGTAGAACCAAAAATTATGATAAAAACGAGTAAAGATATTCTTTGGCTGG TGTGACTCTACTGTTACACCTTAAAAAACTAACTGTGTTATAAGACTTTTTAAACGAACTCGGCAAACTA AGCTTCTCGACTGTTTAACAAAAACATTTCCTTTTGATATGAGTAAAAGGTAGTCCCTGCCCTATGCAAC TAAACTAACGTTTGTTGTAAATGGCGGCGTTAACGTGAGCGTCCTAAGGTAGCGCGATAATTTGCTTTTT AATTGAAGGATGGTATGAAAGGGTTAACGAAGAAGATGCTGTATCTAAAAATTTAATTTAAACTAATTTT AAGGTGAAGAGGCCTTAATGTAAAAGAAGGACGACAAGACCCTATGAAGCTTTATCTTAATTGAAGGTCT TAGCCTTTTATACGTTTTTGATGGGAGATCAGCAAAAATAAGTCTTTTGCTATAACATTAATCTTACTAG AATTTACTAGTTTTATATGTGTGACTAGCTACTCTAGGGATAACAGCGCAATTTCCCCCGAAAGATGGTA 16M-Sl-f (Forward) TTGGAGGAGAAGATTGCGACCTCGATGTTGGCTTTAGGTGCCCTAGAGGCGTAGAAGCCTCTAAGGGTGG GTCTGTTCGCCCTTTAAAATCTAACATGAGCTGAGTTCAGAACGGCGTAAGCTAGTTCAGTTTCTATCCT CTTTTAAAAATGAGCTAATTTTGTACGAAAGGACTCTTTCGCTAAAGTAATGCTTTGGCCCAGCCTTGTA Γ CR_VD1 ATTACACAAATAATGTTACATGACGAGCTGAGTAACTCATAAAAAGGACTGCCTTTTATGTAAGTGAGGT TGGCTACTAGACTTTACAGGAATATACGCAGATAGTTTCACCTTGAAAAAGAGTGTTGTATCGCGTATAT GAAAGGCCTACCTGAACAACAGAGTAATCCCAGGGGAAAGAGGTGCGAGTCTCGTAAAAAATAGGAATAA AGCTACCTAAAAAATATGGTGTGTAATGTGTGTATATAAGTATACGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAACCGTAAAATGTTTGGGAATAAGGTGTTTCTACACGCTTAGACTCCTTGCCATTGCCTGTGACAGAAG CAATCGCCTCAGTTCCCCTGTTTTTTTACACGTAAAAGTCCCCTGTTGACGCACATGGGAGCCGCCTTAT TAAAATAACTTATAATATAAGTGAAAGCACACCTAATTAGTTTTTATTAGGCATTTATAGTTTATTCAAA Γ CR_CD ATTTAGGCCCATATGTCACAGATACCTAGCCATACCTCGTTTTAGATTATGCTCTATAGCCTGTAGTAGA MuDLR (Reverse) TAAAGCTCTACAGCTGATAAGCATTTGTCAGAGTCATGTGAGACTTACCCTAATTAGTAAAAAAACAAGC GGAAAATTTAAAGCCTCAAATCCTAGAGTTATCGAATTTTTATAGTTAACTGTAAACTGTAAAAATGGGA TTCGAAAGGTCTAATTTTTCTCGTTTGACTTAATTCTGGTTGCTCACGTGATTTACCTGGGTTTGAAAAC TAGACTATATCTATCTTAAAATCAGAATATATATATAAATCAAGGTTTAAAAAAATTCCCAAAGCGTAAA Γ CR_VD2 TTATCGGTTGTTCAAAGAAATAACTAATAAAGGCTAATAAAAAAAGGAAAAAAAAGGTTACACACTAATG Γ Y CCTGGGGGGGGCTGGACCTGGAGGGGAAAAAGGAGAACAAACCCATAAGATGGCTGAGGAAAAGGCGGTG AGCTGTAAACTCATAAACAAGGTTGGCCCTTTCTTATGA

11 >gi : Mytilus galloprovincialis haplotype M mitochondrion, rrnal till trnay AAAGCATTAACTATAAAAGATACCCCTAAATGTTTTGTAAAAAGCGGGTCTAAACAAGGATAGTATAAAT AAATTTTAGTACCTTTTGCATAAGGGTTTTTCAAGACAAATTTAAGTATTTAATTTTCCCGAATGAAAGA GAGTTATTTTGTAGAGTTAAAAATCGTGGTAAAGATTTAATTAAATTATAAAATAGCGGCTAGATACTAT TCGCGCTTTTAGATATCTGGTTGGCTTAGAAATATGTGTAAGCATTACCCTTAAATACTTAAGGAGCAAA TTCTTCGGGTTAAGCTGAAAAATGTTAAAATTGACGCCAAGAAAAAAGTTGGTTTTTATAGGCTTTAGAC TAGCCACTAAGCACAAATTTATTTTAACTAAAACCAAGTGGTGGAAAAAATTAATTGGGGTCGTCATTTG CTCTAAGATAAGCCTGTGGTCGTAGAACCAAAAATTATGATAAAAACGAGTAAAGATATTCTTTGGCTGG TGTGACTCTACTGTTACACCTTAAAAAACTAACTGTGTTATAAGACTTTTTAAACGAACTCGGCAAACTA AGCTTCTCGACTGTTTAACAAAAACATTTCCTTTTGATATGAGTAAAAGGTAGTCCCTGCCCTATGCAAC TAAACTAACGTTTGTTGTAAATGGCGGCGTTAACGTGAGCGTCCTAAGGTAGCGCGATAATTTGCTTTTT AATTGAAGGATGGTATGAAAGGGTTAACGAAGAAGATGCTGTATCTAAAAATTTAATTTAAACTAATTTT AAGGTGAAGAGGCCTTAATGTAAAAGAAGGACGACAAGACCCTATGAAGCTTTATCTTAATTGAAGGTCT TAGCCTTTTATACGTTTTTGATGGGAGATCAGCAAAAATAAGTCTTTTGCTATAACATTAATCTTACTAG AATTTACTAGTTTTATATGTGTGACTAGCTACTCTAGGGATAACAGCGCAATTTCCCCCGAAAGATGGTA TTGGAGGAGAAGATTGCGACCTCGATGTTGGCTTTAGGTGCCCTAGAGGCGTAGAAGCCTCTAAGGGTGG GTCTGTTCGCCCTTTAAAATCTAACATGAGCTGAGTTCAGAACGGCGTAAGCTAGTTCAGTTTCTATCCT CTTTTAAAAATGAGCTAATTTTGTACGAAAGGACTCTTTCGCTAAAGTAATGCTTTGGCCCAGCCTTGTA ATTACACAAATAATGTTACATGACGAGCTGAGTAACTCATAAAAAGGACTGCCTTTTATGTAAGTGAGGT TGGCTACTAGACTTTACAGGAATATACGCAGATAGTTTCACCTTGAAAAAGAGTGTTGTATCGCGTATAT GAAAGGCCTACCTGAACAACAGAGTAATCCCAGGGGAAAGAGGTGCGAGTCTCGTAAAAAATAGGAATAA AGCTACCTAAAAAATATGGTGTGTAATGTGTGTATATAAGTATACGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAACCGTAAAATGTTTGGGAATAAGGTGTTTCTACACGCTTAGACTCCTTGCCATTGCCTGTGACAGAAG CAATCGCCTCAGTTCCCCTGTTTTTTTACACGTAAAAGTCCCCTGTTGACGCACATGGGAGCCGCCTTAT TAAAATAACTTATAATATAAGTGAAAGCACACCTAATTAGTTTTTATTAGGCATTTATAGTTTATTCAAA ATTTAGGCCCATATGTCACAGATACCTAGCCATACCTCGTTTTAGATTATGCTCTATAGCCTGTAGTAGA TAAAGCTCTACAGCTGATAAGCATTTGTCAGAGTCATGTGAGACTTACCCTAATTAGTAAAAAAACAAGC GGAAAATTTAAAGCCTCAAATCCTAGAGTTATCGAATTTTTATAGTTAACTGTAAACTGTAAAAATGGGA TTCGAAAGGTCTAATTTTTCTCGTTTGACTTAATTCTGGTTGCTCACGTGATTTACCTGGGTTTGAAAAC TAGACTATATCTATCTTAAAATCAGAATATATATATAAATCAAGGTTTAAAAAAATTCCCAAAGCGTAAA TTATCGGTTGTTCAAAGAAATAACTAATAAAGGCTAATAAAAAAAGGAAAAAAAAGGTTACACACTAATG CCTGGGGGGGGCTGGACCTGGAGGGGAAAAAGGAGAACAAACCCATAAGATGGCTGAGGAAAAGGCGGTG AGCTGTAAACTCATAAACAAGGTTGGCCCTTTCTTATGA National Center for Biotechnology Information,

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24 Forward..CGATTCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGTCCACAG...GCTAAGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCAGGTGTC. Reverse GTGAGTACTTATTTAAATGT GATTTTATGAGAGCAAAT..CGATTCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGTCCACAG. GATTTTATGAGAGCAAAT GTGAGTACTTATTTAAATGT..GCTAAGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCAGGTGTC. GTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAG CACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATC TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATC

25 Forward..CGATTCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGTCCACAG...GCTAAGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCAGGTGTC. Reverse NNCTGCAGGTGAGTACTTATTTAAATGT CTGCAG Pst I: GATTTTATGAGAGCAAATCGACGTCNN GACGTC..CGATTCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGTCCACAG...GCTAAGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATC GATTTTATGAGAGCAAATC GTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGTCCACAG.3..GCTAAGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCAGGTGTC. NNCTGCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGTCCACAG. NNGACGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATC GATTTTATGAGAGCAAATC GTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGCTGCAGNN..GCTAAGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCGACGTCNN NNCTGCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGCTGCAGNN NNGACGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCGACGTCNN

26 NNCTGCAGGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGCTGCAGNN NNGACGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCGACGTCNN Πέψη με Pst I GGTGAGTACTTATTTAAATGTAAATACATTAAG... ATTTTTGTAAACTAAAATACTCTCGTTTAGCTGCA ACGTCCACTCATGAATAAATTTACATTTATGTAATTC...TAAAAACATTTGATTTTATGAGAGCAAATCG

27 Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (puc18 και puc19) Πολυσύνδεσμος (MCS, multi-cloning site) puc18 puc19 Amp r : Γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη. lacz : Γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης. Το προϊόν του γονιδίου lacz συμβάλλει στην εμφάνιση μπλε χρώματος στις βακτηριακές αποικίες όταν στο θρεπτικό μέσο υπάρχει η ουσία X-gal. ori: σημείο έναρξης της αντιγραφής του DNA (origin of replication) Πολυσύνδεσμος: αλληλουχία που περιέχει μοναδικές θέσεις για συγκεκριμένες περιοριστικές ενδονουκλεάσες, η οποία παρεμβάλλεται στο γονίδιο lacz στο σωστό πλαίσιο ανάγνωσης.

28 ...CTGCAG......GACGTC... Eco RI Sac I Kpn I Sma I/Xma I Bam HI Xba I Sal I/Acc I Pst I Sph I Hind III Amp r LacZ MCS Vector 2,7 Kb Πέψη με Pst I...CTGCA G......G ACGTC...

29 Αντίδραση σύνδεσης (ligation) του τμήματος DNA (insert) με άκρα Pst I με τον πλασμιδιακό φορέα....ctgca G......G ACGTC... Pst I insert Pst I G......CTGCA ACGTC......G Τμήμα DNA με άκρα Pst I Μετά την αντίδραση σύνδεσης προκύπτουν 2 πληθυσμοί πλασμιδίων: Α. Ανασυνδυασμένα Β. Μη ανασυνδυασμένα (επανασύνδεση άκρων πλασμιδίου) insert Pst I Pst I Vector Pst I

30 Μετασχηματισμός βακτηρίων Βακτήρια Ανάπτυξη σε θρεπτικό με amp Χρώμα αποικιών παρουσία X-gal Μη μετασχηματισμένα Μετασχηματισμένα με μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Μετασχηματισμένα με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο + Μπλε + Άσπρο Επιλέγουμε άσπρες αποικίες για περαιτέρω έλεγχο (απομόνωση πλασιδιακού DNA, χαρτογράφηση, προσδιορισμό πρωτοδιάταξης κλπ.)