Μεθοδολογία Ορμονικών προσδιορισμών Κριτήρια επιλογής και αξιολόγησης των μεθόδων

Transcript

1 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ: ΕΡΕΥΝΑ ΣΤΗ ΓΥΝΑΙΚΕΙΑ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ Μεθοδολογία Ορμονικών προσδιορισμών Κριτήρια επιλογής και αξιολόγησης των μεθόδων Δημήτρης Ρίζος, Επίκουρος Καθηγητής Κλινικής Χημείας Ορμονολογικό Εργαστήριο, Αρεταίειο Νοσοκομείο Περίληψη παρουσίασης Εργαστήριο και διάγνωση-στάδια εργαστηριακής διαδικασίας Μέθοδοι προσδιορισμού ορμονών Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων Έλεγχος ποιότητας εργαστηριακών αποτελεσμάτων Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων Κλινική αξιολόγηση των ορμονικών προσδιορισμών Εισαγωγή H έρευνα της ενδοκρινολογίας της αναπαραγωγής προϋποθέτει τη καλή γνώση των βασικών αξόνων του ενδοκρινικού συστήματος Υποθάλαμος-Υπόφυση-Γονάδες Υποθάλαμος-Υπόφυση-Επινεφρίδια Υποθάλαμος-Υπόφυση-θυρεοειδής Ο λειτουργία ή δυσλειτουργία των αξόνων ελέγχεται με τους προσδιορισμούς των βασικών ορμονών Ένα αξιόπιστο εργαστήριο προσδιορισμού των ορμονών μπορεί να συμβάλει σημαντικά στη αντιμετώπιση των ενδοκρινικών διαταραχών Εργαστήριο Παραπεμπτικό Αποτέλεσμα ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ

2 Το κύκλωμα της διάγνωσης μέσω εργαστηριακών εξετάσεων Επίσκεψη στον γιατρό Παραγγελία εργ. εξέτασης Ερμηνεία αποτελέσματος Λήψη δείγματος Αποτέλεσμα εξέτασης Εκτέλεση εξέτασης (ανάλυση) Το κύκλωμα του εργαστηρίου Στάδια εργαστηριακής διαδικασίας Προ-αναλυτικό Παραλαβή ή συλλογή και επεξεργασία δείγματος Αναλυτικό Μεθοδολογίες προσδιορισμού-τεχνικές Έλεγχος ποιότητας Μετα-αναλυτικό Επικύρωση μετρήσεων Εκτύπωση ή αποστολή αποτελεσμάτων Αναλυτική διαδικασία Μεθοδολογίες προσδιορισμού ορμονών-τεχνικές Κριτήρια αξιολόγησης μεθόδων Έλεγχος ποιότητας Μέθοδοι προσδιορισμού ορμονών Βιολογικές μέθοδοι Χημικές μέθοδοι

3 Χρωματογραφικές μέθοδοι Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques) HPLC (High performance liquid chromatography) GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) Multiple assay Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassays) Αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος Υψηλή εξειδίκευση Ab Υψηλή χημική συγγένεια δεσμού Ag + Ab Ag-Ab Τύποι ανοσοπροσδιορισμών (1) Ag + Ab Ag-Ab Η χρήση της αντίδρασης αντιγόνου-αντισώματος ως αναλυτικού εργαλείου γίνεται: με την αναγνώριση του συμπλόκου Ag-Ab (Έμμεσες μέθοδοι) με τη βοήθεια της σήμανσης του ενός εκ των δύο αντιδραστηρίων (Άμεσες μέθοδοι) Τύποι ανοσοπροσδιορισμών (2) Έμμεσες μέθοδοι: (ποιοτική ή ημιποσοτική εκτίμηση της ποσότητας του συμπλόκου Ag-Ab) Αντιδράσεις συγκόλλησης (Agglutination) Αντισώματα συνδεδεμένα με ερυθρά ή latex, Σχηματισμός ιζήματος Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Radial immunodiffusion) Ανοσοηλεκτροφόρηση (Immunoelectrophoresis) Νεφελομετρία (Nephelometry) Σχηματισμός μικρο-συσσωματωμάτων (νεφελώματων) Ag-Ab Μέτρηση της σκέδασης του φωτός Χρησιμοποιείται στη μέτρηση ανοσοσφαιρινών

4 Τύποι ανοσοχημικών τεχνικών (3) Άμεσες μέθοδοι: (Χρήση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος, ποσοτικές μέθοδοι) Αν σε διάλυμα ενός αντιγόνου (πχ Τ4) άγνωστης συγκέντρωσης (C x ) προσθέσουμε συγκεκριμένη ποσότητα επισημασμένου Τ4 (πχ με Ι 125 ) και συγκεκριμένη ποσότητα Ab (έναντι της Τ4) τότε μετά την αντίδραση, Ag + Ab Ag-Ab Ag* + Ab Ag*-Ab η ποσότητα του Ag*-Ab είναι αντιστρόφως ανάλογη της C x Ιστορική αναδρομή Πρώτη εφαρμογή: Rosalyn Yalow, Solomon Berson, Nature 1959: Μέθοδος προσδιορισμού ινσουλίνης R. Ekins, Clin Chim Acta 1960: Μέθοδος προσδιορισμού Τ4 Από τότε πληθώρα εφαρμογών 1979 Βραβείο Nobel Φυσιολογίας και Ιατρικής στην R. Yalow Χαρακτηριστικά των ανοσοχημικών μεθόδων Αντίσωμα (Ab) Υψηλής εξειδίκευσης ως προς το Ag Μονοκλωνικά αντισώματα Επισημασμένο Ag ή Ab (conjugate) Σταθερός δεσμός με ιχνηθέτη Να διατηρεί τις (ανοσολογικές) ιδιότητες του Ag ή Ab Ιχνηθέτης Σταθερός δεσμός με Ag ή Ab Υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης (μικρές ποσότητες ιχνηθέτη να δίνουν μεγάλο σήμα) Ραδιοϊσότοπο (κυρίως I125) RIA-IRMA Ένζυμα (Αλκ. Φωσφατάση, Υπεροξειδάση) EIA-ELISA Φθορίζον μόριο (φλοουρεσκείνη) FIA Χημειοφωταυγής αντίδραση CLIA Είδη ανοσοχημικών μεθόδων (1) Ετερογενείς μέθοδοι Απαιτείται διαχωρισμός του ελεύθερου από το δεσμευμένο κλάσμα του επισημασμένου Ag ή Ab Τεχνικές διαχωρισμού: Δεύτερο αντίσωμα Στερεή φάση Ομογενείς μέθοδοι Δεν απαιτείται διαχωρισμός του ελεύθερου από το δεσμευμένο κλάσμα του επισημασμένου Ag ή Ab (αλλαγή ιδιοτήτων)

5 Τύποι ετερογενών μεθόδων Οι ετερογενείς μέθοδοι διακρίνονται σε: Ανταγωνιστικού τύπου Επισήμανση του Ag Το επισημασμένο Ag ανταγωνίζεται με το Ag του δείγματος για τις θέσεις σύνδεσης του Ab Για μικρού ΜΒ ουσίες (απτένια) πχ στεροειδή, θυροειδικές ορμόνες κλπ Μέτρια-μεγάλη ευαισθησία Μη ανταγωνιστικού τύπου (ή sandwich) Επισήμανση του Ab Για πεπτίδια ή πρωτεΐνες πχ TSH, PTH κλπ Πολύ μεγάλη ευαισθησία Μέθοδοι ανταγωνιστικού τύπου (1) Μέθοδοι ανταγωνιστικού τύπου (2) Το «σήμα» του ιχνηθέτη είναι αντιστρόφως ανάλογο της ποσότητας του προσδιοριζόμενου αντιγόνου του δείγματος Μέθοδοι μη ανταγωνιστικού τύπου sandwich (1)

6 Μέθοδοι μη ανταγωνιστικού τύπου sandwich (1) Το «σήμα» του ιχνηθέτη είναι ανάλογο της ποσότητας του προσδιοριζόμενου αντιγόνου του δείγματος Ανοσοχημικές μέθοδοι (3) Πρότυπες καμπύλες Βαθμονομητές (Calibrators) Βαθμονομημένοι ως προς διεθνή πρότυπα (δεν υπάρχουν για όλες τις ορμόνες) Σταθερότητα Κατασκευή πρότυπης καμπύλης Προσαρμογή (fit) της καμπύλης Μέθοδοι προσαρμογής Point to point Linear Logarithmic, Spline HPLC (High performance liquid chromatography) Τεχνική διαχωρισμού υψηλής ευαισθησίας Χρησιμοποιείται και ως 1ο στάδιο «καθαρισμού» του δείγματος πριν από μια ανοσοχημική μέθοδο. Μελέτη προϊόντων μεταβολισμού Κυρίως χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς

7 Για πολλές ορμόνες (πχ στεροειδή) η HPLC αποτελεί μέθοδο αναφοράς Αρχή λειτουργίας HPLC Αποτελέσματα HPLC Προσδιορισμός ορμονών με HPLC Corticotropin releasing hormone (CRH) POMC και ACTH Α-Melanocyte stimulating hormone (a-msh) IGF-1 Calcitonin Insulin and proinsulin Anabolic Steroids 25-OH-Vitamin D GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) Συνδυασμός μιας τεχνικής διαχωρισμού όπως η αέρια χρωματογραφίας (GC), με μια τεχνική ταυτοποίησης (φασματομετρία μάζας MS) Πολύ ισχυρή αναλυτική τεχνική με υψηλή ευαισθησία

8 Εφαρμόζεται σε ουσίες (ορμόνες) με θερμική σταθερότητα και πτητικότητα Χρησιμοποιείται κυρίως για ερευνητικούς σκοπούς Multiple assays Περισσότεροι από ένας προσδιορισμοί (εξετάσεις) ταυτόχρονα Evidence the multi-analyte Biochip Array Technology (Randox) Luminex

9 Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων Χαρακτηριστικά αναλυτικών μεθόδων Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία (Analytical sensitivity) Αναλυτική ειδικότητα (Analytical specificity) Χαρακτηριστικά επίδοσης (Performance characteristics) Ακρίβεια (Accuracy) Επαναληψιμότητα (Precision) Όριο ανίχνευσης (Detection limit) Γραμμικότητα ή αναλυτικό εύρος (Linearity, analytical range) Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία (Analytical sensitivity) Η δυνατότητα της μεθόδου να προσδιορίζει μικρές ποσότητες της προς ανάλυση ορμόνης Ε = ds/dc Αναλυτική ειδικότητα (Analytical specificity) Η ικανότητα της μεθόδου να προσδιορίζει εκλεκτικά και αποκλειστικά την ορμόνη Πχ προσδιορισμός της TSH παρουσία hcg Σχετίζονται με: Είδος αντισώματος Είδος και ευαισθησία ιχνηθέτη Χαρακτηριστικά επίδοσης μεθόδων Ακρίβεια (Accuracy) Η δυνατότητα της μεθόδου να προσδιορίζει την «πραγματική» ποσότητα της ορμόνης Inaccuracy, bias: τα μαθηματικά μέτρα της ακρίβειας Επαναληψιμότητα (Precision) Η δυνατότητα της μεθόδου να δίνει το ίδιο αποτέλεσμα σε επανειλημμένες μετρήσεις του ίδιου δείγματος Μέτρο της επαναληψιμότητας: CV% =SD*100/mean

10 Επαναληψιμότητα Στον ίδιο αναλυτικό κύκλο ( Within run, intraassay) Μέτρηση τουλάχιστον 20 φορές του ιδίου δείγματος μέσα στον αναλυτικό κύκλο. Υπολογισμός του SD και CV Μεταξύ αναλυτικών κύκλων (Between run, interassay) Μέτρηση του ιδίου δείγματος 10 ή περισσότερες διαδοχικές ημέρες Υπολογισμός του SD και CV Συνολική επαναληψιμότητα Συνδυασμός των παραπάνω Συνήθως η επαναληψιμότητα στον ίδιο κύκλο είναι μικρότερη της επαναληψιμότητας μεταξύ κύκλων Η επαναληψιμότητα εξαρτάται από τη συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ορμόνης (όσο μικρότερη η συγκέντρωση τόσο μεγαλύτερη η επαναληψιμότητα) Η επαναληψιμότητα σχετίζεται με το τυχαίο σφάλμα. Μέτρο το CV% (imprecision) Παράδειγμα υπολογισμού της επαναληψιμότητας %CV Ορμονών Ακρίβεια Η απόκλιση των τιμών μιας μεθόδου από την «αληθή» τιμή μπορεί να οφείλεται σε τυχαίες ή συστηματικές αποκλίσεις (τυχαία ή συστηματικά σφάλματα) Η εκτίμηση της ακρίβειας μιας μεθόδου γίνεται κυρίως με πειράματα «Σύγκρισης μεθόδων» Σύγκριση μεθόδων Πως γίνεται? Μέτρηση περισσότερων από 50 (ή 100) δειγμάτων και με τις δύο μεθόδους Τα δείγματα καλύπτουν όλο το εύρος τιμών Πως τα αξιολογούμε? Διαγράμματα διασποράς, διαγράμματα διαφορών Ανάλυση γραμμικής εξάρτησης (Υ=αΧ+β) Κλίση καμπύλης Τετμημένη επί την αρχή Συντελεστής συσχέτισης

11 Παράδειγμα σύγκρισης μεθόδων Υπολογίζουμε την ευθεία γραμμικής εξάρτησης (παλινδρόμησης) Υ=αΧ+β FPIA = 0,54 + 0,98*RIA Εκτίμηση σφαλμάτων: Τυχαία σφάλματα (διασπορά τιμών περί την ευθεία, συντελεστής συσχέτισης ( r =0,90) Συστηματικά σφάλματα Αναλογικό (α) Σταθερό (β) Συνήθως συνυπάρχουν αναλογικό και σταθερό σφάλμα Όριο ανίχνευσης (Detection limit) Ελάχιστη δυνατή ποσότητα της ουσίας (ορμόνης) που μπορεί να μετρηθεί με την μέθοδο Συνδέεται με την αναλυτική ευαισθησία Όσο μεγαλύτερη η αναλυτική ευαισθησία τόσο μικρότερο το όριο ανίχνευσης Δεν έχει πάντα κλινική σημασία Μεγάλη σημασία για την TSH, μικρή σημασία για την T4 Λειτουργική ευαισθησία Η μικρότερη δυνατή ποσότητα της ορμόνης που μπορεί να προσδιοριστεί με επαναληψιμότητα 20%

12 Έλεγχος ποιότητας εργαστηριακών αποτελεσμάτων Έλεγχος ποιότητας Αποτελεί το σημαντικότερο εργαλείο του εργαστηριακού για την παραγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων Αποτελεί μέρος του ευρύτερου συστήματος «Διαχείρισης ολικής ποιότητας» Διακρίνεται σε δύο παράλληλους και συμπληρωματικούς μηχανισμούς: Τον εσωτερικό (ενδο-εργαστηριακό) έλεγχο Τον εξωτερικό (δι-εργαστηριακό) έλεγχο Το βασικό εργαστηριακό πρόβλημα Ερώτημα: Πως μπορούμε να ελέγξουμε την «ποιότητα» μιας εργαστηριακής μέτρησης; Πχ αν το αποτέλεσμα της μέτρησης της χοληστερόλης σε ένα ασθενή είναι 247 πως μπορούμε να ξέρουμε αν το αποτέλεσμα αυτό αντιστοιχεί στην πραγματική συγκέντρωση της χοληστερόλης στον ορό του ασθενούς; Το βασικό εργαστηριακό πρόβλημα (2) Επανάληψη της μέτρησης Λύση: Η ανάλυση, ταυτόχρονα με τον ορό του ασθενούς, ενός ορού ελέγχου ο οποίος έχει αναλυθεί αρκετές φορές στο παρελθόν και γνωρίζουμε την κατανομή των τιμών του. Αν το αποτέλεσμα του ορού ελέγχου είναι μέσα στα όρια της κατανομής των τιμών του τότε μπορούμε με πολύ μεγαλύτερη βεβαιότητα να συμπεράνουμε ότι και το αποτέλεσμα του ασθενούς είναι κατά πάσα πιθανότητα σωστό. Η βασική ιδέα στον έλεγχο ποιότητας Η ορθότητα των αποτελεσμάτων των ασθενών εξασφαλίζεται με την αξιολόγηση της συμπεριφοράς δειγμάτων ελέγχου που αναλύονται παράλληλα με τους ορούς των ασθενών. Τι χρειαζόμαστε;

13 Ένα εργαλείο για να συγκρίνουμε το σημερινό αποτέλεσμα του ορού ελέγχου με αυτό που αναμένεται σύμφωνα με την κατανομή των τιμών Ένα τέτοιο στατιστικό εργαλείο είναι το διάγραμμα ελέγχου. Ιδιότητες των ορών ελέγχου Κανένα κλινικό εργαστήριο δεν μπορεί να λειτουργεί σωστά (και ίσως δεν μπορεί να υπάρξει) χωρίς τα υλικά του ελέγχου ποιότητας. Μερικές από της ιδιότητες των ορών ελέγχου είναι: Να μοιάζουν όσο το δυνατόν με τα δείγματα των ασθενών Μεγάλη σταθερότητα για να μπορούν να χρησιμοποιούνται επί μακρόν Ομοιογένεια μεταξύ διαφορετικών παρτίδων του υλικού Οι συγκεντρώσεις των συστατικών τους να είναι σε επίπεδα ανάλογα με αυτά των ορών των ασθενών και ή δυνατόν σε τιμές κρίσιμες για την κλινική αξιολόγηση. Διαγράμματα ελέγχου Διάγραμμα κατανομής της συγκέντρωσης του ορού ελέγχου σε σχέση με το χρόνο (Διάγραμμα Levey -Jennings) Διάγραμμα Levey-Jennings Κριτήρια ελέγχου Αξιολογούμε τη θέση μια νέας τιμής πάνω στο διάγραμμα Levey-Jennings σε σχέση με τα όρια ελέγχου συγκριτικά με τις προηγούμενες τιμές Αποφασίζουμε αν μία σειρά αναλύσεων είναι υπό έλεγχο ή εκτός έλεγχου Συμβολισμός: Ν L (N ο αριθμός μετρήσεων ορών ελέγχου και L το όριο που παραβιάζεται (πολ/σιο της SD) πχ 1 2s ή 1 3s

14 Μέθοδοι ενός κριτηρίου Ένας ορός ελέγχου ανά σειρά αναλύσεων Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα κριτήρια είναι: 1 2s ή 1 3s Αντιμετώπιση των εκτός ελέγχου καταστάσεων Τι γίνεται όταν μία κατάσταση βρεθεί εκτός ελέγχου; Θα πρέπει να σταματήσουμε την ανάλυση Λήψη μέτρων επαναφοράς της κατάστασης υπό έλεγχο Συσχέτιση του κριτηρίου που παραβιάζεται με το είδος του σφάλματος. Συσχέτιση του είδους του σφάλματος με πιθανές αιτίες. Εντοπισμός της αιτίας, διόρθωση και επιβεβαίωση Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας Γίνεται με τη συμμετοχή του εργαστηρίου στα «Δι-εργαστηριακά προγράμματα εξωτερικής αξιολόγησης ποιότητας» (EQAS) Ο Οργανωτής του EQAS αποστέλλει σε τακτά χρονικά διαστήματα ορούς ελέγχου στα συμμετέχοντα εργαστήρια, τα οποία αφού προσδιορίσουν τα ελεγχόμενα συστατικά αποστέλλουν πίσω στον Οργανωτή τα αποτελέσματα Ο οργανωτής επεξεργάζεται τα αποτελέσματα στατιστικά και αποστέλλει στους συμμετέχοντες την έκθεση των αποτελεσμάτων Έκθεση αποτελεσμάτων εξωτερικού ελέγχου ποιότητας

15 Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων Αβεβαιότητα Κάθε μέτρηση ενός μεγέθους (συγκέντρωσης) αποτελεί εκτίμηση της «αληθούς» τιμής του μεγέθους. Ως αβεβαιότητα ορίζουμε το μέγεθος που εκτιμά τη διασπορά των τιμών περί την αληθή τιμή Αβεβαιότητα «Σφάλμα» Η τελική αβεβαιότητα της μέτρηση προκύπτει ως άθροισμα της αβεβαιότητας των επι μέρους σταδίων Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων Στάδια εργαστηριακής διαδικασίας που συμβάλουν στην τελική αβεβαιότητα του αποτελέσματος. ΠΗΓΕΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ Προ-αναλυτικό Αναλυτικό Μέτα-αναλυτικό Βιολογική Βαθμονομητές Επικύρωση αποτ. μεταβλητότητα Δειγματοληψία Αντιδραστήρια Έκθεση αποτ. Μεταφορά δείγματος Φυγοκέντρηση Εξωγενείς παράγοντες Αναλυτές Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων (2) Ποσοστά σφαλμάτων κατά στάδιο

16 Προ-αναλυτικοί παράγοντες Προ-αναλυτικοί παράγοντες που επηρεάζουν την αβεβαιότητα των αποτελεσμάτων (αλλά και την ερμηνεία) των ορμονικών προσδιορισμών Παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή Παράγοντες που σχετίζονται με το δείγμα Παράγοντες που σχετίζονται με τη φύση των ορμονών Παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή Βιολογικοί παράγοντες (που δεν μπορούν να επηρεαστούν) Ηλικία (παιδιά, έφηβοι, ενήλικες, πχ DEHA-S) Φύλο (στεροειδή του φύλου) Φυλή (Β12, AFP στην κύηση) Κύηση (μεγάλες μεταβολές σχεδόν όλων των ορμονών) Παράγοντες που μπορούν να ελεγχθούν Δίαιτα, Λήψη τροφής (πχ Ινσουλίνη, VMA) Φάρμακα (διεγείρουν ή αναστέλλουν την παραγωγή (Τ4), επηρεάζουν την μεταφορά (Ε2 SHBG) Φυσική κατάσταση - stress (Κορτιζόλη, PRL, κατεχολαμίνες, ACTH, GH) Θέση του σώματος (αλδοστερόνη ρενίνη) Παράγοντες που σχετίζονται με το δείγμα Αιμοληψία Αποφυγή αιμόλησης, stress. Η αιμόλυση επηρεάζει: Ινσουλίνη, ACTH, Prg, T4 κλπ Φιαλίδια πλαστικά ή γυάλινα, μπορεί να επηρεάζουν (Τ3 στα Vacutainer της BD) Αντιπηκτικά (ACTH, PTH, αλλού αντενδείκνυνται πλήρως) Φυγοκέντρηση, Διατήρηση δείγματος Μικρά πεπτίδια ACTH, καλσιτονίνη, PTH, φυγοκεντρούνται υπό ψύξη και φυλάσσονται αμέσως Παράγοντες που σχετίζονται με τη φύση των ορμονών Βιολογικοί ρυθμοί Ρυθμός ζωής (ηλικία) Εποχιακός ρυθμός (πχ Τ4 μειώνεται το καλοκαίρι) Μηνιαίος ρυθμός (Έμμηνος ρύση) Νυχθήμερος ή κιρκάρδιος ρυθμός (Κορτιζόλη κλπ καθοριστική η ώρα αιμοληψίας) Εκκριτικός ρυθμός (γοναδοτροπίνες, GH) Πρωτεΐνες-φορείς: (Ολική - ελεύθερη ορμόνη) Κύηση, λήψη αντισυλληπτικών, οιστρογόνων, ανδρογόνων, κορτικοειδών) Παράγοντες που επηρεάζουν το αναλυτικό στάδιο Οι ανοσοπροσδιορισμοί μετρούν την ανασολογική όχι την βιολογική δραστικότητα των ορμονών Προορμόνες (προ-ινσουλίνη, προ-pth) Άλλες μορφές υπομονάδες, πολυμερείς μορφές, μεταβολικά κλάσματα (PTH 1-84, 7-84, β-hcg, υπεργλυκοζιλιομένες μορφές hcg Μη ειδικές παρεμβολές στους ανοσοπροσδιορισμούς Tg anti-tg αυτοαντισώματα

17 Ετερόφιλα αντισώματα (HAMA) Αντισώματα έναντι ανοσοσφαιρινών ζώων (απομάκρυνση με PEG) Ρευματοειδείς παράγοντες (αυτοαντισώματα ένατι IgG ασθενών με ρευματικά νοσήματα) Φαινόμενο hook (hook effect) Εμφανίζεται σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις τον προσδιοριζόμενων ορμονών (hcg)

18 Κλινική αξιολόγηση αποτελεσμάτων ορμονικών προσδιορισμών Το κύκλωμα της διάγνωσης μέσω εργαστηριακών εξετάσεων Τιμές αναφοράς ΠΟΥ: Υγεία: η κατάσταση πλήρους σωματικής, ψυχικής και κοινωνικής ευεξίας και όχι απλώς η απουσία νόσου ή αναπηρίας Ασαφή όρια «φυσιολογικού»-παθολογικού Τιμές αναφοράς: Το σύνολο των τιμών μιας βιολογικής παραμέτρου που μετρήθηκε σε πληθυσμό ατόμων που βρίσκονταν σε ορισμένη κατάσταση υγείας. Βιολογική μεταβλητότητα (ενδο- και δι-ατομική) Επηρεάζονται από: (βλ. προηγούμενα) Κάθε εργαστήριο δικές του τιμές αναφοράς Τιμές αναφοράς ορμονών Αξιολόγηση αποτελεσμάτων εξετάσεων (δοκιμασιών) Δείκτες διαγνωστικής ποιότητας δοκιμασιών (εξετάσεων) Ευαισθησία δοκιμασίας Ειδικότητα Αποτελεσματικότητα Σχέση Ευαισθησία-Ειδικότητας Διαχωριστικό όριο Καμπύλες ROC Δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας (αποτελεσμάτων δοκιμασιών) Προγνωστική αξία (+) αποτελέσματος Προγνωστική αξία (-) αποτελέσματος Θετικός, αρνητικός λόγος πιθανοφάνειας Θεώρημα Bayes Δείκτες διαγνωστικής ποιότητας δοκιμασιών (εξετάσεων) Αφορούν και αξιολογούν την ποιότητα της δοκιμασίας καθεαυτής

19 Ευαισθησία (Se) Το ποσοστό των ασθενών που δίνουν θετική την δοκιμασία Ειδικότητα (Sp) Το ποσοστό των υγιών που έχουν αρνητική την δοκιμασία Αποτελεσματικότητα Το ποσοστό των ατόμων (ασθενών ή υγιών) που έχουν ορθώς ταξινομηθεί από την δοκιμασία Ο Τετράπτυχος πίνακας Αποτέλεσμα Δοκιμασίας Ασθενείς Υγιείς Σύνολο Θετικό ΑΘ ΨΘ ΑΘ+ΨΘ Αρνητικό ΨΑ ΑΑ ΨΑ+ΑΑ Σύνολο ΑΘ+ΨΑ ΨΘ+ΑΑ Ν Ευαισθησία (Se): (ΑΘ / ΑΘ+ΨΑ) Ειδικότητα: (Sp) (ΑΑ / ΨΘ+ΑΑ) Αποτελεσματικότητα: (ΑΘ+ΑΑ / Ν) Σχέση Ευαισθησίας-Ειδικότητας Ο χαρακτηρισμός μιας δοκιμασίας ως «θετικής» ή «αρνητικής» προϋποθέτει τον καθορισμό «διαχωριστικού ορίου» Διαχωριστικό όριο Μετακίνηση του cut-off δεξιά Ελάττωση Se, Ελάττωση ΨΘ Μετακίνηση του cut-off αριστερά Αύξηση Se, Αύξηση ΨΘ

20 Καμπύλες ROC Το βασικό ερώτημα της διαγνωστικής Βασικό ερώτημα της διαγνωστικής: Τι πιθανότητες έχει ένα άτομο να πάσχει από ένα νόσημα με δεδομένο το αποτέλεσμα μια δοκιμασίας (εξέτασης)? Οι δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας αφορούν τα αποτελεσμάτων δοκιμασιών Προγνωστική αξία (+) αποτελέσματος Προγνωστική αξία (-) αποτελέσματος Θετικός, αρνητικός λόγος πιθανοφάνειας Θεώρημα Bayes Δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας Προγνωστική αξία (+) αποτελέσματος (PPV) Το ποσοστό των θετικών αποτελεσμάτων στους ασθενείς Προγνωστική αξία (-) αποτελέσματος (NPV) Το ποσοστό των αρνητικών αποτελεσμάτων στους υγιείς Θετικός λόγος πιθανοφάνειας (L) Ο λόγος της πιθανότητας θετικού αποτελέσματος στους ασθενείς προς την πιθανότητα θετικού αποτελέσματος στους υγιείς Αρνητικός λόγος πιθανοφάνειας (λ) Ο λόγος της πιθανότητας αρνητικού αποτελέσματος στους ασθενείς προς την πιθανότητα αρνητικού αποτελέσματος στους υγιείς Οι δείκτες διαγνωστικής αξίας εξαρτώνται από τον Επιπολασμό της νόσου

21 Ο Τετράπτυχος πίνακας Αποτέλεσμα Δοκιμασίας Ασθενείς Υγιείς Σύνολο Θετικό ΑΘ ΨΘ ΑΘ+ΨΘ Αρνητικό ΨΑ ΑΑ ΨΑ+ΑΑ Σύνολο ΑΘ+ΨΑ ΨΘ+ΑΑ Ν PPV: (ΑΘ / ΑΘ+ΨΘ) NPV: (ΑΑ / ΨΑ+ΑΑ) L: (Se / (1-Sp)) λ: ((1-Se / Sp) Θεώρημα Bayes Η πιθανότητα ύπαρξης της νόσου σε ένα άτομο μετά την δοκιμασία (εξέταση) είναι συνάρτηση της προυπάρχουσας πιθανότητας της νόσου και του θετικού λόγου πιθανοφάνειας Σχόλια Οι δείκτες διαγνωστικής ποιότητας (ευαισθησία και ειδικότητα) αφορούν τη δοκιμασία και όχι τον ασθενή Το ασθενή αφορούν οι δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας των αποτελεσμάτων της δοκιμασίας