ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗΣ ΑΥΤΩΝ ΣΕ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΚΟΥΚΟΥΜΗΣ Ε. ΧΡΗΣΤΟΣ ΠΑΤΡΑ 2015

2

3 Αφιερωμένο στους γονείς μου, Ευστράτιο και Θεοφανία & στην αδελφή μου, Δέσποινα

4

5 Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών, στο Εργαστήριο Βιοχημικής Μηχανικής και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κ. Κορνάρου Μιχαήλ. Στη διεκπεραίωση και επιτυχή έκβαση αυτής της εργασίας συνέβαλαν πολλοί άνθρωποι τους οποίους θα ήθελα να ευχαριστήσω. Αρχικά, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον αναπληρωτή καθηγητή κ. Κορνάρο Μιχαήλ για την αποδοχή του προτεινόμενου εκ μέρους μου θέματος και την επίβλεψή της εργασίας καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της, καθώς και για τη συμβολή του στην ολοκλήρωση και παρουσίασή της. Ακολούθως, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή του τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Μαντζαβίνο Διονύσιο, καθώς και τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Παρασκευά Χριστάκη για την προθυμία τους να συμμετάσχουν στην Τριμελή Συμβουλευτική Επιτροπή. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους μεταπτυχιακούς και διδακτορικούς ερευνητές του εργαστηρίου Βιοχημικής Μηχανικής και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος για την άψογη συνεργασία και υποστήριξη. Ειδικότερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την υποψήφια διδάκτορα και φίλη μου, Κούτρα Ελένη, την μεταδιδακτορική ερευνήτρια Βαβουράκη Αικατερίνη, τον Κοψαχείλη Αλέξανδρο και τον Βγενή Θοδωρή για την ουσιαστική τους βοήθεια τόσο σε τεχνικό όσο και σε επιστημονικό επίπεδο κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας αυτής. Στο σημείο αυτό δεν μπορώ να μην αναφερθώ στην αγαπημένη και πολύτιμη φίλη μου, Παπαδιονυσίου Μαρίνα, για την αμέριστη ηθική υποστήριξη, την κατανόηση και τις συμβουλές της στα προβλήματα και τις ανησυχίες μου, καθώς και στις πραγματικά αξέχαστες στιγμές και αναμνήσεις που δημιουργήσαμε μαζί κατά τη διάρκεια των φοιτητικών μας χρόνων στην Πάτρα. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω τη βαθιά ευγνωμοσύνη μου στους γονείς μου, Ευστράτιο και Θεοφανία, καθώς και στην αδελφή μου, Δέσποινα, για την πολύτιμη ηθική και υλική υποστήριξή τους. Ευχαριστώ τους γονείς μου για την αγάπη, τις βαθιές αξίες και αρχές που μου εμφύσησαν, χάρη στις οποίες μπορούν να υπερβληθούν όλα τα εμπόδια και οι δυσκολίες της ζωής, που πάντα με ενθαρρύνουν και με στηρίζουν σε όλες μου τις προσπάθειες, αλλά και την αδερφή μου για την υποστήριξή της, που πάντα με ακούει και με ανέχεται με χαρά και κατανόηση.

6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία αναπτύχθηκε μια πολύ-υπολειμματική μέθοδος για τον προσδιορισμό και τη μελέτη της τύχης και απομάκρυνσης των φαρμακευτικών ουσιών από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ). Για το σκοπό αυτόν δείγματα λήφθηκαν το χρονικό διάστημα Μαΐου 2014 Ιανουαρίου 2015 για την ανίχνευση των υπολειμμάτων 12 φαρμακευτικών ουσιών που ανήκουν σε διαφορετικές θεραπευτικές ομάδες. Αυτά είναι φάρμακα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη (ακεταμινοφαίνη / παρακεταμόλη, ιβουπροφαίνη), αντιβιοτικά (αζιθρομυκίνη, κλαριθρομυκίνη), στατίνες / υπολιπιδαιμικοί παράγοντες (ατορβαστατίνη), H 2 ανταγωνιστές της ισταμίνης / αντιόξινα (ρανιτιδίνη, ομεπραζόλη), αντιυπερτασικά (ατενολόλη), διουρητικά (φουροσεμίδη, υδροχλωροθειαζίδη), αντιεπιληπτικά (καρβαμαζεπίνη) και ψυχοδιεγερτικά (καφεΐνη). Οι επιλεγμένες μονάδες δειγματοληψίας της τρέχουσας μελέτης είναι οι ΕΕΛ του Δήμου Πατρών (Πάτρα, Δυτική Ελλάδα) (ΕΕΛ1) και του Γενικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών (Ρίο, Δυτική Ελλάδα) (ΕΕΛ2). Η πιο συνήθης τεχνική εκχύλισης που εφαρμόζεται στην προεπεξεργασία υγρών περιβαλλοντικών δειγμάτων είναι η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE), η οποία και χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση και προσυγκέντρωση των προσδιοριζόμενων ουσιών. Τα δείγματα αναλύθηκαν έπειτα μέσω ενός συστήματος υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης συζευγμένο με ένα τετραπολικό φασματόμετρο μάζας με ανιχνευτή «χρόνου πτήσης» (Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled to a Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometer, UHPLC/QTOF-MS). Η ταυτοποίηση και επιβεβαίωση των αναλυτών βασίστηκε στην οδηγία 2002/657/EΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης, η οποία αναφέρεται στην επίδοση των αναλυτικών μεθόδων και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων τους. Ολόκληρη η μέθοδος αξιολογήθηκε με όρους μέτρησης της ορθότητας (ανάκτηση δειγμάτων) και της πιστότητας (επαναληψιμότητα, αναπαραγωγιμότητα) σε δυο διαφορετικά επίπεδα φόρτισης σε εμβολιασμένα υδατικά εκχυλίσματα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε εκτίμηση των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης της μεθόδου (LOD, LOQ) για κάθε μία προσδιοριζόμενη ουσία, καθώς και η επίδραση της μήτρας κατά τον ιοντισμό τους. Για την ποσοτικοποίηση των δειγμάτων εφαρμόστηκε η μέθοδος εσωτερικού προτύπου. Με βάση τις αναλύσεις των δειγμάτων, όλες οι επιλεγμένες ουσίες έχουν ανιχνευτεί σ αυτά. Συγκεκριμένα, οι μέσες συγκεντρώσεις των παραπάνω φαρμακευτικών ουσιών στην ΕΕΛ1 κυμάνθηκαν μεταξύ 0, μg/l στην είσοδο και μεταξύ 0,03 0,49 μg/l στην έξοδο, ενώ στην ΕΕΛ2 οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις κυμαίνονται μεταξύ 0, μg/l και 0,2 3,8 μg/l, αντίστοιχα. Τέλος, τα ποσοστά απομάκρυνσης των φαρμακευτικών ουσιών από τις δυο εγκαταστάσεις έδειξαν ότι οι συμβατικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων δεν επαρκούν για την πλήρη απομάκρυνση των περισσότερων φαρμακευτικών ουσιών με συνέπεια την συνεχόμενη παροχέτευσή τους στο υδάτινο περιβάλλον. ~ i ~

8 ABSTRACT In this work, a multi-residue method for the determination of pharmaceuticals and a study of their fate and removal from wastewater treatment plants (WWTPs) was developed. For this purpose, wastewater samples were collected the period May 2014 January 2015 to investigate the residues of 12 pharmaceuticals belonging to various therapeutic categories. These were non steroidals / anti-inflammatories pharmaceuticals (acetaminophen / paracetamol, ibuprofen), antibiotics (azithromycin, clarithromycin), statins / hypolipidemic agents (atorvastatin), histamine H 2 -receptor antagonists (ranitidine), antihypertensives (atenolol), psychomotor stimulants (caffeine), antiulcers (omeprazole), antiepileptics (carbamazepine) and diuretics (furosemide, hydrochlorothiazide). The selected areas of the study were the municipal and hospital wastewater treatment plants (WWTPs) of Patras city, located in Western Greece. The most common extraction technique applied to the pretreatment of liquid environmental samples is solid-phase extraction (SPE), which was used for the isolation and pre-concentration of the target analytes. The samples were screened using an Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled to a Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometer (HPLC-QTOF/MS) system. Identification and confirmation of analytes was based on Directive 2002/657/EC of the European Union, which refers to the performance of analytical methods and the interpretation of their results. The overall process was evaluated in terms of measurement of trueness (sample recovery) and precision (repeatability, reproducibility) in two different concentration levels in spiked aqueous extracts. In addition, method detection and quantitation limits (LOD, LOQ) for each analyte, as well as matrix effects during the ionization process were estimated. For the quantitation of the samples internal standard calibration was applied. The results of the analysis confirmed the occurrence of all selected target analytes in wastewater samples. In particular, mean concentrations in the municipal WWTP ranged between 0, μg/l in the influent and between 0,03 0,49 μg/l in the effluent. In the hospital WWTP mean concentrations ranged between 0, μg/l and 0,2 3,8 μg/l, respectively. Finally, the removal rates of pharmaceuticals from the two facilities demonstrated that conventional techniques used in the wastewater treatment plants are not sufficient for the complete removal of most pharmaceuticals resulting in consecutive discharge in the aquatic environment. ~ ii ~

9 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ ΟΡΩΝ Σύντμηση Ξενόγλωσσος όρος Ελληνικός όρος ADC Analog-to-Digital Μετατροπέας Αναλογικού Converter Σήματος σε Ψηφιακό APCI Atmospheric Pressure Χημικός Ιοντισμός σε Chemical Ionization Ατμοσφαιρική Πίεση APPI Atmospheric Pressure Φωτοϊοντισμός σε Photoionization Ατμοσφαιρική Πίεση CDS Calibrant Delivery System Σύστημα Διανομής Διαλύματος Βαθμονόμησης CE Collision Energy Ενέργεια Σύγκρουσης CID Collision Induced Διάσπαση Επαγόμενη από Dissociation Σύγκρουση ECs Emerging Contaminants Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας EDCs Endocrine Disrupter Compounds Ενδοκρινικοί Διαταράκτες ΕΕΛ Wastewater Treatment Εγκατάσταση Plants Επεξεργασίας Λυμάτων EIC Extracted Ion Εξαγόμενο Chromatogram Χρωματογράφημα Ιόντων ESI Electrospray Ionization Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό FIA Flow Injection Analysis Ανάλυση με Έγχυση σε Ροή FWHM Πλήρες Πλάτος στο Μισό Full Width at Half του Μεγίστου της Maximum Κορυφής GC Gas Chromatography Αέρια Χρωματογραφία HLB Hydrophilic-Lipophilic Balanced Copolymer HPLC High Performance Liquid Υγρή Χρωματογραφία Chromatography Υψηλής Απόδοσης HRT Hydraulic Retention Time Υδραυλικός Χρόνος Παραμονής IS Internal Standard Εσωτερικό Πρότυπο LLE Liquid-Liquid Extraction Εκχύλιση Υγρού-Υγρού LOD Limit Of Detection Όριο Ανίχνευσης LOQ Limit Of Quantitation Όριο Ποσοτικοποίησης MCP Microchannel Plate Πλάκα Πολλαπλής ~ iii ~

10 Διέλευσης ΜΕ Matrix Effect Επίδραση Μήτρας MS Mass Spectrometry Φασματομετρία Μάζας MS/MS Mass Spectrometry/ Mass Συζευγμένη Spectrometry Φασματομετρία Μάζας ΜΣΑΦ PFCs Non Steroidals / Antiinflammatories Perfluoride Compounds Μη Στεροειδή Αντιφλεγμονώδη Φάρμακα Υπερφθοριωμένες Ενώσεις PMT Photonmultiplier Tube Φωτοπολλαπλασιαστής PPCPs Φαρμακευτικές Ουσίες και Pharmaceuticals and Προϊόντα Ατομικής Personal Care Products Περιποίησης QqLIT Quadrupole Linear Ion Τετραπολική Γραμμική Trap Παγίδα Ιόντων QTOF Quadrupole Time Of Τετραπολικός ανιχνευτής Flight «χρόνου πτήσης» R Resolution Διακριτική Ικανότητα RE Recovery Ανάκτηση RF Radiofrequency Υψίσυχνη Τάση RSD Relative Standard Deviation Σχετική Τυπική Απόκλιση SIM Single Ion Monitoring Τεχνική επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων SPE Solid Phase Extraction Εκχύλιση Στερεάς Φάσης SRM Selected Reaction Τεχνική Παρακολούθησης Monitoring Επιλεγμένης Αντίδρασης SRT Sludge Retention Time Χρόνος Παραμονής Ιλύος UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης ~ iv ~

11 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... i ABSTRACT... ii ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ ΟΡΩΝ... iii ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ... v I. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας Φαρμακευτικές ουσίες Παρουσία των φαρμακευτικών ουσιών στο περιβάλλον Τύχη και αφαίρεση των φαρμακευτικών ουσιών από τις ΕΕΛ Παράγοντες που επηρεάζουν την απομάκρυνση των φαρμακευτικών ουσιών από τις ΕΕΛ Ανίχνευση και μέτρηση των φαρμακευτικών ουσιών Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Εισαγωγή Πεδίο εφαρμογών Υγρή χρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης Οργανολογία υγρής χρωματογραφίας Δοχεία κινητής φάσης και συστήματα επεξεργασίας διαλυτών Συστήματα άντλησης Παλινδρομικές αντλίες Αντλίες εκτόπισης Πνευματικές αντλίες Συστήματα έγχυσης δείγματος Θερμοστάτες στήλης Στήλες υγρής χρωματογραφίας Αναλυτικές στήλες Προστατευτικές στήλες Χρωματογραφία κατανομής Στήλες για τη χρωματογραφία συνδεδεμένης φάσης Υλικά πλήρωσης για τη χρωματογραφία συνδεδεμένης και κανονικής φάσης Ποιοτική ανάλυση Ποσοτική ανάλυση Αναλύσεις που βασίζονται στο ύψος κορυφής Αναλύσεις που βασίζονται στην επιφάνεια των κορυφών ~ v ~

12 Βαθμονόμηση και πρότυπα Η μέθοδος εσωτερικού προτύπου Σύζευξη υγρής χρωματογραφίας με φασματομετρία μαζών Εφαρμογή συζευγμένων τεχνικών στην ανάλυση φαρμακευτικών ουσιών Φασματομετρία μάζας Εισαγωγή Γενική περιγραφή των τμημάτων του οργάνου Σύστημα εισαγωγής του δείγματος Πηγές ιοντισμού Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό Αρχή λειτουργίας ESI Αναλυτές μαζών Τετραπολικός αναλυτής μαζών Αναλυτές μαζών τύπου «χρόνου πτήσης» Μεταλλάκτες Επεξεργαστής σήματος Σύστημα κενού Τεχνικές ανάλυσης στη φασματομετρία μαζών Τεχνική πλήρους σάρωσης Συζευγμένη φασματομετρία μαζών (MS/MS) Τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων Σύστημα QTOF LC/MS Εισαγωγή Περιγραφή διάταξης Πρώτο στάδιο κενού Δεύτερο και τρίτο στάδιο κενού Τέταρτο στάδιο κενού Πέμπτο στάδιο κενού Προεπεξεργασία δειγμάτων Η προεπεξεργασία δειγμάτων στον προσδιορισμό υπολειμματικών φαρμακευτικών ουσιών Εκχύλιση στερεάς φάσης ~ vi ~

13 1.6 Επικύρωση αναλυτικής μεθόδου Μέση τιμή δείγματος ( ) Τυπική απόκλιση (s) και μεταβλητότητα (s 2 ) δείγματος Σχετική τυπική απόκλιση και συντελεστής μεταβλητότητας Ορθότητα Πιστότητα Ακρίβεια Σφάλματα μετρήσεων Συστηματικά σφάλματα Προκατάληψη Τυχαία σφάλματα Ευαισθησία Όριο ανίχνευσης Γραμμικότητα Εξειδίκευση Εκλεκτικότητα Ανθεκτικότητα II. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χημικά και εξοπλισμός Υλικά Εργαστηριακές συσκευές Διαλύτες και αντιδραστήρια Ουσίες αναφοράς Εσωτερικό πρότυπο Πρότυπα διαλύματα Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων παρακαταθήκης Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων εργασίας Δειγματοληψία Προεπεξεργασία δειγμάτων Οργανολογία Προετοιμασία συστήματος υγρής χρωματογραφίας Προετοιμασία φασματόμετρου μαζών Συνθήκες λειτουργίας συστήματος QTOF LC/MS Συνθήκες λειτουργίας συστήματος υγρής χρωματογραφίας Συνθήκες λειτουργίας συστήματος φασματομετρίας μαζών Αξιολόγηση αναλυτικής διαδικασίας III. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Βελτιστοποίηση συνθηκών χρωματογραφικού διαχωρισμού Βελτιστοποίηση παραμέτρων του φασματόμετρου μαζών ~ vii ~

14 3.3 Βελτιστοποίηση της διαδικασίας SPE Επικύρωση μεθόδου Ορθότητα Πιστότητα Γραμμικότητα και όρια ανίχνευσης Επιδράσεις μήτρας Εφαρμογή της μεθόδου στα πραγματικά δείγματα Απομάκρυνση των φαρμακευτικών ουσιών IV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ V. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ~ viii ~

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΙ ΠΙΝΑΚΕΣ Πίνακας 1.1: Δομή και χαρακτηριστικά των επιλεγμένων φαρμακευτικών ουσιών (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 3 Πίνακας 1.2: Τυπικές εφαρμογές χρωματογραφίας κατανομής (Skoog et al., 2007). 16 Πίνακας 1.3: Εφαρμογές της φασματομετρίας μαζών (Skoog et al., 2007) Πίνακας 1.4: Πηγές ιοντισμού φασματομετρίας μαζών (Skoog et al., 2007) Πίνακας 2.1: Χαρακτηριστικά των δύο εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυμάτων που μελετήθηκαν Πίνακας 2.2: Σχετικές εντάσεις ιόντων ταυτοποίησης σύμφωνα με την οδηγία 2002/657/EΚ Πίνακας 3.1: Βελτιστοποιημένες χρωματογραφικές συνθήκες ανάλυσης των φαρμακευτικών ενώσεων Πίνακας 3.2: Βελτιστοποιημένες φασματομετρικές συνθήκες ανάλυσης των φαρμακευτικών ενώσεων Πίνακας 3.3: Ακριβείς μάζες μητρικού και θυγατρικών ιόντων των αναλυτών. Το σφάλμα μάζας αντιστοιχεί στη διαφορά μεταξύ θεωρητικής και πειραματικής τιμής του μητρικού ιόντος Πίνακας 3.4: Εκτίμηση της ορθότητας, της πιστότητας και των επιδράσεων μήτρας των αναλυτών στα δύο επίπεδα φόρτισης Πίνακας 3.5: Εξισώσεις καμπύλης βαθμονόμησης, δυναμική περιοχή, σταθερές συσχέτισης, όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των αναλυτών Πίνακας 3.6: Ελάχιστες, μέγιστες και μέσες τιμές στην είσοδο των ΕΕΛ1 και ΕΕΛ2 (ng/l) Πίνακας 3.7: Ελάχιστες, μέγιστες και μέσες τιμές στην έξοδο των ΕΕΛ1 και ΕΕΛ2 (ng/l) ~ ix ~

16 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΧΗΜΑΤΑ Σχήμα 1.1: Κύρια τμήματα ενός φασματόμετρου μαζών (Skoog et al., 2007) Σχήμα 1.2: Πηγή ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.3: Εκρόφηση ιόντων από το διάλυμα (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.4: Διάταξη τετραπολικού ανιχνευτή μαζών (Skoog et al., 2007) Σχήμα 1.5: Διάταξη ανιχνευτή τύπου «χρόνου πτήσης» ( principles.htm) Σχήμα 1.6: Ανάλυση με την τεχνική της πλήρους σάρωσης (λειτουργία MS) (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.7: Ανάλυση με την τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων (λειτουργία MS/MS) (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.8: Σχηματική απεικόνιση ιόντος που υφίσταται διάσπαση επαγόμενη από σύγκρουση (CID) με την τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων (λειτουργία MS/MS) (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.9: Βασικά μέρη ενός QTOF-MS (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.10: Σχηματική περιγραφή του αναλυτικού οργάνου 6538 UHD Q-TOF LC/MS της Agilent με επισημασμένα τα κύρια μέρη του και τα στάδια κενού (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.11: Εξαπολική κυψελίδα συγκρούσεων στην οποία πραγματοποιείται η διάσπαση επαγομένη από σύγκρουση (CID) (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.12: Τεχνολογία συμπίεσης και διαμόρφωσης της ιοντικής δέσμης (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.13: Σχηματικό διάγραμμα του ανιχνευτή ιόντων του LC/QTOF-MS (Agilent Technologies, 2011) Σχήμα 1.14: Χημική δομή των ροφητών Oasis HLB ( 48 Σχήμα 1.15: Διάταξη εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) ( 49 Σχήμα 2.1: Σημεία δειγματοληψίας (αριθμοί σε κύκλο) στα διάφορα στάδια της δημοτικής εγκατάστασης επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ1) στην Πάτρα Σχήμα 2.2: Διαγραμματική απεικόνιση της πειραματικής πορείας της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) Σχήμα 3.1: Εξαγόμενο χρωματογράφημα ιόντων μίγματος συγκέντρωσης 10 μg/l στη λειτουργία θετικού ιοντισμού ~ x ~

17 Σχήμα 3.2: Εξαγόμενο χρωματογράφημα ιόντων μίγματος συγκέντρωσης 10 μg/l στη λειτουργία αρνητικού ιοντισμού Σχήμα 3.3: Φάσματα μάζας πειραμάτων MS/MS για την ταυτοποίηση των αναλυτών με τα μητρικά και τα θυγατρικά τους ιόντα. Τα βελάκια πάνω στις μοριακές δομές των αναλυτών υποδηλώνουν τα σημεία θραύσης και την παραγωγή των αντίστοιχων θυγατρικών ιόντων Σχήμα 3.4: Μέσες ποσοστιαίες τιμές ανάκτησης στο επίπεδο φόρτισης των 0,5 μg/l Σχήμα 3.5: Μέσες ποσοστιαίες τιμές ανάκτησης στο επίπεδο φόρτισης των 5 μg/l. 81 Σχήμα 3.6: Ποσοστά διακύμανσης των ορίων ανίχνευσης (LODs) και ποσοτικοποίησης (LOQs) των αναλυτών επί του συνόλου των ενώσεων Σχήμα 3.7: Ποσοστιαίες επιδράσεις μήτρας στα επίπεδα φόρτισης των 0,5 μg/l (αριστερά) και των 5 μg/l (δεξιά) για κάθε αναλύτη Σχήμα 3.8: Διαγράμματα ωριαίας διακύμανσης της συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών στην είσοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.9 (α, β, γ): Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.10 (α, β, γ): Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.11: Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην έξοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.12: Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην έξοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.13: Μέση συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.14: Μέση συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.15: Μέση συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην έξοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.16: Μέση συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην έξοδο της ΕΕΛ Σχήμα 3.17 (α, β, γ): Συγκεντρώσεις (ng/l) των αναλυτών στα διάφορα στάδια επεξεργασίας της ΕΕΛ1 το μήνα Ιανουάριο Σχήμα 3.18: Μέση ποσοστιαία αφαίρεση των φαρμακευτικών ουσιών στην ΕΕΛ1. 98 Σχήμα 3.19: Μέση ποσοστιαία αφαίρεση των φαρμακευτικών ουσιών στην ΕΕΛ2. 98 ~ xi ~

18 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΕΣ ΕΙΚΟΝΕΣ Εικόνα 2.1: Εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων στην περιοχή της Πάτρας από τις οποίες πραγματοποιήθηκε η δειγματοληψία ( google maps) Εικόνα 2.2: Εργαστηριακή διάταξη εκχύλισης SPE με επισημασμένα τα βασικά μέρη της Εικόνα 2.3: Agilent UHD 6538 LC/QTOF-MS ~ xii ~

19 I. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Εισαγωγή Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών η παρουσία μικρορυπαντών στο υδάτινο περιβάλλον έχει μετατραπεί σε παγκόσμιο θέμα αυξανόμενης περιβαλλοντολογικής ανησυχίας. Οι μικρορυπαντές αυτοί οι οποίοι αναφέρονται και ως «αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας» (Emerging Contaminants, ECs), αποτελούν έναν καινούργιο τομέα περιβαλλοντικών αναλύσεων και μελετών, οι ουσίες του οποίου διαχωρίζονται από τους κλασσικούς περιβαλλοντικούς ρύπους και εντοπίζονται συχνά τα τελευταία χρόνια στο παγκόσμιο υδάτινο περιβάλλον. Ως «αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας» ορίζονται οι χημικές ουσίες οι οποίες δεν περιλαμβάνονται στους υπάρχοντες κανονισμούς ποιότητας των υδάτων, δεν είχε προηγουμένως μελετηθεί η επίδρασή τους στο περιβάλλον και φαίνεται να έχουν δυνητικές αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον και στην ανθρώπινη υγεία (Aga, 2008). Οι «αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας» αποτελούνται από έναν τεράστιο και συνεχώς διευρυνόμενο κατάλογο ανθρωπογενών και φυσικών ουσιών, οι οποίες κατατάσσονται σε διάφορες υποκατηγορίες αναλόγως με την δράση τους στο περιβάλλον και τους οργανισμούς, την προέλευσή και την χημική δομή. Ο κατάλογος αυτός περιλαμβάνει φαρμακευτικές ουσίες και προϊόντα ατομικής περιποίησης (Pharmaceuticals and Personal Care Products, PPCPs), ενδοκρινικούς διαταράκτες (Endocrine Disrupter Compounds, EDCs), υπερφθοριωμένες ενώσεις (Perfluoride Compounds, PFCs), στεροειδείς ορμόνες (steroids), φυτοφάρμακα (pesticides) και πολλές άλλες κατηγορίες ενώσεων (Θωμαΐδης, 2011). Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εξετάζονται δώδεκα φαρμακευτικές ουσίες που ανήκουν στην υποκατηγορία των PPCPs (ακεταμινοφαίνη, ιβουπροφαίνη, αζιθρομυκίνη, κλαριθρομυκίνη, ατορβαστατίνη, ρανιτιδίνη, ομεπραζόλη, ατενολόλη, φουροσεμίδη, υδροχλωροθειαζίδη, καρβαμαζεπίνη, καφεΐνη) Φαρμακευτικές ουσίες Οι φαρμακευτικές ουσίες που υπάρχουν στο περιβάλλον προέρχονται από συνταγογραφούμενα και μη φάρμακα, από παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες, καθώς και από κτηνιατρικά φάρμακα και περιλαμβάνουν τους μεταβολίτες και τα σύμπλοκα των ενώσεων αυτών. Οι ουσίες αυτές μαζί με τους μικρορυπαντές που προέρχονται από τα προϊόντα ατομικής περιποίησης αναφέρονται από το 1999 με τον όρο φαρμακευτικές ουσίες και προϊόντα ατομικής περιποίησης (PPCPs) από τους Daughton and Ternes. Η ρύπανση του νερού από τις PPCPs συνδέεται επίσης, με τη ρύπανση του νερού από τους ενδοκρινικούς διαταράκτες (EDCs). Οι ενδοκρινικοί ~ 1 ~

20 διαταράκτες είναι φυσικές ή τεχνητές ενώσεις που είναι γνωστές για το ρόλο τους να μιμούνται τις φυσικές ορμόνες των ζώων (Snyder et al., 2003). Μερικοί EDCs είναι επίσης PPCPs (Daughton, 2003). Οι φαρμακευτικές ενώσεις που συναντώνται στα αστικά απόβλητα και επιλέχθηκαν προς μελέτη καλύπτουν ένα μεγάλο φάσμα κατηγοριών, όπως είναι µη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), αντιυπερτασικά, αντιβιοτικά, αναλγητικά, αντιόξινα, αντιεπιληπτικά, β-αναστολείς, διουρητικά, υπολιπιδαιμικοί παράγοντες και ψυχοδιεγερτικά (Πίνακας 1). Από την άλλη, τα τελευταία χρόνια διάφορες κατηγορίες ψυχοτρόπων και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ενώσεων, όπως οπιούχα και οπιοειδή, διεγερτικά, ηρεμιστικά, παραισθησιογόνα, αντιψυχωτικά, αναισθητικά, και αντικαταθλιπτικά, έχουν αποτελέσει μαζί µε τις φαρμακευτικές ουσίες, ομάδες αναδυόμενων ρύπων προτεραιότητας, εξαιτίας της εμφάνισής τους στο υδάτινο περιβάλλον και των δυνητικών επιπτώσεων που μπορεί να έχουν σε αυτό (Castiglioni et al., 2011; Van Nuijs et al., 2011). Η μελέτη της παρουσίας και της τύχης των ενώσεων αυτών στο περιβάλλον, συνδέεται άμεσα µε τις πηγές από τις οποίες προέρχονται και τις οδούς που ακολουθούν στην συνέχεια. Μετά την κατανάλωση, οι συγκεκριμένες ουσίες μεταβολίζονται μερικώς και απομακρύνονται από τον ανθρώπινο οργανισμό µε τα ούρα και τα περιττώματα ως αρχικές ενώσεις ή ως μεταβολίτες. Ως αποτέλεσμα, τα υπολείμματα των συγκεκριμένων ενώσεων να καταλήγουν στις μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων και στη συνέχεια στο υδατικό περιβάλλον (επιφανειακά, υπόγεια και θαλάσσια ύδατα) λόγω ατελούς απομάκρυνσής τους κατά την επεξεργασία τους (Van Nuijs et al., 2011; Zuccato et al., 2009; Zuccato et al., 2008) Παρουσία των φαρμακευτικών ουσιών στο περιβάλλον Οι φαρμακευτικές ουσίες μπορούν να εισέλθουν στο περιβάλλον μέσω πολλών οδών, με κυριότερες την εκροή των εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ) και την αποστράγγιση των αποβλήτων από πηγές, όπως είναι οι μονάδες εκτροφής ζώων (Daughton, 2001). Οι PPCPs εισέρχονται στις ΕΕΛ μέσω της απέκκρισης και της άμεσης διάθεσης των φαρμακευτικών αγωγών στις τουαλέτες (Halling-Sørensen et al., 1998). Οι ΕΕΛ μπορούν επιπλέον να δεχθούν εισροές από μονάδες παραγωγής φαρμάκων (Phillips et al., 2010). Τα σύμπλοκα των φαρμάκων μπορούν να διασπαστούν κατά την επεξεργασία των λυμάτων, ελευθερώνοντας την αρχική φαρμακευτική ένωση (Heberer, 2002). Μερικά σύμπλοκα μπορούν να επανέλθουν στην μητρική τους ένωση αφότου εισέλθουν στο περιβάλλον (Kolpin, 2010). Ωστόσο υπάρχει και η περίπτωση της άμεσης διάθεσης αυτών, δηλαδή με άμεση εναπόθεση των ουσιών αυτών χωρίς να έχουν χρησιμοποιηθεί, όπως για παράδειγμα η ταφή απορριμμάτων ή η αλόγιστη χρήση φαρμάκων στη γεωργία (Βρουβάκη et al., 2013). Η ιλύς των βιολογικών καθαρισμών, καθώς και η κοπριά που χρησιμοποιείται στο έδαφος για την καλλιέργεια της γης μπορούν επίσης να αποτελέσουν πηγή ρύπανσης των επιφανειακών και υπόγειων υδάτων από φαρμακευτικούς ρυπαντές (Heberer, 2002). Επιπλέον, η παρουσία των φαρμακευτικών ουσιών στα ~ 2 ~

21 Πίνακας 1.1: Δομή και χαρακτηριστικά των επιλεγμένων φαρμακευτικών ουσιών. Προσδιοριζόμενη ουσία Θεραπευτική ομάδα Μοριακή μάζα (g/mol) Μοριακός τύπος pka logk OW Δομή Aκεταμινοφαίνη Αναλγητικά αντιπυρετικά 151,16256 C 8 H 9 NO 2 9,38 0,46 Ατενολόλη β Αδρενεργικοί αποκλειστές 266,33608 C 14 H 22 N 2 O 3 9,6 0,16 Αζιθρομυκίνη Μακρολίδια αντιβιοτικά 748,98448 C 38 H 72 N 2 O 12 8,74 4,02 Κλαριθρομυκίνη Μακρολίδια αντιβιοτικά 747,95336 C 38 H 69 NO 13 8,99 3,16 Ατορβαστατίνη Στατίνες Υπολιπιδαιμικοί παράγοντες 558, C 33 H 35 FN 2 O 5 4,33 5,7 Βαμεθάνη Καρδιαγγειακό σύστημα 209,28476 C 12 H 19 NO 2 Ομεπραζόλη Αναστολείς της αντλίας πρωτονίων Αντιόξινα 345,41606 C 17 H 19 N 3 O 3 S 4,77 2,23 Καρβαμαζεπίνη Αντιεπιληπτικά 236,26858 C 15 H 12 N 2 O 13,9 2,45 Καφεΐνη Ψυχοδιεγερτικά 194,1906 C 8 H 10 N 4 O 2 14,0 0,07 ~ 3 ~

22 Πίνακας 1.1 (συνέχεια): Δομή και χαρακτηριστικά των επιλεγμένων φαρμακευτικών ουσιών. Προσδιοριζόμενη ουσία Θεραπευτική ομάδα Μοριακή μάζα (g/mol) Μοριακός τύπος pka logk OW Δομή Ρανιτιδίνη Η 2 ανταγωνιστές της ισταμίνης Αντιόξινα 314,40378 C 13 H 22 N 4 O 3 S 8,08 0,27 Υδροχλωροθειαζίδη Διουρητικά 297,73912 C 7 H 8 ClN 3 O 4 S 2 pka1=7,9 pka2=9,2 0,07 Φουροσεμίδη Διουρητικά 330,74414 C 12 H 11 ClN 2 O 5 S pka1=3,8 pka2=7,5 2,03 Ιβουπροφαίνη Μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη 206,28082 C 13 H 18 O 2 4,91 3,97 ύδατα μπορεί να προέλθει από την αποστράγγιση των χωματερών στις οποίες θάβονται οικιακά απορρίμματα ή βιομηχανικά απόβλητα που εμπεριέχουν τέτοιες ουσίες ή από την απευθείας απόρριψη των λυμάτων σε λάκκους (Daughton and Ternes, 1999; Holm et al., 1995). Oι φαρμακευτικές ουσίες μπορούν να εισχωρήσουν στα υπόγεια ύδατα μέσω των σηπτικών συστημάτων (Godfrey et al., 2007). Στα επιφανειακά ύδατα μπορούν να εισέλθουν και μέσω εγκαταστάσεων υδατοκαλλιέργειας. Συνεπώς, μπορεί να υπάρχουν πηγές επιφανειακών και υπόγειων υδάτων που χρησιμοποιούνται για την κατανάλωση πόσιμου νερού, οι οποίες να έχουν ήδη ρυπανθεί (Heberer, 2002). Οι διεργασίες επεξεργασίας των λυμάτων είναι απαραίτητες για την εξάλειψη των δυνητικά τοξικών ενώσεων, όμως η αποδοτικότητά τους δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί, καθώς οι ΕΕΛ δεν είχαν αρχικά σχεδιαστεί για την εξάλειψη των ξενοβιοτικών ουσιών (Deblonde et al., 2011). Οι συγκεντρώσεις των μικρορυπαντών στην εισροή και εκροή των ΕΕΛ εμφανίζουν σημαντικές χωρικές και χρονικές διακυμάνσεις, οι οποίες οφείλονται σε μια σειρά από παράγοντες, όπως είναι ο ρυθμός παραγωγής, οι πωλήσεις και οι πρακτικές που εφαρμόζονται για κάθε φαρμακευτική ουσία, ο μεταβολισμός (ρυθμός απέκκρισης), η κατανάλωση νερού ανά άτομο και ανά ημέρα, το μέγεθος των ΕΕΛ, η περιβαλλοντική ανθεκτικότητα και η αποτελεσματικότητα εξάλειψής τους μέσω των διεργασιών επεξεργασίας των λυμάτων (Jelic et al., 2012; Petrovic et al., 2009). Συνεπώς, πολλοί απ αυτούς τους μικρορυπαντές είναι σε θέση να εισέλθουν στο περιβάλλον μέσω των διεργασιών επεξεργασίας των λυμάτων λόγω της ανθεκτικότητας ή / και της συνεχούς εισροής ~ 4 ~

23 τους. Επιπλέον, στις περισσότερες ΕΕΛ δεν έχουν καθιερωθεί μέτρα πρόληψης και παρακολούθησης αυτών των μικρορυπαντών (Bolong et al., 2009). Ως εκ τούτου, πολλές απ αυτές τις ενώσεις μπορούν να καταλήξουν στο υδάτινο περιβάλλον, απειλώντας την άγρια ζωή αλλά και τα αποθέματα πόσιμου νερού. Η παρουσία μικρορυπαντών στο υδάτινο περιβάλλον συσχετίζεται συχνά με σειρά από αρνητικές επιπτώσεις, συμπεριλαμβανομένου της βραχυπρόθεσμης και μακροπρόθεσμης τοξικότητας, της ανθεκτικότητας των βακτηριδίων στα αντιβιοτικά και της διατάραξης του ενδοκρινικού συστήματος που προκαλεί υπογονιμότητα και γρήγορη ενηλικίωση στις γυναίκες (Liu et al., 2008;, Coetsier et al., 2006; Fent et al., 2006; Pruden et al., 2006). Επιπλέον, αρκετές φαρμακευτικές ενώσεις και ειδικά αυτές που ανήκουν στις κατηγορίες των αντιυπερτασικών και των αντιβιοτικών μπορεί να υπόκεινται σε διεργασίες βιοσυσσώρευσης στους υδάτινους οργανισμούς (κυρίως στα ψάρια) (Jo et al., 2011; Chafer-Perica et al., 2010). Το πρόβλημα με τους αναδυόμενους ρύπους έγκειται στην έλλειψη γνώσης του αντίκτυπου των μεσοπρόθεσμων ή μακροπρόθεσμων επιπτώσεων τους στην ανθρώπινη υγεία, το περιβάλλον και τα υδάτινα οικοσυστήματα (Deblonde et al., 2011). Διάφορες στρατηγικές έχουν προταθεί για την αντιμετώπιση της ρύπανσης από φαρμακευτικές ουσίες. Μια προσέγγιση έγκειται στην άποψη ότι η ρύπανση των υδάτων από τις φαρμακευτικές ουσίες δεν θα πρέπει να εστιάζεται αποκλειστικά στην εξεύρεση μηχανικών λύσεων, αλλά στο γεγονός ότι μια πιο υπεύθυνη διαχείριση μπορεί να αποτελέσει αποτελεσματικότερη προσέγγιση για την ελαχιστοποίηση της διάθεσης των φαρμακευτικών ρυπαντών στο περιβάλλον (Daughton et al., 2007). Απεναντίας, μια άλλη προσέγγιση υποστηρίζει την άποψη πως δεδομένου ότι οι φαρμακευτικοί ρυπαντές θα συνεχίσουν να απορρίπτονται στο περιβάλλον, κρίνεται απαραίτητη η βελτιστοποίηση των διαδικασιών επεξεργασίας των ΕΕΛ έτσι ώστε να μπορεί να ελεγχθεί η διάθεση των ουσιών αυτών (Carballa et al., 2007). Άλλοι επιστήμονες έχουν τονίσει τη δυνατότητα εφαρμογής προηγμένων διαδικασιών στην επεξεργασία των λυμάτων και του πόσιμου νερού για την αντιμετώπιση της ρύπανσής τους από τους φαρμακευτικούς ρυπαντές (Ternes et al., 2004; Petrovic et al., 2003; Snyder et al., 2003; Ternes et al., 2002). Οι διεργασίες αυτές μπορεί να περιλαμβάνουν κροκίδωση συσσωμάτωση, προσρόφηση σε ενεργό άνθρακα, οζονισμό και προηγμένες διεργασίες οξείδωσης, διεργασίες μεμβρανών και βιοαντιδραστήρα μεμβρανών (Luo et al., 2014) Τύχη και αφαίρεση των φαρμακευτικών ουσιών από τις ΕΕΛ Οι δημοτικές μονάδες επεξεργασίας λυμάτων έχουν σχεδιαστεί για να διαχειριστούν ένα ευρύ φάσμα ουσιών, όπως είναι τα σωματίδια, οι οργανικές ενώσεις, τα θρεπτικά και τα παθογόνα. Αν και αυτές οι ουσίες μπορούν να εξαλειφθούν αποτελεσματικά, η απομάκρυνση των μικρορυπαντών καθίσταται συχνά ανεπαρκής. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη η αξιολόγηση της τύχης και της αφαίρεσης των δυνητικά επιβλαβών μικρορυπαντών κατά την επεξεργασία των ~ 5 ~

24 λυμάτων για τη βελτιστοποίηση των διεργασιών επεξεργασίας προκειμένου να αποτραπεί η απελευθέρωσή τους στο περιβάλλον. Γενικά, οι ΕΕΛ χρησιμοποιούν μια πρωτοβάθμια, μια δευτεροβάθμια και μια προαιρετική τριτοβάθμια επεξεργασία των λυμάτων. Η τριτοβάθμια επεξεργασία χρησιμοποιείται κυρίως για την παραγωγή νερού καλύτερης ποιότητας για συγκεκριμένους σκοπούς (π.χ. επαναχρησιμοποίηση νερού) και συνδέεται πάντα με υψηλό κόστος επεξεργασίας. Έτσι, η απαίτηση για τριτοβάθμια επεξεργασία των λυμάτων βασίζεται γενικά σε κριτήρια δημόσιας υγείας και περιβάλλοντος. Οι διεργασίες που αφορούν την πρωτοβάθμια επεξεργασία στοχεύουν στην απομάκρυνση των αιωρούμενων στερεών που εισέρχονται στις ΕΕΛ, ενώ είναι αναποτελεσματικές για την απομάκρυνση των περισσότερων μικρορυπαντών (Carballa et al., 2005). Οι μικρορυπαντές απομακρύνονται κυρίως μέσω της ρόφησής τους στην πρωτοβάθμια ιλύ, καθώς η κατανομή μιας ένωσης στην οργανική (λιπόφιλη) στοιβάδα αποτελεί τον κυρίαρχο τρόπο ρόφησης (Ternes et al., 2004). Η αποτελεσματικότητα απομάκρυνσης κατά την πρωτοβάθμια επεξεργασία των φαρμακευτικών ουσιών και των ορμονών κυμαίνεται έως 28% (δικλοφενάκη και εστριόλη), το οποίο υποδηλώνει ότι η προσρόφηση των εξεταζόμενων ενώσεων στα σωματίδια της ιλύος είναι μάλλον περιορισμένη (Behera et al., 2011). Καμιά σημαντική μείωση δεν αναφέρθηκε επίσης για την ιβουπροφαίνη, τη ναπροξαίνη, τη σουλφαμεθοξαζόλη και την οιστρόνη (Carballa et al., 2004). Κατά τη δευτεροβάθμια επεξεργασία οι μικρορυπαντές υποβάλλονται σε μια σειρά διεργασιών, όπως είναι η διασπορά, η αραίωση, η κατανομή μεταξύ στερεής και υγρής φάσης, η βιοαποδόμηση και η αβιοτική μετατροπή. Η συνολική απομάκρυνση κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας αυτής αναφέρεται γενικά στην απώλεια της μητρικής ένωσης μέσω διαφόρων μηχανισμών φυσικής και χημικής μετατροπής, βιοαποδόμησης και ρόφησης σε στερεά (Jelic et al., 2011). Η βιοαποδόμηση / βιομετατροπή και η ρόφηση αποτελούν τους δύο κύριους μηχανισμούς κατά την βιολογική επεξεργασία, ενώ η πτητικότητα των ενώσεων πραγματοποιείται σε περιορισμένο βαθμό (Verlicchi et al., 2012). H βιοαποδομησιμότητα των φαρμακευτικών ουσιών, ακόμη κι αν οι ενώσεις ανήκουν στην ίδια θεραπευτική ομάδα, μπορεί να εμφανίσει μεγάλη διακύμανση. Για παράδειγμα, οι Salgado et al. (2012) ανέφεραν ότι μεταξύ των ΜΣΑΦ, η δικλοφενάκη παρουσίασε χαμηλή (< 25%) βιοαποδομησιμότητα, ενώ η ιβουπροφαίνη και η κετοπροφαίνη βιοαποδομήθηκαν σε μεγαλύτερο βαθμό (> 75%). Τα αντιβιοτικά δεν είναι γενικά εύκολα βιοαποδομήσιμα (Verlicchi et al., 2012). Υπάρχουν διάφοροι μέθοδοι που έχουν μελετηθεί για την απομάκρυνση των PPCPs από τους ΕΕΛ, όμως αρκετές από αυτές έχουν εφαρμοστεί μόνο πιλοτικά ή σε εργαστηριακή κλίμακα λόγω διαφόρων περιορισμών της εφαρμογής τους σε πραγματική κλίμακα. Οι περιορισμοί αυτοί περιλαμβάνουν τις εποχιακές διακυμάνσεις, όπως είναι οι βροχοπτώσεις και η θερμοκρασία που επηρεάζουν τις διεργασίες επεξεργασίας στις ΕΕΛ σε πραγματική κλίμακα, η διακύμανση των επιπέδων εισροής των ρυπαντών, η διαφοροποίηση των ρυπαντών μεταξύ της συμπλοκοποιημένης και μη μορφής τους και η κατανομή των ρυπαντών μεταξύ στερεής και υγρής φάσης (Esperanza et al., 2004). ~ 6 ~

25 Ο Daughton (2010) περιέγραψε δυο ακόμη αξιοσημείωτες προκλήσεις σχετικά με τη μελέτη της απομάκρυνσης των φαρμακευτικών ουσιών μέσα από τις διεργασίες επεξεργασίας των λυμάτων. Πρώτον, διάφορα προϊόντα αντίδρασης μπορούν να παραχθούν από τη διάσπαση των φαρμακευτικών ενώσεων στα στάδια επεξεργασίας των βιολογικών καθαρισμών. Αυτά τα προϊόντα αντίδρασης μπορεί να είναι αποτέλεσμα βιομετατροπής ή παραπροϊόντα διεργασιών οξείδωσης, όπως είναι τα παραπροϊόντα των απολυμαντικών ουσιών που από μόνα τους είναι τοξικά. Δεύτερον, μερικές διεργασίες κατά την επεξεργασία των λυμάτων μπορούν να παράγουν επιπρόσθετα ρεύματα αποβλήτων, τα οποία πρέπει να συνεκτιμηθούν. Για παράδειγμα, η αντίστροφη ώσμωση παράγει ένα συμπυκνωμένο ρεύμα, ενώ οι διεργασίες με ενεργό άνθρακα παράγουν ένα στερεό ρεύμα αποβλήτων. Το γενικό συμπέρασμα από τις προηγούμενες παρατηρήσεις είναι ότι απαιτείται μια πιο ολοκληρωμένη ανάλυση της τύχης των ρυπαντών όπως είναι οι PPCPs, για την εκτίμηση του βαθμού απομάκρυνσής τους από τις υγρές και στερεές φάσεις, καθώς και από τα επιπρόσθετα παραγόμενα ρεύματα αποβλήτων (Kaplan, 2013) Παράγοντες που επηρεάζουν την απομάκρυνση των φαρμακευτικών ουσιών από τις ΕΕΛ Η τύχη των φαρμακευτικών ουσιών στις ΕΕΛ υπόκειται στον έλεγχο ή την επιρροή διαφορών εσωτερικών και εξωτερικών παραγόντων. Οι εσωτερικοί παράγοντες σχετίζονται με τη φύση και τα χαρακτηριστικά των μικρορυπαντών, όπως π.χ. είναι η πολικότητα, η διαλυτότητα, η σταθερά οξύτητας (pka), ο συντελεστής κατανομής οκτανόλης / νερού (logk ow ), η χημική τους σταθερότητα σε όξινες ή αλκαλικές συνθήκες, η βιοαποδομησιμότητα και η πτητικότητα. Οι πολικές και μη πτητικές ενώσεις έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να διαφύγουν από τις διεργασίες επεξεργασίας των λυμάτων (Luo et al., 2014). Γενικά, ενώσεις με τιμές logk ow μικρότερες από 3,0 δεν αναμένεται να προσροφηθούν σε σημαντικό βαθμό στα σωματίδια με αποτέλεσμα η απομάκρυνσή τους να είναι χαμηλή κατά την πρωτοβάθμια επεξεργασία (Behera et al., 2011). Ενώσεις με σχετικά υψηλές τιμές logk ow και με pka μικρότερο από το ph των λυμάτων αναμένονται επίσης να διαχωριστούν στην υδατική φάση και να μην δεσμευτούν στα σωματίδια (Thomas and Foster, 2005). Καθώς η βιοαποδομησιμότητα των μικρορυπαντών εξαρτάται από τη βιοδιαθεσιμότητά τους, το πρώτο στάδιο της βιοαποδόμησης είναι η αφομοίωση τους από τα μικροβιακά κύτταρα, οδηγώντας έτσι σε τυχαία συγγένεια της ένωσης με τα βακτηριακά ένζυμα (Siegrist et al., 2005). Η δομή της ένωσης παίζει επίσης ένα σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της ανθεκτικότητας των μικρορυπαντών στην βιοαποδόμηση. Η βιοαποδομησιμότητα μιας ένωσης βασίζεται στην εγγενή πολυπλοκότητα αυτής (π.χ. μονοκυκλική ή πολυκυκλική ένωση) και στις λειτουργικές ομάδες που διαθέτει (π.χ. ομάδες αλογόνου). Σε γενικές γραμμές, στις εύκολα αποδομήσιμες ουσίες περιλαμβάνονται οι γραμμικές ενώσεις που έχουν κοντές πλευρικές αλυσίδες, οι ακόρεστες αλειφατικές ενώσεις και οι ενώσεις με ~ 7 ~

26 λειτουργική ομάδα δότη ηλεκτρονίων (πυρηνόφιλες). Αντίθετα, στους ανθεκτικούς μικρορυπαντές συγκαταλέγονται οι γραμμικές ενώσεις με μακριές, ιδιαίτερα διακλαδισμένες πλευρικές αλυσίδες, οι κορεσμένες ή πολυκυκλικές ενώσεις και οι ενώσεις που έχουν ηλεκτρόφιλες λειτουργικές ομάδες, θειικά ή αλογόνα (Tadkaew et al., 2011; Jones et al., 2005). Οι εξωτερικοί παράγοντες που επιδρούν στην βιοαποδομησιμότητα των μικρορυπαντών σχετίζονται με τις συνθήκες επεξεργασίας των λυμάτων, το μίγμα των μικρορυπαντών των οποίων η δράση μπορεί να είναι ανταγωνιστική και τις φυσικοχημικές ιδιότητες των λυμάτων (ph και θερμοκρασία) (Luo et al., 2014). Οι πιο σημαντικές από τις συνθήκες λειτουργίας των βιολογικών καθαρισμών είναι ο υδραυλικός χρόνος παραμονής (HRT), ο χρόνος παραμονής της ιλύος (SRT) και η κινητική βιοαποδόμησης, ενώ μερικές από τις σπουδαιότερες περιβαλλοντικές συνθήκες είναι η θερμοκρασία με χαμηλότερες αποδόσεις να έχουν αναφερθεί κατά τη διάρκεια της χειμερινής περιόδου και σε ψυχρά κλίματα (Gros et al., 2012; Verlicchi et al. 2012; Vieno et al., 2005), οι συνθήκες οξειδοαναγωγής έχουν παρατηρηθεί διαφορετικά ποσοστά απομάκρυνσης για αναερόβιες και για αερόβιες συνθήκες και το ph, το οποίο επηρεάζει την κινητική αποδόμησης των ενώσεων (Gros et al., 2012, Verlicchi et al., 2012; Suarez et al., 2008). Οι μεταβολές στη θερμοκρασία, το ρυθμό βροχοπτώσεων και την ηλιακή ακτινοβολία επηρεάζουν την ποσότητα των φαρμακευτικών μορίων που βρίσκονται στα λύματα (Vieno et al., 2005). Αν και οι μηχανισμοί εξάλειψής τους δεν είναι επακριβώς γνωστοί, είναι αποδεκτό ότι τα στάδια βιοαποδόμησης και ρόφησης αποτελούν το κύριο μέρος των διεργασιών εξάλειψης και εξαρτώνται από τη θερμοκρασία. Η φωτοδιάσπαση είναι μια διεργασία εξάλειψης, η οποία είναι λιγότερο αποτελεσματική τη χειμερινή περίοδο, καθώς τότε η ηλιακή ακτινοβολία λαμβάνει τις ελάχιστες τιμές της. Σε πολλές ενώσεις η ρόφηση αυξάνει μειούμενη της θερμοκρασίας, ενώ η βιοαποδόμηση είναι λιγότερο αποτελεσματική σε χαμηλές θερμοκρασίες (Loraine and Pettigrove, 2006; Vieno et al., 2005). Ωστόσο, η αποδοτικότητα των ΕΕΛ στα διάφορα στάδια επεξεργασίας παραμένει ακόμα σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, καθώς είναι δύσκολο να γίνει διάκριση μεταξύ των διαδικασιών εξάλειψης που ως επί το πλείστον λαμβάνουν χώρα, όπως είναι η αποδόμηση των μητρικών μορίων σε ενώσεις μικρότερου μοριακού βάρους, η φυσική απομάκρυνση μέσω της στερεάς φάσης (δηλαδή απομάκρυνση μέσω της ιλύος) και η μετατροπή των μορίων σε σύμπλοκα τα οποία μπορούν αργότερα να υδρολυθούν απελευθερώνοντας έτσι τη μητρική ένωση. Στην τελευταία περίπτωση ειδικότερα, τα σύμπλοκα δρουν ως δεξαμενές φαρμάκων από τις οποίες οι μητρικές ενώσεις μπορούν στη συνέχεια να απελευθερωθούν στο περιβάλλον (Bendz et al., 2005) Ανίχνευση και μέτρηση των φαρμακευτικών ουσιών Υπάρχει ένα σύνολο αναπτυσσόμενης γνώσης σχετικά με τον τρόπο ανίχνευσης και μέτρησης των PPCPs. Τα PPCPs απαντώνται στο περιβάλλον σε ~ 8 ~

27 συγκεντρώσεις της τάξης των λίγων ng/l έως αρκετών μg/l, καθιστώντας έτσι αναγκαία τη χρήση αναλυτικών μεθόδων που να έχουν ταυτόχρονα μεγάλη ευαισθησία και εκλεκτικότητα (Miao et al., 2002). Οι φαρμακευτικές ενώσεις είναι συνήθως πολικές, μια ιδιότητα που διευκολύνει την απελευθέρωσή τους στην κυκλοφορία του αίματος. Η πολικότητα αυτή καθιστά ευκολότερη την ανίχνευσή τους με τεχνικές όπως είναι οι LC/MS ή LC/MS-MS παρά με τις παραδοσιακές GC/MS και GC/MS-MS, οι οποίες χρησιμοποιούνται κυρίως για πτητικές και λιγότερο πολικές ενώσεις. Τα φασματόμετρα μάζας που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος είναι αυτά που έχουν απλό τετράπολο και τριπλό τετράπολο, με τα τελευταία να είναι τα πιο εύχρηστα στην ανίχνευση των φαρμακευτικών ρυπαντών (Loftin, 2010). Οι τεχνικές GC/MS και GC/MS-MS απαιτούν περισσότερο κόπο και χρόνο από τις LC/MS και LC/MS-MS εξαιτίας του σταδίου παραγωγοποίησης, μια διαδικασία επιρρεπή σε επιμολύνσεις και σφάλματα, πιθανόν λόγω της διάσπασης που οι ενώσεις μπορούν να υποστούν (Miao et al., 2002). Εξαιτίας των χαμηλών επίπεδων συγκέντρωσης στα οποία οι PPCPs συχνά απαντώνται στα περιβαλλοντικά δείγματα, οι αναλύτες είναι απαραίτητο να εκχυλιστούν και να προσυγκεντρωθούν πριν πραγματοποιηθεί η ανάλυσή τους. Η τεχνική εκχύλισης στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE) έχει εκτοπίσει την τεχνική εκχύλισης υγρού-υγρού (Liquid Liquid Extraction, LLE), καθώς αποτελεί την πλέον χρησιμοποιούμενη τεχνική προεπεξεργασίας δειγμάτων. Η τεχνική του SPE περιλαμβάνει τη χρήση ροφητών για την εκχύλιση των PPCPs από τα υγρά δείγματα που πρόκειται να αναλυθούν (Hao et al., 2007). Ο ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) που χρησιμοποιείται ως πηγή στην LC/MS-MS είναι η πιο ευρέως διαδεδομένη και εξελιγμένη τεχνική ανάλυσης των φαρμακευτικών ουσιών στα περιβαλλοντικά δείγματα, ενώ οι τεχνικές LC-TOF και LC-QTOF χρησιμοποιούνται ιδιαίτερα στην ανάλυση δειγμάτων για διαγνωστικούς σκοπούς. Ο χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) και ο φωτοϊοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Photoionization, APPI) είναι λιγότερο διαδεδομένες τεχνικές, παρ όλα αυτά αποτελούν τεχνικές τεχνολογίας αιχμής (Loftin, 2010). Η επίδραση του υλικού της μήτρας (Matrix Effect, ME) αποτελεί μία πρόκληση στην ανάλυση των PPCPs, φαινόμενο ιδιαίτερα έντονο με τις τεχνικές LC/MS και LC/MS-MS παρά με τις GC/MS και GC/MS-MS. Οι επιδράσεις του υλικού της μήτρας προκαλούν ενίσχυση ή καταστολή του σήματος των αναλυτώνστόχων κατά τον ιοντισμό τους. Αυτές αποδίδονται κυρίως στα συστατικά της μήτρας που εκλούονται ταυτόχρονα με τους αναλύτες. Με κατάλληλη αξιοποίηση των τεχνικών SPE τα συστατικά αυτά μπορούν να περιοριστούν μέχρι ένα ορισμένο βαθμό, ενώ η χρήση ισοτοπικά επισημασμένων ενώσεων στα δείγματα επαρκεί για την αντιμετώπιση τους (Miao and Metcalfe, 2007). Κατά την ποσοτικοποίηση οι επιδράσεις του υλικού της μήτρας μπορούν να ελαχιστοποιηθούν με τη χρήση των μεθόδων προσθήκης γνωστής ποσότητας και ισοτοπικής αραίωσης στα δείγματα. Η χρήση ισοτοπικά επισημασμένων προτύπων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διόρθωση της αβεβαιότητας στο εργαστήριο και στις αναλυτικές μεθόδους (Hao et ~ 9 ~

28 al., 2007). Τα πρότυπα και τα ισοτοπικά επισημασμένα πρότυπα είναι πολύ περισσότερο διαθέσιμα απ ότι ήταν πριν από μια δεκαετία (Loftin, 2010). Όμως, η έλλειψη διαθέσιμων προτύπων για μερικές δραστικές ουσίες και για ορισμένα σημαντικά παραπροϊόντα μετατροπής, παρεμποδίζει σήμερα την ευρύτερη εφαρμογή των προαναφερθέντων μεθόδων σε ένα μεγαλύτερο αριθμό ουσιών (Kolpin, 2010). ~ 10 ~

29 1.2 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Εισαγωγή Πεδίο εφαρμογών Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης είναι η πιο διαδεδομένη απ όλες τις αναλυτικές τεχνικές διαχωρισμού, με ετήσιες πωλήσεις σε όργανα HPLC που φθάνουν τα δισεκατομμύρια δολάρια. Οι λόγοι αυτής της αποδοχής της τεχνικής είναι η ευαισθησία της, η εύκολη προσαρμογή της σε ακριβείς ποσοτικούς προσδιορισμούς, η καταλληλότητά της σε διαχωρισμούς μη πτητικών ή θερμικά ευαίσθητων συστατικών και κυρίως, η εφαρμογή της σε προσδιορισμούς ουσιών πρωτίστου ενδιαφέροντος για τη βιομηχανία, το δημόσιο και πολλά επιστημονικά πεδία. Παραδείγματα αποτελούν τα αμινοξέα, οι πρωτεΐνες, τα νουκλεϊκά οξέα, οι υδρογονάνθρακες, οι υδατάνθρακες, οι φαρμακευτικές ενώσεις, τα τερπενοειδή, τα φυτοφάρμακα, τα αντιβιοτικά, τα στεροειδή, οι οργανομεταλλικές ενώσεις και μια ποικιλία ανόργανων ουσιών (Skoog, et al., 2007) Υγρή χρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης Ολοένα και περισσότερο υπάρχει η ανάγκη εύρεσης μιας ευαίσθητης, γρήγορης και πολύ-υπολειμματικής αναλυτικής διαδικασίας η οποία θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί από τα εργαστήρια για την ταυτοποίηση δεκάδων φαρμακευτικών ενώσεων που ανήκουν σε διαφορετικές θεραπευτικές ομάδες στο περιβάλλον. Η τρέχουσα τάση γι αυτό είναι η εφαρμογή της τεχνικής της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης (ή πίεσης) (UHPLC). Η UHPLC αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο, επειδή δίνει τη δυνατότητα της απευθείας εφαρμογής της στις ήδη υπάρχουσες συνθήκες της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Στην UHPLC χρησιμοποιούνται μικρές και στενής εσωτερικής διαμέτρου στήλες με πληρωτικό υλικό που έχει πορώδες μικρότερο των 2 μm, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα υπερυψηλές οπίσθιες πιέσεις και μεγάλες γραμμικές ταχύτητες των κινητών φάσεων (Hsieh et al., 2007; Kalovidouris et al., 2006; Petrovic et al., 2006; Yu et al., 2006). Αυτό οδηγεί στην ταχεία και ικανοποιητική έκλουση ενός μεγάλου πλήθους αναλυτών, ακόμα και αυτών παραπλήσιας δομής, δίνοντας υψηλές και στενές κορυφές με πλάτος κορυφής στη γραμμή βάσης μικρότερο των 10 s, παρέχοντας έτσι μέγιστη χρωματογραφική ανάλυση και χωρητικότητα της κορυφής (Lopez-Serna et al., 2011), ενώ ταυτόχρονα ελαχιστοποιείται η συνέκλουση άλλων παρεμποδίζουσων ουσιών με επακόλουθο τη μείωση των επιδράσεων μήτρας κατά τον ιοντισμό (Wu et al., 2010). Ο γρήγορος χρωματογραφικός διαχωρισμός μπορεί να επιτευχθεί είτε μέσω αύξησης του ρυθμού ροής της κινητής φάσης είτε με ελάττωση του μήκους ή του πορώδους του πληρωτικού υλικού της αναλυτικής στήλης. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι, παρόλο που έχουν δημοσιευτεί αρκετές αναλυτικές μέθοδοι που βασίζονται σε ανάλυση με UHPLC, οι περισσότερες απ αυτές χρησιμοποιούν ~ 11 ~

30 συμβατικές στήλες με πληρωτικό υλικό πορώδους 3 ή 5 μm και συνεπώς αυτές οι μέθοδοι δεν αποτελούν στην πραγματικότητα UHPLC (Jakimska et al., 2014).Τα πλεονεκτήματα του γρήγορου διαχωρισμού με UHPLC είναι η δημιουργία στενών κορυφών, οι οποίες μπορούν να αποκτηθούν χρησιμοποιώντας ελάχιστο όγκο δείγματος και μεγάλο ρυθμό απόκτησης δεδομένων, διατηρώντας ταυτόχρονα υψηλές αποδόσεις. Στην περίπτωση πολύπλοκων δειγμάτων (π.χ. υγρά και στερεά περιβαλλοντικά δείγματα) η σύζευξη της UHPLC με τη φασματομετρία μαζών αποτελεί μια συνετή επιλογή (Wang, 2009), κυρίως λόγω της υψηλής ευαισθησίας και της δυνατότητας ταυτοποίησης των στοχευόμενων ενώσεων Οργανολογία υγρής χρωματογραφίας Για να αναπτυχθούν ικανοποιητικές ταχύτητες ροής του υγρού έκλουσης όταν χρησιμοποιούνται υλικά πλήρωσης αποτελούμενα από σωματίδια μεγέθους 2 έως 10 μm, οι απαιτούμενες πιέσεις από τις αντλίες φθάνουν τις μερικές χιλιάδες psi (1 atm = 14,696 psi). Ως συνέπεια αυτών των υψηλών πιέσεων, η οργανολογία της HPLC είναι πολυπλοκότερη και δαπανηρότερη από την οργανολογία άλλων ειδών χρωματογραφίας (Skoog, et al., 2007) Δοχεία κινητής φάσης και συστήματα επεξεργασίας διαλυτών Ένα σύγχρονο σύστημα HPLC είναι εφοδιασμένο με ένα ή περισσότερα υάλινα ή ανοξείδωτα δοχεία, καθένα από τα οποία περιέχει 200 έως 1000 ml διαλύτη. Τα δοχεία είναι συχνά εφοδιασμένα με μέσα απομάκρυνσης των διαλυμένων αερίων (απαερωτές), συνήθως οξυγόνου και αζώτου, που παρεμποδίζουν τον σχηματισμό φυσαλίδων στη στήλη και στον ανιχνευτή των συστημάτων. Οι φυσαλίδες αυτές προκαλούν συχνά διεύρυνση των κορυφών. Επιπλέον, εμποδίζουν συχνά τη σωστή λειτουργία του ανιχνευτή. Οι απαερωτές μπορεί να αποτελούνται από ένα σύστημα άντλησης κενού, ένα σύστημα απόσταξης, διατάξεις που θερμαίνουν και αναδεύουν τους διαλύτες ή από συστήματα εισαγωγής φυσαλίδων αδρανούς αερίου χαμηλής διαλυτότητας. Συχνά τα συστήματα αυτά περιλαμβάνουν φίλτρα απομάκρυνσης σκόνης και αιωρούμενων σωματιδίων από τους διαλύτες για να προληφθούν πιθανές βλάβες στις αντλίες ή στα συστήματα έγχυσης, όπως και η έμφραξη της στήλης. Ο διαχωρισμός στον οποίο χρησιμοποιείται ένας διαλύτης σταθερής σύστασης καλείται ισοκρατική έκλουση (isocratic elution). Συχνά, η απόδοση διαχωρισμού ενισχύεται σημαντικά με τη βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Εδώ χρησιμοποιούνται δύο ή τρία συστήματα διαλυτών, που διαφέρουν σημαντικά ως προς την πολικότητα. Αφού αρχίσει η έκλουση, ο λόγος των διαλυτών μεταβάλλεται με τρόπο προγραμματισμένο άλλες φορές συνεχώς και άλλες με μια σειρά βημάτων. Τα σύγχρονα συστήματα HPLC συχνά είναι εφοδιασμένα με διατάξεις, οι οποίες εισάγουν διαλύτες από δύο ή περισσότερα δοχεία σε θάλαμο ανάμιξης με ρυθμούς ~ 12 ~

31 που μεταβάλλονται συνεχώς. Ο λόγος των όγκων των διαλυτών μπορεί να μεταβάλλεται ως προς το χρόνο γραμμικά ή λογαριθμικά (Skoog, et al., 2007) Συστήματα άντλησης Οι απαιτήσεις ενός συστήματος άντλησης στην HPLC είναι αυστηρές και περιλαμβάνουν: ανάπτυξη πιέσεων μέχρι 600 psi, απαλλαγή από παλμούς ροής, ταχύτητες ροής που κυμαίνονται από 0,1 έως 10 ml/min, έλεγχο ροής και επαναληψιμότητα ροής 0,5 % ή καλύτερη, τμήματα ανθεκτικά στη διάβρωση (φλάντζες από ανοξείδωτο χάλυβα ή Teflon). Τονίζεται ότι οι υψηλές πιέσεις από τις αντλίες της HPLC δεν δημιουργούν κίνδυνο έκρηξης επειδή τα υγρά δεν είναι πολύ συμπιέσιμα. Συνεπώς, η ρήξη ενός τμήματος του συστήματος μπορεί να οδηγήσει μόνο σε διαρροή του διαλύτη. Ωστόσο, μια τέτοια διαρροή μπορεί να οδηγήσει σε πυρκαγιά. Συναντούμε τρεις τύπους αντλιών, που ο καθένας έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του: παλινδρομικές αντλίες, αντλίες σύριγγας ή εκτόπισης και αντλίες πνευματικές ή σταθερής πίεσης Παλινδρομικές αντλίες Οι παλινδρομικές αντλίες (reciprocating pumps) χρησιμοποιούνται σήμερα στο 90 % των εμπορικά διαθέσιμων συστημάτων HPLC και αποτελούνται συνήθως από ένα μικρό θάλαμο, στον οποίο ο διαλύτης αντλείται παλινδρομικά με ένα μηχανικά κινούμενο έμβολο. Δυο σφαιρικές βαλβίδες ανοίγουν και κλείνουν εκ περιτροπής και ελέγχουν τη ροή του διαλύτη μέσα και έξω από έναν κύλινδρο. Ο διαλύτης βρίσκεται σε άμεση επαφή με το έμβολο. Εναλλακτικά, μπορεί να μεταδίδεται πίεση στον διαλύτη μέσω ενός εύκαμπτου διαφράγματος, το οποίο με τη σειρά το αντλείται πνευματικά από ένα παλινδρομικό έμβολο. Οι αντλίες αυτές έχουν το μειονέκτημα ότι παράγουν παλμούς ροής, που πρέπει να αποσβήνονται, επειδή η παρουσία τους γίνεται εμφανής ως θόρυβος στη γραμμή βάσης του χρωματογραφήματος. Πλεονεκτήματα των παλινδρομικών αντλιών είναι οι μικροί εσωτερικοί όγκοι (35 έως 400 μl), οι υψηλές πιέσεις (μέχρι psi), η εύκολη προσαρμογή σε βαθμιδωτή έκλουση και σταθερές ταχύτητες ροής, οι οποίες είναι ανεξάρτητες από την οπισθοπίεση της στήλης και το ιξώδες του διαλύτη Αντλίες εκτόπισης Οι αντλίες εκτόπισης (displacement pumps) συνήθως αποτελούνται από μεγάλους θαλάμους τύπου συριγγών εφοδιασμένων με ένα έμβολο, που ενεργοποιείται από ένα κοχλιωτό μηχανισμό ο οποίος οδηγείται από ένα βηματικό κινητήρα. Οι αντλίες εκτόπισης παράγουν ροή σχεδόν ανεξάρτητη από το ιξώδες και την οπισθοπίεση. Επιπλέον, η ροή είναι απαλλαγμένη από παλμικές διακυμάνσεις. Στα μειονεκτήματά τους περιλαμβάνονται η περιορισμένη χωρητικότητα διαλύτη (250 ml) και η σημαντική δυσκολία κατά την αλλαγή διαλυτών. ~ 13 ~

32 Πνευματικές αντλίες Στις απλούστερες πνευματικές αντλίες (pneumatic pumps) η κινητή φάση περιέχεται σε ένα πτυσσόμενο δοχείο που βρίσκεται σε χώρο, που μπορεί να συμπιέζεται με πεπιεσμένο αέριο. Οι αντλίες του τύπου αυτού είναι φθηνές και απαλλαγμένες από παλμικές ροές. Ωστόσο έχουν μικρή χωρητικότητα και χαμηλή παρεχόμενη πίεση και η ταχύτητα ροής εξαρτάται από το ιξώδες και την οπισθοπίεση της στήλης. Δεν προσαρμόζονται σε βαθμιδωτή έκλουση και περιορίζονται σε πιέσεις μικρότερες από 2000 psi (Skoog, et al., 2007) Συστήματα έγχυσης δείγματος Συχνά, ο περιοριστικός παράγοντας στην επαναληψιμότητα των μετρήσεων στην υγρή χρωματογραφία είναι ο τρόπος εισαγωγής των δειγμάτων στη στήλη. Το πρόβλημα επιδεινώνεται με τη διεύρυνση των κορυφών, που προκαλεί η υπερφόρτωση των στηλών. Συνεπώς, οι όγκοι πρέπει να είναι οι ελάχιστοι δυνατοί, από μερικές δεκάδες μl έως 500 μl. Επιπλέον, είναι σημαντικό να εισάγεται το δείγμα χωρίς να προκαλείται αποσυμπίεση του συστήματος. Ο παλαιότερος και απλός τρόπος εισαγωγής δείγματος ήταν η έγχυση με σύριγγα μέσω ενός ελαστικού διαφράγματος γνωστού ως septum. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται μικροσύριγγες σχεδιασμένες να αντέχουν σε πιέσεις μέχρι 1500 psi. Σε εγχύσεις αναχαίτισης ροής, η ροή του διαλύτη διακόπτεται στιγμιαία, απομακρύνεται ένας προσαρμογέας στην κεφαλή της στήλης και το δείγμα εγχέεται απευθείας στην κορυφή (κεφαλή) της στήλης. Μετά την επανατοποθέτηση του προσαρμογέα, το σύστημα επανέρχεται σε συνθήκες πίεσης. Το πλεονέκτημα αυτή της τεχνικής είναι η απλότητά της. Δυστυχώς, η επαναληψιμότητα της έγχυσης με σύριγγα σπάνια είναι καλύτερη από 2 % έως 3 %. Σήμερα, υπάρχουν διαθέσιμα συστήματα αυτόματων δειγματοληπτών τα οποία ελαχιστοποιούν τα προβλήματα αυτά και αυξάνουν στο μέγιστο δυνατό την επαναληψιμότητα της έγχυσης με σύριγγα (Skoog, et al., 2007) Θερμοστάτες στήλης Σε πολλές εφαρμογές ο αυστηρός έλεγχος της θερμοκρασίας της στήλης δεν είναι αναγκαίος και οι στήλες λειτουργούν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ωστόσο συχνά λαμβάνονται καλύτερα χρωματογραφήματα διατηρώντας τη θερμοκρασία της στήλης σταθερή εντός μερικών δεκάτων του βαθμού Κελσίου. Τα σύγχρονα όργανα είναι σήμερα εφοδιασμένα με θερμοστάτες, που ελέγχουν τη θερμοκρασία της στήλης στην περιοχή δωματίου 100 ή 150 ο C με ακρίβεια μερικών δεκάτων του βαθμού. Επίσης, οι στήλες μπορεί να συνδέονται με μανδύες ύδατος τροφοδοτούμενους από υδατόλουτρο σταθερής θερμοκρασίας για τον ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας (Skoog, et al., 2007). ~ 14 ~

33 1.2.8 Στήλες υγρής χρωματογραφίας Οι στήλες της υγρής χρωματογραφίας κατασκευάζονται συνήθως από σωλήνες μικρής διαμέτρου από ανοξείδωτο χάλυβα, αν και περιστασιακά χρησιμοποιούνται και παχύτοιχοι υάλινοι σωλήνες. Οι τελευταίοι χρησιμοποιούνται σε πιέσεις μικρότερες από 600 psi. Εκατοντάδες πακεταρισμένων στηλών με διαφορετικό μέγεθος και υλικό πλήρωσης είναι διαθέσιμες από διαφορετικούς κατασκευαστές. Το κόστος τους κυμαίνεται από 200 έως 500 $ Αναλυτικές στήλες Η πλειονότητα των στηλών υγρής χρωματογραφίας έχουν μήκος από 10 έως 30 cm. Συνήθως οι στήλες είναι ευθύγραμμες. Όταν απαιτείται επιμήκυνσή τους, αυτή επιτυγχάνεται με σύζευξη δύο ή περισσότερων στηλών μαζί. Η εσωτερική διάμετρος των στηλών είναι συνήθως 4 έως 10 mm και το μέγεθος σωματιδίων του υλικού πλήρωσης είναι 5 ή 10 μm. Σήμερα, η πιο συνηθισμένη στήλη έχει μήκος 25 cm, εσωτερική διάμετρο 4,6 mm και υλικό πλήρωσης με σωματίδια μεγέθους 5 μm. Στήλες αυτού του τύπου διαθέτουν έως πλάκες ανά μέτρο. Πρόσφατα, ορισμένοι κατασκευαστές προσφέρουν στήλες υγρής χρωματογραφίας υψηλής ταχύτητας, με μικρότερες διαστάσεις. Οι στήλες αυτές έχουν εσωτερικές διαμέτρους από 1 έως 4,6 mm και μέγεθος σωματιδίων υλικού πλήρωσης 3 έως 5 μm. Το μήκος τους είναι μικρό (30 έως 75 mm). Οι στήλες του τύπου αυτού διαθέτουν μέχρι και πλάκες ανά μέτρο και προσφέρουν το πλεονέκτημα της ταχύτητας και της ελάχιστης κατανάλωσης διαλύτη. Η τελευταία ιδιότητα έχει ιδιαίτερη σημασία, επειδή οι διαλύτες υψηλής καθαρότητας που απαιτούνται στην υγρή χρωματογραφία είναι δαπανηροί τόσο στην αγορά όσο και στη διάθεση τους ως εργαστηριακά απόβλητα Προστατευτικές στήλες Συνήθως πριν από την αναλυτική στήλη, παρεμβάλλεται μια μικρή προστατευτική στήλη (guard column) ή προστήλη (pre-column) για να αυξήσει το χρόνο ζωής της, απομακρύνοντας όχι μόνο τα αιωρούμενα σωματίδια και τις προσμίξεις από το διαλύτη αλλά και συστατικά του δείγματος που συνδέονται με τη στατική φάση μη αντιστρεπτά. Επιπλέον, στη χρωματογραφία υγρού-υγρού, η προστήλη προκαλεί κορεσμό της κινητής φάση με τη στατική έτσι ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες του διαλύτη της αναλυτικής στήλης. Η σύσταση του υλικού της προστήλης πρέπει να είναι παρόμοια με αυτή της αναλυτικής στήλης. Ωστόσο, το μέγεθος των σωματιδίων είναι συνήθως μεγαλύτερο για να ελαχιστοποιείται η πτώση πίεσης. Όταν η προστήλη ρυπαίνεται, αναγομώνεται ή απορρίπτεται και αντικαθίστανται με νέα του ίδιου τύπου. Επομένως, η προστήλη θυσιάζεται για την προστασία της δαπανηρότερης αναλυτικής στήλης (Skoog, et al., 2007). ~ 15 ~

34 1.2.9 Χρωματογραφία κατανομής Η χρωματογραφία κατανομής είναι ο πιο διαδεδομένος τύπος από τους τέσσερις τύπους υγρής χρωματογραφίας και αυτή χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία. Οι άλλοι τρεις περιλαμβάνουν τη χρωματογραφία προσρόφησης, τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και τη χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού. Βρίσκει πολλές εφαρμογές μερικές από τις οποίες περιγράφονται στον πίνακα 2. Συνήθως η χρωματογραφία κατανομής είναι συνδεδεμένης φάσης, δηλαδή, η στατική φάση δεσμεύεται χημικά στην επιφάνεια του υλικού στήριξης. Παλιότερα η χρωματογραφία κατανομής ήταν αποκλειστικά του τύπου υγρού υγρού, όπου η υγρή στατική φάση κατακρατείται στην επιφάνεια του υλικού πλήρωσης με φυσική προσρόφηση, όμως η μέθοδος αυτή εμφάνιζε ορισμένα μειονεκτήματα και γι αυτό δεν χρησιμοποιείται πλέον Στήλες για τη χρωματογραφία συνδεδεμένης φάσης Τα υλικά στήριξης για την πλειονότητα των υλικών πλήρωσης στη χρωματογραφία κατανομής συνδεδεμένης φάση παρασκευάζονται από άκαμπτη πυριτία ή σύνθεση που βασίζεται σε πυριτία. Αυτά τα στερεά σχηματίζονται ως ομοιόμορφα, πορώδη και μηχανικά σκληρά σωματίδια, τα οποία έχουν συνήθως διάμετρο 3, 5 ή 10 μm. Η επιφάνεια της πλήρως υδρολυμένης πυριτίας (υδρολυμένης με θέρμανση με HCL 0,1 Μ για μία ή δύο ημέρες) αποτελείται από χημικά ενεργές ομάδες σιλανόλης. Δηλαδή, τυπικές επιφάνειες πυριτίας περιέχουν περίπου 8 μmol / m 2 ομάδων OH. Οι πιο χρήσιμες επιστρώσεις στη χρωματογραφία συνδεδεμένης φάσης είναι τα σιλοξάνια (οργανοπυριτικές ενώσεις) που σχηματίζονται κατά την αντίδραση της υδρολυμένης επιφάνειας με ένα οργανοχλωριωμένο σιλάνιο. Πίνακας 1.2: Τυπικές εφαρμογές χρωματογραφίας κατανομής. Πεδίο εφαρμογών Φάρμακα Βιοχημικά Προϊόντα τροφίμων Βιοχημικά χημικά Ρυπαντές Εγκληματολογική Χημεία Κλινική Ιατρική Τυπικά μίγματα Αντιβιοτικά, ηρεμιστικά, στεροειδή, αναλγητικά Αμινοξέα, πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, λιπίδια Τεχνητά γλυκαντικά, αντιοξειδωτικά, αφλατοξίνες, πρόσθετα Πολυπυρηνικές αρωματικές ενώσεις, επιφανειοδραστικές ουσίες, προωθητικά αέρια, χρωστικές Εντομοκτόνα, ζιζανιοκτόνα, φαινόλες, PCBs Φάρμακα, δηλητήρια, αλκοόλη στο αίμα, ναρκωτικά Χολικά οξέα, μεταβολίτες φαρμάκων, εκχυλίσματα ούρων, οιστρογόνα ~ 16 ~

35 Η κάλυψη της επιφάνειας με σιλανοποίηση περιορίζεται σε 4 μmol / m 2 ή λιγότερο, λόγω στερεοχημικών παρεμποδίσεων. Δυστυχώς, οι ομάδες SiOH που δεν αντέδρασαν, δίνουν ανεπιθύμητη πολικότητα στην επιφάνεια, η οποία ίσως οδηγεί στο σχηματισμό «ουρών» (tailing) στις κορυφές του χρωματογραφήματος, ειδικά για διαλυμένες ουσίες σε βασικούς διαλύτες. Για να ελαττωθεί η επίδραση αυτή, τα υλικά πλήρωσης με βάση τα σιλοξάνια συχνά «καλύπτονται» (capped) με μια επιπλέον αντίδραση με χλωροτριμεθυλοσιλάνιο το οποίο, λόγω του μικρότερου μεγέθους του δεσμεύει πολλές από τις σιλανολικές ομάδες που δεν αντέδρασαν Υλικά πλήρωσης για τη χρωματογραφία συνδεδεμένης και κανονικής φάσης Με βάση τη σχετική πολικότητα της κινητής και της στατικής φάσης διακρίνονται δύο τύποι χρωματογραφίας κατανομής. Στην παλαιότερη χρωματογραφία κανονικής φάσης (normal-phase chromatography) χρησιμοποιήθηκαν στατικές φάσεις υψηλής πολικότητας (ύδωρ, τριαιθυλενογλυκόλη) κατακρατούμενες σε σωματίδια πυριτίας ή αλούμινας, ενώ ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε ένας σχετικά μη πολικός διαλύτης, όπως εξάνιο ή ισοπροπυλαιθέρας. Αντίθετα, στην πιο διαδεδομένη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (reversed-phase chromatography), η στατική φάση είναι μη πολική, συχνά ένας υδρογονάνθρακας και η κινητή φάση είναι ένας σχετικά πολικός διαλύτης (όπως ύδωρ, μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο). Στη χρωματογραφία κανονικής φάσης, το λιγότερο πολικό συστατικό εκλούεται πρώτο, διότι είναι το περισσότερο διαλυτό στην κινητή φάση. Αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του χρόνου έκλουσης. Αντίθετα, στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, το πολικότερο συστατικό εμφανίζεται πρώτο και με αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης, ο χρόνος έκλουσης αυξάνει. Τα υλικά πλήρωσης στην τεχνική συνδεδεμένης φάσης κατατάσσονται ως υλικά αντίστροφης φάσης, όταν η δεσμευόμενη επίστρωση (coating) είναι μη πολική και ως κανονικής φάσης, όταν η επίστρωση περιέχει πολικές δραστικές ομάδες. Ίσως τα τρία τέταρτα των εφαρμογών της HPLC πραγματοποιούνται με στήλες, οι οποίες περιέχουν υλικά πλήρωσης αντίστροφης φάσης. Συνηθέστερα, η πλευρική ομάδα R του σιλοξανίου των επιστρώσεων είναι μια αλυσίδα C 8 (n-οκτύλιο) ή μια αλυσίδα C 18 (n-δεκαοκτύλιο). Στις περισσότερες εφαρμογές της χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης, η έκλουση πραγματοποιείται με κινητή φάση υψηλής πολικότητας, ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυτών, όπως η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο ή το τετραϋδροφουράνιο. Ωστόσο, θα πρέπει να ληφθεί πρόνοια να αποφευχθούν τιμές ph μεγαλύτερες από 7,5, διότι στις τιμές αυτές αρχίζει η υδρόλυση του σιλοξανίου, που οδηγεί σε αποικοδόμηση ή καταστροφή του υλικού πλήρωσης (Skoog, et al., 2007). ~ 17 ~

36 Ποιοτική ανάλυση Από ένα χρωματογράφημα μπορεί να ληφθεί μόνο ένα είδος ποιοτικής πληροφορίας για κάθε ουσία σε ένα δείγμα: ο χρόνος κατακράτησής της ή η θέση της σε μια στατική φάση μετά από μια ορισμένη περίοδο έκλουσης. Πρόσθετα δεδομένα μπορούν να ληφθούν από χρωματογραφήματα με διάφορες κινητές και στατικές φάσεις και σε διάφορες θερμοκρασίες έκλουσης. Ωστόσο, η πληροφόρηση που μπορεί να ληφθεί από τη χρωματογραφία είναι περιορισμένη σε σχέση με την πληροφόρηση από ένα και μόνο φάσμα IR, NMR ή ένα φάσμα μαζών. Επιπλέον, τα φασματικά μήκη κύματος μπορούν να προσδιορισθούν με πολύ μεγαλύτερη επαναληψιμότητα σε σχέση με τους χρόνους κατακράτησης των χρωματογραφημάτων (t R ). Από τα προηγούμενα δεν πρέπει να βγει το συμπέρασμα ότι η χρωματογραφία δε βρίσκει σημαντικές εφαρμογές στην ποιοτική ανάλυση. Αντίθετα, χρησιμοποιείται ευρύτατα ως εργαλείο για τη διαπίστωση της παρουσίας ή απουσίας συστατικών σε μίγματα, που περιέχουν ένα περιορισμένο αριθμό ουσιών γνωστής ταυτότητας. Σημειώνεται ότι αν και τα χρωματογραφήματα δεν οδηγούν σε μια θετική ταυτοποίηση των ουσιών σε ένα δείγμα, ωστόσο αποτελούν ένδειξη της απουσίας ορισμένων ενώσεων. Έτσι, εάν ένα δείγμα δεν παρέχει μια κορυφή στον ίδιο χρόνο κατακράτησης ενός προτύπου, το οποίο μετρείται κάτω από τις ίδιες συνθήκες, μπορεί να θεωρηθεί βέβαιη η απουσία της συγκεκριμένης ένωσης (ή είναι παρούσα σε επίπεδα συγκέντρωσης κάτω από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου). Επομένως, η χρωματογραφία αποτελεί ένα πρώτο στάδιο ζωτικής σημασίας για το χρωματογραφικό διαχωρισμό των ενώσεων σε ένα πολύπλοκο μίγμα (Skoog, et al., 2007) Ποσοτική ανάλυση Η ποσοτική χρωματογραφία στήλης βασίζεται σε σύγκριση του ύψους ή της επιφάνειας της κορυφής του αναλύτη με τις αντίστοιχες κορυφές ενός ή περισσότερων προτύπων. Για την επίπεδη χρωματογραφία η επιφάνεια που καλύπτει κάθε διαχωριζόμενη ουσία αποτελεί την αναλυτική παράμετρο. Με κατάλληλο έλεγχο των συνθηκών, οι παράμετροι αυτές μεταβάλλονται γραμμικά με τη συγκέντρωση Αναλύσεις που βασίζονται στο ύψος κορυφής Το ύψος μιας χρωματογραφικής κορυφής υπολογίζεται με χάραξη μιας ευθείας που συνδέει τις γραμμές βάσης και από τις δύο πλευρές της κορυφής και μέτρηση της κατακόρυφης απόστασης αυτής της γραμμής από το υψηλότερο σημείο της κορυφής. Η μέτρηση αυτή μπορεί να γίνει με ικανοποιητικό βαθμό επαναληψιμότητας. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι το ύψος κορυφής είναι αντιστρόφως ανάλογο προς το εύρος της κορυφής. Επομένως, ορθά αποτελέσματα από μετρήσεις ύψους κορυφής λαμβάνονται μόνο εάν οι συνθήκες μέτρησης δεν ~ 18 ~

37 προκαλούν μεταβολή στο εύρος των κορυφών κατά το χρονικό διάστημα των μετρήσεων αγνώστων και προτύπων. Οι μεταβλητές που πρέπει να ελέγχονται στενά είναι η θερμοκρασία στήλης, η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης και η ταχύτητα έγχυσης του δείγματος. Επιπλέον, θα πρέπει να αποφευχθεί και η υπερφόρτιση της στήλης. Η επίδραση της ταχύτητας έγχυσης είναι ιδιαίτερα κρίσιμη για τις πρώτες κορυφές ενός χρωματογραφήματος. Σχετικά σφάλματα 5 έως 10 % που οφείλονται στην αιτία αυτή δεν είναι ασυνήθιστα, όταν η ένεση του δείγματος γίνεται με ένεση Αναλύσεις που βασίζονται στην επιφάνεια των κορυφών Οι επιφάνειες (εμβαδά) των κορυφών είναι ανεξάρτητες από διευρύνσεις οι οποίες οφείλονται στις μεταβλητές που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη παράγραφο. Από την άποψη αυτή οι επιφάνειες αποτελούν προτιμότερη αναλυτική παράμετρο σε σχέση με τα ύψη κορυφών. Ωστόσο, υα ύψη κορυφών μετρούνται ευκολότερα και στην περίπτωση πολύ στενών κορυφών μετρούνται με μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με τις επιφάνειες. Τα σύγχρονα όργανα χρωματογραφίας περιλαμβάνουν ψηφιακούς ηλεκτρονικούς ολοκληρωτές, με τους οποίους είναι εφικτός ο ακριβής υπολογισμός της επιφάνειας κάθε κορυφής. Εάν δεν υπάρχει ολοκληρωτής, ο υπολογισμός μπορεί να γίνει και με το χέρι. Γενικά, η μέτρηση της επιφάνειας με το χέρι είναι επαναλήψιμη κατά 2 έως 5 %. Οι ψηφιακοί ολοκληρωτές είναι ακριβέστεροι κατά μία τουλάχιστον τάξη μεγέθους Βαθμονόμηση και πρότυπα Η πιο άμεση και απλή μέθοδος για ποσοτική χρωματογραφική ανάλυση είναι η χρήση μιας σειράς πρότυπων διαλυμάτων με σύνθεση που προσεγγίζει τη σύνθεση των αγνώστων. Λαμβάνονται τα χρωματογραφήματα των προτύπων, μετρούνται τα ύψη ή οι επιφάνειες των κορυφών και κατασκευάζεται το διάγραμμα των τιμών αυτών ως προς τις συγκεντρώσεις. Ιδανικά, το διάγραμμα θα πρέπει να είναι μια ευθεία γραμμή που θα διέρχεται από την αρχή των αξόνων. Για να επιτευχθεί η μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια απαιτείται συχνή επανάληψη των μετρήσεων των προτύπων (επαναπροτυποποίηση). Η σημαντικότερη πηγή σφάλματος στις αναλύσεις με τη μέθοδο αυτή είναι η αβεβαιότητα στον όγκο του δείγματος. Συχνά και η ταχύτητα έγχυσης του δείγματος αποτελεί παράγοντα αβεβαιότητας. Κανονικά τα δείγματα είναι μικρά (1 μl) και η σχετική αβεβαιότητα, που συνδέεται με την έγχυση ενός επαναλήψιμου όγκου αυτού του μεγέθους με μια μικροσύριγγα, μπορεί να φθάσει και μερικές μονάδες επί τοις εκατό. Τα σφάλματα που οφείλονται στον εισαγόμενο όγκο μπορούν να μειωθούν στο 1 έως 2 % με τη χρήση περιστροφικής βαλβίδας εισαγωγής δείγματος. ~ 19 ~

38 Η μέθοδος εσωτερικού προτύπου Το εσωτερικό πρότυπο είναι μια ουσία που προστίθεται σε σταθερή ποσότητα σε όλα τα δείγματα, τα τυφλά και τα πρότυπα βαθμονόμησης κατά την ανάλυση. Εναλλακτικά, μπορεί να είναι ένα κύριο συστατικό των δειγμάτων και των προτύπων, το οποίο βρίσκεται σε μεγάλη ποσότητα, ώστε η συγκέντρωσή του να μπορεί να θεωρηθεί ίδια σε όλες τις περιπτώσεις. Η βαθμονόμηση πραγματοποιείται με την κατασκευή διαγράμματος του λόγου (σήμα αναλύτη) / (σήμα εσωτερικού προτύπου) ως προς τη συγκέντρωση του αναλύτη στα πρότυπα. Ο ίδιος λόγος μετρείται σε κάθε δείγμα και από την καμπύλη βαθμονόμησης υπολογίζεται η αντίστοιχη συγκέντρωση του αναλύτη. Το εσωτερικό πρότυπο, εάν επιλεγεί και χρησιμοποιηθεί σωστά, μπορεί να αντισταθμίσει αρκετά τυχαία και συστηματικά σφάλματα. Έτσι, εάν τα σήματα του αναλύτη και του εσωτερικού προτύπου αποκρίνονται αναλογικά σε τυχαίες οργανολογικές και μεθοδολογικές διακυμάνσεις, ο λόγος των σημάτων παραμένει σταθερός και ανεξάρτητος των διακυμάνσεων αυτών. Εάν και τα δύο σήματα επηρεάζονται το ίδιο από την επίδραση της μήτρας, πάλι η δράση αυτή όσον αφορά τον λόγο των σημάτων αντισταθμίζεται. Σε περιπτώσεις που το εσωτερικό πρότυπο αποτελεί κύριο συστατικό δειγμάτων και προτύπων, συμβαίνει πάλι αντιστάθμιση σφαλμάτων που προκύπτουν κατά την προετοιμασία των δειγμάτων και των διαλυμάτων. Βασική δυσκολία κατά την εφαρμογή της μεθόδου εσωτερικού προτύπου είναι η εξεύρεση κατάλληλης ουσίας, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εσωτερικό πρότυπο και η εισαγωγή της τόσο στα δείγματα, όσο και στα πρότυπα με τον πιο επαναλήψιμο τρόπο. Το εσωτερικό πρότυπο θα πρέπει να παρέχει σήμα με παρόμοια χαρακτηριστικά με το σήμα του αναλύτη (π.χ. να υφίσταται την ίδια επίδραση από άλλες ουσίες και από διακυμάνσεις οργανολογικών παραμέτρων), αλλά θα πρέπει να διακρίνεται από αυτό έτσι, ώστε κάθε σήμα (αναλύτη και εσωτερικού προτύπου) να μπορεί να μετρηθεί ξεχωριστά. Επίσης, πρέπει να είναι βέβαιο ότι η ουσία που χρησιμοποιείται ως εσωτερικό πρότυπο δεν βρίσκεται στη μήτρα του δείγματος έτσι, ώστε η συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου να υπολογίζεται αποκλειστικά από τις προστιθέμενες ποσότητές του. Στην ποσοτική χρωματογραφική ανάλυση η μέγιστη επαναληψιμότητα λαμβάνεται με τη χρήση εσωτερικών προτύπων, επειδή αποφεύγονται οι αβεβαιότητες οι οποίες εισάγονται κατά την έγχυση του δείγματος. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, μια προσεκτικά μετρημένη ποσότητα μιας ουσίας, που αποτελεί το εσωτερικό πρότυπο, προστίθεται σε κάθε πρότυπο διάλυμα και σε κάθε δείγμα. Ως αναλυτική παράμετρος χρησιμοποιείται ο λόγος της επιφάνειας (ή του ύψους) της κορυφής του αναλύτη προς την αντίστοιχη του εσωτερικού προτύπου. Για να είναι επιτυχής η μέθοδος, είναι απαραίτητο η κορυφή του εσωτερικού προτύπου να διαχωρίζεται καλά από τις κορυφές των άλλων συστατικών του δείγματος, αλλά συγχρόνως δεν θα πρέπει να απέχει πολύ από την κορυφή του αναλύτη. Με κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο μπορούν να επιτευχθούν σχετικές επαναληψιμότητες καλύτερες από 1 % (Skoog, et al., 2007). ~ 20 ~

39 Σύζευξη υγρής χρωματογραφίας με φασματομετρία μαζών Ένα βασικό πρόβλημα στη σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μαζών είναι η ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκων διαλυτών που χρησιμοποιούνται στην πρώτη και του κενού που απαιτείται στη δεύτερη. Για την επίλυση του προβλήματος αυτού, έχουν προταθεί διάφορα σχήματα διασύνδεσης. Σε ένα εμπορικά διαθέσιμο σύστημα, το υγρό έκλουσης από τη στήλη διαχωρίζεται και μόνο ένα μικρό κλάσμα εισάγεται κατευθείαν στον ανιχνευτή μαζών. Αλλά και η προοπτική άμεσης εισαγωγής του υγρού στο σύστημα είναι εφικτή στην περίπτωση χρήσης στηλών μικρής διαμέτρου με ταχύτητες ροής από 10 έως 50 μl/min. Σε ένα δεύτερο τύπο διασύνδεσης, που επίσης υπάρχει στο εμπόριο, το υγρό έκλουσης αποτίθεται σε έναν συνεχώς κινούμενο ιμάντα ή σύρμα, που μεταφέρει τον διαλύτη με το προσδιοριζόμενο συστατικό σε έναν θερμαινόμενο θάλαμο για απομάκρυνση του διαλύτη με ατμοποίηση. Μετά την ατμοποίηση το προς ανάλυση συστατικό επάνω στον ιμάντα ή στο σύρμα εισέρχεται στην περιοχή της πηγής ιοντισμού, όπου πραγματοποιείται εκρόφηση και ιοντισμός. Ένας νέος και πολλά υποσχόμενος τρόπος διασύνδεσης, που επίσης διατίθεται στο εμπόριο, είναι ο θερμοψεκασμός (thermospray). Η διασύνδεση αυτή επιτρέπει την κατ ευθείαν εισαγωγή όλου του υγρού έκλουσης από τη στήλη με ταχύτητες ροής έως και 2 ml/min. Στη διασύνδεση αυτή το υγρό ατμοποιείται καθώς διέρχεται μέσα από ένα ανοξείδωτο, θερμαινόμενο τριχοειδή θάλαμο σχηματίζοντας νέφος σωματιδίων αποτελούμενα από το διαλύτη και μόρια του μετρούμενου συστατικού. Στο σχηματιζόμενο νέφος, το συστατικό ιοντίζεται μέσω ενός μηχανισμού ανταλλαγής φορτίου με ένα άλας, όπως το οξικό αμμώνιο, που προστίθεται στο διαλύτη έκλουσης. Συνεπώς, θερμοψεκασμός δεν είναι μόνο ένας τρόπος διασύνδεσης αλλά και μια πηγή ιοντισμού. Τα προκύπτοντα φάσματα είναι γενικώς απλά και παρέχουν στοιχεία για το μοριακό βάρος, αλλά στερούνται των λεπτομερειών που επιτυγχάνονται με τα αντίστοιχα φάσματα πρόσκρουσης ηλεκτρονίων, που είναι τόσο χρήσιμα σε περιπτώσεις ταυτοποίησης. Επιπλέον η διασύνδεση θερμοψεκασμού μπορεί να εφαρμοστεί μόνο για πολικά μόρια και κινητές πολικές φάσεις, που μπορούν να διαλύουν ένα άλας όπως το οξικό αμμώνιο. Με αυτούς τους περιορισμούς η διασύνδεση θερμοψεκασμού παρέχει φάσματα για ευρεία περιοχή μη πτητικών και θερμικά σταθερών ενώσεων, όπως πεπτίδια και νουκλεοτίδια. Έχουν αναφερθεί όρια ανίχνευσης από 1 έως 10 pg. Πρόσφατα, άρχισε να διατίθεται στο εμπόριο μια νέα διασύνδεση που καθιστά εφικτή την απόκτηση φασμάτων ιοντισμού με πρόσκρουση ηλεκτρονίων ή με χημικό ιοντισμό. Στη διάταξη αυτή πραγματοποιείται ταυτόχρονα θερμική εκνέφωση και απομάκρυνση διαλύτη, για την παραγωγή ενός μίγματος μορίων συστατικών και διαλύτη στην αέρια φάση. Το νέφος των σωματιδίων επιτυγχάνεται με ένα ακροφύσιο στην περιοχή του κενού, όπου απομακρύνονται με άντληση τα μόρια της κινητής φάσης. Εδώ ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενός διαχωριστή ορμής. Τα μόρια του αναλυόμενου συστατικού ιοντίζονται στη συνέχεια με μια δέσμη ηλεκτρονίων ή με χημικό τρόπο (Skoog, et al., 2007). ~ 21 ~

40 Εφαρμογή συζευγμένων τεχνικών στην ανάλυση φαρμακευτικών ουσιών Στις μέρες μας οι συζευγμένες τεχνικές αναφέρονται συνήθως στη σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μάζας και αποτελούν την πιο δημοφιλή τεχνική στον προσδιορισμό των φαρμακευτικών ουσιών και των προϊόντων μετατροπής τους. Με τη τεχνική αυτή μπορούν να ανιχνευτούν φαρμακευτικές ενώσεις με χαρακτηριστικά όπως μεγάλη πολικότητα, πτητικότητα και θερμική ευαισθησία που είναι παρόντες στο περιβάλλον σε πολύ χαμηλά επίπεδα συγκεντρώσεων. Για την απόκτηση επαρκούς ποσότητας δεδομένων ανά κορυφή με τη χρήση HPLC ή UHPLC, μόνο φασματόμετρα μάζας με μικρούς χρόνους υστέρησης (dwell time) και μικρές καθυστερήσεις μεταξύ των σαρώσεων μπορούν να συζευχθούν. Εξαιτίας της υψηλής ευαισθησίας, εκλεκτικότητας και ανθεκτικότητας (Plumb et al., 2004), η απόκτηση δεδομένων με την τεχνική παρακολούθησης επιλεγμένης αντίδρασης (SRM) (Kaufmann et al., 2012; Yu et al., 2011; Gracia-Lor et al., 2010) αποτελεί το πιο αποτελεσματικό εργαλείο για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των φαρμακευτικών ουσιών σε χαμηλές συγκεντρώσεις στα διάφορα περιβαλλοντικά υποστρώματα (Hao et al., 2007). Άλλοι αναλυτές μαζών όπως είναι η τετραπολική γραμμική παγίδα ιόντων (quadrupole linear ion trap MS, QqLIT-MS) (Gros et al., 2012) και ο τετραπολικός ανιχνευτής χρόνου πτήσης (QTOF-MS) (Min et al., 2009; Farre et al., 2008) χρησιμοποιούνται επίσης μαζί με την UHPLC. Στην περίπτωση του MS/MS η σημασία του καλού χρωματογραφικού διαχωρισμού συχνά παραβλέπεται λόγω του διαχωρισμού που αποκτάται μέσω της λειτουργίας SRM με αποτέλεσμα αυτό να οδηγεί σε καταστολή του σήματος και σε ισοβαρείς παρεμποδίσεις. Αυτό αποτελεί σπουδαίο πρόβλημα ειδικά σε τέτοιου είδους αναλύσεις όπου τα συστατικά της μήτρας μπορούν να παρεμποδίσουν την ανίχνευση των αναλυτών που βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις (Petrovic et al., 2006). Ο συνδυασμός συζευγμένης φασματομετρίας μάζας με UHPLC μπορεί να μειώσει σημαντικά το πρόβλημα της συνέκλουσης και της καταστολής του σήματος που μπορεί να προκληθεί από τις παρεμποδίσεις της μήτρας, τον ιοντισμό των δειγμάτων (Wu et al., 2010) και τη φασματομετρική επικάλυψη, καθώς οι χρωματογραφικές κορυφές είναι στενότερες. Στην περίπτωση αυτή όμως, τα φασματόμετρα πρέπει να αποκτούν φάσματα με πιο ταχύ ρυθμό για την αποφυγή μείωσης της ακρίβειας. Αυτός είναι και ο κύριος λόγος που τα τελευταία χρόνια οι αναλυτές προτιμούν τη σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με τους τετραπολικούς ανιχνευτές χρόνου πτήσης, η οποία μπορεί να διαχειριστεί το πρόβλημα της ταχύτητας και να ανταποκριθεί στις αντίστοιχες απαιτήσεις (Gracia-Lor et al., 2011). ~ 22 ~

41 1.3 ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ Εισαγωγή Φασματομετρία μάζας καλείται η τεχνική κατά την οποία τα συστατικά ενός δείγματος μετατρέπονται σε ταχύτατα κινούμενα ιόντα και διαχωρίζονται σε σχέση µε το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z). Η αρχή της τεχνικής βασίζεται στην παρατήρηση ότι τα θετικά ιόντα αποκλίνουν της φοράς τους κατά την κίνηση τους σε ηλεκτρικά ή μαγνητικά πεδία. Η φασματομετρία μάζας προσφέρει πληροφορίες για την ποιοτική και ποσοτική σύσταση αγνώστων μιγμάτων ανόργανων και οργανικών ενώσεων, τη χημική δομή πολύ μεγάλου αριθμού ενώσεων, την παρουσία και το ποσοστό ισοτόπων και τη δομή και σύσταση στερεών επιφανειών. Η φασματομετρία μάζας μπορεί να συνδυασθεί µε την αέρια χρωματογραφία (GC) ή την υγρή χρωματογραφία (LC) και παρέχει στον αναλυτή τις ονομαζόμενες συζευγμένες τεχνικές GC- MS/MS ή LC-MS/MS, η συμβολή των οποίων τόσο στην έρευνα όσο και σε εφαρμογές ρουτίνας θεωρείται ανεκτίμητη. Πίνακας 1.3: Εφαρμογές της φασματομετρίας μαζών. 1. Διευκρίνιση δομής οργανικών και βιολογικών μορίων 2. Προσδιορισμός μοριακού βάρους πεπτιδίων, πρωτεϊνών και ολιγονουκλεοτιδίων 3. Αναγνώριση των συστατικών χρωματογραφημάτων λεπτής στιβάδας και χάρτου 4. Προσδιορισμός αλληλουχίας αμινοξέων σε δείγματα πολυπεπτιδίων και πρωτεϊνών 5. Ανίχνευση και αναγνώριση ουσιών που διαχωρίζονται με χρωματογραφία και ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές 6. Ταυτοποίηση φαρμακευτικών ουσιών και των μεταβολιτών τους στο αίμα, στα ούρα και τον σίαλο 7. Παρακολούθηση αερίων στην εκπνοή ασθενών κατά τη διάρκεια εγχείρησης 8. Έλεγχος παρουσίας φαρμακευτικών ουσιών στο αίμα καθαρόαιμων αλόγων ιπποδρόμου και αθλητών Ολυμπιάδων 9. Χρονολόγηση αρχαιολογικών δειγμάτων 10. Ανάλυση σωματιδίων αερολυμάτων 11. Προσδιορισμός υπολειμμάτων εντομοκτόνων στα τρόφιμα 12. Παρακολούθηση πτητικών οργανικών ουσιών στα αποθέματα ύδατος Γενική περιγραφή των τμημάτων του οργάνου Ένα συνηθισμένο φασματόμετρο μάζας αποτελείται από τα εξής τμήματα: α) Σύστημα εισαγωγής του δείγματος. Με τη βοήθεια αυτού του συστήματος γίνεται η εισαγωγή του δείγματος στο όργανο. Ο σκοπός του συστήματος εισόδου είναι να αφήνει ένα πολύ μικρό ποσό του δείγματος (ένα μg ή λιγότερο) να εισέρχεται στο φασματόμετρο μαζών, όπου τα ~ 23 ~

42 συστατικά του μετατρέπονται σε ιόντα σε αεριώδη κατάσταση. Συχνά το σύστημα εισαγωγής περιλαμβάνει και ένα σύστημα εξαέρωσης στερεών ή υγρών δειγμάτων. β) Πηγή ιοντισμού. Σ αυτό το τμήμα του οργάνου τα συστατικά του δείγματος μετατρέπονται σε ιόντα είτε µε βομβαρδισμό µε ηλεκτρόνια, ιόντα, µόρια ή φωτόνια είτε µε εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου ή υψηλής θερμοκρασίας. Σε πολλές περιπτώσεις σύστημα εισαγωγής και πηγή ιοντισμού συνδυάζονται σε μια ενιαία μονάδα. Στη συνέχεια τα παραχθέντα ιόντα επιταχύνονται και εισέρχονται στον αναλυτή μαζών. γ) Αναλυτής μαζών. Εδώ ο διαχωρισμός των ιόντων βασίζεται στον λόγο μάζας προς φορτίο (m/z) των ιόντων της ουσίας. δ) Μεταλλάκτης (ανιχνευτής). Σ αυτό το τμήμα του οργάνου γίνεται η συλλογή των ιόντων που διαχωρίστηκαν και η μετατροπή τους σε ηλεκτρικό σήμα. ε) Επεξεργαστής σήματος. Το ηλεκτρικό σήμα που λαμβάνεται μετατρέπεται σε ψηφιακό μέσω ενός μετατροπέα αναλογικού σήματος σε ψηφιακό (analog to digital converter, ADC). Στη συνέχεια τα δεδομένα μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία και να αποθηκευτούν στη μνήμη ηλεκτρονικού υπολογιστή. Στο σχήμα 1.1 δίνεται ένα διάγραμμα των κυρίων τμημάτων ενός τυπικού φασματόμετρου μαζών. στ) Σύστημα κενού. Σχήμα 1.1: Κύρια τμήματα ενός φασματόμετρου μαζών. ~ 24 ~

43 1.3.3 Σύστημα εισαγωγής του δείγματος Ο σκοπός του συστήματος εισαγωγής δείγματος είναι να επιτρέπει την εισαγωγή ενός αντιπροσωπευτικού δείγματος στην πηγή ιοντισμού με ελάχιστη απώλεια κενού. Το κλασσικότερο και απλούστερο σύστημα εισαγωγής είναι αυτό της μεμονωμένης εισαγωγής (batch inlet system), όπου το δείγμα εξαερώνεται σε έναν εξωτερικό χώρο αποθήκευσης και στη συνέχεια αφήνεται να διαρρεύσει προς την κενή περιοχή ιοντισμού. Για τα υγρά δείγματα, μια μικρή ποσότητα του δείγματος εισάγεται στον χώρο, συνήθως με μικροσύριγγα. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται σύστημα κενού για να επιτευχθεί πίεση ατμών δείγματος 10-4 έως 10-5 torr. Το σύστημα εισαγωγής είναι συχνά επενδυμένο με ύαλο για να αποφευχθούν απώλειες πολικών ουσιών λόγω προσρόφησης. Τα στερεά και μη πτητικά υγρά μπορούν να εισαχθούν στην περιοχή ιοντισμού με έναν δειγματολήπτη-υποδοχέα (probe) που διεισδύει στο όργανο με μηχανισμό που δεν επηρεάζει το κενό. Το σύστημα αυτό είναι σχεδιασμένο έτσι, ώστε να περιορίζει το όγκο του αέρα, που πρέπει να αντλείται από το σύστημα κατά την εισαγωγή του δείγματος στην περιοχή ιοντισμού. Οι δειγματολήπτες αυτοί χρησιμοποιούνται επίσης, όταν η ποσότητα του δείγματος είναι περιορισμένη, επειδή έτσι καταναλώνεται πολύ λιγότερο δείγμα απ ότι με το σύστημα μεμονωμένης εισαγωγής. Τέλος, τα φασματόμετρα μαζών συνδυάζονται συχνά με συστήματα αέριας χρωματογραφίας ή υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ή στήλες τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης, ώστε να είναι δυνατός ο διαχωρισμός και ο προσδιορισμός των συστατικών πολύπλοκων δειγμάτων. Η σύνδεση μιας χρωματογραφικής ή ηλεκτροφορητικής στήλης με ένα φασματόμετρο μαζών απαιτεί ειδικά συστήματα εισαγωγής (Skoog, et al., 2007), όπως αυτά που περιγράφονται στην υποενότητα Πηγές ιοντισμού Το αρχικό στάδιο σε μια μέτρηση με φασματομετρία μαζών είναι ο σχηματισμός των ιόντων του αέριου αναλύτη, διαδικασία καθοριστική για τους στόχους της μέτρησης και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Οι πηγές ιοντισμού που χρησιμοποιούνται στη μοριακή φασματομετρία μαζών διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τις πηγές αέριας φάσης (gas phase sources) και τις πηγές εκρόφησης (desorption sources). Στον πίνακα 4 αναγράφονται οι πηγές ιοντισμού που ανήκουν στις δύο παραπάνω κατηγορίες. Στις πρώτες το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεται, ενώ στις τελευταίες το δείγμα σε στερεά ή υγρή κατάσταση, μετατρέπεται απευθείας σε αεριώδη ιόντα. Πλεονεκτήματα των πηγών εκρόφησης είναι ότι μπορούν να εφαρμοσθούν σε μη πτητικά ή θερμικώς ασταθή δείγματα. Οι πηγές αέριας φάσης συνήθως περιορίζονται σε θερμικώς σταθερές ενώσεις, με σημεία ζέσεως μικρότερα από περίπου 500 o C. Η προϋπόθεση αυτή περιορίζει την εφαρμογή των πηγών αυτών σε ενώσεις με μοριακά βάρη μικρότερα από περίπου 10 3 Da. Οι πηγές εκρόφησης δεν ~ 25 ~

44 Πίνακας 1.4: Πηγές ιοντισμού φασματομετρίας μαζών. Βασικός τύπος Όνομα Παράγοντες ιοντισμού Αέριας φάσης Πρόσκρουσης ηλεκτρονίων Ηλεκτρόνια μεγάλης ενέργειας Χημικού ιοντισμού Αντιδραστήρια-ιόντα σε αέρια κατάσταση Ιοντισμού πεδίου Ηλεκτρόδιο υψηλού δυναμικού Εκρόφησης Εκρόφησης πεδίου Ηλεκτρόδιο υψηλού δυναμικού Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό Ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο Ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας Ακτίνα λέιζερ Εκρόφησης πλάσματος Θραύσματα σχάσης 252 Cf Βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας Δέσμη ατόμων μεγάλης ενέργειας Φασματομετρία μαζών δευτερογενούς ιόντος Δέσμη ιόντων μεγάλης ενέργειας Ιοντισμός με θερμοψεκασμό Υψηλή θερμοκρασία απαιτούν εξάτμιση των μορίων του αναλύτη και μπορούν να εφαρμοσθούν σε ενώσεις με μοριακά βάρη έως και 10 5 Da. Οι πηγές ιοντισμού διακρίνονται επίσης σε μαλακές και σκληρές. Οι σκληρές πηγές μεταδίδουν στα μόρια του αναλύτη αρκετή ενέργεια, ώστε να παραμείνουν σε έντονα διεγερμένη ενεργειακή κατάσταση. Στη συνέχεια, η αποδιέγερση περιλαμβάνει επιπλέον σπάσιμο δεσμών και παραγωγή ιοντικών θραυσμάτων με λόγους m/z μικρότερους από του μοριακού ιόντος. Οι μαλακές πηγές προκαλούν περιορισμένη θραύση. Κατά συνέπεια, το λαμβανόμενο φάσμα μαζών συχνά αποτελείται από την κορυφή του μοριακού ιόντος και λίγες μόνο επιπλέον κορυφές. Οι πολλές κορυφές σε ένα φάσμα σκληρής πηγής παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τα είδη των δραστικών ομάδων και επομένως για τη δομή των αναλυτών. Τα φάσματα μαλακών πηγών είναι χρήσιμα επειδή παρέχουν ακριβείς πληροφορίες ως προς το μοριακό βάρος των μορίων του αναλύτη (Skoog, et al., 2007). Παρακάτω περιγράφεται λεπτομερώς ο ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό, ο οποίος χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό Η φασματομετρία μαζών με ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό (electrospray ionization/mass spectrometry, ESI/MS) περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1984 και σήμερα αποτελεί μια από τις σημαντικότερες τεχνικές για μετρήσεις βιομορίων, όπως πολυπεπτίδια, πρωτεΐνες και ολιγονουκλεοτίδια με μοριακά βάρη Da. ~ 26 ~

45 Επιπλέον, η τεχνική αυτή έχει αρχίσει να βρίσκει εφαρμογές στον χαρακτηρισμό ανόργανων ουσιών και συνθετικών πολυμερών. Ο ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό πραγματοποιείται σε ατμοσφαιρική πίεση και θερμοκρασία. Το διάλυμα του δείγματος αντλείται μέσω μιας ανοξείδωτης τριχοειδούς βελόνας με ταχύτητα μερικών μl/min. Η βελόνα βρίσκεται σε δυναμικό αρκετών kv ως προς ένα κυλινδρικό ηλεκτρόδιο που περιβάλλει τη βελόνα. Οι δημιουργούμενες φορτισμένες μικρές σταγόνες διέρχονται μέσω ενός τριχοειδούς, όπου ο διαλύτης εξατμίζεται και φορτίζονται τα μόρια του αναλύτη. Καθώς οι σταγόνες μικραίνουν λόγω της εξαέρωσης του διαλύτη, η πυκνότητα φορτίου αυξάνει και πραγματοποιείται εκρόφηση των ιόντων στο περιβάλλον αέριο. Ενδιαφέρον και χρήσιμο χαρακτηριστικό της διαδικασίας ηλεκτροψεκασμού είναι ότι η θραύση μεγάλων και θερμικά ευπαθών βιομορίων είναι περιορισμένη. Επιπλέον τα παραγόμενα ιόντα είναι πολυσθενή, οπότε οι τιμές m/z είναι αρκετά μικρές και ανιχνεύονται εύκολα με τετραπολικά όργανα, που καλύπτουν περιοχή μοριακών βαρών 1500 ή μικρότερη. Ένα επιπλέον χαρακτηριστικό του ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό είναι ότι εύκολα προσαρμόζεται σε συστήματα άμεσης εισαγωγής δείγματος από στήλες υγρής χρωματογραφίας και ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές (Skoog, et al., 2007) Αρχή λειτουργίας ιοντισμού ESI Η αρχή της τεχνικής βασίζεται εν μέρει στη χημεία καθώς προαπαιτεί την παραγωγή φορτισμένων ιόντων του αναλύτη, πριν αυτά εισέλθουν στο φασματόμετρο μάζας. Όπως φαίνεται και στο σχήμα 1.2, η εκροή από την υγρή χρωματογραφία νεφελοποιείται μέσα στο θάλαμο ψεκασμού σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης παρουσία ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου και θερμαινόμενου αερίου ξήρανσης. Το ηλεκτροστατικό πεδίο σχηματίζεται μεταξύ του εκνεφωτή και του τριχοειδούς στο οποίο εφαρμόζεται υψηλό δυναμικό (3-6 kv). Ο ψεκασμός πραγματοποιείται σε ορθή γωνία ως προς το τριχοειδές. Με το σχεδιασμό αυτό ελαττώνεται ο θόρυβος που δημιουργούν τα σταγονίδια, αυξάνεται η ευαισθησία και διατηρείται το τριχοειδές καθαρό για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Στον διπλό ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό (dual ESI) χρησιμοποιείται ένας δεύτερος νεφελοποιητής για την εισαγωγή των ιόντων των μαζών αναφοράς. Ο μηχανισμός ιοντισμού παραμένει ο ίδιος. Ο ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό αποτελείται από τέσσερα στάδια. Αυτά είναι ο σχηματισμός ιόντων, η δημιουργία νεφελώματος, η αποδιαλύτωση των φορτισμένων σταγόνων και ο σχηματισμός ιόντων στην αέρια φάση. Στον ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης ο σχηματισμός των ιόντων πραγματοποιείται μέσω αρκετών μηχανισμών. Εάν η χημεία το αναλύτη, των διαλυτών και του ρυθμιστικού διαλύματος είναι η κατάλληλη, τότε τα ιόντα παράγονται στο διάλυμα πριν τη δημιουργία νεφελώματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την υψηλή συγκέντρωση ιόντων αναλύτη, γεγονός που συνεπάγεται με καλή ευαισθησία της πηγής ιοντισμού. Η ύπαρξη των ιόντων δεν απαιτείται πάντα στο ESI. ~ 27 ~

46 Σχήμα 1.2: Πηγή ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό. Μερικές ενώσεις που δεν ιοντίζονται στο διάλυμα έχουν ακόμη τη δυνατότητα να αναλυθούν. Η διαδικασία δημιουργίας νεφελώματος και η αποδιαλύτωση των φορτισμένων σταγόνων δημιουργούν ένα ισχυρό ηλεκτροστατικό φορτίο στην επιφάνεια των σταγονιδίων ψεκασμού. Αυτό μπορεί να προκαλέσει ιοντισμό στα μόρια του αναλύτη που βρίσκονται στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Η δημιουργία νεφελώματος (αερολύματος) πραγματοποιείται ως εξής: Το διάλυμα του δείγματος εισέρχεται στο θάλαμο ψεκασμού μέσω μιας βελόνας που ονομάζεται νεφελοποιητής. Η νεφελοποίηση και ο σχηματισμός του φορτίου πραγματοποιούνται, καθώς το απορρέον από το HPLC διάλυμα με τα ιόντα των αναλυτών εξέρχεται από το ακροφύσιο της βελόνας νεφελοποίησης. Η βελόνα έχει μηδενικό δυναμικό και περιβάλλεται από ένα ημικυλινδρικό ηλεκτρόδιο στο οποίο εφαρμόζεται υψηλό δυναμικό. Η διαφορά δυναμικού μεταξύ του νεφελοποιητή και του ηλεκτροδίου παράγει ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο (2 6 kv), το οποίο φορτίζει την επιφάνεια του εξερχόμενου υγρού και το διασπά σε σταγονίδια. Η ομόκεντρη ροή αερίου υψηλής πίεσης βοηθά τη νεφελοποίηση. Καθώς τα σταγονίδια διασκορπίζονται, ιόντα της ίδιας πολικότητας μεταναστεύουν επιλεκτικά στην επιφάνεια των σταγονιδίων εξαιτίας των ηλεκτροστατικών δυνάμεων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το δείγμα να φορτίζεται και να διασκορπίζεται μέσα από ένα τέλειο ψεκασμό φορτισμένων σταγονιδίων, εξ ου και το όνομα ηλεκτροψεκασμός. Επειδή το διάλυμα με το δείγμα δεν θερμαίνεται κατά το σχηματισμό του αερολύματος, ο ESI δεν διασπά θερμικά τους περισσότερους αναλύτες. Πριν τα ιόντα εισέλθουν στο φασματόμετρο μαζών, ο διαλύτης πρέπει να απομακρυνθεί ώστε να παρέχει το ελεύθερο ιόν. Ένα ρεύμα αντιρροής ουδέτερου και θερμαινόμενου αερίου ξήρανσης, όπως είναι το άζωτο, εξατμίζει το διαλύτη και συρρικνώνει τη διάμετρο των σταγονιδίων με αποτέλεσμα να αυξάνεται η πυκνότητα ~ 28 ~

47 Σχήμα 1.3: Εκρόφηση ιόντων από το διάλυμα. φορτίου στην επιφάνειά τους. Τα σταγονίδια εξακολουθούν να συρρικνώνονται έως ότου οι απωστικές ηλεκτροστατικές δυνάμεις Coulomb υπερνικήσουν τις δυνάμεις συνοχής (επιφανειακή τάση), προκαλώντας τη διάσπασή τους. Η ίδια διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου σχηματιστούν σταγονίδια υψηλής πυκνότητας επιφανειακών φορτίων. Όταν η πυκνότητα του φορτίου πλησιάσει την τιμή των 10 8 V/cm 3 περίπου, πραγματοποιείται εκρόφηση των ιόντων στην αέρια φάση (άμεση εκδίωξη ελεύθερων ιόντων από την επιφάνεια των σταγονιδίων). Αυτά τα ιόντα έλκονται και κατευθύνονται μέσω της οπής του τριχοειδούς στην περιοχή του οπτικού συστήματος ιόντων και έπειτα στον αναλυτή μαζών (Agilent Technologies, 2011) Αναλυτές μαζών Ένας αναλυτής μαζών μετρά ιόντα στην αέρια φάση σε συνάρτηση με το λόγο μάζα προς φορτίο των ιόντων αυτών (m/z), όπου το φορτίο παράγεται με προσθήκη ή απώλεια ενός πρωτονίου, ηλεκτρονίου, κατιόντος ή ανιόντος. Η προσθήκη του φορτίου επιτρέπει στο μόριο να αλληλεπιδράσει με ηλεκτρικά πεδία, επιτρέποντας έτσι τη μέτρηση της μάζας του. Διακριτική ικανότητα ή διακρισιμότητα (resolution, R) είναι η ικανότητα ενός φασματόμετρου μάζας να διαχωρίζει ιόντα με διαφορετικούς λόγους μάζας προς φορτίο σύμφωνα με τη σχέση R = m / m όπου m είναι η μάζα της πρώτης κορυφής και m η διαφορά μαζών δύο διαδοχικών κορυφών. Μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα συνεπάγεται άμεσα με την αυξημένη ικανότητα του οργάνου να διαχωρίσει ιόντα. Δυο κορυφές θεωρείται ότι διαχωρίζονται, όταν η επικάλυψή τους δεν υπερβαίνει ένα δεδομένο κλάσμα του ύψους τους (συνήθως 10 %). Συνεπώς, ένα φασματόμετρο µε διακριτική ικανότητα 4000 μπορεί να διακρίνει κορυφές με λόγους m/z 400,0 και 400,1 ή 40,00 και 40,01. Η διακριτική ικανότητα ενός φασματογράφου μαζών καθορίζει τη χρήση του και κατηγοριοποιεί τα όργανα σε όργανα χαμηλής και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας (Skoog, et al., 2007). ~ 29 ~

48 Οι κυριότεροι αναλυτές μαζών είναι οι αναλυτές μαγνητικού τομέα (ή απλής εστίασης), τα φασματόμετρα διπλής εστίασης, το τετραπολικό φασματόμετρο μαζών, η τετραπολική παγίδα ιόντων, ο αναλυτής μαζών κυκλοτρονικού συντονισμού ιόντων με μετασχηματισμό Fourier και οι αναλυτές μαζών χρόνου πτήσης. Παρακάτω περιγράφεται αναλυτικά η λειτουργία δύο εκ των σημαντικότερων αναλυτών μαζών που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία Τετραπολικός αναλυτής μαζών Ο συνηθέστερος τύπος φασματόμετρου μαζών, που χρησιμοποιείται στη φασματομετρία μαζών είναι ο τετραπολικός αναλυτής μαζών, ο οποίος απεικονίζεται στο σχήμα 4. Ο τετραπολικός αναλυτής μαζών έχει μικρό μέγεθος, μικρότερο κόστος και είναι μηχανικά σταθερότερος από τους περισσότερους τύπους φασματόμετρων μαζών. Επίσης έχει το πλεονέκτημα των υψηλών ταχυτήτων σάρωσης, ώστε ολόκληρο το φάσμα μαζών να λαμβάνεται σε χρόνο μικρότερο των 100 ms, το οποίο είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για σαρώσεις χρωματογραφικών κορυφών σε πραγματικό χρόνο. Σήμερα, τα τετράπολα είναι οι περισσότερο χρησιμοποιούμενοι αναλυτές μαζών. Καρδιά του τετραπολικού φασματόμετρου είναι οι τέσσερις παράλληλες κυλινδρικές ράβδοι, οι οποίες δρουν ως ηλεκτρόδια. Οι διαγώνιες ράβδοι συνδέονται ηλεκτρικά μεταξύ τους. Το ένα ζεύγος συνδέεται με τον θετικό πόλο μιας πηγής μεταβλητής τάσης DC, ενώ το άλλο με τον αρνητικό πόλο της πηγής. Επιπλέον σε κάθε ζεύγος ράβδων εφαρμόζονται μεταβλητές τάσεις AC (με συχνότητα στην περιοχή ραδιοσυχνοτήτων), που μεταξύ τους βρίσκονται σε διαφορά φάσης 180 ο. Για να ληφθεί το φάσμα μαζών με αυτή τη συσκευή, τα ιόντα επιταχύνονται στο χώρο ανάμεσα στις ράβδους με ένα δυναμικό 5 έως 10 V. Τα εναλλασσόμενα και συνεχή δυναμικά των ράβδων αυξάνουν συγχρόνως διατηρώντας όμως το λόγο τους Σχήμα 1.4: Διάταξη τετραπολικού ανιχνευτή μαζών. ~ 30 ~

49 σταθερό. Σε κάποια χρονική στιγμή όλα τα ιόντα, εκτός από αυτά που έχουν μια συγκεκριμένη τιμή λόγου m/z, φθάνουν στις ράβδους και μετατρέπονται σε ουδέτερα μόρια. Έτσι φθάνουν στον μεταλλάκτη μόνο τα ιόντα, των οποίων οι τιμές m/z βρίσκονται σε μια στενή περιοχή τιμών του λόγου m/z. Με τα τετραπολικά όργανα μπορούν εύκολα να διακριθούν ιόντα, που διαφέρουν κατά μια μονάδα μάζας. Τα τετραπολικά φασματόμετρα μαζών μοιάζουν περισσότερο µε ένα φωτόμετρο µε οπτικό φίλτρο μεταβαλλόμενης ζώνης παρά µε ένα οπτικό φασματόμετρο, στο οποίο το φράγμα διασπείρει παράλληλα το φάσμα ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Για το λόγο αυτό θα ήταν ορθότερο να χαρακτηρίσουμε τη συσκευή αυτή ως φίλτρο μαζών (Skoog, et al., 2007) Αναλυτές μαζών τύπου «χρόνου πτήσης» Στα όργανα τύπου «χρόνου πτήσης» (Time Of Flight, TOF) διάταξη 5 τα θετικά ιόντα παράγονται περιοδικά μετά από βομβαρδισμό του δείγματος με σύντομους παλμούς ηλεκτρονίων, δευτερογενών ιόντων ή φωτονίων ακτινοβολίας λέιζερ. Οι παλμοί έχουν τυπικές συχνότητες 10 έως 50 khz και διάρκεια 0,25 μs. Τα ιόντα που παράγονται με τον τρόπο αυτόν επιταχύνονται σε παλμικό ηλεκτρικό πεδίο 10 3 έως 10 4 V ίδιας συχνότητας με τον παλμό, που προκαλεί τον ιοντισμό. Αυτός όμως εφαρμόζεται με μια μικρή χρονική υστέρηση. Τα επιταχυνόμενα σωματίδια διέρχονται μέσω ενός θάλαμο πορείας, ο οποίος είναι απαλλαγμένος από πεδία και έχει μήκος περίπου ένα μέτρο. Επειδή όλα τα ιόντα έχουν την ίδια κινητική ενέργεια τη στιγμή που εισέρχονται στον θάλαμο, οι ταχύτητές τους στον θάλαμο πρέπει να είναι αντιστρόφως ανάλογες με τις μάζες τους. Τα ελαφρότερα σωματίδια φθάνουν στον ανιχνευτή νωρίτερα σε σχέση με τα βαρύτερα. Οι τυπικοί «χρόνοι πτήσης» των σωματιδίων κυμαίνονται από 1 έως 30 μs. Ο μεταλλάκτης στα φασματόμετρα μαζών τύπου «χρόνου πτήσης» είναι συνήθης ένας ηλεκτονιοπολλαπλασιαστής, του οποίου η έξοδος συνδέεται με τις κάθετες πλάκες απόκλισης ενός ηλεκτρονικού παλμογράφου, ενώ η οριζόντια σάρωση του παλμογράφου συγχρονίζεται με τους παλμούς επιτάχυνσης. Στην οθόνη του παλμογράφου εμφανίζεται σχεδόν ακαριαία το φάσμα μαζών. Οι τυπικοί χρόνοι Σχήμα 1.5: Διάταξη ανιχνευτή τύπου «χρόνου πτήσης». ~ 31 ~

50 πτήσης είναι της τάξης μικροδευτερολέπτων και για τον λόγο αυτό η επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων απαιτεί ταχύτατα ηλεκτρονικά κυκλώματα. Διακυμάνσεις στην ενέργεια των ιόντων και στην αρχική θέση εισόδου στο θάλαμο προκαλούν διεύρυνση των κορυφών, η οποία περιορίζει γενικά την επιτυγχανόμενη διακριτική ικανότητα. Από άποψη διακριτικής ικανότητας και επαναληψιμότητας τα όργανα, που χρησιμοποιούν αναλυτές «χρόνου πτήσης» δεν παρέχουν τόσο ικανοποιητικά αποτελέσματα, όσο τα όργανα στα οποία χρησιμοποιούνται μαγνητικοί αναλυτές ή τετράπολα. Ωστόσο ορισμένα πλεονεκτήματά τους αντισταθμίζουν σε κάποιο βαθμό τα μειονεκτήματα αυτά. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων τους είναι η απλή κατασκευή και η μηχανική ανθεκτικότητα, η εύκολη πρόσβαση στην πηγή ιόντων, η σχεδόν απεριόριστη περιοχή μαζών και η ταχύτατη συλλογή και επεξεργασία των αναλυτικών δεδομένων (Skoog, et al., 2007) Μεταλλάκτες Στο εμπόριο διατίθενται πολλοί τύποι μεταλλακτών για τα φασματόμετρα μαζών. Ο ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής (electron multiplier) είναι ο προτιμότερος μεταλλάκτης για μετρήσεις ρουτίνας. Ο ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής διακριτώνδυνόδων (discrete-dynode electron multiplier) μοιάζει με τον φωτοπολλαπλασιαστή υπεριώδους/ορατής ακτινοβολίας, όπου κάθε δύνοδος βρίσκεται σε υψηλότερο δυναμικό από την προηγούμενη. Η κάθοδος και οι πολλαπλές δύνοδοι έχουν επιφάνειες Cu/Be, από τις οποίες εκπέμπονται ριπές ηλεκτρονίων, όταν προσκρούουν σ αυτές ιόντα ή ηλεκτρόνια υψηλών ενεργειών. Αντίστοιχα, ο ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής συνεχούς δυνόδου κατασκευάζεται από ύαλο υψηλής περιεκτικότητας σε μόλυβδο. Κατά μήκος του εφαρμόζεται ένα δυναμικό 1,8 έως 2 kv. Ιόντα, τα οποία προσκρούουν στην επιφάνεια κοντά στην είσοδο, εκβάλλουν ηλεκτρόνια τα οποία στη συνέχεια αναπηδούν κατά μήκος της επιφάνειας προκαλώντας την αποδέσμευση περισσότερων ηλεκτρονίων μετά από κάθε πρόσκρουση. Οι ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστές μπορούν να χρησιμοποιηθούν στους τετραπολικούς αναλυτές μαζών, στους οποίους οι δέσμες ιόντων που εισάγονται είναι χαμηλής κινητικής ενέργειας. Στις περιπτώσεις αυτές τα ιόντα μετά την έξοδό τους από τον αναλυτή, επιτυγχάνονται τόσο ώστε να αποκτήσουν κινητική ενέργεια πολλών χιλιάδων ηλεκτρονιοβόλτ (ev) πριν προσκρούσουν στην πρώτη επιφάνεια του μεταλλάκτη. Για τη μέτρηση ακτινοβολίας χαμηλής ισχύος χρησιμοποιούνται οι φωτοπολλαπλασιαστές (photonmultiplier tubes, PMTs). Η κάθοδος του φωτοπολλαπλασιαστή επικαλύπτεται με στρώμα φωτοευαίσθητου υλικού, το οποίο εκπέμπει ηλεκτρόνια όταν ακτινοβολείται. Η λυχνία περιλαμβάνει επιπλέον ηλεκτρόδια τα οποία ονομάζονται δύνοδοι. Η δύνοδος 1 συνδέεται με δυναμικό κατά 90 V θετικότερο του δυναμικού της καθόδου, με συνέπεια τα φωτοηλεκτρόνια να επιταχύνονται προς αυτήν. Με την πρόσκρουση τους επάνω στη δύνοδο, κάθε ~ 32 ~

51 ηλεκτρόνιο προκαλεί εκπομπή νέων ηλεκτρονίων από την επιφάνειά της, τα οποία με τη σειρά τους επιταχύνονται προς τη δύνοδο 2, η οποία συνδέεται με δυναμικό κατά 90 V θετικότερο από αυτό της δυνόδου 1. Και πάλι εκπέμπονται νέα ηλεκτρόνια από κάθε ηλεκτρόνιο που προσκρούει στη δύνοδο 2. Όταν ο μηχανισμός αυτός επαναληφθεί εννέα φορές, για κάθε φωτοηλεκτρόνιο θα έχουν παραχθεί 10 6 έως 10 7 ηλεκτρόνια. Αυτός ο «καταρράκτης» ηλεκτρονίων συλλέγεται τελικά από την άνοδο και το προκύπτον ρεύμα ενισχύεται ηλεκτρονικά και μετρείται. Οι φωτοπολλαπλασιαστές είναι υπερευαίσθητοι στην υπεριώδη και ορατή ακτινοβολία και επιπλέον χαρακτηρίζονται από μεγάλη ταχύτητα απόκρισης. Η χρήση των φωτοπολλαπλασιαστών περιορίζεται στις περιπτώσεις μετρήσεων ακτινοβολίας χαμηλής ισχύος, διότι αν δεχθούν έντονο φως μπορεί να προκληθεί μόνιμη βλάβη στη φωτοευαίσθητη επιφάνειά τους. Με κατάλληλο εξωτερικό κύκλωμα οι φωτοπολλαπλασιαστές μπορούν να ανιχνεύσουν την άφιξη στη φωτοκάθοδο ενός και μόνο φωτονίου. Στο φαρανταϊκό κύπελλο (Faraday cup) ο μεταλλάκτης ευθυγραμμίζεται έτσι, ώστε τα ιόντα που εξέρχονται από τον αναλυτή να προσπίπτουν σε ένα ηλεκτρόδιοσυλλέκτη, το οποίο περιβάλλεται από έναν κλωβό Faraday. Ο κλωβός αποτρέπει τη διαφυγή τυχόν ανακλώμενων ιόντων και των δευτερογενών ηλεκτρονίων. Το ηλεκτρόδιο συλλογής έχει μια κλίση ως προς τη διαδρομή των εισερχόμενων ιόντων ώστε τα σωματίδια, που προσπίπτουν ή εγκαταλείπουν το ηλεκτρόδιο, να ανακλώνται προς τα τοιχώματα του κλωβού και όχι προς την είσοδό του. Το φορτίο των θετικών ιόντων που φθάνουν στο συλλέκτη εξουδετερώνεται με ροή ηλεκτρονίων από μια γείωση μεγάλης αντίστασης. Η δημιουργούμενη πτώση τάσης κατά μήκος της αντίστασης ενισχύεται με έναν ενισχυτή υψηλής εμπέδησης. Ο μεταλλάκτης αυτού του τύπου είναι λιγότερο ευαίσθητος από τους ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστές, επειδή λείπει η ενδογενής ενίσχυση. Σε μερικές περιπτώσεις χρησιμοποιούνται μεταλλάκτες τύπου σπινθηριστή (scintillation type). Οι μεταλλάκτες αυτοί αποτελούνται από λεπτό έλασμα αργιλίου, στο οποίο έχει διασπαρθεί κρυσταλλικός φθοριστής και το οποίο τοποθετείται στο παράθυρο ενός φωτοπολλαπλασιαστή. Όταν τα ιόντα (ή ηλεκτρόνια τα οποία παράγονται από τα ιόντα που προσκρούουν σε μια κάθοδο) συγκρούονται με τον φθοριστή, παράγονται σπινθηρισμοί φθορισμού, οι οποίοι ανιχνεύονται από τον φωτοπολλαπλασιαστή (Skoog, et al., 2007) Επεξεργαστής σήματος Η έξοδος των περισσότερων μεταλλακτών που χρησιμοποιούνται στα αναλυτικά όργανα είναι ένα αναλογικό σήμα. Για να αξιοποιηθούν τα πλεονεκτήματα των ψηφιακών ηλεκτρονικών και να γίνει η επεξεργασία δεδομένων με τη βοήθεια υπολογιστών, είναι αναγκαία η μετατροπή του αναλογικού σήματος σε ψηφιακό. Για τη μετατροπή αυτοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρκετές μέθοδοι με τις πιο γνωστές να είναι ο βαθμιδωτός ADC και ο ADC διαδοχικών προσεγγίσεων. ~ 33 ~

52 Η σύνδεση μεταξύ ενός φασματόμετρου μαζών και ενός ηλεκτρονικού υπολογιστή συνήθως παρέχει τη δυνατότητα ψηφιοποίησης του ενισχυμένου ιοντικού ρεύματος, καθώς και διαφόρων άλλων σημάτων που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο των οργανολογικών παραμέτρων, όπως είναι η θερμοκρασία της πηγής, η τάση επιτάχυνσης, η ταχύτητα σάρωσης και η ένταση του μαγνητικού πεδίου ή τα δυναμικά που εφαρμόζονται στους τετραπολικούς ανιχνευτές. Ο υπολογιστής καταγράφει τα δεδομένα που προέρχονται από το φασματόμετρο και τα μετατρέπει σε τιμές μαζών και εντάσεις κορυφών ώστε να καταστεί δυνατή η ερμηνεία των φασμάτων από το χειριστή (Skoog, et al., 2007) Σύστημα κενού Για τα φασματόμετρα μαζών απαιτείται η λειτουργία ενός πολύπλοκου συστήματος κενού για να διατηρεί χαμηλή πίεση (10-4 έως 10-8 torr) σε όλα τα τμήματα του οργάνου, εκτός από το τμήμα του επεξεργαστή σήματος και του συστήματος ανάγνωσης και καταγραφής των δεδομένων. Το υψηλό κενό είναι απαραίτητο, επειδή τα φορτισμένα σωματίδια, συμπεριλαμβανομένων και των ηλεκτρονίων, αλληλεπιδρούν με τα συστατικά της ατμόσφαιρας και καταστρέφονται (Skoog, et al., 2007). Στο QTOF-MS που χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία το κενό επιτυγχάνεται µε συνδυασμό αντλιών. H περιστροφική αντλία λαδιού (rough pump) μειώνει αρχικά την πίεση στην περιοχή των torr και επιπλέον έχει το ρόλο της υποστηρικτικής αντλίας για την αντλία υψηλού κενού. Το υψηλό κενό παρέχεται στο σύστημα από δυο στροβιλομοριακές αντλίες (turbomolecular pumps), που λειτουργούν χωρίς υγρά. Το υψηλό κενό που παρέχεται στο σύστημα από τις στροβιλομοριακές αντλίες είναι της τάξης των 10-7 torr (Agilent Technologies, 2011) Τεχνικές ανάλυσης στη φασματομετρία μαζών Ανεξάρτητα από τη μέθοδο ιοντισμού και την τεχνική διαχωρισμού που χρησιμοποιείται, οι τεχνικές ανάλυσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη φασματομετρία μαζών είναι: α) η τεχνική πλήρους σάρωσης (full scan), β) η τεχνική της επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (single ion monitoring, SIM), γ) η τεχνική της παρακολούθηση επιλεγμένης αντίδρασης (selected reaction monitoring, SRM ή multiple reaction monitoring, MRM) και δ) η συζευγμένη φασματομετρία μαζών (tandem mass spectrometry, MS/MS), η οποία διακρίνεται περαιτέρω σε δύο υποκατηγορίες τεχνικών σάρωσης: α) την τεχνική σάρωσης παραγόμενων ιόντων (product ion scan) και β) την τεχνική σάρωσης πρόδρομου ιόντος (precursor ion scan). Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των φαρμακευτικών ουσιών οι τεχνικές της πλήρους σάρωσης και της σάρωσης παραγόμενων ιόντων. ~ 34 ~

53 Σχήμα 1.6: Ανάλυση με την τεχνική της πλήρους σάρωσης (λειτουργία MS) Τεχνική πλήρους σάρωσης Στην τεχνική πλήρους σάρωσης λαμβάνονται πλήρη φάσματα μεταξύ δύο ακραίων τιμών m/z για καθορισμένο χρόνο. Η πλήρης σάρωση βοηθάει στον προσδιορισμό της ταυτότητας μιας άγνωστης ένωσης (προσδιορισμό µοριακού βάρους). Αυξάνοντας το χρόνο σάρωσης, αυξάνεται η ευαισθησία, καθώς ο συνολικός αριθμός των ιόντων που φθάνουν στον ανιχνευτή αυξάνεται. Η αύξηση της ευαισθησίας επιτυγχάνεται είτε µε μείωση του εύρους των μαζών σάρωσης, είτε µε αύξηση του χρόνου σάρωσης. Στην πρώτη περίπτωση, είναι δυνατόν να χαθούν αναλυτικές πληροφορίες, ενώ στη δεύτερη περίπτωση, μπορεί το φάσμα να µην είναι άρτιο (Hoffman and Stroobant, 2002) Συζευγμένη φασματομετρία μαζών (MS/MS) Η συζευγμένη φασματομετρία μαζών μπορεί να περιλαμβάνει δύο ή περισσότερα επίπεδα φασµατομετρικής ανάλυσης. Κάθε φασματόμετρο μαζών μπορεί να σαρώσει πλήθος δυναμικών, να επιλέξει ένα ιόν ή να μεταφέρει όλα τα ιόντα. Μεταξύ των διαφόρων επιπέδων MS τα ιόντα μπορούν να υποβληθούν σε διαφορετικές διαδικασίες, όπως σε σύγκρουση µε αδρανή ή δραστικά αέρια, σύγκρουση µε επιφάνειες, αλληλεπίδραση µε φως, ηλεκτρόνια ή άλλα ιόντα, επιτάχυνση, επιβράδυνση, ουδετεροποίηση, αποσύνθεση, κτλ. Η επιλογή ανάμεσα στους διάφορους αναλυτές MS σάρωσης ή µη σάρωσης, και ανάμεσα στις διάφορες διαδικασίες στις οποίες υποβάλλονται τα ιόντα μεταξύ των αναλυτών, παρέχει τη δυνατότητα πραγματοποίησης πολυάριθμων πειραμάτων MS/MS (Lemiere, 2001). Οι πληροφορίες που αποκτώνται στη συζευγμένη φασματομετρία μαζών μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην εύρεση της αλληλουχίας πεπτιδίων και ολιγομερών DNA/RNA, στον προσδιορισμό της δομής και σύνδεσης πολυσακχαριτών, στον καθορισμό της θέσης και της δομής των λιπαρών οξέων σε πολύπλοκα λιπίδια και στον προσδιορισμό άλλων δομικών στοιχείων (Skoog, et al., 2007). Στη συζευγμένη ~ 35 ~

54 Σχήμα 1.7: Ανάλυση με την τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων (λειτουργία MS/MS). φασματομετρία μαζών υπάρχουν διάφορες τεχνικές σάρωσης, όπως η τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων που αναλύεται παρακάτω Τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων Η τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική σάρωσης στην MS/MS. Σε αυτή ο πρώτος αναλυτής μαζών (MS1) χρησιμοποιείται για την επιλογή ενός ιόντος, το οποίο ονομάζεται πρόδρομο ή μητρικό ιόν, και στο οποίο παρέχεται επιπλέον ενέργεια σε ένα θάλαμο αντίδρασης για την επαγωγή θραυσματοποίησης. Η ενέργεια αυτή μπορεί να είναι υψηλή (της τάξης μερικών kev) ή ασθενής (της τάξης μερικών ev) και παρέχεται από διάφορες τεχνικές. Η πιο Σχήμα 1.8: Σχηματική απεικόνιση ιόντος που υφίσταται διάσπαση επαγόμενη από σύγκρουση (CID) με την τεχνική σάρωσης θυγατρικών ιόντων (λειτουργία MS/MS). ~ 36 ~

55 συνήθης μέθοδος είναι η σύγκρουση του πρόδρομου ιόντος µε ένα αδρανές αέριο, που εισάγεται στο θάλαμο αντίδρασης, ο οποίος ονομάζεται «κυψελίδα συγκρούσεων» (collision cell). Η διαδικασία αυτή, ονομάζεται «διάσπαση επαγόμενη από σύγκρουση» (collision induced dissociation, CID). Συγκρούσεις µε µια στερεά επιφάνεια μπορούν επίσης να προκαλέσουν θραυσματοποίηση. Άλλες εναλλακτικές περιλαμβάνουν διέγερση των ιόντων µέσω απορρόφησης φωτονίων, ή µε χρήση μιας δέσμης ηλεκτρονίων. Τα διεγερμένα ιόντα διασπώνται σε φορτισμένα θραύσματα ιόντων, τα παραγόμενα ιόντα και σε ένα ή περισσότερα ουδέτερα µόρια. Τα παραγόμενα ιόντα στη συνέχεια διέρχονται από τον επόμενο αναλυτή μαζών (MS2), ο οποίος σαρώνει στην περιοχή m/z ενδιαφέροντος, και τα ιόντα ανιχνεύονται στον ανιχνευτή παρέχοντας ένα φάσμα μαζών παραγόμενων ιόντων. Το φάσμα μαζών που προκύπτει δείχνει τα παραγόμενα ιόντα που παρήχθησαν από τη θραυσματοποίηση του επιλεγμένου πρόδρομου ιόντος. Η τεχνική αυτή παρέχει πληροφορίες για τη δομή μιας ένωσης και χρησιμοποιείται για την εξέταση πολύπλοκων οργανικών μιγμάτων (π.χ. βιολογικά δείγματα), υστερεί όμως λόγω της αργής σάρωσης, µε αποτέλεσμα να µην ευνοείται η εφαρμογή του σε ποσοτικές αναλύσεις (Lemiere, 2001). ~ 37 ~

56 1.4 Σύστημα QTOF LC/MS Εισαγωγή Η εφαρμογή της υγρής χρωματογραφίας σε σύζευξη με τη φασματομετρία μάζας με τετραπολικό ανιχνευτή χρόνου πτήσης για τον προσδιορισμό φαρμακευτικών ουσιών στα διάφορα δείγματα παραμένει ακόμα σπάνια. Ωστόσο, πολλοί συγγραφείς έχουν αναφέρει την εφαρμογή της LC-QTOF στην ανίχνευση, ταυτοποίηση και στην ποσοτική ανάλυση εξαιτίας των πλεονεκτημάτων που έχει (Petrovic et al., 2006). Το QTOF αποτελεί ισχυρό εργαλείο στην ανάλυση των φαρμακευτικών ουσιών σε σύγκριση με τη τεχνική SRM του MS/MS (Magner et al., 2010), διότι παρέχει προσδιορισμό της ακρίβειας μάζας έως τέσσερα δεκαδικά ψηφία και σφάλμα μάζας μικρότερο των 3 ppm με την τεχνική της πλήρης σάρωσης (full scan mode) χάρη στην υψηλή διακριτική ικανότητα των τουλάχιστον FWHM που διαθέτει (Williamson and Bartlett, 2007; Petrovic et al., 2006). Οι μετρήσεις της ακρίβειας μάζας παρέχουν υψηλή αξιοπιστία στην ταυτοποίηση των αναλυτών στη στοχευμένη και μη ανάλυση και επιπλέον επιτρέπει την απόκτηση δεδομένων της στοιχειακής δομής του μητρικού και των θυγατρικών ιόντων. Μέσω των πληροφοριών που συλλέγονται κατά την ανάλυση με την τεχνική της πλήρους σάρωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί περαιτέρω αξιολόγηση των δεδομένων και προσδιορισμός των ενώσεων σε μεταγενέστερο χρόνο. Επειδή δεν απαιτούνται επιπλέον αναλύσεις, αποφεύγονται επιπλέον τα έξοδα και εξοικονομείται χρόνος (Bueno et al., 2007). Η χρήση της γρήγορης UHPLC και του QTOF-MS προσδίδει υψηλή ευαισθησία στην τεχνική πλήρους σάρωσης, επιτρέποντας την ανάλυση τόσο των στοχευμένων όσο και των μη στοχευμένων αναλυτών, παρέχοντας στην περίπτωση της μη στοχευμένης ανάλυσης τη δυνατότητα αναδρομικής αξιολόγησης των δεδομένων για την εύρεση άγνωστων ρυπαντών. Αυτή είναι και η κύρια αιτία γιατί η ανίχνευση με το QTOF-MS είναι πιθανόν αναντικατάστατη τεχνική στην έρευνα μεταβολιτών (Liu et al., 2010), ισομερών (Bartok et al., 2010) και προϊόντων αποδόμησης (Prakash et al., 2007; Radjenovic et al., 2007) των φαρμακευτικών ουσιών Περιγραφή διάταξης Ένα όργανο Q-TOF LC/MS αποτελείται από έναν υγρό χρωματογράφο και έναν τετραπολικό ανιχνευτή μαζών χρόνου πτήσης ο οποίος εκτελεί πειράματα MS/MS χρησιμοποιώντας ένα τετράπολο, μια εξαπολική κυψελίδα συγκρούσεων και μία μονάδα χρόνου πτήσης για να παράγει φάσματα. Το τετράπολο επιλέγει τα μητρικά ιόντα τα οποία θραυσματοποιούνται στην κυψελίδα συγκρούσεων για να δώσουν θυγατρικά ιόντα, τα οποία έπειτα ωθούνται προς τον ανιχνευτή σε γωνία κάθετη ως προς το αρχικό μονοπάτι (Agilent Technologies, 2011). Παρακάτω περιγράφονται οι διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια μιας τυπικής ~ 38 ~

57 Σχήμα 1.9: Βασικά μέρη ενός QTOF-MS. ανάλυσης με βάση τα στάδια κενού του οργάνου 6538 UHD Q-TOF LC/MS της Agilent που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία Πρώτο στάδιο κενού Εμπλουτισμός ιόντων Τα ιόντα που παράγονται από την πηγή ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό εκτοπίζονται ηλεκτροστατικά μέσω του αερίου ξήρανσης και έπειτα μεταφέρονται με αέριο μέσω και της έλλειψης σχηματισμού επιφανειακού φορτίου κατά μήκος της εσωτερικής διαμέτρου του τριχοειδούς, η μετάδοση των ιόντων έχει μεγάλη επαναληψιμότητα και σταθερότητα. Στη συνέχεια η πλειονότητα των ατμών του αερίου ξήρανσης και του διαλύτη εκτρέπονται από τον διαχωριστή ιόντων και απομακρύνονται με τη βοήθεια αντλίας κενού. Τα ιόντα που διαπερνούν τον διαχωριστή ιόντων (αποκορυφωτή), διέρχονται έπειτα στο δεύτερο στάδιο του συστήματος κενού (Agilent Technologies, 2011) Δεύτερο και τρίτο στάδιο κενού Μεταφορά ιόντων Στο στάδιο αυτό τα ιόντα εστιάζονται κατευθείαν σε έναν αγωγό ιόντων, το οκτάπολο. Το οκτάπολο αποτελείται από οκτώ ράβδους σε υψίσυχνη τάση (RF) με δυναμικό συνεχούς ρεύματος αντιστάθμισης. Οι γειτονικές ράβδοι έχουν δυναμικό αντίθετης πολικότητας. Το δυναμικό ραδιοσυχνοτήτων που εφαρμόζεται στις παράλληλες ράβδους του οκτάπολου, απωθούν τα ιόντα που η τιμή της μάζας τους είναι πέρα από ένα ορισμένο εύρος προς το κέντρο της διάταξης των ράβδων. Τα ιόντα διέρχονται μέσω του αγωγού ιόντων του οκτάπολου εξαιτίας της ορμής που απέκτησαν από τον εκτοπισμό τους υπό ατμοσφαιρική πίεση μέσω του τριχοειδούς. ~ 39 ~

58 Σχήμα 1.10: Σχηματική περιγραφή του αναλυτικού οργάνου 6538 UHD Q-TOF LC/MS της Agilent με επισημασμένα τα κύρια μέρη του και τα στάδια κενού. Το οκτάπολο εκτείνεται στο δεύτερο και το τρίτο στάδιο κενού. Τα ιόντα εξέρχονται από το οκτάπολο και διέρχονται μέσω δύο συγκεντρωτικών φακών και ενός φακού ο οποίος λειτουργεί σε υψίσυχνη τάση (RF) (Agilent Technologies, 2011) Τέταρτο στάδιο κενού Επιλογή ιόντων Το δυναμικό του φακού υψίσυχνης τάσης (RF) εναρμονίζεται με αυτό του ακόλουθου τετράπολου έχοντας ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση σε ευαισθησία. Το τετράπολο (φίλτρο μαζών) διαχωρίζει τα ιόντα σύμφωνα με το λόγο μάζα προς φορτίο (m/z) που διαθέτουν, επιτρέποντας μόνο ένα m/z να ταξιδεύει κατά μήκος του τετράπολου τη φορά. Αποτελείται από υπερβολικές ράβδους για τη βελτιστοποίηση της μετάδοσης των ιόντων και της ανάλυσης των φασμάτων. Με τις κυλινδρικές ράβδους, αντιθέτως, υπάρχει η τάση για μεγαλύτερη απώλεια ιόντων. Το τελευταίο τμήμα του τετράπολου αποτελείται επίσης από κοντές υπερβολικές ράβδους, αλλά τα δυναμικά ραδιοσυχνοτήτων τους είναι τόσο υψηλά ώστε να μπορούν να οδηγούν τα ιόντα στην κυψελίδα συγκρούσεων. Μπορεί να λειτουργήσει είτε στη λειτουργία πλήρης σάρωσης (full scan mode) είτε στη λειτουργία παρακολούθησης επιλεγμένου ιόντος (SIM). ~ 40 ~

59 Θραυσματοποίηση ιόντων Τα ιόντα που επιλέχθηκαν από το τετράπολο εισέρχονται έπειτα στην κυψελίδα συγκρούσεων, όπου και θραυσματοποιούνται. Η αξονική επιτάχυνση στην κυψελίδα συγκρούσεων πραγματοποιείται μέσω μιας διάταξης εξάπολου σε υψηλή πίεση με την αξονική επιτάχυνσή της προσαρμοσμένη ώστε να μεγιστοποιείται η ευαισθησία και παράλληλα να εξαλείφονται οι παρεμβολές. Οι παρεμβολές συμβαίνουν όταν τα θυγατρικά ιόντα από ένα μητρικό ιόν που είχε προηγουμένως επιλεχθεί εμφανίζονται στο φάσμα μάζας του επόμενου επιλεγμένου μητρικού ιόντος λόγω της αργής εκκαθάρισής του στην κυψελίδα συγκρούσεων. Αυτό δημιουργεί ένα σύνθετο φάσμα μάζας που είναι δύσκολο να ερμηνευτεί. Η κυψελίδα συγκρούσεων περιέχει άζωτο, το ίδιο αέριο δηλαδή που χρησιμοποιείται και στην πηγή ιοντισμού. Η μικρή διάμετρος του εξάπολου συντελεί στην σύλληψη των θυγατρικών ιόντων. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η κυψελίδα συγκρούσεων περιέχει ένα εξάπολο. Η ακτίνα του είναι διπλάσια σε μέγεθος από αυτή του τετράπολου ώστε να διευκολύνει τις συγκρούσεις των ιόντων και του αερίου. Τα ιόντα εισέρχονται στο εξάπολο και υφίστανται συγκρούσεις με την εφαρμογή δυναμικού ενέργειας σύγκρουσης. Εάν η ενέργεια σύγκρουσης είναι αρκετά υψηλή, το μόριο δονείται έντονα και θραύεται. Το ποσοστό της θραύσης εξαρτάται από την ενέργεια, το αέριο και το ίδιο το μόριο. Τα ελαφριά μόρια απαιτούν πολύ λιγότερη ενέργεια, ενώ τα βαρύτερα χρειάζονται περισσότερη ενέργεια για να θραυσματοποιηθούν. Δεν απαιτείται η πίεση του αερίου για να ωθήσει τα ιόντα μέσα στο σύστημα. Ως εκ τούτου, εφαρμόζεται μια μικρή διαφορά δυναμικού για να διατηρηθεί η κινητικότητα των ιόντων κι έτσι να εξασφαλίζεται ότι τα μητρικά ιόντα που προέρχονται από το τετράπολο ή τα παραγόμενα θυγατρικά ιόντα, μεταδίδονται και δεν παρασύρονται τυχαία. Με αυτόν τον τρόπο αποφεύγονται τα φαινόμενα παρεμβολών που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Για τη μετάδοση της ενέργειας που απαιτείται για θραυσματοποίηση, διεγείρεται από το ποσό της ενέργειας σύγκρουσης ολόκληρη η διαδρομή του ιόντος από την πηγή θραύσης έως το μπροστινό μέρος της κυψελίδας συγκρούσεων. Η ενέργεια των ιόντων που εξέρχονται της κυψελίδας θα είναι ίδια ανεξαρτήτως της ενέργειας σύγκρουσης που προστέθηκε. Τα ιόντα ψύχονται και συγκεντρώνονται πριν την εισαγωγή τους στο θάλαμο πτήσης. Διάσπαση επαγόμενη από σύγκρουση Η πιο κοινή τεχνική θραυσματοποίησης είναι η διάσπαση επαγόμενη από σύγκρουση (collision induced dissociation, CID). Κατά τη διάρκεια της σύγκρουσης, η κινητική ενέργεια του μητρικού ιόντος μετατρέπεται σε εσωτερική ενέργεια η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση των δεσμών του μορίου σε μικρότερα κομμάτια (θυγατρικά ιόντα). Χαρακτηριστικά αέρια σύγκρουσης είναι συνήθως τα αδρανή ήλιο, αργό, άζωτο και ξένο. Οι πιο σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν το μοτίβο θραυσματοποίησης ενός μορίου με διάσπαση επαγόμενης από σύγκρουση είναι το είδος και η πίεση του αερίου σύγκρουσης, η αρχική κινητική ενέργεια του ιόντος, η δομή του ιόντος, η διαμόρφωση του οργάνου και η κατάσταση του φορτίου. Σε χαμηλές ~ 41 ~

60 Σχήμα 1.11: Εξαπολική κυψελίδα συγκρούσεων στην οποία πραγματοποιείται η διάσπαση επαγομένη από σύγκρουση (CID). ενέργειες (κοντά στο κατώφλι θραυσματοποίησης) οι αντιδράσεις θραυσματοποίησης συχνά περιορίζονται σε ουδέτερες απώλειες (H 2 O, MeOH, CO, CO 2, ACN) που εξαρτώνται από τη φύση του μητρικού ιόντος. Αυτές οι απώλειες συχνά δεν θεωρούνται δομικά σημαντικές, αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απόκτηση πληροφοριών σχετικά με το είδος των λειτουργικών ομάδων του μορίου. Σε υψηλότερες ενέργειες, παρατηρούνται συχνά αντιδράσεις αναδιάταξης του μορίου. Αυτές είναι δομικά σημαντικότερες και συχνά έχουν ως αποτέλεσμα τη διάσπαση του μορίου σε χαρακτηριστικές θέσεις. Εάν η ενέργεια που εφαρμόζεται είναι πολύ υψηλή, διασπάσεις δεσμού C-C μπορούν να συμβούν και να οδηγήσουν σε ανεξέλεγκτη θραυσματοποίηση, γεγονός μη επιθυμητό και γι αυτό πρέπει να αποφεύγεται. Η καλύτερη λύση συνήθως είναι να δουλεύουμε γύρω από το κατώφλι θραυσματοποίησης ώστε να καθίστανται οι διαδικασίες θραύσης ελεγχόμενες. Το μοτίβο θραυσματοποίησης που προκύπτει μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εύρεση πληροφοριών σχετικά με τη δομή του μορίου ή για ποσοτική ανάλυση, καθώς τα ιόντα θραυσματοποίησης που παρατηρούνται από τη διάσπαση επαγόμενης από σύγκρουση σχετίζονται με την αρχική δομή του μορίου. Δεν υπάρχει προκαθορισμένη ρύθμιση των συνθηκών κάτω από τις οποίες πραγματοποιείται κάθε πείραμα με διάσπαση επαγόμενης από σύγκρουση με αποτέλεσμα τα φάσματα CID που παράγονται να είναι διαφορετικά για κάθε ένωση. Ως εκ τούτου, δεν υπάρχουν διαθέσιμες βιβλιοθήκες για την σύγκριση των παραγόμενων CID φασμάτων. Η μόνη δυνατότητα για το προσεχές μέλλον έγκειται στην ερμηνεία αυτών φασμάτων από τον χρήστη. ~ 42 ~

61 Σχήμα 1.12: Τεχνολογία συμπίεσης και διαμόρφωσης της ιοντικής δέσμης. Διαμόρφωση δέσμης Η διαμόρφωση της ιοντικής δέσμης παρέχει έως και δέκα φορές συμπίεση και ψύξη και συμβάλλει στη δημιουργία μιας πιο πυκνής και λεπτής δέσμης ιόντων η οποία διέρχεται μέσα από μια πιο στενή σχισμή (slicer) και οδηγείται στην περιοχή του παλμογράφου. Ένας εύκολος τρόπος για την αύξηση της διακριτικής ικανότητας είναι απλά η διέλευση της ιοντικής δέσμης μέσω μιας στενότερης σχισμής πριν τον παλμογράφο, απορρίπτοντας έτσι τα ιόντα που έχουν ακραίες τιμές ταχύτητας ή χαμηλή θέση ως προς την διεύθυνση του άξονα χρόνου πτήσης. Όμως, αυτό έχει ως ανεπιθύμητο αποτέλεσμα την απόρριψη πολλών ιόντων τα οποία είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της ευαισθησίας και της ακρίβειας μάζας. Το δύσκολο κομμάτι για την αύξηση της διακριτικής ικανότητας και την ταυτόχρονη διατήρηση της ευαισθησίας του οργάνου είναι ο επανασχεδιασμός του οπτικού συστήματος ιόντων (ion optics) ανάμεσα στην κυψελίδα συγκρούσεων και τον παλμογράφο ώστε να «ψύξει» ή να συμπιέσει την ιοντική δέσμη, ελαττώνοντας έτσι το μέγεθος και την ταχύτητα κατανομής της στον άξονα χρόνου πτήσης. Για να πραγματοποιηθεί αυτό, φακοί εστιάζουν τα ιόντα έτσι ώστε να εισέλθουν στον αναλυτή χρόνου πτήσης παράλληλα. Όσο πιο ευθύγραμμη είναι η ιοντική δέσμη τόσο υψηλότερη θα είναι η διακριτική ικανότητα στο προκύπτον φάσμα μάζας. Αφού τα ιόντα έχουν διαμορφωθεί σε μία ευθύγραμμη δέσμη, εισέρχονται μέσω μιας σχισμής στο πέμπτο και τελευταίο στάδιο κενού όπου λαμβάνει χώρα η ανάλυση χρόνου πτήσης (Agilent Technologies, 2011) Πέμπτο στάδιο κενού Θάλαμος πτήσης Η ευθύγραμμη δέσμη ιόντων εισέρχεται στον παλμογράφο ιόντων χρόνου πτήσης του σχήματος O παλμογράφος ιόντων είναι μια συστοιχία από πλάκες, καθεμιά (εκτός από την οπίσθια πλάκα) από τις οποίες φέρει μία κεντρική οπή. Τα ιόντα διέρχονται μέσα στη συστοιχία από την μεριά που βρίσκεται μεταξύ της ~ 43 ~

62 οπίσθιας πλάκας και της πρώτης πλάκας που φέρει την κεντρική οπή. Για την έναρξη της πτήσης ενός ιόντος προς τον ανιχνευτή, εφαρμόζεται στην οπίσθια πλάκα ένας παλμός υψηλού δυναμικού. Ο παλμός αυτός επιταχύνει το ιόν μέσω της συστοιχίας των πλακών του παλμογράφου, ο οποίος λειτουργεί σαν ένα πολυβόλο ιόντων. Τα ιόντα εγκαταλείπουν τον παλμογράφο τα οποία ταξιδεύουν επιταχυνόμενα μέσω του θαλάμου πτήσης, μήκους σχεδόν ενός μέτρου. Στο άλλο άκρο του θαλάμου πτήσης είναι τοποθετημένο ένα ανακλαστικό κάτοπτρο (reflectron), το οποίο αντανακλά τα ιόντα που καταφθάνουν στο τέλος του θαλάμου πίσω στον παλμογράφο. Επειδή τα ιόντα εισέρχονται στον παλμογράφο με συγκεκριμένη ορμή, στην πραγματικότητα δεν επιστρέφουν ποτέ σ αυτόν, αλλά κατευθύνονται στην περιοχή όπου βρίσκεται ο ανιχνευτής ιόντων. Το ανακλαστικό κάτοπτρο αυξάνει τη διακριτική ικανότητα του οργάνου διπλασιάζοντας αποτελεσματικά της απόσταση πτήσης (από ένα στα δύο μέτρα) στον ίδιο χώρο, ενώ επανεστιάζει τα ιόντα που ακόμη έχουν διαφορετικές αρχικές ταχύτητες ώστε να φτάσουν ταυτόχρονα στον ανιχνευτή. Επειδή ο υπολογισμός της μάζας κάθε ιόντος εξαρτάται από το χρόνο πτήσης του μέσα στο θάλαμο πτήσης, η πίεση του αερίου πρέπει να είναι πολύ χαμηλή. Η σύγκρουση οποιουδήποτε ιόντος με υπόλειμμα αερίου επιβραδύνει το ιόν στη διαδρομή του προς τον ανιχνευτή και επηρεάζει την ακρίβεια στον υπολογισμό της μάζας. Ανιχνευτής ιόντων Στην επιφάνεια του ανιχνευτή ιόντων υπάρχει μια πλάκα πολλαπλής διέλευσης (microchannel plate, MCP), η οποία είναι πολύ λεπτή και αποτελείται από πολλαπλούς μικροσωλήνες που τη διαπερνούν από τη μια επιφάνεια έως την άλλη. Έτσι, όταν ένα ιόν προσκρούσει στη μπροστινή επιφάνεια του MCP ελευθερώνεται ένα ηλεκτρόνιο και ξεκινά η διαδικασία ενίσχυσης του ηλεκτρικού σήματος. Καθώς τα ηλεκτρόνια που ελευθερώνονται μετακινούνται και συγκρούονται με τα τοιχώματα των μικροσκοπικών σωλήνων, προκαλούν την απελευθέρωση ενός συνεχώς αυξανόμενου "καταρράκτη" ηλεκτρονίων που ταξιδεύει προς το οπίσθιο μέρος της πλάκας. Τελικά, τα ηλεκτρόνια που εξέρχονται από την πλάκα είναι περίπου 10 φορές περισσότερα σε αριθμό από τα εισερχόμενα ιόντα. Τα ηλεκτρόνια αυτά στη συνέχεια επιταχύνονται και προσκρούουν σε ένα σπινθηριστή, ο οποίος, όταν κορεστεί με ηλεκτρόνια, παράγει μια λάμψη φωτός. Το φως από το σπινθηριστή εστιάζεται με τη βοήθεια δύο μικρών φακών σε ένα φωτοπολλαπλασιαστή (PMT), ο οποίος με τη σειρά του παράγει ηλεκτρικό σήμα το οποίο καταγράφεται και ψηφιοποιείται από μια διάταξη μετατροπής του αναλογικού σήματος σε ψηφιακό (ADC). Ο λόγος για την παραγωγή του οπτικού σήματος από τα ηλεκτρόνια του MCP είναι γιατί στην έξοδο του MCP το δυναμικό είναι σχεδόν 6000 volt. Το φως που παράγεται από το σπινθηριστή διέρχεται στον PMT, ο οποίος παράγει σήμα εξόδου με μηδενικό δυναμικό (Agilent Technologies, 2011). ~ 44 ~

63 Σχήμα 1.13: Σχηματικό διάγραμμα του ανιχνευτή ιόντων του LC/QTOF-MS. ~ 45 ~

64 1.5 Προεπεξεργασία δειγμάτων Η προεπεξεργασία δειγμάτων στον προσδιορισμό υπολειμματικών φαρμακευτικών ουσιών Η προεπεξεργασία των δειγμάτων στην ανάλυση αποτελεί συχνά μία πρόκληση για τους αναλυτές (Fu et al., 2005). Οι φαρμακευτικές ουσίες είναι ιδιαίτερα προβληματικές. Η πρόκληση αυτή οφείλεται κυρίως στην εκχύλιση και ανάλυση των φαρμακευτικών ενώσεων που ανήκουν σε διάφορες κατηγορίες, οι οποίες έχουν διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Ακόμη, συχνό χαρακτηριστικό των περιβαλλοντικών δειγμάτων αποτελεί η πολυπλοκότητα της μήτρας τους η οποία περιέχει πολλές παρεμποδίζουσες χημικές ουσίες με αποτέλεσμα να δημιουργούνται προβλήματα κατά την ανάλυση (π.χ. επιδράσεις μήτρας). Επιπρόσθετα, οι φαρμακευτικές ουσίες απαντούν στον περιβάλλον σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (ng/l έως μg/l) και συνεπώς η προεπεξεργασία των δειγμάτων, η οποία περιλαμβάνει τα βήματα της προσυγκέντρωσης και του καθαρισμού, αποτελεί καθοριστικό βήμα στην αναλυτική διαδικασία. Υπάρχουν αρκετές διαφορετικές τεχνικές εκχύλισης για την προεπεξεργασία των υγρών δειγμάτων που έχουν χρησιμοποιηθεί σε διάφορες αναλυτικές διαδικασίες. Σύμφωνα με αυτές που έχουν δημοσιευτεί έως το 2013, στα υγρά δείγματα η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) εφαρμόζεται στις περισσότερες αναλύσεις φαρμακευτικών ουσιών τόσο στην εκχύλιση (Pailler et al., 2009; Sun et al., 2009; Fatta et al., 2007) όσο και στον καθαρισμό (Kaufmann et al., 2012; Baker and Kasprzyk- Hondern, 2011; Ding et al., 2011; Radjenovic et al., 2009) των δειγμάτων αυτών. Όμως, το στάδιο καθαρισμού εξαλείφει μόνο συγκεκριμένες παραμποδίσεις, οι οποίες είναι συνήθως υπεύθυνες μόνο για ένα μέρος απ αυτές που παρατηρούνται από τις επιδράσεις της μήτρας. Παρακάτω περιγράφεται αναλυτικά τεχνική εκχύλισης στερεάς φάσης η οποία χρησιμοποιήθηκε στην προεπεξεργασία των δειγμάτων της παρούσας εργασίας Εκχύλιση στερεάς φάσης Παρά την διαθεσιμότητα πανίσχυρων τεχνικών διαχωρισμού και ανίχνευσης, η ανάλυση πολύπλοκων περιβαλλοντικών υποστρωμάτων απαιτεί μια αποτελεσματική και εκλεκτική προεπεξεργασία των δειγμάτων για τη διευκόλυνση της απομάκρυνσης των παρεμποδίσεων, παρέχοντας έτσι καθαρότερα εκχυλίσματα και έχοντας ως αποτέλεσμα τη μείωση των ορίων ανίχνευσης της μεθόδου. Είναι γνωστό ότι η υψηλή πολυπλοκότητα των αναλυόμενων υποστρωμάτων συνδέεται συχνά με τη συνέκλουση ενώσεων που προκαλούν τις επιδράσεις της μήτρας (ενίσχυση ή καταστολή σήματος). Συνεπώς, πολλές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην προεπεξεργασία των δειγμάτων για την παραλαβή καθαρότερων εκχυλισμάτων πριν το διαχωρισμό και την ανίχνευση, αποφεύγοντας έτσι επίπονες και χρονοβόρες ~ 46 ~

65 διαδικασίες. Με την πάροδο του χρόνου η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) και προσφάτως άλλες τεχνικές ρόφησης όπως η εκχύλιση με προσρόφηση σε περιστρεφόμενη ράβδο (stir bar sorptive extraction, SBSE) ή η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (solid-phase microextraction, SPME) έχουν εκτοπίσει την εκχύλιση υγρού-υγρού (LLE) στην περίπτωση των υγρών περιβαλλοντικών δειγμάτων. Από αυτές η SPE αποτελεί την πιο δημοφιλή επιλογή για την προσυγκέντρωση των αναλυτών και τον καθαρισμό της μήτρας. Επιπλέον, η τεράστια ποικιλία των εμπορικά διαθέσιμων ροφητών και διατάξεων καθιστά την τεχνική αυτή κατάλληλη για τη εκχύλιση πολλών ενώσεων με διαφορετικές πολικότητες και φυσικοχημικές ιδιότητες (Fontanals et al., 2005). Τις δυο τελευταίες δεκαετίες έχει αυξηθεί το ενδιαφέρον για την ανάπτυξη υδρόφιλων πολυμερικών ροφητών στην SPE για τις πολικές ενώσεις. Έτσι, η λειτουργικότητα των πορωδών πολυμερών βασίστηκε κυρίως στη δομή στυρενίουδιβινυλοβενζολίου (styrene-divinylbenzene, St-DVB) με πολικές λειτουργικές ιδιότητες. Αυτό επιτεύχθηκε μέσω δύο βασικών στρατηγικών: το συμπολυμερισμό των μονομερών έτσι ώστε να αποκτήσουν την επιθυμητή λειτουργικότητα και την εισαγωγή μιας λειτουργικής ομάδας στο υδροφοβικό πολυμερές. Πολλές βιβλιογραφικές εργασίες έχουν αναφερθεί στις αναλυτικές εφαρμογές αυτών των καινοτόμων πολυμερικών ροφητών με την ενισχυμένη υδροφοβικότητα στην εκχύλιση μιας ευρείας γκάμας αναδυόμενων ρύπων προτεραιότητας με διαφορετικές πολικότητες που απαντούν στα περιβαλλοντικά δείγματα (Fontanals et al., 2007; Fontanals et al., 2005). Σήμερα υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία εμπορικά διαθέσιμων ροφητών SPE με τον πιο γνωστό και ευρέως διαδεδομένο αυτόν της Oasis HLB (Hydrophilic- Lipophilic Balanced Copolymer) της εταιρίας Waters, τον οποίο χρησιμοποιούμε στην παρούσα εργασία. Το υλικό του ροφητή αποτελείται από ένα μακροπορώδες συμπολυμερές, την πολυ-(n-βινυλοπυρολιδόνη-dvb) (PVP-DVB) με ειδική επιφάνεια περίπου 800 m 2 /g. Από την εμπορευματοποίησή του κι έπειτα, το Oasis HLB απέκτησε μεγάλη δημοτικότητα στην προεπεξεργασία των δειγμάτων λόγω των πλεονεκτημάτων που διαθέτει. Αυτά είναι η εκχύλιση τόσο των πολικών όσο και των μη πολικών ενώσεων, η υψηλή χωρητικότητα, ο καθαρισμός των πολύπλοκων υποστρωμάτων και η αποτελεσματικότητα στην απομάκρυνση παρεμποδίζουσων ουσιών. Επιπλέον, οι ροφητές HLB έχουν τη δυνατότητα να διαβρεχτούν με νερό, είναι σταθεροί στο εύρος ph 1-14, δεν αλληλεπιδρούν με τις ομάδες σιλανόλης και εμφανίζουν μεγάλες ανακτήσεις στις όξινες, βασικές και ουδέτερες ενώσεις (Gilart et al., 2014). Ο ροφητής αυτός αποτελεί την καλύτερη επιλογή σε πολλές μελέτες για την εκχύλιση και τον προσδιορισμό των φαρμακευτικών ενώσεων (Van Nuijs et al., 2010; Gros et al., 2006), των προϊόντων ατομικής περιποίησης (Gonzalez-Marino et al., 2009), των παράνομων φαρμάκων (Vazquez-Roig et al., 2010) και των γλυκαντικών ουσιών (Ordonez et al., 2012). Οι αναλυτικές μέθοδοι που αναπτύχθηκαν με τη χρήση του Oasis HLB στην περιβαλλοντική ανάλυση δίνει τη δυνατότητα φόρτωσης μεγάλων όγκων δειγμάτων (από 50 έως 1000 ml), παρέχοντας έτσι υψηλούς παράγοντες εμπλουτισμού. Με το συνδυασμό της υψηλής χωρητικότητας των ροφητών ~ 47 ~

66 Σχήμα 1.14: Χημική δομή των ροφητών Oasis HLB. Oasis HLB και της ευαισθησίας της τεχνικής ανίχνευσης MS/MS μπορούν να επιτευχθούν πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης της μεθόδου της τάξης των ng/l (Gilart et al., 2014). Η διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Προεπεξεργασία δείγματος Ανάλογα τον αναλύτη, τη μήτρα του δείγματος και τη φύση της χημικής συγκράτησης η προεπεξεργασία του δείγματος μπορεί να περιλαμβάνει ρύθμιση του ph, φυγοκέντρηση, διήθηση, αραίωση, προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος, κ.α. Ρύθμιση συνθηκών έκλουσης (conditioning) Ο οργανικός διαλύτης διέρχεται μέσω των ροφητών του SPE και διαβρέχει τους πόρους του υλικού, όπου υπάρχουν συνδεδεμένες οι λειτουργικές ομάδες. Έτσι εξασφαλίζεται συνεχής αλληλεπίδραση. Είναι όμως πολύ ισχυρός για τη φόρτωση του δείγματος. Εξισορρόπηση συνθηκών έκλουσης (equilibration) Ο ισχυρός οργανικός διαλύτης αντικαθίστανται από ένα υδατικό διαλύτη παρόμοιας χημικής σύστασης (πολικότητα, ph) με αυτή της μήτρας του δείγματος. Έτσι μεγιστοποιείται η κατακράτηση. Οι πόροι είναι τώρα έτοιμοι για να υποδεχτούν το δείγμα. Φόρτωση δείγματος Εισάγεται το δείγμα με τους αναλύτες να δεσμεύονται/εκχυλίζονται πάνω στη φάση του ροφητή. ~ 48 ~

67 Έκπλυση Ο διαλύτης έκπλυσης απομακρύνει επιλεκτικά τις ανεπιθύμητες παρεμποδίσεις που εκχυλίστηκαν μαζί με τους αναλύτες, χωρίς όμως να πραγματοποιείται πρόωρη έκλουση των αναλυτών. Ξήρανση Ακολουθεί ξήρανση των ροφητών για περίπου πέντε λεπτά για την απομάκρυνση της περίσσειας του διαλύτη έκπλυσης. Έκλουση Ο οργανικός διαλύτης υπερνικά τις αλληλεπιδράσεις κατακράτησης των αναλυτών με το ροφητή και εκλούει τους αναλύτες. Εξάτμιση και Ανασύσταση (προαιρετικά βήματα) Εάν πρόκειται να ακολουθήσει ανάλυση με LC, ο οργανικός διαλύτης έκλουσης πρέπει να εξατμιστεί και να γίνει ανασύσταση του εκχυλίσματος στους διαλύτες της αρχικής κινητής φάσης του LC. Εάν πρόκειται να ακολουθήσει ανάλυση με GC, τότε πρέπει να χρησιμοποιηθεί διαλύτης συμβατός με το GC (π.χ. μεθανόλη). Σχήμα 1.15: Διάταξη εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). ~ 49 ~

68 1.6 Επικύρωση αναλυτικής μεθόδου Μέση τιμή δείγματος ( ) Η μέση τιμή δείγματος (sample mean) είναι η μέση τιμή (ή μέσος όρος) ενός δεδομένου αριθμού μετρήσεων. Επειδή το N είναι ένα πεπερασμένος αριθμός, η συχνά διαφέρει κάπως από τη μέση τιμή του πληθυσμού μ, δηλαδή της αληθούς τιμής της μετρούμενης ποσότητας (Skoog, et al., 2007). Η μέση τιμή δίνεται από την εξίσωση Τυπική απόκλιση (s) και μεταβλητότητα (s 2 ) δείγματος Η τυπική απόκλιση (s) των δεδομένων ενός δείγματος περιορισμένου μεγέθους δίνεται από την εξίσωση Σχετική τυπική απόκλιση και συντελεστής μεταβλητότητας Η σχετική τυπική απόκλιση (relative standard deviation, RSD) παρέχει συχνά καλύτερη πληροφόρηση σε σχέση με την απόλυτη τυπική απόκλιση. Η σχετική τυπική απόκλιση ενός δείγματος αναλυτικών δεδομένων δίνεται από τη σχέση Όταν z = 2, η σχετική τυπική απόκλιση δίνεται ως επί τοις εκατό, ενώ για z = 3 η απόκλιση δίνεται ως μέρη στα χίλια. Όταν η τυπική απόκλιση εκφράζεται επί τοις εκατό (%) αναφέρεται και ως συντελεστής μεταβλητότητας (coefficient of variation, CV) των δεδομένων. Δηλαδή 10 z Ορθότητα Η ορθότητα δείχνει την εγγύτητα μεταξύ της μέσης τιμής (πολλαπλών επαναλήψεων) και της «αληθούς» τιμής. Αυστηρώς οριζόμενη, το μόνο είδος ~ 50 ~

69 μέτρησης που μπορεί να είναι απόλυτα ακριβές είναι αυτό που περιλαμβάνει απαριθμούμενα αντικείμενα. Όλες οι υπόλοιπες μετρήσεις περιλαμβάνουν σφάλματα και δίνουν μόνο μια προσέγγιση της αλήθειας. Η ορθότητα είναι ένας σχετικός όρος με την έννοια ότι μια ακριβής ή ανακριβής μέθοδος εξαρτάται από τις ανάγκες του αναλυτή και τη δυσκολία του αναλυτικού προβλήματος. Η ορθότητα εκφράζεται ως απόλυτο σφάλμα ή ως σχετικό σφάλμα, αλλά μπορεί να εκφραστεί και ως ανάκτηση. Το απόλυτο σφάλμα της μέσης τιμής (ή του μέσου όρου) ενός μικρού αριθμού επαναλαμβανόμενων αναλύσεων δίνεται από τη σχέση: ορθότητα = μ όπου μ είναι η αληθής τιμή. Συχνά, είναι χρήσιμο να εκφράζεται η ακρίβεια με την έννοια του σχετικού σφάλματος (relative error), όπου σχετικό σφάλμα = Να σημειωθεί ότι το τόσο το απόλυτο όσο και το σχετικό σφάλμα φέρουν ένα σήμα, είτε θετικό υποδηλώνοντας ότι το μετρούμενο σήμα είναι μεγαλύτερο από το πραγματικό είτε αρνητικό όπου ισχύει το αντίθετο (Οδηγία 2002/657/ΕΚ) Πιστότητα Η πιστότητα περιγράφει τη συγκέντρωση των μετρήσεων γύρω από την κεντρική τιμή, με άλλα λόγια τη συμφωνία μεταξύ των αριθμητικών τιμών για δύο ή περισσότερες επαναλαμβανόμενες μετρήσεις, που έχουν ληφθεί υπό τις ίδιες ακριβώς συνθήκες. Γενικά, η πιστότητα της αναλυτικής μεθόδου λαμβάνεται εύκολα με απλή επανάληψη της μέτρησης. Η πιστότητα αποτελεί το μέτρο του τυχαίου ή απροσδιόριστου σφάλματος της ανάλυσης και δίνεται από τη σχέση πιστότητα = όπου x i μια αποδεκτή τιμή της ποσότητας που μετρείται και η μέση τιμή (Οδηγία 2002/657/ΕΚ). Τρεις όροι χρησιμοποιούνται για να περιγράψουν την πιστότητα μιας ομάδας πειραματικών δεδομένων: η τυπική απόκλιση (standard deviation), η μεταβλητότητα ή διακύμανση (variance) και ο συντελεστής μεταβλητότητας ή διακύμανσης (coefficient of variation, CV) (Skoog, et al., 2007).Υποσύνολα της πιστότητας είναι οι όροι επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Ως επαναληψιμότητα (repeatability) ορίζεται το μέτρο διασποράς των αποτελεσμάτων διαδοχικών ελέγχων στο ίδιο δείγμα κάτω από τις ίδιες συνθήκες (ίδιο όργανο, ίδιος αναλυτής και σε σύντομο χρονικό διάστημα). Ως αναπαραγωγιμότητα (reproducibility) ορίζεται το μέτρο διασποράς των αποτελεσμάτων διαδοχικών ελέγχων στο ίδιο δείγμα κάτω από διαφορετικές συνθήκες (αλλάζει ένας τουλάχιστον εκ των 3 παραγόντων επαναληψιμότητας) (Οδηγία 2002/657/ΕΚ). ~ 51 ~

70 1.6.6 Ακρίβεια Η ακρίβεια (accuracy) ή αναλυτική αβεβαιότητα (analytical uncertainty) ορίζεται ως η εγγύτητα μεταξύ του αποτελέσματος και της «αληθούς» τιμής. Αφορά το ολικό σφάλμα και περιλαμβάνει το τυχαίο (πιστότητα) και το συστηματικό (ορθότητα) (Οδηγία 2002/657/ΕΚ). Δηλαδή ακρίβεια = πιστότητα + ορθότητα = μ Σφάλματα μετρήσεων Τα σφάλματα, τα οποία παρατηρούνται στην στατιστική ανάλυση των δεδομένων, ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες ανάλογα την προέλευσή τους: τα καθορισμένα ή συστηματικά σφάλματα (determinate ή systematic errors), που μπορούν να αποδοθούν σε συγκεκριμένες αιτίες και τα τυχαία σφάλματα (indeterminate ή random errors), που οφείλονται σε μη ελεγχόμενες και μη μόνιμες αιτίες (Χατζηιωάννου et al., 2006) Συστηματικά σφάλματα Προκατάληψη Τα συστηματικά σφάλματα έχουν καθορισμένη τιμή, προσδιοριζόμενη αιτία και είναι ίδιου πρόσημου και μεγέθους για επαναλαμβανόμενες μετρήσεις οι οποίες πραγματοποιούνται με ακριβώς τον ίδιο τρόπο. Κατά κανόνα, είναι δυνατή η εύρεση των συστηματικών σφαλμάτων και ο προσδιορισμός τους, και κατά συνέπεια ο παρατηρητής μπορεί να τα ελέγχει και να τα εξουδετερώνει μερικώς ή ολικώς (Χατζηιωάννου et al., 2006). Η προκατάληψη (bias) αποτελεί μέτρο του συστηματικού ή καθορισμένου σφάλματος μιας αναλυτικής μεθόδου, επηρεάζει όλα τα δεδομένα και χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένο πρόσημο. Ο προσδιορισμός της προκατάληψης πραγματοποιείται με ανάλυση ενός ή περισσότερων πρότυπων υλικών αναφοράς, των οποίων η περιεκτικότητα σε αναλύτη είναι γνωστή. Ωστόσο τα αποτελέσματα μιας ανάλυσης αυτού του είδους θα περιλαμβάνουν τυχαία και συστηματικά σφάλματα. Εάν πραγματοποιηθεί ικανός αριθμός αναλύσεων, η μέση τιμή μπορεί να προσδιορισθεί με δεδομένη στάθμη εμπιστοσύνης. Κάθε διαφορά μεταξύ αυτής της τιμής και της γνωστής συγκέντρωσης του αναλύτη στο πρότυπο υλικό αναφοράς μπορεί να θεωρηθεί ότι εκφράζει την προκατάληψη. Κανονικά για την ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου γίνεται κάθε προσπάθεια για να εντοπισθεί η πηγή προκατάληψης και στη συνέχεια να εξουδετερωθεί ή να διορθωθεί με τη χρήση τυφλών (blanks) και με βαθμονόμηση του οργάνου (Skoog, et al., 2007). Τα συστηματικά σφάλματα είναι τριών ειδών: οργανολογικά, προσωπικά και μεθοδολογικά. ~ 52 ~

71 Οργανολογικά σφάλματα Μεταξύ των τυπικών αιτιών των οργανολογικών σφαλμάτων αναφέρονται τα φαινόμενα ολίσθησης των ηλεκτρονικών κυκλωμάτων, οι διαρροές συστημάτων κενού, οι επιδράσεις θερμοκρασίας στους ανιχνευτές, τα επαγόμενα ρεύματα στα κυκλώματα από το δίκτυο παροχής τάσης, οι μειώσεις στις τάσεις των μπαταριών κατά τη χρήση τους και τα σφάλματα βαθμονόμησης σε μέτρα, σταθμά και ογκομετρικά σκεύη. Τα συστηματικά οργανολογικά σφάλματα συχνά ανακαλύπτονται και διορθώνονται με βαθμονόμηση με κατάλληλα πρότυπα. Η συχνή βαθμονόμηση των συσκευών είναι πάντοτε επιθυμητή καθότι η απόκρισή τους συχνά αλλάζει με το χρόνο ως συνέπεια φθοράς, διάβρωσης ή κακής χρήσης (Skoog, et al., 2007). Προσωπικά σφάλματα Τα προσωπικά σφάλματα προέρχονται από τις εκτιμήσεις που πρέπει να κάνει ο αναλυτής για το πείραμα. Παραδείγματα αποτελούν ο προσδιορισμός της θέσης μιας βελόνας οργάνου μεταξύ δυο υποδιαιρέσεων μιας κλίμακας, το χρώμα ενός διαλύματος στο τελικό σημείο μια τιτλοδότησης, το επίπεδο του υγρού σε σχέση με μια υποδιαίρεση ενός σιφωνίου ή η σχετική ένταση μεταξύ δυο δεσμών φωτός. Αχρωματοψία ή άλλες φυσικές αδυναμίες αυξάνουν σημαντικά τα προσωπικά σφάλματα. Μια σχεδόν γενικευμένη αιτία προσωπικών σφαλμάτων είναι η προκατάληψη. Οι περισσότεροι αναλυτές έχουν μια φυσική τάση να εκτιμούν τις αναγνώσεις κλιμάκων προς την κατεύθυνση εκείνη που βελτιώνει την πιστότητα σε μια σειρά δεδομένων ή οδηγεί τα αποτελέσματα πλησιέστερα προς την επιθυμητή τιμή. Τα περισσότερα προσωπικά σφάλματα μπορούν να ελαχιστοποιηθούν με προσοχή και αυτοπειθαρχία ή μέσα από αυτοματοποιημένα συστήματα συλλογής δεδομένων (Skoog, et al., 2007). Μεθοδολογικά σφάλματα Τα μεθοδολογικά σφάλματα συχνά προκαλούνται από μη ιδανική χημική και φυσική συμπεριφορά των αντιδραστηρίων και των αντιδράσεων πάνω στην οποία βασίζεται μια ανάλυση. Πιθανές αιτίες περιλαμβάνουν την επιβράδυνση ή μη ολοκλήρωση των χημικών αντιδράσεων, απώλειες λόγω πτητικότητας, προσρόφηση του αναλύτη σε στερεές επιφάνειες, αστάθεια των αντιδραστηρίων, προσμίξεις και χημικές παρεμποδίσεις. Τα συστηματικά μεθοδολογικά σφάλματα είναι συχνά δύσκολο να ανιχνευθούν και να διορθωθούν. Ο καλύτερος και ασφαλέστερος τρόπος είναι η επικύρωση (validation) της μεθόδου χρησιμοποιώντας για την ανάλυση πρότυπα δείγματα, που είναι παρόμοια στη χημική σύσταση και στη φυσική κατάσταση με τα προς ανάλυση δείγματα. Η συγκέντρωση του αναλύτη στα πρότυπα αυτά δείγματα ~ 53 ~

72 πρέπει να είναι γνωστή και με μεγάλη ακρίβεια. Για απλά σώματα, τα πρότυπα δείγματα μπορούν να παρασκευαστούν με προσεκτική ανάμιξη συγκεκριμένων ποσοτήτων από καθαρές ουσίες. Δυστυχώς, τις περισσότερες φορές τα δείγματα είναι ιδιαίτερα πολύπλοκα και η προηγούμενη προσέγγιση δεν είναι τόσο απλή (Skoog, et al., 2007) Τυχαία σφάλματα Τα τυχαία σφάλματα συνοδεύουν κάθε μέτρηση, προέρχονται από μη μόνιμες αιτίες (ατέλειες των αισθητήριων οργάνων του παρατηρητή, παρασιτικές διαταραχές που παρενοχλούν τη μέτρηση, διακυμάνσεις εξωτερικών επιδράσεων και πλήθος άλλων αστάθμητων και μη ελεγχόμενων παραγόντων) και είναι δικατευθυνόμενα (θετικά και αρνητικά), γι αυτό και επιδρούν ακανόνιστα στο αποτέλεσμα. Τα τυχαία σφάλματα έχουν ως μέση τιμή το μηδέν και εξουδετερώνονται με αύξηση του αριθμού των μετρήσεων, χωρίς όμως να είναι δυνατή η πλήρης εξάλειψής τους, εφόσον γι αυτό θα χρειαζόταν άπειρες μετρήσεις. Στις χημικές αναλύσεις, τα αποτελέσματα των επαναλαμβανόμενων μετρήσεων που προκύπτουν από την ύπαρξη τυχαίων σφαλμάτων, θεωρούνται ότι κατανέμονται σύμφωνα με το νόμο της κανονικής κατανομής σφάλματος (Χατζηιωάννου et al., 2006) Ευαισθησία Ως ευαισθησία ενός οργάνου ή μιας αναλυτικής μεθόδου ορίζεται το μέτρο της ικανότητάς τους να διακρίνουν μικρές διαφορές στη συγκέντρωση του αναλύτη. Δυο παράγοντες καθορίζουν την ευαισθησία: η κλίση της καμπύλης βαθμονόμησης και η πιστότητα της συσκευής μέτρησης. Μεταξύ δύο μεθόδων που παρουσιάζουν την ίδια πιστότητα, η πιο ευαίσθητη είναι εκείνη η οποία έχει καμπύλη βαθμονόμησης με τη μεγαλύτερη κλίση. Αντίστοιχα, εάν οι δύο μέθοδοι έχουν καμπύλες βαθμονόμησης με ίσες κλίσεις, η πιο ευαίσθητη είναι εκείνη με την καλύτερη πιστότητα (Skoog, et al., 2007) Όριο ανίχνευσης Το όριο ανίχνευσης αποτελεί την ελάχιστη συγκέντρωση ή μάζα του αναλύτη, η οποία μπορεί να ανιχνευθεί με καθορισμένη στάθμη (ή επίπεδο) εμπιστοσύνης. Το όριο εξαρτάται από τον λόγο της τιμής του αναλυτικού σήματος προς το μέγεθος των στατιστικών διακυμάνσεων του σήματος του τυφλού. Εάν το σήμα δεν είναι μεγαλύτερο από το σήμα του τυφλού κατά ένα πολλαπλάσιο της μεταβλητότητας του τυφλού, λόγω σφαλμάτων, είναι αδύνατη η ανίχνευση αναλυτικού σήματος με βεβαιότητα (Skoog, et al., 2007). ~ 54 ~

73 Γραμμικότητα Η δυναμική περιοχή μιας αναλυτικής μεθόδου είναι περιοχή η οποία εκτείνεται από τη μικρότερη συγκέντρωση στην οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί ποσοτική μέτρηση, γνωστή ως όριο ποσοτικοποίησης (limit of quantitation, LOQ), έως τη συγκέντρωση στην οποία η καμπύλη βαθμονόμησης αποκλίνει από τη γραμμικότητα, γνωστή ως όριο γραμμικότητας (limit of linearity, LOL). Το κατώτερο όριο ποσοτικών μετρήσεων γενικά θεωρείται ότι είναι το δεκαπλάσιο της τυπικής απόκλισης του τυφλού. Για να είναι χρήσιμη μια αναλυτική μέθοδος θα πρέπει να διαθέτει δυναμική περιοχή που να καλύπτει τουλάχιστον δύο τάξεις μεγέθους. Μερικές μέθοδοι μπορούν να εφαρμοσθούν σε δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων που καλύπτει πέντε έως έξι τάξεις μεγέθους (Skoog, et al., 2007) Εξειδίκευση Εκλεκτικότητα Η εξειδίκευση και η εκλεκτικότητα αφορούν την ικανότητα της μεθόδου να διακρίνει έναν αναλύτη από τους υπόλοιπους αναλύτες ή από γνωστές προσμίξεις, μεταβολίτες, προϊόντα διάσπασης και συστατικά του μητρικού υλικού του δείγματος. Για χρωματογραφικές μεθόδους η εξειδίκευση ελέγχεται με τη διαχωριστική ικανότητα (R s ) της στήλης. Στη χρωματογραφία ο έλεγχος της εξειδίκευσης πρέπει να αποδεικνύει την καθαρότητα της χρωματογραφικής κορυφής, δηλαδή, ότι η κορυφή αυτή προέρχεται από ένα μόνο συστατικό. Σε μίγμα πολλών ουσιών πολλές από τις οποίες συνεκλούονται, η εξειδίκευση μπορεί πιο εύκολα να αποδειχθεί με χρήση δύο στηλών διαφορετικής πολικότητας. Με τις τεχνικές φασματομετρίας μάζας η εξειδίκευση αυξάνεται σε μέγιστο βαθμό, πρέπει όμως και πάλι να αποδεικνύεται, π.χ. με τη χρήση της αναλογίας των δύο σημαντικότερων ιόντων (Οδηγία 2002/657/ΕΚ). Η εκλεκτικότητα μιας αναλυτικής μεθόδου αναφέρεται στο βαθμό στον οποίο η μέθοδος είναι απαλλαγμένη παρεμποδίσεων από άλλες ουσίες, οι οποίες βρίσκονται στη μήτρα του δείγματος. Δυστυχώς καμία αναλυτική μέθοδος δεν είναι τελείως απαλλαγμένη από παρεμποδίσεις άλλων ουσιών και συχνά πρέπει να λαμβάνονται μέτρα για να ελαχιστοποιηθούν αυτές οι παρεμποδίσεις (Skoog, et al., 2007) Ανθεκτικότητα Η ανθεκτικότητα είναι η ικανότητα της μεθόδου να μη μεταβάλλεται το αποτέλεσμα της μέτρησης, όταν πραγματοποιούνται μικρές μεταβολές στις πειραματικές παραμέτρους. Η ανθεκτικότητα δείχνει την αξιοπιστία μιας ανάλυσης σε σχέση με προσχεδιασμένες τεχνικές. Εξετάζεται δηλαδή αν υπάρχουν διαφορές που να οφείλονται σε ορισμένες παραμέτρους. Για το σχεδιασμό μιας τέτοιας μελέτης επιλέγονται οι παράγοντες που μπορεί να επηρεάσουν το αποτέλεσμα της μέτρησης όπως είναι η θερμοκρασία, το ph, ο αναλυτής, η πηγή προέλευσης και η ηλικία αντιδραστηρίων, διαλυτών και προτύπων. Η εκτίμηση της ανθεκτικότητας γίνεται ~ 55 ~

74 εξετάζοντας κατά πόσον η συμμετοχή της αβεβαιότητας των παραμέτρων αυτών στη συνολική αβεβαιότητα της μεθόδου είναι σημαντική (Οδηγία 2002/657/ΕΚ). ~ 56 ~

75 II. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Χημικά και εξοπλισμός Υλικά 1) Βαθμονομημένες ογκομετρικές φιάλες παρασκευής και φύλαξης διαλυμάτων χωρητικότητας 10, 25 και 100 ml της Isolab. 2) Εργαστηριακές μεταλλικές σπάτουλες. 3) Ογκομετρικοί κύλινδροι χωρητικότητας 10, 50, 100, 500 και 1000 ml της Isolab. 4) Πλαστικά ρύγχη (tips) αυτόματων πιπετών. 5) Πλαστικά σκαφίδια ζύγισης. 6) Πλαστικές φιάλες συλλογής δειγμάτων από πολυαιθυλένιο (PE) χωρητικότητας 1000 ml. 7) Υάλινα σκουρόχρωμα φιαλίδια (vials) αυτόματου εισαγωγέα της Agilent με βιδωτό πλαστικό πώμα με ελαστικό διάφραγμα (septum) χωρητικότητας 2 ml. 8) Υάλινα φιαλίδια των 20 ml με πώμα από πολυπροπυλένιο (PP). 9) Υάλινες πιπέτες Pasteur. 10) Υάλινοι σωλήνες συλλογής των 10 ml για την παραλαβή των εκχυλισμάτων από την SPE. 11) Φιαλίδια Eppendorf χωρητικότητας 1,5 ml. 12) Φίλτρα διήθησης μικροϊνών υάλου GF/F (Whatman, UK) της GE Healthcare Life Sciences με διάμετρο πόρων 0,70 μm. 13) Φίλτρα σύριγγας Puradisc 25 NYL με διάμετρο πόρων 0,20 μm. 14) Φυσίγγια εκχύλισης Oasis HLB TM (200 mg, 6 ml) της Waters Εργαστηριακές συσκευές 1) Αναλυτικός ζυγός ALJ NM της Kern, τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων με εύρος ορίων ζύγισης 10 mg 220 g για τη ζύγιση πρότυπων ουσιών αναφοράς. 2) Αυτόματες πιπέτες μεταβλητού όγκου μl HTL Labmate + και μl Smart Accumax και Transferpette S. 3) Αυτόματος αναδευτήρας τύπου δύνης (vortex) της Velp Scientifica για την ανάδευση δειγμάτων και διαλυμάτων. 4)Διάταξη διήθησης υπό κενό βρύσης. 5) Διάταξη εκχύλισης SPE Vac Elut 20 Manifold της Agilent με πίεση παρεχόμενη με κενό βρύσης. 6) Μαγνητικός αναδευτήρας και θερμαντικός μανδύας (heat control-hotplate magnetic stirrer) Cole Parmer για την ανάδευση και θέρμανση των εκχυλισμάτων κατά το στάδιο της εξάτμισής τους στην SPE. ~ 57 ~

76 7) Συσκευή παραγωγής τρις αποσταγμένου νερού Myron L Company αγωγιμότητας 18 ΜΩ cm Διαλύτες και αντιδραστήρια 1) Ακετονιτρίλιο (CH 3 CN/ACN) chromasolv κατάλληλο για HPLC, βαθμού καθαρότητας 99,9 % (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 2) Μεθανόλη (CH 3 OH/MeOH) chromasolv κατάλληλο για HPLC, βαθμού καθαρότητας 99,9 % (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 3) Νερό (H 2 O) chromasolv plus κατάλληλο για HPLC, (Sigma Aldrich, Switzerland). 4) Νερό (H 2 O) τρεις φορές αποσταγμένο, ειδικής αγωγιμότητας τουλάχιστον 18 MΩ cm. 5) 2-προπανόλη (C 3 H 7 OH) chromasolv κατάλληλο για HPLC, βαθμού καθαρότητας 99,9 % (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 6) Οξικό οξύ (HCOOH), κατάλληλο για LC-MS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 7) Διάλυμα βαθμονόμησης και συντονισμού του QTOF LC/MS (ESI-L Low Concentration Tuning Mix, P/N G , Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA). Πρόκειται για μίγμα αποτελούμενο από 13 ουσίες διαλυμένες σε μίγμα ακετονιτριλίου/νερού 95:5 (v/v). 8) Σετ παρασκευής διαλύματος διόρθωσης βαθμονόμησης του TOF-MS κατά τη διάρκεια των αναλύσεων (API-TOF Reference Mass Solution Kit, P/N G , Agilent Technologies). Το σετ αποτελείται από δύο αμπούλες με διάλυμα αμμωνιακού άλατος του τριφθοροξικού οξέος, δύο αμπούλες με διάλυμα εξάκις- (1Η,1Η,3Η-τετραφλουοροπροποξυ)-φωσφαζίνης και δύο αμπούλες με διάλυμα πουρίνης. 9) Διάλυμα οξικού οξέος 0,01 % (v/v) σε νερό καθαρότητας HPLC που χρησιμοποιήθηκε στην κινητή φάση ως διαλύτης Α. 10) Διάλυμα οξικού οξέος 0,01 % (v/v) σε ακετονιτρίλιο καθαρότητας HPLC που χρησιμοποιήθηκε στην κινητή φάση ως διαλύτης Β. 11) Διαλύτης ανασύστασης των εκχυλισμάτων SPE πριν την ανάλυση με το UHPLC/QTOF-MS ήταν ακετονιτρίλιο/νερό 10:90 (v/v). 12) Αέριο άζωτο (Ν 2 ) υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για LC-MS Ουσίες αναφοράς Δεκατρείς ουσίες αναφοράς προμηθεύτηκαν από τις εταιρείες Sigma Aldrich και Fluka σε στερεή μορφή (σκόνη). Αυτές ήταν οι εξής: ακεταμινοφαίνη ή παρακεταμόλη, ατενολόλη, ατορβαστατίνη (ως τριϋδρικό άλας ασβεστίου), βαμεθάνη (ως ημισουλφιδικό άλας), αζιθρομυκίνη (διϋδρική), ιβουπροφαίνη, καρβαμαζεπίνη, καφεΐνη, κλαριθρομυκίνη, ομεπραζόλη, ρανιτιδίνη (υδροχλωρική), υδροχλωροθειαζίδη, φουροσεμίδη. Οι ουσίες αυτές επιλέχθηκαν με βάση την υψηλή ετήσια ~ 58 ~

77 κατανάλωσή τους στην Ελλάδα και το ενδιαφέρον για τις πιθανές επιπτώσεις τους στους ανθρώπινους και υδάτινους οργανισμούς Εσωτερικό πρότυπο Η ποσοτικοποίηση των δώδεκα φαρμακευτικών ουσιών πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του εσωτερικού προτύπου. Η παρουσία εσωτερικού προτύπου καθίστανται αναγκαία κατά την ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων, ιδιαίτερα όταν αυτά προέρχονται από πολύπλοκα υποστρώματα όπως είναι τα υγρά απόβλητα προκειμένου να αντισταθμιστούν απώλειες κατά το στάδιο της προεπεξεργασίας (διήθηση, εκχύλιση), να εξαλειφθούν φαινόμενα καταστολής ή ενίσχυσης του σήματος που είναι συχνά στην τεχνική φασματομετρίας μαζών και ιδιαίτερα σε συστήματα που χρησιμοποιούν ως πηγή ιοντισμού τον ηλεκτροψεκασμό και γενικά να εξασφαλιστεί η κατά το δυνατό πιο αξιόπιστη ποσοτικοποίηση των προσδιοριζόμενων ουσιών. Επιπρόσθετα, επιβάλλεται η καθαρότητα του εσωτερικού προτύπου να είναι υψηλού βαθμού, προκειμένου να αποφευχθεί η συνεισφορά αυτού στο σήμα του αναλύτη. (Ferrer et al., 2010; Gros et al., 2006; Stokvis et al., 2005; Wieling, 2002). Ως εσωτερικό πρότυπο επιλέχθηκε η βαμεθάνη μια φαρμακευτική ένωση με παρόμοια δομή με τους εξεταζόμενους αναλύτες, η οποία δεν είναι εμπορικά διαθέσιμη και δεν ανιχνεύεται στα υγρά απόβλητα. Η ένωση αυτή εκλούεται κοντά, αλλά σε καμία περίπτωση δεν επικαλύπτει κάποιον άλλο αναλύτη και δεν διασπάται. ~ 59 ~

78 2.2 Πρότυπα διαλύματα Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων παρακαταθήκης Η παρασκευή διαλυμάτων παρακαταθήκης για κάθε μία από τις φαρμακευτικές ουσίες που μελετήθηκαν πραγματοποιήθηκε με τη ζύγιση κατάλληλης ποσότητας στερεής πρότυπης ουσίας, η οποία στη συνέχεια διαλύθηκε και αραιώθηκε σε καθαρή μεθανόλη με τελική συγκέντρωση 1000 μg/ml. Εξαίρεση αποτέλεσε η ατορβαστατίνη η οποία λόγω της περιορισμένης διαθέσιμης ποσότητας αραιώθηκε σε τελική συγκέντρωση 100 μg/ml. Το διάλυμα της ομεπραζόλης ανανεώνονταν κάθε μήνα λόγω της χαμηλής σταθερότητας της ένωσης αυτής (Gracia-Lor et al., 2010; Castiglioni et al., 2005). Τα διαλύματα παρακαταθήκης τοποθετήθηκαν σε ειδικά υάλινα φιαλίδια με πώμα από Teflon και αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη στους 18 ο C. Ένα διάλυμα εργασίας με συγκέντρωση 1 μg/ml το οποίο περιείχε μίγμα όλων των προσδιοριζόμενων ουσιών παρασκευάστηκε σε νερό/μεθανόλη 90:10 (v/v) Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων εργασίας Μίγματα πρότυπων διαλυμάτων εργασίας παρασκευάζονταν με κατάλληλη αραίωση των ατομικών διαλυμάτων παρακαταθήκης των αναλυτών σε υπόστρωμα πόσιμου νερού βρύσης στο οποίο είχε πιστοποιηθεί η απουσία των εξεταζόμενων ουσιών. Τα μίγματα αυτά παρασκευάστηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των πρότυπων καμπυλών βαθμονόμησης και στην επικύρωση της μεθόδου. Όλα τα πρότυπα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση και δεν αποθηκεύονταν. ~ 60 ~

79 2.3 Δειγματοληψία Η συλλογή των δειγμάτων διενεργήθηκε την περίοδο Μαΐου Ιανουαρίου 2015 από δύο εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ) στην περιοχή της Πάτρας, Δυτική Ελλάδα, τη μονάδα επεξεργασίας αστικών λυμάτων του Δήμου Πατρών (ΕΕΛ1) και τη μονάδα επεξεργασίας νοσοκομειακών λυμάτων του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου των Πατρών (ΕΕΛ2). Η ΕΕΛ του Δήμου Πατρών εφαρμόζει προκαταρκτική επεξεργασία για την αφαίρεση των χονδρόκοκκων σωματιδίων, πρωτοβάθμια επεξεργασία για τη μείωση των αιωρούμενων στερεών σωματιδίων (πρωτοβάθμια καθίζηση), βιολογική διεργασία με ενεργό ιλύ (αναερόβια/ανοξική και αερόβια βαθμίδα ακολουθούμενη από δευτεροβάθμια καθίζηση) και τελική απολύμανση (χλωρίωση) των επεξεργασμένων λυμάτων. Λόγω του σημαντικά μικρότερου μεγέθους, τα στάδια της πρωτοβάθμιας καθίζησης και της αναερόβιας/ανοξικής βιολογικής βαθμίδας απουσιάζουν στην ΕΕΛ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Στιγμιαία δείγματα συλλέχτηκαν εντός εικοσιτετραώρου κάθε δύο μήνες την ανωτέρω περίοδο από διάφορα σημεία της ΕΕΛ1 όπως είναι η εισροή, η εκροή της δεξαμενής πρωτοβάθμιας καθίζησης, η εισροή και η εκροή της δεξαμενής δευτεροβάθμιας καθίζησης και η τελική εκροή (μετά τη χλωρίωση), ενώ από την ΕΕΛ2 τα δείγματα αφορούσαν μόνο την είσοδο και έξοδο των λυμάτων από τη μονάδα. Τα δείγματα διατηρήθηκαν στη συντήρηση από τη στιγμή της δειγματοληψίας μέχρι και την εκχύλισή τους. Σε κάθε περίπτωση, πραγματοποιήθηκε διήθηση όλων των δειγμάτων μέσω φίλτρου ινών υάλου πορώδους 0,7 μm για την αφαίρεση των αιωρούμενων στερεών σωματιδίων και εκχύλιση εντός 48 ωρών από τη δειγματοληψία. Σχήμα 2.1: Σημεία δειγματοληψίας (αριθμοί σε κύκλο) στα διάφορα στάδια της δημοτικής εγκατάστασης επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ1) στην Πάτρα. ~ 61 ~

80 Πίνακας 2.1: Χαρακτηριστικά των δύο εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυμάτων που μελετήθηκαν. ΕΕΛ Ισοδύναμοι κάτοικοι Μέση ροή (m 3 /d) SRT (d) HRT (h) Τελικός αποδέκτης Πάτρα (ΕΕΛ1) Πατραϊκός κόλπος Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών (ΕΕΛ2) Υγρή περίοδος: Χείμαρρος Σέλεμνος Ξηρή περίοδος: Υπεδάφιο πεδίο διάθεσης Εικόνα 2.1: Εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων στην περιοχή της Πάτρας από τις οποίες πραγματοποιήθηκε η δειγματοληψία. ~ 62 ~

81 2.4 Προεπεξεργασία δειγμάτων Για την προσυγκέντρωση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε μία επιτραπέζια διάταξη Εκχύλισης Στερεάς Φάσης (SPE). Η διάταξη αυτή παρέχει ειδικές θέσεις για την τοποθέτηση των φυσιγγίων εκχύλισης και λειτουργεί υπό κενό βρύσης για τη διευκόλυνση της διέλευσης των διαλυτών και των δειγμάτων μέσα από τους ροφητές των φυσιγγίων εκχύλισης. Τα φυσίγγια εκχύλισης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Oasis HLB TM (200 mg, 6 ml) της Waters. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ενεργοποίηση των ροφητών των φυσιγγίων Oasis HLB TM με την προσθήκη 5 ml μεθανόλης και ακολούθως με 6 ml νερού καθαρότητας HPLC με ρυθμό ροής 1 ml/min. Μετά το στάδιο της ενεργοποίησης ακολούθησε η φόρτωση των δειγμάτων στα φυσίγγια. Για τα δείγματα που προέρχονται από την εισροή, καθώς και αυτά από τα ενδιάμεσα στάδια των ΕΕΛ ο όγκος δείγματος που φορτώθηκε ήταν 100 ml, ενώ για τα δείγματα που προέρχονται από την εκροή των ΕΕΛ ο όγκος αυτός ήταν 200 ml. Η φόρτωση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με ρυθμό ροής 10 ml/min. Κατόπιν, τα φυσίγγια εκπλένονται με 5 ml νερό και αφήνονται για περίπου 5 λεπτά να στεγνώσουν υπό κενό πριν ακολουθήσει η έκλουση. Η έκλουση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με 2 x 4 ml μεθανόλης με ρυθμό ροής 1 ml/min. Τα εκχυλίσματα παρελήφθησαν σε σωλήνες συλλογής των 10 ml, τοποθετήθηκαν στη συνέχεια σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 35 o C και εξατμίστηκαν σχεδόν μέχρι ξηρού με τη βοήθεια απαλού ρεύματος αζώτου. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ανασύσταση των δειγμάτων σε 1 ml ακετονιτριλίου/νερού, 10:90 (v/v) και τέλος, ακολούθησε η Εικόνα 2.2: Εργαστηριακή διάταξη εκχύλισης SPE με επισημασμένα τα βασικά μέρη της. ~ 63 ~

82 διήθησή τους με τη χρήση φίλτρου σύριγγας 0,20 μm κατευθείαν σε φιαλίδια ανάλυσης. Τα βήματα που ακολουθήθηκαν κατά την εκχύλιση στερεάς φάσης παρατίθενται στο σχήμα 2.2. Σχήμα 2.2: Διαγραμματική απεικόνιση της πειραματικής πορείας της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). ~ 64 ~

83 2.5 Οργανολογία Προετοιμασία συστήματος υγρής χρωματογραφίας Παρασκευή επαρκούς ποσότητας από τους διαλύτες που αποτελούν την κινητή φάση του συστήματος υγρής χρωματογραφίας και ενημέρωση του λογισμικού του οργάνου με τον ακριβή όγκο του διαλύτη σε καθέναν από τους δύο διαλύτες. Έκπλυση της διαδρομής του δείγματος με διάλυμα κινητής φάσης με υψηλή περιεκτικότητα σε οργανικό διαλύτη π.χ. μίγμα ακετονιτριλίου/νερού 90:10 (v/v). Πλήρωση του φιαλιδίου έκπλυσης της σύριγγας του αυτόματου δειγματολήπτη με διαλύτη ισοπροπανόλης/νερού 50:50 (v/v). Σταθεροποίηση της χρωματογραφικής στήλης με την κινητή φάση της μεθόδου ανάλυσης και καταγραφή της πίεσης του συστήματος και του αριθμού των αναλυόμενων δειγμάτων Προετοιμασία φασματόμετρου μαζών Βαθμονόμηση (calibration) του συστήματος ως προς τις τιμές m/z (με ακρίβεια μέτρησης 4 δεκαδικών ψηφίων) με βάση τις τιμές m/z γνωστών πρότυπων ουσιών, σύμφωνα με τις προδιαγραφές και τις υποδείξεις του κατασκευαστή του οργάνου. Για το σκοπό αυτό εισάγεται από το σύστημα παροχής CDS (calibrant delivery system) με απευθείας έγχυση στην πηγή ιοντισμού του φασματόμετρου μαζών διάλυμα μίγματος 13 ουσιών (ESI-L low concentration tuning mix) που στη λειτουργία θετικού ιοντισμού σχηματίζουν 10 πρωτονιωμένα ιόντα με τιμές m/z που κυμαίνονται μεταξύ 118, ,8950, ενώ στη λειτουργία αρνητικού ιοντισμού σχηματίζουν ιόντα σε εύρος τιμών m/z 112, ,8731. Η βαθμονόμηση του άξονα των τιμών m/z πραγματοποιείται αυτόματα από το λογισμικό του οργάνου με τη βοήθεια πολυωνυμικής εξίσωσης και υπολογίζονται οι ακριβείς τιμές m/z για τα ιόντα αναφοράς, καθώς και τα σφάλματα αυτών. Κριτήριο αποδοχής τη διαδικασίας βαθμονόμησης είναι η εμφάνιση τυχαία κατανεμημένων θετικών και αρνητικών σφαλμάτων για τα 10 ιόντα, ενώ η απόλυτη τιμή του σφάλματος δε θα πρέπει σε καμία περίπτωση να υπερβαίνει τα 2 ppm. Η διαδικασία βαθμονόμησης του άξονα m/z πραγματοποιείται καθημερινά πριν την έναρξη της ανάλυσης των δειγμάτων (Βοναπάρτη, 2011). Ο συντονισμός (tuning) του συστήματος πραγματοποιείται για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων του φασματόμετρου μαζών, τόσο του αναλυτή χρόνου πτήσης όσο και του τετράπολου, με στόχο να επιτευχθεί η μέγιστη δυνατή απόκριση διατηρώντας ταυτόχρονα αποδεκτή διακριτική ικανότητα (Βοναπάρτη, 2011). Οι παράμετροι που ρυθμίζονται με τη διαδικασία αυτή σχετίζονται με τη μεταφορά, το διαχωρισμό και την ανίχνευση των ιόντων. Τα μέρη του φασματόμετρου που επηρεάζονται είναι το οπτικό σύστημα ιόντων (τριχοειδής σωλήνας, αποκορυφωτής, οκτάπολο, ηλεκτροστατικοί φακοί), ο αναλυτής μάζας ~ 65 ~

84 (τετράπολο ή χρόνου πτήσης) και ο συλλέκτης ιόντων (πλάκα πολλαπλής διέλευσης σπινθηριστής φωτοπολλαπλασιαστής) (Αναγνωστόπουλος, 2012). Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται για την περίπτωση του αναλυτή χρόνου πτήσης μία έως δύο φορές το μήνα και ανά εξάμηνο για το τετράπολο. Πραγματοποιείται με την απευθείας εισαγωγή στην πηγή ιοντισμού ενός διαλύματος ιόντων των οποίων οι ακριβείς μάζες είναι γνωστές, όπως αναφέρθηκε παραπάνω κατά τη διαδικασία βαθμονόμησης. Κριτήρια αποδοχής της διαδικασίας είναι η εμφάνιση σφαλμάτων μάζας μικρότερων των 2 ppm σε όλα τα ιόντα αναφοράς, η λήψη ικανοποιητικής μορφής κορυφών για τα ιόντα με συγκεκριμένες τιμές m/z, καθώς και για τα ισότοπά τους και η επίτευξη διακριτικής ικανότητας των κορυφών πάνω από μία προκαθορισμένη τιμή. Στη συνέχεια λαμβάνεται μια αναφορά στην οποία παρουσιάζονται με τη μορφή πίνακα για κάθε ένα από τα ιόντα αναφοράς οι θεωρητικές τιμές m/z, οι πειραματικές τιμές m/z μετά την ολοκλήρωση του συντονισμού, ο χρόνος πτήσης, η αφθονία των ιόντων, η διακριτική ικανότητα, η τιμή FWHM που αντιστοιχεί στο εύρος της φασματικής κορυφής στο μισό του ύψους αυτής, η διαφορά ανάμεσα στη θεωρητική και πειραματική τιμή m/z και το αντίστοιχο σφάλμα εκφρασμένο σε ppm (Βοναπάρτη, 2011). Για την επίτευξη υψηλής ακρίβειας μάζας των μετρήσεων υπάρχει η δυνατότητα της συνεχούς διόρθωσης της καμπύλης βαθμονόμησης (reference mass correction) καθ όλη τη διάρκεια της ανάλυσης. Αυτή πραγματοποιείται με τη συνεχή εισαγωγή στο φασματόμετρο μαζών διαλύματος αναφοράς που περιέχει τις ουσίες πουρίνη και εξάκις-(1η,1η,3η-τετραφλουοροπροποξυ)-φωσφαζίνη στη λειτουργία θετικού ιοντισμού και επιπλέον την ουσία τριφθοροξικό αμμώνιο στη λειτουργία αρνητικού ιοντισμού. Προκειμένου να αποφευχθεί η πρόκληση του φαινομένου καταστολής του σήματος των ιόντων των αναλυόμενων ουσιών από τις παραπάνω ουσίες αναφοράς, το προαναφερθέν διάλυμα εισάγεται στο φασματόμετρο μαζών και μετατρέπεται σε αερόλυμα σε διαφορετική βελόνα νεφελοποίησης από εκείνη που διέρχεται η εξερχόμενη από τη χρωματογραφική στήλη κινητή φάση. Η διοχέτευση του διαλύματος αναφοράς γίνεται αυτόματα από το σύστημα παροχής CDS και ενεργοποιείται από το χειριστή του οργάνου λίγα λεπτά πριν την έναρξη της ανάλυσης. Με τον τρόπο αυτό το σύστημα ρυθμίζει αυτόματα τυχόν αποκλίσεις πέραν των επιτρεπτών ορίων. Επιπλέον, η παράμετρος της ακρίβειας μάζας παρακολουθείται μέσω του διαγράμματος μέσης τιμής. Η απόκριση των αντίστοιχων ιόντων ελέγχεται ώστε να βρίσκεται μεταξύ των τιμών Κ (Βοναπάρτη, 2011) Συνθήκες λειτουργίας συστήματος QTOF LC/MS Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το σύστημα QTOF LC/MS της εταιρείας Agilent που περιλαμβάνει σύστημα υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) συνδεδεμένο με τετραπολικό φασματόμετρο μαζών με αναλυτή χρόνου πτήσης (Quadrupole Time Of Flight Mass Spectrometer, QTOF-MS). ~ 66 ~

85 Συνθήκες λειτουργίας συστήματος υγρής χρωματογραφίας Το σύστημα υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης (1260 LC Series Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) αποτελείται από σύστημα αντλίας δύο καναλιών με δυνατότητα βαθμιδωτής έκλουσης και παροχής των διαλυτών με ανάμιξη σε υψηλή πίεση, σύστημα αυτόματης απαέρωσης για την απομάκρυνση του αέρα από τα κανάλια διόδου της κινητής φάσης, αυτόματο δειγματολήπτη 100 θέσεων με δυνατότητα ρύθμισης του όγκου ένεσης μεταξύ 0,1 100 μl και θερμοστατούμενο θάλαμο τοποθέτησης της χρωματογραφικής στήλης. Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντίστροφης φάσης, η οποία φέρει ως υλικό πλήρωσης ομάδες σιλανόλης χημικά συνδεδεμένες με αλυσίδες 18 ατόμων άνθρακα (C 18 ). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η στήλη Zorbax Extend-C 18 Rapid Resolution HT της Agilent με μήκος 50 mm, εσωτερική διάμετρο 2,1 mm και διάμετρο σωματιδίων 1,8 μm. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 30 o C. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε περιείχε υδατικό διάλυμα οξικού οξέος 0,01 % (v/v) ως διαλύτη Α και ακετονιτρίλιο με οξικό οξύ 0,01 % (v/v) ως διαλύτη Β. Λόγω της μεγάλης ποικιλίας που παρουσιάζουν οι αναλύτες ως προς την πολικότητά τους, επιλέχθηκε η χρησιμοποίηση βαθμιδωτής έκλουσης (gradient elution) με διατήρηση σταθερής ταχύτητας ροής της κινητής φάσης στην τιμή 0,4 ml/min. Για τον καλύτερο διαχωρισμό των αναλυτών, αλλά και λόγω των διαφορετικών συνθηκών ιοντισμού τους, κρίθηκε απαραίτητη η κατηγοριοποίηση των 12 αναλυτών σε 3 ομάδες. Για τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού και των παραμέτρων MS/MS των προσδιοριζόμενων ουσιών κρίθηκε απαραίτητη η κατηγοριοποίηση τους σε 3 ομάδες. Ο όγκος του ενέσιμου δείγματος ήταν 20 μl. Η βαλβίδα εκτροπής (divert valve) που υπάρχει στο χρησιμοποιούμενο σύστημα μετά την έξοδο του χρωματογραφικού εκλούσματος από τη στήλη και πριν την είσοδό του στην πηγή ιοντισμού του φασματόμετρου μαζών ρυθμίστηκε να διοχετεύει τη ροή της κινητής φάσης εκτός του ανιχνευτή κατά τη διάρκεια της περιόδου μετά την ανάλυση (post time) έτσι ώστε να απομακρύνονται τυχόν υπολείμματα του προηγούμενου δείγματος. Για την αποφυγή εμφάνιση επιμόλυνσης κατά τη μεταφορά των δειγμάτων (carry over), το σύστημα επιτρέπει τη δυνατότητα έκπλυσης της βελόνας ένεσης εξωτερικά με κατάλληλο μίγμα διαλυτών έπειτα από κάθε χρήση της, ενώ ταυτόχρονα πραγματοποιείται συνεχής έκπλυση της βελόνας εσωτερικά κατά τη διάρκεια της ανάλυσης από τη ροή των διαλυτών της κινητής φάσης (Βοναπάρτη, 2011). Ο διαλύτης έκπλυσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα ισοπροπανόλης/νερού 50:50 (v/v) Συνθήκες λειτουργίας συστήματος φασματομετρίας μαζών Το παραπάνω σύστημα ήταν συνδεδεμένο με σύστημα συζευγμένης φασματομετρίας μαζών QTOF-MS (6538 UHD Accurate-Mass QTOF LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) με πηγή ιοντισμού με διπλό ηλεκτροψεκασμό (dual ESI) και με δυνατότητα ρύθμισης της λειτουργίας αυτής σε θετικό ή αρνητικό ιοντισμό. Το σύστημα διέθετε τετραπολικό αναλυτή μαζών ~ 67 ~

86 συζευγμένο με ορθογώνιας επιτάχυνσης αναλυτή χρόνου πτήσης, ενώ μια γεννήτρια αζώτου παρείχε υψηλής καθαρότητας άζωτο τόσο στην πηγή ιοντισμού ως αέριο εκνέφωσης (nebulizing gas) και αποδιαλύτωσης (drying gas) όσο και στη κυψελίδα συγκρούσεων ως αέριο σύγκρουσης (collision gas). Η θερμοκρασία και η ταχύτητα ροής του αερίου αποδιαλύτωσης ρυθμίστηκαν στους 300 o C και 10 L/min, αντίστοιχα. Η πίεση του αερίου στη βελόνα νεφελοποίησης στην οποία εισάγεται το χρωματογραφικό έκλουσμα ρυθμίστηκε στα 30 psi. Το δυναμικό του τριχοειδούς (capillary voltage) και του αποκορυφωτή / διαχωριστή ιόντων (skimmer) στην έξοδο του τριχοειδούς ρυθμίστηκαν για το θετικό ιοντισμό στα 3500 V και 65 V, ενώ για τον αρνητικό ιοντισμό στα 3500 V και 65 V, αντίστοιχα. Για κάθε αναλύτη ορίστηκαν συγκεκριμένες τιμές δυναμικού θραυσματοποίησης και ενέργειας σύγκρουσης, όπως αυτές περιγράφονται στην ενότητα 3.2. Ο ανιχνευτής του συστήματος ήταν ένας αναλογοψηφιακός μετατροπέας (ADC) και επιλέχτηκε στη λειτουργία υψηλού δυναμικού εύρους συχνότητας 2 GHz (extended dynamic range) και σε χαμηλό εύρο τιμών m/z ( m/z). Το εύρος των ανιχνευόμενων τιμών m/z ρυθμίστηκε σε m/z και η ταχύτητα σάρωσης ήταν 1 scan/sec. Όλες οι υπόλοιπες παράμετροι λειτουργίας του φασματόμετρου μαζών ρυθμίζονταν και βελτιστοποιούνταν στο σύνολό τους μέσω της διαδικασίας συντονισμού του οργάνου με στόχο τη μέγιστη δυνατή διακριτική ικανότητα και ευαισθησία του συστήματος QTOF-MS. Κατά τη διάρκεια των αναλύσεων επιλέχθηκε η δυνατότητα συνεχούς διόρθωσης της βαθμονόμησης του συστήματος με Εικόνα 2.3: Agilent UHD 6538 LC/QTOF-MS. ~ 68 ~

87 διοχέτευση κατάλληλου διαλύματος που περιείχε γνωστές τιμές ιόντων αναφοράς. Στη λειτουργία θετικού ιοντισμού τα ιόντα αναφοράς είχαν τιμές m/z 121,0509 και 922,0098, ενώ στη λειτουργία αρνητικού ιοντισμού οι αντίστοιχες τιμές m/z ήταν 112,9856 και 1033,9881. Σε ό,τι αφορά τους τρόπους λήψης φασμάτων με το σύστημα LC/QTOF-MS χρησιμοποιήθηκαν δύο τεχνικές: Στη λειτουργία MS (MS mode) η λήψη φασμάτων πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της πλήρους σάρωσης η οποία δίνει ακρίβεια στο τέταρτο δεκαδικό ψηφίο. Στην τεχνική αυτή το όργανο λειτουργεί ως MSD (Mass Selective Detector), δηλαδή το τετράπολο και ο θάλαμος θραυσματοποίησης που βρίσκονται πριν τον αναλυτή TOF επιτρέπουν να φτάσουν σε αυτόν όλα τα ιόντα με τη μορφή που αυτά σχηματίζονταν στην πηγή ιοντισμού. Η στοχευμένη ανάλυση στη λειτουργία MS/MS (Targeted MS/MS mode) πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της σάρωσης θυγατρικού ιόντος από προεπιλεγμένα μητρικά ιόντα. Ο έλεγχος λειτουργίας του οργάνου, η επεξεργασία των ληφθέντων χρωματογραφημάτων και φασμάτων, η επεξεργασία και ανάλυση δεδομένων ποσοτικοποίησης και η αυτοματοποιημένη λήψη και εκτύπωση ποιοτικών και ποσοτικών αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση τριών επιμέρους λογισμικών (Mass Hunter Workstation Software) της εταιρείας Agilent Technologies, το Mass Hunter Data Acquisition (B.06.01), το Mass Hunter Qualitative Analysis (B.05.00) και το Mass Hunter Quantitative Analysis (B.05.00). ~ 69 ~

88 2.6 Αξιολόγηση αναλυτικής διαδικασίας Η ποσοτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο εσωτερικού προτύπου στη λειτουργία MS με την τεχνική της πλήρους σάρωσης και στο πιο έντονο ιόν ([Μ+Η] + ή [Μ Η] ανάλογα τον ιοντισμό), το οποίο συνήθως ήταν το μητρικό ιόν, εκτός από λίγους αναλύτες που είχαν σε μεγαλύτερη αφθονία κάποιο θυγατρικό ιόν. Η μέτρηση του εμβαδού κορυφής του κάθε αναλύτη και του αντίστοιχου του εσωτερικού προτύπου πραγματοποιήθηκε σε εξαγόμενο χρωματογράφημα ιόντων (extracted ion chromatogram, EIC) με παράθυρο μάζας 20 mda. Για την ποιοτική ανάλυση μετρήθηκαν στη λειτουργία στοχευμένου MS/MS με την τεχνική παραγωγής θυγατρικών ιόντων, οι αναλογίες των κορυφών μεταξύ του μητρικού και των θυγατρικών ιόντων των δειγμάτων και συγκρίθηκαν με αυτές των προτύπων με τη βοήθεια του λογισμικού Mass Hunter Quantitative Analysis. Η ταυτοποίηση και επιβεβαίωση των αναλυτών βασίστηκε στην οδηγία 2002/657/EΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης, η οποία αναφέρεται στην επίδοση των αναλυτικών μεθόδων και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων τους. Σύμφωνα μ αυτήν, με την τεχνική UHPLC/QTOF-MS απαιτείται ένα σύνολο τεσσάρων μονάδων ταυτοποίησης για κάθε αναλύτη που περιλαμβάνει την παρουσία του μητρικού ιόντος και τουλάχιστον δύο θυγατρικών ιόντων. Τα κριτήρια για θετική ταυτοποίηση των φαρμακευτικών ενώσεων στα περιβαλλοντικά δείγματα πρέπει να πληρούν τις εξής Πίνακας 2.2: Σχετικές εντάσεις ιόντων ταυτοποίησης σύμφωνα με την οδηγία 2002/657/EΚ. Σχετική ένταση ιόντος (% της βασικής κορυφής) LC-QTOF (% επιτρεπόμενη απόκλιση) > 50 % ± 20 % > 20 % έως 50 % ± 25 % > 10 % έως 20 % ± 30 % 10 % ± 50 % προϋποθέσεις: α) το σφάλμα μέτρησης της ακριβής μάζας της βασικής κορυφής να είναι μικρότερο των 5 ppm, β) να γίνει ακριβής μέτρηση της μάζας τουλάχιστον δύο θυγατρικών ιόντων και γ) ο χρόνος κατακράτησης του αναλύτη σε σύγκριση με αυτόν ενός πρότυπου διαλύματος να έχει μέγιστη απόκλιση ± 2,5 %. Τέλος, οι σχετικές εντάσεις των ιόντων ταυτοποίησης σε σχέση με τη βασική κορυφή του αναλύτη σε ένα φάσμα μαζών πρέπει να ακολουθούν τις μέγιστες επιτρεπτές τιμές ανοχής της Ευρωπαϊκής Οδηγίας, όπως αυτές ορίζονται στον πίνακα 2.2. Κατά τη διάρκεια των αναλύσεων εφαρμόστηκε έλεγχος ποιότητας για την εξέταση της σταθερότητας της μεθόδου στο χρόνο και την αποτροπή επιμόλυνσης. Έτσι, με κάθε παρτίδα πρότυπων διαλυμάτων και δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε ένα τυφλό διάλυμα (method blank) που περιείχε μόνο το εσωτερικό πρότυπο και κανέναν αναλύτη και ένα εμβολιασμένο διάλυμα (matrix spike) με το μίγμα αναλυτών σε συγκέντρωση 0,5 μg/l. Ο έλεγχος του εμβολιασμένου διαλύματος κρίνονταν ~ 70 ~

89 ικανοποιητικός, εφόσον οι ανακτήσεις για κάθε αναλύτη κυμαίνονταν στο εύρος %. Τέλος, κάθε εβδομάδα πραγματοποιούνταν έλεγχος της καμπύλης βαθμονόμησης. Η γραμμικότητα (δυναμική περιοχή) μελετήθηκε με πρότυπα διαλύματα σε υπόστρωμα πόσιμου νερού βρύσης για ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων (0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100 μg/l ή ppb). Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν τελικώς στην καμπύλη βαθμονόμησης εξαρτήθηκαν από την αντίστοιχη ευαισθησία που ο κάθε αναλύτης επέδειξε. Σε κάθε περίπτωση πάντως οι καμπύλες βαθμονόμησης όλων των αναλυτών αποτελούνταν από τουλάχιστον πέντε επίπεδα συγκέντρωσης. Κάθε επίπεδο συγκέντρωσης αποτέλεσε το μέσο όρο τριών μετρήσεων. Η συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου ορίστηκε στα 50 ppb. Για κάθε αναλύτη σχεδιάστηκε η αντίστοιχη καμπύλη βαθμονόμησης με την μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων, η οποία έδωσε καλές σταθερές συσχέτισης (R 2 > 0,99) στις αντίστοιχες περιοχές γραμμικότητας κάθε αναλύτη. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου (LOD) προσδιορίστηκαν για κάθε αναλύτη έπειτα από τριπλή ένεση εμβολιασμένων πρότυπων εκχυλισμάτων (μετά από διήθηση και SPE) σε νερό βρύσης και σε χαμηλές συγκεντρώσεις ώστε ο λόγος του σήματος προς το θόρυβο να είναι ίσος με 3, ενώ για τα όρια ποσοτικοποίησης της μεθόδου (LOQ) πραγματοποιήθηκε το ανάλογο αλλά με λόγο αυτό να είναι ίσο με 10. Η ορθότητα και πιστότητα ολόκληρης της μεθόδου αξιολογήθηκε σε δείγματα με υπόστρωμα ποσίμου νερού βρύσης και σε δύο επίπεδα φόρτισης, 0,5 και 5 μg/l. Η ορθότητα της μεθόδου υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος πέντε επαναλαμβανόμενων μετρήσεων για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης και εκφράστηκε ως ποσοστιαία ανάκτηση (% RE). Αυτό επιτεύχθηκε με τη σύγκριση του εμβαδού κορυφής του αναλύτη ενός εμπλουτισμένου δείγματος πριν την εκχύλιση (extracted sample) με αυτό ενός δείγματος στο οποίο έχει προστεθεί ο αναλύτης μετά την εκχύλιση (post-extracted spiked sample) και στο ίδιο επίπεδο συγκέντρωσης. % RE = 100 % Η πιστότητα της μεθόδου αξιολογήθηκε με όρους επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας και εκφράστηκε ως σχετική τυπική απόκλιση (% RSD). Η επαναληψιμότητα προσδιορίστηκε με τη μέτρηση πέντε διαδοχικών ενέσεων ενός εμβολιασμένου πρότυπου εκχυλίσματος (μετά από διήθηση και SPE) σε νερό βρύσης εντός μίας ημέρας, ενώ η αναπαραγωγιμότητα προσδιορίστηκε με τη μέτρηση του ίδιου διαλύματος σε πέντε διαδοχικές ημέρες. Με βάση τα επίπεδα συγκέντρωσης των αναλυτών στα περιβαλλοντικά δείγματα ως ικανοποιητικές τιμές ανάκτησης ορίστηκε το εύρος %, ενώ οι τιμές τις σχετικής τυπικής απόκλισης έπρεπε να ήταν μικρότερες του 20 %. Οι επιδράσεις της μήτρας μελετήθηκαν σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης, 0,5 και 5 μg/l. Οι επιδράσεις της μήτρας προσδιορίστηκαν με σύγκριση του εμβαδού κορυφής του αναλύτη ενός εκχυλίσματος (post-extracted spiked sample) με αυτό ενός διαλύματος σε καθαρό διαλύτη (non-extracted neat solvent) στο ίδιο επίπεδο ~ 71 ~

90 συγκέντρωσης εξίσωση. Υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος τριών επαναλαμβανόμενων μετρήσεων για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης και εκφράστηκε ως επί τοις εκατό επιδράσεις της μήτρας (% ΜE). % ΜE = 100 % Αν οι % ΜE < 0 %, τότε υπάρχει καταστολή του σήματος, αν οι % ΜE > 0 %, τότε υπάρχει ενίσχυση του σήματος και τέλος, αν οι % ΜE = 0 %, τότε δεν παρατηρούνται επιδράσεις μήτρας. ~ 72 ~

91 III ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 3.1 Βελτιστοποίηση συνθηκών χρωματογραφικού διαχωρισμού Για τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού των ενώσεων μελετήθηκαν δύο από τους πιο ευρέως διαδεδομένους διαλύτες κινητών φάσεων στη χρωματογραφική ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων, η μεθανόλη και το ακετονιτρίλιο, με ή χωρίς την προσθήκη φορμικού οξέος. Η ευαισθησία των ενώσεων που ανιχνεύτηκαν στη θετική λειτουργία ιοντισμού ήταν αυξημένη με την προσθήκη φορμικού οξέος στην κινητή φάση ACN / H 2 O. Οι ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στην αρνητική λειτουργία χωρίς την προσθήκη φορμικού οξέος εμφάνισαν καλύτερη απόδοση στον ιοντισμό τους, αλλά η χρωματογραφική κορυφή δεν παρείχε το επιθυμητό σχήμα. Το πρόβλημα αυτό λύθηκε με την προσθήκη του φορμικού οξέος. Με το φορμικό οξύ βελτιώθηκε ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των περισσότερων ενώσεων μειώνοντας την εμφάνιση ουράς και παρέχοντας καλύτερη ανάλυση, ενώ ταυτόχρονα μειώθηκε ο χρόνος έκλουσης των ενώσεων στην αρνητική λειτουργία. Γι αυτό αποφασίστηκε η προσθήκη 0,1 % φορμικού οξέος στους διαλύτες ακετονιτριλίου και νερού και στις δυο λειτουργίες ιοντισμού. Σχήμα 3.1: Εξαγόμενο χρωματογράφημα ιόντων μίγματος συγκέντρωσης 10 μg/l στη λειτουργία θετικού ιοντισμού. Σχήμα 3.2: Εξαγόμενο χρωματογράφημα ιόντων μίγματος συγκέντρωσης 10 μg/l στη λειτουργία αρνητικού ιοντισμού. ~ 73 ~

92 Στο χρωματογραφικό διαχωρισμό των φαρμακευτικών ενώσεων χρησιμοποιήθηκε μια αναλυτική στήλη C 18 με διάμετρο σωματιδίων μόλις 1,8 μm. Το πολύ μικρό πορώδες της στήλης συνέβαλε στο σχηματισμό πολύ στενών κορυφών κατά την έκλουση των ενώσεων, γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα τον καλύτερο χρωματογραφικό διαχωρισμό και το μεγάλο ύψος κορυφής για κάθε αναλύτη. Ακόμη, το χαρακτηριστικό εύρος της κάθε κορυφής ήταν περίπου 5 20 s στη βάση της, επιτρέποντας έτσι καλό διαχωρισμό μεταξύ των αναλυτών, ενώ ο χρόνος ανάλυσης για κάθε ομάδα αναλυτών ήταν λιγότερο από 7 min. Στο χρωματογραφήματα των σχημάτων 3.1 και 3.2 παρουσιάζονται οι κορυφές των φαρμακευτικών ενώσεων στις δυο λειτουργίες ιοντισμού, έπειτα από ένεση πρότυπου διαλύματος το οποίο περιείχε μίγμα όλων των αναλυτών σε συγκέντρωση 10 μg/l. Για την απόκτηση της μέγιστης διακριτικής ικανότητας και του βέλτιστου σχήματος των χρωματογραφικών κορυφών χρησιμοποιήθηκε τόσο στα εκχυλίσματα των δειγμάτων όσο και σ αυτά των προτύπων η ίδια σύσταση διαλυτών. Για τον καλύτερο χρωματογραφικό διαχωρισμό των αναλυτών, αλλά και λόγω των διαφορετικών συνθηκών ιοντισμού τους, κρίθηκε απαραίτητη η κατηγοριοποίηση των 12 αναλυτών σε 3 ομάδες. Οι αναλύτες που περιλαμβάνονται σε κάθε ομάδα και οι συνθήκες ανάλυσης περιγράφονται αναλυτικά στον Πίνακα 3.1. Πίνακας 3.1: Βελτιστοποιημένες χρωματογραφικές συνθήκες ανάλυσης των φαρμακευτικών ενώσεων. Συνθήκες LC Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Προσδιοριζόμενες ACE, RAN, AZI, CLA, ουσίες ATR ATE, CAF, OME, CRB HDR, FUR, IBU 5 % ACN με 0,1 % 5 % ACN με 0,1 % 10 % ACN με 0,1 % Αρχική κινητή φάση HCOOH HCOOH HCOOH 95 % H 2 O με 0,1 % 95 % H 2 O με 0,1 % 90 % H 2 O με 0,1 % HCOOH HCOOH HCOOH Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης t = 0,00 5 % ACN t = 1,30 5 % ACN t = 5, % ACN t = 6, % ACN t = 0,00 5 % ACN t = 1,30 5 % ACN t = 5, % ACN t = 5, % ACN Stop time (min) 6,50 5,90 4,60 Post time (min) 2,50 2,50 2,50 Λειτουργία ιοντισμού + + t = 0,00 10 % ACN t = 1,30 20 % ACN t = 2, % ACN t = 4, % ACN ~ 74 ~

93 3.2 Βελτιστοποίηση παραμέτρων του φασματόμετρου μαζών Στην ενότητα αυτή μελετήθηκε ο σχηματισμός και η θραυσματοποίηση των αναλυτών σε θετικό και αρνητικό ιοντισμό. Για το σκοπό αυτό διενεργήθηκαν πειράματα ανάλυσης με έγχυση σε ροή (Flow Injection Analysis, FIA), δηλαδή, με άμεση εισαγωγή 1 μl πρότυπου διαλύματος συγκέντρωσης 1 μg/l σε μίγμα διαλυτών ACN / H 2 O, 10:90 (v/v) από κάθε αναλύτη, μέσω του αυτόματου δειγματολήπτη στο χρωματογραφικό σύστημα και χωρίς την παρουσία χρωματογραφικής στήλης. Από τα πειράματα αυτά λήφθηκαν φάσματα μαζών στη λειτουργία πλήρης σάρωσης MS και στη λειτουργία σάρωσης θυγατρικών ιόντων στοχευμένου MS/MS για τον προσδιορισμό του βέλτιστου δυναμικού θραυσματοποίησης της πηγής ιοντισμού και της ενέργειας σύγκρουσης που εφαρμόζεται στην κυψελίδα συγκρούσεων ώστε να αποκτηθεί η μέγιστη ευαισθησία του μητρικού ιόντος και η μεγαλύτερη αφθονία των θυγατρικών ιόντων, αντίστοιχα. Από τις 12 ενώσεις 9 ανιχνεύτηκαν στη θετική λειτουργία ιοντισμού και 3 στην αρνητική λειτουργία ιοντισμού. Όλες οι ενώσεις εμφάνισαν σε μεγαλύτερη αφθονία τα ιόντα [Μ+Η] + ή [Μ Η] τα οποία και επιλέχτηκαν ως μητρικά. Αντίστοιχα πειράματα πραγματοποιήθηκαν για το εσωτερικό πρότυπο. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.2. Η ακρίβεια μάζας των μητρικών και των θυγατρικών ιόντων ήταν εντός των αποδεκτών ορίων (<5 ppm), επιτρέποντας έτσι τον ακριβή προσδιορισμό της μοριακής δομής όλων των αναλυτών. Στον πίνακα 3.3 παρουσιάζονται οι ακριβείς μάζες των μητρικών ιόντων των αναλυτών με τα αντίστοιχα σφάλματα μάζας, καθώς και οι ακριβείς μάζες των θυγατρικών τους ιόντων. Όλοι οι αναλύτες παρουσίασαν τουλάχιστον 2 θυγατρικά ιόντα, τα οποία είναι επαρκή για την ταυτοποίηση των ενώσεων. Μόνο η ιβουπροφαί- Πίνακας 3.2: Βελτιστοποιημένες φασματομετρικές συνθήκες ανάλυσης των φαρμακευτικών ενώσεων. Ένωση RT (min) Mητρικό Ιόν Δυναμικό Θραυσματοποίησης (V) Ενέργεια Σύγκρουσης (ev) Ατενολόλη 1, Παρακεταμόλη 1, Ρανιτιδίνη 1, Βαμεθάνη (IS) 2, Καφεΐνη 4, Αζιθρομυκίνη 5, Ομεπραζόλη 5, Κλαριθρομυκίνη 5, Καρβαμαζεπίνη 5, Ατορβαστατίνη 6, Υδροχλωροθειαζίδη 1, Φουροσεμίδη 3, Ιβουπροφαίνη 4, ~ 75 ~

94 νη παρουσίασε ένα μοναδικό θυγατρικό ιόν, το οποίο όμως επιβεβαιώνεται από αντίστοιχες περιβαλλοντικές αναλύσεις της ουσίας αυτής στη βιβλιογραφία (Ferrer and Thurman, 2012; Pedrouzo et al., 2011; Gomez et al., 2010). Πίνακας 3.3: Ακριβείς μάζες μητρικού και θυγατρικών ιόντων των αναλυτών. Το σφάλμα μάζας αντιστοιχεί στη διαφορά μεταξύ θεωρητικής και πειραματικής τιμής του μητρικού ιόντος. Ένωση Μητρικό Σφάλμα 1 ο Θυγατρικό 2 ο Θυγατρικό 3 ο Θυγατρικό 4 ο Θυγατρικό ιόν [M+H] + μάζας (ppm) ιόν ιόν ιόν ιόν Αζιθρομυκίνη 749,5158 0,01 591, , ,1176 Ακεταμινοφαίνη 152,0706 2,26 134, , ,0335 Ατενολόλη 267,1703 1,66 225, , ,0648 Ατορβαστατίνη 559,2603 0,33 440, , , ,1026 Βαμεθάνη (IS) 210,1486 0,11 192, , ,0646 Ιβουπροφαίνη 1 205,1234 0,81 161,1336 Καρβαμαζεπίνη 237,1022 1,77 194, ,0730 Καφεΐνη 195, ,12 138, , ,0713 Κλαριθρομυκίνη 748,4842 1,79 590, ,1176 Ομεπραζόλη 346,1220 3,31 198, ,0757 Ρανιτιδίνη 315,1485 2,72 270, , , ,0559 Υδροχλωροθειαζίδη 1 295,9572 1,27 268, , ,0114 Φουροσεμίδη 1 329,0004 0,96 285, , , Οι ενώσεις αυτές ανιχνεύτηκαν στην αρνητική λειτουργία ιοντισμού ως [M H]. ~ 76 ~

95 ~ 77 ~

96 ~ 78 ~

97 Σχήμα 3.3: Φάσματα μάζας πειραμάτων MS/MS για την ταυτοποίηση των αναλυτών με τα μητρικά και τα θυγατρικά τους ιόντα. Τα βελάκια πάνω στις μοριακές δομές των αναλυτών υποδηλώνουν τα σημεία θραύσης και την παραγωγή των αντίστοιχων θυγατρικών ιόντων. ~ 79 ~

98 3.3 Βελτιστοποίηση της διαδικασίας SPE Ο στόχος της βελτιστοποίησης της διαδικασίας εκχύλισης στερεάς φάσης ήταν η εκχύλιση όλων φαρμακευτικών ενώσεων που ανήκουν σε διαφορετικές θεραπευτικές ομάδες και οι οποίες έχουν διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες (όξινες, ουδέτερες, βασικές ενώσεις), σε ένα και μόνο βήμα, διατηρώντας παράλληλα ικανοποιητικές τιμές ανάκτησης. Η αναλυτική διαδικασία της μεθόδου που ακολουθήθηκε βασίστηκε με ελάχιστες τροποποιήσεις στην μεθοδολογία που έχει αναπτυχθεί από αρκετούς συγγραφείς (Kosma et al., 2014; Ferrer and Thurman, 2012; Gomez et al., 2010; Gros et al., 2008; Petrovic et al., 2006) για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό φαρμακευτικών ουσιών που ανήκουν σε διαφορετικές θεραπευτικές ομάδες. Έτσι, για την αποτελεσματική εκχύλιση όλων των φαρμακευτικών ουσιών επιλέχθηκαν σύμφωνα και με τη βιβλιογραφία (Ferrer and Thurman, 2012; Gomez- Ramos et al., 2011; Gomez et al., 2010; Gracia-Lor et al., 2010) τα πολυμερικά φυσίγγια εκχύλισης Oasis HLB (200 mg, 6 ml) της Waters. Η μεθανόλη επιλέχθηκε ως καταλληλότερος διαλύτης λόγω της αποτελεσματικότητάς της στην έκλουση των πολικών φαρμακευτικών ουσιών (Zhang and Zhou, 2007). Η ρύθμιση του ph των δειγμάτων δεν κρίθηκε απαραίτητη (Martin et al., 2012; Buchberger, 2011; Gracia- Lor et al., 2010; Gros et al., 2006), καθώς στόχος ήταν η έκλουση όλων των ενώσεων σε ένα βήμα. Επιπλέον, η ρύθμιση του ph δεν αυξάνει την ανακτησιμότητα των περισσότερων αναλυτών και προκαλεί την υδρόλυση πολλών απ αυτών (Ferrer al., 2010; Gros et al., 2006). ~ 80 ~

99 3.4 Επικύρωση μεθόδου Ορθότητα Πιστότητα Η εργαστηριακή εκτίμηση της ορθότητας και της πιστότητας της μεθόδου προσδιορίστηκε εφαρμόζοντας τη μέθοδο σε εμβολιασμένα δείγματα με υπόστρωμα νερού βρύσης σε δύο επίπεδα φόρτισης, 0,5 και 5 μg/l. Η ορθότητα υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος πέντε επαναλαμβανόμενων μετρήσεων για κάθε επίπεδο φόρτισης και εκφράστηκε ως ποσοστιαία ανάκτηση. Στο χαμηλότερο επίπεδο φόρτισης οι μέσες ανακτήσεις κυμαίνονται μεταξύ %, ενώ στο μέγιστο επίπεδο φόρτισης μεταξύ %. Οι μέσες ποσοστιαίες τιμές ανάκτησης των αναλυτών στα δύο επίπεδα φόρτισης παρουσιάζονται στα σχήματα 3.4 και 3.5. Γενικά, στις περισσότερες φαρμακευτικές ενώσεις που μελετήθηκαν οι τιμές ανάκτησης στα φυσίγγια εκχύλισης HLB ήταν εντός των επιθυμητών ορίων ( %) που ορίζει η οδηγία 2002/657/EΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Μόνο τρεις από τους αναλύτες εμφάνισαν χαμηλή ανακτησιμότητα, η ατορβαστατίνη (40 43 %), η ATR AZI CLA OME RAN ATE FUR CAF CRB HDR ACE IBU Σχήμα 3.4: Μέσες ποσοστιαίες τιμές ανάκτησης στο επίπεδο φόρτισης των 0,5 μg/l ATR AZI CLA OME RAN FUR CRB ATE ACE CAF IBU HDR Σχήμα 3.5: Μέσες ποσοστιαίες τιμές ανάκτησης στο επίπεδοo φόρτισης των 5 μg/l. ~ 81 ~

100 Πίνακας 3.4: Εκτίμηση της ορθότητας, της πιστότητας και των επιδράσεων μήτρας των αναλυτών στα δύο επίπεδα φόρτισης. Ένωση Ανάκτηση (% RE) Επαναληψιμότητα (% RSD) Αναπαραγωγιμότητα (% RSD) Επιδράσεις μήτρας (% ME) Επίπεδο φόρτισης 0,5 μg/l Ακεταμινοφαίνη 104 3,8 16,0 15 Ατενολόλη 82 3,2 3,9-10 Αζιθρομυκίνη 51 6,0 11,7-25 Ατορβαστατίνη 40 7,2 13,5 11 Κλαριθρομυκίνη 55 7,3 9,4-21 Ρανιτιδίνη 74 6,2 17,9 3 Ομεπραζόλη 67 2,5 4,2-68 Καρβαμαζεπίνη 92 3,4 8,6-30 Καφεΐνη 90 7,7 7,8 7 Υδροχλωροθειαζίδη 102 2,4 7,3 2 Φουροσεμίδη 86 5,0 13,2-16 Ιβουπροφαίνη 114 2,9 12,2 22 Επίπεδο φόρτισης 5 μg/l Ακεταμινοφαίνη 90 2,4 14,4 14 Ατενολόλη 87 0,4 10,0 7 Αζιθρομυκίνη 48 1,8 2,2-4 Ατορβαστατίνη 43 1,2 14,8 8 Κλαριθρομυκίνη 52 2,6 2,8 8 Ρανιτιδίνη 76 1,3 9,8 19 Ομεπραζόλη 69 2,4 16,7-33 Καρβαμαζεπίνη 80 0,8 11,4-6 Καφεΐνη 92 1,4 15,9 10 Υδροχλωροθειαζίδη 110 1,7 9,7 1 Φουροσεμίδη 80 1,5 5,9 8 Ιβουπροφαίνη 92 5,4 5,6 6 αζιθρομυκίνη (48 51 %) και η κλαριθρομυκίνη (52 55 %). Η δυσκολία εκχύλισης της ατορβαστατίνης αποδίδεται στην αστάθεια που εμφανίζει λόγω της πιθανής αλληλομετατροπής της στην όξινη μορφή της και σε λακτόνη, ενώ η αστάθεια των αντιβιοτικών οφείλεται κυρίως στην υδρόλυσή τους (Novakova et al., 2008; Miao and Metcalfe, 2003). Επίσης, τα ποσοστά ανάκτησης της ομεπραζόλης κυμάνθηκαν λίγο χαμηλότερα (67 69 %) από το κατώτερο επιθυμητό όριο, επειδή η ένωση αυτή είναι ασταθής και φωτοευαίσθητη με αποτέλεσμα να διασπάται εύκολα. Επιπλέον, η σταθερότητά της επηρεάζεται σημαντικά από το ph και την αλατότητα του διαλύματος στο οποίο βρίσκεται (Ekpe et al., 1999; Mathew et al., 1995). Ωστόσο, η χαμηλές τιμές ανάκτησης δεν αποτελούν τροχοπέδη για την αδιαμφισβήτητη ανίχνευση των αναλυτών αυτών, η οποία επιβεβαιώνεται από τις ικανοποιητικές τιμές πιστότητας που εμφάνισαν, καθώς και από την παρουσία των αντίστοιχων θυγατρικών ιόντων. Η πιστότητα εκτιμήθηκε με μέτρηση της επαναληψιμότητας και της αναπαραγωγιμότητας. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου εκφράστηκε ως η ποσοστιαία σχετική τυπική απόκλιση (RSD) πέντε επαναλαμβανόμενων μετρήσεων και ~ 82 ~

101 % επί των ενώσεων κυμάνθηκε μεταξύ 0,4 7,7 %. Η αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου εκφράστηκε ως η ποσοστιαία σχετική τυπική απόκλιση (RSD) εμβολιασμένων και εκχυλισμένων δειγμάτων νερού σε πέντε διαδοχικές ημέρες και κυμάνθηκε μεταξύ 2,2 17,9 %. Τα ποσοστά αυτά κρίνονται ικανοποιητικά και εμπίπτουν εντός του ποσοστού που ορίζει η οδηγία 2002/657/EΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Όλα τα αποτελέσματα εκτίμησης της ορθότητας και της πιστότητας παρουσιάζονται αναλυτικά στον πίνακα Γραμμικότητα και όρια ανίχνευσης Εμβολιασμένα δείγματα πόσιμου νερού με μίγμα φαρμακευτικών ουσιών εκχυλίστηκαν με την ίδια ακριβώς διαδικασία με αυτή που χρησιμοποιήθηκε στα πραγματικά δείγματα και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των καμπυλών βαθμονόμησης ώστε τόσο οι επιδράσεις της μήτρας όσο και η ανάκτηση των αναλυτών να συνυπολογιστούν και συνεπώς, να αφαιρεθούν κατά την ποσοτικοποίηση των πραγματικών δειγμάτων. H γραμμικότητα του αναλυτικού σήματος ήταν πολύ καλή και σε όλες τις περιπτώσεις οι σταθερές συσχέτισης (R 2 ) ήταν μεγαλύτερες από 0,995, ενώ το εύρος των τιμών των υπολοίπων ήταν μικρότερο του 30 %. Στα δείγματα που εμφάνισαν συγκεντρώσεις εκτός του δυναμικής περιοχής της μεθόδου πραγματοποιήθηκε αραίωση και δεύτερη ανάλυση. Οι εξισώσεις ευθείας με τις σταθερές συσχέτισης παρουσιάζονται στον πίνακα 3.5, ενώ οι καμπύλες βαθμονόμησης παρουσιάζονται στα διαγράμματα του παραρτήματος. Τα όρια ανίχνευσης των αναλυτών κυμάνθηκαν σε πολύ χαμηλά επίπεδα, της τάξης των μερικών ng/l. Συγκεκριμένα, οι ενώσεις που εμφάνισαν τη μεγαλύτερη ευαισθησία (LOD < 5 ng/l) ήταν η αζιθρομυκίνη, η κλαριθρομυκίνη, η ομεπραζόλη, η καρβαμαζεπίνη και η φουροσεμίδη. Όρια ανίχνευσης από 5 10 ng/l εμφάνισαν η ατενολόλη και η ιβουπροφαίνη, ενώ από ng/l η ακεταμινοφαίνη και η ατορβαστατίνη. Τέλος, τη χαμηλότερη ευαισθησία ( ng/l) επέδειξαν η υδροχλωροθειαζίδη, η ρανιτιδίνη και η καφεΐνη. Τα αντίστοιχα όρια ποσοτικοποίησης των αναλυτών κυμάνθηκαν από ng/l. Στον πίνακα 3.5 παρατίθενται τα όρια LODs LOQs 10 0 < Συγκέντρωση (ng/l) Σχήμα 3.6: Ποσοστά διακύμανσης των ορίων ανίχνευσης (LODs) και ποσοτικοποίησης (LOQs) των αναλυτών επί του συνόλου των ενώσεων. ~ 83 ~

102 Πίνακας 3.5: Εξισώσεις καμπυλών βαθμονόμησης, δυναμική περιοχή, σταθερές συσχέτισης, όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των αναλυτών. Ένωση Εξίσωση καμπύλης βαθμονόμησης Δυναμική περιοχή (ng/l) LOD (ng/l) LOQ (ng/l) Ακεταμινοφαίνη y = 0, * x + 0, , Ατενολόλη y = 0, * x + 0, , Αζιθρομυκίνη y = 0, * x 0, ,9954 < Ατορβαστατίνη y = 0, * x + 0, , Κλαριθρομυκίνη y = 0, * x 0, ,9986 < Ρανιτιδίνη y = 0, * x 0, , Ομεπραζόλη y = 0, * x + 0, ,9992 < Καρβαμαζεπίνη y = 0, * x + 0, ,9989 < Καφεΐνη y = 0, * x 0, , Υδροχλωροθειαζίδη y = 0, * x + 0, , Φουροσεμίδη y = 0, * x + 0, ,9980 < Ιβουπροφαίνη y = 0, * x + 0, , R 2 ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των αναλυτών, ενώ στο σχήμα 3.6 παρουσιάζεται η ποσοστιαία κατανομή των αναλυτών με βάση τα LODs και τα LOQs Επιδράσεις μήτρας Οι επιδράσεις της μήτρας, δηλαδή των συστατικών του υποστρώματος, αξιολογήθηκαν με εμβολιασμένα διαλύματα σε διαλύτη νερό βρύσης και συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα διαλύματα που περιείχαν ως διαλύτη νερό καθαρότητας HPLC. Το νερό βρύσης επιλέχθηκε ως διαλύτης για τα πρότυπα διαλύματα και τα δείγματα, διότι έχει την πλησιέστερη σύσταση με αυτή των δειγμάτων των υγρών αποβλήτων. Δεν επιλέχθηκε ως διαλύτης το ίδιο το υπόστρωμα των δειγμάτων (δηλαδή υγρά απόβλητα), διότι σε αυτό περιέχονται οι εξεταζόμενοι αναλύτες με αποτέλεσμα να ήταν αναγκαία η αφαίρεση των συγκεντρώσεών τους από τα αρχικά δείγματα για τον υπολογισμό της πραγματικής συγκέντρωσης τους, διαδικασία που είναι χρονοβόρα και οδηγεί συνήθως σε υψηλότερα σφάλματα στον υπολογισμό της ανάκτησης (ορθότητα) και της σχετικής τυπικής απόκλισης (πιστότητα) (Gracia-Lor et al., 2010). Έτσι, η σύγκριση μεταξύ των δύο υποστρωμάτων που επιλέχθηκαν είχε ουσιαστικά ως στόχο την ανάδειξη της πολυπλοκότητας της μήτρας των περιβαλλοντικών δειγμάτων και την ευαισθησία της πηγής ESI στα διάφορα συστατικά της μήτρας που συνεκλούονται μαζί με τους αναλύτες (Jahnke et al., 2004; Benijts et al., 2004; Zrostlikova et al., 2002), καθώς και την αναγκαιότητα της χρήσης εσωτερικού προτύπου για τη διόρθωση των επιδράσεων αυτών και τη σωστή ποσοτικοποίηση των πραγματικών δειγμάτων (Ferrer et al., 2010; Gracia-Lor et al., 2010). Σχεδόν οι μισές ενώσεις παρουσίασαν καταστολή στο σήμα τους σε σχέση με τον καθαρό διαλύτη, ενώ οι άλλες μισές ενίσχυση αυτού. Εντούτοις, τα φαινόμενα ~ 84 ~

103 καταστολής ήταν πιο έντονα σε σχέση με τα αντίστοιχα φαινόμενα ενίσχυσης του σήματος, ιδιαίτερα στο χαμηλό επίπεδο φόρτισης. Η ομεπραζόλη ήταν η ένωση που εμφάνισε τη μεγαλύτερη καταστολή στο σήμα της ( 68 %), ενώ η ιβουπροφαίνη είχε τη μεγαλύτερη ενίσχυση (+ 22 %). Η ποσοστιαία κατανομή των επιδράσεων της μήτρας για κάθε αναλύτη στα δυο επίπεδα φόρτισης φαίνεται στο σχήμα 3.7, ενώ οι αντίστοιχες τιμές τους παρουσιάζονται στον πίνακα OME CRB AZI CLA FUR ATE HDR RAN CAF ATR ACE IBU (α) OME CRB AZI HDR IBU ATE FUR CLA ATR CAF ACE RAN (β) Σχήμα 3.7: Ποσοστιαίες επιδράσεις μήτρας στα επίπεδα φόρτισης των 0,5 μg/l (α) και των 5 μg/l (β) για κάθε αναλύτη. ~ 85 ~

104 3.5 Εφαρμογή της μεθόδου στα πραγματικά δείγματα Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στην εργασία αυτή εφαρμόστηκε για την ανάλυση των πραγματικών περιβαλλοντικών δειγμάτων και τη στοχευμένη ανίχνευση και προσδιορισμό δώδεκα φαρμακευτικών ουσιών σε υγρά αστικά και νοσοκομειακά απόβλητα του νομού Αχαΐας. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν συνολικά 52 δείγματα από την ΕΕΛ του Δήμου Πατρών (ΕΕΛ1) και 8 δείγματα από την ΕΕΛ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου των Πατρών (ΕΕΛ2), η οποία επεξεργάζεται τόσο τα υγρά απόβλητα του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών όσο και αυτά του Πανεπιστημίου Πατρών. Στιγμιαία δείγματα συλλέχθηκαν ανά δύο μήνες (Μάιος, Ιούλιος, Νοέμβριος, Ιανουάριος) από την ΕΕΛ1 σε συγκεκριμένες ώρες εντός μιας ημέρας (03:00, 08:00, 10:30, 13:00, 16:30, 22:00), ενώ από την ΕΕΛ2 συλλέχθηκαν Πίνακας 3.6: Ελάχιστες, μέγιστες και μέσες τιμές (σε παρένθεση) στην είσοδο των ΕΕΛ1 και ΕΕΛ2 (ng/l). Ένωση ΕΕΛ1 ΕΕΛ2 Ακεταμινοφαίνη (104771) (245995) Ατενολόλη (1150) (1599) Αζιθρομυκίνη (306) (2179) Ατορβαστατίνη (959) (561) Κλαριθρομυκίνη (3658) (2870) Ρανιτιδίνη (1432) (2873) Ομεπραζόλη (355) (1974) Καρβαμαζεπίνη (548) (647) Καφεΐνη (229868) (315879) Υδροχλωροθειαζίδη (3503) (9617) Φουροσεμίδη (2735) (12034) Ιβουπροφαίνη (1726) (3766) Πίνακας 3.7: Ελάχιστες, μέγιστες και μέσες τιμές (σε παρένθεση) στην έξοδο των ΕΕΛ1 και ΕΕΛ2 (ng/l). Ένωση ΕΕΛ1 ΕΕΛ2 Ακεταμινοφαίνη n/d 221 (196) (1066) Ατενολόλη n/d 254 (116) n/d 524 (524) Αζιθρομυκίνη n/d 98 (45) (544) Ατορβαστατίνη n/d 294 (249) n/d 396 (396) Κλαριθρομυκίνη (41) (736) Ρανιτιδίνη n/d (1935) Ομεπραζόλη (25) (299) Καρβαμαζεπίνη (72) (199) Καφεΐνη n/d 773 (492) (3850) Υδροχλωροθειαζίδη n/d 281 (208) n/d 2313 (1864) Φουροσεμίδη n/d n/d 4659 (3104) Ιβουπροφαίνη n/d 459 (339) n/d 4210 (4210) * n/d: not detected (below LOQ) ~ 86 ~

105 στιγμιαία δείγματα σε συγκεκριμένη χρονική στιγμή (13:00) τους μήνες Σεπτέμβριο, Νοέμβριο και Ιανουάριο. Οι συγκεντρώσεις των φαρμακευτικών ουσιών που ανιχνεύθηκαν στην είσοδο και την έξοδο των δύο βιολογικών καθαρισμών παρουσιάζονται αναλυτικά στους πίνακες 3.6 και 3.7, αντίστοιχα. Αρχικά, επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη όλων των επιλεγμένων φαρμακευτικών ενώσεων της παρούσας εργασίας τόσο στην είσοδο όσο και στην έξοδο των δύο ΕΕΛ. Ειδικότερα, ανιχνεύτηκαν σε όλα τα δείγματα που συλλέχθηκαν από την είσοδο των δύο ΕΕΛ και στην πλειονότητα των δειγμάτων της εξόδου. Οι μέσες τιμές συγκέντρωσης της μηνιαίας διακύμανσης των φαρμακευτικών ενώσεων στην είσοδο και στην έξοδο των δύο ΕΕΛ παρουσιάζονται στα διαγράμματα των σχημάτων 3.9 και Αντίστοιχα, οι μέσες τιμές συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών στην είσοδο και στην έξοδο των δύο βιολογικών καθαρισμών παρουσιάζονται στα σχήματα Πιο συγκεκριμένα στα σχήματα 3.13 και 3.14 της εισόδου των δύο ΕΕΛ είναι ολοφάνερη η κατά πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών που εισέρχονται στην ΕΕΛ2 σε αντίθεση με την ΕΕΛ1, γεγονός που οφείλεται στο ότι ο κύριος όγκος των λυμάτων της ΕΕΛ2 προέρχεται από το νοσοκομείο της περιοχής. Εντύπωση προκαλεί το γεγονός ότι δυο φαρμακευτικές ουσίες, η ακεταμινοφαίνη (παρακεταμόλη) και η καφεΐνη, παρουσιάζουν σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις και στους δύο βιολογικούς σε σχέση με τις υπόλοιπες φαρμακευτικές ουσίες. Ειδικότερα, οι μέσες τιμές συγκεντρώσεις της ακεταμινοφαίνης και της καφεΐνης στην είσοδο της ΕΕΛ1 ανέρχονται στα 104,8 και 229,9 μg/l και στην ΕΕΛ2 στα 246,0 και 315,9 μg/l, αντίστοιχα. Αυτό οφείλεται κυρίως στην ευρεία κατανάλωση παυσίπονων που περιέχουν ως δραστική ουσία την ακεταμινοφαίνη (παρακεταμόλη). Αντίστοιχα, η καφεΐνη περιέχεται σε πολλά ροφήματα υψηλής κατανάλωσης, όπως είναι ο καφές, το τσάι, τα αναψυκτικά και τα ενεργειακά ποτά, ενώ περιέχεται ως έκδοχο σε πολλά φάρμακα (Pedrouzo et al., 2011). Μάλιστα, οι υψηλές τιμές συγκεντρώσεων της καφεΐνης στην είσοδο των ΕΕΛ συνάδουν και με άλλες μελέτες από τη βιβλιογραφία (Huerta-Fontela et al., 2008; Pedrouzo et al., 2007). Η συγκέντρωση των υπόλοιπων ενώσεων δεν ξεπερνά τα 16 μg/l με εξέχουσες τα διουρητικά υδροχλωροθειαζίδη και φουροσεμίδη, το αναλγητικό ιβουπροφαίνη, τη ρανιτιδίνη και το αντιβιοτικό κλαριθρομυκίνη. Στον αντίποδα, οι φαρμακευτικές ουσίες που ανιχνεύτηκαν σε συγκεντρώσεις μερικών μg/l στην είσοδο των δύο ΕΕΛ ήταν η ατορβαστατίνη, η ατενολόλη, η ομεπραζόλη και η καρβαμαζεπίνη. Στην έξοδο των δύο ΕΕΛ οι συγκεντρώσεις των φαρμακευτικών ουσιών που ανιχνεύτηκαν είχαν μειωθεί δραστικά σε σχέση με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις στην είσοδο και ήταν της τάξης των ng/l στην ΕΕΛ1 και των μερικών μg/l στην ΕΕΛ2. Έτσι, στα σχήματα 3.15 και 3.16 της εξόδου των δύο ΕΕΛ, οι φαρμακευτικές ουσίες με τις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις είναι αυτές της καφεΐνης, των δύο διουρητικών και της ιβουπροφαίνης. Ωστόσο, αξίζει να επισημανθεί ότι η φουροσεμίδη και η ρανιτιδίνη δεν ανιχνεύτηκαν στην έξοδο της ΕΕΛ1. Με βάση τα διαγράμματα ωριαίας διακύμανσης του σχήματος 3.8 οι μέγιστες συγκεντρώσεις των φαρμακευτικών ουσιών στην είσοδο της ΕΕΛ1 παρατηρήθηκαν τις μεσημεριανές ώρες (13:00 > 10:30 > 16:30) και οι ελάχιστες τη νύχτα (03:00 > ~ 87 ~

106 22:00). Αντίστοιχα, με βάση τη μηνιαία διακύμανση οι μέγιστες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκαν τους φθινοπωρινούς και χειμερινούς μήνες, γεγονός που εξηγείται από την έξαρση των ασθενειών την περίοδο αυτή και την αυξημένη κατανάλωση φαρμάκων και ιδιαίτερα αντιβιοτικών (π.χ. κλαριθρομυκίνη) για την αντιμετώπισή τους. Συνολικά, οι μέσες συγκεντρώσεις των φαρμακευτικών ουσιών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία κυμάνθηκαν στην ΕΕΛ1 μεταξύ 0, μg/l στην είσοδο και μεταξύ 0,03 0,49 μg/l στην έξοδο, ενώ στην ΕΕΛ2 μεταξύ 0, μg/l και 0,2 3,8 μg/l, αντίστοιχα. Υδροχλωροθειαζίδη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22:00 Φουροσεμίδη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22: Ιβουπροφαίνη (ng/l) 3:00 8:00 10:30 13:00 16:30 22:00 Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 ~ 88 ~

107 Ακεταμινοφαίνη/Παρακεταμόλη Κλαριθρομυκίνη (ng/l) (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22: Ρανιτιδίνη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22:00 Αζιθρομυκίνη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22:00 ~ 89 ~

108 3000 Ατορβαστατίνη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22: Ατενολόλη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22: Καφεΐνη (ng/l) 3:00 8:00 10:30 13:00 16:30 22:00 Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 ~ 90 ~

109 1400 Ομεπραζόλη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22: Καρβαμαζεπίνη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22: Ακεταμινοφαίνη/Παρακεταμόλη (ng/l) Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος :00 8:00 10:30 13:00 16:30 22:00 Σχήμα 3.8: Διαγράμματα ωριαίας διακύμανσης της συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών στην είσοδο της ΕΕΛ1. ~ 91 ~

110 HDR FUR CLA IBU RAN ATE 0 Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 (α) ATR OME CRB AZI Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 (β) ACE CAF Μάιος 2014 Ιούλιος 2014 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 (γ) Σχήμα 3.9 (α, β, γ): Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ1. ~ 92 ~

111 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 ATR OME AZI CLA ATE CRB IBU RAN (α) Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 HDR FUR (β) ACE CAF Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 (γ) Σχήμα 3.10 (α, β, γ): Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ2. ~ 93 ~

112 Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 HDR IBU ACE AZI CLA ATR ATE CAF OME CRB Σχήμα 3.11: Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην έξοδο της ΕΕΛ Σεπτέμβριος 2014 Νοέμβριος 2014 Ιανουάριος 2015 HDR FUR IBU ACE RAN AZI CLA ATR ATE CAF OME Σχήμα 3.12: Μηνιαία διακύμανση συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην έξοδο της ΕΕΛ HDR FUR IBU RAN AZI CLA ATR ATE OME CRB ACE CAF Σχήμα 3.13: Μέση συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην είσοδο της ΕΕΛ1. ~ 94 ~