Ενδοκρινικό Σύστημα Μέτρηση Ορμονών -Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Ε. Μπότουλα Γ.Ν.Α ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ

Transcript

1 Ενδοκρινικό Σύστημα Μέτρηση Ορμονών -Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Ε. Μπότουλα Γ.Ν.Α ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ 1

2 Κύτταρο

3

4

5 Ενδοκρινής Κυκλοφορία Ιστοί-στόχοι αδένας (κύτταρο) Πυρήνας

6 Πεπτιδικές Στεροειδείς Αµίνες Figure 3c-1. Pathways of thyroid hormone metabolism.

7 Ενδοκρινικό κύτταρο Παρακείµενο κύτταρο ΠΑΡΑΚ ΡΙΝΙΚ Η ΡΑΣΗ ΕΝ ΟΚΡΙΝΙΚΗ ΡΑΣΗ ΑΥΤΟΚΡΙΝΙΚΗ ΡΑΣΗ Περιφερικά κύτταραι

8 Ενδοκρινής Κυκλοφορία Ιστοί-στόχοι αδένας (κύτταρο) Πυρήνας

9 Ειδικές Πρωτείνη που µεταφέρει τις θυρεοειδικές ορµόνες (TBG) Πρωτείνη που µεταφέρει τις ορµόνες του φύλου (SHBG) Πρωτείνη που µεταφέρει την κορτιζόλη (CBG) Πρωτείνη που µεταφέρει την βιταµίνη D Μη ειδικές Λευκωµατίνη Προλευκωµατίνη

10 (-) Υποθάλαµος (+) (-) Νευροϋπόφυση Αδενοϋπόφυση (+) Υποφυσιακή ορµόνη Περιφερικός Ενδοκρινής Αδένας ΟΡΜΟΝΗ

11 Υποθάλαµος ΤRH Αδενοϋπόφυση (+) TSH (-) Θυρεοειδής (περιφερικός αδένας) T3 + T4

12 TSH T4 ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ

13 α) την αύξηση και ανάπτυξη, β) τη διατήρηση της ισορροπίας του εσωτερικού περιβάλλοντος, γ) την παραγωγή, χρήση και αποθήκευση της ενέργειας δ) την αναπαραγωγή.

14

15 Ορµόνες της υπόφυσης ΑΔΕΝΟ-ΥΠΟΦΥΣΗ 1. Αυξητική (GH) 2. Θυρεοειδοτρόπος (TSH) 3. Φλοιοεπινεφριδιοτρόπος (ACTH) 4. Γοναδοτρόποι (FSH, LH) 5. Προλακτίνη (Prol) ΝΕΥΡΟ-ΥΠΟΦΥΣΗ 1. Αντιδιουρητική (ADH) 2. Ωκυτοκίνη

16 Ορµόνες του υποθαλάµου Εκλυτική των γοναδοτροφινών ορµόνη (GnRH GnRH) Εκλυτική της αυξητικής ορµόνης (GhRH GhRH) Εκλυτική της θυρεοειδοτρόπου (TRH) Εκλυτική ττης κορτικοτροφίνης (CRH) Σωµατοστατίνη Ντοπαµίνη

17 Θυροξίνη Σωµατοστατίνη Κορτιζόλη Αργινίνη (+) Ασκηση Υπογλυκαιµ Υποθάλαµος (-) GnRH Αδενουπόφυση GH

18 Θυρεοειδής αδένας Τ3, Τ4 TG Επινεφρίδια Κορτιζόλη Αλδοστερόνη Γονάδες Οιστραδιόλη Τεστοστερόνη 18

19

20 Υπερπαραγωγή Ανεπαρκής παραγωγή Αντίσταση των ιστών στη δράση της ορµόνη

21 H έρευνα της ενδοκρινολογίαςπροϋποθέτει τη καλή γνώση των βασικών αξόνων τουενδοκρινικού συστήματος Υποθάλαμος-Υπόφυση-Γονάδες Υποθάλαμος-Υπόφυση-Επινεφρίδια Υποθάλαμος-Υπόφυση-θυρεοειδής Η λειτουργία ή δυσλειτουργία των αξόνων ελέγχεται μετους εργαστηριακούς προσδιορισμούς των βασικών ορμονών Ένα αξιόπιστο εργαστήριο μπορεί να συμβάλει σημαντικάστη αντιμετώπιση των ενδοκρινικών διαταραχών 21

22 Επίσκεψη στον γιατρό Παραγγελία εργ. εξέτασης Ερμηνεία αποτελέσματος ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Λήψη δείγματος Εκτελεση εξετασης (αναλυση) Αποτελεσμα εξέτασης 22

23 Προ-αναλυτικό - Παραλαβή ή συλλογή και επεξεργασία δείγματος Αναλυτικό Μεθοδολογίες προσδιορισμού-τεχνικές Έλεγχος ποιότητας Μετα-αναλυτικό Επικύρωση μετρήσεων Εκτύπωση ή αποστολή αποτελεσμάτων 23

24 Μεθοδολογίες προσδιορισμού ορμονών- Τεχνικές Κριτήρια αξιολόγησης μεθόδων Έλεγχος ποιότητας 24

25 Βιολογικές µέθοδοι Χηµικές µέθοδοι Χρωµατογραφικές µέθοδοι Ανοσοχηµικές µέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισµοί (Immunoassay techniques) HPLC (High performance liquid chromatography) GC MS (Gas chromatography Mass spectrometry) Multiple assay 25

26 Οι ανοσοχηµικές µέθοδοι αποτελούν ειδική κατηγορία αναλυτικών τεχνικών στις οποίες χρησιµοποιούνται ως αντιδραστήρια αντισώµατα µε σκοπό τον ειδικό ποιοτικό ήποσοτικόπροσδιορισμό συγκεκριμένων ουσιών σε βιολογικά ή άλλα δείγματα. Χαρακτηριστικά ανοσοχηµικών µεθόδων: Εξειδίκευση Ευαισθησία Ακρίβεια Επαναληψιµότητα Απλότητα εκτέλεσης 26

27 1959: Ανάπτυξη ραδιοανοσοχημικής μεθόδου για τον προσδιορισμό της ινσουλίνης από τους R.S. Yalow και S.A. Berson και ραδιοδεσμευτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό της θυροξίνης από R.P. Ekins. 1967: Εισαγωγή των τεχνικών στερεάς φάσης για των διαχωρισμό των ελεύθερων από τα δεσμευμένα ανοσοαντιδραστήρια. 1968: Ανάπτυξη των πρώτων μη ανταγωνιστκών ανοσοχημικών μεθόδων. 1971: Αναπτύσονται οι πρώτοι ενζυμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί. 1973: Εφαρμόζεται για πρώτη φορά η τεχνική του πολωμένου φθορισμού για την ανάπτυξη ομογενών ανοσοχημικών μεθόδων. 1975: Οι Kohler και Milstein αναπτύσουν τη μέθοδο παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων. 1977: Εισαγωγή των χημειοφωταυγών ιχνηθετών για την αύξηση της ευαισθησίας των προσδιορισμών. 1979: Η R.S. Yalow λαμβάνει το βραβείο Nobel Φυσιολογίας και Ιατρικής. 1979: Ανάπτυξη του πρώτου ανοσοχημικού ηλεκτροχημικού αισθητήρα. 1981: Η τεχνική του χρονικά διαχωριζόμενου φθορισμού οδηγεί στην ανάπτυξη υπερευαίσθητων ανοσοχημικών μεθόδων. 1984: Ανάπτυξη του πρώτου οπτικού ανοσοχημικού αισθητήρα. 1989: Ανάπτυξη των πρώτων συστοιχιών αντισωμάτων για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών αναλυτών στο ίδιο δείγμα. 27

28 Ag* Ag + Ab Ag*Ab + AgAb Προσδιορισµός κατανοµής ιχνηθέτη µετά από τον διαχωρισµό των δεσµευµένων από τις ελεύθερες µορφές ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Προσδιορισµός κατανοµής ιχνηθέτη χωρίς διαχωρισµό των δεσµευµένων από τις ελεύθερες µορφές ΟΜΟΓΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 28

29 Αντίσωµα (Ab Ab) Υψηλής εξειδίκευσης ως προς το Ag Μονοκλωνικά αντισώµατα Επισηµασµένο Ag ή Ab (conjugate) Σταθερός δεσµός µε ιχνηθέτη Να διατηρεί τις (ανοσολογικές) ιδιότητες του Ag ή Ab Ιχνηθέτης Ραδιοϊσότοπο (κυρίως I125) RIA IRMA Ένζυµα (Αλκ. Φωσφατάση, Υπεροξειδάση) EIA-ELISA Φθορίζον µόριο (φλοουρεσκείνη) FIA Χηµειοφωταυγής αντίδραση CLIA 29

30 Ανάµειξη δείγµατος µε θερµή ορµόνη και αντίσωµα Επώαση ιαχωρισµός ελεύθερης από συνδεδεµένη ορµόνη Μέτρηση Κατασκευή καµπύλης αναφοράς 30

31 Δύο είναι οι σπουδαιότεροι τύποι ανοσοχημικών μεθόδων : Ανταγωνιστικού τύπου Επισήμανση του Ag Το επισημασμένο Ag ανταγωνίζεται με το Ag του δείγματος για τις θέσεις σύνδεσης του Ab Για μικρού ΜΒ ουσίες (απτένια) πχ στεροειδή, θυροειδικές ορμόνες κλπ Μεγάλη ευαισθησία Μη ανταγωνιστικού τύπου (ή sandwich) Επισήμανση του Ab Για πεπτίδια ή πρωτεΐνες πχ TSH, PTH κλπ Πολύ μεγάλη ευαισθησία 31

32 A + A B + Σήµα Σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η α ν α λ ύ τ η Ιχνηθέτης Ορµόνη Ακινητοποιηµένος αναλύτης 32

33 B + Σήµα Σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η α ν α λ ύ τ η Αντίσωµα σύλληψης Ορµόνη Αντίσωµα ανίχνευσης 33

34 Αντίσωµα Επισηµασµένο αντιγόνο -αντίσωµα Ιχνηθέτης Πρότυπα διαλύµατα Σύστηµα διαχωρισµού/διάκρισης φάσεων Συστηµα επεξεργασίας των αποτελεσµάτων 34

35 Κριτήρια επιλογής αντισώματος ανάλυσης Σταθερά σύνδεσης Εξειδίκευση Η εξειδίκευση ενός αντισώματος εκφράζει την ικανότητα του να αναγνωρίζει αποκλειστικά την προς προσδιορισμό ουσία. Μετρό της εξειδίκευσης ενός αντισώματος είναι η διασταυρούμενη δραστικότητα (cross-reactivity)με ουσίες παρεμφερούς δομής προς αυτή του αναλύτη. 35

36 Πολυκλωνικά αντισώµατα Μονοκλωνικά αντισώµατα 36

37 Διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης της προς προσδιορισμό ουσίας. Χρησιμοποιείται πρώτη ύλη υψηλής καθαρότητας όμοιας δομής με την ουσία που θα προσδιοριστεί στα δείγματα των ασθενών. Το μέσο παρασκευής τους επιλέγεται ώστε να μην παρατηρούνται διαφοροποιήσεις ανάμεσα στα πρότυπα διαλύματα και τα άγνωστα δείγματα. Η βαθμονόμηση τους γίνεται ώς προς Διεθνή Πρότυπα τα όποια διαθέτει ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ή η Ευρωπαϊκή Ένωση. 37

38 Εξειδίκευση Προσδιορισμός διασταυρούμενης δραστικότητας Ευαισθησία Κλίση καμπύλης βαθμονόμησης Προσδιορισμός ορίου ανίχνευσης Ακρίβεια Ανάκτηση εξωγενώς προστιθέμενης ουσίας Γραμμικότητα αραίωσης δειγμάτων Επαναληψιμότητα Προσδιορισμός διακύμανσης των τιμών των δειγμάτων εντός του ιδίου και μεταξύ προσδιορισμών 38

39 39

40 Πλεονεκτήματα αυτόματων αναλυτών Μπορούν να εκτελούν πολλούς διαφορετικούς προσδιορισμούς σε σειρά Μπορούν να εκτελούν αναλύσεις σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων σε πολύ μικρότερο χρόνο Επεξεργάζονται τα αποτελέσματα Έχουν ενσωματωμένα προγράμματα ελέγχου ποιότητας μέσω ορών ελέγχου Η αξιοπιστία της ανάλυσης δεν εξαρτάται από τον χειριστή 40

41 Μειονεκτήματα αυτόματων αναλυτών Υψηλό κόστος αγοράς και λειτουργίας Κλειστά συστήματα που χρησιμοποιούν συγκεκριμένα αντιδραστήρια Μπορεί να εμφανίσουν προβλήματα αξιοπιστίας Η αξιοπιστία της ανάλυσης δεν εξαρτάται από τον χειριστή 41

42 Τεχνική διαχωρισμού υψηλής ευαισθησίας Χρησιμοποιείται και ως 1ο στάδιο «καθαρισμού» του δείγματος πριν από μια ανοσοχημική μέθοδο. Μελέτη προϊόντων μεταβολισμού Κυρίως χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς Για πολλές ορμόνες (πχ στεροειδή) η HPLC αποτελεί μέθοδο αναφοράς 42

43 43

44 44

45 Συνδυασμός μιας τεχνικής διαχωρισμού όπως η αέρια χρωματογραφίας (GC), με μια τεχνική ταυτοποίησης (φασματομετρία μάζας MS) Πολύ ισχυρή αναλυτική τεχνική με υψηλή ευαισθησία Εφαρμόζεται σε ουσίες (ορμόνες) με θερμική σταθερότητα και πτητικότητα Χρησιμοποιείται κυρίως για ερευνητικούς σκοπούς 45

46 Περισσότεροι από ένας προσδιορισμοί (εξετάσεις) ταυτόχρονα (στο ίδιο δείγμα): Evidence the multi-analyte Biochip Array Technology (Randox) Luminex 46

47 47

48 Παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή και την προετοιμασία του Παράγοντες που σχετίζονται με το δείγμα Παράγοντες που σχετίζονται με την ίδια τη φύση των ορμονών αλλά και με ενδογενείς περιορισμούς των ανοσομετρήσεων 48

49 Διαιτητική κατάσταση Φύλο ηλικία Φάρμακα Φυσική κατάσταση του ασθενούς stress Θέση του σώματος 49

50 Τόσο η λήψη, όσο και η αποφυγή λήψης τροφής μπορεί: -Να προκαλέσουν διέγερση ή αναστολή της έκκρισης ορισμένων ορμονών -Να παρέμβουν στον προσδιορισμό των ορμονών in vitro 50

51 Φύλο: Επηρεάζει την παραγωγή ορµονών και των συνδετικών πρωτεϊνών τους ιαφοροποίηση ανάλογα µε την ηλικία 51

52 Μπορεί να επηρεάσουν τα επίπεδα των ορμονών με τρείς τρόπους: Να διεγείρουν ή να αναστείλουν την παραγωγή μιας ορμόνης ή της δεσμευτικής της πρωτεΐνης in vivo Να επηρεάσουν τη μεταφορά (μέσω ανταγωνισμού στη σύνδεση με τις πρωτεΐνες-φορείς), τον μεταβολισμό ή την απέκκριση μίας ορμόνης Να παρέμβουν στην αναλυτική διαδικασία 52

53 Φυσική κατάσταση του ασθενούς stress Θέση του σώματος 53

54 Αιμοληψία Αιμόλυση Φιαλίδια συλλογής Αντιπηκτικά Συνθήκες διαχωρισμού του δείγματος Συνθήκες διατήρησης 54

55 1. Βιολογικοί ρυθμοί: Ρυθμός ζωής Εποχιακός ρυθμός Μηνιαίος ρυθμός Νυχθήμερος ή κιρκαδιανός ρυθμός Ρυθμός εκκριτικής αιχμής (secretory peak) ανά λεπτό ή ώρα 2. Συνδετικές πρωτεΐνες 55

56 Μέτρηση της ανοσολογικής δραστικότητας Μη ειδικές παρεµβολές στις ανοσοαναλύσεις Φαινόµενο hook στις υψηλές συγκεντρώσεις 56

57 Αυτές δεν ταυτίζονται πάντα, γιατί μπορεί να κυκλοφορούν περισσότερες της μιάς μορφές της ορμόνης βιολογικά αδρανείς ή λιγότερο δραστικές από την ανέπαφη, όπως: Μεγαλυτέρου Μ.Β.(πρόδρομες ορμόνες, πολυμερείς μορφές) Μικρότερου Μ.Β. κλάσματα Μη φυσιολογικά ανάλογα της φυσικής ορμόνης ή έκτοπη παραγωγή πρόδρομων μορφών 57

58 ΜΟΡΦΗ ΠΡΟΛΑΚΤΙΝΗΣ Απλή (Little) ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ (KD) 23 % ΤΗΣ ΟΛΙΚΗΣ ΠΡΟΛΑΚΤΙΝΗΣ ΣΤΟΝ ΟΡΟ Μεγάλη (Big) Μεγάλη-Μεγάλη (Big-Big) 150 <10

59 NH COOH Carboxy-terminal fragments COOH 84 N-terminal fragments

60 Παρουσία αντισωµάτων προς την ίδια την ορµόνη Ετερόφιλα αντισώµατα Ρευµατοειδείς παράγοντες 60

61 Παράδειγμα: Τα αντιθυρεοσφαιρινικά αυτοαντισώματα (TgAb) παρεμβαίνουν στη μέτρηση της θυρεοσφαιρίνης (Tg) κυρίωςμε τις ανοσομετρικές μεθόδους δύο θέσεων προκαλώντας ψευδώς χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα αποτελέσματα.όμως, ούτε οι ανταγωνιστικές RIAείναι ασφαλείς Γι αυτό συνιστάται, μαζί με τη μέτρηση της Tg, να μετρώνται σε κάθε δείγμα και τα TgAb με ευαίσθητη μέθοδο και να μην αξιολογούνται τα αποτελέσματα της όταν αυτά είναι θετικά. 61

62 Αντισώματα που αναπτύσσονται στον ορό ορισμένων ανθρώπων προς τις ανοσοσφαιρίνες ενός ή/και περισσοτέρων ζώων Προέλευση Ιατρογενής:χορήγηση φαρμακευτικών ή διαγνωστικών ουσιών Μη ιατρογενής: συγκατοίκηση και ενασχόληση με ζώα Συχνότερα εμφανιζόμενο: το HAMA ( Human Anti-Mouse Antibody) 62

63 Αποτέλεσμα μη συμβατό με την κλινική εικόνα Ετερόφιλο αντίσωμα; Δοκιμασία αραίωσης Όχι η αναμενόμενη γραμμικότητα; Αυξημένη πιθανότητα 63

64 Χαμηλής συγγένειας ανθρώπινα αυτοαντισώματα (κυρίως IgM) που αναγνωρίζουν επιτόπους στο τμήμα Fcτης IgGασθενών που πάσχουν από ρευματικά νοσήματα Συνδέονται με το τμήμα Fcτων επιστρωμένων ή ακινητοποιημένων πολυκλωνικών αντισωμάτων Παρεμποδίζουν τη σύνδεση της ορμόνης στο αντίσωμα 64

65 Επηρεάζει: Δείγματα με πολύ ψηλές τιμές ορμόνης, όπως π.χ. με HCG, TG Τις ανοσομετρικές μεθόδους δύο θέσεων ( two site-ima) Προκαλεί: Ψευδώς χαμηλές ή μηδενικές τιμές 65

66 66

67 Αποτέλεσμα μη συμβατό με την κλινική εικόνα και αναμενόμενη τιμή πολύ υψηλή Μέτρηση του δείγματος ως έχει και με αραίωση 1:10 με ορό ελεύθερο ορμόνης Ψηλότερη τιμή στο σωληνάριο με το αραιωμένο δείγμα hook effect 67

68 Τεχνικά Σφάλµατα Τιµές Αναφοράς Η Απόλυτη τιµή πολλές φορές στερείται διαγνωστικής αξίας 68

69 Μέτρηση ιάγνωση

70 70