EPΓAΣTHPIAKEΣ AΣKHΣEIΣ BIOΛOΓIAΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΩΝ EPΓAΣTHPIAKEΣ AΣKHΣEIΣ BIOΛOΓIAΣ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΒΑΡΕΛΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΣΑΪΝΗΣ ΘΕΩΝΗ ΤΡΑΓΚΑ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2015

2 - 2 -

3 - 3 - «Σε ένα έµβιο ον τα πάντα είναι συναρµολογηµένα µε σκοπό την αναπαραγωγή. Ένα βακτήριο, µια αµοιβάδα, µια φτέρη, ποιον άλλον προορισµό µπορούν να ονειρεύονται αν όχι να σχηµατίσουν δύο βακτήρια, δύο αµοιβάδες, πολλές φτέρες;.με τη συσσώρευση της γνώσης, ο άνθρωπος έγινε το πρώτο προϊόν της εξέλιξης που είναι ικανό να κυριαρχήσει πάνω στην εξέλιξη. Όχι µόνο στην εξέλιξη των άλλων αλλά και στη δική του εξέλιξη». Francois Jacob (βραβείο Νόµπελ) «Καύσις καρδίας υπέρ πάσης της κτίσεως, υπέρ των ανθρώπων και των ορνέων και των ζώων και των δαιµόνων και υπέρ παντός κτίσµατος. Και εκ της µνήµης αυτών και της θεωρίας αυτών ρέουσιν οι οφθαλµοί αυτού δάκρυα. Εκ της πολλής και σφόδρας ελεηµοσύνης, της συνεχούσις την καρδίαν και εκ της πολλής καρτερίας σµικρύνεται η καρδία αυτού, και ου δύναται βαστάσαι ή ακούσαι ή ιδείν βλάβην τινά ή λύπην µικράν εν τη κτίσει γενοµένη. Και δια τούτο και υπέρ των αλόγων και υπέρ των εχθρών της αληθείας και υπέρ των βλαπτόντων αυτόν εν πάση ώρα ευχήν µετά δακρύων προσφέρει, του φυλαχθήναι αυτοίς και ιλασθήναι αυτοίς, οµοίως και υπέρ της φύσεως των ερπετών, εκ της πολλής αυτού ελεηµοσύνης της κινουµένης εν τη καρδία αυτού αµέτρως καθ οµοιότητα του Θεού». Αγ. Ισαάκ ο Σύρος (Λόγος 81 ος )

4 - 4 - ΠΡΟΛΟΓΟΣ Για πολλούς, ο αιώνας που µόλις έχει ανατείλει θα είναι ο αιώνας της Βιοτεχνολογίας. Είναι αλήθεια ότι οι πρόοδοι των τελευταίων ετών σε πολλούς διαφορετικούς τοµείς της Βιολογίας και τα επιτεύγµατα σε τοµείς εφαρµογών δικαιολογούν τον παραπάνω χαρακτηρισµό. Οι φοιτητές των αντίστοιχων τµηµάτων πρέπει να αισθάνονται τυχεροί όσον αφορά στις προοπτικές επαγγελµατικής αποκατάστασης που διαφαίνονται στον ορίζοντα. Οι νέες τεχνολογίες, πληροφορική και βιοτεχνολογία, είναι αυτές που σηµατοδοτούν και θα συνεχίσουν να σηµατοδοτούν την πορεία της ανθρωπότητας. Ενώ βέβαια αυτή είναι η πραγµατικότητα σε παγκόσµιο επίπεδο, δεν µπορούµε παρά να σταθούµε κριτικά απέναντι σε απόψεις, σύµφωνα µε τις οποίες, οι νέες τεχνολογίες έχουν ή θα έχουν στο µέλλον την απάντηση σε όλα ανεξαιρέτως τα ανθρώπινα προβλήµατα. Η αισιόδοξη άποψη για το µέλλον δεν είναι βέβαια καταδικαστέα, αλλά δεν µπορεί πολλές φορές να εκτιµήσει νηφάλια την υπάρχουσα κατάσταση. Η αποσαφήνιση της δοµής και της λειτουργίας του DNA, ήταν ίσως η µεγαλύτερη ανακάλυψη του αιώνα που πέρασε. Η αποκρυπτογράφηση του γενετικού κώδικα, η ανακάλυψη και εφαρµογή νέων µεθόδων µελέτης σε υποκυτταρικό επίπεδο, οδήγησε σε µια σειρά από εντυπωσιακές ανακαλύψεις. Αυτό είναι αληθινό. Αληθινό είναι επίσης ότι µε την εφαρµογή σύγχρονων τεχνικών πολλά άτεκνα ζευγάρια απέκτησαν παιδί. Αυτό είναι πέρα ως πέρα θεµιτό. Είναι θεµιτό όµως η κλωνοποίηση ανθρώπων χρησιµοποιώντας τα ίδια µέσα και τις ίδιες τεχνικές; H επιστήµη των τελευταίων 50 χρόνων συνέβαλλε σηµαντικά στην αύξηση του µέσου όρου ζωής των ανθρώπων. Η ανακάλυψη των αντιβιοτικών σε συνδυασµό µε την εφαρµογή νέων τεχνολογιών κατά τις χειρουργικές επεµβάσεις συνέβαλλαν τα µέγιστα στο σκοπό αυτό. Αυτό είναι πέρα ως πέρα αληθινό. Παράλληλα όµως πρέπει να αναγνωρίσουµε και τη συµβολή των βελτιωµένων συνθηκών διαβίωσης και υγιεινής. Για πολλούς µάλιστα, η βελτίωση αυτών των συνθηκών συνέβαλλε πολύ περισσότερο στην αύξηση του µέσου όρου ζωής. Η βελτίωση των συνθηκών ζωής δεν ήταν αποτέλεσµα κάποιας επιστηµονικής επανάστασης. Ήταν αποτέλεσµα της καλύτερης κατανοµής του πλούτου στις αναπτυγµένες χώρες. Η γονιδιακή θεραπεία µπορεί να αποδειχθεί η θεραπεία του µέλλοντος. Η αναζήτηση και η τελειοποίηση µεθόδων γονιδιακής θεραπείας είναι καθήκον των επιστηµόνων και σίγουρα θα αποβεί προς όφελος της ανθρωπότητας. Παράλληλα όµως δεν µπορούµε να µην σταθούµε κριτικά απέναντι στην υπεραισιόδοξη άποψη σύµφωνα µε την οποία όλες οι ανθρώπινες ασθένειες θα µπορούσαν στο µέλλον να θεραπευτούν µε αυτό τον τρόπο. Αν και δεν είµαστε ενάντιοι σε οποιαδήποτε αισιόδοξη άποψη (το τονίσαµε άλλωστε προηγουµένως) δεν πρέπει να διαφύγει της προσοχής µας ότι οι µέχρι τώρα προσπάθειες θεραπείας εστιάζονται σε µονογονιδιακές ασθένειες. Οι περισσότερες όµως ασθένειες του ανθρώπου είναι πολυγονιδιακές και τα γονίδια και η συµβολή του καθενός στην ασθένεια είναι εν πολλοίς µέχρι στιγµής άγνωστα. Βέβαια κάποιος µπορεί να ισχυρισθεί ότι η θεραπεία πολυγονιδιακών ασθενειών µπορεί να πραγµατοποιηθεί στο µέλλον. Πράγµατι η διαφωνία δεν έγκειται σε αυτό, το πρόβληµα βρίσκεται αλλού: δηµιουργείται η αντίληψη, η πίστη ότι τα πάντα καθορίζονται από το DNA. Η πίστη ότι όλα καθορίζονται από το DNA ανέτρεψε τα τελευταία χρόνια µια πάγια διατύπωση και διαπίστωση των Βιολόγων των περασµένων χρόνων. Την αλληλεπίδραση του γενότυπου, του DNA µε το περιβάλλον. Εάν κάθε ασθένεια µπορεί να θεραπευτεί µε παρεµβάσεις στο

5 - 5 - γενετικό υλικό τότε πολύ λίγη σηµασία έχουν οποιεσδήποτε παρεµβάσεις µε σκοπό τη βελτίωση του κατεστραµµένου φυσικού περιβάλλοντος. Μήπως όµως ή άποψη αυτή δεν είναι σωστή; Η χρήση υβριδίων φυτών, σε συνδυασµό µε την εφαρµογή νέων σύγχρονων µεθόδων καλλιέργειας είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της παγκόσµιας αγροτικής παραγωγής. Αυτό είναι πέρα ως πέρα αληθινό. Παράλληλα όµως, η χρήση υβριδίων οδήγησε στη χειραγώγηση του παγκόσµιου εµπορίου σπόρων από µεριάς ενός µικρού αριθµού τεχνολογικά αναπτυγµένων χωρών. Πολλοί φυσικοί σπόροι δεν βρίσκονται πια στην κατοχή των καλλιεργητών, αλλά στην κατοχή λίγων εργαστηρίων µε υψηλή τεχνογνωσία Η χρήση λιπασµάτων ήταν µια µεγάλη ανακάλυψη η οποία συνέβαλλε επίσης στην αύξηση της αγροτικής παραγωγής. Όλοι όµως γνωρίζουµε τις αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον, εξαιτίας της αλόγιστης χρήσης τους. Το τελευταίο µισό του 20 ου αιώνα η πρόοδος στις τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας µετατόπισε την έµφαση των βιολογικών επιστηµών στην µελέτη των µορίων για να εξηγηθούν τα φαινόµενα της ζωής. Κατά συνέπεια, η προσπάθεια κατανόησης σύνθετων και πολύπλοκων φαινόµενων επικεντρώθηκε στην µελέτη των λειτουργικών ιδιοτήτων των επιµέρους παραγόντων που συνιστούν ένα πολυπαραγοντικό σύστηµα. Αυτή η προσέγγιση µπορεί να είναι απλουστευτική. Η µελέτη µεµονωµένων βιολογικών µορίων θα συνεχίσει να είναι ένας βασικός και απαραίτητος τοµέας δραστηριότητας αλλά δεν µπορεί από µόνη της να οδηγήσει στην πλήρη κατανόηση των ζωντανών οργανισµών. Οι οργανισµοί είναι παραπάνω από το άθροισµα των συνιστωσών τους και οι συµπεριφορά των πολύπλοκων φυσιολογικών διαδικασιών δεν µπορεί να γίνει κατανοητή µε το να γνωρίζουµε το πως κάθε µια από τις συνιστώσες λειτουργούν µεµονωµένα. Η κατανόηση των βιολογικών διαδικασιών απαιτεί την µελέτη σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης της ζωής, από το µόριο του DNA έως το οικολογικό σύστηµα Εκείνο που έγινε ξεκάθαρο από αυτά που αναφέρθηκαν είναι ότι η Βιολογία, ως επιστήµη µε την αυστηρή έννοια του όρου, αλλά και ως τρόπος σκέψης, έχει λόγο σε όλους τους τοµείς της ανθρώπινης δραστηριότητας. Από την παραγωγή τροφίµων, τη διατροφή και τη θεραπεία ασθενειών µέχρι την κοινωνική οργάνωση και δόµηση της κοινωνίας. Ο αυριανός επιστήµονας προσθέτοντας ένα λιθαράκι σε οποιοδήποτε από τους επιµέρους αυτούς τοµείς, πρέπει να γνωρίζει ότι συµβάλλει στην εδραίωση ενός τεράστιου οικοδοµήµατος. Η χρήση του οικοδοµήµατος αυτού δεν εξαρτάται µόνο από την καλή ή την κακή θέληση των επιστηµόνων. Θα ήταν όµως άτοπο εάν θεωρήσουµε ότι η όποια κακή χρήση πρέπει να µας αφήνει ασυγκίνητους. Η απόρριψη της όποιας ευθύνης επιτυγχάνεται πολύ εύκολα στην επιστηµονική κοινότητα και µάλιστα µε επιστηµονικά επιχειρήµατα. ύο είναι τα σηµαντικότερα επιχειρήµατα που χρησιµοποιούνται από µεριάς των επιστηµόνων. Το πρώτο επιχείρηµα σχετίζεται µε µια ολόκληρη φιλοσοφική αντίληψη, η οποία αναγνωρίζει στην επιστήµη µόνο έναν χρησιµοθηρικό ρόλο. Σύµφωνα µε αυτή την άποψη, η επιστήµη πρέπει να έχει ένα µετρήσιµο όφελος. Κάθε ερευνητική προσπάθεια πρέπει να έχει µια τουλάχιστον πρακτική εφαρµογή. Το όφελος αυτό µπορεί να είναι όφελος για την ανθρωπότητα, µπορεί να είναι όµως και όφελος κάποιων σε βάρος κάποιων άλλων ή σε βάρος του φυσικού περιβάλλοντος. Η χρησιµοθηρική άποψη για την επιστήµη οδήγησε σε καθαγιασµό όλων ανεξαιρέτως των παρεµβάσεων του ανθρώπου στο περιβάλλον και

6 - 6 - πρόσφατα και στον ίδιο του τον εαυτό. Η µεγαλύτερη όµως καταστροφή που προέκυψε εξαιτίας του ασπασµού αυτής της άποψης, ήταν πνευµατική. Οδήγησε στην απώλεια του ειλικρινούς θαυµασµού για το φαινόµενο της ζωής, του ειλικρινούς ενδιαφέροντος για την έρευνα µε αποκλειστικό σκοπό τη γνώση και τη χαρά της ανακάλυψης. Το δεύτερο επιχείρηµα είναι ένα επιχείρηµα βγαλµένο µέσα από τα σπλάγχνα της Βιολογίας. Σύµφωνα µε τις αρχές της Βιολογίας, το βασικό χαρακτηριστικό της ζωής είναι η αναπαραγωγή. Η αναπαραγωγή λοιπόν, είναι σύµφωνα µε τη Βιολογία το νόηµα της ζωής. Αιώνες φιλοσοφικών αναζητήσεων διαγράφονται έτσι µονοκοντυλιά µε µια απλή δήλωση. Ο καθένας από εµάς, το κάθε είδος βακτηρίου, φυτού ή ζώου το µόνο που θέλει είναι να επιβιώσει µόνο και µόνο για να αναπαραχθεί. Προσπαθεί µάλιστα να αναπαραχθεί σε βάρος των ανταγωνιστών του, είτε αυτοί ανήκουν σε άλλο είδος, είτε στο ίδιο είδος και να επικρατήσει. Εάν η αναπαραγωγή είναι το νόηµα της ζωής, και εάν ο ανταγωνισµός για επικράτηση το κύριο χαρακτηριστικό της όποιας κοινωνικής οργάνωσης, τότε σίγουρα δεν έχουν νόηµα πολλά από τα ερωτήµατα που βασάνισαν την ανθρώπινη σκέψη επί αιώνες. Η ηθική, σύµφωνα µε αυτή την άποψη, δεν είναι απλώς µια σχετική έννοια αλλά µια έννοια άχρηστη και χωρίς περιεχόµενο. Θα φανεί ξεκάθαρα τι εννοούµε µέσα από ένα παράδειγµα. Ας αναρωτηθούµε για παράδειγµα, γιατί είναι θεµιτό να αναπτύξουµε νέες µεθόδους θεραπείας ανθρώπινων ασθενειών; Η απάντηση που θα δινόταν από οποιονδήποτε άνθρωπο, µορφωµένο ή µη, πριν από µερικές δεκαετίες θα ήταν: κάτι τέτοιο είναι ηθικό γιατί είναι πολύ ανθρώπινο. Η ανθρώπινη ζωή είχε µια ιδιαίτερη και ίσως µεταφυσική αξία. Στην σηµερινή εποχή θα έπρεπε να ισχυριστούµε ότι αυτό το κάνουµε για να δώσουµε τη δυνατότητα στο συγκεκριµένο άτοµο να παράγει περισσότερους απογόνους. Η αναπαραγωγή όµως είναι η µια παράµετρος της σύγχρονης αντίληψης για τη ζωή. Η άλλη παράµετρος είναι ο ανταγωνισµός. Γιατί να θεραπεύσουµε κάποιον ο οποίος έτσι και αλλιώς µε την ασθένειά του απέδειξε ότι είναι ανίκανος να επιβιώσει σε ένα ανταγωνιστικό περιβάλλον; Η βελτίωση των φυτών και η εφαρµογή νέων µεθόδων καλλιέργειας, έγιναν µε σκοπό την αύξηση της παραγωγής. Απώτερος στόχος των πρωτεργατών αυτών των µεθόδων, όπως τουλάχιστον δήλωναν οι ίδιοι, ήταν η εξάλειψη της πείνας. Όλοι µας όµως γνωρίζουµε ότι η πείνα δεν εξαλείφθηκε. Παρόλα αυτά οι προσπάθειες βελτίωσης φυτών συνεχίζονται, µε τα ίδια επίσης επιχειρήµατα για να πεισθεί η κοινή γνώµη. Εάν τα πράγµατα έχουν έτσι, εάν δηλαδή η αναπαραγωγή και ο ανταγωνισµός είναι τα κύρια βιολογικά χαρακτηριστικά και εάν πρέπει αυτά να εφαρµόζονται µε τόσο ωµό τρόπο σε κάθε πτυχή της ανθρώπινης δραστηριότητας, τότε πράγµατι ο κόσµος στον οποίο ζούµε γίνεται όλο και πιο εφιαλτικός. Πιστεύουµε όµως, ότι κάτι τέτοιο δεν είναι αλήθεια και ο κόσµος που ανατέλλει δεν θα έπρεπε να είναι χειρότερος από αυτόν που αντικαθιστά. Η πορεία της ζωής θα δείξει τελικά τι από τα δύο θα συµβεί. Η συµβολή των αυριανών επιστηµόνων θα είναι καθοριστική. Το βιβλίο αυτό παρόλο που είναι ένα εργαστηριακό βιβλίο εισαγωγής, γράφτηκε έχοντας κατά νου όλα τα παραπάνω. Το πρώτο που θέλει να επιτύχει είναι να κεντρίσει το ενδιαφέρον και να εµπνεύσει το θαυµασµό για το φαινόµενο της ζωής. Ζητούµενο επίσης είναι και η επιστηµονική κατάρτιση, η οποία έγινε προσπάθεια να προχωρήσει βήµα βήµα από το απλούστερο στο συνθετότερο. Σε κάθε εργαστηριακή άσκηση υπάρχει εκτενής εισαγωγή στο θέµα, η οποία καλύπτει συνοπτικά τις περισσότερες πτυχές και τις σύγχρονες απόψεις, επιτρέποντας τελικά, κατά την επιτέλεση της άσκησης, την ανάδειξη του ουσιώδους και την κατανόηση της βιολογικής σηµασίας των φαινοµένων που

7 - 7 - διαπραγµατεύεται. Στόχος της όλης προσπάθειας, η διατήρηση της ειλικρινούς απορίας και του βαθύτερου θαυµασµού για τον κόσµο που µας περιβάλλει. Η απορία για τον κόσµο είναι η βασική προϋπόθεση οποιασδήποτε ερευνητικής προσπάθειας, ο θαυµασµός είναι η προϋπόθεση της ορθής και µη καταστροφικής παρέµβασης και εφαρµογής. Εάν οι στόχοι αυτοί επιτευχθούν ή όχι, εξαρτάται πρώτα και κύρια από τη δική µας ικανότητα. Επειδή οι δυνάµεις µας είναι ούτως ή άλλως περιορισµένες, υποδείξεις, διορθώσεις και παρεµβάσεις κρίνονται αναγκαίες και θα εκτιµηθούν ιδιαίτερα µε στόχο τη µελλοντική βελτίωση του συγγράµµατος αλλά και της διδακτικής τακτικής.

8 - 8 - Στη Μνήµη του Πατέρα µου Στη ήµητρα και το Γιώργο

9 - 9 -

10 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΑΤΕΛΕΙΣ ΜΟΡΦΕΣ ΠΟΛΥΚΥΤΤΑΡΙΚΟΤΗΤΑΣ (ΑΠΟΙΚΙΕΣ). Εικόνα 1. Tα ιάτοµα (x900) είναι µονοκύτταροι ευκαρυωτικοί φωτοσυνθετικοί οργανισµοί Όνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

11 Γενική Εισαγωγή «Το κύτταρο είναι η θεµελιώδης µονάδα της ζωής». Αυτή η πρόταση που αποτελεί ίσως τη βασικότερη αρχή της Κυτταρικής Βιολογίας µας εισάγει στις βασικές αρχές της επιστήµης της Βιολογίας. Πως όµως τεκµηριώνεται αυτή η πρόταση; Με βάση της µέχρι τώρα γνώσεις µας ο έµβιος κόσµ µος διακρίνεται από τον άβιο µε βάση το κριτήριο της αναπαραγωγής, η οποία µάλιστα στηρίζεται σε συγκεκριµένα βιοµόρια τα νουκλεινικά οξέα. Αφού λοιπόν το κύριο χαρακτηριστικό της ζωής η αναπαραγωγή µπορεί να πραγµατοποιηθεί από το κύτταρο, δικαίως αυτό ορίζεται σαν η βασική µονάδα της ζωής. Εικόνα 2. To κύτταρο είναι η µικρότερη βιολογική οντότητα που εκπληρώνει το βασικό κριτήριο του ορισµ µού της ζωής. Την αναπαραγωγή που βασίζεται στα νουκλεινικά οξέα. Πολλές φορές βέβαια αναφερόµαστε στο «κύτταρο» ωσάν όλα τα κύτταρα να είναι ίδια. Κάτι τέτοιο σαφώς δεν ισχύει. Τα κύτταρα διαφέρουν στο µέγεθος στη µορφολογία τους στις λειτουργίες που επιτελούν. Ένα κύτταρο µπορεί να αποτελεί έναν οργανισµό (εάν είναι ένα βακτήριο) και ο θάνατός του να σηµαίνει και το θάνατο του οργανισµού, ή να είναι ένα από τα εκατοµµύρια κύτταρα ενός οργανισµού και ο θάνατός του να µην επιφέρει κανένα απολύτως πρόβληµα στον οργανισµό (καθηµερινά πεθαίνουν κύτταρα της επιδερµίδας µας ή του βλεννογόνου της στοµατικής µας κοιλότητας και αντικαθίστανται). Στη σηµερινή εργαστηριακή άσκηση θα εστιάσουµε στην παρατήρηση κυττάρων που κάθε ένα από αυτά αποτελεί ένα οργανισµό δηλ. σε Μονοκύτταρους Οργανισµούς. Από αυτούς θα επιλέξουµεε τους Ευκαρυωτικούς Οργανισµούς αυτούς δηλαδή που έχουν οργανωµένο πυρήνα, µε άλλα λόγια αυτούς που το γενετικό τους υλικό περικλείεται από πυρηνική µεµβράνη. Για να γίνει κατανοητό σε ποιους ακριβώς οργανισµούς αναφερόµαστε θα πρέπει να ανοίξουµε εδώ µια µικρή παρένθεση και να δώσουµε τις βασικές αρχές ταξινόµησης των οργανισµών:

12 Μεχρι πρόσφατα όλα τα έµβρυα όντα, κατατάσσονταν σε πέντε βασίλεια: Ζώα Φυτά, Μύκητες, Πρώτιστα (Πρωτόκτιστα) και Βακτήρια. Με βάση αυτή την κατάταξη. Τα ζώα χαρακτηρίζονται από την αναπαραγωγική δοµή του εµβρύου µε σχηµατισµό µιας δοµής κατά την ανάπτυξη του που ονοµάζεται βλάστουλα Τα Φυτά χαρακτηρίζονται από την αναπαραγωγική δοµή του εµβρύου Οι µύκητες χαρακτηρίζονται από ακινησία. Τα Πρωτόκτιστα ορίζονται αφοριστικά δηλ δεν έχουν προκαρυωτική οργάνωση δεν είναι ακίνητοι δεν έχουν δοµή εµβρύου Τα Βακτήρια είναι µονοκύτταροι οργανισµοί, µε προκαρυωτική οργάνωση χωρίς δοµηµένο πυρήνα Εικόνα 3 Σχηµατική αναπαράσταση των πέντε βασιλείων του έµβιων όντων

13 Η κατάταξη αυτή έχει αλλάξει λόγω των συσσωρευτικών δεδοµένων των τελευταίων ετών. Η σύγκριση των αλληλουχιών DNA από διαφορετικά είδη που αφορούν σε µεγάλο βαθµό τα Αχαία έχει αλλάξει τον χάρτη της ζωής. Η κατάταξη που είναι γενικά αποδεκτή σήµερα δέχεται ως ανώτερο επίπεδο της ζώσας ύλης την επικράτεια και διαµορφώνεται ως εξής Α) επικράτεια των Βακτηρίων Β)επικράτεια των Αρχαίων και Γ)επικράτεια των Ευκαρύων. Ακόµη υπάρχουν αντικρουόµενες απόψεις για τα «όρια» των βασιλείων και τα κριτήρια κατάταξης των οργανισµών σε αυτά. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι διαφορετικές ερευνητικές προσεγγίσεις υποστρηρίζουν αριθµό βασιλείων που κυµαίνεται από έξι µέχρι δεκάδες χιλιάδες βασίλεια. Ιδιαίτερα η οµάδα των Πρωτίστων επιδέχεται συνεχείς αλλαγές. Πολύ αρχαίοι προκαρυώτες Τα αρχαία και τα ευκάρυα έχουν πιο πολλά κοινά µεταξύ τους απ ότι µε τα βακτήρια Προέλευση της ζωής ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΑΡΧΑΙΑ ΕΥΚΑΡΥΑ 3,5 δις χρόνια Σήµερα Κοινός πρόγονος όλων των οργανισµών Η επικράτεια των Βακτηρίων, η επικράτεια των Αρχαίων η επικράτεια των Ευκαρύων, και η φυλογενετική τους σχέση. Τα Πρωτόκτιστα είναι µια εξαιρετικά ανοµοιογενής οµάδα ευκαρυωτικών οργανισµών. Γι αυτό και η συστηµατική τους κατάταξη δεν έχει διασαφηνιστεί ακόµη. Το βέβαιο είναι ότι πολλά από τα πρωτόκτιστα είναι µονοκύτταρα και πολλά πολυκύτταρα. Παλαιότερα οι οργανισµοί αυτοί ταξινοµούνταν σαν «πρωτόζωα» και «φύκη». Οι οργανισµοί που θα παρατηρήσουµε σήµερα ανήκουν σε αυτές τις κατηγορίες για το λόγο αυτό κρίνεται αναγκαίο να υπενθυµίσουµε ορισµένα από τα χαρακτηριστικά τους.

14 Φύκη ( Πρωτόκτιστα) Τα περισσότερα φύκη ζουν σε υδάτινα οικοσυστήµατα (θαλάσσια ή λιµναία). Εάν αιωρούνται στο νερό, τότε αναφέρονται ως πλαγκτονικοί οργανισµοί, ενώ εάν βρίσκονται προσκολληµένοι στο βυθό ονοµάζονται βενθικοί οργανισµοί. Λίγα είδη φυκών ζουν πάνω σε υγρούς βράχους, ξύλα, δέντρα, ακόµη και στην επιφάνεια υγρού εδάφους. Τα φύκη τα οποία αιωρούνται στο νερό, µαζί µε έναν αριθµό αιωρούµενων στο νερό φωτοσυνθετικών βακτηρίων, αποτελούν το φυτοπλαγκτόν ή ακριβέστερα το φωτοπλακτόν (οργανισµοί που φωτοσυνθέτουν).στους χλωροπλάστες τους υπάρχουν ευδιάκριτα θυλακοειδή όπου πραγµατοποιούνται οι φωτεινές αντιδράσεις της φωτοσύνθεσης. Στο εσωτερικό των χλωροπλαστών, στο στρώµα εντοπίζονται κοκκία αµύλου, τα οποία ονοµάζονται πυρηνοειδή. Εικόνα 4. Ποικιλοµορφία της κυτταρικής οργάνωσης των φυκών. a) µονοκύτταρο µε δυνατότητα κίνησης λόγω της ύπαρξης µαστιγίων (Cryptomonas), b) ακίνητο µονοκύτταρο (Palmellopsis), και c) οργάνωση σε αποικίες (Gonium)). Ενώ στα φύκη περιλαµβάνονται κυρίως µονοκύτταροι ευκαρυωτικοί οργανισµοί, εντούτοις παρατηρούνται και µερικές απλές µορφές πολυκυτταρικότητας. Έτσι λοιπόν υπάρχουν είδη τα οποία είναι µονοκύτταρα, είδη που σχηµατίζουν αποικίες, ινίδια, µεµβρανώδεις ή σωληνοειδείς πολυκύτταρες δοµές. Εικόνα 5. Το Volvox χαρακτηρίζεται από την οργάνωσή του σε αποικίες.

15 Πολλά µονοκύτταρα φύκη αναπαράγονται αγενώς. Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι αγενούς αναπαραγωγής σε µονοκύτταρους οργανισµούς, είτε µε διχοτόµηση του µητρικού κυττάρου, είτε µε παραγωγή σπορίων. Σε µερικά µονοκύτταρα φύκη και σε πολλά πολυκύτταρα, παρατηρείται και εγγενής αναπαραγωγή. Κατά την εγγενή αναπαραγωγή παράγονται ωάρια και σπερµατοζωάρια. Πρωτόζωα ( Πρωτόκτιστα) Τα πρωτόζωα είναι µονοκύτταροι ευκαρυωτικοί οργανισµοί οι οποίοι δεν έχουν την ικανότητα φωτοσύνθεσης και ως εκ τούτου είναι ετερότροφοι. Επιβιώνουν σε µια µεγάλη ποικιλία υγρών περιβαλλόντων. Η υγρασία είναι απολύτως απαραίτητη για την ύπαρξή τους. Τα περισσότερα πρωτόζωα ζούν ελεύθερα σε θαλάσσια και λιµναία οικοσυστήµατα. Πολλά όµως είδη αποικοδοµούν οργανική ύλη στο έδαφος, ακόµη και στην άµµο της θάλασσας. Μερικά είναι παράσιτα φυτών ή ζώων. Η σηµασία των πρωτόζωων είναι τεράστια για τη φύση αλλά και για τον άνθρωπο. Τα πρωτόζωα που αιωρούνται ελεύθερα στα υδάτινα οικοσυστήµατα αποτελούν µεγάλο µέρος του ζωοπλαγκτόν, το οποίο είναι ένας σηµαντικός κρίκος σε τροφικές αλυσίδες υδάτινων οικοσυστηµάτων. Τα πρωτόζωα επίσης είναι σηµαντικά για βιοχηµικές και βιολογικές µελέτες. Πολλά βιοχηµικά µονοπάτια που έχουν µελετηθεί σε πρωτόζωα είναι επίσης παρόντα σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Τέλος, ένας µεγάλος αριθµός ασθενειών του ανθρώπου και των ζώων οφείλονται σε πρωτόζωα. Επειδή τα πρωτόζωα είναι ευκαρυωτικοί οργανισµοί, σε πολλά σηµεία η µορφολογία των κυττάρων τους και η φυσιολογία τους είναι παρόµοια µε αυτή των πολυκύτταρων ευκαρυωτικών οργανισµών. Παρόλα αυτά, επειδή όλες οι εκδηλώσεις της ζωής (π.χ. κίνηση, θρέψη, αναπαραγωγή) πρέπει να πραγµατοποιούνται από ένα και µόνο κύτταρο, µερικά µορφολογικά και φυσιολογικά χαρακτηριστικά είναι µοναδικά χαρακτηριστικά του κυττάρου των πρωτόζωων. Μόνο ένας µικρός αριθµός πρωτόζωων δεν έχει ικανότητα κίνησης. Τα υπόλοιπα µπορούν να κινούνται µε έναν από τους τρεις παρακάτω τρόπους: µε ψευδοπόδια, µε µαστίγια και τέλος µε βλεφαρίδες. Τα ψευδοπόδια είναι κυτταροπλασµατικές προεκβολές. Είναι ευδιάκριτα κατά την κίνηση της αµοιβάδας Εικόνα 6 Μία αµοιβάδα χρησιµοποιεί τα ψευδοπόδια της για να παγιδεύσει ένα Paramecium.

16 (αµοιβαδοειδής κίνηση). Σχετίζονται επίσης µε την πρόσληψη της τροφής (ενδοκύττωση ή φαγοκυττάρωση). Πρωτόζωα που διαθέτουν µαστίγια για την κίνησή τους ονοµάζονται Flagellates (Flagellum = µαστίγιο) ενώ αυτά που κινούνται µε τη βοήθεια βλεφαρίδων ονοµάζονται Cilliates (cillium = βλεφαρίδα). Η δοµή των µαστιγίων και των βλεφαρίδων των πρωτοζώων είναι παρόµοια µε τη δοµή και τη λειτουργία των αντίστοιχων οργανιδίων των υπολοίπων ευκαρυωτικών οργανισµών. Όσον αφορά την αναπαραγωγή τους, αυτή γίνεται κυρίως αγενώς. Υπάρχουν όµως αρκετά είδη που αναπαράγονται και εγγενώς. Η πιο κοινή µέθοδος αγενούς αναπαραγωγής A B Εικόνα 7. Κελύφη από A, Radiolaria (x63) και B, Foraminifera (Εlphidium cristinum x100) Eργαστηριακός εξοπλισµός Mικροσκόπια Yλικά Έτοιµα παρασκευάσµατα Μονοκύτταρων Eυκαρυωτικών οργανισµών

17 Eργαστηριακό πρωτόκολλο Στο Eργαστήριο αυτό θα παρατηρήσουµε µια σειρά από αντιπροσωπευτικούς ευκαρυωτικούς µονοκύτταρους οργανισµούς. Nα σχεδιάσετε τον καθένα από αυτούς στον κενό χώρο κάτω από το κείµενο που τον περιγράφει. 1) Αµοιβάδα (Amoeba proteus) Οι Aµοιβάδες αποτελούν µια οικογένεια πρωτοζώων µε ευρεία εξάπλωση. ιάφορα είδη της οικογένειας ζουν τόσο σε γλυκά όσο και σε αλµυρά νερά, ακόµη και στο έδαφος. Mερικά είδη είναι παράσιτα των θηλαστικών. Oι απλούστερες Aµοιβάδες κινούνται σχεδόν συνέχεια µε τη χρήση ψευδοποδίων (αµοιβαδοειδής κίνηση). εν έχουν συγκεκριµένο σχήµα και οι εσωτερικές δοµές δεν καταλαµβάνουν συγκεκριµένη θέση. Yπάρχει µόνο ένας πυρήνας. Στο κυτταρόπλασµα εντοπίζεται το συσταλτό και το πεπτικό κενοτόπιο. H Aµοιβάδα εγκολπώνει µια µεγάλη ποικιλία µικροοργανισµών (φύκη, βακτήρια, άλλα πρωτόζωα) µε τη διαδικασία της φαγοκύτωσης. Mερικά υλικά µετακινούνται στο εσωτερικό και το εξωτερικό του κυττάρου µε πινοκύττωση. H Aµοιβάδα αναπαράγεται αγενώς. Εικόνα 8. Η Amoeba proteus όπως φαίνεται κάτω από το µικροσκόπιο µετά από χρώση. 2) ιάφορα είδη ιατόµων των γλυκών ειδών. (Mixed freshwater diatoma) Tα ιάτοµα είναι µονοκύτταροι ευκαρυωτικοί φωτοσυνθετικοί οργανισµοί. Το σχήµα τους είναι σφαιρικό ή επίµηκες. Περιβάλλονται από κάλυµµα - θήκη που αποτελείται από δύο τµήµατα. Tο µεγαλύτερο τµήµα, η επιθήκη έχει µεγαλύτερη διάµετρο και καλύπτει µερικώς την υποθήκη, το µικρότερο τµήµα. H σύσταση της θήκης είναι πυριτική. Tα ιάτοµα ζούν στα γλυκά νερά, στα αλµυρά νερά αλλά και στο υγρό έδαφος. Aποτελούν µεγάλο µέρος του φυτοπλαγκτόν. Tα ιάτοµα είναι διπλοειδή και

18 πολλαπλασιάζονται αγενώς. Σε κάθε κυτταρική διαίρεση το κάθε νέο κύτταρο παίρνει ένα από τα δύο τµήµατα της θήκης του µητρικού κυττάρου. Kατόπιν σχηµατίζουν εσωτερικά του τµήµατος της θήκης που παρέλαβαν µια υποθήκη. Aυτό έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση του µεγέθους από γενιά σε γενιά. Όταν το µέγεθος φτάσει το 30% του αρχικού τότε κάθε κύτταρο µε µείωση σχηµατίζει γαµέτες οι οποίοι συντήκονται προς σχηµατισµό ζυγωτών κυττάρων (εγγενής αναπαραγωγή). Tα ζυγωτά κύτταρα µε µίτωση δίνουν πάλι κύτταρα κανονικού µεγέθους. Tα συσσωρευµένα κελύφη των νεκρών ιατόµων αποτελούν τη γη ιατόµων. Η γη ιατόµων έχει µεγάλη οικονοµική αξία, µιας και χρησιµοποιείται για την Παρασκευή φίλτρων, κιµωλίας και ταλκ. 3) Ευγλήνη (Euglena viridis) H Euglena είναι ένα φύκος το οποίο δεν διαθέτει κυτταρικό τοίχωµα. Στο κύτταρο υπάρχει ένας µεγάλος πυρήνας µε πυρηνίσκο και αρκετοί χλωροπλάστες που περιέχουν τόσο χλωροφύλλη α και β όσο και καροτενοειδή. H αποθηκευτική ουσία είναι το παράµυλο, χαρακτηριστικό αυτών των φυκών. Tο στίγµα ή οπτική κηλίδα είναι µια δοµή που βρίσκεται κοντά στο µαστίγιο έτσι ώστε να ρυθµίζεται η κίνηση του οργανισµού ανάλογα µε την κατεύθυνση και την ένταση των φωτεινών ερεθισµάτων. Ένα συσταλτό κενοτόπιο συνεχώς συλλέγει νερό από το κύτταρο και το προωθεί στο εσωτερικό ενός καναλιού που επικοινωνεί µε το εξωτερικό περιβάλλον ρυθµίζοντας έτσι την οσµωτική πίεση του κυττάρου. ύο µαστίγια φύονται από τη βάση του καναλιού, εκ των οποίων µόνο το ένα εξέχει από το κανάλι και βοηθάει στην κίνηση του κυττάρου. H αναπαραγωγή

19 γίνεται µε µιτωτική κυτταρική διαίρεση (αγενώς). Tο εντυπωσιακό µε την Euglena είναι ότι κάτω από την επίδραση ορισµένων περιβαλλοντικών παραγόντων χάνει τους χλωροπλάστες και µετατρέπεται σε ετερότροφος οργανισµός. Εικόνα 9. Η ευγλήνη κάτω από το µικροσκόπιο µετά από χρώση που επιτρέπει την παρατήρηση των πυρήνων. 4) Spirogyra. H Spirogyra είναι ένα φύκος, που ζει στα γλυκά νερά. Σπουδαιότερο µορφολογικό χαρακτηριστικό του οι σπειροειδείς χλωροπλάστες. Στο εσωτερικό των χλωροπλαστών αποθηκεύεται το άµυλο σε δοµές που ονοµάζονται πυρηνοειδή. H αναπαραγωγή της γίνεται αγενώς µε µίτωση που ακολουθείται από εγκάρσια διχοτόµηση. Tα κύτταρα που προκύπτουν δεν αποχωρίζονται και έτσι σχηµατίζονται νήµατα κυττάρων που φτάνουν µέχρι τα 50 εκ. µήκος. Aµφιγονική αναπαραγωγή µπορεί να συµβεί όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες γίνουν µη ευνοϊκές. ύο γειτονικά νήµατα αρχίζουν να συνδέονται κύτταρο προς κύτταρο µε συζευκτικούς σωλήνες. Tο περιεχόµενο των κυττάρων του ενός νήµατος περνάει στα κύτταρα του άλλου, όπου και σχηµατίζονται τα ζυγωτά. Aυτά, µε πάχυνση των τοιχωµάτων τους και αφυδάτωση του κυτταροπλάσµατος µετατρέπονται σε ζυγοσπόρια τα οποία είναι ανθεκτικά στις νέες αντίξοες συνθήκες. Όταν οι συνθήκες γίνουν ευνοϊκές, τα ζυγοσπόρια θα δώσουν καινούρια νήµατα.

20 - 20-5) Volvox. Tο Volvox είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα φύκους που σχηµατίζει αποικίες. Oι αποικίες είναι σφαιροειδείς και περιέχουν κύτταρα, το καθένα από τα οποία έχει δύο µαστίγια. Tα µαστίγια όλων των κυττάρων πάλλονται συγχρονισµένα έτσι ώστε όλη η αποικία περιστρέφεται κατά τη φορά των δεικτών του ρολογιού µε αποτέλεσµα να κινείται µέσα στο νερό. Mόνο µερικά κύτταρα είναι ικανά προς αναπαραγωγή και αυτά βρίσκονται στον οπίσθιο πόλο της αποικίας. Mερικά κύτταρα διπλασιάζονται αγενώς και παράγουν νέες αποικίες, ενώ άλλα παράγουν γαµέτες. Mετά τη γονιµοποίηση το ζυγωτό διαιρείται και παράγει θυγατρικές αποικίες. Aυτές αρχικά παραµένουν µε την µητρική και κατόπιν αποκόπτονται. 6) Ακτινόζωα και Τρηµατοφόρα (Radiolaria και Foraminifera) Tα Foraminifera και τα Radiolaria είναι κυρίως θαλάσσιες αµοιβάδες µε κέλυφος. Mερικά είδη απαντώνται και σε γλυκά νερά. Tα περισσότερα Foraminifera ζουν σε µεγάλα θαλάσσια βάθη ενώ τα Radiolaria βρίσκονται στην ανοικτή θάλασσα. Tα κελύφη των Foraminifera και οι σκελετοί των Radiolaria έχουν µοναδικά σχήµατα χαρακτηριστικά του είδους. Όσον αφορά τη σύσταση των κελυφών, αυτή είναι ασβεστολιθική στην περίπτωση των Τρηµατοφόρων και πυριτική στην περίπτωση των Ακτινοζώων. Ο ρόλος των τρηµατοφόρων είναι σηµαντικός στο σχηµατισµό των θαλάσσιων ιζηµάτων. Σε πολλές τροπικές περιοχές, η παραλιακή άµµος αποτελείται αποκλειστικά από κελύφη Τρηµατοφόρων. Οι πυραµίδες της Αιγύπτου οικοδοµήθηκαν µε ασβεστολιθικά πετρώµατα που σχηµατίσθηκαν από τα κελύφη µεγάλων τρηµατοφόρων.

21 - 21-8) Paramecium caudatum. Tο P. caudatum είναι ένα πρωτόζωο που περιβάλλεται από ελαστικό χιτινώδες περίβληµα που του δίνει συγκεκριµένο σχήµα. Kινείται µε τη βοήθεια βλεφαρίδων οι οποίες καλύπτουν όλη την εξωτερική του επιφάνεια. H πρόσληψη της τροφής γίνεται από το κυτταρόστοµα, ένα άνοιγµα δηλαδή του εξωτερικού περιβλήµατός του. H τροφή στη συνέχεια προχωρεί στον κυτταροφάρυγγα, στο άκρο του οποίου σχηµατίζονται πεπτικά κενοτόπια. Tα υπολείµατα της τροφής µετά την πέψη αποβάλλονται από ένα µικρό άνοιγµα την κυτταροπηγή. ιαθέτει δύο πυρήνες, τον µακροπυρήνα και τον µικροπυρήνα. Tο P. caudatum εµφανίζει αµφιγονικό τρόπο αναπαραγωγής. O µακροπυρήνας ρυθµίζει το µεταβολισµό του κυττάρου, ενώ ο µικροπυρήνας συµµετέχει στην αµφιγονική αναπαραγωγή. Σύµφωνα µε αυτόν τον τρόπο αναπαραγωγής, δύο άτοµα διαφορετικού φύλου ενώνονται µε τα κυτταροστόµατά τους και συνδέονται µε µια κυτταροπλασµατική γέφυρα. O µακροπυρήνας διαλύεται, ενώ ο µικροπυρήνας του καθενός µε µειωτική διαίρεση δίνει 4 απλοειδείς µικροπυρήνες. Aπό αυτούς, οι τρείς διαλύονται και ο τέταρτος δίνει µε µιτωτική διαίρεση 2 απλοειδείς. O ένας από τους δύο µικροπυρήνες του κάθε κυττάρου παραµένει στο κυτταρόπλασµα ενώ ο δεύτερος µεταναστεύει στο άλλο άτοµο όπου συντήκεται µε τον αντίστοιχο µικροπυρήνα του άλλου ατόµου σχηµατίζοντας έναν διπλοειδή πυρήνα. Oι δύο οργανισµοί τελικά αποχωρίζονται είναι όµως κατά το ήµισυ γενετικά ανανεωµένοι. Εικόνα 10. Το Paramecium caudatum όπως φαίνεται κάτω από το µικροσκόπιο

22 Σχόλια- Παρατηρήσεις-Συµπεράσµατα

23 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ AΣKHΣH 2 Ο ΠΥΡΗΝΑΣ ΕΙΝΑΙ ΤΟ ΠΙΟ ΕΥ ΙΑΚΡΙΤΟ ΟΡΓΑΝΙ ΙΟ ΤΟΥ ΕΥΚΑΡΥΩΤΡΙΚΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ. ΧΡΩΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΠΥΡΗΝΩΝ ΣΕ ΦΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ΖΩΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Εικόνα 1. Η ύπαρξη πυρήνα χαρακτηρίζει τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Πυρηνική χρώση σε επιθηλιακά κύτταρα. Όνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

24 Εισαγωγή Tα Eυκαρυωτικά κύτταρα διαφέρουν από τα Προκαρυωτικά όχι µόνο γιατί περιέχουν µεµβρανώδη οργανίδια στο κυτταρόπλασµά τους αλλά κυρίως γιατί το γενετικό τους υλικό περιέχεται σ έναν πυρήνα που ορίζεται από µια µεµβράνη. Εικόνα 2. Συγκριτική εικόνα ενός βακτηριακού ενός φυτικού και ενός ζωικού κυττάρου.

25 Με µικροσκοπική παρατήρηση µετά από χρώση ο πυρήνας είναι σαφώς το πιο ευδιάκριτο οργανίδιο των Eυκαρυωτικών κυττάρων. Στον πυρήνα εντοπίζεται το γενετικό υλικό των Ευκαρυωτικών κυττάρων,, µε µορφή δίκλωνων γραµµικών µορίων DNA. Tο DNA βρίσκεται πάντοτε συνδεδεµένο µε πρωτείνες που ονοµάζονται ιστόνες. Με τον τρόπο αυτό συγκροτούνται τα ινιδία της χρωµατίνης. Τα ινίδια αυτά είναι αποσυσπυρωµένα και συµπυκνώνονται µόνο κατά την φάση της κυτταρικής διαίρεσης την µίτωση. Όπως θα δούµε αναλυτικά σε επόµ µενη εργαστηριακή άσκηση τότε και µόνο τότε το DNA είναι ορατό µε τη µορφή του χρωµοσώµατος. Στο εσωτερικό του πυρήνα εντοπίζεται µια υπερµοριακή δοµή, ο πυρηνίσκος. Στον πυρηνίσκο πραγµατοποιείται η σύνθεση των rrna. O πυρήνας περιβάλλεται από διπλή µεµβράνη, το πυρηνικό περίβληµα (πυρηνικό φάκελο). H εσωτερική και εξωτερική µεµβράνη κατά τόπους συνδέονται µεταξύ τους σχηµατίζοντας τους πυρηνικούς πόρους. Oι πυρηνικοί πόροι χρησιµεύουν για την µετακίνηση µορίων µεταξύ κυτταροπλάσµατος και πυρήνα. Εικόνα 3. Τα χρωµοσώµ µατα ενός κυττάρου είναι ορατά µόνο κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης. Στο µεγαλύτερο µέρος της ζωής του κυττάρου το DNA υπάρχει συνδεδεµένο µε πρωτείνες µε τη µορφή λεπτών νηµατίων χρωµατίνης Ολοι οι ανώτεροι ευκαρυωτικοί οργανισµοί (φυτά και ζώα) ) αποτελούνται από κύτταρα που οµοιάζουν και ταυτόχρονα διαφέρουν µεταξύ τους. Στο επίπεδο του οργανισµού τα κύτταρα διαφοροποιούνται, προκριµένου να επιτελέσει το καθένα συγκεκριµένη λειτουργία,, µε δεδοµένο ότι υπάρχει σαφής καταµ µερισµός εργασίας. Υπάρχουν κύτταρα σε ένα φυτό, υπεύθυνα για την φωτοσύνθεση και είναι διαφορετικά από αυτά που µεταφέρουν τα θρεπτικά συστατικά στο σώµα του φυτού, ή από αυτά που συγκροτούν την επιδερµίδα που προστατεύει τους εσωτερικούς ιστούς του φυτού. Η διαφοροποίηση συνεπώς των κυττάρων είναι απαραίτητη για την συγκρότηση ενός οργανισµού. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα κάποιες γενικές κυτταρικές «ιδιότητες» να µην ισχύουν όταν αναφερόµαστε σε κύτταρα στο επίπεδο του οργανισµού. Για παράδειγµα, α) υπάρχουν κύτταρα χωρίς πυρήνα (ώριµα ερυθρά αιµοσφαίρια) ή κύτταρα µε περισσότερους από έναν πυρήνες (σκελετικοί µύες), β) υπάρχουν λειτουργικά κύτταρα σε φυτικούς ιστούς τα οποία είναι νεκρά (κύτταρα ξυλώµατος) και γ) υπάρχουν κύτταρα που δεν µπορούν να πολλαπλασιαστούν (νευρικά κύτταρα ζώων).

26 Β Α Γ Εικόνα 4.(Α) Arabidopsis thaliana, (Β) Drosophila melanogaster και (Γ) Homo sapiens. Ολοι αυτοί οι οργανισµοί αποτελούνται από κύτταρα µε όµοιες βιολογικές λειτουργίες Στη σηµερινή άσκηση θα µελετηθούν χαρακτηριστικοί κυτταρικοί τύποι, φυτικών και ζωικών οργανισµών και θα γίνει χρώση των πυρήνων τους. Tα φυτικά κύτταρα είναι τα πρώτα κύτταρα που έγιναν ορατά µετά από µικροσκοπική παρατήρηση. Συγκεκριµένα το 1665, ο Robert Hooke, ανακοίνωσε ότι εξέτασε στο µικροσκόπιο ένα κοµµάτι φελού και διαπίστωσε ότι αποτελείται από µια µάζα µικροσκοπικώv θαλάµων, τους οποίους ονόµασε κύτταρα (cells). O όρος κύτταρο επικράτησε στη διεθνή βιβλιογραφία, παρόλο που αργότερα διαπιστώθηκε ότι οι δοµές που περιγράφηκαν από τον R.Hooke, ήταν στην πραγµατικότητα τα κυτταρικά τοιχώµατα, που απέµειναν µετά τον κυτταρικό θάνατο. Tο

27 γεγονός ότι η πρώτη παρατήρηση κυττάρου αφορούσε φυτικά κύτταρα δεν ήταν τυχαία, σχετίζεται µε το µεγάλο µέγεθος των φυτικών κυττάρων. Τα φυτικά κύτταρα είναι πολύ µεγαλύτερα σε µέγεθος από τα ζωικά κύτταρα, γεγονός που τα καθιστά ποιό εύχρηστα κατά τη µικροσκοπική παρατήρηση. Εικόνα 5. Πρώιµη απεικόνιση φυτικού κυττάρου κατά τη διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης, από τον Eduard Strasburger το H δοµή τόσο του ζωικού όσο και του φυτικού κυττάρου είναι µια τυπική ευκαρυωτική δοµή µε ορισµένα επιπλέον δοµικά στοιχεία που πρέπει να επισηµάνουµε: Στα φυτικά κύτταρα υπάρχει παχύ τοίχωµα κυτταρίνης (και συχνά και δευτερογενές τοίχωµα λιγνίνης) που περιβάλει την κυτταρική µεµβράνη και προσδίδει στερεότητα και σχετική ακαµψία στο φυτικό κύτταρο. Αυτό είναι απαραίτητο γιατί ο κυτταροσκελετός του φυτικού κυττάρου δεν διαθέτει τα ενδιάµεσα ινίδια των ζωικών κυττάρων που προσδίδουν αντοχή σε δυνάµεις πίεσης που ασκούνται στο κύτταρο. Επιπλέον η διαφορά οσµωτικής πίεσης µεταξύ του εσωκυττάριου και του εξωκυττάριου περιβάλλοντος (πίεση σπαργής) καθιστά απαραίτητη την ύπαρξη του κυτταρικού τοιχώµατος στα φυτά. Οι ίνες της κυτταρίνης προσδίδουν εκτατική ισχύ στο κυτταρικό τοίχωµα των φυτικών κυττάρων επιτρέποντας µεταξύ των άλλων και την αύξησή τους. Μόνο στα φυτικά και όχι στα ζωικά κύτταρα απαντώνται πλαστίδια: χλωροπλάστες, χρωµοπλάστες και αµυλοπλάστες, οµές που σχετίζονται µε τη φωτοσύνθεση και την αποθήκευση των προιόντων της εντοπίζονται µόνο στα φυτικά κύτταρα. Ζωικά και φυτικά κύτταρα έχουν κενοτόπια. Στα φυτικά κύτταρα όµως µπορούν να καλύψουν µέχρι και το 90% του κυτταρικού όγκου. Πρόκειται για υδαρή έγκλειστα που περιβάλλονται από τον τονοπλάστη και η αύξηση του µεγέθους τους επιτρέπει την καθ ύψος ανάπτυξη των φυτών. Στα ζωικά κύτταρα δεν επιτελούν τέτοιο ρόλο και δεν έχουν αξιόλογο µέγεθος. Οι κυριότεροι τύποι φυτικών κυττάρων είναι τα επιδερµικά κύτταρα που παρέχουν προστασία στους υποκείµενους ιστούς, τα παρεγχυµατικά κύτταρα που επιτελούν κυρίως λειτουργίες θρέψης,µεταβολισµού, αποθήκευσης (πχ περιέχουν χλωροφύλλες και φωτοσυνθέτουν), τα κολεγχυµατικά και τα σκηρεγχυµατικά (στηρικτικά κύτταρα) οι τραχεϊδες τα αγγεία και οι ηθµοσωλήνες που εξυπηρετούν ανάγκες κυκλοφορίες νερού και ουσιών αλλά και µηχανικούς σκοπούς. Η ποικιλοµορφία των κυττάρων που απαντώνται στους ζωικούς οργανισµούς είναι σαφώς µεγαλύτερη σε σχέση µε αυτή των ζωικών οργανισµών.στο ανθρώπινο σώµα για παράδειγµα έχουν ταυτοποιηθεί πάνω από 200 τύποι κυττάρων. Οι πιο αντιπροσωπευτικοί κυτταρικοί τύποι είναι τα επιθηλιακά κύτταρα µε

28 ευρύ φάσµα λειτουργιών (προστασία, έκκριση, ανίχνευση σηµάτων κ.α.) οι ινοβλάστες οι οστεοβλάστες, τα λιποκύτταρα τα νευρικά κύτταρα, τα µυικά κύτταρα, τα βλαστικά κύτταρα τα κύτταρα του αίµατος κ.α. Eργαστηριακός Eξοπλισµός Mικροσκόπια, Aντικειµενοφόροι, καλυπτρίδες, λαβίδες Yλικά και διαλύµατα H 2 O οξική ορκεΐνη βολβοί κρεµµυδιού φύλλα διαφόρων φυτών Eργαστηριακό Πρωτόκολλο Παρασκεύασµα από Επιδερµίδα βολβών κρεµµυδιού 1. Aφαιρέστε µε ιδιαίτερη προσοχή την επιδερµίδα βολβών κρεµµυδιού σύµφωνα µε τις οδηγίες. Kόψτε µε την βοήθεια νυστεριού σε µικρά τµήµατα. Eπιστρώστε το παρασκεύασµα σε αντικειµενοφόρος πλάκα, όπου έχετε βάλει µια σταγόνα H 2 O. Kαλύψτε το δείγµα σας µε καλυπτρίδα. Παρατηρήστε στο µικροσκόπιο. Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας. 2. Προσθέστε στο παρασκεύασµά σας µε πιπέτα Pasteur οξική ορκεΐνη. Παρατηρήστε στο µικροσκόπιο. Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας. Tι διαφορά παρατηρείτε σε σχέση µε το προηγούµενο παρασκεύασµα;

29 Παρασκεύασµα από Επιδερµίδα φύλλου 3. Σχίστε ένα φύλλο και αποκολλήστε την επιδερµίδα. Kόψτε µε προσοχή ένα κοµµάτι της επιδερµίδας και τοποθετείστε την στην αντικειµενοφόρο πλάκα όπου έχετε προσθέσει από πριν µια σταγόνα H 2 O. Kαλύψτε το δείγµα σας µε καλυπτρίδα. Παρατηρήστε στο µικροσκόπιο. Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας. 4. Προσθέστε στο παρασκεύασµατά σας µε πιπέτα Pasteur οξική ορκεΐνη. Παρατηρήστε στο µικροσκόπιο. Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας. Tι διαφορά παρατηρείτε σε σχέση µε τα προηγούµενα παρασκεύασµατα; Εικόνα 6. Μικροσκοπική εικόνα επιδερµίδας φύλλου. Η χρώση του DNA µας βοηθάει να «δούµε» τον πυρήνα του κυττάρου.

30 Παρασκεύασµα από επιθηλιακά κύτταρα της στοµατικής σας κοιλότητας 5.Απαλά ξύστε το στόµα σας χρησιµοποιώντας τα δόντια και τη γλώσσα σας για 30 sec. Εκχύστε ελάχιστη ποσότητα από το σάλιο σας σε αντικειµενοφόρο πλάκα και καλύψτε µε καλυπτρίδα. Παρατηρήστε στο µικροσκόπιο. Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας 6. Προσθέστε στο παρασκεύασµατά σας µε πιπέτα Pasteur οξική ορκεΐνη. Παρατηρήστε στο µικροσκόπιο. Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας. Tι διαφορά παρατηρείτε σε σχέση µε τα προηγούµενα παρασκεύασµατα

31 Ετοιµο παρασκεύασµα από κύτταρα του αίµατος Στο αίµα θα συναντήσουµε πολύ διαφορετικά µεταξύ τους κύτταρα που επιτελούν και διαφορετική λειτουργία. Χωρίζονται σε δύο βασικές κατηγορίες στα ερυθροκύτταρα που είναι απύρηνα κύτταρα υπεύθυνα για τη µεταφορά οξυγόνου, και στα λευκοκύτταρα που είναι εµπύρηνα κύτταρα µε διάφορες λειτουργίες: λεµφοκύτταρα (Τ και Β) υπεύθυνα για την ανοσολογική απόκριση του οργανισµού, µακροφάγα, ουδετερόφιλα για την καταστροφή βακτηρίων κ. Παρατηρείστε στο µικροσκόπιο και σκιαγραφείστε στις σηµειώσεις τους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. 8. Ετοιµο παρασκεύασµα από τοµή ήπατος. Παρατηρείστε στο µικροσκόπιο και σκιαγραφείστε στις σηµειώσεις τους. Πόσους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους παρατηρείται;

32 Συµπεράσµατα-Σχόλια-Παρατηρήσεις

33 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 3 ΤΟ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΟΜΗΣ ΤΟΥ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ Α Β Εικόνα 1. Α Μορφολογία των προκαρυωτικών κυττάρων. Κόκκοι, βάκιλλοι και σπειρύλια. Β. Χαρακτηριστικά είδη βακτηρίων από πάνω προς τα κάτω: Staphylococcus aureus (x1000), Bacillus megaterium (x600), Spirillum volutans (x400). Όνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

34 Eισαγωγή στο Προκαρυωτικό κύτταρο i) Σχήµα και Mέγεθος του προκαρυωτικού κυττάρου. Τα προκαρυωτικά κύτταρα συγκροτούν ένα πολυπληθές και εξαιρετικά ποικιλόµορφο βασίλειο, αυτό των βακτηρίων. Από άποψη µορφολογίας Tα Bακτήρια έχουν σχήµα σφαιρικό ραβδοειδές ή σπειροειδές.. Aυτά που έχουν σφαιρικό σχήµα ονοµάζονται Kόκκοι (Cocci). Yπάρχουν µε τη µορφή µεµονωµένων κυττάρων ή κυττάρων συνδεδεµένων µεταξύ τους. O τρόπος µε τον οποίο βρίσκονται συνδεδεµένα τα κύτταρα αυτά µας βοηθάει πολλές φορές να αναγνωρίσουµε το συγκεκριµένο είδος. Για παράδειγµα στα γένη Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, τα κύτταρα µετά τη διαίρεση παραµένουν συνδεδεµένα µεταξύ τους σχηµατίζοντας µακριές αλυσίδες. Στο γένος Neisseria, οι κόκκοι παραµένουν συνδεδεµένοι σε ζεύγη µετά την διαίρεση (Diplococci). H άλλη µεγάλη κατηγορία Bακτηρίων περιλαµβάνει Bακτηριακά κύτταρα σε σχήµα ράβδου. Aυτά τα βακτηριακά κύτταρα ονοµάζονται Bάκιλλοι (Bacilli). Kαι στη περίπτωση των Bακίλλων τα κύτταρα µπορεί να είναι µονήρη ή µετά τον διπλασιασµό να παραµένουν συνδεδεµένα σχηµατίζοντας αλυσίδες. Τέλος πολλά Bακτήρια έχουν µορφή ράβδου περιεστραµµένης µε µορφή σπείρας ή έλικας. Eίναι τα Bακτήρια που αναφέρονται ως Σπειρύλια (Spirilia) και Σπειροχαίτες (Spirochetes) αντίστοιχα. Στα Bακτήρια λοιπόν, µπορούµε να συναντήσουµε µια µεγάλη ποικιλία σχηµάτων αν και τα περισσότερα από αυτά είναι σφαιροειδή ή ραβδοειδή. Tα Bακτήρια διαφέρουν ως προς το µέγεθος. Tα µικρότερα από αυτά (µερικά είδη του γένους Mycoplasma) έχουν διάµετρο nm. H Escherichia coli, ένας Bάκιλλος, έχει µέγεθος µm πλάτος και 2-6 µm µήκος. Mερικές σπειροχαίτες περιστασιακά φτάνουν και τα 500 µm µήκος. ii) Oργάνωση του προκαρυωτικού κυττάρου. Σε γενικές γραµµές η οργάνωση του προκαρυωτικού κυττάρου θεωρείται απλούστερη από αυτή του ευκαρυωτικού. Παρόλα αυτά, µία ποικιλία δοµών εµφανίζεται και στο Προκαρυωτικό κύτταρο, ιδιαίτερα εάν αυτό παρατηρηθεί µε ισχυρό µικροσκόπιο. α. H κυτταροπλασµατική µεµβράνη. Όπως σε όλους τους οργανισµούς µε κυτταρική δοµή, η κυτταροπλασµατική µεµβράνη είναι αυτή που περιβάλλει το κυτταρόπλασµα και µε τις ιδιότητές της επιτρέπει την επικοινωνία µεταξύ κυτταροπλάσµατος και εξωτερικού περιβάλλοντος. H κυτταρική µεµβράνη έχει εκλεκτική διαπερατότητα, επιτρέπει την είσοδο των θρεπτικών συστατικών και διαµέσου αυτής εξέρχονται τα άχρηστα προϊόντα του µεταβολισµού. Eπειδή τα Bακτήρια EN διαθέτουν τυπικά ενδοκυτταρικά οργανίδια, όλες οι λειτουργίες που στα Eυκαρυωτικά κύτταρα πραγµατοποιούνται στα οργανίδια αυτά, στα Bακτήρια πραγµατοποιούνται σε αναδιπλώσεις της κυτταρικής µεµβράνης. Έτσι λοιπόν, σε αναδιπλώσεις της κυτταρικής µεµβράνης πραγµατοποιείται η αναπνοή (σε όλα τα Bακτήρια) και η φωτοσύνθεση (στα αυτότροφα φωτοσυνθετικά Bακτήρια). β. Tο κυτταρόπλασµα Στο κυτταρόπλασµα των προκαρυωτικών κυττάρων EN υπάρχουν οργανίδια. Yπάρχει όµως µια ποικιλία συσσωµατωµάτων που αναφέρονται µε τον γενικό όρο Kυτταροπλασµατικά Έγκλειστα (inclusion bodies). Tέτοια έγκλειστα, µπορεί να περιέχουν Γλυκογόνο ή/και Πολυ - β - υδροξυβουτυρικό (PHB) ως αποθήκες ενέργειας. Στα

35 Kυανοβακτήρια (φωτοσυνθετικά αυτότροφα) υπάρχουν δύο ειδών έγκλειστα. Tα συσσωµατώµατα κυανοφυκίνης (Cyanophycin granules) ως αποθήκες αζώτου και τα καρβοξυσώµατα (Carboxysomes) τα οποία σχετίζονται µε την καθήλωση του CO2. Eπίσης σε πολλά Kυανοβακτήρια υπάρχει ένα κενοτόπιο αερίων. Tα Bακτήρια αυτά επιπλέουν κοντά στην επιφάνεια των υδάτων και τα κενοτόπια αερίων τους δίνουν αυτή τη δυνατότητα. Στο κυτταρόπλασµα των Bακτηριακών κυττάρων υπάρχουν διάσπαρτα ριβοσώµατα. Πολλά ριβοσώµατα είναι επίσης προσκολληµένα στην κυτταρική µεµβράνη. Tα Bακτηριακά ριβοσώµατα είναι µικρότερα από τα ριβοσώµατα των Eυκαρυωτικών κυττάρων. Aναφέρονται συνήθως ως 70S ριβοσώµατα. Aποτελούνται από δύο υποµονάδες, την µεγάλη (50S) και τη µικρή (30S). Μεσόσωµα Πυρηνοειδές Ριβόσωµα Κυτταρ. Εγκλειστα Κάψα Μαστίγιο Πρωτείνες επιφάνειας Κυτταρικό τοίχωµα Περιπλασµατικός χώρος Πλασµατική µεµβράνη Εικόνα 2. Σχηµατική απεικόνιση της δοµής του προκαρυωτικού κυττάρου. γ. Tο πυρηνοειδές H πιο σηµαντική διαφορά µεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων είναι ο τρόπος µε τον οποίο πακετάρεται το γενετικό τους υλικό. Στα προκαρυωτικά κύτταρα δεν υπάρχει πυρηνική µεµβράνη. Tο προκαρυωτικό χρωµόσωµα είναι σχεδόν πάντα ένα µόριο κυκλικού δίκλωνου DNA. Tο DNA πακετάρεται µε τη βοήθεια πρωτεϊνών οι οποίες είναι διαφορετικές από τις ιστόνες των ευκαρυωτικών. To Bακτηριακό DNA (βακτηριακό χρωµόσωµα) εντοπίζεται σε µια ακανόνιστη περιοχή του κυτταροπλάσµατος, η οποία ονοµάζεται πυρηνοειδές. Mελέτες µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο έχουν δείξει σύνδεση του πυρηνοειδούς µε την κυτταρική µεµβράνη. H κυτταρική µεµβράνη πιθανόν να εµπλέκεται στο διαχωρισµό των δύο θυγατρικών µορίων κατά την κυτταρική διαίρεση. Σε ορισµένα Bακτήρια υπάρχουν και µικρά κυκλικά µόρια δίκλωνου DNA, τα πλασµίδια. Tα µόρια αυτά διπλασιάζονται ανεξάρτητα από το διπλασιασµό του βακτηριακού χρωµοσώµατος και έτσι σε κάθε κύτταρο µπορούν να υπάρξουν σε πολλαπλά αντίγραφα. Στα πλασµίδια εντοπίζονται γονίδια που καθιστούν τα βακτήρια ανθεκτικά στα

36 αντιβιοτικά, τους προσδίδουν νέες µεταβολικές ιδιότητες, τα καθιστούν παθογόνα ή ακόµη τους δίνουν τη δυνατότητα ανταλλαγής γενετικού υλικού µεταξύ βακτηρίων. Tα πλασµίδια σε πολλές περιπτώσεις µπορεί να ενσωµατωθούν στο βακτηριακό χρωµόσωµα. δ. Tο Bακτηριακό κυτταρικό τοίχωµα Tο κυτταρικό τοίχωµα των βακτηρίων είναι ένα από τα σηµαντικότερα τµήµατα του βακτηριακού κυττάρου για πολλούς λόγους. Tα κυτταρικά τοιχώµατα πολλών παθογόνων βακτηρίων περιέχουν συστατικά που σχετίζονται µε την παθογένειά τους. Tο κυτταρικό τοίχωµα προστατεύει τα βακτήρια από διάφορες τοξικές ουσίες και είναι επίσης ο στόχος δράσης πολλών αντιβιοτικών. Tα βακτήρια ανάλογα µε τη δοµή του τοιχώµατος διακρίνονται σε Gram θετικά και Gram αρνητικά. Tα Gram θετικά έχουν ένα οµογενές παχύ κυτταρικό τοίχωµα που αποτελείται από πεπτιδογλυκάνες ή µουρεΐνη. Tα Gram αρνητικά βακτήρια έχουν αρκετά σύνθετο κυτταρικό τοίχωµα. Συγκεκριµένα στα βακτήρια αυτά υπάρχει ένα στρώµα πεπτιδογλυκάνης που περιβάλλει την κυτταρική µεµβράνη, το οποίο µε τη σειρά του περιβάλλεται από µια µεµβράνη, την εξωτερική µεµβράνη. O χώρος µεταξύ της κυτταρικής µεµβράνης και της εξωτερικής µεµβράνης στα Gram αρνητικά βακτήρια και ο χώρος µεταξύ της κυτταρικής µεµβράνης και του κυτταρικού τοιχώµατος στα Gram θετικά βακτήρια ονοµάζεται περιπλασµικός χώρος. Πεπτιδογλυκάνες Κυτταροπλασµατική µεµβράνη Εξωτερική µεµβράνη Πεπτιδογλυκάνες Κυτταροπλασµατική µεµβράνη Περιπλασµικός χώρος Εικόνα 3. οµή κυτταρικού τοιχώµατος σε Gram + και Gram Βακτήρια αντίστοιχα. Τελός αρκετά βακτήρια διαθέτουν επιπλέον δοµές εξωτερικά του κυτταρικού τοιχώµατος, όπως κάψα, βλεφαρίδες, µαστίγια. Τα Βακτήρια θεωρούνται οι απλούστεροι οργανισµοί στη Γη. Πράγµατι, το µέγεθός τους, το µήκος του γενετικού τους υλικού, η απουσία τυπικής πολυκυτταρικής οργάνωσης είναι τα στοιχεία που υποστηρίζουν την άποψη αυτή. Σε αντίθεση όµως µε τα παραπάνω, δεν πρέπει να διαφύγει της προσοχής µας ότι τα Βακτήρια βρίσκονται παντού, έχοντας αποικίσει κάθε σηµείο του πλανήτη από τις ψυχρότερες και πιο αφιλόξενες περιοχές για όλες τις άλλες µορφές ζωής µέχρι και τις πιο

37 θερµές και άνυδρες ερήµους. Μεταβολισµός των βακτηρίων Στα βακτήρια εµφανίζεται όλη η γνωστή ποικιλία τύπων θρέψης που παρατηρείται στα έµβια όντα της Γης. Ενώ λοιπόν όλα τα ζώα είναι ετερότροφοι οργανισµοί, όλα τα φυτά αυτότροφοι οργανισµοί, υπάρχουν βακτήρια που είναι ετερότροφα αλλά και βακτήρια που είναι αυτότροφα. Βέβαια όταν λέµε ότι κάποια βακτήρια είναι ετερότροφα δεν εννοούµε ότι τρέφονται µε τη βρώση άλλων οργανισµών. Εννοούµε ότι προσλαµβάνουν µικρές σε µέγεθος οργανικές ενώσεις από το περιβάλλον. Τα αυτότροφα βακτήρια απ την άλλη έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί σε αυτά δεν ανήκουν µόνο αυτά που φωτοσυνθέτουν µε παρόµοιο τρόπο όπως τα φυτά (κυανοβακτήρια) αλλά και αυτά που χηµειοσυνθέτουν. Η χηµειοσύνθεση είναι µια µέθοδος σύνθεσης οργανικών ενώσεων χρησιµοποιώντας ενέργεια που απελευθερώνεται κατά την οξείδωση οργανικών ή και ανόργανων ενώσεων. Η µέθοδος αυτή σύνθεσης οργανικών ενώσεων είναι αποκλειστικό χαρακτηριστικό του βασιλείου των βακτηρίων. Tο σηµαντικό µε τη χηµειοσύνθεση είναι ότι παρέχει ανεξαρτησία από πηγές ενέργειας όπως ο Ήλιος. Ενώ λοιπόν τα οικοσυστήµατα της χέρσου και των επιφανειακών υδάτων θαλασσών και λιµνών βασίζονται αποκλειστικά στην ενέργεια του Ήλιου για να διατηρηθούν, τα οικοσυστήµατα του πυθµένα των βαθύτερων θαλασσών εκεί όπου η ενέργεια του Ήλιου δεν µπορεί να φτάσει, βασίζουν την ύπαρξή τους στα χηµειοσυνθετικά βακτήρια. Ένα άλλο βασικό χαρακτηριστικό των βακτηρίων είναι οι διαφορετικές απαιτήσεις τους σε οξυγόνο. Σχεδόν όλοι οι ανώτεροι οργανισµοί είναι πλήρως εξαρτώµενοι από το ατµοσφαιρικό οξυγόνο για την ανάπτυξή τους, είναι δηλαδή υποχρεωτικά αερόβιοι. Τα βακτήρια µπορεί να είναι υποχρεωτικά αερόβια, αλλά και υποχρεωτικά αναερόβια όταν το οξυγόνο είναι τοξικό για αυτά. Μεταξύ αυτών των δύο άκρων υπάρχουν βακτήρια προαιρετικά αναερόβια τα οποία δεν απαιτούν οξυγόνο για την ανάπτυξή τους αλλά µεγαλώνουν καλύτερα παρουσία οξυγόνου. Τέλος υπάρχουν αναερόβια βακτήρια τα οποία µεγαλώνουν το ίδιο καλά είτε παρουσία είτε απουσία οξυγόνου, και µικροαερόφιλα βακτήρια που απαιτούν µικρές συγκεντρώσεις οξυγόνου 2 10%. Για πολλά χρόνια τα βακτήρια ήταν γνωστά µόνο εξαιτίας των ασθενειών που προκαλούσαν και εξακολουθούν να προκαλούν στον άνθρωπο, τα ζώα και τα φυτά. Εάν προσθέσουµε και τη γνώση ότι σε βακτήρια οφείλονταν γνωστές χρήσιµες για τον άνθρωπο ζυµώσεις, όπως η µετατροπή του γάλακτος σε τυρί ή η µετατροπή του κρασιού σε ξύδι, δεν υπήρχε τίποτε άλλο αξιόλογο να αναφερθεί. Σήµερα, µε τις γνώσεις που αποκτήσαµε σχετικά µε τις δοµικές και µεταβολικές προσαρµογές των βακτηρίων, πιστεύουµε ότι µε τη µελέτη τους θα µπορέσουµε να δώσουµε ίσως απάντηση στο ερώτηµα της εµφάνισης της ζωής. Τα κυανοβακτήρια είναι πιθανόν από τις πρώτες πετυχηµένες µορφές ζωής στον πλανήτη, που υπάρχουν µέχρι σήµερα. Ο ρόλος τους στον εµπλουτισµό της αρχέγονης ατµόσφαιρας της γης µε οξυγόνο θεωρείται κοµβικό σηµείο στην εξέλιξη της ζωής.

38 Τέλος δεν πρέπει να ξεχνάµε πως µια µέχρι πρόσφαταα θεωρούµενη ως υποκατηγορία βακτηρίων,, τα Αρχαιοβακτήρια σήµερα συγκροτούν µια ξεχωριστή επικράτεια της ζωής αυτή των Αρχαίων. Πρόκειται για προκαρυωτικούς οργανισµούς που όµως φυλογενετικά είναι πιο κοντά στα Ευκάρυα παρά στα Βακτήρια. Εικόνα 4. Το Βακτήριο Rhizobium leguminosarum µε τα δύο χαρακτηριστικά του µαστίγια (x14.000) ύο µόνο γένη βακτηρίων (Rhizobium και Azotobacter) είναι ικανά να συντηρούν τη χερσαία ζωή µιας και είναι οι µόνοι χερσαίοι οργανισµοί µε δυνατότητα δέσµευσης του ατµοσφαιρικού αζώτου και µετατροπής του σε προσλήψιµες απ ο τα φυτά µορφές. Στα υδάτινα οικοσυστήµατα το ρόλο αυτό έχουν αναλάβει τα Κυανοβακτήρια. Τα Κυανοβακτήρια επίσης, µε την ικανότητα φωτοσύνθεσης εµπλουτίζουν τα υδάτινα οικοσυστήµατα µε οξυγόνο, οι πρόγονοί τους δε θεωρούνται υπεύθυνοι για τον εµπλουτισµό της αρχέγονης Γήινης ατµόσφαιρας σε οξυγόνο. Εικόνα 5. Κυανοβακτήριο Nostoc µε τις χαρακτηριστικές του ετεροκύστεις.

39 Η βιοτεχνολογική επανάσταση ξεκίνησε τόσο µε την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασµένου DNA, όσο και µε την ανάπτυξη τεχνικών ελεγχόµενης καλλιέργειας βακτηρίων. Το βακτήριο E.coli είναι το πιο χρήσιµο βακτήριο στη βιοτεχνολογία. Το Agrobacterium tumefaciens µας έδωσε τη δυνατότητα να παράγουµε γενετικά τροποποιηµένα φυτά. Είδη του γένους Pseudomonas χρησιµοποιούνται στην αποικοδόµηση πετρελαιοκηλίδων. Πολλά βακτήρια παράγουν αντιβιοτικά, χρήσιµα στην καταπολέµηση άλλων παθογόνων βακτηρίων. Aυτές είναι µόνο µερικές από τις σηµερινές εφαρµογές που βασίζονται στη χρήση βακτηρίων. Οι µελλοντικές εφαρµογές σίγουρα θα είναι πολύ περισσότερες και ίσως πιο εντυπωσιακές. Eργαστηριακός εξοπλισµός Mικροσκόπια Yλικά Μονιµοποιηµένα και χρωµατισµένα κατά Gram παρασκευάσµατα αντιπροσωπευτικών βακτηρίων. Eργαστηριακό πρωτόκολλο Παρατηρήστε και σχεδιάστε τις µορφές και τα χαρακτηριστικά αντιπροσωπευτικών βακτηριακών ειδών.

40 Τα Αποτελέσµατά σας 1) Escherichia coli (E.coli) To Bακτήριο αυτό είναι ένα από τα πιο καλά µελετηµένα βακτήρια. Xρησιµοποιείται ως πειραµατικός οργανισµός από πάρα πολλούς ερευνητές και είναι το πιο χρήσιµο βακτήριο στη Bιοτεχνολογία. Έχει µορφή ράβδου και ανήκει στην οικογένεια των Eντεροβακτηρίων (Enterobacteriaceae). Είναι αρνητικό κατά Gram βακτήριο. H E.coli είναι ένας συµβιωτικός οργανισµός και εντοπίζεται σε τεράστιους αριθµούς στο κόλον του ανθρώπου και άλλων θερµόαιµων ζώων. Eξαιτίας του εντοπισµού του στο κόλον πολλές φορές αναφέρεται στην µη επιστηµονική βιβλιογραφία ως κολοβακτηρίδιο. Mερικά στελέχη του βακτηρίου E.coli προκαλούν γαστρεντερίτιδα ή ουρολοιµώξεις. H ύπαρξη βακτηρίων E.coli σε πόσιµα νερά είναι δείκτης µόλυνσης των νερών από λύµατα και ανθρωπογενούς ή/και ζωικής προελεύσεως.. Εικόνα 6. Μορφολογια της Ε.coli, (Gram -) όπως φαίνεται κάτω από το µικροσκόπιο µετά από χρώση κατά Gram. 2) Streptococcus pneumoniae (παλαιότερη ονοµασία: Diplococcus pneumoniae). O S. pneumoniae είναι ένα θετικό κατά Gram βακτήριο το οποίο εµφανίζεται µε µορφή ζευγών κυττάρων, όταν καλλιεργηθεί σε υγρό θρεπτικό µέσο. Τα κύτταρα αυτά έχουν τη µορφή κόκκων. O S. pneumoniae είναι παθογόνος µικροοργανισµός µόνο όταν εξωτερικά του κυτταρικού τοιχώµατος φέρει και κάψα. Eντοπίζεται φυσιολογικά στην στοµατική κοιλότητα και την αναπνευστική οδό. Μπορεί να προκαλέσει πνευµονία σε άτοµα εξασθενηµένα από ιικές µολύνσεις της αναπνευστικής οδού, ή σε περιπτώσεις ατόµων µε τραύµατα στην αναπνευστική οδό, καπνιστές, αλκοολικούς και διαβητικούς.

41 - 41-3) Staphylococcus aureus Tο βακτήριο αυτό ανήκει στην οικογένεια Micrococcaceae η οποία περιλαµβάνει δύο γένη, το γένος Micrococcus και το γένος Staphylococcus. O S. aureus είναι ένας κατά Gram θετικός κόκκος, προαιρετικά αναερόβιος, χωρίς τη δυνατότητα κίνησης. Oι κόκκοι µετά τον πολλαπλασιασµό τους παραµένουν µεταξύ τους συνδεδεµένοι σχηµατίζοντας ακανόνιστα στη δοµή συσσωµατώµατα. Tα διάφορα είδη Σταφυλοκόκκων είναι υπεύθυνα για πολλές ανθρώπινες ασθένειες. Iδιαίτερα ο S. aureus είναι το σηµαντικότερο ανθρώπινο παθογόνο της οικογένειας. Προκαλεί, αποστήµατα, µολύνσεις των τραυµάτων, πνευµονία, τοξικά σύνδροµα κ.α. Aποτελεί επίσης αίτιο πολλών τροφικών δηλητηριάσεων. 4) Βacillus megaterium Χαρακτηριστική περίπτωση ραβδόµορφου βακτηρίου. Σχηµατίζει µακρυά ινίδια από κύτταρα συνδεδεµένα µεταξύ τους. Είναι θετικό κατά Gram. Όταν βρεθεί σε αντίξοες συνθήκες περιβάλλοντος σχηµατίζει ενδοσπόρια. Εικόνα 7. Μορφολογία του Βacillus megaterium. (Gram +) όπως φαίνεται κάτω από το µικροσκόπιο µετά από χρώση κατά Gram.

42 - 42-5) Spirillium serpens Tο βακτήριο αυτό έχει χαρακτηριστική µορφή σπειρυλίου. Έχει ικανότητα κίνησης µε µαστίγια τα οποία εντοπίζονται και στους δύο πόλους του κυττάρου. Eίναι αερόβιο, απαιτεί όµως µικρή συγκέντρωση οξυγόνου 2-3 % (µικροαερόφιλο, microaerophilic). Zεί σε λιµνάζοντα ύδατα. 6) Rhizobium leguminosarum Ένα από τα πιο σηµαντικά βακτήρια για τη διατήρηση της ζωής στη Γη. Tο Rhizobium και το Azotobacter είναι τα βακτήρια στα οποία οφείλεται η καθήλωση του ατµοσφαιρικού αζώτου (αζωτοδεσµευτικά βακτήρια) και η µετατροπή του σε µορφή προσλήψιµη από τα φυτά. Tο Rhizobium έχει ραβδοειδή µορφή και κινείται µε µαστίγια. Συµβιώνει µέσα στα κύτταρα των κονδύλων της ρίζας των ψυχανθών (legumes). 7) Azotobacter chroococcum Σε αντίθεση µε το Rhizobium, το Azotobacter είναι ένα γένος αζωτοδεσµευτικών βακτηρίων που πολλαπλασιάζεται ελεύθερα στο έδαφος. Είναι ραβδόµορφα Gram αρνητικά βακτήρια. Τα βακτήρια αυτά εντοπίζονται σε ζευγάρια ή συσσωµατώµατα. Σε πολλές περιπτώσεις σχηµατίζουν µακριές αλυσίδες.

43 - 43-8) Agrobacterium tumerfaciens Ραβδόµορφο, Gram αρνητικό βακτήριο. Όταν µολύνει τα φυτά, προκαλεί σε αυτά το σχηµατισµό κάλλων, µορφών δηλαδή που µοιάζουν µε όγκους. Η ικανότητα των βακτηρίων να προκαλούν σχηµατισµό κάλλων στα φυτά οφείλεται στην ύπαρξη ενός πλασµιδίου που ονοµάζεται πλασµίδιο Ti (Tumor inducing). To πλασµίδιο αυτό µπορεί να τροποποιηθεί και να χρησιµοποιηθεί για τη µεταφορά νέων γενετικών χαρακτηριστικών στα φυτά. Εικόνα 8. Μορφολογία του Agrobacterium tumerfaciens (Gram -)όπως φαίνεται κάτω από το µικροσκόπιο µετά από χρώση κατά Gram.

44 Συµπεράσµατα-Σχόλια-Παρατηρήσεις

45 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΓΙΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΣΤΕΡΕΗΣ ΦΑΣΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠO ΦΥΣΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ ΥΠΟ ΑΣΗΠΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ Εικόνα 1. Ανάπτυξη µικροοργανισµών του εδάφους σε στερεό θρεπτικό υλικό Oνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

46 Eισαγωγή στην ανάπτυξη κυττάρων σε εργαστηριακές συνθήκες Η σταθερή παροχή βιολογικού υλικού είναι απαραίτητη παράµετρος «επιβίωσης» για την εργαστηριακή έρευνα. Η ανάγκη αυτή οδήγησε στις καλλιέργειες κυττάρων σε εργαστηριακές συνθήκες, ώστε να υπάρχει διαθέσιµη η πρώτη ύλη εν αφθονία O όρος «καλλιέργεια» όταν χρησιµοποιείται για τους ευκαρυωτικούς ή τους προκαρυωτικούς οργανισµούς εµπεριέχει και µε την έννοια του κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Συνεπώς, όταν µιλάµε για καλλιέργεις κυττάρων στο εργαστήριο εννοούµε την ανάπτυξη των κυττάρων ή των οργανισµών σε απόλυτα ελεγχόµενες συνθήκες εργαστηρίου που µας δίνουν την δυνατότητα για µια συνεχή παροχή βιολογικού υλικού για τις µελέτες µας. O χειρισµός όλων των βιολογικών υλικών (προκαρυωτικά ή ευκαρυωτικά κύτταρα, αίµα, βιολογικά υγρά) συνήθως απαιτεί ασηπτικές συνθήκες εργασίας. Στόχος των ασηπτικών συνθηκών που εφαρµόζονται είναι η αποφυγή µολύνσεων, του προς µελέτη βιολογικού υλικού από εξωγενείς παράγοντες. Σε όλες τις περιπτώσεις είναι επίσης αναγκαία η παροχή θρεπτικών συστατικών που είναι απαιραίτητα για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων. Η ανάγκη αυτή εξυπηρετείται µε την καταλληλη χρήση θρεπτικών υλικών, που ουσιαστικά αποτελούν την τροφή των καλλιεργιών µας. Για την καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων συνήθως απαιτούνται και εξειδικευµένοι χώροι εργασίας. Για παράδειγµα οι καλλιέργειες κυτταρικών σειρών που αποτελούν το κατεξοχήν κυτταρικό µοντέλο για µελέτες βιοχηµικές, µοριακές, ανοσολογικές γίνονται σε εξειδικευµένους χώρους που ονοµάζονται δωµάτια κυτταρικής καλλιέργειας. Οι χώροι αυτοί φέρουν κατάλληλο εξοπλισµό. Θάλαµο νηµατικής ροής για την ελαχιστοποίηση των µολύνσεων, επωαστικούς κλιβάνους µε σταθερή παροχή CO2 για την ανάπτυξη των κυττάρων σε σταθερό ph κ.α. Aντίθετα οι καλλιέργειες βακτηρίων µπορούν να πραγµατοποιηθούν υπό ασηπτικές συνθήκες, και σε περιβάλλον δωµατίου. Στη σηµερινή άσκηση όπως και σε αυτές που θα ακολουθήσουν οι µικροοργανισµοί που θα χρησιµοποιηθούν, είτε προέρχονται από φυσικές πηγές είτε πρόκειται για εργαστηριακά στελέχη δεν είναι παθογόνοι για τον άνθρωπο. Σκοπός της άσκησης είναι να µάθετε να εργάζεστε υπό ασηπτικές συνθήκες προκειµένου: α. να παρασκευάσετε θρεπτικά υλικά υγρής και στερεής φάσης για την ανάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων. β. να αναπτύξετε καλλιέργειες προκαρυωτικών κυττάρων. γ. να κάνετε έλεγχο της µικροβιακής χλωρίδας των χεριών σας H άσκηση αυτή είναι προπαρασκευαστική για τις επόµενες ασκήσεις. Θα σας καταστήσει ικανούς σε χειρισµούς που σχετίζονται µε την καλλιέργεια οποιουδήποτε προκαρυωτικού οργανισµού.

47 Εισαγωγή στη Βακτηριακή θρέψη Η ανάλυση της σύνθεσης του µικροβιακού κυττάρου έδειξε ότι, το 97% του ξηρού του βάρους αποτελείται από λίγα µόνο στοιχεία: Άνθρακα, Οξυγόνο, Υδρογόνο, Άζωτο, Θείο, Φώσφορο, Κάλιο, Ασβέστιο, Μαγνήσιο και Σίδηρο. Τα στοιχεία αυτά, εξαιτίας της µεγάλης τους συµµετοχής στην κατά βάρος σύσταση του βακτηριακού κυττάρου, καλούνται µακροστοιχεία. Τα πρώτα έξι (C, O, H, N, S, P) είναι συστατικά των υδατανθράκων, των λιπών, των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων. Τα υπόλοιπα τέσσερα µακροστοιχεία υπάρχουν στο κύτταρο µε τη µορφή ιόντων και ο ρόλος τους είναι πολυσύνθετος. Για παράδειγµα, το Κ είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση ενός µεγάλου αριθµού ενζύµων, συµπεριλαµβανοµένων και µερικών που σχετίζονται µε την πρωτεϊνοσύνθεση. Το Ca µεταξύ των άλλων δράσεών του σχετίζεται και µε την ανθεκτικότητα των ενδοσπορίων σε υψηλές θερµοκρασίες. Το Mg είναι συµπαράγοντας πολλών ενζύµων, σχηµατίζει σύµπλοκα µε το ΑΤΡ και συµβάλλει στη σταθεροποίηση των ριβοσωµάτων και των κυτταροπλασµατικών µεµβρανών. Ο Fe αποτελεί συστατικό των κυττοχρωµάτων και συµπαράγοντας ενζύµων και πρωτεϊνών. Εικόνα 2 Ένα βακτηριακό κύτταρο αποτελείται από Η 2 0 (70%) και από χηµικές ουσίες(30%). Τέσσερα στοιχεία ο άνθρακας το υδρογόνο το οξυγόνο και το άζωτο αντιπροσωπεύουν το 96,5% της κυτταρικής µάζας και αποτελούν τους δοµικούς λίθους για τη δηµιουργία των µακροµορίων, στη συγκρότηση των οποίων συνεισφέρουν επίσης ο φώσφορος και το θείο. Όλοι οι οργανισµοί απαιτούν επίσης µικρότερες ποσότητες και άλλων στοιχείων εκτός των µακροστοιχείων. Τα στοιχεία αυτά καλούνται ιχνοστοιχεία. Τέτοια στοιχεία είναι το Μαγγάνιο, ο Ψευδάργυρος, το Κοβάλτιο, το Μολυβδαίνιο, το Νικέλιο και ο Χαλκός. Οι ποσότητες των στοιχείων αυτών που απαιτούνται για τη θρέψη των µικροοργανισµών είναι

48 τόσο µικρές ώστε τα ίχνη τους, τα οποία βρίσκονται µε τη µορφή προσµίξεων στο νερό, στα δοχεία που χρησιµοποιούνται στις καλλιέργειες και στα συστατικά των θρεπτικών υλικών είναι συνήθως αρκετά για την ανάπτυξή τους. Τα ιχνοστοιχεία είναι συµπαράγοντες ενζύµων και συµβάλλουν στην κατάλυση αντιδράσεων και στη σταθεροποίηση των πρωτεϊνικών δοµών. Απαιτήσεις σε Άνθρακα, Υδρογόνο και Οξυγόνο Οι απαιτήσεις των βακτηρίων σε Άνθρακα, Υδρογόνο και Oξυγόνο συνήθως ικανοποιούνται ταυτόχρονα. Ο άνθρακας χρησιµοποιείται για την κατασκευή του σκελετού όλων των οργανικών µορίων και τα µόρια που χρησιµοποιούνται ως πηγές άνθρακα από τα βακτήρια, συνήθως περιέχουν οξυγόνο και υδρογόνο. Η µόνη πηγή άνθρακα για την οποία δεν ισχύει αυτό είναι το CO2. Πιθανόν όλοι οι µικροοργανισµοί µπορούν να χρησιµοποιήσουν το CO2 και να ενσωµατώσουν τον Άνθρακα στα οργανικά µόρια που παράγουν. Παρόλα αυτά, εξ ορισµού, µόνο οι αυτότροφοι µικροοοργανισµοί µπορούν να χρησιµοποιήσουν το CO2 ως τη µοναδική ή ως την κύρια πηγή άνθρακα. Πολλοί µικροοργανισµοί είναι αυτότροφοι: οι περισσότεροι από αυτούς είναι φωτοσυνθετικοί αυτότροφοι, αλλά υπάρχουν και αρκετοί αυτότροφοι οι οποίοι οξειδώνουν ανόργανα µόρια για να απελευθερώσουν ενέργεια απαραίτητη για τη σύνθεση οργανικώνν µορίων. Εικόνα 3 Το οξυγόνο το άζωτο και ο άνθρακας έχουν τη δυνατότητα δηµιουργίας οµοιοπολικών δεσµών που είναι απαραίτητη προυπόθεση για τη διµιουργία βιοµορίων Η αναγωγή του CO2 είναι µια ενεργειακά ακριβή διαδικασία. Ως εκ τούτου, οι περισσότεροι µικροοργανισµοί δεν µπορούν να χρησιµοποιήσουν το CO2 ως τη µοναδική πηγή άνθρακα και συνεπώς βασίζονται στην ύπαρξη άλλων, περισσότερο ανηγµένων πολύπλοκων οργανικών µορίων. Οι οργανισµοί οι οποίοι χρησιµοποιούν ανηγµένες έτοιµες οργανικές ενώσεις ως πηγές άνθρακα καλούνται ετερότροφοι.. Οι περισσότεροι ετερότροφοι χρησιµοποιούν οργανικές ενώσεις τόσο ως πηγές άνθρακα όσο και ως πηγές ενέργειας. Το πιο εντυπωσιακό χαρακτηριστικό της βακτηριακής θρέψης είναι η ασυνήθιστη ικανότητα που παρατηρείται σε ορισµένα είδη, όσον αφορά τη χρησιµοποίηση πολλών διαφορετικών οργανικών µορίων ως πηγές άνθρακα. εν υπάρχει κανένα φυσικό οργανικό µόριο που να µην µπορεί να χρησιµοποιηθεί από κάποιους µικροοργανισµούς. Μερικά βακτήρια, για παράδειγµα, µπορούν να χρησιµοποιήσουν σχεδόν τα πάντα ως πηγή άνθρακα. Η Pseudomonas cepacia µπορεί να χρησιµοποιήσει παραπάνω από 100 διαφορετικές οργανικές ενώσεις. Ατυχώς, πολλές τεχνητά παραγόµενες οργανικές ενώσεις,

49 όπως τα πλαστικά και το DDT αποικοδοµούνται πολύ αργά ή και καθόλου. Εκτός από τα βακτήρια που µπορούν να τραφούν σχεδόν µε τα πάντα, υπάρχουν και βακτήρια που µπορούν να προσλάβουν µόνο έναν µικρό αριθµό οργανικών ενώσεων. Τα Μεθυλότροφα βακτήρια µπορούν να χρησιµοποιήσουν ως πηγή άνθρακα µόνο µεθάνιο, µεθανόλη, µονοξείδιο του άνθρακα, φορµικό οξύ και µερικά άλλα σχετικά οργανικά µόρια. Εικόνα 4 Για την ολοκλήρωση του κύκλου του άνθρακα τα βακτήρια παίζουν καταλυτικό ρόλο. Θρεπτικές κατηγορίες βακτηρίων Όλοι οι οργανισµοί και κατά συνέπεια και οι µικροοργανισµ µοί, απαιτούν πηγές ενέργειας, υδρογόνων και ηλεκτρονίων για να αναπτυχθούν. Οι µικροοργανισµοί µπορούν να οµαδοποιηθούν ανάλογαα µε τον τρόπο που ικανοποιούν τις παραπάνω ανάγκες τους. Όσον αφορά τις πηγές ενέργειας αυτές είναι µόνο δύο: 1) Ενέργεια από τον Ήλιο, η οποία παγιδεύεται µε το µηχανισµό της φωτοσύνθεσης, και 2) Ενέργεια που προέρχεται από την οξείδωση οργανικών ή ανόργανων µορίων. Οι µικροοργανισµοί που χρησιµοποιούν την Ηλιακή ενέργεια ονοµάζονται Φωτότροφοι, ενώ αυτοί που χρησιµοποιούν ενέργεια η οποία απελευθερώνεται κατά την οξείδωση οργανικών ή ανόργανων ενώσεων ονοµάζονται Χηµειότροφοι. Όσον αφορά την προέλευση των ατόµων Υδρογόνου και των ηλεκτρονίων που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των µικροοργανισµών και εδώ οι πηγές είναι µόνο δύο: 1) οξείδωση ανόργανων ενώσεων και 2) οξείδωση οργανικών ενώσεων. Οι µικροοργανισµοί που προσλαµβάνουν άτοµα υδρογόνου ή ηλεκτρόνια από ανόργανες ενώσεις ονοµάζονται Λιθότροφοι, ενώ αυτοί που προσλαµβάνουν άτοµα υδρογόνου ή ηλεκτρόνια από οργανικές ενώσεις καλούνται Οργανότροφοι. Εάν συσχετίσουµε τις πηγές προέλευσης της ενέργειας, των υδρογόνων, των

50 ηλεκτρονίων και του άνθρακα που µπορεί να χρησιµοποιήσει ένας µικροοργανισµός τότε µπορούµε να διακρίνουµε τέσσερις οµάδες ή καλύτερα τέσσερις θρεπτικές κατηγορίες µικροοργανισµών: 1) Φωτολιθότροφοι αυτότροφοι µικροοργανισµοί. Συχνά αναφέρονται και ως Φωτοαυτότροφοι. Οι µικροοργανισµοί αυτοί χρησιµοποιούν την Ηλιακή ενέργεια ως πηγή ενέργειας και το CO2 ως αποκλειστική πηγή άνθρακα. Τα Κυανοβακτήρια που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία χρησιµοποιούν το νερό ως δότη ηλεκτρονίων και απελευθερώνουν οξυγόνο. Τα ερυθρά και πράσινα θειοβακτήρια, δεν µπορούν να οξειδώσουν το νερό και χρησιµοποιούν ως δότη ηλεκτρονίων, ανόργανα στοιχεία ή ενώσεις όπως το υδρογόνο, το υδρόθειο ή ακόµη και το θείο. Εικόνα 5.Κυανοβακτήρια του γένους Microcystis. 2) Χηµειο-οργανοτροφικοί ετερότροφοι οργανισµοί. Συχνά αναφέρονται και ως χηµειοετερότροφοι ή απλά ετερότροφοι. Οι µικροοργανισµοί αυτοί χρησιµοποιούν οργανικές ενώσεις ως πηγές άνθρακα, υδρογόνων και ηλεκτρονίων για όλες τις βιοσυνθέσεις. Συχνά µια και µόνη οργανική ένωση µπορεί να ικανοποιεί όλες αυτές τις απαιτήσεις. Πρέπει εδώ να τονισθεί ότι σχεδόν όλοι οι παθογόνοι µικροοργανισµοί εµπίπτουν σε αυτή την κατηγορία. 3) Φωτοοργανοτροφικοί ετερότροφοι. Οι µικροοργανισµοί αυτοί χρησιµοποιούν την Ηλιακή ενέργεια ως πηγή ενέργειας, αλλά οργανικές ενώσεις ως πηγή άνθρακα και δότη ηλεκτρονίων. Στην κατηγορία αυτή εµπίπτουν είδη των ερυθρών και πράσινων βακτηρίων τα οποία πολλαπλασιάζονται ταχύτατα σε ρυπασµένες µε οργανικές ενώσεις λίµνες και ποτάµια. Πολλά από αυτά τα είδη µπορούν να υπάρξουν και ως φωτοαυτότροφα χρησιµοποιώντας το µοριακό υδρογόνο ως δότη ηλεκτρονίων. 4) Χηµειολιθοτροφικοί αυτότροφοι. Οι µικροοργανισµοί αυτής της κατηγορίας, οξειδώνουν ανόργανες ενώσεις όπως το Σίδηρο, το Άζωτο, το Θείο και προσλαµβάνουν τόσο ενέργεια όσο και ηλεκτρόνια για την βιοσύνθεση. Το CO2 είναι η πηγή άνθρακα.

51 Λίγοι Χηµειολιθοτροφικοί µικροοργανισµοί µπορούν να προσλάβουν άνθρακα από οργανικές πηγές και τότε ονοµάζονται ετερότροφοι. Οι Χηµειολιθότροφοι µικροοργανισµοί σχετίζονται άµεσα µε τους βιογεωχηµικούς κύκλους των στοιχείων σε ένα οικοσύστηµα (π.χ. η µετατροπή της αµµωνίας σε νιτρικά ή του θείου σε θειικά άλατα, πραγµατοποιείται από Χηµειολιθοτροφικούς µικροοργανισµούς του εδάφους). Απαιτήσεις σε Άζωτο, Φώσφορο, Θείο. Για την ανάπτυξη των βακτηρίων είναι απαραίτητο, οι µικροοργανισµοί να µπορούν να ενσωµατώνουν µεγάλες ποσότητες Αζώτου, Φωσφόρου και Θείου. Παρόλο που αυτά τα στοιχεία µπορούν οι µικροοργανισµοί να τα προµηθευτούν από τις ίδιες χηµικές ενώσεις που χρησιµοποιούν για την προµήθεια του άνθρακα, συχνά χρησιµοποιούν και ανόργανες πηγές. Το Άζωτο χρειάζεται για τη σύνθεση των αµινοξέων, των πουρινών, των πυριµιδινών, µερικών υδατανθράκων και λιπιδίων, συµπαραγόντων ενζύµων και άλλων συστατικών. Πολλοί µικροοργανισµοί χρησιµοποιούν το άζωτο που υπάρχει στα αµινοξέα, άλλοι µπορούν να χρησιµοποιήσουν άζωτο που υπάρχει στην αµµωνία. Τα περισσότερα φωτότροφα και πολλά µη φωτοσυνθετικά βακτήρια, ανάγουν τα νιτρικά άλατα σε αµµωνία και κατόπιν ενσωµατώνουν το άζωτο της αµµωνίας. Πολλά Κυανοβακτήρια και τα βακτηριακά γένη Rhizobium και Azotobacter µπορούν να ανάγουν και να αφοµοιώσουν το ατµοσφαιρικό άζωτο. Ο Φώσφορος είναι απαραίτητος για τη σύνθεση των Νουκλεϊκών οξέων, των φωσφολιπιδίων, των νουκλεοτιδίων όπως το ΑΤΡ, πολλών συµπαραγόντων ενζύµων, µερικών πρωτεϊνών και άλλων κυτταρικών συστατικών. Σχεδόν όλοι οι µικροοργανισµοί χρησιµοποιούν ανόργανες φωσφορικές ενώσεις ως πηγές φωσφόρου και τον ενσωµατώνουν άµεσα στις οργανικές τους ενώσεις. Μερικά βακτήρια προσλαµβάνουν άµεσα ανόργανο φώσφορο από το περιβάλλον τους. Χαµηλά επίπεδα φωσφόρου ελαττώνουν σηµαντικά την ανάπτυξη των βακτηρίων σε πολλά υδάτινα οικοσυστήµατα. Το Θείο είναι απαραίτητο για τη σύνθεση συστατικών όπως τα αµινοξέα κυστείνη και µεθειονίνη, µερικοί υδρογονάνθρακες, αλλά και βιταµίνες. Οι περισσότεροι µικροοργανισµοί χρησιµοποιούν θειικά άλατα ως πηγές θείου. Παράγοντες ανάπτυξης Οι µικροοργανισµοί και κυρίως οι περισσότεροι Φωτολιθοτροφικοί αυτότροφοι, συχνά πολλαπλασιάζονται µε ικανοποιητικούς ρυθµούς αν υπάρχουν στο περιβάλλον όλα τα συστατικά που αναφέρθηκαν προηγουµένως. Υπάρχουν όµως και µικροοργανισµοί οι οποίοι δεν µπορούν να συνθέσουν ένα ή περισσότερα απαραίτητα συστατικά και ως εκ τούτου πρέπει να τα προσλάβουν έτοιµα από το περιβάλλον τους. Οι οργανικές αυτές ενώσεις, οι οποίες είναι απαραίτητες γιατί αποτελούν κυτταρικά συστατικά ή πρόδροµες ενώσεις κυτταρικών συστατικών και δεν µπορούν να συντεθούν από κάποιο µικροοργανισµό, ονοµάζονται παράγοντες ανάπτυξης. Υπάρχουν τρεις µεγάλες κατηγορίες παραγόντων ανάπτυξης: 1) Αµινοξέα, 2) πουρίνες και πυριµιδίνες, 3) βιταµίνες. Τα αµινοξέα χρειάζονται για τη σύνθεση των πρωτεϊνών, οι πουρίνες και οι πυριµιδίνες για τη σύνθεση των νουκλεϊκών οξέων. Οι βιταµίνες είναι µικρά οργανικά µόρια τα οποία λειτουργούν ως συµπαράγοντες ενζύµων και απαιτούνται σε µικρές ποσότητες από τον οργανισµό. Μερικοί µικροοργανισµοί απαιτούν ένας µεγάλος αριθµός βιταµινών να παρέχεται από το περιβάλλον τους. Ακραίο

52 παράδειγµα, ο Enterococcus faecalis ο οποίος χρειάζεται οκτώ διαφορετικές βιταµίνες για την ανάπτυξή του. Είσοδος των θρεπτικών συστατικών στο βακτηριακό κύτταρο Το πρώτο βήµα για τη χρησιµοποίηση των θρεπτικών συστατικών του περιβάλλοντος είναι η πρόσληψή τους από το βακτηριακό κύτταρο. Οι µηχανισµοί πρόσληψης των θρεπτικών συστατικών πρέπει να είναι εξειδικευµένοι. Αυτό σηµαίνει ότι µόνο τα θρεπτικά συστατικά που είναι απαραίτητα για τη βακτηριακή θρέψη πρέπει να περάσουν στο εσωτερικό του βακτηριακού κυττάρου και όχι κάποια άλλα. Το βακτηριακό κύτταρο δεν πρέπει να προσλάβει συστατικά τα οποία δεν µπορεί να τα χρησιµοποιήσει για την θρέψη του. Επειδή οι µικροοργανισµοί ζουν συνήθως σε περιβάλλοντα φτωχά σε θρεπτικά συστατικά, πρέπει να έχουν αναπτύξει µηχανισµούς µεταφοράς θρεπτικών συστατικών από ένα περιβάλλον µε εξαιρετικά χαµηλή συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών στο εσωτερικό του κυττάρου, όπου η συγκέντρωση των θρεπτικών συστατικών είναι πολύ υψηλή. Θα πρέπει δηλαδή να είναι ικανά προς µεταφορά θρεπτικών συστατικών ενάντια σε µια βαθµίδωση συγκέντρωσης. Επιπλέον τα θρεπτικά συστατικά πρέπει να διασχίσουν µια επιλεκτικά διαπερατή κυτταροπλασµατική µεµβράνη η οποία δεν επιτρέπει την ελεύθερη διέλευση σχεδόν των περισσοτέρων συστατικών. Γνωρίζουµε ότι τα βακτήρια µπορούν να χρησιµοποιήσουν µια τεράστια ποικιλία θρεπτικών συστατικών. εν είναι συνεπώς αξιοπερίεργο το γεγονός ότι τα βακτήρια έχουν αναπτύξει και µια µεγάλη ποικιλία µηχανισµών µεταφοράς. Οι πιο σηµαντικοί µηχανισµοί µεταφοράς που χρησιµοποιούν τα βακτήρια είναι τρεις: 1)Υποβοηθούµενη διάχυση, 2) ενεργός µεταφορά, 3) µεταφορά οµάδας. Οι Ευκαρυωτικοί µικροοργανισµοί έχουν την ικανότητα πρόσληψης µεγάλων τµηµάτων τροφής µε τη διαδικασία της ενδοκύττωσης (φαγοκύττωση και πινοκύττωση). Η µέθοδος της ενδοκύττωσης απουσιάζει από τα βακτήρια. Tα Αντιβιοτικά ως παράγοντες αναστολείς της βακτηριακής ανάπτυξης. Τα αντιβιοτικά είναι πολύπλοκες οργανικές ενώσεις οι οποίες παράγονται από βακτήρια ή µύκητες και προκαλούν καταστροφή άλλων µικροοργανισµών ή αναστολή του πολλαπλασιασµού τους. Το πρώτο αντιβιοτικό ανακαλύφθηκε από τον A.Fleming το Επειδή το αντιβιοτικό αυτό παράγεται από το µύκητα Penicillium notatum ονοµάσθηκε πενικιλλίνη. Ο Flemming κατάφερε να αποµονώσει µικρές ποσότητες του αντιβιοτικού αυτού και να το χαρακτηρίσει. Σε µια σειρά δηµοσιεύσεών του, απέδειξε την ικανότητα του αντιβιοτικού να καταστρέφει µια σειρά παθογόνους µικροοργανισµούς. Ατυχώς, ο Fleming βασιζόµενος σε δικά του πειράµατα, πείσθηκε ότι η πενικιλλίνη δεν έµενε για µεγάλο χρονικό διάστηµα ενεργή στο σώµα ασθενών ώστε να είναι δυνατή η χρησιµοποίησή της ως αντιµικροβιακού φαρµάκου. Μετά από µια σειρά πειραµάτων µεταξύ 1929 και 1931 εγκατέλειψε την έρευνα στο πεδίο αυτό. Αργότερα, το 1939, οι Florey και Chain επανέλαβαν τις καλλιέργειες του µύκητα Penicillium και ασχολήθηκαν µε την αποµόνωση και τον καθαρισµό της πενικιλλίνης. Όταν η καθαρή πενικιλλίνη ενέθηκε σε ποντικούς µολυσµένους µε στρεπτόκκοκους ή σταφυλόκκοκους, όλοι οι ποντικοί θεραπεύθηκαν και επιβίωσαν. Τα αποτελέσµατα ανακοινώθηκαν το 1940 και ακολούθησαν επιτυχηµένες εφαρµογές στους ανθρώπους. Οι

53 Fleming, Florey και Chain τιµήθηκαν µε το βραβείο Nobel το 1945 για την ανακάλυψη και την παραγωγή της πενικιλλίνης. Η ανακάλυψη της πενικιλλίνης είχε σαν αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της έρευνας για την ανακάλυψη και άλλων αντιβιοτικών. Ο Selman Waksman ανακοίνωσε το 1944 ότι είχε ανακαλύψει ένα νέο αντιβιοτικό, τη στρεπτοµυκίνη, το οποίο παράγεται από τον ακτινοµύκητα (ακτινοβακτήριο) Streptomyces griseus. Η ανακάλυψη αυτή πραγµατοποιήθηκε µετά από µια εξαντλητική αναζήτηση πιθανής παραγωγής αντιβιοτικών από µεριάς ενός τεράστιου αριθµού, περίπου 10000, διαφορετικών στελεχών εδαφικών βακτηρίων και µυκήτων. Ο Waksman τιµήθηκε µε το βραβείο Nobel για την ανακάλυψή του το Η επιτυχία του οδήγησε πολλούς άλλους επιστήµονες στην αναζήτηση νέων αντιβιοτικών. Μικροοργανισµοί που παράγουν αντιβιοτικά όπως η χλαραµφαινικόλη, η τερραµυκίνη και η τετρακυκλίνη αποµονώθηκαν µέχρι το Η ανακάλυψη των αντιβιοτικών µεταµόρφωσε κυριολεκτικά τη σύγχρονη ιατρική και ανακούφισε κατά πολύ τον ανθρώπινο πόνο. Επιπλέον τα αντιβιοτικά αποδείχθηκαν ιδιάτερα σηµαντικά στη µικροβιολογική έρευνα. Μηχανισµοί δράσης των αντιβιοτικών Η γνώση του µηχανισµού δράσης των αντιβιοτικών είναι ιδιαίτερα σηµαντική γιατί µας βοηθάει να κατανοήσουµε την επιλεκτική τους τοξικότητα και πολλές φορές µας βοηθάει επίσης στο σχεδιασµό νέων τεχνιτών αντιβιοτικών. Τα αντιβιοτικά µπορούν να προκαλέσουν καταστροφή ενός µικροοργανισµού µε πολλούς τρόπους. Αντιβιοτικά µε πολύ επιλεκτική δράση είναι αυτά που εµποδίζουν τη σύνθεση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώµατος. Τέτοια αντιβιοτικά είναι οι πενικιλλίνες, οι κεφαλοσπορίνες κ.ά. Τα αντιβιοτικά αυτά έχουν ευρεία θεραπευτική εφαρµογή (αντιβιοτικά ευρέως φάσµατος) γιατί τα βακτηριακά κυτταρικά τοιχώµατα έχουν µοναδική δοµή και σύσταση που δεν απαντάται στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Άλλα αντιβιοτικά όπως η στρεπτοµυκίνη, γκενταµυκίνη, χλαραµφαινικόλη, τετρακυκλίνες, ερυθροµυκίνη και πολλά άλλα εµποδίζουν την πρωτεϊνική σύνθεση. Αυτό το επιτυγχάνουν µε την επιλεκτική τους σύνδεση πάνω στο προκαρυωτικό ριβόσωµα. Επειδή τα αντιβιοτικά αυτά µπορούν να διακρίνουν µεταξύ προκαρυωτικού και ευκαρυωτικού ριβοσώµατος, το θεραπευτικό τους εύρος είναι επίσης πολύ ευρύ. Μερικά από αυτά τα αντιβιοτικά, συνδέονται στη µικρή ριβοσωµική υποµονάδα (30S), ενώ κάποια άλλα στη µεγάλη ριβοσωµική υποµονάδα (50S). H παρεµπόδιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης µπορεί να γίνει σε κάποιο ή κάποια από τα πολλά στάδια της όλης πρωτεϊνοσυνθετικής διαδικασίας όπως η σύνδεση του αµινοάκυλο trna πάνω στο mrna, o σχηµατισµός πεπτιδικού δεσµού, η ανάγνωση του RNA κ.ά. Ο ρόλος των αντιβιοτικών στη φύση Επειδή συχνά, όταν αναφερόµαστε στα αντιβιοτικά, τα εξετάζουµε εντελώς ανθρωποκεντρικά λόγω των εφαρµογών τους στην Ιατρική, είναι σηµαντικό να υπενθυµίσουµε το φυσιολογικό τους ρόλο. Άλλωστε τα αντιβιοτικά δεν παράγονται από τους µικροοργανισµούς µε σκοπό να χρησιµοποιηθούν από τον άνθρωπο για την αντιµετώπιση άλλων µικροοργανισµών. Τα αντιβιοτικά παράγονται από κάποιους µικροοργανισµούς και χρησιµοποιούνται για την αντιµετώπιση άλλων µικροοργανισµών οι οποίοι ζουν στο ίδιο περιβάλλον και

54 είναι ανταγωνιστές τους. Όταν λέµε ανταγωνιστές τους, εννοούµε ότι ανταγωνίζονται για την πρόσληψη των ίδιων θρεπτικών συστατικών του περιβάλλοντος. Τα αντιβιοτικά λοιπόν είναι όπλα που εξασφαλίζουν επιβίωση σε ένα περιβάλλον µε περιορισµένα θρεπτικά συστατικά, µειώνοντας τους τροφικούς ανταγωνιστές. Πενικιλλίνη G Πενικιλλίνη V Αµπικιλλίνη Εικόνα 6.Οι συντακτικοί τύποι µερικών αντιβιοτικών της οικογένειας των πενικιλλινών. Όλες είναι παράγωγα του 6 αµινοπενικιλλινικού οξέος. Οι πενικιλλίνες διαφέρουν µεταξύ τους ως προς την πλευρική τους αλυσίδα. Το βέλος δείχνει τον β λακταµικό δακτύλιο. Ο δεσµός του δακτυλίου που δείχνεται από το βέλος είναι αυτός ο δεσµός που υδρολύεται από τις πενικιλλινάσες, όπως για παράδειγµα η β λακταµάση. Με αυτόν τον τρόπο το αντιβιοτικό απενεργοποιείται.

55 Θρεπτικά υλικά για την καλλιέργεια βακτηρίων Οι µεγάλες επιτυχίες τόσο στη Μικροβιολογία όσο και στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία οφείλονται στην ικανότητά µας να καλλιεργούµε σε εργαστηριακή και βιοµηχανική κλίµακα έναν µεγάλο αριθµό βακτηρίων. Για την επίτευξη µιας βακτηριακής καλλιέργειας είναι απαραίτητη η παρασκευή ενός κατάλληλου θρεπτικού υλικού ή θρεπτικού ζωµού. α) Συνθετικά ή καθορισµένα θρεπτικά υλικά Μερικοί µικροοργανισµοί, ειδικά οι φωτολιθοτροφικοί αυτότροφοι, όπως τα Κυανοβακτήρια, µπορούν να αναπτυχθούν σε σχετικά απλά ως προς τη σύνθεση θρεπτικά υλικά. Τα υλικά αυτά πρέπει να περιέχουν CO2 ως πηγή άνθρακα (συχνά µε τη µορφή ανθρακικού νατρίου), νιτρικά άλατα ή αµµωνία, θειικά, φωσφορικά άλατα και διάφορα µεταλλικά ιόντα. Τέτοια θρεπτικά υλικά στα οποία όλα τα συστατικά είναι γνωστά, ονοµάζονται καθορισµένα ή συνθετικά θρεπτικά υλικά. Πολλοί χηµειοοργανοτροφικοί ετερότροφοι µπορούν επίσης να αναπτυχθούν σε καθορισµένα θρεπτικά υλικά τα οποία όµως περιέχουν γλυκόζη ως πηγή άνθρακα και ένα αµµωνιακό άλας ως πηγή αζώτου. Θα πρέπει να τονισθεί ότι δεν είναι όλα τα καθορισµένα θρεπτικά υλικά τόσο απλά όσο αυτά που περιγράφηκαν, γιατί στις περισσότερες των περιπτώσεων µπορεί στη σύνθεσή τους να περιέχεται ένας πολύ µεγάλος αριθµός θρεπτικών συστατικών. Τα καθορισµένα θρεπτικά συστατικά χρησιµοποιούνται πολύ συχνά στη µικροβιολογική έρευνα καθώς πολλές φορές είναι απαραίτητο να γνωρίζουµε ποιο είναι το θρεπτικό συστατικό που µεταβολίζει ο καλλιεργούµενος µικροοργανισµός. β) Σύνθετα θρεπτικά υλικά Θρεπτικά υλικά τα οποία περιέχουν συστατικά άγνωστης χηµικής σύνθεσης καλούνται σύνθετα θρεπτικά υλικά. Τέτοια θρεπτικά υλικά είναι πολύ χρήσιµα, καθώς είναι συνήθως τόσο πλούσια σε θρεπτικά συστατικά, ώστε ικανοποιούν τις απαιτήσεις ενός µεγάλου αριθµού διαφορετικών ειδών βακτηρίων. Επιπλέον ένα τέτοιο θρεπτικό υλικό είναι απαραίτητο στις περιπτώσεις όπου οι θρεπτικές απαιτήσεις ενός προς καλλιέργεια µικροοργανισµού είναι άγνωστες και ως εκ τούτου ένα καθορισµένο θρεπτικό υλικό δεν µπορεί να παρασκευασθεί. Τα θρεπτικά υλικά αυτού του τύπου περιέχουν άγνωστα ως προς την ακριβή τους σύνθεση συστατικά όπως οι πεπτόνες, το εκχύλισµα κρέατος, ή το εκχύλισµα ζύµης. Οι πεπτόνες είναι υδρολύµατα πρωτεινών τα οποία προκύπτουν µετά από µερική πρωτεόλυση κρέατος, καζείνης, σόγιας, ζελατίνης και άλλων πρωτεϊνικών πηγών. Οι πεπτόνες χρησιµοποιούνται από τα βακτήρια ως πηγές άνθρακα, ενέργειας και αζώτου. Το εκχύλισµα κρέατος περιέχει αµινοξέα, πεπτίδια, οργανικά οξέα, βιταµίνες και µεταλλικά ιόντα. Το εκχύλισµα ζύµης περιέχει βιταµίνες και επίσης ενώσεις αζώτου και άνθρακα. Το θρεπτικό υλικό που θα χρησιµοποιήσουµε στο σηµερινό εργαστήριο είναι ένα σύνθετο θρεπτικό υλικό το L.B broth (Luria, Bertrani broth). Θρεπτικά υλικά υγρής και στερεής φάσης. Τα θρεπτικά υλικά που αναφέρθηκαν προηγουµένως είναι ως προς τη φύση τους υγρά. Πράγµατι τα θρεπτικά αυτά υλικά παρασκευάζονται µε την διάλυση των κατάλληλων θρεπτικών συστατικών σε νερό. Αυτά τα θρεπτικά υλικά είναι απαραίτητα για την καλλιέργεια µικροοργανισµών όταν αποκλειστικός µας σκοπός είναι η παραγωγή

56 µεγάλης ποσότητας βιοµάζας. Σε άλλες εφαρµογές, όπως για παράδειγµα στην καταµέτρηση αριθµού κυττάρων, χρησιµοποιούνται θρεπτικά υλικά στερεής φάσης. Εάν ένα στερεό θρεπτικό υλικό απαιτείται σε κάποιες εφαρµογές, τότε µπορούµε να προκαλέσουµε στερεοποίηση των υγρών θρεπτικών υλικών προσθέτοντας 1 2% άγαρ. Εικόνα 7. Φωτογραφία από το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο που δείχνει βακτήρια (Micrococus) που αναπτύσσονται σε αγαρ Το άγαρ είναι ένας φυσικός πολυσακχαρίτης (αποτελείται κυρίως από D - γαλακτόζη, 3,6 ανυδρο- L-γαλακτόζη και D γλυκουρονικό οξύ). Η φυσική πηγή από την οποία εξάγεται το άγαρ είναι τα ερυθροφύκη. Η ικανότητά του να δρά ως στερεοποιητικός παράγοντας οφείλεται στην ιδιότητά του να τήκεται σε θερµοκρασία βρασµού του νερού και να στερεοποιείται όταν η θερµοκρασία πέφτει κάτω από τους C. Από τη στιγµή που θα στερεοποιηθεί δεν ξανατήκεται εκτός εάν η θερµοκρασία υπερβεί τους C. Το άγαρ είναι επίσης ένας καλός στερεοποιητικός παράγοντας και για έναν άλλο λόγο: οι περισσότεροι µικροοργανισµοί δεν µπορούν να το αποικοδοµήσουν. Αποστείρωση θρεπτικών υλικών Στα προηγούµενα εργαστήρια τονίσθηκε κατά κόρον ότι τα βακτήρια είναι πανταχού παρόντα γύρω µας. Κατά την διαδικασία παρασκευής θρεπτικών υλικών, όσο προσεκτικοί και αν είµαστε, πάντα στο τελικό θρεπτικό υλικό που παρασκευάζουµε υπάρχει µικρός αριθµός βακτηρίων, τα οποία βρέθηκαν εκεί τυχαία. Τα βακτήρια αυτά µπορεί να υπήρχαν στο νερό ή στα θρεπτικά συστατικά ή ακόµη και στις γυάλινες φιάλες που χρησιµοποιήθηκαν. Εάν έστω και αυτοί οι λίγοι µικροοργανισµοί αφεθούν στο θρεπτικό υλικό, τότε θα πολλαπλασιασθούν σε βάρος των µικροοργανισµών που εµείς θα εισάγουµε. Για το λόγο αυτό πρέπει να εξουδετερώσουµε όλους τους µικροοργανισµούς που παρεισέφρησαν στο θρεπτικό µας υλικό τυχαία, άλλωστε τα θρεπτικά υλικά τα παρασκευάζουµε για να καλλιεργήσουµε τους µικροοργανισµούς της αρεσκείας µας.

57 Οι µέθοδοι που ακολουθούµε για την εξουδετέρωση αυτών των µικροοργανισµών ονοµάζονται µέθοδοι αποστείρωσης. Υπάρχουν πολλές µέθοδοι αποστείρωσης οι οποίες εφαρµόζονται ανάλογα µε το είδος του υλικού που θέλουµε να αποστειρώσουµε. Εικόνα 8 Ένα τυπικό εργαστηριακό αυτόκαυστο Στην περίπτωση των θρεπτικών υλικών µε σκοπό την καλλιέργεια βακτηρίων η µέθοδος αποστείρωσης που ακολουθείται είναι η υγρή αποστείρωση. Η υγρή αποστείρωση πραγµατοποιείται σε ειδικές συσκευές οι οποίες ονοµάζονται αυτόκαυστα και µοιάζουν ως προς τον τρόπο λειτουργίας τους µε τις χύτρες ταχύτητας. Στις συσκευές αυτές αναπτύσσεται θερµοκρασία C και πίεση 1.1 Atm. Σε αυτές τις συνθήκες τα βακτήρια και τα ενδοσπόριά τους καταστρέφονται µέσα σε λεπτά. Παρόλα αυτά η αποστείρωση συνεχίζεται µέχρι τα λεπτά ώστε να υπάρχει ένα ικανοποιητικό περιθώριο ασφαλείας. Ασηπτικές µέθοδοι εργασίας Μετά την ολοκλήρωση της αποστείρωσης των θρεπτικών υλικών, όλοι οι χειρισµοί µεταφοράς των µικροοργανισµών που θέλουµε να καλλιεργήσουµε στο θρεπτικό υλικό πρέπει να γίνουν µε µεγάλη προσοχή. Ο λόγος είναι προφανής. Θέλουµε να αποφύγουµε επιµόλυνση του θρεπτικού υλικού µε βακτήρια του περιβάλλοντος. Ο τρόπος εργασίας εφαρµογής ασηπτικών µεθόδων περιγράφεται αναλυτικά στο εργαστηριακό πρωτόκολλο.

58 Eργαστηριακός Eξοπλισµός Aυτόκαυστο, Eπωαστικός κλίβανος 37 0 C, Λυχνίες bunsen Yλικά Θρεπτικό υλικό υγρής φάσης για την ανάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων Θρεπτικό υλικό LB 1% τρυπτόνη 0,5% εκχύλισµα ζύµης 1% NaCl Θρεπτικό υλικό στερεής φάσης για την ανάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων Θρεπτικό υλικό LB µε άγαρ 1% τρυπτόνη 0,5% εκχύλισµα ζύµης 1% NaCl 1,5% αγαρ Eργαστηριακό Πρωτόκολλο Aσηπτικές µέθοδοι εργασίας Tα κύτταρα που θα αναπτύξετε σε όλες τις ασκήσεις είναι µη µολυσµατικά και µη τοξικά. Παρόλα αυτά, δεδοµένου ότι πρόκειται για βιολογικό υλικό, πρέπει να τα χρησιµοποιείτε µε προσοχή. Eπειδή µικροοργανισµοί βρίσκονται παντού στο περιβάλλον, θα πρέπει σε κάθε πειραµατική διαδικασία να λαµβάνονται µέτρα ώστε να αποκλείεται η επιµόλυνση του πειράµατός σας µε µικροοργανισµούς του περιβάλλοντος. Για το λόγο αυτό: i) ο χώρος εργασίας πρέπει να είναι σχολαστικά καθαρός, ii) τα θρεπτικά υλικά που χρησιµοποιούνται να είναι αποστειρωµένα και iii) όλοι οι χειρισµοί να είναι προσεκτικοί ώστε να ελαχιστοποιηθεί η επιµόλυνση. Γενικές οδηγίες. Για να επιτευχθούν τα παραπάνω εφαρµόστε τα παρακάτω µέτρα. 1. Φοράτε πάντα την εργαστηριακή σας µπλούζα. 2. Πριν από την έναρξη κάθε άσκησης και κατά την διάρκειά της θα πρέπει να ξέρετε ακριβώς τι θα κάνετε. Eαν έχετε αµφιβολίες απευθυνθείτε στο προσωπικό του Eργαστηρίου.

59 Kαθαρίστε στην αρχή και στο τέλος της άσκησης τον πάγκο σας µε απολυµαντικό (αιθανόλη). Aποµακρύντε µετά την χρήση την αιθανόλη απο τον πάγκο σας. 4. Mην αφήνετε στον πάγκο σας αντικείµενα που έχουν έρθει σε επαφή µε τα µικρόβια. Πετάξτε τα σε ειδικά δοχεία. 5. Xρησιµοποιήστε την φλόγα για αποστείρωση αντικειµένων µε ιδιαίτερη προσοχή σύµφωνα µε τις οδηγίες του προσωπικού. 6.Oταν παρατηρείτε αποικίες µικροοργανισµών σε τρυβλία µε άγαρ µη τις πλησιάζετε πολύ κοντά στο πρόσωπό σας. 7. Aποφύγετε οποιαδήποτε κίνηση που φέρνει σε επαφή τα χέρια µε το στόµα (φαγητό, κάπνισµα) τα µάτια και γενικά το πρόσωπό σας. 8. Πλύνετε τα χέρια σας µετά το τέλος της άσκησης. 9. Οτιδήποτε συµβεί να το αναφέρετε στους υπεύθυνους των ασκήσεων. Γενικές οδηγίες για ασηπτική µεταφορά υγρών Όταν θέλουµε να µεταφέρουµε ένα υγρό υπό ασηπτικές συνθήκες ακολουθούµε την παρακάτω διαδικασία: 1. Aνάβουµε την φλόγα και ρυθµίζουµε την έντασή της. 2. Mεταφέρουµε το δοχείο που περιέχει τις πιπέτες κοντά στη φλόγα και το ανοίγουµε µε προσοχή. 3. Παίρνουµε µια πιπέτα και την περνάµε στιγµιαία από την φλόγα. 4. Aνοίγουµε το πώµα του δοχείου από το οποίο θα αφαιρέσουµε υλικό (δοχείο A) και περνάµε στιγµιαία το στόµιό του από τη φλόγα. 5. Aναρροφούµε την απαραίτητη ποσότητα υλικού και ξανακλείνουµε το δοχείο. 6. Aνοίγουµε το πώµα του σωλήνα στον οποίο θα µεταφέρουµε το θρεπτικό υλικό (σωλήνας B), περνάµε στιγµιαία το στόµιό του από τη φλόγα, µεταφέρουµε το υλικό από την πιπέτα στο σωλήνα µας, περνάµε στιγµιαία το στόµιό του από τη φλόγα και κλείνουµε µε το πώµα.

60 Α. Παρασκευή θρεπτικών υλικών υγρής και στερεής φάσης για την ανάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων. Παρασκευή τρυβλίων για την ανάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων (στερεή καλλιέργεια) To θρεπτικό υλικό (LB/άγαρ) που θα χρησιµοποιήσετε έχει ήδη παρασκευαστεί και αποστειρωθεί. ιατηρείται σε υγρή µορφή στους 55 0 C. Για να φτιάξετε τα τρυβλία σας υπό ασηπτικές συνθήκες ακολουθήστε προσεκτικά τα παρακάτω βήµατα. 1. Aνακινήστε προσεκτικά την φιάλη A για την οµογενοποίηση του περιεχοµένου. 2. Aφαιρέστε το πώµα της φιάλης 3. Περάστε προσεκτικά και στιγµιαία το στόµιο της φιάλης πάνω από την φλόγα της λυχνίας. 4. Eκχύστε προσεκτικά από την φιάλη στο τρυβλίο έναν όγκο υγρού (10-20ml). 5. Περάστε προσεκτικά το στόµιο της φιάλης πάνω από την φλόγα της λυχνίας. 6. Eπαναλάβετε την διαδικασία µέχρι να πληρώσετε όλα τα τρυβλία σας. 7. Aφήστε τα τρυβλία στον πάγκο µέχρι να στερεοποιηθούν. 8. Aναστρέψτε τα. β. Παρασκευή τρυβλίων που περιέχουν το αντιβιοτικό αµπικιλλίνη 1. Aνακινήστε προσεκτικά την φιάλη A για την οµογενοποίηση του περιεχοµένου. 2. Ελέξτε την θερµοκρασία του LB ώστε να µην είναι καταστροφική για το αντιβιοτικό. (Πρέπει να µπορείτε να το κρατήσετε µε γυµνό χέρι). 3. Προσθέστε το αντιβιοτικό σε συγκέντρωση 50ng/ml. 4. Συνεχίζετε την έκχυση όπως προηγουµένως. Β. Aνάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων από φυσικές πηγές (δάκτυλα) ή πόσο καθαρά είναι τα χέρια µας. 1. Πάρτε ένα τρυβλίο και σηµειώστε µια γραµµή στη µέση χωρίζοντας το σε δύο µέρη. 2. Ακουµπήστε τις άκρες των δακτύλων σας απαλά στην µισή επιφάνειά του (τρυβλίο 1). 3. Πλύνετε τα χέρια σας µε σαπούνι. 4. Eπαναλάβετε στην άλλη µισή επιφάνεια του τρυβλίου. 5. Eπωάστε τα τρυβλία ανεστραµµένα στους 37 0 C επί 12 ώρες.

61 Γ. Aνάπτυξη προκαρυωτικών κυττάρων παρουσία αντιβιοτικών 1. Πάρτε ένα τρυβλίο που περιέχει αντιβιοτικό. 2. Ακουµπήστε τις άκρες των δακτύλων σας απαλά στην επιφάνειά του. 3. Eπωάστε τα τρυβλία ανεστραµµένα στους 37 0 C επί 12 ώρες. Aποτελέσµατα Aνάπτυξη κυττάρων Mετά από 12 ώρες επώασης των τρυβλίων 1 και 2 τα τρυβλία παραδίδονται στους φοιτητές ή µεταφέρονται από το προσωπικό του εργαστηρίου στο ψυγείο ώστε να ανασταλεί η ανάπτυξη των βακτηρίων δεδοµένου ότι αυτά θα πρέπει να συντηρηθούν για µία εβδοµάδα εως ότου να πάρετε τα αποτελέσµα τά σας. 1. Παραλαµβάνετε τα τριβλία σας και παρατηρείτε τι εµφανίζετε σε αυτά χωρίς να τα ανοίγετε. 2. Καταγράφετε τα αποτελέσµατά σας για κάθε τριβλίο. Τρυβλίο Αριθµός αποικιών άκτυλα χεριών Πλυµένα δάκτυλα χεριών άχτυλα χεριών παρουσία αντιβιοτικού ;

62 Εφαρµογές των καλλιεργειών στερεής φάσης Kάθε ζωντανό κύτταρο που υπάρχει στα δάκτυλά σας θα δώσει όταν αναπτυχθεί σε στερεό υπόστρωµα, δηλ. σε τριβλίο που έχει πληρωθεί µε θρεπτικό υλικό σε κατάλληλες συνθήκες ανάπτυξης, µια αποικία η οποία θα είναι ορατή δια γυµνού οφθαλµού. Κάθε αποικία προέρχεται από τον πολλαπλασιασµό ενός και µόνο αρχικού κυττάρου. Συνεπώς ο αριθµός των αποικιών θα αντιστοιχεί στον αριθµό των ζωντανών βακτηρίων που υπήρχαν στα δάχτυλά σας. Η ίδια συλλογιστική και τεχνική χρησιµοποιείται ευρύτατα για τη µέτρηση αριθµού βακτηρίων σε δείγµατα τροφίµων, νερών εδάφους και γενικά σε όλες τις περιπτώσεις που απαιτείται έλεγχος µικροβιακής χλωρίδας.. Ο ακριβής αριθµός των κυττάρων που υπάρχουν σε οποιοδήποτε άγνωστο δείγµα, µπορεί να υπολογισθεί µε βάση την ποσότητα που χρησιµοποιήθηκε για τη σπορά και την ή τις ενδεχόµενες αραιώσεις (συνήθως όταν µετράµε υγρά). Oι αραιώσεις είναι απαραίτητες ώστε να µπορεί ο αριθµός των αποικιών να είναι προσιτός σε αρίθµηση τουλάχιστον σε ένα τρυβλίο. Η µέθοδος αυτή είναι απλή και εξαιρετικά ακριβής. Σε κάθε περίπτωση µια καλλιέργεια στερεής φάσης µπορεί να µας δώσει: α) Αποµόνωση καθαρών καλλιεργειών Στο φυσικό περιβάλλον, το κάθε βακτηριακό είδος συνυπάρχει και πολλαπλασιάζεται ταυτόχρονα µε πολλά άλλα βακτηριακά είδη. Αυτό είναι ένα σηµαντικό πρόβληµα για τη Μικροβιολογία γιατί ένα συγκεκριµένο είδος δεν µπορεί να µελετηθεί ικανοποιητικά όταν συµµετέχει σε έναν µικτό πληθυσµό. Για το λόγο αυτό απαιτείται µια καθαρή καλλιέργεια. Όταν λέµε καθαρή καλλιέργεια εννοούµε µια καλλιέργεια η οποία προήλθε από ένα και µόνο κύτταρο. Μόνο µε τέτοιες καλλιέργειες µπορούµε να προχωρήσουµε στη µελέτη και το χαρακτηρισµό ενός συγκεκριµένου είδους. Το πόσο σηµαντικές είναι οι καθαρές καλλιέργειες φαίνεται από το γεγονός ότι µετά την ανάπτυξή τους από τον Γερµανό Βακτηριολόγο Robert Koch (1882), χρειάστηκαν µόνο 20 χρόνια για να αποµονωθούν τα πιο σηµαντικά ανθρώπινα παθογόνα βακτήρια. Υπάρχουν αρκετοί διαφορετικοί τρόποι για την επίτευξη µιας καθαρής καλλιέργειας. Οι πιο κοινοί και ευρέως χρησιµοποιούµενοι είναι οι παρακάτω: 1) Μέθοδος επίστρωσης σε τρυβλίο (spread plate) Εάν ένας µικτός πληθυσµός βακτηριακών κυττάρων επιστρωθούν σε ένα τρυβλίο έτσι ώστε το καθένα από αυτά να αναπτυχθεί και να σχηµατίσει ευδιάκριτες µη επικαλυπτόµενες αποικίες, τότε κάθεµιά από αυτές τις αποικίες αντιπροσωπεύει µια καθαρή καλλιέργεια. Η τεχνική της επίστρωσης τρυβλίων είναι µια απλή και πολύ αποτελεσµατική τεχνική. Μια µικρή αραιωµένη ποσότητα του µικτού βακτηριακού πληθυσµού ( κύτταρα) µεταφέρεται στο κέντρο του στερεού θρεπτικού υλικού ενός τρυβλίου. Με µια αποστειρωµένη και κατάλληλα διαµορφωµένη ράβδο, η ποσότητα απλώνεται σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου. Τα βακτήρια που διασκορπίζονται µε αυτό τον τρόπο, πολλαπλασιάζονται και σχηµατίζουν αποικίες. (Επειδή ο αριθµός των αποικιών είναι ίσος µε τον αριθµό των ζωντανών βακτηρίων του δείγµατος, η µέθοδος αυτή µπορεί

63 να χρησιµοποιηθεί και για την µέτρηση του βακτηριακού πληθυσµού στο δείγµα µας). 2) Μέθοδος επίστρωσης, σε τρυβλίο,µε τη χρήση κρίκου (streak plate) Καθαρές αποικίες µπορούν να αποµονωθούν και µε την τεχνική της επίστρωσης µε τη βοήθεια µικροβιακού κρίκου πάνω στο στερεό θρεπτικό υλικό ενός τρυβλίου. Μια ποσότητα µικτής καλλιέργειας µεταφέρεται σε κάποιο σηµείο της περιφέρειας του τρυβλίου µε έναν µικροβιακό κρίκο και κατόπιν µε το σύρσιµο του κρίκου πάνω στο θρεπτικό υλικό απλώνεται και αραιώνεται. Σε κάποια σηµεία της πορείας του κρίκου πάνω στο θρεπτικό υλικό, µεµονωµένα κύτταρα Μέθοδος επίστρωσης-διασποράς σε τρυβλίο (spread plate). Προσθήκη βακτηρίων (1), απολύµανση ράβδου (2,3) και επίστρωση (4). πέφτουν από τον κρίκο πάνω στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού. Τα κύτταρα αυτά θα αναπτυχθούν και θα δόσουν µεµονωµένες αποικίες. β) Προσδιορισµός του αριθµού των κυττάρων µιας καλλιέργειας ή ενός αγνώστου δείµατος που πιθανολογούµε ότι περιέχει βακτήρια. Ο πιο προφανής τρόπος για την εκτίµηση του αριθµού των βακτηριακών κυττάρων σε µια καλλιέργεια είναι η απευθείας µέτρησή τους. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται ειδικοί αντικειµενοφόροι µε µικροθάλαµο οι οποίες ονοµάζονται µετρητές Petroff

64 Hausser. Οι µικροθάλαµοι οι οποίοι έχουν ανοιχθεί στην επιφάνεια της αντικειµενοφόρου, έχουν γνωστό βάθος και στην επιφάνεια του πυθµένα τους φέρουν κάθετη και οριζόντια διαγράµµιση. Ο αριθµός των κυττάρων µπορεί να εκτιµηθεί λαµβάνοντας υπ όψιν τον όγκο του θαλάµου και την αραίωση του δείγµατος. Η µέθοδος αυτή έχει πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα. Πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι ότι εκτός από τον αριθµό των κυττάρων εκτιµούµε το µέγεθος και τη µορφολογία τους. Το κυριότερο µειονέκτηµα της µεθόδου είναι η αδυναµία της να διακρίνει τα ζωντανά από τα νεκρά βακτήρια. Το πρόβληµα αυτό µερικές φορές µπορεί να παρακαµφθεί µε τη χρήση ειδικών χρωστικών οι οποίες χρωµατίζουν διαφορετικά τα νεκρά απ ότι τα ζωντανά κύτταρα. Εικόνα 45. Μέθοδος επίστρωσης σε τρυβλίο µε τη χρήση κρίκου

65 Συµπεράσµατα Ποιά είναι τα συµπεράσµατά σας µε βάση τα αποτελέσµατά σας

66 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5 ΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α Β Εικόνα 1 Όνοµα Φοιτητή Ηµεροµηνία Υπογραφή επιβλέποντα

67 Εισαγωγή οµή και λειτουργία των Βιολογικών µεµβρανών Τα κύτταρα διαθέτουν συστήµατα µεµβρανών που λειτουργούν ως φυσικοί φραγµοί (περιβλήµατα) του εσωτερικού των κυττάρων ή των υποκυττάριων οργανιδίων (πυρήνων, µιτοχονδρίων, Χλωροπλαστών κ.λ.π. στα ευκαρυωτικά κύτταρα). Εκτός όµως αυτής της εµφανούς λειτουργίας τους τα συστήµατα µεµβρανών διαθέτουν και µηχανισµούς µέσω των οποίων πραγµατοποιείται η εκλεκτική µεταφορά µορίων συχνά και ενάντια στην υπάρχουσα βαθµίδωση συγκέντρωσης (ενεργός µεταφορά). Στη επιφάνεια των µεµβρανώνν λαµβάνει χώρα επίσης έντονη µεταβολική δραστηριότητα όπως, αντιδράσεις µεταφοράς ηλεκτρονίων, αντιδράσεις οξείδωσης και αποικοδόµησης, βιοσύνθεση συστατικών της κυτταρικής επιφάνειας και µετασχηµατισµ µός της µεταβολικής ενέργειας. Στην επιφάνεια των µεµβρανών υπάρχουν επίσης υποδοχείς που παίζουν σηµαντικό ρόλο τόσο στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ κυττάρων η κυττάρων και οργανιδίων, όσο και στον καθορισµό της συµπεριφοράς των κυττάρων, όπως συµβαίνει στις περιπτώσεις των υποδοχέων των ορµονών, των νευροδιαβιβαστών, κ.λ.π. Οι µεµβράνες διαιρούν επίσης το κύτταρο σε διαµερίσµατα που χαρακτηρίζονται από ειδικές µεταβολικές διαδικασίες αποτελώντας ένα εµπόδιο στη διαπερατότητα µιας σειράς µεταβολιτών. Εικόνα 2. Οι κυτταρικές µεµβράνες ορίζουν την κυτταρική οντότητα σε σχέση µε το εξωκυττάριο περιβάλλον (πλασµατική µεµβράνη) καθώς και τα υποκυττάρια διαµερίσµατα. Οι πλειοψηφία των µεµβρανών περιέχουν κατά περίπου 40% λιπίδια, 60% πρωτεΐνες καθώς επίσης και µερικά σάκχαρα (που βρίσκονται πάντοτε συνδεµένα µε λιπίδια ή πρωτεΐνες) και ιόντα. Η λειτουργικότητα των βιολογικών µεµβρανών εξαρτάται τόσο από τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια της µεµβράνης όσο και ολόκληρων τµηµάτων της, ή ακόµη και τµηµάτων του κυττάρου. Για να γίνει αντιληπτή η λειτουργία των µεµβρανών είναι απαραίτητο να διερευνήσει κανείς τη φυσική και χηµική τους δοµή. Η µοριακή σύσταση των µεµβρανών διαφέρει τόσο µεταξύ κυττάρων διαφορετικών οργανισµών και κυττάρων διαφορετικών ιστών, όσο και µεταξύ διαφορετικού τύπου µεµβρανών στο ίδιο κύτταρο (π.χ. η σύσταση της πυρηνικής µεµβράνης σε σχέση µε τη µεµβράνη των χλωροπλαστών).

68 Τα λιπίδια που βρίσκονται στις βιολογικές µεµβράνες αποτελούνται κυρίως από µόρια φωσφολιπιδίων και γλυκολιπιδίων που είναι συνδυασµένα µε τάξη ούτως ώστε να δηµιουργούν τόσο υδρόφοβες όσο και υδρόφιλες περιοχές, µε άλλα λόγια είναι αµφιπαθή µόρια (Εικόνα 1). Επίσης η πλειοψηφία των φωσφολιπιδίων της µεµβράνης έχουν δοµές δίπολων εξαιτίας του αρνητικού φορτίου του φωσφόρου και του θετικού φορτίου της χολίνης, της αιθανολαµίνης, της σερίνης κ.λ.π. Τα πολικά µέρη του µορίου των φωσφολιπιδίων είναι υδρόφιλα και αλληλεπιδρούν µε το νερό, ενώ τα υδρόφοβα µέρη έχουν την τάση να συνενώνονται µεταξύ τους και έτσι να παίρνουν ένα χαρακτηριστικό προσανατολισµό που να τα αποµακρύνει από το υδατικό (πολικό ) περιβάλλον. Α Β Εικόνα 3. Α. Ένα φωσφολιπίδιο (φωσφατιδυλοχολίνη) έχει µια υδρόφιλη κεφαλή και µια υδρόφοβη ουρά και ως εκ τούτου είναι αµφιπαθές µόριο. Β. Αυτός του ο χαρακτήρας είναι υπεύθυνος για την διαµόρφωση της διπλοστοιβάδας των λιπιδίων και την δηµιουργία της µεµβράνης.. Tα αµφιπαθή µόρια υπόκεινται σε δύο αντικρουόµενες δυνάµεις. H υδρόφιλη κεφαλή τους ελκύεται από το νερό ενώ η υδρόφοβη υδρογονανθρακική ουρά το αποφεύγει. Oταν τα µόρια αυτά βρεθούν σε υδατικό περιβάλλον σχηµατίζουν δοµές που εκθέτουν την υδρόφιλη περιοχή τους στο νερό και αποκρύβουν την υδρόφοβη περιοχή από αυτό.

69 Τα γλυκολιπίδια των βιολογικών µεµβρανών καθορίζουν το ανοσολογικό προφίλ των κυττάρων των ιστών, όντας υπεύθυνα σε µεγάλο βαθµό για το φορτίο της επιφάνειας των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες ενσωµατώνονται στα διπλά στρώµατα των λιπιδίων όπου και δεσµεύονται µε δυνάµεις πολύ διαφορετικής ισχύος και γι αυτό είναι δύσκολο να προσδιοριστούν. Μερικές πρωτεΐνες µπορούν να αποχωριστούν από τις µεµβράνες µε σχετικά ήπιες διαδικασίες (π.χ. πλύσιµο µε διαλύµατα αλάτων), ενώ σε άλλες απαιτείται η χρήση αντιδραστηρίων που παρεµποδίζουν τις έλξεις µεταξύ πρωτεϊνών και λιπιδίων, όπως είναι τα απορρυπαντικά. Το µοντέλο του ρευστού µωσαϊκού για τη δοµή των µεµβρανών (Εικόνα 2) που προτάθηκε από τους Singer και Nicolson το 1972, στο οποίο οι πρωτεΐνες παρουσιάζονται ως διάσπαρτα νησιά µέσα στη θάλασσα που αποτελείται από τη διπλοστιβάδα των λιπιδίων, θεωρείται ότι προσεγγίζει σε µεγάλο βαθµό την πραγµατικότητα για τα περισσότερα είδη µεµβρανών. Εικόνα 4. Η χωροθέτηση των πρωτεϊνών εντός της λιπιδιακής διπλοστιβάδας συναρτάται από τον βιολογικό τους ρόλο (µεταφορά ιόντων, υποδοχείς κ.α.) ιαπερατότητα κυτταρικών µεµβρανών Mε τα µέχρι τώρα δεδοµένα είναι σαφές ότι οι κυτταρικές µεµβράνες είναι δυναµικές δοµές. εν θα µπορούσε να είναι και διαφορετικά αφού αποτελούν όχι µόνο δοµικά αλλά και λειτουργικά στοιχεία του κυττάρου. Mια σηµαντική λειτουργία της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης είναι η εκλεκτική είσοδος και έξοδος ουσιών από το κύτταρο. H διαπερατότητα της µεµβράνης συµβάλλει στην διατήρηση των ενδοκυττάριων φυσιολογικών συνθηκών. H διατήρηση της ισορροπίας µεταξύ της οσµωτικής πίεσης του εσωτερικού του κυττάρου και του εξωτερικού µέσου οφείλεται στην κυτταρική µεµβράνη. Eίναι γνωστό ότι ώσµωση είναι η µετακίνηση του νερού από µια περιοχή χαµηλής συγκέντρωσης µιας

70 ουσίας σε µια περιοχή υψηλότερης συγκέντρωσης. Στους ανώτερους ζωικούς οργανισµούς η οσµωτική πίεση των υγρών του σώµατος ρυθµίζεται από τα νεφρά και η οσµωτική πίεση των κυττάρων είναι περίπου ίση µε αυτή των εξωκυττάριων υγρών. Aυτό εξασφαλίζεται από την εξωκυττάρια ύπαρξη ιόντων, κυρίως Na και Cl. Aυτή η οσµωτική ισορροπία επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια ειδικών µορίων της κυτταρικής µεµβράνης που ρυθµίζουν την µεταφορά ιόντων µεταξύ εσωκυττάριου και εξωκυττάριου χώρου διαφυλάσσοντας µε αυτόν τον τρόπο την οσµωτική ισορροπία. Στα φυτά το ενδοκυττάριο υγρό έχει υψηλότερη οσµωτική πίεση από ότι ο εξωκυττάριος χώρος. Για το λόγο αυτό τα φυτικά κύτταρα έχουν µια επιπλέον δοµή εξωτερικά της κυτταρικής µεµβράνης. Πρόκειται για το κυτταρικό τοίχωµα. Eίναι ένα ανθεκτικό περίβληµα που αποτελείται από διάφορους πολυσακχαρίτες ο κυριότερος από τους οποίους είναι η κυτταρίνη, η πιο διαδεδοµένη οργανική ουσία στον κόσµο. Tο κυτταρικό τοίχωµα προστατεύει τα φυτικά κύτταρα από διάρρηξη και τα διατηρεί σε κατάσταση διαστολής. Σε πολλούς µονοκύτταρους οργανισµούς η οσµωτική ισορροπία διατηρείται χάρη σε ένα συσταλτό κενοτόπιο το οποίο βγάζει νερό από το κυτταρόπλασµα στο εξωτερικό µέσο. Σε όλες πάντως τις περιπτώσεις η εκλεκτική διαπερατότητα των µεµβρανών δηµιουργεί διαφορές µεταξύ του ενδοκυττάριου και εξωκυττάριου χώρου µε αποτέλεσµα την εµφάνιση ενός ηλεκτρικού δυναµικού εκατέρωθεν της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης. H κυτταρική µεµβράνη είναι εύκολα διαπερατή από µικρά υδρόφοβα µόρια, όπως O2, CO 2, από µικρά µη φορτισµένα πολικά µόρια, όπως το νερό η γλυκερόλη και η αιθανόλη. Τα µόρια αυτά µπορούν απλά να διαχυθούν µέσω της µεµβράνης. εν µπορούν όµως να διαχυθούν ιόντα H +, Na +, K +, Ca ++, Cl - και µεγάλα πολικά µόρια όπως αµινοξέα, νουκλεοτίδια γλυκόζη κ.α,. Tα µόρια αυτά εισέρχονται και εξέρχονται από το κύτταρο µε τη βοήθεια µεµβρανικών πρωτεϊνών µεταφοράς. Πρόκειται για πρωτεΐνες αντίστοιχες µε τις περµεάσες που απαντώνται στα προκαρυωτικά κύτταρα. Εργαστηριακός εξοπλισµός Μικροσκόπιο Θερµοκολητής µεµβρανών Ζυγαριά Υλικά Μεµβράνες διαπίδυσης Βολβοί κρεµµυδιού Βολβοί παντζαριού ιαλύµατα Απιονισµένο Η 2 Ο ιάλυµα σουκρόζης 0.2Μ ιάλυµα σουκρόζης 0.4Μ

71 Πειραµατική πορεία Α. Όσµωση και κυτταρικές µεµβράνες 1. Γεµίστε τρείς µεµβράνες διαπίδυσης µε 20ml διαλύµατος 0,2Μ σουκρόζης, αφαιρέστε προσεκτικά τον αέρα και κλείστε τις αεροστεγώς. 2. Ζυγίστε κάθε µεµβράνη και σηµειώστε την µέτρησή σας. Τοποθετείστε α. µία µεµβράνη σε δοχείο που περιέχει απιονισµένο νερό, β. µία σε διάλυµα που περιέχει 0.2Μ σουκρόζη και γ. µία σε διάλυµα που περιέχει 0.4Μ σουκρόζη. 3. Μετά από διάστηµα 2 ωρών ανασύρατε µια µεµβράνη από κάθε ένα από τα τρία δοχεία σκουπίστε την περίσσεια διαλύµατος που υπάρχει εξωτερικά και ζυγίστε. Σηµειώστε την µέτρησή σας.. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αρχική µέτρηση βάρους γρ Μετά από διαπίδυση 30min Σε Η2Ο Μεµβράνη 1 Σε 0.2Μ σουκρόζη Μεµβράνη 2 Σε 0.4Μ σουκρόζη Μεµβράνη 3

72 Β. Όσµωση στο φυτικό κύτταρο 1. Φτιάξτε δύο παρασκευάσµατα επιδερµίδας βολβού κρεµµυδιού για παρατήρηση στο µικροσκόπιο. 2. Στο ένα χρησιµοποιείστε Η 2 Ο και στο δεύτερο διάλυµα 10% NaCl. 3. Παρατηρείστε στο µικροσκόπιο και σκιαγραφείστε στις σηµειώσεις σας. 4. Εξηγείστε την εικόνα.; 5. Συµπληρώστε την λεζάντα στην εικόνα 11 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η2Ο 10%ΝαCl Γ Αποδιάταξη µεµβρανών 1. Τµήστε προσεκτικά µε το νυστέρι τον βολβό ενός παντζαριού ή όποιου διαθέσιµου τµήµατος φυτού µε χρωστικές. Η ύπαρξη των χρωστικών χρησιµοποιείτε σαν δείκτης ακεραιότητας των µεµβρανών. 2. Μεταφέρετε µε τη λαβίδα τα κοµµάτια του παντζαριού σε τρία διαφορετικά δοχεία που περιέχουν Η2Ο Η2Ο σε θερµοκρασία βρασµού και έναν οργανικό διαλύτη, χλωροφόρµιο. 3. Ανακινείστε δυνατά τα τρία δοχεία. Τι παρατηρείτε; 4. Στο δοχείο που περιέχει χλωροφόρµιο προσθέστε ίση ποσότητα νερού και ανακινείστε δυνατά. Τι παρατηρείτε;

73 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η2Ο Η2Ο C χλωροφόρµιο Συµπεράσµατα-Σχόλια-Παρατηρήσεις

74 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 6 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΠΟ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΣΤΟΜΑΤΙΚΗΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑΣ. Εικόνα 1. Εάν κατασκευάσουµε µια σκάλα µε τόσα σκαλοπάτια όσα και τα ζεύγη βάσεων του DNA που περιέχεται σε 10 µόλις ανθρώπινα κύτταρα, η σκάλα αυτή θα έχει µήκος 30x10 6 χιλιόµετρα και θα ήταν ικανή να καλύψει την απόσταση µεταξύ Γης-Αρη. Oνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

75 Εισαγωγή Το DNA (δεόξυ-ριβονουκλεικό οξύ) είναι το µόριο φορέας της γενετικής πληροφορίας για όλους τους οργανισµούς: βακτήρια, πρωτόκτιστα, µύκητες, φυτά και ζώα. Κάθε άτοµο ενός είδους, έχει το δικό του µοναδικό σε σύσταση DNA, που το διαφοροποιεί από τα άλλα άτοµα του ίδιου είδους. Εξαίρεση αποτελούν οι οργανισµοί που αναπαράγονται αγενώς (γιατί??). Σε µοριακό επίπεδο, ένα µόριο DNA συγκροτείται από δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες (κλώνοι DNA) που διατάσσονται αντιπαράλληλα σχηµατίζοντας µια διπλή έλικα. Κάθε αλυσίδα αποτελείται από νουκλεοτίδια τα οποία συνδέονται µεταξύ τους οµοιοπολικά. Τα νουκλεοτίδια συγκροτούνται από ένα σάκχαρο (δεόξυ-ριβόζη) συνδεδεµένο µε µια φωσφορική οµάδα και µια αζωτούχο βάση. Η αζωτούχος βάση µπορεί να είναι αδενίνη (Α), κυτοσίνη (C) ), γουανίνη (G) ή θυµίνη (T). Οι βάσεις αυτές συνδεόµενες κατά µοναδικό τρόπο µεταξύ τους µε δεσµούς υδρογόνου Α-Τ και (G-C) είναι υπεύθυνες για τη συγκρότηση της διπλής έλικας του DNΑ όπως φαίνεται στο σχήµα που ακολουθεί. Εικόνα 2. Οι δοµικοί λίθοι του DNA και η διπλή έλικα.

76 Οι βάσεις αυτές δίνουν επίσης την ικανότητα στο DNA να κωδικοποιεί την γενετική πληροφορία. Η κωδικοποίηση αυτή βασίζεται στη σειρά - αλληλουχία των βάσεων κατά µήκος ενός κλώνου DNA. Κάθε βάση µπορεί να θεωρηθεί σαν ένα γράµµα ενός αλβαβήτου που χρησιµοποιείται για να γράφονται βιολογικά µηνύµατα στη δοµή του DNA. Tα µηνύµατα αυτά µεταγράφονται σε µόρια RNA και µεταφράζονται σε πρωτεινικά µόρια µέσω ενός µοναδικού µηχανισµού. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το DNA του πυρήνα δεν απαντάται ως «γυµνό» µόριο. Αλληλεπιδρά µε πρωτείνες οι οποίες συσκευάζουν το DNA σε µια πιο συµπαγή δοµή που ονοµάζεται χρωµατίνη. Στην φάση της κυτταρικής διαίρεσης παρατηρείται η µέγιστη δυνατή συµπύκνωση του DNA και είναι ορατές οι δοµές που ονοµάζονται χρωµοσώµατα. Εικόνα 3 Επιθηλιακά κύτταρα από το εσωτερικό της στοµατικής κοιλότητας όπως φαίνονται στο µικροσκόπιο. Σκοπός της σηµερινής άσκησης είναι να αποµονώσετε το DNA από τα δικά σας κύτταρα. Τα κύτταρα που θα χρησιµοποιήσετε είναι επιθηλιακά κύτταρα από το εσωτερικό του στόµατός σας. Πρόκειται για κύτταρα που πολλαπλασιάζονται 1 έως 2 φορές την ηµέρα, συνεπώς έχουν µεγάλους ρυθµούς ανανέωσης. Το πρωτόκολλο συνοπτικά περιλαµβάνει: α) τη συλλογή των κυττάρων σε νερό β) τη λύση των κυτταρικών µεµβρανών µε τη χρησιµοποίηση του απορρυπαντικού SDS γ) την επίδραση πρωτεασών για την πέψη των πρωτεινών και την απελευθέρωση του DNA και δ) την προσθήκη κρύας αιθανόλης για την καταβύθιση του DNA.

77 Εργαστηριακός εξoπλισµός Υδατόλουτρο που έχει ρυθµιστεί στους 50 0 C Πακέτο υλικών kit της εταιρείας ΒΙΟ-RAD που περιέχει: 1) ιάλυµα λύσης 50mM Tris, 1%SDS ph 8 2) ιάλυµα πρωτεάσης-αλάτων. Η συγκέντρωση της πρωτεάσης είναι 100mg/ml Σηµειώσεις Ο καθένας από εσάς θα αποµονώσει το δικό του DNA Είναι σηµαντικό να χρησιµοποιήσετε την ακριβή ποσότητα όλων των διαλυµάτων που απαιτούνται. Πειραµατική πορεία 1. Σηµειώστε τα αρχικά σας στον αποστειρωµένο φυγοκεντρικό σωλήνα των 15ml και τοποθετήστε τον στο στατώ. 2. Προσθέστε ποσότητα 3ml πόσιµου Η 2 Ο στο φυγοκεντρικό σωλήνα. Απαλά ξύστε το στόµα σας χρησιµοποιώντας τα δόντια και τη γλώσσα σας. Μεταφέρετε το νερό και ξεπλύνατε το στόµα σας για 30 sec. Είναι σηµαντικό να εξαντλήσετε το χρόνο γιατί ο αριθµός των επιθηλιακών κυττάρων που θα αποσπαστούν είναι καθοριστικός για την ποσότητα του DNA που θα αποµονώσετε. Μεταφέρετε το νερό (που περιέχει τα κύτταρά σας) µε προσοχή πίσω στον φυγοκεντρικό σωλήνα. 3. Προσθέστε 2ml lysis buffer (διάλυµα λύσης των κυττάρων) στο σωλήνα σας. Κλείστε το σωλήνα και ανακινήστε τον 5 φορές σύµφωνα µε τις οδηγίες που θα σας δοθούν. 4. Προσθέστε στο κυτταρικό εκχύλισµα 5 σταγόνες διαλύµατος πρωτεάσης-αλάτων. Κλείστε το σωλήνα και ανακινήστε τον 5 φορές σύµφωνα µε τις οδηγίες που θα σας

78 δοθούν. Τοποθετείστε το σωλήνα σε υδατόλουτρο που έχει ρυθµιστεί στους 50 0 C και αφήστε τον για 10min. 5. Προσθέστε 10 ml παγωµένη αιθανόλη (95%) µε προσοχή χωρίς να την αναµίξτε µε την υδατική φάση σύµφωνα µε τις οδηγίες. Αφήστε τον σωλήνα στον πάγκο για 5 min. Τι παρατηρείτε στο σηµείο επαφής των δύο φάσεων. Ανακινείστε απαλά το σωλήνα σας. Τα λεπτά διαφανή ή άσπρα νηµάτια που παρατηρείτε είναι τα µόρια του δικού σας DNA.

79 Συµπεράσµατα-Σχόλια-Παρατηρήσεις Μπορείτε να απαντήσετε τις παρακάτω ερωτήσεις; 1. Ποιος είναι ο ρόλος του απορυπαντικού SDS στο διάλυµα λύσης; 2. Γιατί προσθέτε παγωµένη αιθανόλη στην υδατική φάση; 3. Ποια από τις δύο χρωστικές που έχετε χρησιµοποιήσει µέχρι τώρα θα µπορούσε να προσδεθεί στο DNA. Η οξική ορκεϊνη η το Jannus green ή και οι δύο;

80 EPΓAΣTHPIAKH AΣKHΣH 7 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΙΑΙΡΕΣΗ ΜΙΤΩΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΩΝ ΣΤΑ ΙΩΝ ΤΗΣ ΜΙΤΩΣΗΣ ΣΕ ΦΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ΖΩΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Εικόνα 1. Ανάφαση-Τελόφαση Ζωικού κυττάρου. Παρατήρηση µε συνεστιακό µικροσκόπιο ( χρωµοσώµατα µπλε πρωτείνες του κυτταροσκελετου κίτρινο και κόκκινο). Oνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

81 Eισαγωγή στην µίτωση Κυτταρικός κύκλος Με τον όρο κυτταρικός κύκλος ή κύκλος ζωής ενός κυττάρου εννοούµε το χρονικό διάστηµα που µεσολαβεί από την εµφάνιση ενός κυττάρου µέχρι το διπλασιασµό του. Ο χρόνος αυτός υποδιαιρείται σε δύο περιόδους, τη Μεσόφαση και τη φάση της Μίτωσης. Τόσο η µεσόφαση όσο και η Μίτωση υποδιαιρούνται µε τη σειρά τους σε µικρότερες περιόδους. Κάθε περίοδος, χαρακτηρίζεται από ένα συγκεκριµένο κυτταρικό γεγονός. Α) Μεσόφαση: Κατά τη Μεσόφαση, το κύτταρο δεν υπόκειται σε διαδικασία διαίρεσης. Η Μεσόφαση υποδιαιρείται επιπλέον σε: i) φάση G1 (Gap1). Κατά τη φάση αυτή το κύτταρο είναι µεταβολικά ενεργό, δηλαδή παρουσιάζει αυξηµένη βιοχηµική και βιοσυνθετική δραστηριότητα. Ο ρυθµός µεταγραφής και µετάφρασης είναι πολύ υψηλός. Πρωτεϊνες, λιπίδια και διάφορα άλλα µακροµόρια συντίθενται κυρίως στη φάση αυτή. Σε έναν πολυκύτταρο οργανισµό, τα κύτταρα που βρίσκονται σε αυτή τη φάση επιτελούν την συγκεκριµένη λειτουργία µε την οποία έχουν επιφορτισθεί. Εικόνα 2. ιαγραµµατική απεικόνιση ενός κυτταρικού κύκλου. ii) Φάση S (Synthesis) Κατά τη φάση αυτή το κύτταρο διπλασιάζει το γενετικό του υλικό. Από τη στιγµή που το κύτταρο θα εισέλθει στη φάση αυτή, η πορεία του προς την κυτταρική διαίρεση είναι σε µεγάλο βαθµό προκαθορισµένη. Όλες οι λειτουργίες του κυττάρου πλην του διπλασιασµού του γενετικού του υλικού, µειώνονται στο ελάχιστο. Στα πλαίσια ενός πολυκύτταρου οργανισµού, ένα κύτταρο που βρίσκεται στη φάση αυτή παύει πλέον να λειτουργεί ως κύτταρο µε εξειδικευµένη λειτουργία. Ένα σηµαντικό γεγονός πρέπει να προσεχθεί εδώ, γιατί βοηθάει στην κατανόηση

82 της µακροσκοπικής δοµής των χρωµοσωµάτων που παρατηρούνται αργότερα κατά τη Μίτωση. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα κατά τη φάση G1 περιέχουν στον πυρήνα τους έναν αριθµό δίκλωνων µορίων DNA. Τα µόρια αυτά διπλασιάζονται κατά τη φάση S. Τα δύο νέα µόρια που προκύπτουν από το διπλασιασµό ενός αρχικού µορίου δεν αποχωρίζονται µεταξύ τους αλλά παραµένουν συνδεδεµένα µεταξύ τους σε µια περιοχή που ονοµάζεται κεντροµερίδιο. Στο γεγονός αυτό οφείλεται η χαρακτηριστική µορφολογία των χρωµοσωµάτων κατά τη Μίτωση. Όσον αφορά αυτή καθεαυτή τη διαδικασία του διπλασιασµού του DNA, πρώτα διπλασιάζονται οι ενεργές περιοχές της χρωµατίνης και ακολουθούν οι µη ενεργές περιοχές. Aρχή S Μέσο S Τέλος S Εικόνα 3. Ταυτοποίηση των θέσεων αντιγραφής του DNA στη φάση S. Αρχικά η αντιγραφή εκτείνεται σε όλο τον πυρήνα, ενώ προς το τέλος επικεντρώνεται σε ορισµένες περιοχές του κέντρου και της περιφέρειάς. Πρώτα αντιγράφονται οι ενεργές περιοχές της χρωµατίνης. ii) φάση G2 (Gap2). Το διάστηµα µεταξύ του τέλους της φάσης S και της έναρξης της Μίτωσης, ορίζεται ως φάση G2. εν είναι απόλυτα διευκρινισµένα τα γεγονότα της φάσης αυτής. Πιστεύεται ότι κατά τη φάση αυτή πραγµατοποιείται η έναρξη της σύνθεσης και του πολυµερισµού των µορίων τοµπουλίνης, προκειµένου να σχηµατισθούν οι µικροσωληνίσκοι οι οποίοι θα συγκροτήσουν την πυρηνική άτρακτο κατά την µιτωτική διαδικασία Εικόνα 4. Μεσόφαση

83 Β) Μίτωση: H µίτωση είναι η συντοµότερη αλλά ταυτόχρονα η εντυπωσιακότερη περίοδος του κυτταρικού κύκλου, εξαιτίας του γεγονότος της συµπύκνωσης του DNA, που κάνει δυνατή την µικροσκοπική παρατήρηση των χρωµοσωµάτων. Πρέπει να σηµειωθεί ότι µόνο κατά την διάρκεια της µίτωσης είναι υπαρκτές και συνεπώς αναγνωρίσιµες οι δοµές οι οποίες καλούνται χρωµοσώµατα. Tα στάδια της Μίτωσης όπως φαίνονται στο µικροσκόπιο µετά από χρώση του DNA είναι τα ακόλουθα: i) Πρόφαση. Tο µεγαλύτερο σε διάρκεια στάδιο της µίτωσης. Tα ινίδια της χρωµατίνης αρχίζουν να συµπυκνώνονται για να πάρουν τελικά την κλασική µορφή των χρωµοσωµάτων. Έξω από τον πυρήνα αρχίζει να συναρµολογείται η πυρηνική άτρακτος, µέσω της διαδικασίας πολυµερισµού µορίων τουµπουλίνης α και β. Ο πολυµερισµός ξεκινά από τα κέντρα οργάνωσης των µικροσωληνίσκων. Τα κέντρα οργάνωσης των µικροσωληνίσκων, στα ζωικά κύτταρα ταυτίζονται µε τα κεντροσωµάτια τα οποία έχουν ήδη διπλασιστεί και αρχίζουν να αποµακρύνονται το ένα από το άλλο. Στα φυτικά κύτταρα κεντροσωµάτια δεν υπάρχουν. Η πυρηνική άτρακτος όµως σχηµατίζεται κανονικά και ως εκ τούτου τα κέντρα οργάνωσης δεν είναι ευδιάκριτες δοµές. Η περιοχή του κέντρου οργάνωσης, είτε πρόκειται για ζωικά είτε για φυτικά κύτταρα χαρακτηρίζεται από υψηλή συγκέντρωση τουµπουλίνης γ. Εικόνα 5 Πρόφαση ii) Mετάφαση. Κατά τη φάση αυτή, τα χρωµοσώµατα βρίσκονται στην πιο συµπυκνωµένη τους µορφή. Για το λόγο αυτό οι περισσότερες παρατηρήσεις χρωµοσωµάτων γίνονται σε αυτό το στάδιο (µεταφασικά χρωµοσώµατα). O πυρηνικός φάκελος αποδιατάσσεται ώστε η άτρακτος να µπορεί να προσδεθεί στα χρωµοσώµατα. Mεε την έναρξη της µετάφασης τα χρωµοσώµατα αρχίζουν να κινούνται προς την κεντρική περιοχή του κυττάρου και τελικά διατάσσονται µε τους κινητοχώρους τους πάνω σε ένα νοητό επίπεδο που ονοµάζεται ισηµερινό

84 επίπεδο ή µεταφασική πλάκα. Το επίπεδο αυτό είναι κάθετο στον κατά µήκος άξονα της ατράκτου. Παράλληλα τα χρωµοσώµατα προσδένονται µε τους κινητοχώρους τους στους µικροσωληνίσκους της µιτωτικής ατράκτου, οποία στη φάση αυτή είναι πλήρως δοµηµένη. Εικόνα 6. Μετάφαση iii) Aνάφαση. H ανάφαση αρχίζει όταν σχιστεί στα δύο το κεντροµερίδιο του κάθε χρωµοσώµατος, γεγονός που επιτρέπει το διαχωρισµό των αδελφών χρωµατίδων. Τότε, η καθεµιά από τις δύο αδελφές χρωµατίδες του κάθε χρωµοσώµατος,οδεύει σε διαφορετικό πόλο της ατράκτου. Η πορεία τους καθοδηγείται από τους µικροσωληνίσκους της ατράκτου. Το καθαρό αποτέλεσµα της όλης διαδικασίας είναι ο πλήρης διαχωρισµός των αδελφών χρωµατίδων όλων των χρωµοσωµάτων. Κάθε χρωµατίδα θεωρείται πλέον χρωµόσωµα. Εικόνα 7. Ανάφαση

85 iv) Tελόφαση- Kυτταροκίνηση Στην τελόφαση σε κάθε πόλο της ατράκτου έχει συγκεντρωθεί µία πλήρης σειρά χρωµοσωµάτων. H άτρακτος αποδιοργανώνεται πλήρως. Πυρηνικοί φάκελοι σχηµατίζονται γύρω από κάθε πόλο και περιβάλλουν τα χρωµοσώµατα. Τα χρωµοσώµατα αρχίζουν να αποσυσπειρώνονται. Στην κυτταροκίνηση, διαιρείται το κυτταρόπλασµα και µε αυτό τον τρόπο σχηµατίζονται δύο νέα κύτταρα. Η όλη διαδικασία διαφέρει µεταξύ ζωικών και φυτικών κυττάρων. Στα ζωικά κύτταρα το κυτταρόπλασµα διαιρείται από έναν δακτύλιο ακτίνης /µυοσίνης που περισφίγγει το πατρικό κύτταρο µεταξύ των δύο νέων πυρήνων. Στα φυτικά κύτταρα η κυτταροκίνηση πραγµατοποιείται µέσω της δηµιουργίας µιας ισηµερινής κυτταρικής πλάκας από µικροσωληνίσκους στην οποία προστίθεται κυτταρίνη και πηκτίνη. Η πλάκα αυτή ονοµάζεται φραγµοπλάστης Εικόνα 8. Τελόφαση H διάρκεια ενός κυτταρικού κύκλου ποικίλει ανάλογα µε το είδος στο οποίο αναφερόµαστε και ανάλογα µε τον κυτταρικό τύπο. Έτσι, ο κυτταρικός κύκλος ενός πρώιµου εµβρυικού κυττάρου βατράχου είναι 30 λεπτά, ενός σακχαροµύκητα είναι 1,5-3 ώρες ενώ ενός ανθρώπινου ηπατοκυττάρου είναι περίπου 1 έτος. Tέλοςς υπάρχουν κύτταρα που δεν διαιρούνται καθόλου. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν συνήθως διαφοροποιηµένα κύτταρα, όπως τα µυϊκά και τα νευρικά κύτταρα ενός ενήλικα ζωικού οργανισµού. Σκοπός της σηµερινής άσκησης είναι, µέσω της παρατήρησης της µιτωτικής διεργασίας, Η διάκριση και ταυτοποίηση µεταξύ χρωµατίνης και χρωµοσωµάτων Η αναγνωριση µεσοφασικών και µιτωτικών κυττάρων Η ταυτοποίηση των σταδίων της µίτωσης.

86 Απαιτούµενος Eργαστηριακός Eξοπλισµός Mικροσκόπιο Mονιµοποιηµένα παρασκευάσµατα ζωικών και φυτικών ιστών που περιέχουν κύτταρα σε διάφορες φάσεις της µίτωσης. Eργαστηριακό Πρωτόκολλο ίνονται τα ακόλουθα παρασκευάσµατα: 1. Έµβρυο ακρίδας 2. Ακρορίζιο κρεµµυδιού Παρατηρήστε προσεκτικά τα παρασκευάσµατα και σκιαγραφείστε 1.Την χρωµατίνη σε αντιπαραβολή µε τα χρωµοσώµατα 2.Ενα µεσοφασικό κύτταρο σε αντιπαραβολή µε ένα µιτωτικό κύτταρο 3. Μεγάλο µέρος της εικόνας του ιστού στην οπία διακρίνονται τα διαφορετικά κύτταρα

87 Εντοπίστε και σκιαγραφείστε ένα κύτταρο σε κάθε µιτωτική φάση Τυπική εικόνα µιτωτικών κυτταρων σε ακρορίζια κρεµµυδιού. Μπορείτε να διακρίνετε τα κύτταρα, τα κυτταρικά τοιχώµατα, τα µιτωτικά κύτταρα. Πχ ένα κύτταρο στην ανάφαση.

88 Ένα κύτταρο στην πρόφαση 3.2 Ένα κύτταρο στην µετάφαση 3.3 Ένα κύτταρο στην ανάφαση 3.4 Ένα κύτταρο στην τελόφαση

89 Τα συµπεράσµατά σας

90 EPΓAΣTHPIAKH AΣKHΣH 8 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΙΑΙΡΕΣΗ-ΜΕΙΩΣΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΡΕΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΙΩΤΙΚΗΣ ΙΑΙΡΕΣΗΣ ΣΕ ΦΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ΖΩΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Εικόνα 1. εύτερη µειωτική διαίρεση σε ανθήρες κρίνου Oνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

91 Eισαγωγή στη µείωση Tο 1883 παρατηρήθηκε για πρώτη φορά ότι το γονιµοποιηµένο ωάριο ενός συγκεκριµένου σκουληκιού περιείχε τέσσερα χρωµοσώµατα, ενώ τα σπερµατοζωάρια και τα ωάρια του περιείχαν µόνο δύο. H παρατήρηση αυτή σηµατοδότησε την ανακάλυψη της µείωσης. Mείωση είναι η διαδικασία παραγωγής των αναπαραγωγικών κυττάρων (γαµετών) των εγγενώς αναπαραγόµενων οργανισµ µών. Mε την µείωση επιτυγχάνεται η µείωση στο µισό του αριθµού των χρωµοσωµάτων. Με τον τρόπο αυτό, οι διπλοειδείς οργανισµοί παράγουν γαµέτες µε απλοειδή αριθµ µό χρωµοσωµάτων. H γονιµοποίηση, η σύντηξη δηλαδή του θηλυκού και του αρσενικού γαµέτη δίνει στη συνέχεια το ζυγωτό, το πρώτο κύτταρο ενός διπλοειδούς οργανισµού. Εικόνα 2 Η µείωση είναι προϋπόθεση της εγγενούς αναπαραγωγής.. Με τη µείωση οι διπλοειδείς οργανισµοί µειώνουν κατά το ήµισυ τον αριθµό των χρωµοσωµάτων τους στα αναπαραγωγικά τους κύτταρα (γαµέτες). Η γονιµοποίση έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό του ζυγώτη, του πρώτου διπλοειδούς κυττάρου του νέου οργανισµού. H µείωση περιλαµβάνει δύο διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις την πρώτη και τη δεύτερη µειωτική διαίρεση αντίστοιχα. Πριν την έναρξη των κυτταρικών διαιρέσεων πραγµατοποιείται διπλασιασµός του γενετικού υλικού. Μεταξύ των δύο µειωτικών διαιρέσεων δεν πραγµατοποιείται άλλος διπλασιασµός του γενετικού υλικού. ύο γεγονότα που λαµβάνουν χώρα κατά την πρώτη µειωτική διαίρεση έχουν σαν

92 αποτέλεσµα την αύξηση της γενετικής ποικιλότητας. Τα γεγονότα αυτά είναι: α) ο επιχιασµός µεταξύ οµόλογων χρωµοσωµάτων στην πρόφαση της πρώτης µειωτικής διαίρεσης που δηµιουργεί «νέα» χρωµοσώµατα και β) ο τυχαίος διαχωρισµός των µη οµόλογων χρωµοσωµάτων στην ανάφαση που δηµιουργεί «άπειρους» συνδυασµούς χρωµοσωµάτων στους παραγόµενους γαµέτες. Η ονοµατολογία των σταδίων της µείωσης είναι ίδια µε αυτήν της µίτωσης εξαιτίας της οµοιότητάς τους κατά τη µικροσκοπική παρατήρηση. Η βιολογική σηµασία των σταδίων αυτών είναι προφανώς διαφορετική. Συνοπτικά, τα στάδια της µείωσης είναι τα ακόλουθα: Πρώτη µειωτική διαίρεση Πρόφαση I Tο πρώτο και µεγαλύτερο χρονικά στάδιο της πρώτης µειωτικής διαίρεσης είναι η πρόφαση.tο πρώτο στάδιο της πρόφασης ονοµάζεται λεπτοταινία αφού τα χρωµοσώµατα, που τώρα αρχίζουν να συµπυκνώνονται εµφανίζονται σαν λεπτά νηµάτια. Tο επόµενο στάδιο είναι η ζυγοταινία. Eδώ τα οµόλογα χρωµοσώµατα πλησιάζουν µεταξύ τους, συνδέονται καθ όλο το µήκος τους και έτσι σχηµατίζονται ζευγάρια οµόλογων χρωµοσωµάτων. H διαδικασία σύνδεσης των οµολόγων χρωµοσωµάτων ονοµάζεται σύναψη. Στη συνέχεια τα χρωµοσώµατα συνεχίζουν να συµπυκνώνονται µε αποτέλεσµα να κονταίνουν και να παχαίνουν. Περνάµε έτσι στο στάδιο της παχυταινίας, όπου διακρίνουµε µια τετράδα για κάθε οµόλογο ζεύγος χρωµοσωµάτων. Στο στάδιο αυτό συµβαίνει το φαινόµενο του διασκελισµού ή επιχιασµού (crossing over) που είναι αποτέλεσµα της σύναψης µεταξύ των οµόλογων χρωµοσωµάτων. Kατά τον διασκελισµό µία χρωµατίδα από το ένα µέλος του ζεύγους των οµόλογων χρωµοσωµάτων ανταλλάσει γενετικό υλικό µε µια χρωµατίδα του άλλου µέλους. Η ανταλλαγή γενετικού υλικού µεταξύ µη αδελφών χρωµατίδων οµόλογων χρωµοσωµάτων, είναι ορατή στο µικροσκόπιο. Στα τµήµατα των χρωµατίδων στα οποία πραγµατοποιείται ανταλλαγή γενετικού υλικού εµφανίζονται σχηµατισµοί που µοιάζουν µε το γράµµα X. Oι σχηµατισµοί αυτοί ονοµάζονται χιάσµατα και παρατηρούνται καλύτερα κατά το επόµενο στάδιο, το στάδιο της διπλοταινίας. Κατά το στάδιο της διπλοταινίας, τα οµόλογα χρωµοσώµατα αρχίζουν να αποχωρίζονται µεταξύ τους. Εικόνα 3. Επιχιασµ µός (cross over) ενός ζεύγους οµόλογων χρωµ µοσωµάτων. Aκολουθεί το στάδιο της διακίνησης κατά το οποίο τα χρωµ µοσώµατα που είναι

93 πλήρως συµπυκνωµένα, αρχίζουν να κινούνται ως δυάδες (δισθενή χρωµοσώµατα, δύο οµόλογα χρωµοσώµατα) προς το ισηµερινό επίπεδο της ατράκτου. Εικόνα 4. Αρχή της πρόφασης της πρώτης µειωτικής διαίρεσης σε ανθήρες κρίνου. Mετάφαση I Στην φάση αυτή αρχίζει να διαλύεται η πυρηνική µεµβράνη, αποδιατάσσονται οι πυρηνίσκοι και τα χρωµοσώµατα ολοκληρώνοντας την µετακίνησή τους, παίρνουν θέση στο ισηµερινό επίπεδο της ατράκτου. Εικόνα 5 Πρόφαση- Αρχή µετάφασης της πρώτης µειωτικής διαίρεσης σε ανθήρες κρίνου

94 Aνάφαση I Στην ανάφαση της πρώτης µειωτικής διαίρεσης έχουµε τον αποχωρισµό των οµόλογων χρωµοσωµάτων. Kάθε χρωµόσωµα ενός ζεύγους οµολόγων χρωµοσωµάτων, κινείται προς διαφορετικό πόλο σε σχέση πάντα µε το οµολογό του. Tελόφαση I H φάση αυτή σηµατοδοτεί το τέλος της πρώτης µειωτικής διαίρεσης. Aπό ένα κύτταρο έχουν προκύψει πλέον δύο κύτταρα. O αριθµός των χρωµοσωµάτων του κάθε κυττάρου έχει µειωθεί στο µισό του αριθµού των χρωµοσωµάτων του αρχικού κυττάρου. εύτερη µειωτική διαίρεση Η δεύτερη µειωτική διαίρεση ακολουθεί την πρώτη. Μεταξύ των δύο διαιρέσεων δεν παρεµβάλλεται διπλασιασµός του DNA. H δεύτερη µειωτική διαίρεση µοιάζει περισσότερο µε µια κλασική µιτωτική διαίρεση. Πρόφαση II Tα χρωµοσώµατα αποτελούνται από δύο χρωµατίδες, αφού κατά την ανάφαση I µετακινήθηκαν στους πόλους της αυτάκτου ολόκληρα χρωµοσώµατα. Eχουν συνεπώς την χαρακτηριστική δοµή µε το κεντροµέρος και τις δύο χρωµατίδες. Κατά την πρόφαση ΙΙ αρχίζει να σχηµατίζεται µια νέα άτρακτος σε καθένα από τα δύο κύτταρα που ολοκλήρωσαν την πρώτη µειωτική διαίρεση. Mετάφαση II Tα χρωµοσώµατα αρχίζουν να µετακινούνται και καταλαµβάνουν τελικά θέση στο ισηµερινό επίπεδο της ατράκτου. εν υπάρχει πλέον πυρηνική µεµβράνη και η άτρακτος είναι πλήρως σχηµατισµένη. Aνάφαση II Tα κεντροµερίδια διαιρούνται, οι αδελφές χρωµατίδες αποχωρίζονται και οι χρωµατίδες κάθενός χρωµοσώµατος κινούνται προς αντίθετους πόλους, µε την βοήθεια των ινιδίων της ατράκτου. Tελόφαση II Tο τελευταία στάδιο της µείωσης είναι η τελόφαση II. H τελόφαση ακολουθείται από την κυτταροκίνηση τον διαχωρισµό δηλαδή του κυτταροπλάσµατος. Με την ολοκλήρωση της µειωτικής διαδικασίας έχουµε τη δηµιουργία των τεσσάρων απλοειδών γαµετών.

95 Εικόνα 6 ιαγραµµατική απεικόνιση της µειωτικής πορείας.

96 Σκοπός της άσκησης είναι η παρατήρηση της µειωτικής διαδικασίας, που συµβαίνει κατά τη διαδικασία α) της µικροσποριογένεσης και β) της σπερµατογένεσης. H µικροσποριογένεση είναι η διαδικασία παραγωγής γαµετών στο αρσενικό τµήµα του άνθους, ενώ η αντίστοιχη διαδικασία παραγωγής γαµετών στο θηλυκό τµήµα του άνθους ονοµάζεται µεγασποριoγένεση. Στη σηµερινή άσκηση θα γίνει παρατήρηση της µείωσης σε ανθήρες του γένους Lilium. H σπερµατογένεση είναι η αντίστοιχη διαδικασία παραγωγής αρσενικών γαµετών στο ζωικό βασίλειο. Mέσω της διαφορετικής διευθέτησης των χρωµοσωµάτων στην πρώτη και τη δεύτερη µειωτική διαίρεση οι φοιτητές θα αποκτήσουν µια συνολική εικόνα της µείωσης. Εικόνα 7. Πρόφαση της δεύτερης µειωτικής διαίρεσης σε ανθήρες κρίνου

97 Απαιτούµενος Eργαστηριακός Eξοπλισµός Mικροσκόπιο Παρασκευάσµατα διαφoρετικών σταδίων της µείωσης σε ανθήρες του γένους Lilium Eργαστηριακό Πρωτόκολλο ίνονται τα παρακάτω παρασκευάσµατα. Παρατηρήστε τα προσεκτικά στο µικροσκόπιο Σκιαγραφήστε την εικόνα στις σηµειώσεις σας. Τα αποτελέσµατά σας 1. Aνθήρες Lilium. Πρόφασης της πρώτης µειωτικής διαίρεσης. Μπορείτε να διακρίνετε διαφορετικά στάδια της πρόφασης; 2.Aνθήρες Lilium. Mετάφαση της πρώτης µειωτικής διαίρεσης

98 Aνθήρες Lilium. Tέλος της πρώτης µειωτικής διαίρεσης 4. Aνθήρες Lilium. εύτερη µειωτική διαίρεση Πρόφαση 7. Aνθήρες Lilium. εύτερη µειωτική διαίρεση Μετάφαση-Ανάφαση -Τελόφαση

99 Συµπεράσµατα Εχετε κατανοήσει τη διαφορετική βιολογική σηµασία της µίτωσης και της µείωσης; Πόσα είναι τα προιόντα της µίτωσης; Πόσα τα προινόντα της µείωσης; Ποια διαδικασία φροντίζει για την γενετική ποικιλότητα στα βιολογικά συστήµατα; Μια µειωτική διαδικασία που καταλήγει σε τέσσερα κύτταρα γενετικά όµοια είναι µια πετυχηµένη διαδικασία; Γιατί;

100 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 9 ΕΞΕΛΙΞΗ TΗΣ ΖΩΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟΛΙΘΩΜΑΤΩΝ Εικόνα 1. Απολιθωµένοι οργανισµοί σε πέτρωµα ηλικίας 500 εκατοµµυρίων ετών. Όνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

101 Ι) Eισαγωγή στη µελέτη του αρχείου των απολιθωµάτων H κατανόηση του φαινοµένου της εξέλιξης της ζωής, ως µιας µακροχρόνιας αργής διαδικασίας, είναι ένα από τα ζητούµενα για κάθε φοιτητή Bιολογίας. Iδιαίτερα για τους αυριανούς Bιοτεχνολόγους, η κατανόηση της εξελικτικής πορείας της ζωής είναι ένα απαραίτητο εφόδιο για την απόκτηση σεβασµού απέναντι σ αυτό που ονοµάζουµε Bιολογικό υλικό και το οποίο, µετά την αποφοίτησή τους, θα αποτελέσει αντικείµενο των παρεµβάσεών τους. Σήµερα, η θεωρία της εξέλιξης, όπως διατυπώθηκε αρχικά από το αρβίνο και όπως συµπληρώθηκε και διορθώθηκε στα χρόνια που µεσολάβησαν, θεωρείται γενικά αποδεκτή και πέραν πάσης αµφιβολίας. Yπάρχουν βέβαια αντιρρήσεις και διαξιφισµοί σε επιµέρους ζητήµατα, ίσως ακόµη και σε πολύ βασικά ζητήµατα (για παράδειγµα συζητείται ο σταδιακός ή ο αιφνίδιος τρόπος εµφάνισης νέων ειδών). Σήµερα όµως κανένας δεν προσπαθεί να εξηγήσει την πολυπλοκότητα της ζωής, την αδιαµφισβήτητη µέσα στο χρόνο ανάδυση του πολύπλοκου µετά το απλούστερο, χρησιµοποιώντας πλαίσια και τρόπο σκέψης που δεν εµπίπτουν στα ευρύτερα πλαίσια της Eξελικτικής θεωρίας. Για να επιτευχθεί αυτό, δεν αρκούσαν µόνο οι όποιες επιστηµονικές αποδείξεις, χρειάστηκε και αλλαγή στον τρόπο σκέψης των ανθρώπων. Eµείς, σ αυτό το Eργαστήριο, θα ασχοληθούµε µόνο µε τις επιστηµονικές αποδείξεις που θεµελιώνουν την Θεωρία της Eξέλιξης και όχι µε τα αίτια και τους εξωεπιστηµονικούς λόγους που τελικά την καθιέρωσαν στο ευρύτερο κοινό. Εικόνα 2: Glenobotrydion aenigmatis Schopf, από Προκάµβρια στρώµατα της Αυστραλίας. Τα δείγµατα παρουσιάζουν εµφανή στάδια κυτταρικής διαίρεσης και πιστεύεται ότι τα σκούρα σώµατα (n) αντιπροσωπεύουν κυτταρικούς πυρήνες. ΙΙ) Τα απολιθώµατα H εξελικτική θεωρία στηρίζεται σήµερα σε δύο πυλώνες, το «αρχείο των απολιθωµάτων» και διάφορα µοριακά δεδοµένα. Oι αποδείξεις από το «αρχείο των απολιθωµάτων», όπως είναι φυσικό, είναι και οι παλαιότερες αποδείξεις που χρησιµοποιήθηκαν για την καθιέρωση της Θεωρίας της Eξέλιξης. Mε τον όρο απολιθώµατα, εννοούµε, λείψανα οργανισµών οι οποίοι έζησαν σε προγενέστερες γεωλογικές εποχές και τα οποία µετά το θάνατό τους εγκλείσθηκαν σε

102 στρώµατα γης, που σχηµατίσθηκαν πριν από την παρούσα γεωλογική εποχή. Tα σώµατα των οργανισµών, ως γνωστόν, µετά το θάνατό τους αν µείνουν εκτεθειµένα δεν αργούν να αποσυντεθούν και να εξαφανισθούν εξ ολοκλήρου. Για να διατηρηθούν και να καταστούν απολιθώµατα θα πρέπει ο νεκρός οργανισµός να έχει σκληρό σκελετό ή κέλυφος και να καλυφθεί αµέσως από λεπτόκοκκο υλικό (ίζηµα). Eκτός από κάποιες σπάνιες περιπτώσεις, όταν ένας οργανισµός νεκρωθεί, το µόνο που διατηρείται από αυτόν είναι το σκληρό του τµήµα: π.χ. στα Mαλάκια και στα Πρωτόζωα διατηρείται το όστρακο ή το κέλυφος ενώ στα θηλαστικά ο σκελετός. Eπίσης διατηρούνται φυτά το οποία έχουν ασβεστολιθικό ή πυριτικό περίβληµα π.χ τα ασβεστοφύκη, τα διάτοµα κ.λ.π. των οποίων οι πληθυσµοί αναπτύσσονται σε τεράστιες συγκεντρώσεις. Mετά τον θάνατο των παραπάνω οργανισµών, τα περιβλήµατά τους συσσωρεύονται στον πυθµένα των θαλασσών και σχηµατίζουν ασβεστολιθικά ή πυριτικά πετρώµατα, π.χ. την γη των διατόµων. Tα στερεά υπολείµµατα των οργανισµών, οστά, δόντια, κέρατα, καλυπτήριες πλάκες, ωτόλιθοι, λέπια, κελύφη, δεν διατηρούν την αρχική τους σύσταση αλλά υφίστανται αλλοιώσεις, λόγω της µεταβολής τους σε ορυκτή ύλη. H αλλοίωση που υφίστανται αυτά τα υπολείµµατα είναι ανάλογη της παλαιότητάς τους. Έτσι λοιπόν όστρακα µαλακίων ή οστά θηλαστικών τα οποία βρίσκονται σε στρώµατα της Tεταρτογενούς περιόδου, ελάχιστα διαφέρουν κατά την όψη, το ειδικό βάρος και τη χηµική τους σύσταση από τα όστρακα των Mαλακίων και τα οστά των Θηλαστικών της σηµερινής εποχής. Εικόνα 3: Σπάνια απολιθώµατα θαλάσσιων οργανισµών (Κοιλεντερωτά Σκυφόζωα) σε ιζηµατογενές πέτρωµα

103 ΙΙΙ) Μηχανισµοί σχηµατισµού απολιθωµάτων α) Mοριακή αντικατάσταση της ύλης. H µοριακή αντικατάσταση της ύλης αποτελεί τον τελειότερο µηχανισµό απολίθωσης, γιατί η αρχική οργανική ύλη αντικαθίσταται µόριο προς µόριο από ορυκτή ύλη. Αυτή η ανόργανη ορυκτή ύλη είναι συνήθως ανθρακικό ασβέστιο. Eπειδή η αντικατάσταση αυτή γίνεται µόριο προς µόριο, είναι δυνατή η διατήρηση της γενικής µορφής π.χ. του οστού ή του κελύφους αλλά και της λεπτότατης δοµής. Eποµένως, η ποιοτική εξέταση της ύλης ενός απολιθώµατος δείχνει ότι η ύλη αυτή δεν έχει σχεδόν καµιά σχέση µε την αρχική ύλη του αντικειµένου. Πρέπει να παρατηρήσουµε εδώ ότι µερικές ανόργανες ουσίες όπως η αδαµαντίνη των δοντιών, διατηρούνται όπως ήταν στην αρχική τους κατάσταση, όσα εκατοµµύρια χρόνια και αν περάσουν, δηλαδή δεν απολιθώνονται µε την έννοια που αναφέραµε παραπάνω. Mερικές φορές συµβαίνει σε ασβεστολιθικά όστρακα, να αντικατασταθεί η αρχική ύλη που είναι ανθρακικό ασβέστιο, µε άλλη ανόργανη ύλη, το διοξείδιο του πυριτίου (SiO2) ή και το αντίστροφο, όπως για παράδειγµα συµβαίνει στους πυριτόσπογγους µε αποτέλεσµα να προκύπτουν πυριτόσπογγοι µε ασβεστολιθικό σκελετό. Tο παραπάνω φαινόµενο ονοµάζεται ψευδοµόρφωση. Tο διοξείδιο του πυριτίου µε µορφή οπαλλίου σχηµατίζει πολύ ωραία απολιθώµατα σκελετικών τµηµάτων ζώων ή κορµών δέντρων. H οπαλλίωση ή αποπυριτίωση, γίνεται σε σύντοµο χρονικό διάστηµα και έχει διαπιστωθεί σε πάρα πολλές περιοχές της Γης, όπως στο απολιθωµένο δάσος της Mυτηλίνης. Πολλές φορές, είναι δυνατόν, η αντικατάσταση των µορίων του προς απολίθωση αντικειµένου, να γίνει από σιδηροπυρίτη ή µαρκασίτη (FeS2). H απολίθωση αυτή ονοµάζεται σιδηροπυρίτωση και δεν θεωρείται ιδεώδης τρόπος απολίθωσης, γιατί το υλικό αυτό αποσαθρώνεται εύκολα και το απολίθωµα µετατρέπεται σε άµορφη µάζα µελαντηρίτη (FeSO4 7H2O). Όταν βρεθεί απολίθωµα αυτής της µορφής, οι ειδικοί προσπαθούν µε µονωτικό υλικό να το προφυλάξουν από την επίδραση του ατµοσφαιρικού αέρα και να εµποδίσουν µε αυτό τον τρόπο την καταστροφή του. Εικόνα 4: Φωλιά εινόσαυρου της Κρητιδικής περιόδου µε έξι απολιθωµένα αυγά β) Aπανθράκωση Ένας ιδιαίτερος τρόπος «απολίθωσης» θεωρείται και η απανθράκωση. Φυτά του παρελθόντος, κάτω από ειδικές συνθήκες περιβάλλοντος, µετατρέπονται σε

104 κάρβουνα που έχουν τη µορφή του ξυλίτη, του λιγνίτη ή του λιθάνθρακα. Mελετούµε αυτά τα υπολείµµατα των φυτών, κυρίως τους καρπούς τους και βγάζουµε συµπέρασµα για το είδος των φυτών και την ηλικία τους, για το κλίµα της περιοχής την εποχή εκείνη και τέλος για τις συνθήκες κάτω από τις οποίες έγινε η απανθράκωση των φυτών αυτών. Πολλές φορές µαζί µε τα απανθρακωµένα φυτά και κυρίως σε λιγνιτικά στρώµατα, βρίσκονται και λείψανα ζωικών οργανισµών. ΙΙΙ) Άλλες πηγές πληροφοριών για οργανισµούς του παρελθόντος, πλην των απολιθωµάτων Πληροφορίες για τους οργανισµούς του παρελθόντος παίρνουµε επίσης από: α) Tα Bιοδηλωτικά ίχνη. Σε πολλές περιπτώσεις έχουν διατηρηθεί µέχρι τις µέρες µας διάφορα ίχνη δηλωτικά της ζωής και της δράσης των οργανισµών, ικανά να µας δώσουν χρήσιµες πληροφορίες για τον τρόπο της ζωής τους. Mέσα στα βιοδηλωτικά ίχνη πρωτεύουσα θέση κατέχουν τα ίχνη από τα πατήµατα και τον ερπυσµό διαφόρων ζώων. Tο πιο εντυπωσιακό βιοδηλωτικό ίχνος αυτής της κατηγορίας είναι η ανακάλυψη αποτυπωµάτων πελµάτων του Aυστραλοπίθηκου από την M. Leaky στην Aνατολική Aφρική. Mεγάλο ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζουν τα εκµαγεία, που εµφανίζονται στη φύση πολύ συχνά και διακρίνονται σε εσωτερικά και εξωτερικά. Eξωτερικό εκµαγείο είναι για παράδειγµα το αποτύπωµα που αφήνει ένα ελασµατοβράγχιο στον πυθµένα της λίµνης ή της θάλασσας. Eσωτερικό εκµαγείο είναι αυτό που σχηµατίζεται όταν το εσωτερικό του ελασµατοβραγχίου ή ενός κρανίου γεµίσει µε συστατικά (π.χ πηλό) τα οποία µε την πάροδο του χρόνου στερεοποιούνται. Tα εκµαγεία αυτά παραµένουν και µετά την καταστροφή του οστράκου ή του κρανίου και πολλές φορές αναφέρονται ως πυρήνες. Bιοδηλωτικά ίχνη θεωρούνται επίσης οι κατοικίες και οι φωλιές διαφόρων ζώων, οι χαρακιές που άφησαν τα δόντια των σαρκοφάγων επάνω στα οστά άλλων ζώων που κατασπάραξαν, οι κοπρόλιθοι, τα αυγά κ.λ.π. Εικόνα 5 Bιοδηλωτικό ίχνος. Ίχνος πέλµατος εινοσαύρου της Κρητιδικής περιόδου.

105 β) Tα διατηρηµένα πτώµατα Kάτω από ειδικές συνθήκες περιβάλλοντος, πτώµατα ζώων του παρελθόντος µπορούν να διατηρηθούν σε πολύ καλή κατάσταση. Θα αναφερθούµε σε τρία εντυπωσιακά παραδείγµατα: i) Στην περιοχή Mπερεσόβκα της Σιβηρίας βρέθηκε πριν από 100 περίπου χρόνια ένα πτώµα µαµούθ (Mammuthus primigenius) διατηρηµένο σε πολύ καλή κατάσταση. Πιστεύεται ότι παρέµεινε στο παγωµένο έδαφος για περισσότερο από χρόνια. ii) Στην περιοχή Σταρούνια της Πολωνίας βρέθηκε κατά τη διάρκεια του πρώτου παγκοσµίου πολέµου το πτώµα ενός ρινόκερου (Coelodonta antiquitatis) µέσα σε οζοκηρίτη (παράγωγο του πετρελαίου), το οποίο αρχικά είναι παχύρρευστο υγρό που τελικά στερεοποιείται και παίρνει µε την πάροδο του χρόνου τη µορφή κεριού. O ρινόκερος έπεσε µέσα στο υλικό αυτό και το σώµα του δεν ήρθε σε επαφή µε τον ατµοσφαιρικό αέρα, µε αποτέλεσµα να διατηρηθεί µε τις σάρκες και το τρίχωµά του χρόνια περίπου. iii) ιάφορα έντοµα κατά το παρελθόν νοµίζοντας ότι η ρητίνη των κωνοφόρων δέντρων ήταν τροφή, κόλλησαν επάνω της και εγκλείσθηκαν µέσα σ αυτήν. Όταν ύστερα από διάφορες γεωλογικές καταστροφές, τα δέντρα αυτά καταπλακώθηκαν, οι κορµοί και τα κλαδιά τους έγιναν λιθάνθρακες και η ρητίνη έγινε το γνωστό µας κεχριµπάρι (ήλεκτρο). Mέσα σ αυτό το κεχριµπάρι βρίσκουµε πολλές φορές και σήµερα έντοµα της εποχής εκείνης σε πολύ καλή κατάσταση διατήρησης. Εικόνα 6 Μηρµύγκι (Sphecomyrma freyi), εγκλεισµένο σε κεχριµπάρι (Κρητιδική περίοδος). Tέλος πρέπει να αναφερθούµε σε ορισµένες περίεργες µορφές που µοιάζουν µε λείψανα απολιθωµένων φυτών ή ζώων, τα οποία όµως δεν έχουν καµιά σχέση µε απολιθωµένους οργανισµούς. Oι µορφές αυτές καλούνται ψευδοαπολιθώµατα. Xαρακτηριστικότερο παράδειγµα είναι οι δενδρίτες. Oι δενδρίτες είναι σχηµατισµοί που µοιάζουν καταπληκτικά µε φυτά και δηµιουργούνται στις σχισµογενείς επιφάνειες των πετρωµάτων. Στις ρωγµές αυτές εισέρχεται νερό το οποίο µεταφέρει διαλυµένα οξείδια του

106 µαγγανίου και του σιδήρου. Tα οξείδια αυτά σκορπίζονται µέσα στις ρωγµές και παίρνουν σχήµατα που µοιάζουν καταπληκτικά µε βρύα ή µε άλλα φυτά. Εικόνα 7. Ψευδοαπολίθωµα δενδρίτη. Σχηµατίστηκε από διαλύµατα οξειδίων του µαγγανίου µέσα σε διαχωριστική επιφάνεια του πλακώδη ασβεστόλιθου του Solnhofen της Βαυβαρίας. Yλικά Συλλογές χαρακτηριστικών απολιθωµάτων από την Kάµβρια περίοδο µέχρι την Tεταρτογενή περίοδο Eργαστηριακό πρωτόκολλο Στο εργαστήριο αυτό θα µελετήσουµε χαρακτηριστικά δείγµατα απολιθωµάτων των περισσοτέρων Γεωλογικών εποχών. Σκοπός του εργαστηρίου είναι η εξοικείωση µε τον Γεωλογικό χρόνο, η εκµάθηση των Γεωλογικών εποχών και η κατανόηση της πολυπλοκότητας του αρχείου των απολιθωµάτων. Kάθε απολιθωµένος οργανισµός που θα σας δοθεί, πρέπει να τοποθετηθεί στο Γεωλογικό χρόνο και να γραφεί στην αντίστοιχη θέση στον πίνακα που βρίσκεται στην τελευταία σελίδα της άσκησης αυτής. Eπίσης σε κάθε Γεωλογική περίοδο ή εποχή να γραφεί το γεγονός που τη χαρακτηρίζει. Στα κενά µεταξύ των διαφόρων περιόδων θα σκιαγραφήσετε το απολίθωµα που αντιστοιχεί. Kάµβρια περίοδος : H Kάµβρια περίοδος εκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνων πριν την σηµερινή εποχή. Xαρακτηρίζεται από µια ξαφνική «έκρηξη» νέων µορφών ζωής. Kατά την περίοδο αυτή εµφανίζονται όλοι οι πρόγονοι των σύγχρονων φύλων εκτός από ένα. Στην περίοδο αυτή βρίσκουµε τον πρόγονο των σηµερινών χορδοτών και κατά συνέπεια και των σπονδυλωτών, ο οποίος ανήκει στο γένος Pikaia. Oρδοβίσια περίοδος : Eκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν από τη σηµερινή εποχή. Στην περίοδο αυτή κυριαρχούν τα ασπόνδυλα. Tο µοναδικό νέο φύλο που

107 εµφανίζεται την περίοδο αυτή είναι το φύλο των Bρυόζωων. Έτσι λοιπόν και µε την εµφάνιση των Bρυοζώων ολοκληρώνεται η εµφάνιση όλων των προγονικών µορφών των σύγχρονων οργανισµών. Σιλούρια περίοδος: Eκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν από τη σηµερινή εποχή. H περίοδος χαρακτηρίζεται από την εµφάνιση των πρώτων χερσαίων φυτών και των πρώτων χερσαίων ασπονδύλων. Από την περίοδο αυτή θα παρατηρήσουµε ένα Εχινόδερµο Κρινοειδές. Tα Eχινόδερµα είναι ζώα ακτινωτής συµµετρίας, κυρίως πενταµερούς ή αµφίπλευρης. Tο εξώδερµα αναπτύσσει σµήριγγες ή άκανθες, ενώ το µεσόδερµα εκκρίνει ασβεστολιθική ουσία για το σχηµατισµό ασβεστολιθικού σκελετού. Eίναι ζώα θαλάσσια τα οποία ζουν ελεύθερα ή βρίσκονται προσκολληµένα µε το ραχιαίο µέρος τους στον πυθµένα. Eµφανίζονται από το κατώτερο Σιλούριο και υπάρχουν µέχρι σήµερα. Tα Eχινόδερµα διακρίνονται σε Πελµατόζωα και σε Eλευθερόζωα. Tα µεν Πελµατόζωα προσκολλώνται στον πυθµένα ενώ τα Eλευθερόζωα κινούνται αργά µεν αλλά ελεύθερα. Tα Πελµατόζωα διαιρούνται σε : i) Kρινοειδή, ii) Kυστοειδή, iii) Bλαστοειδή. Tα Eλευθερόζωα διαιρούνται σε : i) Aστερόζωα και ii) Eχινόζωα. Εικόνα 8. Εχινόδερµο-Κρινοειδές της Σιλούριας περιόδου. εβόνια περίοδος: Eκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν την σηµερινή εποχή. Xαρακτηρίζεται από την εµφάνιση των πρώτων ψαριών και των πρώτων χερσαίων σπονδυλωτών. Λιθανθρακοφόρος περίοδος: H περίοδος αυτή εκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν από την εποχή µας. Yποδιαιρείται σε δύο Γεωλογικές εποχές, την Πενσυλβάνια ( εκ.χρ.) και την Mισσισσίππια ( εκ. χρ.). Kατά τη Mισσισσίππια εποχή που είναι και η αρχαιότερη παρατηρείται ανάπτυξη των αµφιβίων και των εντόµων, ενώ κατά την Πενσυλβάνια περίοδο έχουµε την εµφάνιση των πρώτων ερπετών. Aπό την Πενσυλβάνια εποχή θα παρατηρήσουµε ένα Eχινόδερµο.

108 Aπό την περίοδο αυτή θα παρατηρήσουµε επίσης απολιθώµατα Bραχιοπόδων. Tα Bραχιόποδα είναι ζώα θαλάσσια, µε αµφίπλευρη συµµετρία. Περιβάλλονται από όστρακο µε δύο θυρίδες. H σύσταση του οστράκου είναι ασβεστολιθική ή χιτινώδης ή ασβεστοκερατινώδης. Eίναι ζώα γονοχωριστικά, τα ωάρια και τα σπερµατοζωάρια αποβάλλονται στο θαλασσινό νερό όπου και γίνεται η γονιµοποίηση. Εικόνα 9. Βραγχιόποδο Πενσυλβάνιας περιόδου. Από την ίδια περίοδο θα παρατηρήσουµε επίσης απολίθωµα Βρυοζώου. Τα Βρυόζωα είναι ζώα τα οποία ζουν προσκολληµένα πάνω σε βράχια ή πάνω σε όστρακα άλλων ζώων. Σχηµατίζουν αποικίες στη θάλασσα ή σε λίµνες και σε ποικίλο βάθος. Έχουν µικρό µέγεθος, συνήθως επίµηκες και κυλινδρικό και περιβάλλονται από χιτινώδες ασβεστολιθικό περίβληµα. Είναι ζώα ερµαφρόδιτα, µπορούν όµως να πολλαπλασιασθούν και µε εκβλαστήσεις. Εµφανίζονται για πρώτη φορά στο αρχείο των απολιθωµάτων κατά την Ορδοβίσια περίοδο. Εικόνα 10. Βρυόζωο Πενσυλβάνιας περιόδου. Απολίθωµα Κοιλεντερωτού (Ανθόζωου) της Πενσυλβάνιας περιόδου Τα Κοιλεντερωτά ονοµάζονται και Κνιδόζωα γιατί ως µέσα προσβολής και άµυνας έχουν όργανα τα οποία προκαλούν κνησµό, τους κνιδοβλάστες. Είναι ζώα πολυκύτταρα

109 ακτινωτής συµµετρίας. Τα κοιλεντερωτά εµφανίζονται µε δύο µορφές, τη µορφή του πολύποδα και τη µορφή της µέδουσας. Οι πολύποδες βρίσκονται προσκολληµένοι σε στερεό υπόστρωµα, ενώ οι µέδουσες ζουν ελεύθερες. Τα κοιλεντερωτά είναι ζώα θαλάσσια και παρουσιάζουν µεγάλη ποικιλία µορφών και µεγέθους. Χωρίζονται σε 4 οµοταξίες: I) Ανθόζωα ή κοράλλια, ii) Υδρόζωα, iii) Σκυφόζωα και iv) Κτενοφόρα. Εικόνα 11. Κοιλεντερωτό-Ανθόζωο Πενσυλβάνιας περιόδου I) Απολίθωµα Μαλακίου Γαστεροπόδου της Πενσυλβάνιας περιόδου Tα Mαλάκια είναι ζώα µε αµφίπλευρη συµµετρία µε ή χωρίς κεφαλή. Tο όστρακο του ζώων αυτών είναι µονόθυρο ή δίθυρο, εσωτερικό ή εξωτερικό. Tα περισσότερα είδη είναι θαλάσσια, πολλά όµως είδη ζουν σε υφάλµυρα νερά ακόµη και στην ξηρά. Tα Mαλάκια διακρίνονται σε i) Eλασµατοβράγχια ii) Γαστερόποδα, iii) Kεφαλόποδα, iv) Aµφίνευρα, v) Σκαφόποδα. Tα Γαστερόποδα είναι Mαλάκια προσαρµοσµένα στον ερπυσµό, πιο ευκίνητα από τα Eλασµατοβράγχια. ιαθέτουν κέλυφος περιελιγµένο. H κεφαλή είναι καλοσχηµατησµένη και διαθέτουν κεραίες, οφθαλµούς και ακουστικές φυσαλίδες. Στην κοιλιακή επιφάνεια βρίσκεται ο ερπυστικός πους ο οποίος βοηθάει στον ερπυσµό. Eξαιτίας της ύπαρξης αυτού του ποδός στην κοιλιακή περιοχή ονοµάστηκαν και Γαστερόποδα. Tα περισσότερα είδη είναι γονοχωριστικά, υπάρχουν όµως και είδη που είναι ερµαφρόδιτα. ιακρίνουµε είδη που ζούν στη θάλασσα και τα οποία αναπνέουν µε βράγχια, ενώ τα λίγα χερσαία είδη που υπάρχουν αναπνέουν µε πνεύµονες. Yπάρχουν επίσης και µερικά λιµναία είδη. Aπό Παλαιοντολογική άποψη τα Γαστερόποδα εµφανίζονται αρχικά κατά την Kάµβρια περίοδο. Aπό τότε εξελίχθηκαν προοδευτικά και σήµερα βρίσκονται στο µέγιστο βαθµό της εξέλιξής τους Πέρµια περίοδος: Eκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν την εποχή µας. Xαρακτηρίζεται από την εξάπλωση των ερπετών και την εξαφάνιση πολλών πρώιµων µορφών ασπονδύλων. Tριάσσια περίοδος: H περίοδος αυτή εκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν από την εποχή µας. Xαρακτηρίζεται από την εµφάνιση των κωνοφόρων φυτών. Aπό την περίοδο αυτή θα παρατηρήσουµε ένα απολίθωµα τραχεοφύτου.

110 Εικόνα 12. Απανθρακωµένο τµήµα τραχειόφυτου Τριάσσιας περιόδου Iουράσσια περίοδος : Eκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν την εποχή µας. Xαρακτηρίζεται από την κυριαρχία των γιγαντιαίων εινοσαύρων και την εµφάνιση των πρώτων πτηνών. Aπό την εποχή αυτή θα παρατηρήσουµε ένα οστό εινοσαύρου, και ένα Κοιλεντερωτό ανθόζωο. Mε την ονοµασία εινόσαυροι, αναφερόµαστε σε ερπετά που ανήκουν σε δύο µεγάλες τάξεις, τα Σαυρίσχια και τα Ορνιθίσχια. Μια από τις βασικές διαφορές µεταξύ των δύο παραπάνω τάξεων παρατηρείται στην κατασκευή της λεκάνης. Οι εινόσαυροι αρχικά ήταν σαρκοφάγοι αλλά αργότερα παρουσιάσθηκαν και φυτοφάγοι εινόσαυροι. Επειδή πολλών φυτοφάγων εινοσαύρων τα δόντια δεν ήταν κατάλληλα για µια σωστή και ολοκληρωµένη µάσηση της φυτικής τροφής, κατάπιναν βότσαλα για να διευκολύνουν τη χώνεψή της. Σε ανασκαφές που πραγµατοποιήθηκαν για την αποκάλυψη οστών εινοσαύρων, βρέθηκα τέτοια βότσαλα στη θέση που ήταν το στοµάχι τους. Οι στρογγυλεµένες αυτές πέτρες ονοµάσθηκαν γαστρόλιθοι. Εικόνα 13. Αποικία κοιλεντερωτών ανθόζωων της Ιουράσιας περιόδου

111 Εικόνα 14. Οστό εινοσαύρου Ιουράσιας περιόδου Kρητιδική περίοδος: ιαρκεί µεταξύ εκ. χρόνια πριν την εποχή µας. Xαρακτηριστικό της περιόδου η εξαφάνιση των εινοσαύρων και η εµφάνιση των πρώτων φυτών µε άνθη. Aπό την περίοδο αυτή θα παρατηρήσουµε ένα Mαλάκιο - Κεφαλόποδο και ένα Mαλάκιο - Πελεκύποδο. Tα Kεφαλόποδα είναι τα τελειότερα των Mαλακίων από εξελικτική άποψη. Tο όστρακό τους αποτελείται από ένα µόνο τµήµα. Mπορούν να έρπουν ή να µετακινούνται µε τα πλοκάµια τους. Έχουν κεφαλή και πόδια ευδιάκριτα. Στην κεφαλή τους έχουν δύο οφθαλµούς οι οποίοι µοιάζουν µε τους οφθαλµούς των Σπονδυλωτών, γι αυτό και θεωρούνται τα τελειότερα των Mαλακίων. Tο στόµα τους έχει ισχυρή µασητική σιαγόνα, η οποία περιβάλλεται από 8-10 σαρκοειδείς πλοκάµους που χρησιµεύουν ως συλληπτήρια και κινητήρια όργανα. Eίναι ζώα γονοχωριστικά και υδρόβια. Zουν σε βαθείς θάλασσες. Aναπνέουν µε βράγχια. O αριθµός των βραγχίων είναι δύο ή τέσσερα και έτσι ονοµάζονται ιβράγχια και Tετραβράγχια αντίστοιχα. Tα ιβράγχια φέρουν επιπλέον και µελανοφόρο σάκο ως όργανο άµυνας. Εικόνα 15 Αµµωνίτης (Μαλάκιο-Κεφαλόποδο) Κρητιδικής περιόδου.

112 Tα Mαλάκια - Πελεκύποδα ανήκουν στα Mαλάκια - Eλασµατοβράγχια. Ως Eλασµατοβράγχια είναι Mαλάκια χωρίς κεφαλή, µε δίθυρο όστρακο τα οποία διαθέτουν πλευρική συµµετρία. έχουν αναπτυγµένα τα δύο ελασµατώδη βράγχια και γι αυτό καλούνται Eλασµατοβράγχια. Tα Πελεκύποδα διαφέρουν από τα υπόλοιπα ελασµατοβράγχια γιατί ο ερπυστικός πους έχει σχήµα πελέκεως και προεξέχει µονίµως στο κάτω χείλος του εµπρόσθιου µέρους. Tριτογενής περίοδος: Eκτείνεται µεταξύ εκ. χρόνια πριν την εποχή µας. Yποδιαιρείται σε πέντε εποχές : i) Πλειόκαινος ( εκ. χρ.), ii) Mειόκαινος ( εκ. χρ), iii) Oλιγόκαινος ( εκ. χρ), iv) Hώκαινος (34-55 εκ. χρ) και v) Παλαιόκαινος (55-65 εκ.χρ). H κάθε εποχή χαρακτηρίζεται από ένα εντυπωσιακό γεγονός. Kατά την αρχαιότερη εποχή, τη Mειόκαινο έχουµε εµφάνιση των πρώτων θηλαστικών. Kατά την Hώκαινο κυριαρχούν τα φυτά µε άνθη, στην Oλιγόκαινο εµφανίζονται σύγχρονες µορφές θηλαστικών και ασπονδύλων. Στη Mειόκαινο εποχή αυξάνονται τα είδη των ψαριών µε οστά (τελεόστεοι), ενώ κατά την Πλειόκαινο εποχή κυριαρχούν τα θηλαστικά και τα πτηνά. Aπό την εποχή αυτή θα µελετήσουµε ένα Mαλάκιο - Γαστερόποδο ένα Μαλάκιο Πελεκύποδο και ένα δόντι καρχαρία (Xονδριχθύες). Oι Xονδριχθύες έχουν χόνδρινο σκελετό. Στους αντιπροσώπους της οµοταξίας αυτής δεν υπάρχει οστέϊνη ουσία. H γνάθος είναι καλά σχηµατισµένη και φέρει δόντια που προέρχονται από το µετασχηµατισµό πλακοειδών λεπιών. Στην πραγµατικότητα η ακανθώδης προεξοχή των πλακοειδών λεπιών έχει λάβει ανάλογο µέγεθος και σχήµα, σε τρόπο που να εξυπηρετεί τις ανάγκες του ζώου. Σε περίπτωση καταστροφής µερικών δοντιών αυτά ανανεώνονται και γι αυτό οι Xονδριχθύες χαρακτηρίζονται ως πολυφυοδοντικοί οργανισµοί. Oι Xονδριχθύες εµφανίζονται στο µέσο της εβόνιας περιόδου µε ελάχιστους εκπροσώπους. Tη µεγαλύτερη ανάπτυξη της ιστορίας τους τη γνωρίζουν στο τέλος της Kρητιδικής περιόδου. Eίναι γνωστά σήµερα 214 απολιθωµένα γένη. Εικόνα 16. όντι καρχαρία Τριτογενούς περιόδου

113 Εικόνα 17. Μαλάκια Γαστερόποδα εγκλεισµένα σε πέτρωµα της Τριτογενούς περιόδου

114 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΟΙ ΤΡΕΙΣ ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΕΣ ΤΗΣ ΖΩΗΣ Επικράτεια Ευκάρυα Βασίλειο: Ζώα (όλα τα ζώα που είναι ετερότροφα) Συνοµοταξία: Χορδωτά (όλα τα ζώα µε νωτιαία χορδή) Υποσυνοµοταξία: Σπονδυλωτά (όλα τα σπονδυλωτά, i.e., µε σπονδυλική στήλη) Οµοταξία: Θηλαστικά (όλα τα σπονδυλωτά, τα θηλυκά των οποίων θηλάζουν τα νεογνά τους) Υφοµοταξία: Θηρία (τα θηλαστικά που τρέφουν τα µικρά τους δια µέσου του πλακούντα) Τάξη: Πρωτεύοντα (θηλαστικά µε πέντε δάχτυλα, τρισδιάστατη όραση, και µεγάλο εγκέφαλο) Οικογένεια: Ανθρωποειδή (όλα τα ανθρωποειδή του παρόντος και του παρελθόντος) Γένος: Homo (δίποδα πρωτεύοντα; 'άνθρωπος') Είδος: Homo sapiens (ανθρώπινο γένος; 'άνθρωπος ο σοφός') Υποείδος: Homo sapiens sapiens Εικόνα 1 Ταξινόµιση του ανθρώπου. Ονοµα φοιτητή Ηµεροµηνία άσκησης Υπογραφή επιβλέποντα

115 ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑ Χαρακτήρας Βακτήρια Αρχαία Ευκάρυα Πυρηνικός φάκελος όχι όχι Μεµβρανώδη οργανίδια όχι όχι Πεπτιδογλυκάνη στο κυτ. τοίχωµα όχι όχι Λιπίδια µεµβρανών Με µη διακλαδισµένους υδρογονάνθρακες Μερικοί διακλαδισµένοι υδρογονάνθρακες Με µη διακλαδισµένους υδρογονάνθρακες 1ο εντασσόµενο αµινοξύ Φορµυλο-µεθειονίνη Μεθειονίνη Μεθειονίνη Ύπαρξη ιντρονίων Εξαιρετικά σπάνια Σε µερικά γονίδια Στην πλειονότητα των γονιδίων Είδη RNA πολυµεράσης 1 Αρκετά είδη Αρκετά είδη Ιστόνες συνδεδεµένες µε DNA όχι Σε µερικά είδη Επίδραση χλωραµφαινικόλης και στρεπτοµυκίνης Αναστέλλει την ανάπτυξη εν αναστέλει την ανάπτυξη εν αναστέλει την ανάπτυξη Κυκλικό χρωµόσωµα όχι Ανάπτυξη σε θερµοκρασία µεγαλύτερη των 100 ο C όχι υνατή σε µερικά είδη όχι

116 A. Βακτήρια Τα βακτήρια µπορούν να έχουν επωφελή ή επιβλαβή επίδραση στον άνθρωπο Από την µια πλευρά Μισές ασθένειες οφείλονται σε βακτήρια. Μόλυνση κατευθείαν, ή συχνά μέσω εντόμων. (πχ. ~2 εκ. άνθρωποι πεθαίνουν από πνευμονία/ έτος) «Η Ιατρική χρωστάει τη καλή της φήμη της στα αντιβιοτικά» Από την άλλη πλευρά Συμβιώνουμε αρμονικά μαζί τους. 150 Εί δη βακτηρίων στο δέρμα μας. ~10 εκατ. Κύτταρα/ τετραγωνικό εκατοστό είδη στο έντερο μας. Αριθμός κυττάρων 10x τα κύτταρα του σώματος μας Το 2003 διαβάστηκε το γονιδίωμα του Bacteroides sp. Ένα βακτήριο του εντέρου μας. Ταυτοποιήθηκαν Γονίδια για σύνθεση υδατανθράκων, βιταμινών και άλλων θρεπτικών συστατικών που είναι απαραίτητα για τον άνθρωπο. Γονίδια που αυξάνουν την αγγειογένεση για την απορρόφηση των θρεπτικών ουσιών από το έντερο

117 Campbell et al. κεφ

118 Πως τα βλέπω στο Μικροσκόπιο; Α. οµή Βακτηρίων (Kόκκοι, Βάκιλοι, Σπειρύλια) Β. Χρώση κατά Gram Gram + Gram-

119 Κυανοβακτήρια, τα φωτοσυνθετικά βακτήρια Συχνά σχηµατίζουν αλυσίδες, νηµάτια, σφαιροειδείς αποικίες. εν είναι πάντα πράσινα. Το planktothrix rubescens έχει κόκκινο έως καφέ χρώµα Πως φαίνονται στο µικροσκόπιο; Microcystis sp. Anabaena sp planktothrix rubescens Aphanizomenon sp.

120 Oscillaroria sp. Εκτός από την φωτοσύνθεση σηµαντική είναι και η αζωτοδέσµευση που επιτελούν

121 Anabaena sp. Anabaena sp. Microcystis sp. Aphanizomenon sp. Anabaena sp. Microcystis sp. Aphanizomenon sp. Μικροσκοπική παρατήρησηη κυανοβακτηρίων της λίµνης Παµβώτιδας. Παρατηρούµε κυριαρχία των γενών Microcystis, Anabaena και Aphanizomenon

122 είγµα από νερό της λίµνης Παµβώτιδας. Ποια κυανοβακτήρια µπορείτε να αναγνωρίσετε; Σηµειώστε τα Tο νερό της λίµνης Ζηρού όπως εµφανίστηκε την άνοιξη του Τι πιστεύετε ότι συµβαίνει στη λίµνη?

123 B. ΑΡΧΑΙΑ-Ένας καινούργιος κόσµος 1. Προκαρυωτική κυτταρική οργάνωση 2. Όχι πεπτιδογλυκάνες στο κυτταρικό τοίχωµα 3. Πολλές RNA πολυµεράσες 4. Αρχη πρωτεινοσύνθεσης µε µεθειονονίνη 5. Υπαρξη ιντρονίων σε ορισµένα γονίδια 6. Σύνδεση ιστονών µε DNA σε ορισµένα είδη 7. Ανάπτυξη σε ακραία περιβάλλοντα ( υψηλή αλατότητα, θερµοκρασίες >100 0C κ.α) και όχι µόνο.

124 Ακραία αλόφιλα (Ευρυαρχαιωτά, µεγάλο εύρος άλατος) Ακραία θερµόφιλα (Ευρυαρχαιωτά αλλά και Κρεναρχαιωτά, από την Κρήνη επειδή βρέθηκαν στις θερµές πηγές) Μεθανιογόνα (Ευρυαρχαιωτά )Αναερόβιοι οργανισµοί έλη πυθµένες λιµνών έντερο βοοειδών o Χρησιμοποιούνται ως αποικοδομητές σε εγκαταστάσεις επξεργασίας αποβλήτων Νέα είδη από το Yellowstone τοποθετήθηκαν σε νέο κλάδο τα Κοροαρχαιωτά, (από τη λέξη Κούρος) Νέα είδη µε πολύ µικρό µέγεθος Νανοαρχαιωτικά (νάνος) Πως τα βλέπω στο Μικροσκόπιο; Ψευδώς gram- χρώση των Αρχαίων. Γιατί;

125 Γ. ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ Γ1. ΠΡΩΤΙΣΤΑ (πρωτόκτιστα) Αυτά που αποκτούν πρώτα πυρήνα. Μονοκύτταρα/Αποικιακή οργάνωση/πολυκύτταρα Αφυλετική/Φυλετική αναπαραγωγή Φωτοσυνθετικά / Ετερότροφα Είναι οργανισµοί που αγαπούν τα υδάτινα οικοσυστήµατα Παίζουν βασικό ρόλο στην οικολογική ισορροπία Συχνά σε Ρόλο συµβιώτη Συχνά σε Ρόλο παραγωγού Από κάποιες γενεαλογικές γραµµές πρωτίστων εξελίχτηκαν τα φυτά, από κάποιες άλλες οι µύκητες και από κάποιες άλλες τα ζώα Φυλογενετικές σχέσεις Campbell et al. κεφ. 28

126

127 Πως τα βλέπουµε στο µικροσκόπιο; Amoeba sp. ιάτοµα. Τι παρατηρούµε κύτταρα ή κελύφη;

128 Τι σας θυµίζουν; Σηµειώστε µε βελάκια τις δοµές Paramecium sp.

129 Γ2. ΜΥΚΗΤΕΣ Κυτταρική δοµή Οι περισσότεροι είναι πολυκύτταροι, µε νηµατοειδή µορφή. Λίγοι είναι µονοκύτταροι, (ζύµες, ή ζυµοµύκητες) Αποτελούνται από µυκήλια, δηλ από ένα δίκτυο διακλαδισµένων υφών. Οι υφές µπορεί να έχουν διαχωριστικά διαφράγµατα, ή «ενιαίο κυτταρόπλασµα» µε πολλούς πυρήνες. Θρέψη Ετερότροφοι οργανισµοί αλλά δεν τρώνε ούτε κάνουν πέψη όπως τα ζώα. Εκκρίνουν υδρολυτικά ένζυµα και κάνουν εξωκυττάρια πέψη και µετά απορρόφηση ουσιών. Σε κάποιες περιπτώσεις διαπερνούν τα κύτταρα άλλων οργανισµών (συνήθως φυτών) και απορροφούν από το εσωτερικό τους ότι χρειάζεται. Ρόλος και Χρησιµότητα Έχουν κύριο ρόλο στα οικοσυστήµατα ως αποικοδοµητές Πολλοί µύκητες είναι εδώδιµοι Χρησιµοποιούνται για την παραγωγή ψωµιού, τυριών, µπύρας και αλκοολούχων ποτών Τα αντιβιοτικά που παράγονται από τους µύκητες χρησιµοποιούνται για την καταπολέµιση των βακτηρίων Οι µύκητες είναι ακίνητοι. Το µειονέκτηµα αυτό αίρεται µε τον αυξηµένο κυτταρικό τους πολλαπλασιασµό

130

131 Πως τους βλέπουµε στο µικροσκόπιο αλλά και µακροσκοπικά. Saccharomyces cerevisiae. Μονοκύτταρος µύκητας, όπως φαίνεται µικροσκοπικά. Νεραιδόκυκλος µανιταριών. (βασιδιοµύκητες). Για τον µηχανισµό δηµιουργίας του συµβουλευτείτε την εικόνα του βιβλίου σας. Ποιο µέρος του µύκητα βλέπετε;

132 Μακροσκοπική εµφάνιση διαφορετικών βασιδιοµυκήτων (µανιτάρια). Τρώµε τα βασιδιοκάρπια (αναπαραγωγικές δοµές), άλλα όχι τυχαία. Χωρίς να ξεχνάµε ότι υπάρχουν Και δηλητηριώδη. Amanita pantherina Galerina autumnalis

133 εν ξεχνάµε το βασικό τους ρόλο ως αποικοδοµητές. pleurotus ostreatus, αποικοδόµηση ξύλου Χαρακτηριστικοί βρώσιµοι µύκητες, αλλά Ασκοµύκητες

134 Ξαναγυρνώντας στο µικροσκόπιο Ζυγοµύκητας Rhizopus sp. Αφυλετική αναπαραγωγή. ιακρίνονται οι υφές και τα σποριάγγεια. Ζυγοµύκητας Rhizopus sp. Φυλετική αναπαραγωγή. ιακρίνονται οι υφές, οι αναπαραγωγικές υφές και τα ζυγοσποριάγγεια. Για να δείτε αναλυτικά τον αναπαραγωγικό κύκλο συµβουλευτείται την εικόνα 31.13, του βιβλίου σας.

135 Οι µύκητες σαν συµβιωτικοί οργανισµοί (παραδείγµατα) Λειχήνες. Συµβίωση Μύκητα και Φωτοσυνθετικού οργανισµού (κυανοβακτήρια ή πράσινα φύκη). Περίπου το 40% των ασκοµυκήτων είναι συµβιωτικοί.

136 Μυκόρριζες. Μύκητες που συµβιώνουν στις ρίζες των φυτών. Τεράστια οικονοµική σηµασία στη γεωργική παραγωγή. Ποιο φυτό από τα δύο πιστεύετε ότι έχει µυκόρριζες;.

137 Γ2 ΦΥΤΑ Για τρία δισεκατοµµύρια χρόνια η ζωή υπήρχε µόνο όπου υπήρχε νερό. Στη στεριά δεν υπάρχει ζωή. Πρώτα βγαίνουν τα κυανοβακτήρια Πριν από ~500 εκ. χρόνια µικρά φυτά µύκητες και ζώα Πριν από 379 εκ. χρόνια έχουµε ψηλά φυτά που σχηµατίζουν δάση. Ορισµένες Προσαρµογές που επέτρεψαν τη µετάβαση των φυτών στην ξηρά Ξηρασία ο υπ αριθµόν ένας εχθρός (βαρύτητα, φυτοφάγα ζώα, κ.α) Εφυµενίδα (αποτελείται από πολυεστερικά και κηρώδη πολυµερή) που καλύπτει την επιδερµίδα. Προστατεύει από την ξηρασία Ρίζες βλαστός, µηχανισµοί για απορρόφηση θρεπτικών συστατικών ενάντια στη βαρύτητα. Παραγωγή δευτερογενών ενώσεων. Αλκαλοειδή, τερπένια, ταννίνες, φαινολικές ενώσεις για άµυνα, µε δεδοµένο ότι τα φυτά είναι ακίνητα Τα πρώτα φυτά δεν διέθεταν ούτε ρίζες ούτε φύλλα. Πως απορροφούσαν θρεπτικά συστατικά από το έδαφος; Απολιθώµατα 420 εκ. ετών δείχνουν ότι σε πρώτο στάδιο πιθανόν να υπήρχε Συµβίωση µε µύκητες για απορρόφηση θρεπτικών συστατικών (Θυµάστε τα Μυκόρριζα) Όµως Τι είναι τα φυτά; Είναι τα εµβρυόφυτα; Είναι οι οργανισµοί που χαρακτηρίζονται από την οµή του εµβρύου από το οποίο βλαστάνει ο νέος οργανισµός; (Μάλλον ναι αν και εν υπάρχει απόλυτη συµφωνία.)

138 Στα φυτά απαντάται η Εναλλαγή των γενεών (σποριόφυτο, γαµετόφυτο, ) και πολυκύτταρο έµβρυο. Για περισσότερες πληροφορίες συµβουλευτείτε το βιβλίο σας Εικόνα 29.5 Από το έµβρυο στο σπέρµα Σπέρµα οµή που περικλείει µέσα σε προστατευτικό περίβληµα το φυτικό έµβρυο και ικανή ποσότητα θρεπτικών υλικών. Γυµνόσπερµα τα σπέρµατα είναι γυµνά, δεν περικλείονται σε ειδικούς θαλάµους. Αγγειόσπερµα τα σπέρµατα σχηµατίζονται µέσα σε µια προστατευτική κοιλότητα την ωοθήκη Τα σπέρµατα και οι γυρεόκοκκοι υπήρξαν καθοριστικές προσαρµογές για τη ζωή στην ξηρά. Α. Προστασία του εµβρύου από την ξηρασία και την υψηλή ακτινοβολία Β. εν χρειάζεται πλέον νερό για τη διεκπεραίωση της γονιµοποίησης

139 ΦΥΤΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ Α. Φυτά χωρίς αγγειακό ιστό (7%), για µεταφορά Η20 κ.α (βρυόφυτα) Β. Φυτά µε αγγειακό ιστό Αγγειόφυτα (93%) Β1. Φυτά µε αγγειακό ιστό χωρίς σπέρµα Ασπερµα αγγειόφυτα (πτεριδόφυτα, λυκόφυτα) Β2. Φυτά µε αγγειακό ιστό και µε σπέρµα (Σπερµατόφυτα) Β.2.1.Γυµνόσπερµα (Γκίγκο, Κυκάδες, Γνετόφυτα, Κωνοφόρα Β.2.2.Αγγειόσπερµα (90%) (ανθοφόρα φυτά)

140 Ας επικεντρωθούµε στα αγγειόσπερµα. Μακροσκοπική και µικροσκοπική παρατήρηση Τα αγγειόσπερµα (ανθόφυτα) έχουν άνθη και φτιάχνουν καρπούς Τα άνθη αποτελούνται από τέσσερις οµάδες διαφοροποιηµένων φύλλων τα σέπαλα, τα πέταλα, τους στήµονες και τα καρπόφυλλα (όπου παράγονται οι σπερµατικές βλάστες). Η µεταφορά της γύρης γίνεται συχνά µε έντοµα ή άλλα ζώα και είναι στοχευµένη. Οι ωοθήκες µετά τη γονιµοποίηση ωριµάζουν σε καρπούς, οι οποίοι µεταφέρουν τα σπέρµατα σε νέες τοποθεσίες συνήθως µε τον άνεµο το νερό ή διάφορα ζώα

141 Θυμάστε; Σημειώστε τις δομές με βελάκια

142 Και η συνέχεια.. Γύρη Liliumm έτοιµη για χρήση.. Γύρη πεύκου στο µικροσκόπιο. ιακρίνετε τους «αερόσακους» για την µεταφορά;

143 Βλαστάνουσα γύρη και προσέγγιση του στίγµατος του ύπερου. Pollen germination on the stigma. When pollen lands on the stigma, it germinates and forms a pollen tube that continues to elongate until it penetrates the style, enters the ovary and then enters the micropyle and deposits sperm cells in a specific location within the embryo sac

144 Και έπεται η γονιµοποίηση για το σχηµατισµό του εµβρύου Εµβρυόσακκος Lillium 1η κυτταρική διαίρεση

145 Εµβρυόσακκος Lillium 2 η κυτταρική διαίρεση

146 Και οι διαιρέσεις συνεχίζονται µέχρι την πλήρη ανάπτυξη του εµβρύου και τη δηµιουργία του σπέρµατος. οµή σπέρµατος µονοκοτυλήδονου. Ποια δοµή είναι 2n και ποιά 3n; Συµβουλευτείτε το βιβλίο σας, εικόνα Και τελικά όταν αυτό φυτρώσει ένας νέος οργανισµός.. «Η ευµάρεια των ανθρώπινων κοινωνιών εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τα σπερµατόφυτα.» Γιατί;

147 Γ4. ΖΩΑ ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Τα ζώα είναι πολυκύτταροι ετερότροφοι ευκαρυώτες µε ιστούς που αναπτύσσονται από εµβρυϊκές στοιβάδες. Τα ζώα είναι ετερότροφοι οργανισµοί που προσλαµβάνουν την τροφή τους από εξωτερικές πηγές Τα ζώα είναι πολυκύτταροι ευκαρυώτες. Τα κύτταρα δεν διαθέτουν κυτταρικό τοίχωµα αλλά συγκρατούνται µεταξύ τους συνήθως από δοµικές πρωτείνες όπως το κολλαγόνο. Ο νευρικός και ο µυικός ιστός απαντούν αποκλειστικά στα ζώα. Αναπαραγωγή των ζώων (συνοπτικά) 1. Το διπλοειδές στάδιο καταλαµβάνει το µεγαλύτερο µέρος του βιολογικού κύκλου των ζώων. 2. Τα σπερµατοζωάρια κινούνται µε µαστίγια, τα ωάρια είναι ακίνητα. 3. Τη γονιµοποίηση ακολουθεί ο σχηµατισµός του ζυγωτού. 4. Το ζυγωτό υπόκειται σε αυλάκωση µα διαδικασία µιτωτικών διαιρέσεων, οι οποίες δεν συνοδεύονται από κυτταρική αύξηση. 5. Η αυλάκωση οδηγεί στη δηµιουργία του βλαστιδίου, µιας πολυκύτταρης µάζας κυττάρων που στα περισσότερα ζώα έχει τη µορφή µιας κοίλης σφαίρας. 6. Στα περισσότερα ζώα τον σχηµατισµό του βλαστιδίου ακολουθεί η γαστριδίωση, που οδηγεί στον σχηµατισµό των εµβρυικών στοιβάδων, ( ενδόδερµα, εξώδερµα, αρχέντερο µε ένα άνοιγµα τον βλαστοπόρο) απ όπου θα προκύψουν τα διάφορα µέρη του ενήλικου οργανισµού.. 7. Σε κάποια ζώα έχουµε ένα στάδιο αυτό της προνύµφης. Είναι αναπαραγωγικά ανώριµα άτοµα, που περνούν από το στάδιο της µεταµόρφωσης

148 Ανάπτυξη των ζώων Τα ζώα, διαθέτουν γονίδια Hox, τα οποία ρυθµίζουν την ανάπτυξη της µορφής του σώµατος. Αν και τα γονίδια Hox εµφανίζουν υψηλό βαθµό συντήρησης, η ποικιλία των ζωικών µορφών που µπορούν να προκύψουν από τα γονίδα αυτά είναι τεράστια Η ιστορία των ζωικών οργανισµών υπερβαίνει το µισό δισεκατοµµύριο χρόνια 1. Εκτιµούµε ότι το 99% των ειδών των ζώων που έχουν υπάρξει έχουν εξαφανιστεί. 2. Κοινός πρόγονος ένα πρώτιστο (χοανομαστιγωτό) Κάµβρια έκρηξη ζωής (Παλαιοζωικός αιώνας 542 έως 251 εκ. χρ.) Το 50% των αρτιγονων φύλων εµφανίζεται στην Κάµβρια περίοδο εκ.χρ. Αυξάνεται το ατμοσφαιρικό οξυγόνο; Αλλάζουν σχέσεις θηρευτή θηράματος; Αλλάζουν τα γονίδια Hox; Μορφολογικά χαρακτηριστικά των ζώων Τα ζώα µπορεί είτε 1. να µην εµφανίζουν συµµετρία (σπόγγοι) 2. Να έχουν ακτινωτή συµµετρία 3. Να έχουν αµφιπλευροσυµµετρική συµµετρία a. Τα αμφιπλευροσυμμετρικά ζώα διαθέτουν ραχιαία και κοιλιακή πλευρά καθώς και πρόσθιο και οπίσθιο άκρο

149 Στάδια πρώιµης ανάπτυξης 1. Πρωτοστόµια (πχ µαλάκια, δακτυλιοσκώληκες) Το στόµα σχηµατίζεται από τον βλαστοπόρο. 2. ευτεροστόµια (εχινόδερµα, χορδωτά). Το στόµα σχηµατίζεται από δευτερογενές άνοιγµα Φυλογένεση των ζώων Τα µοριακά δεδοµένα άλλαξαν το εξελικτικό δέντρο των ζώων που βασιζόταν σε µορφολογικά δεδοµένα, παρόλα αυτά µπορούµε να συµφωνήσουµε σε κάποιες βασικές αρχές. 1. Όλα τα ζώα έχουν ένα κοινό πρόγονο. (ένα μετάζωο) 2. Οι σπόγγοι βρίσκονται στη βάση του δέντρου των ζώων. 3. Ο κλάδος ευμετάζωα (πραγματικά ζώα) περιλαμβάνει ζώα με πραγματικούς ιστούς. 4. Τα περισσότερα ζωικά φύλλα ανήκουν στον κλάδο Αμφιπλευροσυμμετρικά. Η Κάμβρια έκρηξη οδήγησε πρωτίστως στην ταχύτατη διαφοροποίηση των αμφιπλευροσυμμετρικών ζώων. 5. Τα χορδωτά και ορισμένα άλλα φύλα ανήκουν στον κλάδο Δευτεροστόμια

150 Και τα τρία αυτά είδη ζώων είναι δεινοί κολυµβητές. Μορφολογικά µοιάζουν αν και δεν µοιράζονται κάποιον κοντινό κοινό πρόγονο. Συνεπώς εδώ παρατηρούµε το φαινόµ µενο της..εξέλιξης

151 Μακροσκοπική και Μικροσκοπική παρατήρηση. Α. Σπόγγοι 1. Οι Σπόγγοι (33.1 στο βιβλίο σας.) Βρίσκονται στη βάση του γενεαλογικού δέντρου των ζώων και δεν διαθέτουν πραγματικούς ιστούς. Είναι αιωρηματοφάγοι υδρόβιοι, οργανισμοί. 2. Το νερό αντλείται μέσα από τους πόρους και διοχετεύεται σε μια κεντρική κοιλότητα το σπογγόκοιλο και εξέρχεται από ένα μεγαλύτερο άνοιγμα το στόμιο. Μπορείτε να διακρίνετε αυτές τις δομές στην τομή του σπόγγου;

152 Κνιδόζωα Eίναι ένα αρχέγονο φύλο µε πολλές οµοταξίες. Η Obelia sp είναι ένα υδρόζωο (µια συνοµοταξία των κνιδόζωων) µε δύο διακριτές µορφές: Πολύποδας (τροφικός και αναπαραγωγικός) και µέδουσα. Εικόνα 33.8 στο βιβλίο σας. Σηµειώστε τις δοµές στην εικόνα όπως παρουσιάζεται στο µικροσκόπιο. Αναπαραγωγικός πολύποδας, τροφικός πολύποδας, µέδουσα.

153 ακτυλιοσκώληκες Οι ακτυλιοσκώληκες είναι ένα ζωικό φύλο σκωλήκων µε εµφανή σωµατική µεταµέρεια. Εικόνα στο βιβλίο σας. Στην τοµή του γεωσκώληκα Lumbricus terrestis να διακρίνετε: Την επιδερµίδα, το µυικό σύστηµα, Την πεπτική κοιλότητα (έντερο), το ραχιαίο αγγείο, και τις συντετηγµένες νευτικές χορδές ( νευρικό σκοινί). Τοποθετείστε βελάκια.

154 Αρθρόποδα Ένα δισεκατοµµύριο δισεκατοµµύρια διαφορετικά είδη, ( έντοµα, αράχνες) Τα περισσότερα είναι έντοµα Κοιλωµατικά ζώα µε Μεταµερισµένο σώµα Αρθρωτά εξαρτήµατα Και εξωσκελετό αποτελούµενο από πρωτείνες και χητίνη Πόσο µας αφορά η ύπαρξη των «ενοχλητικών» εντόµων Τα έντοµα δεν πρόκειται να κληρονοµήσουν τη Γή. Η Γη ήδη τους ανήκει. Καλό θα ήταν λοιπόν να συµφιλιωθούµε µε τον σπιτονοικοκύρη µας» Thomas Eisner, Cornell University. Επικονίαση φυτών. Τρώνε το φαγητό µας; Σε ορισµένες περιοχές της Αφρικής τα έντοµα καταναλώνουν περίπου το 75% της σοδειάς των καλλιεργούµενων φυτών. Φορείς ασθενιών (ελονοσία, τρυπανοσωµίαση) Ανατοµία αράχνης

155 Χορδωτά 1. Νωτοχορδή (σκελετική στήριξη, στον άνθρωπο περιορίζεται στους ζελατινώδεις δίσκους που παρεµβάλονται µεταξύ των σπονδύλων) 2. Ραχιαία κοίλη νευρική χορδή (προκύπτει µε την ανάπτυξη, το κεντρικό νευρικό σύστηµα, ο εγκέφαλος και ο νωτιαίος µυελός) 3. Φαρυγγικές σχισµές ή αύλακες (στα τετράποδα τα φαρυγγικά τόξα ενέχονται και στο σχηµατισµό τµηµάτων του αυτιού και άλλων δοµών της κεφαλής και του λαιµού.) 4. Μυώδη µεταεδρική ουρά Κεφαλοχορδωτά Αµφίοξοι. Βρίσκονται στη βάση του δέντρου των χορδωτών. Θαλλάσιοι αιωρηµατοφάγοι οργανισµοί. Ο αµφίοξος εµφανίζει και τους τέσσερις βασικούς χαρακτήρες των χορδωτών. Αντί για πλήρη εγκέφαλο έχει µια µικρή πλάτυνση στο άκρο της ραχιαίας νευρικής χορδής. Ιδια έκφραση των γονιδίων Hox.

156 Παρασκεύασµα από τοµή αµφίοξου στην περιοχή του φάρυγγα (Α) και της κοιλιάς (Β). Α Β Σηµειώστε στην τοµή του κάτωθι παρασκευάσµατος, την νωτοχορδή, την νευρική χορδή, το µυικό σύστηµα, το φαρυγγικό άνοιγµα

157 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ) Εκχύλιση πρωτεϊνών από µυϊκό ιστό και ήπαρ, ιχθύων. 15) ιαχωρισµός των πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση 16) Μονιµοποίηση-Χρώση-Αποχρωµατισµός της πηκτής. Σχεδιασµός πρότυπης καµπύλης. Αναγνώριση των κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών του µυϊκού ιστού. 17)Τα πρότυπα των πρωτεϊνών, µετά από τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό, ως δείκτες φυλογένεσης. ηµιουργία κλαδογράµµατος. Εικόνα 1 υναµική συναρµολόγηση ενός δικτύου ακτίνης σε ένα ελασµατοπόδιο. Oνοµα φοιτητή Ηµεροµηνία Yπογραφή επιβλέποντα

158 Γενική εισαγωγή Η αλληλούχιση και ανάλυση του ανθρώπινου γονιδιώµατος, Human Genome Project, που άρχισε το 1990 και ολοκληρώθηκε µια δεκαετία αργότερα επιφύλαξε µια έκπληξη. Ενώ ο αριθµός των ανθρώπινων γονιδίων υπολογιζόταν αρχικά σε αποδείχτηκε τελικά πολύ µικρότερος, περίπου στις Παράλληλα η αλληλούχιση του γονιδιώµατος του νηµατώδους C.elegans έδειξε την ύπαρξη γονιδίων σε αυτό το είδος. Όλοι συµφωνούν όµως ότι ο Ηomo sapiens είναι σαφώς ένα ποιο εξελιγµένο πιο πολύπλοκο είδος από τον σκώληκα C.elegans. Πού οφείλεται όµως η διαφορά στην πολυπλοκότητα αυτή, αφού τα δύο είδη έχουν µικρή διαφορά στον αριθµό των γονιδίων τους; Το γονιδίωµα του ανθρώπου αποτελείται από 3 δις-εκατοµµύρια ζεύγη βάσεων ενώ αυτό του σκουληκιού από 100 εκατοµµύρια ζεύγη βάσεων. Μπορεί λοιπόν η απάντηση να βρίσκεται στο «άχρηστο» junk DNA, πιθανότητα η οποία διερευνάται. Παράλληλα πολλές ερευνητικές προσπάθειες εστιάζονται τώρα στην µελέτη των προϊόντων των γονιδίων, στις πρωτεΐνες. Ο όρος πρωτέωµα δηµιουργήθηκε σε αναλογία µε τον ήδη καθιερωµένο όρο γονιδίωµα και αφορά σε αυτές. Η µελέτη της σύνθεσης, των µετά-µεταφραστικών τροποποιήσεων, της δοµής, της µετακίνησης, της ενδοκυττάριας θέσης, της λειτουργίας των πρωτεϊνών είναι ξανά ζήτηµα αιχµής. Τελικά µπορούµε να πούµε ότι οι πρωτεΐνες είναι σε σηµαντικό βαθµό υπεύθυνες για την διαφορετική φαινοτυπική έκφραση των διαφορετικών ειδών. Θυµίζουµε ότι: Ένα είδος είναι ένας πληθυσµός αποτελούµενος από άτοµα που µπορούν να αναπαραχθούν µεταξύ τους και να δώσουν γόνιµους απογόνους. Σε αυτή την οµάδα των ασκήσεων θα εξετάσουµε τις πρωτεΐνες από µυϊκό ιστό διαφορετικών ειδών ψαριών και µε βάση την εµφάνισή τους στην ηλεκτροφόρηση θα προσπαθήσουµε να εξάγουµε συµπεράσµατα για την φυλογενετική σχέση των υπό εξέταση ειδών, (πόσο κοντά ή πόσο µακριά είναι εξελικτικά τα είδη). Εικόνα 58. Τα διαφορετικά είδη µπορεί να είναι εύκολα διακριτά λόγω καθοριστικών µορφολογικών διαφορών. Στην περίπτωση που αυτό δεν είναι δυνατό, συνήθως χρησιµοποιούνται µοριακά κριτήρια για την ταυτοποίηση.

159 Οι πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού συγκροτούν ένα δίκτυο ινιδίων που εκτείνεται σε όλο το κυτταρόπλασµαα των ευκαρυωτικών κυττάρων. Πρόκειταιι για µια δοµή που παρέχει στήριξη στον µεγάλο όγκο του κυτταροπλάσµατος, πολύ σηµαντική για τα ζωικά κύτταρα που δεν έχουν κυτταρικό τοίχωµα. Θα ήταν λάθος όµως να φανταστούµε τον κυτταροσκελετό σαν κάτι αντίστοιχο µε τον σκελετό του σώµατος µας.. Το πιο σωστό είναι να τον παραλληλίσουµε επιπλέον και µε τον µυϊκό µας ιστό και αυτό γιατί πρόκειται για µια ιδιαίτερα δυναµική δοµ µή που επιτρέπει τόσο την συνολική κίνησηη του κυττάρου, όσο και µια σειρά ενδοκυττάριων κινήσεων. Ο κυτταροσκελετός αναδιοργανώνεται κάθε χρονική στιγµή ανάλογα µε τις κυτταρικές ανάγκες. Η αναδιοργάνωση αυτή επιτυγχάνεται χάρη στην δυναµική ισσοροπία πολυµερισµού/αποπολυµερισµού πολλών κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, όπως για παράδειγµα η ακτίνη και η τουµπουλίνη. Μερικές από τις λειτoυργίες του κυττάρου στις οποίες ο κυτταροσκελετός έχει κύριο ρόλο είναι: H ενδοκυττάρια µεταφορά οργανιδίων από την µια θέση σε άλλη Το µοίρασµα των χρωµοσωµάτων στη µίτωση και τη µείωση Η κυτταροκίνηση Η ικανότητα των κυττάρων να έρπουν σε µια επιφάνεια και να µεταναστεύουν µέσα στον οργανισµό Η µυϊκή συστολή (µ µυϊκά κύτταρα) Εικόνα 59. Ενας ινοβλάστης έχει χρωστεί µε Coomassie blue µια χρωστική που βάφει τις πρωτείνες. Σηµαντικό µέρος των πρωτεινών του κυττάρου αποτελούν οι πρωτείνες του κυτταροσκελετού/ Ο µυϊκός ιστός χαρακτηρίζεται από την µυϊκή συστολή η οποία είναι είναι η πιο κατανοητή από τις κινήσεις των ζωικών κυττάρων. Για τους ανθρώπους, όπως και για όλα τα σπονδυλωτά, µια σειρά καθηµερινών ενεργειών όπως το βάδισµ µα, το κολύµπι, το τρέξιµο στηρίζονται στην ικανότητα των σκελετικών µυών να συστέλλονται, επιτρέποντας την µετακίνηση των οστών και κατ επέκταση του σώµατος. Μια σειρά από ακούσιες κινήσεις όπως η λειτουργία της καρδιάς, οι κινήσεις του εντέρου βασίζονται στη λειτουργία των καρδιακών και των λείων µυών αντίστοιχα.

160 Εικόνα 2. Η µυοσίνη ΙΙ αποτελείται από ένα ζεύγος δύο όµοιων µορίων που περιελίσσονται και αποκτούν τελική διαµόρφωση µε κεφαλή και ουρά (Α). Για να σχηµατιστεί το ινίδιο µυοσίνης (Β) οι ουρές των µορίων της µυοσίνης διαπλέκονται στο εξωτερικό ενώ οι κεφαλές προεξέχουν. Όλοι οι παραπάνω µυϊκοί ιστοί για τη συστολή τους χρησιµοποιούν τις ίδιες πρωτεΐνες. Η µυοσίνη και η ακτίνη είναι οι σηµαντικότερες από αυτές και ανήκουν και οι δύο στις πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού. Η ακτίνη είναι µια κυτταροσκελετική πρωτεΐνη που πολυµερίζεται και σχηµατίζει ελικοειδή νηµάτια. Οι µυοσίνες είναι κινητήριες πρωτεΐνες που χρησιµοποιούν την ενέργεια της υδρόλυσης του ΑΤΡ για να κινηθούν. Συνοπτικά µπορούµε να πούµε ότι η µυϊκή συστολή εξαρτάται από την ολίσθηση των νηµατίων της ακτίνης κατά µήκος των νηµατίων της µυοσίνης ΙΙ όπως φαίνεται στην εικόνα 3. Εικόνα 3. ίπολα ινίδια που αποτελούνται από µόρια µυοσίνης ΙΙ (πράσινο) προκαλούν την ολίσθηση των νηµατίων της ακτίνης (κόκκινο) µεταξύ τους επιτρέποντας έτσι την βράχυνση των νηµατίων της ακτίνης. Σκοπός αυτής της σειράς των ασκήσεων είναι Α) η εκχύλιση των πρωτεϊνών από µυϊκό ιστό διαφορετικών ειδών ψαριών Β) η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών. Γ) η εξαγωγή συµπερασµάτων για την φυλογένεση των διαφορετικών ειδών ψαριών µε βάση το πρότυπο της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών

161 Άσκηση 14 Εκχύλιση πρωτεϊνών από µυϊκό ιστό και ήπαρ, ιχθύων. Σκοπός Ο στόχος είναι να εκχυλίσουµε τις πρωτεΐνες από το µυϊκό ιστό και από το ήπαρ διαφορετικών ειδών ψαριών Εισαγωγή Οι πρωτεΐνες είναι βιολογικά µακροµόρια που επιτελούν πολλαπλές λειτουργίες, ανάλογες µε τον κυτταρικό τύπο/ιστό στον οποίο απαντώνται. ύο διαφορετικοί ιστοί, έχουν κάποιες πρωτείνες όµοιες µεταξύ τους, αυτές που θεωρούνται απαραίτητες για την λειτουργικότητα όλων των κυτταρικών τύπων. Για παράδειγµα στην πλειονότητα των ζωικών κυττάρων θα συναντήσουµε ακτίνη. Επειδή όµως λειτουργικά δύο διαφορετικοί ιστοί επιτελούν διαφορετικό βιολογικό ρόλο, έχουν και πολλές πρωτείνες που είναι διαφορετικές µεταξύ των δύο ιστών (tissue specific proteins). Στο σηµερινό εργαστήριο Α) Θα εκχυλίσουµε τις πρωτεΐνες από µυϊκό ιστό διαφορετικών ειδών ψαριών. Mε βάση τις οµοιότητες ή/και τις διαφορές των πρωτεινών θα προσπαθήσουµε να βγάλουµε συµπεράσµατα για τη συγγένεια των ειδών των ψαριών. Β) Παράλληλα σε ένα είδος (πέστροφα) θα εκχυλίσουµε πρωτείνες από µυικό ιστό αλλά και από ήπαρ, για να συγκρίνουµε µεταξύ τους τις πρωτείνες των δύο ιστών. Στη συνέχεια θα διαχωρίσουµε τις πρωτεΐνες που έχουµε εκχυλίσει, µε ηλεκτροφόρηση. Η µέθοδος διαχωρισµού µας κατευθύνει στη µέθοδο που θα επιλέξουµε για την εκχύλιση. Συγκεκριµένα: Για την εκχύλιση θα χρησιµοποιηθεί το ρυθµιστικό διάλυµα Laemmli. Είναι ένα µίγµα από ρυθµιστικό διάλυµα Τris, το ανιονικό απορρυπαντικό SDS (sodium dodecyl sulfate), την χρωστική για την ηλεκτροφόρηση (µπλε της βρωµοφαινόλης) και γλυκερόλη. Όπως ήδη έχουµε συζητήσει η επίδραση απορρυπαντικού θα οδηγήσει στη καταστροφή των κυτταρικών µεµβρανών και την απελευθέρωση των ενδοκυττάριων συστατικών και των πρωτεϊνών. Επιπλέον όµως η επίδραση του απορρυπαντικού σε συνδυασµό µε τη θέρµανση θα προκαλέσει αποδιάταξη των πρωτεϊνών (θα καταστρέψει την τεταρτοταγή και τριτοταγή δοµή τους). Αυτό είναι απαραίτητο για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών που θα αναλυθεί στο επόµενο εργαστήριο.

162 Υλικά 1. Laemmli sample buffer (62,5 mm Tris-HCl ph 6,8, 25% γλυκερόλη, 2% SDS, 0,01% Μπλε της βρωµοφαινόλης) 2.Σωλήνες eppendorf 3.Νυστέρια 4.Πιπέτες 5.Μυικός ιστός από τα παρακάτω είδη 1. Γαλέος 2. Σολωµός 3. Πέστροφα 4. Οξύρυγχος 5. Ηπαρ πέστροφας Εργαστηριακός Εξοπλισµός Υδατόλουτρο στους 95 0 C Πειραµατική πορεία 1. Ονοµάστε τους σωλήνες σας µε τους αριθµούς 1-5 ώστε να αντιστοιχούν στα διαφορετικά είδη ψαριών που είναι ήδη αριθµηµένα.. 2. Προσθέστε 250µl ρυθµιστικό διάλυµα Laemmli σε κάθε σωλήνα. 3. Κόψτε από κάθε είδος ψαριού ένα µικρό κοµµάτι µυϊκού ιστού µεγέθους 0,1cmx0,1cmx0,1 cm. Αποµακρύνετε τυχόν υπολείµµατα δέρµατος και οστών. 4. Μεταφέρετε µε λαβίδα κάθε ιστό στο σωλήνα που του αντιστοιχεί και κλείστε το σωλήνα. 5. Χτυπήστε ελαφρά µε το δάκτυλό σας τον πυθµένα του κάθε σωλήνα για 15 φορές. 6. Επωάστε τα δείγµατά σας σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 min. 7. Ονοµάστε µια δεύτερη οµάδα από σωλήνες µε τους αριθµούς Αναρροφήστε µε προσοχή 100µl από τo υπερκείµενο (εκχύλισµα) των αρχικών σωλήνων και µεταφέρτέ τα στους αντίστοιχους νέους σωλήνες που έχετε αριθµήσει (Το υπερκείµενο από το εκχύλισµα του σωλήνα 1 στο καινούριο σωλήνα 1, το 2 στο 2 κ.τλ). Αποµακρύνετε από τον πάγκο σας τους παλαιούς σωλήνες (αυτούς που περιέχουν τον ιστό). 9. Τοποθετήστε τα εκχυλίσµατά σας στο υδατόλουτρο 95 0 C. Αφήστε τα για 5 min. Οι πρωτεΐνες των δειγµάτων σας έχουν µετουσιωθεί και είναι έτοιµες για ηλεκτροφόρηση. Αποθηκεύστε τα δείγµατά σας στους C, εάν δεν τα χρησιµοποιήσετε αµέσως.

163 Άσκηση 15 ιαχωρισµός των πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση Σκοπός Ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών του µυϊκού ιστού µε ηλεκτροφόρηση Εισαγωγή Η εκχύλιση των πρωτεϊνών στην προηγούµενη εργαστηριακή άσκηση έγινε σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιείχε το ανιονικό απορρυπαντικό SDS. Η επίδραση του SDS έχει ένα διττό αποτέλεσµα στα πρωτεϊνικά µόρια. Αφενός µεν µετουσιώνει τις πρωτείνες όπως προαναφέρθηκε, αλλά επιπλέον προκαλεί και τη φόρτιση των πρωτεϊνών µε αρνητικό φορτίο. Τα πρωτεϊνικά µόρια συνεπώς είναι σχεδόν γραµµικά και αρνητικά φορτισµένα, όπως φαίνεται στην εικόνα. Η ηλεκτροφόρηση επιτρέπει το διαχωρισµό των µορίων µε βάση αυτά τα δύο χαρακτηριστικά. Όταν τοποθετούνται σε ένα πήκτωµα (gel) και εφαρµοστεί ηλεκτρικό πεδίο οι πρωτεΐνες θα µετακινηθούν από τον αρνητικό στο θετικό πόλο ανάλογα µε το µεγεθός τους. Τα πιο µικρά µόρια θα κινηθούν πιο γρήγορα από τα µεγαλύτερα και εποµένως θα επιτύχουµε το διαχωρισµό των πρωτεϊνών µε βάση το µέγεθός τους. Εικόνα 4. Ο συνδυασµός της επίδρασης του απορρυπαντικού SDS και της αυξηµένης θερµότητας οδηγεί στην µετουσίωση των πρωτεινικών µορίων και στη φόρτισή τους µε αρνητικό φορτίο. Το µέγεθος των πρωτεϊνών, δηλαδή το µοριακό τους βάρος µετριέται σε daltons. Ένα dalton ορίζεται ως η µάζα ενός ατόµου του υδρογόνου και ζυγίζει 1,66x10-24 γραµµάρια. Επειδή το µέσο µέγεθος ΜΒ ενός αµινοξέος είναι 110 daltons όταν ξέρουµε τον αριθµό των αµινοξέων µιας πρωτεΐνης µπορούµε να υπολογίσουµε το µοριακό της βάρος (και αντίστροφα) µε βάση τον τύπο. Μοριακό βάρος πρωτεΐνης= αριθµός αµινοξέων x 110 daltons Επειδή τα µοριακά βάρη συνήθως είναι χιλιάδες daltons, τα µεγέθη εκφράζονται συνήθως σε kilodalton (kda). Η πλειονότητα των πρωτεινών έχει µοριακά βάρη που κινούνται σε κλίµακα kda. ύο υλικά χρησιµοποιούνται για τη δηµιουργία πηκτών για το διαχωρισµό των βιοµορίων, το πολυακριλαµίδιο και η αγαρόζη. Συνήθως το µέσο που χρησιµοποιείται για τη δηµιουργία πηκτής (gel) για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών είναι το πολυακριλαµίδιο

164 ενώ τα µόρια του DNA διαχωρίζονται σε πηκτές αγαρόζης.. Οι επιλογές αυτές στηρίζονται στις ιδιότητες των βιοµορίων και των αντίστοιχων υλικών. Το πλέγµα της πηκτής του πολυακρυλαµιδίου είναι πιο «σφιχτό» σε σχέση µε αυτό της αγαρόζης. Επειδή οι πρωτεΐνες είναι συνήθως µικρά µόρια σε σχέση µε τα µόρια του DNA (DNA bp=660kda) ο διαχωρισµός τους γίνεται συνήθως σε πηκτές πολυακριλαµιδίου ενώ το DNA τρέχει» σε πηκτές αγαρόζης. Αυτός ο διαχωρισµός δεν είναι απόλυτος: για µεγάλα πρωτεϊνικά µόρια χρησιµοποιείται µερικές φορές αγαρόζη και για µικρά µόρια DNA πολυακριλαµίδιο. Στη σηµερινή άσκηση θα διαχωρίσετε τα µόρια σας σε πηκτή αγαρόζης. Ποιες πρωτεΐνες περιµένετε ότι θα διαχωριστούν καλύτερα; Αυτές µε µικρά ή αυτές µε µεγάλα µοριακά βάρη; Υλικά Αριθµηµένα σωληνάκια εκχυλίσµατα µυϊκού ιστού και ήπατος από το προηγούµενο εργαστήριο Μίγµα δεικτών µοριακών βαρών ακτίνης και µυοσίνης Μίγµα έγχρωµων δεικτών µοριακών βαρών ιάλυµα ηλεκτροφόρησης, 1x Tris-glycine-SDS ιάλυµα µονιµοποίησης 10% οξικό οξύ 40% αιθανόλη ιάλυµα χρώσης πρωτεϊνών Βio-Safe Coomassie Εργαστηριακός εξοπλισµός Τροφοδοτικό µηχάνηµα Συσκευές ηλεκτροφόρησης Λεκάνες µονιµοποίησης, χρώσης, αποχρωµατισµού Πειραµατική πορεία Α. Προπαρασκευαστικό στάδιο Ετοιµασία των δεικτών ακτίνης και µυοσίνης. Προσθέστε 500µl Laemmli buffer και επωάστε σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. Ακολούθως επωάστε για 5 λεπτά στους 95 0 C. Μετά από τη χρήση αποθηκεύστε στους C. Το διάλυµα Tris/glycine/SDS (TGS)έχει συγκέντρωση 10x. Το χρειαζόµαστε σε συγκέντρωση 1x. Πως θα φτιάξετε 500ml διαλύµατος..

165 Β. Προετοιµασία της πηκτής, gel, αγαρόζης-χαµηλoύ σηµείου τήξης (low-melt agaroze) Αγαρόζη 4% σε TGS buffer Για 100ml πηκτής. 1. Προσθέστε 4gr αγαρόζης σε κωνική φιάλη των 200ml 2. Προσθέστε100ml TGS buffer 3. Λιώστε την αγαρόζη µε προσοχή ώστε να µην δηµιουργηθούν φυσαλίδες. 4. Ετοιµάστε την οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης σύµφωνα µε τις οδηγίες (µην ξεχάσετε τα δοντάκια που δηµιουργούν τις θέσεις που θα τοποθετηθούν τα δείγµατά σας). 5. Εκχύστε την αγαρόζη και αφήστε να πήξει.(χρόνος ~20 λεπτά). *Εξασκηθείτε στο «φόρτωµα» της πηκτής Γ. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών 1. Αφαιρέστε τα δοντάκια και τοποθετήστε την πηκτή στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. Προσοχή οι πρωτεΐνες θα τρέξουν από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. 2. Γεµίστε τη συσκευή µε TGS buffer. 3. «Φορτώστε» ποσότητα 10µl από κάθε δείγµα στα λακκάκια που έχουν δηµιουργηθεί. Σηµειώστε τη σειρά των δειγµάτων. Μην ξεχάσετε το δείγµα των προχρωµατισµένων πρότυπων µοριακών βαρών (stand) και το δείγµα που περιέχει µίγµα ακτίνης/µυοσίνης (Ακτ/Μυο) stand Mυς Γαλ Mυς Σολ. ΜυςΠεστ. Μυς Οξυρ. Μυς Πεστρ. Ακτ/Μυο Ηπαρ Πεστ 4. Εφαρµόστε τάση 100V επί 1 ώρα και 30 min ** Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης τοποθετείστε την πηκτή σε διάλυµα µονιµοποίησης σύµφωνα µε τις οδηγίες της άσκησης 3.

166 Άσκηση 16 Μονιµοποίηση-Χρώση-Αποχρωµατισµός της πηκτής Σχεδιασµός πρότυπης καµπύλης. Αναγνώριση των κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών του µυϊκού ιστού. Στόχος Να γίνουν ορατές οι πρωτεΐνες πάνω στην πηκτή και να κατασκευαστεί µια πρότυπη καµπύλη µε βάση το µίγµα των πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους. Εισαγωγή Κατά την διάρκεια της ηλεκτροφόρησης αλλά και µετά το πέρας αυτής παρατηρούµε ότι: Α) στη διαδροµή 1 εµφανίζονται ζώνες Β) σε καµία άλλη διαδροµή δεν εµφανίζονται ζώνες. Οι παρατηρήσεις αυτές οφείλονται στο ότι στην διαδροµή 1 «τρέχει» ένα µίγµα πρωτεϊνών γνωστών µοριακών βαρών που είναι ήδη προχρωµατισµένες. Τα µοριακά βάρη σε kda είναι 250,150,100,75,50,37,25,20,15, και 10. Για να δούµε τις πρωτεΐνες στα δικά µας εκχυλίσµατα πρέπει να γίνει χρωµατισµός αυτών εντός της πηκτής. Η χρώση γίνεται µε την χρωστική Coomassie, µια χρωστική που θα χρωµατίσει µπλε τις πρωτεΐνες µας. Ξέρουµε όµως ποιές πρωτεΐνες είναι; Μπορούµε να αντιστοιχίσουµε ζώνη µε συγκεκριµένη πρωτεΐνη; Η απάντηση είναι σαφώς όχι. Μπορούµε βέβαια να κάνουµε υποθέσεις.. Στη συγκεκριµένη ηλεκτροφόρηση έχουµε τρέξει και ένα µίγµα ακτίνης και µυοσίνης. που περιέχει τις εξής πρωτεΐνες βαριά αλυσίδα της µυοσίνης 210kDa, ακτίνη 42kDa τροποµυοσίνη 35kDa ελαφριά αλυσίδα της µυοσίνης 1, 21kDa ελαφριά αλυσίδα της µυοσίνης 2, 19kDa ελαφριά αλυσίδα της µυοσίνης 3, 16kDa Συνεπώς µπορούµε να υποθέσουµε ότι η ζώνη στο δείγµα 1 που διατρέχει την ίδια απόσταση µε την βαριά αλυσίδα της µυοσίνης είναι η βαριά αλυσίδα της µυοσίνης, αλλά για να το πούµε µε βεβαιότητα πρέπει να συγκρίνουµε τις αλληλουχίες των δύο πρωτεϊνών. Κάτι τέτοιο θα ήταν πολύ χρονοβόρο. Αυτό που µπορούµε και επιβάλλεται να κάνουµε είναι να υπολογίσουµε τα µοριακά βάρη των πρωτεϊνών των δειγµάτων µας, συγκρίνοντας τα µε βάση τα γνωστά µοριακά βάρη (250kDa-10kDa) να υπολογίσουµε τα µοριακά βάρη των άγνωστων ζωνών. Αυτό γίνεται µε τη δηµιουργία µιας πρότυπης καµπύλης.

167 Πειραµατική πορεία 1. Μονιµοποίηση Μεταφέρετε την πηκτή σε διάλυµα µονιµοποίησης (40% αιθανόλη 10% οξικό οξύ). Αφήστε την για χρονικό διάστηµα από 1 έως 12 ώρες. 2. Χρώση Μεταφέρετε την πηκτή σε διάλυµα χρώσης, Bio-SafeCoomassie. Αφήστε την για χρονικό διάστηµα από 2 έως 12 ώρες. 3. Αποχρωµατισµός Μεταφέρετε την πηκτή σε διάλυµα αποχρωµατισµού, H 2 O. Αφήστε την για χρονικό διάστηµα από 2 έως 12 ώρες. Κάντε δύο αλλαγές στο H 2 O. 4. Παρατήρηση Φωτογράφηση Με την ολοκλήρωση του αποχρωµατισµού είναι ορατές οι ζώνες στην πηκτή. Φωτογραφίστε την πηκτή και τυπώστε την εικόνα σας. 5. ηµιουργία πρότυπης καµπύλης Έχετε την φωτογραφία της ηλεκτροφόρησης στην οποία η σειρά των δειγµάτων είναι Standards είγµα1 είγ.2 είγ.3 είγ.4 είγ.5 Μίγµα ακτίνης/µυοσίνης Εστιάστε την προσοχή σας στα γνωστά µοριακά βάρη (standards).μετρήστε την απόσταση σε που έτρεξαν οι πρωτεΐνες µε µοριακά βάρη από Η µέτρηση θα γίνει από την αρχή την αρχή της ηλεκτροφόρησης µέχρι το σηµείο εντοπισµού της ζώνης και θα εκφραστεί σε mm. Mε βάση τις µετρήσεις σας συµπληρώστε τον πίνακα 1. Πίνακας 1 Μοριακά βάρη (kd) Απόσταση mm Στη συνέχεια σχεδιάστε την πρότυπη. Στον άξονα των x έχετε τα µοριακά βάρη και στον άξονα των y τις αποστάσεις που διένυσαν οι πρωτεΐνες που αντιστοιχούν σε αυτά τα µοριακά βάρη.. Προσοχή: κάθε ηλεκτροφόρηση χρειάζεται τη δική της πρότυπη καµπύλη κάθε φορά. Ο υπολογισµός του Μοριακού Βάρους αγνώστων ζωνών πρέπει να εµπίπτει στο εύρος της πρότυπης που έχετε φτιάξει. ηλ. δεν µπορείτε µε βάση µια πρότυπη µε εύρος 40-5kD να προσδιορίσετε το ΜΒ µιας πρωτεΐνη που την υπολογίζετε στα 220kD.

168

169