Μεθοδολογία Ορμονικών προσδιορισμών. μεθόδων

Transcript

1 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ: ΕΡΕΥΝΑ ΣΤΗ ΓΥΝΑΙΚΕΙΑ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ Μεθοδολογία Ορμονικών προσδιορισμών Κριτήρια επιλογής και αξιολόγησης των μεθόδων Δημήτρης Ρίζος, PhD, EuSpLM Αναπλ. Καθηγητής Κλινικής Χημείας Ορμονολογικό Εργαστήριο, Αρεταίειο Νοσοκομείο

2 Περίληψη παρουσίασης Κλινικό Εργαστήριο και διάγνωση Εργαστηριακή διαδικασία Μέθοδοι προσδιορισμού ορμονών Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων Έλεγχος ποιότητας εργαστηριακών αποτελεσμάτων Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων Παράγοντες που επηρεάζουν τα αποτελέσματα των ορμονικών προσδιορισμών Κλινική αξιολόγηση των ορμονικών προσδιορισμών

3 Εισαγωγή H έρευνα της ενδοκρινολογίας της αναπαραγωγής προϋποθέτει τη καλή γνώση των βασικών αξόνων του ενδοκρινικού συστήματος Υποθάλαμος-Υπόφυση Υπόφυση-Γονάδες Υποθάλαμος-Υπόφυση-Επινεφρίδια Υποθάλαμος-Υπόφυση-θυρεοειδής Ο λειτουργία ή δυσλειτουργία των αξόνων ελέγχεται με τους εργαστηριακούς προσδιορισμούς των βασικών ορμονών Ένα αξιόπιστο εργαστήριο μπορεί να συμβάλει σημαντικά στη αντιμετώπιση των ενδοκρινικών διαταραχών

4 Το Κλινικό Εργαστήριο Παραπεμπτικό Αποτέλεσμα ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ

5 Το κύκλωμα της διάγνωσης μέσω εργαστηριακών εξετάσεων Επίσκεψη στον γιατρό Παραγγελία εργ. εξέτασης Ερμηνεία αποτελέσματος Λήψη δείγματος Αποτέλεσμα εξέτασης ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Εκτέλεση εξέτασης (ανάλυση)

6 Το κύκλωμα του εργαστηρίου Παραλαβή δείγματος ή αιμοληψία (παραπεμπτικό) Αποτέλεσμα εξέτασης ΠΡΟΑΝΑΛΥΤΙΚΟ Επεξεργασία δείγματος (φυγοκέντρηση) ΜΕΤΑΝΑΛΥΤΙΚΟ Επικύρωση μετρήσεων Παραλαβή μετρήσεων Αναλυτική διαδικασία (αυτόματη ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ή χειρονακτική)

7 Στάδια εργαστηριακής διαδικασίας Προ-αναλυτικό Παραλαβή ή συλλογή και επεξεργασία δί δείγματος Αναλυτικό Μεθοδολογίες προσδιορισμού-τεχνικές Έλεγχος ποιότητας Μετα-αναλυτικόαναλυτικό Επικύρωση μετρήσεων Εκτύπωση ή αποστολή αποτελεσμάτων

8 Αναλυτική διαδικασία Μεθοδολογίες προσδιορισμού ορμονών-τεχνικές Κριτήρια αξιολόγησης μεθόδων Έλεγχος ποιότητας

9 Μέθοδοι προσδιορισμού ορμονών Βιολογικές μέθοδοι Χημικές μέθοδοι Χρωματογραφικές μέθοδοι Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques) HPLC (High performance liquid chromatography) GC-MS S(Gas chromatography-mass spectrometry) Multiple assay

10 Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassays) Αντίδραση αντιγόνου-αντισώματοςαντισώματος Ag + Ab Ag-AbAb Αντίσωμα: Ανοσοσφαιρίνη (IgG) Αντιγόνο: Κάθε ουσία που μπορεί προκαλέσει ανοσολογική απόκριση (Απτένιο) Υψηλή εξειδίκευση Ab Υψηλή χημική συγγένεια δεσμού

11 Τύποι ανοσοπροσδιορισμών (1) Ag + Ab Ag-Ab Ab Η χρήση της αντίδρασης αντιγόνου-αντισώματος ως αναλυτικού εργαλείου γίνεται: με την «αναγνώριση» του συμπλόκου Ag-Ab (Έμμεσες μέθοδοι) με τη βοήθεια της σήμανσης του ενός εκ των δύο αντιδραστηρίων (Άμεσες μέθοδοι)

12 Τύποι ανοσοπροσδιορισμών ρ (Έμμεσες μέθοδοι) Ποιοτική ή ημιποσοτική εκτίμηση της ποσότητας του συμπλόκου Ag-AbAb Αντιδράσεις συγκόλλησης (Agglutination) Αντισώματα συνδεδεμένα με ερυθρά ή latex, Σχηματισμός ιζήματος Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Radial immunodiffusion) Ανοσοηλεκτροφόρηση (Immunoelectrophoresis) Νεφελομετρία (Nephelometry), Θολωσιμετρία Σχηματισμός μικρο-συσσωματωμάτων (νεφελώματων) Ag-Ab Μέτρηση η της σκέδασης του φωτός Χρησιμοποιείται στη μέτρηση ανοσοσφαιρινών

13 Τύποι ανοσοχημικών τεχνικών Άμεσες μέθοδοι: (Χρήση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος, ποσοτικές μέθοδοι) Αν σε διάλυμα ενός αντιγόνου (πχ Τ4) άγνωστης συγκέντρωσης (C x ) προσθέσουμε συγκεκριμένη ποσότητα επισημασμένου Τ4 (πχ με Ι 125 ) και συγκεκριμένη ποσότητα Ab (έναντι της Τ4) τότε μετά την αντίδραση, Ag + Ab Ag-Ab Ag* + Ab Ag*-Ab η ποσότητα του Ag*-Ab Ab είναι αντιστρόφως ανάλογη της C x

14 Τύποι ανοσοχημικών τεχνικών (Άμεσες μέθοδοι) Χρήση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος, ποσοτικές μέθοδοι Ag (C x ) Ag-AA + Ab (C) A Ag*(C) * Ag*-Ab Ab (C y ) C y = 1/C x η ποσότητα του Ag*-Ab είναι αντιστρόφως ανάλογη της C x

15 Ιστορική αναδρομή Πρώτη εφαρμογή: Rosalyn Yalow, Solomon Berson, (Nature 1959): Μέθοδος προσδιορισμού ινσουλίνης R. Ekins, (Clin Chim Acta 1960): Μέθοδος προσδιορισμού Τ4 Από τότε πληθώρα εφαρμογών 1979: Βραβείο Nobel Φυσιολογίας και Ιατρικής στην R. Yalow

16 Χαρακτηριστικά των ανοσοχημικών μεθόδων Αντίσωμα (Ab) Υψηλής εξειδίκευσης ως προς το Ag Μονοκλωνικά αντισώματα Επισημασμένο Ag ή Ab (conjugate) Σταθερός δεσμός με ιχνηθέτη χη η Να διατηρεί τις (ανοσολογικές) ιδιότητες του Ag ή Ab Ιχνηθέτης Σταθερός δεσμός με Ag ή Ab Υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης (μικρές ποσότητες ιχνηθέτη να δίνουν μεγάλο σήμα) Ραδιοϊσότοπο (κυρίως I125) RIA-IRMA IRMA Ένζυμα (Αλκ. Φωσφατάση, Υπεροξειδάση) EIA-ELISA Φθορίζον μόριο (φλοουρεσκείνη) FIA Χημειοφωταυγής αντίδραση CLIA

17 Χαρακτηριστικά των ανοσοχημικών μεθόδων Αντίσωμα (Ab) Υψηλής εξειδίκευσης ως προς το Ag Μονοκλωνικά αντισώματα Επισημασμένο Ag ή Ab (conjugate) Σταθερός δεσμός με ιχνηθέτη Να διατηρεί τις (ανοσολογικές) ιδιότητες του Ag ή Ab Ιχνηθέτης Ραδιοϊσότοπο (κυρίως I125) RIA-IRMA Ένζυμα (Αλκ. Φωσφατάση, Υπεροξειδάση) EIA-ELISA Φθορίζον μόριο (φλοουρεσκείνη) FIA Χημειοφωταυγής αντίδραση CLIA

18 Τύποι ανοσοχημικών μεθόδων Δύο είναι οι σπουδαιότεροι τύποι ανοσοχημικών μεθόδων : Ανταγωνιστικού τύπου Επισήμανση του Ag Το επισημασμένο Ag ανταγωνίζεται με το Ag του δείγματος για τις θέσεις σύνδεσης του Ab Για μικρού ΜΒ ουσίες (απτένια) πχ στεροειδή, θυροειδικές ορμόνες κλπ Μεγάλη ευαισθησία Μη ανταγωνιστικού τύπου (ή sandwich) Επισήμανση του Ab Για πεπτίδια ή πρωτεΐνες πχ TSH, PTH κλπ Πολύ μεγάλη ευαισθησία

19 Μέθοδοι ανταγωνιστικού τύπου (1)

20

21

22 Μέθοδοι ανταγωνιστικού τύπου (2) Το «σήμα» του ιχνηθέτη είναι αντιστρόφως ανάλογο της ποσότητας του προσδιοριζόμενου αντιγόνου του δείγματος

23 Μέθοδοι μη ανταγωνιστικού τύπου sandwich (1) ανταγωνιστική ELISA

24 The sandwich assay Microspheres with different primary antibodies form the basis of the assay A complex mix of proteins (cell lysate) is added to the assay in a 96 well plate Phosphorylation site specific antibodies (reporter) for the captured proteins are added to the assay well Excess reporter antibody is removed during a wash step Streptavidinphycoerythrin is added to the assay Both total and phosphorylated proteins are captured by the specific bead-bound antibody Excess cell lysate is removed during the filtration/wash step The Strep-PE binds to the biotinylated reporter antibody

25 Μέθοδοι μη ανταγωνιστικού τύπου sandwich (1) Το «σήμα» του ιχνηθέτη είναι ανάλογο της ποσότητας του προσδιοριζόμενου αντιγόνου του δείγματος

26 Πρότυπες καμπύλες Βαθμονομητές (Calibrators) Βαθμονομημένοι ως προς διεθνή πρότυπα (δεν υπάρχουν για όλες τις ορμόνες) Σταθερότητα Κατασκευή πρότυπης καμπύλης Προσαρμογή (fit) της καμπύλης Μέθοδοι προσαρμογής Point to point Linear Logarithmic, Spline

27 HPLC (High performance liquid chromatography) Τεχνική διαχωρισμού υψηλής ευαισθησίας Χρησιμοποιείται και ως 1ο στάδιο «καθαρισμού» του δί δείγματος πριν από μια ανοσοχημική μέθοδο. Μελέτη προϊόντων μεταβολισμού μ Κυρίως χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς Για πολλές ορμόνες (πχ στεροειδή) η HPLC αποτελεί μέθοδο αναφοράς

28 Αρχή λειτουργίας HPLC

29 Αποτελέσματα HPLC

30 Προσδιορισμός ορμονών με HPLC Corticotropin releasing hormone (CRH) POMC και ACTH Α-Melanocyte stimulating hormone (a-msh) IGF-1 Calcitonin Insulin and proinsulin Anabolic Steroids 25-OH-Vitamin D

31 GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) Συνδυασμός μιας τεχνικής διαχωρισμού όπως η αέρια χρωματογραφίας (GC), με μια τεχνική ταυτοποίησης (φασματομετρία μάζας MS) Πολύ ισχυρή αναλυτική τεχνική με υψηλή ευαισθησία Εφαρμόζεται σε ουσίες (ορμόνες) με θερμική σταθερότητα και πτητικότητα Χρησιμοποιείται κυρίως για ερευνητικούς σκοπούς

32 Multiple assays Περισσότεροι από ένας προσδιορισμοί (εξετάσεις) ταυτόχρονα (στο ίδιο δείγμα) Evidence the multi-analyte Biochip Array Technology (Randox) Luminex

33 Evidence the multi-analyte Biochip Array Technology (Randox)

34 Luminex technology Luminex xmap Technology

35 Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων

36 Χαρακτηριστικά αναλυτικών μεθόδων Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία (Analytical sensitivity) Αναλυτική ειδικότητα (Analytical specificity) Χαρακτηριστικά επίδοσης (Performance characteristics) Ακρίβεια (Accuracy) Επαναληψιμότητα (Precision) Όριο ανίχνευσης (Detection eec limit) Γραμμικότητα ή αναλυτικό εύρος (Linearity, analytical range)

37 Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία (Analytical sensitivity) Η δυνατότητα της μεθόδου να προσδιορίζει μικρές ποσότητες της προς ανάλυση ορμόνης Ε =ds/dc Αναλυτική ειδικότητα (Analytical specificity) Η ικανότητα της μεθόδου να προσδιορίζει εκλεκτικά και αποκλειστικά την ορμόνη Πχ προσδιορισμός της TSH παρουσία hcg Σχετίζονται με: Είδος αντισώματος Είδος και ευαισθησία ιχνηθέτη η

38 Χαρακτηριστικά επίδοσης μεθόδων Ακρίβεια (Accuracy) Η δυνατότητα της μεθόδου να προσδιορίζει την «πραγματική» ποσότητα της ορμόνης τυχαίες ή συστηματικές αποκλίσεις Inaccuracy, bias: τα μέτρα της ακρίβειας Επαναληψιμότητα (Precision) Η ικανότητα της μεθόδου να δίνει το ίδιο αποτέλεσμα σε επανειλημμένες μετρήσεις του ίδιου δείγματος Πειράματα επαναληψιμότητας Μέτρο της : CV% = SD*100/mean

39 α β Επαναλήψιμες γ δ Μη Επαναλήψιμες Ακριβείς Μη Ακριβείς

40 Όριο ανίχνευσης (Detection limit) Ελάχιστη δυνατή ποσότητα της ουσίας (ορμόνης) που μπορεί να μετρηθεί με την μέθοδο Συνδέεται με την αναλυτική ευαισθησία Όσο μεγαλύτερη η αναλυτική ευαισθησία τόσο μικρότερο το όριο ανίχνευσης Δεν έχει πάντα κλινική σημασία Μεγάλη σημασία για την TSH, μικρή σημασία για την T4 Λειτουργική ευαισθησία Η μικρότερη δυνατή ποσότητα της ορμόνης που μπορεί να Η μικρότερη δυνατή ποσότητα της ορμόνης που μπορεί να προσδιοριστεί με επαναληψιμότητα 20%

41 Επαναληψιμότητα Ορμονών (%CV) C ορού ελέγχου Ορμόνη Low Medium High FSH 6,6 5,5 7,8 LH 10,4 12,4 12,9 Estradiol 11,9 3,8 2,5 Pr 10,7 7,5 4,1 PRL 7,2 6,9 10,2

42 Αναλυτικά χαρακτηριστικά μεθόδων Ορμονών Assay Analyzer Sencitivity %CV Ref range TSH Architect i1000 0,0025 μiu/ml 5,3 0,4-4,0 TT3 Architect i1000 0,25 ng/ml 7,3 0,7-1,5 TT4 Architect i1000 1,0 μg/dl 7,3 4,5-12,0 FT3 Architect i1000 1,0 pg/ml 5 1,5-3,5 FT4 Architect i1000 0,4 ng/dl 7,8 0,7-1,8 Anti-TPO Architect i1000 0,5 IU/mL 9,8 < 5,6 Anti-TG Architect i1000 0,1 IU/mL 8,2 < 4,1 Testosterone t Architect i1000 0,08 ng/ml 8 0,13-1,1 Insulin Architect i μu/ml 5, DHEA-S Cobas e ng/ml 4, SHBG Cobas e-411 0,35 nmol/l 5, PTH (intact) Cobas e-411 1,2 pg/ml 7, OH-Vit D Cobas e ng/ml 8, OH-Progesterone Manual ELISA 0,0404 ng/ml 7,2 0,2-1,2 Δ4-Androstenedione Manual ELISA 2 ng/dl

43 Έλεγχος ποιότητας εργαστηριακών αποτελεσμάτων

44 Έλεγχος ποιότητας Αποτελεί το σημαντικότερο εργαλείο του εργαστηριακού για την παραγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων Αποτελεί μέρος του ευρύτερου συστήματος «Διαχείρισης ολικής ποιότητας» Διακρίνεται σε δύο παράλληλους και συμπληρωματικούς μηχανισμούς: Τον εσωτερικό (ενδο-εργαστηριακό) έλεγχο Τον εξωτερικό (δι-εργαστηριακό) έλεγχο

45 Το βασικό εργαστηριακό πρόβλημα Ερώτημα: Πως μπορούμε να ελέγξουμε την «ποιότητα» μιας εργαστηριακής μέτρησης; Πχ αν το αποτέλεσμα της μέτρησης της χοληστερόλης σε ένα ασθενή είναι 247 πως μπορούμε να ξέρουμε αν το αποτέλεσμα αυτό αντιστοιχεί στην πραγματική συγκέντρωση της χοληστερόλης στον ορό του ασθενούς;

46 Το βασικό εργαστηριακό πρόβλημα (2) Επανάληψη της μέτρησης Λύση: Η ανάλυση, ταυτόχρονα με τον ορό του ασθενούς, ενός ορού ελέγχου ο οποίος έχει αναλυθεί αρκετές φορές στο παρελθόν και γνωρίζουμε την κατανομή των τιμών του. Αν το αποτέλεσμα του ορού ελέγχου είναι μέσα στα όρια της κατανομής των τιμών του τότε μπορούμε με πολύ μεγαλύτερη βεβαιότητα να συμπεράνουμε ότι και το αποτέλεσμα του ασθενούς είναι κατά πάσα πιθανότητα σωστό.

47 Η βασική ιδέα στον έλεγχο ποιότητας Η ορθότητα των αποτελεσμάτων των ασθενών εξασφαλίζεται με την αξιολόγηση η της συμπεριφοράς ρφ ρ δειγμάτων ελέγχου που αναλύονται παράλληλα με τους ορούς των ασθενών. Τι χρειαζόμαστε; Ένα εργαλείο λί για να συγκρίνουμε το σημερινό αποτέλεσμα του ορού ελέγχου με προηγούμενα αποτελέσματα (κατανομή των τιμών) Ένα τέτοιο στατιστικό εργαλείο είναι το διάγραμμα ελέγχου.

48 Ιδιότητες των ορών ελέγχου Κανένα κλινικό εργαστήριο δεν μπορεί να λειτουργεί σωστά (και ίσως δεν μπορεί να υπάρξει) χωρίς τα υλικά του ελέγχου ποιότητας. Μερικές από της ιδιότητες των ορών ελέγχου είναι: Να μοιάζουν όσο το δυνατόν με τα δείγματα των ασθενών Μεγάλη σταθερότητα για να μπορούν να χρησιμοποιούνται επί μακρόν Ομοιογένεια μεταξύ διαφορετικών παρτίδων του υλικού Οι συγκεντρώσεις των συστατικών τους να είναι σε επίπεδα ανάλογα με αυτά των ορών των ασθενών και ή δυνατόν σε τιμές κρίσιμες για την κλινική αξιολόγηση.

49 Διαγράμματα ελέγχου Διάγραμμα κατανομής της συγκέντρωσης του ορού ελέγχου σε σχέση με το χρόνο (Διάγραμμα Levey - Jennings) SD +2 SD +1 SD mean -1 SD -2 SD -3 SD Control PAPP-A A (ng/ml) 230 8/8 4/5 8/5 12/5 16/5 20/5 24/5 28/5 1/6 5/6 9/6 13/6 17/6 21/6 25/6 29/6 3/7 7/7 11/7 15/7 19/7 23/7 27/7 31/7 4/8 Ημερομηνία

50 Διάγραμμα Levey-Jennings +3 SD +2 SD +1 SD mean -1 SD -2 SD -3 SD Control PAPP-A (ng/ml) 4/5 8/5 12/5 16/5 20/5 24/5 28/5 1/6 5/6 9/6 13/6 17/6 21/6 25/6 29/6 3/7 7/7 11/7 15/7 19/7 23/7 27/7 31/7 4/8 8/8 Ημερομηνία

51 Πως αξιολογούμε μια τιμή στο διάγραμμα Levey-Jennings? Κριτήρια ελέγχου 1. Μέτρηση ενός ορού ελέγχου 1 2s : 1 3s : 2. Μέτρηση η περισσοτέρων ρ ορών ελέγχου 2 2s 2s : 4 1s : Μία μέτρηση ορού ελέγχου εκτός του ορίου των 2 SD Μία μέτρηση ορού ελέγχου εκτός του ορίου των 3 SD Δύο μετρήσεις ορών ελέγχου εκτός του ορίου των 2 SD 4 1 : Τέσσερις διαδοχικές μετρήσεις εκτός του ορίου της 1SD Αποφασίζουμε αν μία σειρά αναλύσεων είναι υπό έλεγχο ή εκτός έλεγχου

52 Μέθοδοι ενός κριτηρίου Ένας ορός ελέγχου ανά σειρά αναλύσεων Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα κριτήρια είναι: 1 2s ή 1 3s 310 ng/ml) Con ntrol PAPP-A ( SD +2 SD +1 SD mean -1 SD -2 SD -3 SD 4/5 8/5 12/5 16/5 20/5 24/5 28/5 1/6 5/6 9/6 13/6 17/6 21/6 25/6 29/6 3/7 7/7 11/7 15/7 19/7 23/7 27/7 31/7 4/8 8/8 Ημερομηνία

53 Μέθοδοι ενός κριτηρίου +3 3SD +2 SD +1 SD mean -1 SD -2 SD -3 SD Control PAPP-A (ng/ml) 4/5 8/5 12/5 31/7 16/5 20/5 24/5 28/5 1/6 5/6 9/6 13/6 17/6 21/6 25/6 29/6 3/7 7/7 11/7 15/7 19/7 23/7 27/7 4/8 8/8 Ημερομηνία 12S 13S 41S

54 Αντιμετώπιση των εκτός ελέγχου καταστάσεων Τι γίνεται όταν μία κατάσταση βρεθεί εκτός ελέγχου; Λήψη μέτρων επαναφοράς της κατάστασης υπό έλεγχο Συσχέτιση του κριτηρίου που παραβιάζεται με το είδος του σφάλματος. Συσχέτιση του είδους του σφάλματος με πιθανές αιτίες. Εντοπισμός της αιτίας, διόρθωση και επιβεβαίωση Διακοπή της ανάλυσης, επανάληψη

55 Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας Γίνεται με τη συμμετοχή του εργαστηρίου στα «Διεργαστηριακά προγράμματα εξωτερικής αξιολόγησης ης ποιότητας» (EQAS) Ο Οργανωτής του EQAS αποστέλλει σε τακτά χρονικά διαστήματα ορούς ελέγχου στα συμμετέχοντα εργαστήρια, τα οποία αφού προσδιορίσουν τα ελεγχόμενα συστατικά αποστέλλουν πίσω στον οργανωτή τα αποτελέσματα Ο οργανωτής επεξεργάζεται τα αποτελέσματα στατιστικά και αποστέλλει στους συμμετέχοντες την έθ έκθεση των αποτελεσμάτων

56 Έκθεση αποτελεσμάτων εξωτερικού ελέγχου ποιότητας

57 Αβεβαιότητα εργαστηριακών Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων

58 Αβεβαιότητα Κάθε μέτρηση ενός μεγέθους (συγκέντρωσης) αποτελεί εκτίμηση της «αληθούς» τιμής του μεγέθους. Ως αβεβαιότητα ορίζουμε το μέγεθος που εκτιμά τη διασπορά των τιμών περί την αληθή τιμή Αβεβαιότητα «Σφάλμα» Η τελική αβεβαιότητα της μέτρηση προκύπτει ως άθροισμα της αβεβαιότητας των επι μέρους σταδίων

59 Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων Όλα τα στάδια της εργαστηριακής διαδικασίας συμβάλουν στην τελική αβεβαιότητα του αποτελέσματος! Προ-αναλυτικό ΠΗΓΕΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ Αναλυτικό Μέτα-αναλυτικό αναλυτικό Βιολογική μεταβλητότητα Βαθμονομητές Επικύρωση αποτ. Δειγματοληψία Αντιδραστήρια Έκθεση αποτ. Μεταφορά δείγματος Αναλυτές Φυγοκέντρηση Εξωγενείς παράγοντες

60 Αβεβαιότητα εργαστηριακών αποτελεσμάτων (2) Ποσοστά σφαλμάτων κατά στάδιο

61 Προ-αναλυτικοί παράγοντες Προ-αναλυτικοί παράγοντες που επηρεάζουν την αβεβαιότητα (αλλά και την ερμηνεία) των αποτελεσμάτων των ορμονικών προσδιορισμών Παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή Παράγοντες που σχετίζονται με το δείγμα Παράγοντες που σχετίζονται με τη φύση των ορμονών

62 Παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή Βιολογικοί παράγοντες (που δεν μπορούν να επηρεαστούν) ) Ηλικία (παιδιά, έφηβοι, ενήλικες, πχ DEHA-S) Φύλο (στεροειδή του φύλου) Φυλή (Β12, AFP στην κύηση) ) Κύηση (μεγάλες μεταβολές σχεδόν όλων των ορμονών) Παράγοντες που μπορούν να ελεγχθούν Δίαιτα, Λήψη τροφής (πχ Ινσουλίνη, VMA) Φάρμακα (διεγείρουν ή αναστέλλουν την παραγωγή (Τ4), επηρεάζουν την μεταφορά (Ε2 SHBG) Φυσική κατάσταση - stress (Κορτιζόλη, PRL, κατεχολαμίνες, ACTH, GH) Θέση του σώματος (αλδοστερόνη ρενίνη)

63 Παράγοντες που σχετίζονται με το δείγμα Αιμοληψία Αποφυγή αιμόλησης, stress. Η αιμόλυση επηρεάζει: Ινσουλίνη, ACTH, Pr, T4 κλπ Φιαλίδια πλαστικά ή γυάλινα, μπορεί να επηρεάζουν (Τ3 στα Vacutainer της BD) Αντιπηκτικά (ACTH, PTH, αλλού αντενδείκνυνται πλήρως) Φυγοκέντρηση, Διατήρηση δείγματος Μικρά πεπτίδια ACTH καλσιτονίνη PTH φυγοκεντρούνται υπό Μικρά πεπτίδια ACTH, καλσιτονίνη, PTH, φυγοκεντρούνται υπό ψύξη και φυλάσσονται αμέσως

64 Παράγοντες που σχετίζονται με τη φύση των ορμονών Βιολογικοί ρυθμοί Ρυθμός ζωής (ηλικία) Εποχιακός ρυθμός (πχ Τ4 μειώνεται το καλοκαίρι) Μηνιαίος ρυθμός (Έμμηνος ρύση) Νυχθήμερος ή κιρκάρδιος ρυθμός (Κορτιζόλη κλπ καθοριστική η ώρα αιμοληψίας) Εκκριτικός ρυθμός (γοναδοτροπίνες, GH) Πρωτεΐνες-φορείς: (Ολική ή - ελεύθερη λύθ ορμόνη) ) Κύηση, λήψη αντισυλληπτικών, οιστρογόνων, ανδρογόνων, κορτικοειδών)

65 Παράγοντες που επηρεάζουν το αναλυτικό στάδιο Οι ανοσοπροσδιορισμοί μετρούν την ανασολογική όχι την βιολογική δραστικότητα των ορμονών Προορμόνες (προ-ινσουλίνη, προ-pth) Άλλες μορφές υπομονάδες, πολυμερείς μορφές, μεταβολικά κλάσματα (PTH 1-84, 7-84, β-hcg, υπεργλυκοζιλιομένες μορφές hcg Μη ειδικές παρεμβολές στους ανοσοπροσδιορισμούς Tg anti-tg αυτοαντισώματα Ετερόφιλα αντισώματα (HAMA) Αντισώματα έναντι ανοσοσφαιρινών ζώων (απομάκρυνση με PEG) Ρευματοειδείς παράγονταες (αυτοαντισώματα ένατι IgG ασθενών με ρευματικά νοσήματα) Φαινόμενο hook (hook effect) Εμφανίζεται σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις τον προσδιοριζόμενων ορμονών (hcg)

66 Κλινική αξιολόγηση αποτελεσμάτων ορμονικών προσδιορισμών

67 Το κύκλωμα της διάγνωσης μέσω εργαστηριακών εξετάσεων Επίσκεψη στον γιατρό Παραγγελία εργ. εξέτασης Ερμηνεία αποτελέσματος Λήψη δείγματος Αποτέλεσμα εξέτασης Εκτέλεση εξέτασης (ανάλυση)

68 Ερμηνεία του αποτελέσματος Σχετίζεται με: Ιστορικό του «ασθενούς» Τρέχουσα ρχ κατάσταση του «ασθενούς» ς Αξιοπιστία εργαστηριακού αποτελέσματος Συνεργασία Κλινικών-Εργαστηριακών Πως γίνεται? Σύγκριση με τιμές αναφοράς Σύγκριση με προηγούμενα αποτελέσματα

69 Τιμές αναφοράς Τι είναι φυσιολογικό? ΠΟΥ: Υγεία είναι η κατάσταση πλήρους σωματικής, ψυχικής και κοινωνικής ευεξίας και όχι απλώς η απουσία νόσου ή αναπηρίας Ασαφή όρια «φυσιολογικού»-παθολογικού Τιμές αναφοράς: Το σύνολο των τιμών μιας βιολογικής παραμέτρου που μετρήθηκε σε πληθυσμό ατόμων που βρίσκονταν σε ορισμένη κατάσταση υγείας. Βιολογική μεταβλητότητα (ενδο- και δι-ατομική) Επηρεάζονται από: (βλ. προηγούμενα) Κάθε εργαστήριο δικές του τιμές αναφοράς

70 Τιμές αναφοράς ορμονών Εξέταση α' φάση Μέγ ιστο Μέγ ιστο κύκλου ωορρηξίας ωχρινοποίησης LH (miu/ml) , FSH (miu/ml) Οιστραδιόλη (pg/ml) Προγ εστερόνη (ng/ml) 0,3-1,0 0,95-1, OH Προγ εστ.(ng/ml 0,2-1,2 0,2-1,2 1,0-4,5

71 Τιμές αναφοράς ορμονών (2) Εξέ τ αση α' φάση κύκλου PRL (ng/ml) 1-24 Δ4-Α (ng/dl) DHEA-S (ng/ml) Testo (ng/ml) 0,2-1,2 SHBG (nmol/l) Free Androgen Index 1-8

72 Σχέση αποτελέσματος-διάγνωσης Κλινικός γιατρός Αρχική διαγνωστική υπόθεση Εργαστήριο Αποτέλεσμα Πρέπει Να υπάρχει μια αρχική διάγνωση! Πρέπει Να γνωρίζει τις εξετάσεις!! Τελική διάγνωση Πρέπει Να γνωρίζει τι περιμένει από κάθε εξέταση!!!

73 Δείκτες αξιολόγησης εξετάσεων (δοκιμασιών) Πόσο «ικανή» είναι μια εξέταση να βοηθήσει στη διάγνωση μιας νόσου; Δείκτες διαγνωστικής ποιότητας δοκιμασιών (εξετάσεων): Ευαισθησία Ειδικότητα

74 Δείκτες διαγνωστικής ποιότητας δοκιμασιών (εξετάσεων) Αφορούν και αξιολογούν την ποιότητα της δοκιμασίας καθεαυτής Ευαισθησία (Se) Το ποσοστό των ασθενών που δίνουν θετική την δοκιμασία Ειδικότητα (Sp) Το ποσοστό των υγιών που έχουν αρνητική την δοκιμασία Αποτελεσματικότητα Το ποσοστό των ατόμων (ασθενών ή υγιών) που έχουν ορθώς ταξινομηθεί από την δοκιμασία

75 Ο Τετράπτυχος πίνακας Υπολογισμός ευαισθησίας-ειδικότητας Μελέτες Ασθενών-Μαρτύρων Προοπτικές μελέτες (cohort studies) Αποτέλεσμα Δοκιμασίας Κατάσταση Ασθενείς Υγιείς Σύνολο Θετικό ΑΘ ΨΘ ΑΘ+ΨΘ Αρνητικό ΨΑ ΑΑ ΨΑ+ΑΑ Σύνολο ΑΘ+ΨΑ ΨΘ+ΑΑ Ν Ευαισθησία (Se): (ΑΘ / ΑΘ+ΨΑ) Ειδικότητα: (Sp) (ΑΑ / ΨΘ+ΑΑ)

76 Από τι εξαρτάται η ευαισθησία και η ειδικότητα? 1. Από την κατανομή των τιμών του δείκτη στους υγιείς και πάσχοντες 2. Από τη θέση του «διαχωριστικού ορίου» Normal Affected Τιμές Δείκτη

77 Μεταβολή της Se και Sp με τη θέση του διαχωριστικού ορίου Cut-off SP Normal Affected SE Low Marker concentration High

78 Normal Σχέση ευαισθησίας-ειδικότητας Affected Καμπύλη ROC: Διάγραμμα Ευαισθησίας-ΨΘ (ΨΘ=1-Ειδικότητα) -1,1 Τιμές Δείκτη 1 0,9 0,8 0,7 Cut off όριο encitivity (%) S 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 01 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 FP (%)

79 Normal Affected Καμπύλη ROC: Σχέση με την κατανομή των τιμών -1,1 11-1,1 11-1,1 11-1, Τιμές Δείκτη 0,9 0,8 0,7 Sencitivity (%) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 FP (%)

80 Το βασικό ερώτημα της διαγνωστικής Τι πιθανότητες έχει ένα άτομο να πάσχει από ένα νόσημα με δεδομένο το αποτέλεσμα μιας δοκιμασίας (εξέτασης)? Απάντηση: Δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας Προγνωστική αξία (+) αποτελέσματος Προγνωστική αξία (-) αποτελέσματος Λόγοι πιθανοφάνειας (Likelihood ratio) Θετικός λόγος πιθανοφάνειας Αρνητικός λόγος πιθανοφάνειας Αφορούν τα αποτελέσματα α α των δοκιμασιών (εξετάσεων)

81 Δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας Προγνωστική αξία (+) αποτελέσματος (PPV) Το ποσοστό των θετικών αποτελεσμάτων στους ασθενείς Προγνωστική αξία (-) αποτελέσματος (NPV) Το ποσοστό των αρνητικών αποτελεσμάτων στους υγιείς Θετικός λόγος πιθανοφάνειας (L) Πόσο πιο πιθανό είναι το θετικό αποτέλεσμα στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς L = Se/(1-Sp) Sp) Αρνητικός λόγος πιθανοφάνειας (λ) Πόσο λιγότερο πιθανό είναι το αρνητικό αποτέλεσμα στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς λ = (1-Se)/Sp Οι δείκτες διαγνωστικής αξίας εξαρτώνται από τον Επιπολασμό της νόσου

82 Ο Τετράπτυχος πίνακας Αποτέλεσμα Δοκιμασίας Ασθενείς Υγιείς Σύνολο Θετικό ΑΘ ΨΘ ΑΘ+ΨΘ Αρνητικό ΨΑ ΑΑ ΨΑ+ΑΑ Σύνολο ΑΘ+ΨΑ ΨΘ+ΑΑ Ν PPV: (ΑΘ / ΑΘ+ΨΘ) NPV: (ΑΑ / ΨΑ+ΑΑ) L: (Se / (1-Sp)) λ: ((1-Se / Sp)

83 Θετική προγνωστική αξία (PPV) (Παράδειγμα) PPV P Se P=Επιπολασμός Se=Ευαισθησία Sp=Ειδικότητα P Se ( 1 P ) (1 Sp ) Παράδειγμα 1: P=1%, Se=90%, Sp=90% PPV = 8.3% Παράδειγμα 2: P=1%, Se=90%, Sp=99% PPV = 48%!! Θεώρημα Bayes Παράδειγμα 3: P=10%, Se=90%, Sp=90% PPV = 50%!

84 Σχόλια Οι δείκτες διαγνωστικής ποιότητας (ευαισθησία και ειδικότητα) αφορούν τη δοκιμασία και όχι τον ασθενή Το ασθενή αφορούν οι δείκτες διαγνωστικής ή προβλεπτικής αξίας των αποτελεσμάτων της δοκιμασίας

85