ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΠΟΡΕΙΑ ΚΑΙ ΠΡΟΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΠΑΠΑΘΑΝΑΣΟΠΟΥΛΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ- ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ Τ- ΒΟΗΘΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΠΟΡΕΙΑ ΚΑΙ ΠΡΟΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Α. ΔΗΜΗΣΙΑΝΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΠΑΠΑΘΑΝΑΣΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΜΟΥΖΑΚΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΕΛΛΟΥΛ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΠΑΠΑΘΑΝΑΣΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΜΟΥΖΑΚΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΕΛΛΟΥΛ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΕΛΙΣΑΒΕΤ ΧΡΟΝΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΠΟΛΥΧΡΟΝΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΓΡΗΓΟΡΙΑΔΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ ΕΛΙΣΑΒΕΤ ΑΝΔΡΕΑΔΟΥ ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΑΣ 2

3 Στην αγαπημένη μνήμη της μητέρας μου και του πατέρα μου Στη σύζυγό μου Άννα και στο γιο μου Ανδρέα 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ) είναι μια χρόνια, φλεγμονώδης, ανοσομεσολαβούμενη νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), που χαρακτηρίζεται από πολυεστιακή απομυελίνωση, σταδιακή συσσώρευση νευρολογικού ελλείμματος και αναπηρία. Η βλάβηορόσημο της ΠΣ είναι η απομυελινωτική πλάκα, όπου παρατηρείται εστιακή διήθηση από Τ- κύτταρα, μακροφάγα, πλασματοκύτταρα και άλλα κύτταρα και παράγοντες φλεγμονής, με αποτέλεσμα καταστροφή του ελύτρου της μυελίνης. Κλινικά η ΠΣ χαρακτηρίζεται από διασπορά των συμπτωμάτων και σημείων στο χώρο και στο χρόνο, η εκδήλωση δηλαδή της νόσου υποδηλώνει βλάβες σε περισσότερες της μιας περιοχές εντός του ΚΝΣ, ενώ εξελίσσεται χρονικά είτε με τη μορφή εξάρσεων και υφέσεων, είτε με προοδευτική επιδείνωση. Η αιτιολογία της ΠΣ παραμένει άγνωστη, παρά την εντυπωσιακά μεγάλη ερευνητική προσπάθεια σε παγκόσμιο επίπεδο τις τελευταίες δεκαετίες. Η παθογένεση της νόσου είναι αποτέλεσμα συνδυασμού γενετικής προδιάθεσης, περιβαλλοντικών παραγόντων και απορρύθμισης του ανοσοποιητικού συστήματος. Η κρατούσα αντίληψη περί ανοσοπαθογένεσης της ΠΣ υποστηρίζει ότι αυτοαντιδρώντα Τ- κύτταρα, της κατηγορίας των βοηθητικών Τ- κυττάρων (helper T- cells, Th) ή CD4+ Τ- κυττάρων, είναι υπεύθυνα για την έναρξη και διατήρηση της ανοσολογικής αντίδρασης έναντι αντιγόνων της μυελίνης του ΚΝΣ. Εντός της κατηγορίας των Th κυττάρων έχουν αναγνωριστεί ξεχωριστοί πληθυσμοί με βάση τη λειτουργία τους στις διάφορες ανοσολογικές αντιδράσεις. Η αρχική διάκριση σε Th1 και Th2 συμπληρώθηκε την τελευταία δεκαετία από την ομάδα των Th17 κυττάρων. Από αυτά τα Th1 και Th17 θεωρούνται ως υπεύθυνα για την παθογένεση της ΠΣ, είναι δηλαδή «φλεγμονώδη», ενώ τα Th2 θεωρούνται ως προστατευτικά ή «αντιφλεγμονώδη». Τα κύτταρα αυτά διακρίνονται μεταξύ τους από επιφανειακούς δείκτες αλλά κυρίως από το προφίλ των κυτταροκινών που εκκρίνουν και με τις οποίες μεσολαβούν τις ανοσολογικές αντιδράσεις. 4

5 Έτσι, τα Th1 εκκρίνουν κυρίως ιντερφερόνη- γ (IFN-γ), τα Th2 ιντερλευκίνη- 4 (IL-4) και τα Th17 ιντερλευκίνη- 17 (IL-17), από την οποία πήραν και την ονομασία τους. Το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας σχετικά με την ΠΣ έχει γίνει, για αυτονόητους λόγους, στο ζωικό μοντέλο της νόσου, την Πειραματική Αλλεργική ή Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Allergic Encephalomyelitis- EAE). Από το μοντέλο αυτό προέκυψαν οι επικρατούσες θεωρίες περί παθογένεσης της ΠΣ και οι περισσότερες θεραπευτικές παρεμβάσεις με στόχο τον ανοσολογικό μηχανισμό. Ωστόσο, όπως αποδείχθηκε, η γενίκευση ή συναγωγή (extrapolation) των παρατηρήσεων του πειραματικού μοντέλου στον άνθρωπο ήταν προβληματική, αφού υφίστανται αρκετές διαφορές στο ανοσοποιητικό σύστημα μεταξύ των δύο, ενώ και το ίδιο το μοντέλο δεν αποτελεί πιστή μίμηση της ανθρώπινης ΠΣ, αλλά μάλλον μιας οξείας απομυελινωτικής κατάστασης. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου των βοηθητικών Τ- κυττάρων (Th ή CD4+) και των κυτταροκινών τους στην παθογένεση, πορεία και πρόγνωση της ΠΣ. Παρόλο που τα κύτταρα αυτά κατείχαν κεντρικό ρόλο στην εικαζόμενη παθογένεση της νόσου εδώ και δεκαετίες, οι διαρκώς μεταβαλλόμενες αντιλήψεις σχετικά με αυτή αλλά και οι ολοένα αυξανόμενες γνώσεις σχετικά με τα ίδια τα κύτταρα του ανοσοποιητικού καθιστούν πάντα επίκαιρη την ερευνητική προσπάθεια προς αυτή την κατεύθυνση. Η έρευνά μας επεκτάθηκε σε όλους τους πληθυσμούς των CD4+ κυττάρων, τόσο σε αυτούς με ρυθμιστική/ κατασταλτική δράση (ρυθμιστικά Τ- κύτταρα, Tregs), όσο και σε αυτούς με φλεγμονώδη δράση (δραστικά ή τελεστικά Τ- κύτταρα, effector T- cells), δηλαδή στα Th1, Th2 και Th17. Έτσι, διερευνήθηκε η ποσοστιαία αναλογία και η λειτουργικότητα των ρυθμιστικών Τ- κυττάρων στις διάφορες φάσεις της νόσου (υποτροπή, ύφεση) και υπό διαφορετικές θεραπευτικές αγωγές (μεθυλπρεδνιζολόνη, ιντερφερόνη, ναταλιζουμάμπη) (Μελέτη Α). Μελετήθηκε το προφίλ των κυτταροκινών, φλεγμονωδών και αντιφλεγμονωδών, σε δείγματα ορού και ΕΝΥ ασθενών με ΠΣ συγκριτικά με ασθενείς με άλλες, φλεγμονώδεις και μη φλεγμονώδεις νευρολογικές παθήσεις και συμπτωματικών μαρτύρων, προκειμένου να 5

6 διαπιστωθεί ο ρόλος των υποπληθυσμών των CD4+ Τ- κυττάρων στη νόσο και κατά πόσο υπάρχει ένα προφίλ ανοσολογικό που να διακρίνει την ΠΣ από άλλες νευρολογικές παθήσεις (Μελέτη Β). Τέλος, μια σειρά ασθενών με ΠΣ παρακολουθήθηκαν για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα, αφού κατά τη διάγνωση μετρήθηκαν και πάλι οι κυτταροκίνες των διαφόρων υποπληθυσμών των Τ- κυττάρων, προκειμένου μεταξύ των κυτταροκινών να ανευρεθούν προγνωστικοί δείκτες εξέλιξης της νόσου και ανταπόκρισης στη θεραπεία πρώτης γραμμής με IFNβ (Μελέτη Γ). Η ερευνητική αυτή προσπάθεια ήταν μακροχρόνια και κοπιώδης και δεν θα μπορούσε να ολοκληρωθεί επιτυχώς χωρίς τη βοήθεια και υποστήριξη πολλών ανθρώπων, τους οποίους θα ήθελα από καρδιάς να ευχαριστήσω: Τον Καθηγητή Νευρολογίας κ. Παναγιώτη Παπαθανασόπουλο, Επιβλέποντα Καθηγητή μου, για την αμέριστη υποστήριξη, υλική, ηθική και επιστημονική, τόσο στη διάρκεια εκπόνησης της Διατριβής όσο και στην Ειδίκευσή μου στη Νευρολογία. Την Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας- Αιμοδοσίας κ. Αθανασία Μουζάκη, για την πολύτιμη και σοφή καθοδήγηση στα δύσκολα μονοπάτια της ανοσολογίας, την άοκνη και διαρκή υποστήριξη και προτροπή για την επίτευξη του βέλτιστου αποτελέσματος. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Νευρολογίας κ. Γιάννη Ελλούλ, για την πρακτικότητα του πνεύματος που μου μετέδωσε και για την επί έτη γόνιμη συνεργασία στην ομάδα του στην Κλινική. Τις εξαίρετες συνεργάτιδες της κ. Μουζάκη στο Εργαστήριο Πειραματικής Αιματολογίας- Ανοσολογίας κ. Μαρία Ρόδη και κ. Δήμητρα Καλαβριζιώτη, μεταπτυχιακές ερευνήτριες, για την πολύτιμη συμβολή τους στο πειραματικό σκέλος της έρευνας. Τη φαρμακευτική εταιρεία Genesis για την ευγενική χορηγία των αντιδραστηρίων που ήταν απαραίτητα για την ολοκλήρωση του εργαστηριακού μέρους της έρευνας. Τους ασθενείς, που μεγαλόψυχα δέχθηκαν να συμμετάσχουν στην έρευνα, με την ελπίδα τα αποτελέσματά της να αποβούν επ ωφελεία τους. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη και την αγάπη στην οικογένειά μου, για την υπομονή και υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια. 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. ΠΡΟΛΟΓΟΣ 4 ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΙΣ ΟΡΩΝ 10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ- Η ΝΟΣΟΣ Ιστορική Αναδρομή Επιδημιολογία Κλινικές Εκδηλώσεις της ΠΣ Πορεία- Μορφές της ΠΣ Παθοφυσιολογία Παθολογική Ανατομική- Η Πλάκα Αιτιολογία της ΠΣ Γενετικοί Παράγοντες Περιβαλλοντικοί Παράγοντες Αυτοανοσία- Η Διάσπαση της Ανοσολογικής Ανοχής Διάγνωση της ΠΣ Διαγνωστικά Κριτήρια Διαγνωστικές Εξετάσεις στην ΠΣ Μαγνητική Τομογραφία (MRI) Ανάλυση του Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού (ΕΝΥ) Προκλητά Δυναμικά Διαφορική Διάγνωση της ΠΣ Πρόγνωση της ΠΣ Θεραπεία της ΠΣ Θεραπεία Οξείας Φάσης (Υποτροπής) Συμπτωματική Θεραπεία Προφυλακτική Θεραπεία- Τροποποιητικά της Νόσου Φάρμακα ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΙ Η ΠΣ Η Παθογένεση της Πολλαπλής Σκλήρυνσης- Τρέχουσες Αντιλήψεις Πειραματική Αλλεργική ή Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα- Το Ζωικό 52 Μοντέλο της ΠΣ 2.3. Τα Κύτταρα του Ανοσοποιητικού που Συμμετέχουν στην Παθογένεση της 55 7

8 ΠΣ και ο Κυτταροκίνες τους 2.4. Ανοσολογική Ανοχή- Τα Ρυθμιστικά Κύτταρα Ένα Μοντέλο για την Παθογένεση της ΠΣ 64 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΜΕΛΕΤΗ Α- ΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ Τ- ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΗΝ ΠΣ ΜΕ ΕΞΑΡΣΕΙΣ 68 ΚΑΙ ΥΦΕΣΕΙΣ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ 3.1. Εισαγωγή- Σκοπός της Μελέτης Υλικό και Μέθοδοι Ασθενείς και Μάρτυρες Κύτταρα και Καλλιέργειες Πεπτίδια Αντιγονικών Επιτόπων της MOG και της MBP Κυτταρομετρία Ροής Μέτρηση Κυτταροκινών στα Υπερκείμενα των Καλλιεργειών Στατιστική Ανάλυση Αποτελέσματα Τα CD4+CD25 high Foxp3+ Tregs (ntregs) Άλλοι πληθυσμοί Tregs Επίδραση της Καλλιέργειας Παρουσία Πεπτιδίων στη Λειτουργία των 80 ntregs 3.4. Συζήτηση Συμπεράσματα ΜΕΛΕΤΗ Β- ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ 93 ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΠΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ 4.1. Εισαγωγή- Σκοπός της μελέτης Υλικό και Μέθοδοι Ασθενείς με ΠΣ (RRMS) και Μάρτυρες με Νευρολογικές Παθήσεις Μέτρηση Κυτταροκινών στα Βιολογικά Δείγματα Αναλογίες Κυτταροκινών στον Ορό και στο ΕΝΥ Στατιστική Ανάλυση Αποτελέσματα Κυτταροκίνες στον Ορό και στο ΕΝΥ Αναλογίες Κυτταροκινών στον Ορό και στο ΕΝΥ 100 8

9 IgG index και Συσχετίσεις με τις Κυτταροκίνες Συζήτηση Συμπεράσματα ΜΕΛΕΤΗ Γ. ΟΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ΩΣ ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ 114 ΠΟΡΕΙΑΣ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΚΑΙ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ IFNβ 5.1. Εισαγωγή- Σκοπός της Μελέτης Υλικό και Μέθοδοι Ασθενείς με ΠΣ (RRMS) Σχεδιασμός της Μελέτης- Παρακολούθηση Ασθενών- Κριτήρια Έκβασης Μέτρηση Κυτταροκινών στα Βιολογικά Δείγματα Αναλογίες Κυτταροκινών στον Ορό και στο ΕΝΥ Στατιστική Ανάλυση Αποτελέσματα Παρακολούθηση των Ασθενών και Κατάταξή τους σε Ομάδες Αναλόγως της 121 Ανταπόκρισης στη Θεραπεία (GR, PR, norx) Κυτταροκίνες στον Ορό και στο ΕΝΥ των Ασθενών Αναλόγως της 128 Ανταπόκρισης στη Θεραπεία με IFNβ Αναλογίες Κυτταροκινών στον Ορό και το ΕΝΥ των Ασθενών Αναλόγως της 128 Ανταπόκρισης στη Θεραπεία με IFNβ Συσχετίσεις μεταξύ των Κυτταροκινών, των Αναλογιών τους και Άλλων 129 Παραμέτρων 5.4. Συζήτηση Συμπεράσματα ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ 145 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 147 SUMMARY 151 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ- ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΕΙΣ 155 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 158 ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ- Expanded Disability Status Scale 173 9

10 ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΙΣ ΟΡΩΝ APC Αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο ADEM Οξεία διάσπαρτη εγκεφαλομυελίτιδα CD Cluster of differentiation CIS Κλινικά μεμονωμένο σύνδρομο CNP Κυκλική νουκλεοτιδική φωσφοδιεστεράση CTL Κυτταροτοξικό Τ- κύτταρο DMT Τροποποιητικό της νόσου φάρμακο EBV Epstein- Barr virus EDSS Expanded Disability Status Scale Foxp3 Forkhead family transcription factor 3 Gd Γαδολίνιο IFN Ιντερφερόνη IL Ιντερλευκίνη MAG Σχετιζόμενη με τη μυελίνη γλυκοπρωτεΐνη MBP Βασική πρωτεΐνη της μυελίνης MHC Μείζον Σύμπλεγμα Ιστοσυμβατότητας MOG Γλυκοπρωτεΐνη μυελίνης ολιγοδενδροκυττάρων MRI Μαγνητική Τομογραφία MSFC Multiple Sclerosis Functional Composite NK Κύτταρα φυσικοί φονείς OCB Ολιγοκλωνικές δέσμες PLP Πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη PPMS Πρωτοπαθώς προϊούσα πολλαπλή σκλήρυνση PRMS Προϊούσα υποτροπιάζουσα πολλαπλή σκλήρυνση RIS Ακτινολογικά μεμονωμένο σύνδρομο RRMS Πολλαπλή σκλήρυνση με εξάρσεις και υφέσεις SPMS Δευτεροπαθώς προϊούσα πολλαπλή σκλήρυνση TCR T- cell receptor TGF Μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας Th Βοηθητικά Τ- κύτταρα TNF Παράγων νέκρωσης των όγκων Treg Ρυθμιστικό Τ- κύτταρο ΑΕΦ Αιματοεγκεφαλικός φραγμός ΕΝΥ Εγκεφαλονωτιαίο υγρό ΚΝΣ Κεντρικό Νευρικό Σύστημα ΟΔΚ Ολιγοδενδροκύτταρο ΟΠΔ Οπτικά Προκλητά Δυναμικά ΠΑΕ Πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα ΠΣ Πολλαπλή Σκλήρυνση ΠΝΣ Περιφερικό Νευρικό Σύστημα 10

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

12 1. ΠΟΛΛΑΠΛΗ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ- Η ΝΟΣΟΣ 1.1. Ιστορική Αναδρομή Η πρώτη περιγραφή περίπτωσης υποδηλωτικής Πολλαπλής Σκλήρυνσης (ΠΣ) πιθανώς να είναι αυτή της Αγίας Ludwina του Schiedam, που έζησε στην Ολλανδία στα τέλη του 14 ου αιώνα. Λεπτομερής περιγραφή της περίπτωσής της υπάρχει στα Αρχεία του Βατικανού, στα πλαίσια της τεκμηρίωσης για την αγιοποίησή της (Murray, 2009). Οι πρώτες γραπτές αναφορές περιστατικών που αποδόθηκαν αναδρομικά στην ΠΣ χρονολογούνται από τις αρχές του 19 ου αιώνα. Το 1822 ο Sir Augustus d Este ( ) περιέγραψε τη νόσο από την οποία έπασχε ο ίδιος, αν και η επίσημη δημοσίευση έγινε πολύ αργότερα, το Το 1824 δημοσιεύθηκε η περίπτωση του Ollivier D Anger, που χρονολογείται ωστόσο πριν από την περίπτωση του d Este. Πρόσφατα ανακαλύφθηκε μια άλλη, παλαιότερη περίπτωση που είχε διαφύγει της προσοχής και δημοσιεύθηκε το 1757 στο περιοδικό Philosophical Transactions από τον Patrick Brydone (Lincoln and Ebers, 2012). Το ενδιαφέρον στην περίπτωση αυτή, που αφορούσε μια νεαρή γυναίκα 33 ετών, την Elizabeth Foster, είναι ότι ο Brydone την υπέβαλε σε θεραπεία με ηλεκτροσόκ, με σημαντική και άμεση υποχώρηση των συμπτωμάτων της. Η πρώτη περιγραφή των απομυελινωτικών πλακών έγινε το 1838 από τον Robert Carswell (Pathological Anatomy), ωστόσο αυτός που ασχολήθηκε συστηματικά με τη μελέτη της ανθρώπινης απομυελινωτικής νόσου ήταν ο Jean- Martin Charcot ( ) στο Νοσοκομείο Salpétrière κατά τις 3 τελευταίες δεκαετίες του 19 ου αιώνα. Ο Charcot χρησιμοποίησε τους όρους sclèrose en plaques disseminées, sclèrose multiloculaire και sclèrose generalisée, για να περιγράψει την κατάσταση αυτή, όροι που στα Αγγλικά αποδόθηκαν ως disseminated sclerosis. Η ονομασία αυτή επικράτησε μεταξύ των αγγλόφωνων ιατρών για μεγάλο χρονικό διάστημα, ώσπου τελικά αντικαταστάθηκε από τον γενικά αποδεκτό όρο Πολλαπλή Σκλήρυνση τη δεκαετία του 1950, με την έκδοση του 12

13 βιβλίου Multiple Sclerosis από τους Douglas McAlpine, Nigel Compston και Charles Lumden το 1955 (McAlpine et al., 1955). Η ανάδειξη της ΠΣ ως ξεχωριστής νευρολογικής νόσου από τον Charcot άνοιξε το δρόμο για τη συστηματική μελέτη της. Μόλις το 1882 ο Sir Byron Bramwell έκανε την παρατήρηση ότι ο επιπολασμός της ΠΣ είναι μεγαλύτερος στα υψηλότερα γεωγραφικά πλάτη, ενώ την ίδια χρονιά ο Sir William Gowers περιέγραψε και απεικόνισε την οπτική ατροφία στα πλαίσια της νόσου. Τη δεκαετία του 1930 ο Curtius και άλλοι ερευνητές στη Γερμανία άρχισαν να μελετούν συστηματικά τη γενετική πλευρά της επιδημιολογίας της ΠΣ, αλλά μόλις τη δεκαετία του 1980 τεκμηριώθηκε η γενετική προδιάθεση από την Canadian Collaborative Study Group στον Καναδά (Ebers et al., 1995). Η λοιμώδης θεωρία για την αιτιολογία της ΠΣ διατυπώθηκε ήδη από τον Charcot και ιδιαίτερα από τον μαθητή του Pierre Marie. Τις επόμενες δεκατίες υπήρξαν πάμπολλες αιτιάσεις για διάφορους μικροοργανισμούς, μέχρι τη σύγχρονη εποχή, όπου το ενδιαφέρον έχει εστιάσει σε λοιμώξεις από ιούς, όπως ο Epstein- Barr (EBV). Αντίστοιχα, οι προσπάθειες για θεραπευτική αντιμετώπιση ακολουθούσαν τις εκάστοτε αντιλήψεις περί αιτιοπαθογένεσης. Μέχρι τη δεκαετία του 1940 είχαν δοκιμαστεί πλήθος ετερογενών θεραπειών με απογοητευτικά αποτελέσματα. Τη δεκαετία αυτή, η ανακάλυψη της πενικιλλίνης και αργότερα και άλλων αντιβιοτικών, σε συνδυασμό με τη λοιμώδη θεωρία της ΠΣ, οδήγησε στη δοκιμή τους σε ασθενείς με ΠΣ, χωρίς όμως θετικά αποτελέσματα. Οι δεκαετίες που ακολούθησαν ήταν σημαντικές, αφενός γιατί καθιερώθηκε η ανοσολογική θεωρία για την παθογένεση της νόσου και αφετέρου γιατί συστηματοποιήθηκε η μεθοδολογία για τη διεξαγωγή κλινικών μελετών. Οι πρώτοι καρποί ήρθαν το 1958 και το 1961, με τις μελέτες για την επίδραση των κορτικοστεροειδών στη δραστηριότητα της νόσου από τον Henry Miller και τους συνεργάτες του (Miller et al., 1961). Έκτοτε, τα κορτικοστεροειδή αποτελούν την καθιερωμένη θεραπεία για τις υποτροπές της ΠΣ. Τη δεκαετία του 1980 επήλθε μια πραγματική επανάσταση στην ΠΣ, αλλά και γενικότερα στην Ιατρική, με την ανάπτυξη της απεικόνισης μαγνητικού συντονισμού (MRI) από τον Ian 13

14 Young στο Λονδίνο το 1981 (Young et al., 1981). Πλέον ήταν δυνατή η απεικόνιση των βλαβών στο ζωντανό εγκέφαλο, γεγονός που επέτρεπε την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και την ανταπόκριση στις διάφορες θεραπείες. Η εξέλιξη αυτή έδωσε μια τεράστια ώθηση στην έρευνα της ΠΣ. Έτσι, την επόμενη δεκαετία, εμφανίστηκαν οι πρώτες θεραπείες που τροποποιούσαν την πορεία της νόσου, μείωναν δηλαδή τις υποτροπές και επιβράδυναν την εξέλιξη της αναπηρίας. Αυτές ήταν οι ιντερφερόνες β (IFNβ- 1α και IFNβ- 1β) (IFNb- MSSG, 1995; Jacobs et al., 1996; PRISMS, 1998) και η οξεική γλατιραμέρη (Johnson et al., 1995). Την τελευταία δεκαετία, στην αυγή του 21 ου αιώνα, η πενία στα μέσα αντιμετώπισης της ΠΣ έχει αντικατασταθεί από μια πληθώρα θεραπευτικών επιλογών, με την προσθήκη νέων φαρμάκων, όπως το μονοκλωνικό αντίσωμα ναταλιζουμάμπη, τη μιτοξανδρόνη, τη φινγκολιμόδη (το πρώτο φάρμακο για από του στόματος χορήγηση) και άλλων που αναμένεται σύντομα να είναι διαθέσιμα. Ωστόσο, πολλά ερωτήματα σχετικά με την αιτιολογία και παθογένεση της νόσου παραμένουν αναπάντητα, με αποτέλεσμα η ριζική και οριστική θεραπεία της νόσου να παραμένει ένας μελλοντικός στόχος Επιδημιολογία Η ΠΣ είναι νόσος των νεαρών ενηλίκων με μέση ηλικία εμφάνισης τα έτη, ενώ η πρωτοπαθώς προϊούσα μορφή εκδηλώνεται αργότερα, στα έτη. Στις γυναίκες η ηλικία εμφάνισης είναι περίπου 5 έτη νωρίτερα απ ό,τι στους άνδρες. Ωστόσο, η νόσος μπορεί να εκδηλωθεί από την παιδική ηλικία μέχρι και την έβδομη δεκαετία της ζωής, αν και κάτι τέτοιο είναι σπάνιο (Compston et al., 2006; Lublin and Miller, 2008). Όπως σε όλα τα αυτοάνοσα νοσήματα, οι γυναίκες είναι πιο ευάλωτες από τους άνδρες. Σε μια ανασκόπηση 30 μελετών επίπτωσης και επιπολασμού η συνολική αναλογία γυναικώνανδρών ήταν 1.77:1 (Lublin and Miller, 2008), αν και σε μεταγενέστερες επιδημιολογικές μελέτες η αναλογία αυτή έχει αυξηθεί σημαντικά, φθάνοντας το 3:1 σε σχέση με τους λευκούς άνδρες (Kalman, 2008). 14

15 Παραδοσιακά η επίπτωση της ΠΣ θεωρούταν ότι αυξανόταν όσο μεγάλωνε η απόσταση από τον Ισημερινό, ότι υπάρχει δηλαδή μια βαθμίδωση εξαρτώμενη από το γεωγραφικό πλάτος (Kurtzke, 1980). Η εικόνα, ωστόσο, είναι πιο πολύπλοκη, αφού σύμφωνα με μελέτες επιπολασμού- επίπτωσης κάτι τέτοιο δεν ισχύει σε όλες τις περιοχές του κόσμου, όπου φαίνεται ότι πιο σημαντικός παράγοντας είναι η τοποθεσία παρά το γεωγραφικό πλάτος (Kalman, 2008). Εξάλλου, πρόσφατες ανασκοπήσεις δείχνουν ότι η σχέση αυτή με το γεωγραφικό πλάτος τείνει να εξαλειφθεί στην Ευρώπη και στη Βόρειο Αμερική μετά το 1980, κυρίως λόγω αύξησης της επίπτωσης στις περιοχές με χαμηλή συχνότητα ΠΣ (Alonso and Hernan, 2008; Koch-Henriksen and Sorensen, 2010). Στον Ελληνικό χώρο, οι επιδημιολογικές μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε διάφορες περιοχές δείχνουν αύξηση του επιπολασμού από 10.1/100,000 το 1984 (Vassilopoulos, 1984), σε 29.5/100,000 το 1990 στη Βόρειο Ελλάδα (Milonas et al., 1990), σε 39.5/100,000 στον Έβρο το 1999 (Piperidou et al., 2003) και σε /100,000 στην περιοχή της Δυτικής Ελλάδας το 2006 (Papathanasopoulos et al., 2008). Η φυλή φαίνεται επίσης να παίζει καθοριστικό ρόλο στον κίνδυνο για ΠΣ, με τους λευκούς, ιδίως της Βόρειας Ευρώπης, να έχουν τα υψηλότερα ποσοστά. Οι Ασιάτες, οι Αφρικανοί και οι Αμερικανοί ινδιάνοι έχουν τα χαμηλότερα ποσοστά (Kalman, 2008) Κλινικές εκδηλώσεις της ΠΣ Η ΠΣ έχει μια ποικιλία νευρολογικών εκδηλώσεων, καθώς οι βλάβες μπορεί να εντοπίζονται σε οποιοδήποτε σημείο του ΚΝΣ, από τα εγκεφαλικά ημισφαίρια, το στέλεχος, την παρεγκεφαλίδα, τα οπτικά νεύρα ή το νωτιαίο μυελό. Τα συμπτώματα και σημεία της ΠΣ αντανακλούν το μπλοκ αγωγής στα ευρέως απομυελινωμένα τμήματα νευραξόνων ή την απώλεια νευραξόνων καθώς και τη χρονική διασπορά που προκαλείται από την καθυστέρηση της αγωγής σε μικρότερης έκτασης απομυελίνωση. Στον Πίνακα 1.1 παρουσιάζονται τα 15

16 συμπτώματα με τα οποία εκδηλώνεται ένα πρώτο απομυελινωτικό επεισόδιο, με σειρά συχνότητας. Πίνακας 1.1. Αρχικά συμπτώματα σε ασθενείς με Πολλαπλή Σκλήρυνση Σύμπτωμα Συχνότητα (%) Αισθητικές διαταραχές- άκρα 30.7 Απώλεια/ θάμβος όρασης 15.9 Κινητικό 13.2 Διπλωπία 6.8 Διαταραχή βάδισης 4.8 Διαταραχές ισορροπίας 2.9 Αισθητικές διαταραχές- πρόσωπο 2.8 Φαινόμενο Lhermitte 1.8 Ίλιγγος 1.7 Κυστικές διαταραχές 1 Αταξία άκρου 1 Οξεία εγκάρσια μυελίτιδα 0.7 Άλγος 0.5 Αδιευκρίνιστα 2.5 Πολυσυμπτωματική εκδήλωση 13.7 Τροποποιημένο από (Olek, 2005). Μολονότι η ΠΣ μπορεί να εκδηλωθεί με πληθώρα συμπτωμάτων και σημείων, ορισμένα κλινικά χαρακτηριστικά είναι πιο συχνά και υποδηλώνουν τη νόσο: εμφάνιση μεταξύ 15 και 50 ετών, προσβολή πολλαπλών περιοχών του ΚΝΣ, κόπωση, διαπυρηνική οφθαλμοπληγία, οπτική νευρίτιδα, σημείο Lhermitte, επιδείνωση με την αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος (φαινόμενο Uhthoff) (Lublin and Miller, 2008; Olek, 2005). Στην πορεία του χρόνου εμφανίζονται και άλλα συμπτώματα, τα οποία οφείλονται στη διαδικασία της νευροεκφύλισης, που βαίνει παράλληλα με τις υποτροπές ή την προϊούσα πορεία, όπως έκπτωση γνωστικών λειτουργιών, συναισθηματικές διαταραχές (κατάθλιψη, άγχος, αυτοκτονικότητα, ευφορία), σπαστικότητα, διαταραχές ούρησης και αφόδευσης, στυτική δυσλειτουργία (Compston and Coles, 2008; Lublin, 2008) Πορεία- Μορφές της ΠΣ Η πλέον συνήθης μορφή της ΠΣ (στο 85% των νεοδιαγνωσμένων ασθενών) είναι αυτή που χαρακτηρίζεται από εξάρσεις (ή ώσεις ή υποτροπές) νευρολογικής δυσλειτουργίας, 16

17 ακολουθούμενες από υφέσεις, μερικές ή πλήρεις και άλλοτε άλλης διάρκειας. Οι εξάρσεις μπορεί να είναι οξείας ή υποξείας έναρξης, να διαρκούν ημέρες ή εβδομάδες, πάντα όμως περισσότερες από 24 ώρες. Η συχνότητα των υποτροπών ποικίλλει και εξαρτάται από τον υπό μελέτη πληθυσμό. Από επιδημιολογικές μελέτες προκύπτει ένας μέσος όρος 0.4 έως 0.6 υποτροπών ανά έτος (Confavreux, 2006). Στις κλινικές μελέτες, στο σκέλος των ασθενών που λαμβάνουν εικονικό φάρμακο, η συχνότητα αυτή είναι μεγαλύτερη και φθάνει τις 0.8 έως 1.2 υποτροπές ανά έτος. Σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών (5-10%) η νόσος ακολουθεί από την αρχή μια πορεία με προϊούσα εξέλιξη. Με βάση την παρουσία ή όχι υποτροπών και τη χρονική εξέλιξη της αναπηρίας έχουν περιγραφεί οι εξής μορφές της ΠΣ (Lublin and Reingold, 1996): ΠΣ με εξάρσεις και υφέσεις (Relapsing- remitting MS- RRMS). Σαφείς υποτροπές με πλήρη ύφεση ή νευρολογικά υπολείμματα. Οι περίοδοι μεταξύ των υποτροπών χαρακτηρίζονται από κλινική στασιμότητα. Δευτεροπαθώς προϊούσα ΠΣ (Secondary progressive MS- SPMS). Αρχική πορεία με εξάρσεις και υφέσεις, ακολουθούμενη από πορεία με σταδιακή νευρολογική επιδείνωση, με ή χωρίς περιστασιακές υποτροπές, ήσσονες υφέσεις και στασιμότητα. Πρωτοπαθώς προϊούσα ΠΣ (Primary progressive MS- PPMS). Σταδιακή νευρολογική επιδείνωση από την έναρξη της νόσου. Επιτρέπονται περίοδοι στασιμότητας και παροδικής μικρής βελτίωσης. Προϊούσα ΠΣ με εξάρσεις (Progressive relapsing MS- PRMS). Σταδιακή επιδείνωση από την έναρξη της νόσου, συνοδευόμενη από σαφείς υποτροπές με πλήρη ή ατελή ύφεση. Οι μεταξύ των υποτροπών περίοδοι χαρακτηρίζονται από σταδιακή επιδείνωση (Εικόνα 1.1). Το κλινικά μεμονωμένο σύνδρομο (Clinically Isolated Syndrome- CIS) αποτελεί το στάδιο πριν τη διάγνωση της κλινικά βέβαιης ΠΣ, κατά το οποίο υπάρχει μία κλινική εκδήλωση, χωρικά και χρονικά (συνήθως οπτική νευρίτιδα, μυελίτιδα ή στελεχιαία βλάβη) 17

18 (Εικόνα 1.1). Η μετάπτωση σε κλινικά βέβαιη ΠΣ εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, κυρίως από τον αριθμό των βλαβών όπως αναδεικνύονται από την MRI (Brex et al., 2002). ΠΣ με εξάρσεις και υφέσεις (RRMS) Δευτεροπαθώς προϊούσα ΠΣ (SPMS) Πρωτοπαθώς προϊούσα ΠΣ (PPMS) Προϊούσα ΠΣ με εξάρσεις (PRMS) Εικόνα 1.1. Στο πάνω μέρος παρουσιάζονται σχηματικά οι τέσσερεις κλινικές μορφές της ΠΣ. Στο κάτω μέρος περιγράφεται χρονικά η πορεία της τυπικής μορφής της ΠΣ. Στην προκλινική περίοδο περιλαμβάνεται και το λεγόμενο ακτινολογικά μεμονωμένο σύνδρομο (Radiologically Isolated Syndrome- RIS), κατά το οποίο δεν υπάρχουν ακόμη κλινικά επεισόδια, συμπτώματα ή σημεία, αλλά σε MRI εγκεφάλου διαπιστώνονται βλάβες τυπικές ΠΣ. Η κλινική πορεία ξεκινά με ένα πρώτο κλινικό επεισόδιο (CIS), στη συνέχεια εκδηλώνονται και άλλα, οπότε τίθεται η διάγνωση της κλινικά βέβαιης ΠΣ (RRMS). Τα επεισόδια (υποτροπές) με την πάροδο του χρόνου μειώνονται σε συχνότητα, το νευρολογικό έλλειμμα συσσωρεύεται, και κάποια στιγμή η νόσος μεταπίπτει στη δευτεροπαθώς προϊούσα μορφή (SPMS). Ένα ποσοστό ασθενών με RRMS, που κυμαίνεται ευρέως ανάλογα με τα κριτήρια και την περίοδο παρακολούθησης, ακολουθεί μια πορεία χωρίς συχνές υποτροπές και με ελάχιστη αναπηρία μετά από τουλάχιστον 10 έτη από την έναρξη των συμπτωμάτων (EDSS 3) 18

19 (Costelloe et al., 2008; Tremlett et al., 2010). Η μορφή αυτή ονομάζεται καλοήθης ΠΣ (benign MS), αν και εξακολουθούν να υπάρχουν αντιρρήσεις σχετικά με το πόσο «καλοήθης» είναι, δεδομένου ότι μακροπρόθεσμα ένας σημαντικός αριθμός ακολουθεί λιγότερο καλοήθη πορεία (Leray et al., 2012), ενώ και σε αυτούς που πληρούν τα κριτήρια της καλοήθους ΠΣ ως προς τα κινητικά συμπτώματα υπάρχουν σημαντικές επιπτώσεις στις γνωστικές λειτουργίες, που δεν ανιχνεύονται με τις συνήθεις μεθόδους εξέτασης (Amato and Portaccio, 2012). Παρόλα αυτά, αρκετές σειρές παρακολούθησης για μεγάλα χρονικά διαστήματα (30 έως και 50 έτη) έδειξαν ότι η καλοήθης ΠΣ δεν είναι σπάνια (τουλάχιστον 10%) (Hawkins, 2012) και ότι η ανίχνευση ασθενών με αυτή τη μορφή είναι σημαντική για την πρόγνωση και τη θεραπευτική τους αντιμετώπιση (Hutchinson, 2012). Στον αντίποδα της καλοήθους ΠΣ βρίσκεται η κακοήθης ΠΣ, με ταχέως εξελισσόμενη πορεία, που οδηγεί σε σημαντικά νευρολογικά ελλείμματα σε πολλαπλά συστήματα ή και στο θάνατο σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα (Lublin, 2008). Η εξέλιξη της νόσου παρακολουθείται με κλινικά και απεικονιστικά μέσα. Τα κλινικά κριτήρια περιλαμβάνουν τη συχνότητα των υποτροπών και την εξέλιξη της αναπηρίας, όπως αυτή καταγράφεται με κλίμακες. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη κλίμακα, τόσο στην κλινική πράξη όσο και στις κλινικές μελέτες είναι η Expanded Disabilty Status Scale (EDSS) του Kurtzke (βλ. Προσάρτημα) (Kurtzke, 1983). Είναι μια δεκαβάθμια κλίμακα όπου το 0 αντιστοιχεί στη φυσιολογική νευρολογική λειτουργία και το 10 στο θάνατο εξαιτίας της ΠΣ. Παρά την ευρεία της χρήση, ωστόσο, ολοένα και περισσότερο αναγνωρίζονται τα μειονεκτήματα και οι περιορισμοί της, αφού είναι κυρίως εστιασμένη στο κινητικό έλλειμμα (από το βαθμό 4 και άνω καθορίζεται σχεδόν αποκλειστικά από την ικανότητα βάδισης), δεν είναι γραμμική και οι ασθενείς τείνουν να συγκεντρώνονται στις κατώτερες και ανώτερες βαθμίδες ενώ δεν έχει ευαισθησία στις μεσαίες βαθμίδες (Noseworthy, 2006). Οι προσπάθειες για δημιουργία ενός ολοκληρωμένου συστήματος καταγραφής της εξέλιξης της νόσου οδήγησαν στην ανάπτυξη της κλίμακας Multiple Sclerosis Functional Composite (MSFC) 19

20 (Cutter et al., 1999), η οποία έχει τρία σκέλη: το Paced Auditory Serial Addition Test (PASAT), το 9-Hole Peg Test (9HPT) και το Timed 25- Foot Walk Test (T25WT), τα οποία ελέγχουν αντίστοιχα τις νοητικές ικανότητες, τα άνω και κάτω άκρα. Η κλίμακα αυτή έχει ήδη αρχίσει να χρησιμοποιείται στις κλινικές μελέτες της ΠΣ Παθοφυσιολογία Τα συμπτώματα και σημεία της ΠΣ είναι το αποτέλεσμα των παθοφυσιολογικών διαδικασιών που παρατηρούνται στο ΚΝΣ, δηλαδή της απομυελίνωσης με σχετική διατήρηση των νευραξόνων. Νεότερα δεδομένα, ωστόσο, από παθολογοανατομικές μελέτες και από ειδικές τεχνικές μαγνητικού συντονισμού (MRI), υποδεικνύουν ότι υπάρχει κάποιου βαθμού απώλεια νευραξόνων στις πλάκες της ΠΣ, ακόμη και στις εξάρσεις της νόσου (Compston and Coles, 2008). Οι κλινικές συνέπειες αυτής της απώλειας νευρώνων, τόσο στο φλοιό όσο και σε εν τω βάθει δομές της φαιάς ουσίας, δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητές. Η συμπαγής μυελίνη είναι η αναδιπλωμένη, πλούσια σε λιπίδια μεμβράνη των ολιγοδενδοκυττάρων που παρέχει μόνωση στις ηλεκτρικές ώσεις που μεταδίδονται κατά μήκος των νευραξόνων. Οι εμμύελοι νευράξονες μεταδίδουν τις νευρικές ώσεις ταχύτατα, με «κατά άλματα» τρόπο και με έναν υψηλής ασφάλειας παράγοντα (5 έως 7 φορές πάνω από τον ουδό). Το ιοντικό ρεύμα δημιουργείται από το άνοιγμα ηλεκτροευαίσθητων διαύλων Na + στους κόμβους του Ranvier. Η επακόλουθη εισροή ιόντων Na + δημιουργεί ένα ρεύμα που κινείται προς τον επόμενο κόμβο του Ranvier, αφού δεν μπορεί να κινηθεί προς τα έξω στα εμμύελα μεσοκομβικά τμήματα του νευράξονα. Το άνοιγμα διαύλων Κ + τερματίζει τη ροή του ρεύματος και οδηγεί σε επαναπόλωση. Υπάρχουν διάφοροι υπότυποι διαύλων Κ +. Οι ταχείς δίαυλοι, ευαίσθητοι στην 4- αμινοπυριδίνη, βρίσκονται στα μεταξύ των κομβίων εμμύελα τμήματα και είναι υπεύθυνοι για την επαναπόλωση σε απομυελινωμένους νευράξονες. Οι βραδείς δίαυλοι βρίσκονται στα κομβία του Ranvier και διαδραματίζουν ρόλο 20

21 στη ρύθμιση της επαναλαμβανόμενης πυροδότησης. Η αντλία Na + - K + - ATPάση αποκαθιστά την ιοντική ισορροπία μετά από πυροδότηση υψηλής συχνότητας (Lublin, 2008). Η απομυελίνωση διαταράσσει τη ροή του ρεύματος λόγω της απομάκρυνσης της μόνωσης των μεταξύ των κομβίων τμημάτων του νευράξονα. Στις περιπτώσεις βραχείας απομυελίνωσης (ένα ή δύο μεσοκομβικά τμήματα) η απομυελίνωση δεν έχει επιπτώσεις εξαιτίας του υψηλού βαθμού ασφάλειας της μετάδοσης. Ωστόσο, σε απομυελίνωση μεγαλύτερων τμημάτων επέρχεται διαταραχή της μετάδοσης, επειδή το ρεύμα πρέπει πλέον να «ταξιδέψει» με συνεχή μετάδοση. Η χαμηλή πυκνότητα των μεσοκομβικών διαύλων Na + εμποδίζει τη μετάδοση της ηλεκτρικής ώσης, ενώ όταν αυτή συμβεί είναι σε πολύ μειωμένη ταχύτητα (5-10% της φυσιολογικής). Η ανερέθιστη περίοδος των απομυελινωμένων νευραξόνων είναι παρατεταμένη και επαναλαμβανόμενες ώσεις αποκλείονται όταν συναντήσουν ένα τμήμα του νευράξονα σε ανερέθιστη περίοδο. Τα εμμένοντα νευρολογικά ελλείμματα ή τα αρνητικά συμπτώματα της ΠΣ προκαλούνται από περιοχές στις οποίες παραμένει μπλοκ αγωγής, όπως συμβαίνει σε περιοχές με μεγάλες πλάκες, ενώ η παροδική επιδείνωση της λειτουργίας αντανακλά μια πτώση κάτω από τον ουδό ασφαλείας της αγωγιμότητας εξαιτίας μεταβολών που αφορούν στους μερικώς απομυελινωμένους νευράξονες (φαινόμενο Uhthoff, επιδείνωση κατά την αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος). Τα συμπτώματα ή σημεία μπορεί επίσης να προκληθούν από επιβράδυνση της αγωγής που προκαλεί χρονική διασπορά σε χρονικά κρίσιμες συνάψεις. Επιπλέον, το μπλοκ αγωγής είναι πλήρες στους διατμημένους νευράξονες (Lublin, 2008). Η μηχανική διέγερση στους απομυελινωμένους νευράξονες μπορεί να δημιουργήσει de novo δυναμικά δράσης και μπορεί να εξηγεί το φαινόμενο Lhermitte, το αίσθημα ηλεκτρικού ρεύματος κατά μήκος της σπονδυλικής στήλης κατά την κάμψη του αυχένα. Αυτόματη γένεση δυναμικών δράσης έχει καταγραφεί από απομυελινωμένους νευράξονες και θα μπορούσε να εξηγήσει τα παροξυσμικά- θετικά συμπτώματα της ΠΣ, όπως η νευραλγία τριδύμου, οι μυοκυμίες και ο σπασμός των παρασπονδυλικών μυών. 21

22 Εκτός από τις δομικές μεταβολές πρέπει να συνυπολογιστούν και οι λειτουργικές διαταραχές της νευρομεταβίβασης που προκαλούνται από το οίδημα ή τους διαλυτούς παράγοντες που απελευθερώνονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (κυτταροκίνες, χημειοκίνες, μόρια προσκόλλησης) στην πλάκα και στη γύρω περιοχή, που μπορεί να είναι τοξικοί για τα κύτταρα ή τους νευράξονες. Η ταχεία επαναφορά της λειτουργικότητας μπορεί να οφείλεται στην υποχώρηση του οιδήματος, σε μεταβολές του ph, μείωση των κυτταρικών διηθήσεων ή αποδόμηση των κυτταροκινών, ενώ η πιο καθυστερημένη επαναφορά μπορεί να αντανακλά τη χρήση εναλλακτικών νευρωνικών κυκλωμάτων ή την αύξηση των μεσοκομβικών διαύλων Na + και η όψιμη μπορεί να οφείλεται σε επαναμυελίνωση (Lublin and Miller, 2008) Παθολογική Ανατομική- Η πλάκα Το παθολογοανατομικό ορόσημο στην ΠΣ είναι η πλάκα στον εγκέφαλο και στο νωτιαίο μυελό, η οποία αποτελείται από μια διακριτή περιοχή απομυελίνωσης με σχετική διατήρηση των νευραξόνων, μολονότι φασματοσκοπικές και παθολογοανατομικές μελέτες δείχνουν ότι κάποιου βαθμού απώλεια νευραξόνων αποτελεί τμήμα της βλάβης, ακόμη και στα αρχικά στάδια (Bennett and Stuve, 2009). Μακροσκοπικά ο εγκέφαλος εμφανίζει ποικίλου βαθμού ατροφία και διάταση του κοιλιακού συστήματος. Οι πλάκες μπορεί να είναι ορατές στην επιφάνεια του εγκεφάλου ή του νωτιαίου μυελού. Σε διατομές του εγκεφάλου οι πλάκες εμφανίζουν περιαγγειακή κατανομή, γύρω από μικρά φλεβίδια, και εντοπίζονται συχνότερα στην περικοιλιακή λευκή ουσία, στο στέλεχος και στο νωτιαίο μυελό. Ωστόσο, μεγάλος αριθμός μικρών πλακών, συχνά ορατές μόνο μικροσκοπικά, εντοπίζονται και στις φλοιϊκές περιοχές, προσβάλλοντας τις ενδοφλοιϊκές εμμύελες ίνες (Lublin, 2008). Ένα από τα πρώιμα χαρακτηριστικά της οξείας βλάβης στην ΠΣ είναι η διάσπαση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ), που ανιχνεύεται με την MRI. Η διάσπαση του ΑΕΦ 22

23 αποτελεί το πρώτο κρίσιμο βήμα στην παθογένεση της βλάβης. Ο ΑΕΦ σχηματίζεται από στενές συνδέσεις μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων των εγκεφαλικών αγγείων. Οι συνδέσεις αυτές δε διαταράσσονται, αλλά μάλλον ενεργοποιείται ένα ενδοθηλιακό κυτταρικό σύστημα μεταφοράς κυστιδίων, που μεταφέρει ύδωρ, πρωτεΐνες, αντισώματα και κυτταροκίνες (και γαδολίνιο) εντός του εγκεφάλου (Compston and Coles, 2008). Η ιστολογική εξέταση των ενεργών πλακών αποκαλύπτει περιαγγειακή διήθηση από λεμφοκύτταρα (κυρίως Τ- κύτταρα), μακροφάγα και περιστασιακά πλασματοκύτταρα. Εντός της πλάκας η μυελίνη εμφανίζει διάσπαση, με αποτέλεσμα συντρίμματα μυελίνης να σχηματίζουν σωρούς ή να συσσωρεύονται εντός των μακροφάγων. Τα μακροφάγα, που βρίσκονται κυρίως στο κέντρο της πλάκας, φαίνεται ότι διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην απομάκρυνση της μυελίνης από τους νευράξονες. Έντονη είναι και η παρουσία αντιδραστικών αστροκυττάρων εντός της πλάκας. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει αυξημένα επίπεδα κυτταροκινών στις ενεργές πλάκες, γεγονός που υποδηλώνει συνεχιζόμενη ανοσοδιέγερση (Lublin, 2008). Η τύχη της ολιγοδενδρογλοίας στις βλάβες της ΠΣ αποτελεί αντικείμενο διαμάχης. Η επικρατούσα άποψη είναι ότι ο αριθμός των ολιγοδενδροκυττάρων είναι μειωμένος στο κέντρο της πλάκας, σε αναλογία με την απώλεια μυελίνης, ενώ στην περιφέρεια είναι σταθερός ή ακόμη και αυξημένος, υποδηλώνοντας μια προσπάθεια επαναμυελίνωσης. Η επαναμυελίνωση θεωρούταν απίθανη στο ΚΝΣ (σε αντίθεση με το περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ)), ωστόσο η ανακάλυψη των σκιωδών πλακών (περιοχές με νευράξονες με λεπτό έλυτρο μυελίνης) υποστηρίζει την άποψη της επαναμυελίνωσης στο ΚΝΣ (Prineas et al., 2001) ενώ έχουν ανιχνευθεί και πρόδρομα κύτταρα των ολιγοδενδροκυττάρων στον ενήλικο εγκέφαλο. Η επαναμυελίνωση μπορεί να προέλθει είτε από ολιγοδενδροκύτταρα που παρήγαγαν μυελίνη είτε από ωρίμανση πρόδρομων κυττάρων. Η επαναμυελίνωση μπορεί να εξηγήσει και το κλινικό εύρημα της βραδείας και καθυστερημένης ανάρρωσης από ένα οξύ επεισόδιο, ενώ η ταχεία κλινική ανάρρωση μπορεί να αποδοθεί στην υποχώρηση του 23

24 οιδήματος, της φλεγμονής και της απομάκρυνσης τοξικών προϊόντων στις οξείες πλάκες στις οποίες η καταστροφή της μυελίνης είναι ελάχιστη. Πρόσφατες παθολογοανατομικές μελέτες δείχνουν ότι η έκταση της επαναμυελίνωσης μπορεί να είναι σημαντική, ακόμη και σε ασθενείς με προϊούσα νόσο (Patrikios et al., 2006). Οι χρόνια απομυελινωμένες πλάκες είναι αποτέλεσμα μάλλον υποτροπιαζόντων επεισοδίων απομυελίνωσης στο ίδιο σημείο παρά ενός σοβαρού επεισοδίου απομυελίνωσης (Prineas et al., 2001). Τα υποτροπιάζοντα αυτά επεισόδια έχουν ως αποτέλεσμα είτε εξάντληση της ικανότητας της ολιγοδενδρογλοίας για επαναμυελίνωση είτε ιστικές μεταβολές που εμποδίζουν την επαναμυελίνωση. Η Lucchinetti και συν. (Lucchinetti et al., 2000) απέδειξαν, μελετώντας βιοψίες και νεκροτομικό υλικό από εγκεφάλους ασθενών, την ετερογένεια της βλάβης στην ΠΣ. Περιέγραψαν τέσσερεις διαφορετικούς τύπους βλάβης. Στους δύο πρώτους (τύπος Ι και τύπος ΙΙ) κυριαρχεί το φλεγμονώδες στοιχείο, με διήθηση από Τ- λεμφοκύτταρα και μακροφάγα. Το στοιχείο που διαφοροποίησε τον τύπο Ι από τον ΙΙ ήταν η παρουσία IgG και συμπληρώματος στις περιοχές ενεργού καταστροφής της μυελίνης αποκλειστικά στον τύπο ΙΙ. Στους άλλους δύο τύπους (τύπος ΙΙΙ και IV) το χαρακτηριστικό ήταν η καταστροφή των ολιγοδενδροκυττάρων με ελάχιστη αντικατάσταση (σε αντίθεση με τους πρώτους δύο τύπους όπου η αντικατάσταση ήταν σημαντική) και μια εικόνα που προσομοίαζε με ιϊκή ή τοξική απόπτωση ή νέκρωση (Πίνακας 1.2 και Εικόνα 1.2). Πίνακας 1.2. Παθολογικοί Υπότυποι της Πολλαπλής Σκλήρυνσης Τύπος Ι Τύπος ΙΙ Τύπος ΙΙΙ Τύπος IV Τ- κύτταρα Μακροφάγα Συμπλήρωμα/ IgG Απομυελίνωση Περιφλεβική Περιφλεβική Ακαθόριστη Περιφλεβική Απώλεια ΟΔΚ Ποικίλη Ποικίλη Σημαντική Σημαντική Απόπτωση ΟΔΚ Επαναμυελίνωση Συχνότητα ΟΔΚ= Ολιγοδενδροκύτταρα. Τροποποιημένος από Lucchinetti et al., Ann Neurol,

25 Όλες οι ενεργές βλάβες σε κάθε ασθενή ήταν του ίδιου τύπου (Lucchinetti et al., 2000). Ωστόσο, μια πιο πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι όλες οι οξείες πλάκες είναι του ίδιου τύπου (ΙΙ) και ότι οι άλλοι τύποι είναι πολύ σπάνιοι (Breij et al., 2008). Ο συγκεκριμένος στόχος της ανοσομεσολαβούμενης βλάβης στην ΠΣ παραμένει αδιευκρίνιστος. Η απώλεια της μυελίνης και της ολιγοδενδρογλοίας υποδηλώνουν μια πρωτογενή επίθεση ενάντια στην ολιγοδενδρογλοία ή σε κάποιο αντιγόνο στην επιφάνεια των ολιγοδενδροκυττάρων ή της μυελίνης. Εναλλακτικά, η μυελίνη μπορεί να αποτελεί τον πρωτογενή στόχο και η ολιγοδενδρογλοία μπορεί να επιβιώσει της απομυελίνωσης, τουλάχιστον στα αρχικά στάδια της νόσου. Οι ενεργές βλάβες περιέχουν Τ- λεμφοκύτταρα και μακροφάγα στις περιαγγειακές περιοχές και στο παρέγχυμα. Τα περισσότερα από τα Τ- λεμφοκύτταρα εκφράζουν τον υποδοχέα α/β TCR. Αναγνωρίζονται τόσο CD4+ όσο και CD8+ Τ- κύτταρα. Τα CD4+ κύτταρα εκτείνονται από την περιφέρεια της ενεργού πλάκας μέχρι την παρακείμενη λευκή ουσία, ενώ τα CD8+ κύτταρα κυριαρχούν στις περιαγγειακές περιοχές. Μεταξύ των λεμφοκυττάρων υπάρχουν κύτταρα με ειδική ευαισθητοποίηση έναντι αντιγόνων της μυελίνης. Η ευαισθητοποίηση των Τ- κυττάρων μπορεί να επέλθει μέσω άμεσης έκθεσης σε αντιγόνα της μυελίνης εντός του ΚΝΣ ή των αυχενικών λεμφαδένων, που αποτελούν σημεία στα οποία αποχετεύονται αντιγόνα του ΚΝΣ, ή με την έκθεση σε εξωγενή αντιγόνα που μοιράζονται παρόμοιους αντιγονικούς επίτοπους με τη μυελίνη, φαινόμενο που καλείται μοριακή μιμική. Τα μικρογλοιακά κύτταρα, τα αστροκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορούν, μέσω επαγωγής, να εκφράσουν στην επιφάνειά τους αντιγόνα του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητα (MHC), και να δράσουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC), προάγοντας έτσι την παρουσίαση αντιγόνων της μυελίνης στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (Fainardi, 2009; Lublin, 2008). Τα Τ- λεμφοκύτταρα και τα μικρογλοιακά κύτταρα- μακροφάγα συμβάλλουν στην ιστική καταστροφή και με μη αντιγονικούς μηχανισμούς. Τα κύτταρα αυτά εκκρίνουν μια ποικιλία 25

26 διαλυτών μορίων που μπορούν να προκαλέσουν ιστική βλάβη, περιλαμβανομένης της ολιγοδενδρογλοίας. Τα μόρια αυτά περιλαμβάνουν τις κυτταροκίνες (TNF, IFN-γ κ.α.), λευκοτριένια, πρωτεάσες, συμπλήρωμα, κ.α. Εικόνα Τα τέσσερα πρότυπα παθολογοανατομικής βλάβης στην ΠΣ (με βάση τη μελέτη των Luchinetti et al), τα οποία έχουν ως κοινή αφετηρία τη φλεγμονή (λεμφοκυτταρική διήθηση) και οδηγούν στο ίδιο τελικό αποτέλεσμα, τη νευροεκφύλιση και την ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων. Από (Compston and Coles, 2008). Οι χρόνιες, ανενεργές πλάκες εμφανίζουν σαφή όρια από το γύρω εγκεφαλικό παρέγχυμα και είναι φτωχές σε κύτταρα. Οι πλάκες δείχνουν πολλαπλασιασμό των αστροκυττάρων, απογυμνωμένους νευράξονες και απουσία ολιγοδενδρογλοίας. Παρατηρείται επίσης συρρίκνωση ή και απώλεια των νευραξόνων σε ποικίλο βαθμό. Διάσπαρτα στη βλάβη αναγνωρίζονται μικρογλοιακά κύτταρα και μακροφάγα, συχνά με αφρώδη εμφάνιση. Στην παρυφή της πλάκας μπορεί να υπάρχει ακόμη αύξηση των κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει συνέχιση της δραστηριότητας της νόσου (Lublin, 2008). 26

27 Υπάρχουν σημαντικές παθολογοανατομικές διαφορές ανάμεσα στην τυπική μορφή της ΠΣ και στις λεγόμενες παραλλαγές της. Στην παραλλαγή Baló (συγκεντρική σκλήρυνση) παρατηρούνται εναλλασσόμενες περιοχές απομυελινωμένων και μυελινωμένων ινών στη λευκή ουσία. Κλινικά, η Baló χαρακτηρίζεται από πιο θορυβώδη έναρξη και κεραυνοβόλο πορεία και από εντονότερη φλεγμονή στο ΕΝΥ. Μια άλλη παραλλαγή, η Marburg, χαρακτηρίζεται από ογκόμορφες, ευμεγέθεις βλάβες με εκτεταμένες περιοχές φλεγμονής και οιδήματος. Η οπτική νευρομυελίτιδα ή νόσος Devic θεωρείται πλέον απομυελινωτική νόσος πλήρως διακριτή από την ΠΣ, με ξεχωριστό και σαφή παθογενετικό μηχανισμό, που χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη αντισωμάτων έναντι της ακουαπορίνης- 4 (AQP- 4 ή anti- NMO). Προσβάλλει πρωτίστως το νωτιαίο μυελό και τα οπτικά νεύρα, με τις βλάβες να εμφανίζουν πιο έντονη νέκρωση, κυστικούς σχηματισμούς και πολλαπλασιασμό αγγείων σε σχέση με την ΠΣ (Compston and Coles, 2008; Lublin, 2008) Αιτιολογία της ΠΣ Η ακριβής αιτιολογία της ΠΣ παραμένει άγνωστη. Θεωρείται ότι η ΠΣ είναι το αποτέλεσμα της επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων σε άτομα με γενετική προδιάθεση, ενώ καθοριστικό ρόλο διαδραματίζει η διαταραχή της ανοσολογικής ανοχής (Εικόνα 1.3) Γενετικοί παράγοντες Η εμφάνιση ΠΣ είναι πιο συχνή μεταξύ των μελών οικογενειών που έχουν κάποιο προσβεβλημένο μέλος, και η συχνότητα αυξάνεται όσο αυξάνεται ο βαθμός γενετικής συγγένειας. Έτσι, ενώ στο γενικό πληθυσμό ο κίνδυνος εμφάνισης ΠΣ είναι περίπου %, στα αμφιθαλή αδέλφια είναι 3-5%, όσος και στους διζυγωτικούς διδύμους, ενώ στους μονοζυγωτικούς διδύμους αυξάνεται δραματικά στο 20-38% (Εικόνα 1.4). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι υπάρχει κάποιο γενετικό υπόστρωμα, του τύπου της μη μενδελιανής 27

28 πολυγονιδιακής κληρονομικότητας (Compston and Coles, 2008; Lublin and Miller, 2008; Olek, 2005). Εικόνα 1.3. Οι αιτιολογικοί παράγοντες που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους προκειμένου να εκδηλωθεί η ΠΣ. ΔΚ= Δενδριτικά κύτταρα, EBV= Epstein- Barr virus, HHV= Human herpes virus, Μφ= Μακροφάγα, ΟΔΚ= ολιγοδενδροκύτταρα. Η συσχέτιση της ΠΣ και των αλληλίων του MHC είχε αναγνωριστεί ήδη από τη δεκαετία του 1970 (Compston et al., 1976). Τα αλληλόμορφα γονίδια με τη μεγαλύτερη συσχέτιση είναι τα DRB1*1501, DRB5*0101, DQA1*0102 και DQB2*0602 (Olerup and Hillert, 1991). Η συσχέτιση είναι μεγαλύτερη στους Βοειοευρωπαίους, παρατηρείται ωστόσο σε όλους τους πληθυσμούς, εκτός από τους Σαρδήνιους και μερικούς άλλους Μεσόγειους, στους οποίους η συσχέτιση είναι μεγαλύτερη για το DR4 (DRB1*0405-DQA1*0301-DQB1*0302) (Marrosu et al., 1992). Τα παραπάνω ευρήματα επιβεβαιώθηκαν και σε νεότερες μελέτες γονιδιωματικής, σύμφωνα με τις οποίες στη λίστα προστέθηκαν και άλλα γονίδια, όπως τα HLA-C5 και HLA-DRB1*11, τα οποία παρέχουν προστατευτική δράση, ενώ αυξημένη προδιάθεση προσδίδουν πολυμορφισμοί (SNPs) της α αλύσου των υποδοχέων της ιντελευκίνης- 2 (IL-2) και της ιντελευκίνης- 7 (IL-7) (Compston and Wekerle, 2006; Hafler et al., 2007; Peltonen, 2007). 28

29 Εικόνα 1.4. Ο κίνδυνος σε όλη τη διάρκεια της ζωής εμφάνισης ΠΣ αναλόγως του βαθμού γενετικής συγγένειας (Compston and Coles, 2008) Περιβαλλοντικοί παράγοντες Τα δεδομένα από μελέτες μετανάστευσης υποδηλώνουν την εμπλοκή περιβαλλοντικού παράγοντα στην παθογένεια της ΠΣ. Άτομα που μεταναστεύουν από περιοχές υψηλής σε περιοχές χαμηλής επίπτωσης μετά την εφηβεία φέρουν μαζί τους τον αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΠΣ, ενώ άτομα που μεταναστεύουν σε παιδική ηλικία έχουν τον ίδιο κίνδυνο με αυτά της περιοχής στην οποία μετανάστευσαν (Compston and Coles, 2008). Από τους περιβαλλοντικούς παράγοντες, αυτός που μελετήθηκε εκτενέστερα είναι οι λοιμώξεις. Έχει παρατηρηθεί ότι οι ασθενείς με ΠΣ νόσησαν από παιδικές ασθένειες όπως ιλαρά, παρωτίτιδα, ερυθρά, σε μεγαλύτερη ηλικία συγκριτικά με υγιή άτομα με τον ίδιο HLA-DR2 γονότυπο (Martyn et al., 1993). Επίσης, μια επιδημιολογική μελέτη σε 3 εκατομμύρια άτομα έδειξε ότι η νόσηση από τον ιό Epstein- Barr (EBV) κατά τη νεαρή ενήλικο ζωή αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης ΠΣ (RR 3.0). Παρόμοιες παρατηρήσεις οδήγησαν στη διατύπωση της λεγόμενης «υπόθεσης υγιεινής», σύμφωνα με την οποία τα άτομα που δεν είχαν έλθει σε επαφή με παθογόνους οργανισμούς στην παιδική ηλικία, λόγω καθαρού περιβάλλοντος, εκδηλώνουν παθολογικές ανοσολογικές αντιδράσεις σε αυτούς όταν έρχονται σε επαφή μαζί τους ως 29

30 νεαροί ενήλικες (Levin et al., 2003). Εντούτοις, πολυάριθμες προσπάθειες να απομονωθεί κάποιος υπεύθυνος μικροοργανισμός οδήγησαν σε αντικρουόμενα συμπεράσματα. Η υπόθεση της ιογενούς λοίμωξης ήταν πάντα ελκυστική για διάφορους λόγους: οι ιογενείς λοιμώξεις οδηγούν σε ενεργοποίηση των Th1 κυττάρων και παραγωγή IFNγ, αύξηση της διαπερατότητας του ΑΕΦ και δυνητικά εισροή κυττάρων του ανοσοποιητικού στο ΚΝΣ οι ιογενείς λοιμώξεις μπορεί να προδιαθέτουν σε αύξηση των υποτροπών η ευεργετική δράση της IFNβ στους ασθενείς με ΠΣ ενισχύει την υπόθεση της ιογενούς εμπλοκής στην παθογένεση (Karabetsos, 2000). Η αποτυχία στην ανάδειξη μιας σαφούς ιογενούς αιτίας της ΠΣ είχε ως αποτέλεσμα η έρευνα για την αναζήτηση περιβαλλοντικών αιτίων να στραφεί σε άλλους παράγοντες, προδιαθεσικούς ή εκλυτικούς, όπως η χαμηλή έκθεση στο ηλιακό φως, η ανεπάρκεια της βιταμίνης D ( Ho et al., 2012; Pierrot-Deseilligny et al., 2012), η διατροφή, το κάπνισμα (Healy et al., 2009; Hernan et al., 2005; Zivadinov et al., 2009), η γεωμαγνητική δραστηριότητα (Resch, 1995), ραδιενεργές ουσίες και τοξίνες (D'Hooghe M et al., 2010; Ebers, 2008). Η επίδραση συγκεκριμένων περιβαλλοντικών παραγόντων σε άτομα με γενετική προδιάθεση μπορεί να εξηγήσει πολλά από τα επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της ΠΣ, όπως η γεωγραφική κατανομή, οι φυλετικές διαφορές και η αναλογία ανδρών/ γυναικών Αυτοανοσία- Η διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής Αυτοαντιδρώντα Τ- και Β- κύτταρα ανευρίσκονται στο αίμα υγιών ατόμων όπως και ασθενών με ΠΣ. Πρόκειται για κύτταρα που διέφυγαν της κλωνικής διαγραφής κατά την ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος και διατηρούν μια ανοχή έναντι των αντιγόνων τους. Η αυτοανοσία αναπτύσσεται όταν τα κύτταρα αυτά χάσουν την ανοχή, οπότε ξεκινά μια πολύπλοκη διεργασία ανοσολογικής αντίδρασης έναντι των ιστών που περιέχουν τα αυτοαντιγόνα. Η απώλεια της ανοχής μπορεί να συμβεί μέσω μοριακής μιμικής, μεταξύ ιδίων και εξωγενών αντιγόνων, όπως αυτά των ιών. Οι ιοί και τα βακτήρια μπορεί να έχουν 30

31 πεπτιδικά αντιγόνα που να είναι παρόμοια με τμήματα πρωτεϊνών της μυελίνης, με αποτέλεσμα να διεγείρουν Τ- κύτταρα που αναγνωρίζουν αυτά τα αντιγόνα και να οδηγούν σε αυτοανοσία. Ένας άλλος μηχανισμός διάσπασης της ανοσολογικής ανοχής μεσολαβείται από λοίμωξη του ΚΝΣ, με αποτέλεσμα ιστική καταστροφή και απελευθέρωση αντιγόνων στην κυκλοφορία, όπου μπορεί να ενεργοποιήσουν τα αντίστοιχα αυτοαντιδρώντα Τ- κύτταρα (Abbas, 2007; Compston and Coles, 2008). Μολονότι η αυτοανοσία είναι ένας πιθανός αιτιολογικός μηχανισμός στην ΠΣ, το υπεύθυνο αυτοαντιγόνο δεν έχει ακόμη αναγνωριστεί ενώ και ο παθογενετικός μηχανισμός δεν έχει αποσαφηνιστεί (Lublin, 2008). Περισσότερα στοιχεία σχετικά με τον ανοσολογικό μηχανισμό της ΠΣ αναφέρονται παρακάτω, στο Κεφάλαιο Διάγνωση της ΠΣ Διαγνωστικά κριτήρια Η διάγνωση της ΠΣ είναι πρωτίστως κλινική, με την τεκμηρίωση της προσβολής του ΚΝΣ με διασπορά στο χώρο (2 ή περισσότερες βλάβες) και στο χρόνο (2 ή περισσότερα επεισόδια ή προοδευτική επιδείνωση). Για να βελτιωθεί η ομοιογένεια των ασθενών με ΠΣ η Schumacher Committee on Diagnostic Criteria for MS έθεσε 6 κλινικά διαγνωστικά κριτήρια για τη διάγνωση της κλινικά βέβαιης ΠΣ: (1) αντικειμενική δυσλειτουργία του ΚΝΣ, (2) προσβολή δομών της λευκής ουσίας, (3) 2 ή περισσότερες περιοχές προσβολής, (4) πορεία με εξάρσεις και υφέσεις ή προϊούσα πορεία (για πάνω από 6 μήνες), (5) ηλικία έναρξης μεταξύ 10 και 50 ετών και (6) απουσία άλλης, καλύτερης εξήγησης των συμπτωμάτων, με βάση την κρίση ενός έμπειρου νευρολόγου. Τα κριτήρια αυτά δεν περιλάμβαναν δεδομένα από παρακλινικές εξετάσεις. Οι Poser και συν. το 1983 τροποποίησαν τα κριτήρια αυτά προσθέτοντας στοιχεία που προκύπτουν από τον παρακλινικό έλεγχο (ανάλυση ΕΝΥ, προκλητά δυναμικά και νευροαπεικόνιση) (Poser et al., 1983). Στη συνέχεια ο McDonald και οι συνεργάτες του πρότειναν νέα διαγνωστικά κριτήρια με σαφείς κατευθυντήριες γραμμές για τα απεικονιστικά 31

32 (MRI) κριτήρια για χρήση τόσο στην κλινική πράξη όσο και σε κλινικές μελέτες (McDonald et al., 2001). Τα κριτήρια αυτά αναθεωρήθηκαν το 2005 από τη National Multiple Sclerosis Society (Polman et al., 2005) (Πίνακας 1.3). Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 1.3, στην περίπτωση μονοσυμπτωματικής εκδήλωσης, όταν δηλαδή υπάρχει μόνο μία κλινική ώση και δεν έχει τεκμηριωθεί κλινικά η διασπορά στο χώρο και στο χρόνο, αξιοποιούνται τα στοιχεία από τις εργαστηριακές εξετάσεις, και κυρίως την MRI, ώστε να τεθεί η διάγνωση της ΠΣ (Πίνακας 1.4). Πίνακας 1.3. Αναθεωρημένα Διαγνωστικά Κριτήρια McDonald για την Πολλαπλή Σκλήρυνση (2005) Κλινική Εικόνα Επιπλέον Διαγνωστικά Ευρήματα 2 ή περισσότερες κλινικές ώσεις (επεισόδια) Κανένα (επιπλέον ευρήματα είναι θεμιτά αλλά πρέπει να είναι 2 ή περισσότερα συμβατά με ΠΣ) αντικειμενικά κλινικά ευρήματα 2 ή περισσότερες κλινικές ώσεις Διασπορά στο χώρο, που αναδεικνύεται με ένα από τα παρακάτω: 1 αντικειμενικό κλινικό MRI εύρημα θετικό ΕΝΥ και 2 ή περισσότερες βλάβες στην MRI συμβατές με ΠΣ άλλη ώση από προσβολή άλλης περιοχής 1 κλινική ώση Διασπορά στο χρόνο, που αναδεικνύεται με ένα από τα 2 ή περισσότερα παρακάτω: αντικειμενικά κλινικά MRI ευρήματα δεύτερη κλινική ώση 1 κλινική ώση Διασπορά στο χώρο, που αναδεικνύεται με ένα από τα 1 αντικειμενικό κλινικό παρακάτω: εύρημα MRI (μονοσυμπτωματική εκδήλωση) θετικό ΕΝΥ και 2 ή περισσότερες βλάβες στην MRI συμβατές με ΠΣ ΚΑΙ Διασπορά στο χρόνο, που αναδεικνύεται με ένα από τα παρακάτω: MRI Πρωτοπαθώς προϊούσα μορφή (συνεχής νευρολογική επιδείνωση υποδηλωτική ΠΣ) δεύτερη κλινική ώση Συνεχιζόμενη εξέλιξη για 1 έτος (αναδρομικά ή προοπτικά) ΚΑΙ 2 από τα 3 παρακάτω: Θετική MRI εγκεφάλου ( 9 αυξημένου σήματος βλάβες στην Τ2 ακολουθία ή 4 ή περισσότερες βλάβες στην Τ2 με θετικά ΟΠΔ) Θετική MRI ΝΜ (2 ή περισσότερες βλάβες στην Τ2) Θετικό ΕΝΥ Όταν πληρούνται όλα τα κριτήρια η διάγνωση είναι ΠΣ, όταν δεν πληρούνται όλα η διάγνωση είναι πιθανή ΠΣ και όταν δεν πληρούται κανένα αναζητούμε άλλη διάγνωση Πρόσφατα υπήρξε νέα αναθεώρηση των κριτηρίων του McDonald, με έμφαση στα απεικονιστικά κριτήρια για τη διασπορά στο χώρο και στο χρόνο, απλοποιώντας τα 32

33 προηγούμενα αλλά διατηρώντας την ευαισθησία και την ειδικότητά τους (Polman et al., 2011). Πίνακας 1.4. Διευκρινίσεις για τα Διαγνωστικά Κριτήρια κατά McDonald Τι είναι ώση; Νευρολογική διαταραχή του είδους που παρατηρείται στην ΠΣ Υποκειμενική αναφορά ή αντικειμενική παρατήρηση Διάρκειας τουλάχιστον 24 ωρών Αποκλείει τις ψευδοϋποτροπές και τα μεμονωμένα παροξυσμικά επεισόδια Χρόνος μεταξύ των ώσεων 30 ημέρες μεταξύ της έναρξης του επεισοδίου 1 και της έναρξης του επεισοδίου 2 MRI κριτήρια για τη διασπορά στο χώρο (3 από τα παρακάτω): 1 εστία που προσλαμβάνει παραμαγνητική ουσία (Gd) ή 9 υπέρπυκνες εστίες στην T2W 1 τουλάχιστον υποσκηνίδια εστία 1 τουλάχιστον υποφλοιώδης εστία 3 τουλάχιστον περικοιλιακές εστίες (μία εστία στο νωτιαίο μυελό μπορεί να αντικαταστήσει μια εστία στον εγκέφαλο αλλά όχι μια υποφλοιώδη ή περικοιλιακή εστία) MRI κριτήρια για τη διασπορά στο χρόνο (τουλάχιστον 1 από τα παρακάτω): Εμφάνιση μιας εστίας που προσλαμβάνει σκιαστικό σε θέση που δε σχετίζεται με το κλινικό σύμπτωμα εφόσον η εξέταση γίνει σε χρονικό διάστημα τουλάχιστον 3 μηνών από το κλινικό συμβάν Εμφάνιση μιας νέας εστίας στην T2W οποτεδήποτε, συγκρινόμενη με απεικόνιση που έγινε τουλάχιστον 30 ημέρες από το αρχικό κλινικό συμβάν Θετικό ΕΝΥ (ένα από τα παρακάτω): Ολιγοκλωνικές ζώνες IgG με απουσία τους στον ορό Αυξημένος δείκτης IgG (IgG index) Θετικά ΟΠΔ Παθολογικά όταν υπάρχει παράταση του λανθάνοντος χρόνου χωρίς διαταραχή των κυματομορφών Διαγνωστικές εξετάσεις στην ΠΣ Παρόλο που η διάγνωση της ΠΣ είναι πρωτίστως κλινική, υπάρχουν διάφορες επικουρικές εργαστηριακές εξετάσεις που βοηθούν στη διάγνωση Μαγνητική Τομογραφία (MRI) Η MRI έχει αλλάξει σημαντικά τη διαγνωστική προσέγγιση της ΠΣ και αποτελεί την εξέταση εκλογής για την ανάδειξη των απομυελινωτικών βλαβών. Οι βλάβες της ΠΣ εντοπίζονται τυπικά στην περικοιλιακή λευκή ουσία, στο μεσολόβιο, στο ημιωοειδές κέντρο, στην εν τω βάθει λευκή ουσία, στην παραφλοιώδη λευκή ουσία (ίνες U), στο στέλεχος και στο νωτιαίο μυελό. Έχουν συνήθως ωοειδές σχήμα, με το μεγάλο άξονα κάθετο προς το μεσολόβιο, σαν να ακτινοβολούν από αυτό (δάκτυλοι του Dawson) (Εικόνα 1.5). 33

34 A B Γ Δ Εικόνα 1.5. Χαρακτηριστικές εικόνες MRI ασθενών με ΠΣ. Α. Διακρίνονται οι συρρέουσες περικοιλιακές εστίες, ιδίως πέριξ των κεράτων των πλαγίων κοιλιών (πάνω εικόνες, ακολουθίες FLAIR), καθώς και οι ενισχυόμενες με Gd εστίες (κάτω αριστερά) και οι μαύρες οπές (κάτω δεξιά) στις T1 ακολουθίες. Β. Τυπική εικόνα με τις εστίες στο μεσολόβιο και με το μεγάλο τους άξονα κάθετο προς αυτό. Γ. Οβελιαία τομή στο ύψος του μεσολοβίου, όπου δακρίνονται οι δάκτυλοι του Dawson, παραφλοιώδεις εστίες και μία εστία στο φλοιό (βέλος). Δ. Χαρακτηριστική εστία στο ΝΜ (Α6), η οποία εμφανίζει ενίσχυση με Gd (Τ1 ακολουθία). Οι πλάκες έχουν υπέρπυκνη απεικόνιση στις Τ2, PD και FLAIR ακολουθίες, ενώ στις Τ1 ακολουθίες μπορεί να είναι υπόπυκνες (μαύρες οπές), γεγονός που υποδηλώνει απώλεια νευραξόνων εκτός της απομυελίνωσης και έχει χειρότερη πρόγνωση. Η χορήγηση γαδολινίου (Gd-DTPA), μιας παραμαγνητικής ουσίας που προσλαμβάνεται από το εγκεφαλικό 34

35 παρέγχυμα μόνο όταν υπάρχει διάσπαση του ΑΕΦ, είναι χρήσιμη για την ανάδειξη των ενεργών βλαβών. Η ενίσχυση διαρκεί συνήθως για 4 εβδομάδες και η κορτιζόνη, που χορηγείται στις υποτροπές αποκαθιστά τον ΑΕΦ με αποτέλεσμα να καταργεί την ενίσχυση των βλαβών (Lublin, 2008). Εκτός από την ενεργότητα της νόσου, η MRI πληροφορεί και για το συνολικό φορτίο της νόσου (disease burden), το συνολικό όγκο δηλαδή του εγκεφάλου που εμφανίζει πλάκες, καθώς και για το βαθμό της εγκεφαλικής ατροφίας που αυξάνεται καθώς η νόσος εξελίσσεται. Η MRI αποτελεί τον πιο ευαίσθητο δείκτη δραστηριότητας της ΠΣ, αφού η παρατηρούμενη με διαδοχικές απεικονίσεις δραστηριότητα της νόσου υπερβαίνει κατά 2 έως 10 φορές την κλινικά παρατηρούμενη. Ακόμη, αποτελεί ευαίσθητο και ειδικό δείκτη εξέλιξης του CIS σε κλινικά βέβαιη ΠΣ. Ασθενείς με CIS και καμία βλάβη στην MRI εξελίχθηκαν σε ΠΣ στην 5ετία σε ποσοστό 6%, στη 10ετία σε 11% και στα 14 έτη σε ποσοστό 19%. Από την άλλη, ασθενείς με αρχική MRI με περισσότερες από 3 βλάβες είχαν ποσοστά μετατροπής 67% στην 5ετία, 87% στη 10ετία και 87% στα 14 έτη (Brex et al., 2002). Έχουν προταθεί διάφορα κριτήρια για τη διάκριση των βλαβών στην MRI που αποδίδονται στην ΠΣ, τα οποία λαμβάνουν υπόψη τις τυπικές θέσεις εντόπισης των βλαβών στην ΠΣ και το γεγονός της συχνής ανεύρεσης βλαβών στην MRI σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας, οι οποίες συνήθως είναι αγγειακής αιτιολογίας (Barkhof et al., 1997; Fazekas et al., 1988; Paty et al., 1988; Tintore et al., 2000; Tintore et al., 2006). Οι πληροφορίες που παρέχει η MRI έχουν υποκαταστήσει τις κλινικές πληροφορίες όσον αφορά στην τεκμηρίωση της διασποράς στο χώρο και στο χρόνο, όπως φαίνεται και στα διαγνωστικά κριτήρια της ΠΣ (McDonald et al., 2001; Polman et al., 2005). Λίγο πριν την τελευταία αναθεώρηση των διαγνωστικών κριτηρίων, δημοσιεύθηκε ένα άρθρο σχετικά με τις πιο πρόσφατες προτάσεις για τα MRI κριτήρια του CIS (Montalban et al., 2010). Σύμφωνα με αυτό, η τεκμηρίωση της διασποράς στο χώρο μπορεί πλέον να γίνει με την παρουσία 1 ή περισσότερων βλαβών σε 2 ή περισσότερες από τις 4 θέσεις που θεωρούνται χαρακτηριστικές στην ΠΣ (παραφλοιώδεις, 35

36 περικοιλιακές, υποσκηνιδιακές, νωτιαίος μυελός). Η διασπορά στο χρόνο τεκμηριώνεται είτε με την παρουσία 1 ή περισσοτέρων, ασυμπτωματικών, ενισχυόμενων και μη ενισχυόμενων, βλαβών, ανεξαρτήτως του χρόνου διενέργειας της απεικόνισης, είτε με την παρουσία 1 νέας, Τ2 και/ ή ενισχυόμενης, βλάβης συγκριτικά με προηγούμενη απεικόνιση, ανεξάρτητα από το χρόνο διεξαγωγής της αρχικής απεικόνισης. Τα νέα αυτά κριτήρια ενσωματώθηκαν τελικά στα πιο πρόσφατα διαγνωστικά κριτήρια της ΠΣ (Polman et al., 2011) Ανάλυση του Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού (ΕΝΥ) Η ανάλυση του ΕΝΥ, παρότι μη διαγνωστική, μπορεί να βοηθήσει την κλινική διάγνωση της ΠΣ. Το ΕΝΥ στους ασθενείς με ΠΣ είναι εν πολλοίς φυσιολογικό (άχρουν, διαυγές, με φυσιολογική πίεση). Ο αριθμός των κυττάρων είναι φυσιολογικός στο 67% των ασθενών, ενώ σπάνια ξεπερνά τα 50 κύτταρα/ μl (κάτι τέτοιο αποτελεί αιτία αναζήτησης άλλης διάγνωσης). Ο τύπος κυττάρων που επικρατεί είναι ο λεμφοκυτταρικός (Τ- κύτταρα) (Lublin, 2008). Τα επίπεδα αλβουμίνης στο ΕΝΥ είναι αυξημένα στο 20-30% των ασθενών (υποδηλώνει διάσπαση του ΑΕΦ), αλλά μόνο στο 1% φθάνουν σε επίπεδα διπλάσια του ανώτερου φυσιολογικού. Το χαρακτηριστικότερο εύρημα είναι η αύξηση της ανοσοσφαιρίνης, κυρίως IgG, σε σχέση με άλλα συστατικά, που υποδηλώνει ενδορραχιαία σύνθεση. Ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης είναι ο δείκτης IgG (IgG index), που προέρχεται από την αναλογία IgG του ΕΝΥ προς του ορού δια της αναλογίας αλβουμίνης του ΕΝΥ προς του ορού (Εικόνα 1.6). Η ευαισθησία του IgG index είναι 70-90% στις περιπτώσεις κλινικά βέβαιης ΠΣ (Awad et al., 2010). Ένας άλλος δείκτης ενδορραχιαίας σύνθεσης IgG είναι η ανεύρεση ολιγοκλωνικών δεσμών (Oligoclonal bands- OCBs) κατά την ηλεκτροφόρηση του ΕΝΥ (Εικόνα 1.6). Αυτές αντιπροσωπεύουν αντισώματα που παράγονται από έναν ή περισσότερους κλώνους πλασματοκυττάρων, χωρίς ωστόσο να έχει αποσαφηνιστεί η ειδικότητά τους έναντι 36

37 συγκεκριμένων αντιγόνων (Bennett and Stuve, 2009). Η ευαισθησία των OCBs είναι 85-95% στις περιπτώσεις κλινικά βέβαιης ΠΣ. Ωστόσο, η ειδικότητα της εξέτασης δεν είναι αντίστοιχα υψηλή, αφού OCBs παρατηρούνται σε μια πλειάδα άλλων νευρολογικών παθήσεων, κυρίως φλεγμονωδών και λοιμωδών (Awad et al., 2010). Εικόνα 1.6. Πάνω: Ο τύπος υπολογισμού του δείκτη IgG index. Κάτω: Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών στο ΕΝΥ και στο πλάσμα. Αριστερά, σε φυσιολογικό άτομο, υπάρχει απουσία ολιγοκλωνικών δεσμών στο ΕΝΥ. Δεξιά, σε άτομο με ΠΣ παρατηρούνται ολιγοκλωνικές δέσμες στο ΕΝΥ. Άλλοι δείκτες που έχουν αξιολογηθεί ως προς την ευαισθησία και ειδικότητά τους στη διάγνωση της ΠΣ περιλαμβάνουν την εντόπιση ελεύθερων ελαφρών κ αλύσων στο ΕΝΥ (Presslauer et al., 2008) (96% και 86% αντίστοιχα). Η ανεύρεση βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης (ΜΒΡ) στο ΕΝΥ στερείται ειδικότητας, ενώ μία πιο πρόσφατη μελέτη έδειξε ευαισθησία 83.7% και ειδικότητα 78.3% (Tian et al., 2009). Τα αντισώματα έναντι της MBP αποτελούν έναν πιθανό δείκτη ενεργού νόσου, χρειάζεται ωστόσο να αξιολογηθούν περαιτέρω πριν θεωρηθούν ότι έχουν ρόλο στην αιτιολογία της ΠΣ (Warren and Catz, 1990) Προκλητά Δυναμικά Τα προκλητά δυναμικά [οπτικά (ΟΠΔ), σωματοαισθητικά (ΣΑΠΔ) και τα ακουστικά του στελέχους (ΑΣΠΔ)], αποτελούσαν χρήσιμες διαγνωστικές εξετάσεις για την ΠΣ μέχρι την έλευση της MRI. Τα μόνα που παραμένουν σε κλινική χρήση είναι τα ΟΠΔ (Εικόνα 1.7), τα 37

38 οποία είναι θετικά (παράταση του λανθάνοντος χρόνου του Ρ100) στο 90% των ασθενών με ιστορικό οπτικής νευρίτιδας, ακόμη και όταν η οπτική οξύτητα έχει πλέον επανέλθει στο φυσιολογικό (Lublin, 2008). Εικόνα 1.7. ΟΠΔ ασθενούς με οπτική νευρίτιδα του αριστερού οφθαλμού (πράσινη κυματομορφή). Το έπαρμα P100 του δεξιού οφθαλμού (κόκκινη κυματομορφή) είναι εντός φυσιολογικών ορίων (107 msec), ενώ του αριστερού οφθαλμού εμφανίζει παράταση (121 msec). (Ίδια περίπτωση, Εργαστήριο Οπτικών Προκλητών Δυναμικών Νευρολογικής Κλινικής Π. Ν. Πατρών) Διαφορική διάγνωση της ΠΣ Η διάγνωση της ΠΣ είναι σχετικά εύκολη στις περιπτώσεις νέων ατόμων με 2 ή περισσότερα επεισόδια νευρολογικής δυσλειτουργίας, τα οποία ακολουθούνται από μερική ή πλήρη ύφεση. Τα προβλήματα προκύπτουν όταν υπάρχουν άτυπες εκδηλώσεις, μονοφασικά επεισόδια ή προϊούσα νόσος. Ακόμη, όμως, και στις περιπτώσεις που ο κλινικός φαινότυπος είναι συμβατός με ΠΣ, πρέπει να αποκλείονται άλλες καταστάσεις που μπορεί να εκδηλωθούν με παρόμοιο φαινότυπο. Εξάλλου, τα διαγνωστικά κριτήρια της ΠΣ απαιτούν τον «αποκλεισμό άλλων παθήσεων που θα μπορούσαν να εξηγήσουν καλύτερα τα συμπτώματα των ασθενών». Υπάρχουν πολλές τέτοιες παθήσεις που ταιριάζουν στους 38

39 ποικίλους κλινικούς φαινότυπους ενός πρωτοεμφανιζόμενου ασθενή με πιθανή ΠΣ, όπως μονοεστιακή εκδήλωση, πολυεστιακή (διασπορά στο χώρο), μονοφασική (CIS), πολυφασική (υποτροπιάζουσα), προϊούσα. Πρόσφατα ξεκίνησε μια συντονισμένη προσπάθεια να τεθούν κατευθυντήριες οδηγίες στη διαφορική διάγνωση της ΠΣ, από μια διεθνή ομάδα εργασίας ειδικών στην ΠΣ (Task Force on Differential Diagnosis of MS) (Miller et al., 2008). Η ομάδα αυτή έθεσε κατευθύνσεις για τις λεγόμενες «κόκκινες σημαίες», ευρήματα δηλαδή από το ιστορικό, την κλινική εξέταση και τις παρακλινικές εξετάσεις, που όταν εντοπίζονται πρέπει να παρακινούν τον κλινικό να αναζητήσει εναλλακτικές διαγνώσεις (Πίνακας 1.5), καθώς και αλγόριθμους για τη διαφορική διάγνωση των κυριότερων μεμονωμένων κλινικών συνδρόμων (CIS), διαγνωστικά κριτήρια για το CIS, την ADEM και τη νόσο Devic (Miller et al., 2008). Στον Πίνακα 1.6 παρατίθενται οι κυριότερες παθήσεις που πρέπει να αποκλειστούν κατά τη διαφορική διάγνωση της ΠΣ (Lublin, 2008; Miller et al., 2008; Rolak and Fleming, 2007; Scolding, 2001; Trojano and Paolicelli, 2001; Zaffaroni et al., 2001). Πίνακας 1.5. Κυριότερες «κόκκινες σημαίες» που απομακρύνουν από τη διάγνωση της ΠΣ Ηλικία <10 και >60 ετών Οικογενειακό ιστορικό νευρολογικής νόσου (εκτός της ΠΣ) Προσβολή του ΠΝΣ Ημιανοψία Φλοιϊκά συμπτώματα, όπως αφασία, απραξία, αγνωσία Έλλειμμα που εγκαθίσταται εντός λεπτών Οστικές βλάβες Προσβολή πνευμόνων, νεφρών, αμφιβληστροειδούς Καρδιακή νόσος Μυοπάθεια Φλοιϊκά έμφρακτα Εξωπυραμιδικά συμπτώματα Ενίσχυση απεικονιστικά των μηνίγγων Φυσιολογική ή άτυπη MRI Αιματολογικές διαταραχές Έλκη στους βλεννογόνους, εξανθήματα Αρθρίτιδα, πολυαρθραλγίες, μυαλγίες 39

40 Πίνακας 1.6. Παθήσεις που πρέπει να αποκλειστούν κατά τη διαφορική διάγνωση της ΠΣ Φλεγμονώδεις παθήσεις Οξεία διάσπαρτη εγκεφαλομυελίτδα (ADEM) Παρανεοπλασματικές εγκεφαλομυελίτιδες Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ) Κοκκιωματώδης αγγειΐτιδα Νόσος Sjögren Νόσος Αδαμαντιάδη- Behçet Οζώδης πολυαρτηρίτιδα Οπτική νευρομυελίτιδα (νόσος Devic) Οπτική νευρίτιδα Εγκάρσια μυελίτιδα Λοιμώδεις παθήσεις Νόσος Lyme (νευρομπορρελίωση) Λοίμωξη από ιό HTLV-1 (τροπική παραπάρεση)* Λοίμωξη από ιό HIV Προϊούσα πολυεστιακή λευκοεγκεφαλοπάθεια (PML- JC virus)* Νευροσύφιλη * Νόσος Whipple Κυστικέρκωση Τοξοπλάσμωση Κοκκιωματώδεις παθήσεις Σαρκοείδωση Κοκκιωμάτωση Wegener Λεμφοκυτταρική κοκκιωμάτωση Αγγειακές παθήσεις Πολλαπλά εμβολικά έμφρακτα (καρδιογενή, αγγειογενή) Σύνδρομο αντιφωσφολιπιδικών αντισωμάτων Κενοτοπιώδη έμφρακτα (lacunar) Σύνδρομο CADASIL Αμυλοειδική αγγειοπάθεια Νόσος Moya Moya Θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα Αρτηριοφλεβώδεις δυσπλασίες Αγγειΐτιδα ΚΝΣ Νεοπλασματικές παθήσεις Λέμφωμα ΚΝΣ* Γλοίωμα* Ιστιοκυττάρωση Εγκεφαλικές μεταστάσεις* Παθήσεις της μυελίνης- Κληρονομικές διαταραχές Μεταγχρωματική λευκοδυστροφία* Αδρενομυελολευκοδυστροφία* Κληρονομική οπτική νευροπάθεια του Leber (LHON)* Γεφυρική και εξωγεφυρική μυελινόλυση Διάφορες Ανεπάρκεια βιταμίνης Β 12 * Νωτιαιοπαρεγκεφαλιδικές διαταραχές* Δυσπλασία Arnold- Chiari Μιτοχονδριακή εγκεφαλοπάθεια (π.χ. MELAS)* 40

41 Πίνακας 1.6. συνέχεια Φυσιολογική (παρουσία UBOs [Unidentified Bright Objects] στην MRI) Φάρμακα και τοξίνες Ημικρανία Αυχενική σπονδύλωση * Καταστάσεις με πρωτίστως προϊούσα πορεία. Καταστάσεις πρωτίστως με μονοφασική εκδήλωση (διασπορά στο χώρο αλλά όχι στο χρόνο). Καταστάσεις κυρίως με διασπορά στο χρόνο αλλά όχι στο χώρο (πολυφασική εκδήλωση). Καταστάσεις με συχνή διασπορά τόσο στο χώρο όσο και στο χρόνο Πρόγνωση της ΠΣ Παρόλο που υπάρχει μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των ασθενών ως προς την πρόγνωση της νόσου, διάφοροι παράγοντες έχουν αναγνωριστεί ως πιθανοί προγνωστικοί δείκτες (Lublin, 2008). Ως προς το φύλο, οι γυναίκες θεωρείται ότι έχουν καλύτερη πρόγνωση συγκριτικά με τους άνδρες (Lublin, 2008). Η εμφάνιση της νόσου σε μικρότερη ηλικία φαίνεται να έχει καλύτερη πρόγνωση απ ό,τι σε μεγαλύτερη, αλλά αυτό πιθανόν να οφείλεται στο ότι στις μικρότερες ηλικίες η νόσος εκδηλώνεται με την RRMS μορφή, ενώ σε μεγαλύτερες με την προϊούσα μορφή, η οποία έχει χειρότερη πρόγνωση. Στην RRMS, η υψηλή συχνότητα υποτροπών κατά την αρχική φάση καθώς και το σύντομο χρονικό διάστημα μεταξύ των υποτροπών αποτελούν κακό προγνωστικό δείκτη. Ως προς τα συμπτώματα με τα οποία εκδηλώνεται αρχικά η νόσος, φαίνεται ότι οι αισθητικές διαταραχές, η δυσλειτουργία κρανιακών νεύρων και η οπτική νευρίτιδα συνοδεύονται από καλή πρόγνωση, ενώ αντίθετα τα πυραμιδικά, στελεχιαία και παρεγκεφαλιδικά συμπτώματα από χειρότερη πρόγνωση. Καθώς η νόσος προσβάλλει κυρίως γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας, η εγκυμοσύνη αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα που μπορεί να επηρεάσει την πρόγνωσή της. Έχει φανεί από πολυάριθμες μελέτες ότι η κατά την εγκυμοσύνη οι υποτροπές μειώνοναι σημαντικά, για να εμφανίσουν αύξηση στην περίοδο της λοχείας, ιδίως στους 3 πρώτους μήνες, και να επανέλθουν στα προ της κύησης επίπεδα στη συνέχεια (Confavreux et al., 1998; Fernandez Liguori et al., 2009; Vukusic and Confavreux, 2006; Vukusic et al., 2004). Η κύηση, ωστόσο, δε φαίνεται να μεταβάλλει μακροπρόθεσμα την πορεία της ΠΣ (Lee and O'Brien, 2008; 41

42 Lublin, 2008; Weinshenker et al., 1989), αν και υπάρχουν μελέτες που έδειξαν καλύτερη πρόγνωση στις γυναίκες που είχαν γεννήσει (Keyhanian et al., 2012; Runmarker and Andersen, 1995). Ο θηλασμός δεν έχει φανεί από τις περισσότερες μελέτες να έχει ευεργετική επίδραση στην πορεία της ΠΣ (Fernandez Liguori et al., 2009; Nelson et al., 1988; Vukusic et al., 2004; Worthington et al., 1994), αν και υπήρξαν μελέτες που έδειξαν θετική επίδραση του θηλασμού στη συχνότητα των επιλόχειων υποτροπών (Iorio et al., 2009; Langer-Gould et al., 2009). Μια μεταανάλυση των σχετικών με το θηλασμό στην ΠΣ μελετών κατέληξε στο συμπέρασμα ότι οι γυναίκες που θηλάζουν έχουν τις μισές πιθανότητες εμφάνισης επιλόχειων υποτροπών, αναγνώρισαν ωστόσο τη μεγάλη ετερογένεια των μελετών που καθιστούσε δυσχερή την ερμηνεία των αποτελεσμάτων (Pakpoor et al., 2012). Αυτό που μπορεί πάντως να ειπωθεί με βεβαιότητα είναι ότι σε καμία μελέτη ο θηλασμός δε φάνηκε να αποτελεί κακό προγνωστικό δείκτη της πορείας της ΠΣ (Dimisianos et al., 2013) Θεραπεία της ΠΣ Η θεραπεία της ΠΣ διακρίνεται σε τρία στάδια: τη θεραπεία της οξείας φάσης (ώσης ή υποτροπής), τη θεραπεία των επιπλοκών της νόσου (συμπτωματική θεραπεία) και την προφυλακτική θεραπεία (αποτροπή μελλοντικών υποτροπών) Θεραπεία οξείας φάσης (υποτροπής) Όπως προαναφέρθηκε, υποτροπή ορίζεται ως η εμφάνιση νέας νευρολογικής δυσλειτουργίας που διαρκεί περισσότερες από 24 ώρες (συνήθως ημέρες ή εβδομάδες). Παρόλο που η φυσική εξέλιξη μιας υποτροπής είναι η ύφεση σε άλλοτε άλλο χρονικό διάστημα, η προσπάθεια βελτιστοποίησης της έκβασης οδήγησε στη δοκιμή φαρμακευτικών θεραπειών. Τα κορτικοστεροειδή κατέχουν κυρίαρχη θέση στην αντιμετώπιση των υποτροπών. Από όσα έχουν δοκιμαστεί (κορτικοτροπίνη (ACTH), μεθυλπρεδνιζολόνη, πρεδνιζολόνη, πρεδνιζόνη) στην κλινική πράξη προτιμάται η ενδοφλέβια χορήγηση μεθυλπρεδνιζολόνης mg 42

43 την ημέρα για 3-5 ημέρες με ή χωρίς συνέχιση της αγωγής με από του στόματος πρεδνιζολόνη σε σταδιακή μείωση (tapering), χωρίς ωστόσο να υπάρχουν πειστικά δεδομένα για την ανωτερότητά της έναντι της από του στόματος θεραπείας (Burton et al., 2012; Goodin et al., 2002; Kopke and Heesen, 2005; Sellebjerg et al., 1998). Στην Kλινική μας έχει επικρατήσει το σχήμα μεθυλπρεδνιζολόνης 1000 mg για 3 ημέρες χωρίς tapering. Πίνακας 1.7. Φαρμακολογικές παρεμβάσεις για τη συμπτωματική ανακούφιση των επιπλοκών της ΠΣ Σύμπτωμα Παρέμβαση Αναφορές Σπαστικότητα Μπακλοφαίνη (Miorel ) p.os. ή ενδορραχιαία Τιζανιδίνη (Sirdalud ) Βενζοδιαζεπίνες (π.χ. διαζεπάμη, κλοναζεπάμη) Γκαμπαπεντίνη (Neurontin ) Δαντρολένιο 4- αμινοπυριδίνη και 3,4- διαμινοπυριδίνη Αλλαντική τοξίνη τύπου Α (Botox) Κανναβινοειδή (Sativex ) (Shakespeare et al., 2003) (Nance et al., 1997) (Cutter et al., 2000) (Zajicek et al., 2005) Τρόμος και αταξία Πριμιδόνη (Mysoline ) Καρβαμαζεπίνη (Tegretol ) Ισονιαζίδη Γκαμπαπεντίνη (Neurontin ) Τοπιραμάτη (Topamac ) Κλοναζεπάμη (Rivotril ) Προπρανολόλη (Inderal ) Ονδανσετρόνη (Zofron ) (Sechi et al., 1989) (Hallett et al., 1985) (Rice et al., 1997) (Lange et al., 2009) (Hadjimichael et al., 2008) Κόπωση Μοδαφινίλη (Modiodal ) DMTs Διαταραχές βάδισης Φαμπριδίνη (Fampyra ) (Goodman et al., 2008; Goodman et al., 2007) Κυστική δυσλειτουργία Σπαστική Χαλαρή Σεξουαλική δυσλειτουργία Παροξυσμικά φαινόμενα Νευραλγία τριδύμου Τονικοί σπασμοί Φαινόμενο Lhermitte Εμμένον άλγος Αντιχολινεργικά (αντιμουσκαρινικά) φάρμακα, π.χ. Οξυβουτυνίνη (Ditropan ), Σολιφενασίνη (Vesicare ),Τολτεροδίνη (Detrusitol ) Ενδοκυστική έγχυση αλλαντικής τοξίνης Κανναβινοειδή Α- αδρενεργικοί αποκλειστές (Xatral, Omnic ) (Gajewski and Awad, 1986) (Duthie et al., 2007) (Freeman et al., 2006) (O'Riordan et al., 1995) Σιλδεναφίλη (Viagra ) (Fowler et al., 2005) Καρβαμαζεπίνη (Tegretol ), Οξκαρβαζεπίνη (Trileptal ), Λαμοτριγίνη (Lamictal ), Γκαμπαπεντίνη (Neurontin ), Τοπιραμάτη (Topamac ) Γκαμπαπεντίνη (Neurontin ), Αλλαντική τοξίνη Αντιεπιληπτικά, αποκλειστές διαύλων νατρίου Αντιεπιληπτικά (Γκαμπαπεντίνη (Neurontin ), Λαμοτριγίνη (Lamictal )) Κανναβινοειδή (van Kleef et al., 2009) (Cianchetti et al., 1999; Houtchens et al., 1997) (Iskedjian et al., 2007) 43

44 Το όφελος από τη χορήγηση κορτικοστεροειδών, ωστόσο, περιορίζεται στην επιτάχυνση της ύφεσης των συμπτωμάτων της υποτροπής, ενώ δε φαίνεται να έχει καμία επίδραση στη συχνότητα εμφάνισης νέων υποτροπών ή στη μακροχρόνια αναπηρία (Myhr and Mellgren, 2009) Συμπτωματική θεραπεία Η αντιμετώπιση των συμπτωμάτων που προκαλούνται από την ΠΣ είναι εξίσου σημαντική με την προφυλακτική θεραπεία, καθώς τα συμπτώματα αυτά επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα ζωής των ασθενών. Η αντιμετώπιση των εκάστοτε συμπτωμάτων πρέπει να είναι πάντα εξατομικευμένη και συνήθως εμπλέκει πολλές ιατρικές και παραϊατρικές ειδικότητες (νευρολόγος, ψυχολόγος, φυσικοθεραπευτής, εργοθεραπευτής, νευροχειρουργός, κ.α.). Κεντρικό ρόλο στην αντιμετώπιση των συμπτωμάτων της ΠΣ έχει η φαρμακευτική θεραπεία. Στον Πίνακα 1.7. παρουσιάζονται συνοπτικά οι διάφορες φαρμακολογικές παρεμβάσεις για κάθε σύμπτωμα, κυρίως αυτές για τις οποίες υπάρχουν αξιόπιστες μελέτες που αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητά τους. Για περισσότερα ο αναγνώστης παραπέμπεται στην εκτενή ανασκόπηση των Thomson et al., που δημοσιεύθηκε στο Lancet Neurology το 2010 (Thompson et al., 2010) Προφυλακτική θεραπεία- Τροποποιητικά της νόσου φάρμακα Οι θεραπευτικές προσπάθειες στην ΠΣ στράφηκαν από την αρχή έναντι του φλεγμονώδους στοιχείου της νόσου, το οποίο είναι συνυφασμένο με τα αρχικά στάδια της τυπικής μορφής με εξάρσεις και υφέσεις. Έτσι, οι θεραπείες που δοκιμάστηκαν είχαν ως στόχο την τροποποίηση της ανοσολογικής αντίδρασης και δι αυτής της πορείας της νόσου, κυρίως των υποτροπών και, εμμέσως, της εξέλιξης της αναπηρίας (Noseworthy, 2006). Υπό αυτό το πρίσμα οι θεραπείες αυτές ονομάστηκαν τροποποιητικές της νόσου (disease modifying treatments- DMTs) ή προφυλακτικές θεραπείες. Μέχρι τη δεκαετία του 1990 είχαν 44

45 δοκιμαστεί πολυάριθμες θεραπείες χωρίς ωστόσο κάποια από αυτές να πείσει για την αποτελεσματικότητα και/ ή την ασφάλειά της. Τέτοιες θεραπείες ήταν η ιντερφερόνη- α (Panitch, 1987), η ιντερφερόνη-γ (Panitch et al., 1987), ανοσοκατασταλτικά φάρμακα όπως η αζαθειοπρίνη (Group, 1988), η μεθοτρεξάτη (Neumann and Ziegler, 1972), η κυκλοσπορίνη (Rudge et al., 1989), η κυκλοφωσφαμίδη (Hauser et al., 1983), και πολλές άλλες (Noseworthy, 2006). Τη δεκαετία του 1990 εμφανίστηκαν οι πρώτες εγκεκριμένες θεραπείες, που έδειξαν αποτελεσματικότητα ως προς τη μείωση των παραμέτρων της MRI και της συχνότητας των υποτροπών στην RRMS με αποδεκτό προφίλ ανεπιθύμητων ενεργειών. Τα πρώτα αυτά φάρμακα ήταν οι ιντερφερόνες- β (IFNβ). Η IFNβ-1β (Betaferon ), χορηγούμενη υποδορίως κάθε 2 η ημέρα ήταν η πρώτη από τις ιντερφερόνες που έδειξε αποτελεσματικότητα στη μείωση της συχνότητας των υποτροπών σε ασθενείς με κλινικά βέβαιη ΠΣ (IFNb-MSSG, 1993; IFNb-MSSG, 1995). Ακολούθησε η IFNβ-1α για εβδομαδιαία ενδομυϊκή χορήγηση (Avonex ) (Jacobs et al., 1996) και η ιντερφερόνη β-1α για υποδόρια χορήγηση 3 φορές την εβδομάδα (Rebif ) (PRISMS, 1998). Οι IFNβ ανήκουν μαζί με τις IFNα και IFNγ στην ομάδα των ιντερφερονών, με τις δύο πρώτες να χαρακτηρίζονται ως τύπου Ι IFN και την IFNγ ως τύπου ΙΙ. Η χρήση των ιντερφερονών στην ΠΣ, ενδογενών ουσιών με αντιϊκή δράση, είχε ως βάση την πεποίθηση ότι η νόσος οφειλόταν σε μια χρόνια ιογενή λοίμωξη. Τα πρώτα εμπόδια που αναδύθηκαν στη δεκαετία του 1980 σχετικά με τη χρήση φυσικών ιντερφερονών ως προς την διαθεσιμότητα και την οδό χορήγησης, συστηματική ή ενδορραχιαία (Jacobs et al., 1981), επιλύθηκαν την επόμενη δεκαετία με την παραγωγή ανασυνδυσμένων ιντερφερονών και την υποδόρια χορήγηση. Οι ιντερφερόνες- α και β (τύπου Ι IFN) είναι κυτταροκίνες της φυσικής ανοσίας που ανταγωνίζονται για τους ίδιους υποδοχείς, οι οποίοι βρίσκονται στα περισσότερα κύτταρα. Η κύρια πηγή της IFNβ είναι οι ινοβλάστες. Οι IFN τύπου Ι συνδέονται με τους υποδοχείς τους (IFNAR1 και IFNRA2), που είναι συζευγμένοι με Janus κινάσες της τυροσίνης (Tyk2 και 45

46 Jak1, αντίστοιχα), οι οποίες με τη σύνδεση της IFN στον υποδοχέα ενεργοποιούνται και οδηγούν σε φωσφορυλίωση των STAT1 και STAT2 πρωτεϊνών, που με τη σειρά τους σχηματίζουν ετεροδιμερή και ενεργοποιούν τον παράγοντα IRF9 (IFN Regulatory Factor). Το σύμπλοκο STAT1-2/IRF9 μετακινείται στον πυρήνα όπου συνδέεται με ακολουθίες νουκλεϊκών οξέων που καλούνται IFN- stimulated response elements (ISREs), που υπάρχουν σε πολλά γονίδια, επάγοντας τη μεταγραφή τους (Abbas, 2007). Μολονότι η κύρια δράση των IFN τύπου Ι είναι η άμυνα έναντι των ιών, η χρήση της IFNβ στην ΠΣ δεν αξιοποιεί αυτή την ιδιότητα, αλλά μάλλον ποικίλες άλλες δράσεις της στο ανοσοποιητικό σύστημα, που τη χαρακτηρίζουν ως αντιφλεγμονώδες και ανοσοτροποποιητικό μόριο (Noseworthy, 2006). Αναφέρονται συνοπτικά μερικοί μόνο από τους προτεινόμενους μηχανισμούς δράσης της IFNβ, που την καθιστούν αποτελεσματική στην ΠΣ: Αναστέλλει την έκφραση των MHC II και άλλων μορίων που επάγονται από την IFNγ και είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των Τ- κυττάρων (Arnason et al., 1996; Huang et al., 2001). Τροποποιεί την έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων στα δενδριτικά και άλλα είδη κυττάρων (Huang et al., 2001; Liu et al., 2001). Αναστέλλει την ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό των Th17 κυττάρων (Durelli et al., 2009; Martin-Saavedra et al., 2008; Ramgolam et al., 2009; Zhang et al., 2009). Αυξάνει την παραγωγή και έκφραση των IL-10 και IL-4 σε πρωτεϊνικό και mrna επίπεδο (Cucci et al., 2010; Krakauer et al., 2008). Μειώνει την παραγωγή των TNFα, IFNγ, IL-12 (Cucci et al., 2010; Meyers et al., 2006). Μειώνει την ικανότητα μετανάστευσης των T- κυττάρων (Prat et al., 1999). Αυξάνει τη συχνότητα και τη λειτουργικότητα των ρυθμιστικών Τ- κυττάρων (ntregs) (Chen et al., 2012; Martin-Saavedra et al., 2008; Namdar et al., 2010). 46

47 Η οξική γλατιραμέρη (Copaxone ) είναι ένα άλλο φάρμακο, που προήλθε από την προσπάθεια παρασκευής πεπτιδικών αναλόγων με στόχο την εμπόδιση της ενεργοποίησης των αυτοαντιδρώντων Τ- κυττάρων στην ανοσιακή σύναψη με αντιγόνα της μυελίνης (Noseworthy, 2006). Αρχικά ονομαζόταν Copolymer-1 και αποτελούταν από ένα μίγμα 4 αμινοξέων (L- αλανίνη, L- γλουταμικό οξύ, L- λυσίνη και L- τυροσίνη), το οποίο σχεδιάστηκε για να προσομοιάζει με την MBP, με στόχο την εκτροπή της ανοσολογικής αντίδρασης των MBP- ειδικών Τ- κυττάρων (Bennett and Stuve, 2009). Ωστόσο, αργότερα σε in vivo μελέτες φάνηκε ότι οι επαναλαμβανόμενες ενέσεις οξικής γλατιραμέρης προκαλούσαν μια εκτροπή προς Th2 φαινότυπο και αυξημένη έκκριση κυτταροκινών IL-5 και IL-13 (Duda et al., 2000). Μετά από μια σειρά πειστικών μελετών σε μικρές σειρές ασθενών δημοσιεύθηκαν το 1995 τα αποτελέσματα της κεντρικής μελέτης στη Βόρειο Αμερική (Johnson et al., 1995) με βάση τα οποία ο FDA ενέκρινε τη χρήση του στην RRMS το 1996, ενώ ακολούθησε η ΕΕ το Πίνακας 1.8. Εγκεκριμένες προφυλακτικές θεραπείες για την ΠΣ με εξάρσεις και υφέσεις και θεραπείες που αναμένεται να εγκριθούν με βάση τις κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ. Ουσία Σκεύασμα FDA EMA Αναφορές IFNβ- 1β sc Betaferon, Extavia (IFNb-MSSG, 1993; IFNb- MSSG, 1995) IFNβ- 1α im Avonex (Jacobs et al., 1996) IFNβ- 1α sc Rebif (PRISMS, 1998) Οξική γλατιραμέρη Copaxone (Johnson et al., 1995) Ναταλιζουμάμπη Tysabri (Polman et al., 2006; Rudick et al., 2006) Μιτοξανδρόνη Novantrone (Hartung et al., 2002) Φινγκολιμόδη Gilenya (Cohen et al., 2010; Kappos et al., 2010) Τεριφλουνομίδη Aubagio (O'Connor et al., 2011) Διμεθυλφουμαρικό (BG-12) Tecfidera (Fox et al., 2012; Gold et al., 2012) Λακουϊνιμόδη Nerventra - - (Comi et al., 2012) Αλεμτουζουμάμπη Lemtrada (Cohen et al., 2012; Coles et al., 2012) EMA= European Medicines Agency, FDA= Food and Drug Administration Η μιτοξανδρόνη είναι το μόνο από τα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα που έχει εγκριθεί για προφυλακτική χρήση στην ΠΣ, κυρίως σε ασθενείς με επιθετική νόσο (υψηλή συχνότητα υποτροπών, αύξηση στην EDSS 2 βαθμούς εντός 1 έτους), παρά τη θεραπεία με IFNβ ή 47

48 οξική γλατιραμέρη, καθώς και σε ασθενείς με δευτεροπαθώς προϊούσα ή προϊούσα με εξάρσεις. Ο FDA παρείχε έγκριση για τη χρήση της το 2000, μετά την ανακοίνωση των προκαταρκτικών αποτελεσμάτων της μελέτης MIMS (Hartung et al., 2002), ενώ στην Ευρώπη είναι εγκεκριμένη σε διάφορες χώρες. Η ναταλιζουμάμπη (Tysabri ) είναι ένα ανθρωποποιημένο, ανασυνδυασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της α4 υπομονάδας της α4β1 ιντεγκρίνης, που υπάρχει σε όλα τα λευκοκύτταρα εκτός των ουδετεροφίλων. Ο ανταγωνισμός της ιντεγκρίνης από τη ναταλιζουμάμπη εμποδίζει τα λευκοκύτταρα από το να προσκοληθούν στα μόρια VCAM1 στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και εν συνεχεία να εισέλθουν σε φλεγμαίνοντες ιστούς, εν προκειμένω του ΚΝΣ (Steinman, 2005; Stuve and Bennett, 2007). Η ναταλιζουμάμπη εγκρίθηκε αρχικά από τον FDA το 2004, αλλά αποσύρθηκε το 2005 λόγω εμφάνισης δύο περιστατικών προϊούσας πολυεστιακής λευκοεγκεφαλοπάθειας (PML) σε ασθενείς που την ελάμβαναν σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα για την ΠΣ. Τελικά, επανακυκλοφόρησε για χρήση στην RRMS ως μονοθεραπεία το 2006, υπό πρόγραμμα αυστηρής παρακολούθησης (Polman et al., 2006; Rudick et al., 2006). Η φινγκολιμόδη (Gilenya ) είναι το πρώτο φάρμακο για από του στόματος λήψη που εγκρίθηκε για την RRMS, μετά τη διενέργεια 2 κλινικών μελετών φάσης ΙΙΙ (TRANSFORMS και FREEDOMS) (Cohen et al., 2010; Kappos et al., 2010). Είναι ανάλογο της φυσικής σφιγγοσίνης, που δρα μέσω κατάληψης των υποδοχέων S1P, με αποτέλεσμα εσωτερίκευσή τους και αναστολή της ενεργοποίησής τους. Η δράση αυτή στα λεμφοκύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την παγίδευσή τους στα λεμφικά όργανα και την αδυναμία τους να μετακινηθούν προς τους ιστούς που εμφανίζουν φλεγμονή. Στον Πίνακα 1.8, εκτός από τις παραπάνω θεραπείες περιλαμβάνονται και άλλα φάρμακα που έχουν ήδη εγκριθεί από τον FDA, όπως το διμεθυλφουμαρικό (ή BG-12) (Fox et al., 2012; Gold et al., 2012) και η τεριφλουνομίδη (O'Connor et al., 2011), αμφότερες από του στόματος θεραπείες, καθώς και άλλα που έχουν ολοκληρώσει τις κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ 48

49 και είναι σε διαδικασία αδειοδότησης από τις αρμόδιες αρχές, όπως η λακουϊνιμόδη (Comi et al., 2012) και το μονοκλωνικό αντίσωμα αλεμτουζουμάμπη (Cohen et al., 2012; Coles et al., 2012). 2. ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΙ Η ΠΣ 2.1. Η παθογένεση της ΠΣ- Τρέχουσες αντιλήψεις Παρόλη την εκτενή έρευνα σχετικά με την παθογένεση της ΠΣ, ακόμη δεν είναι σαφές αν αποτελεί ένα αυτοάνοσο νόσημα και ποιος είναι ο μηχανισμός δημιουργίας των απομυελινωτικών βλαβών. Σε αντίθεση με άλλα αυτοάνοσα νοσήματα, όπως η μυασθένεια, η θυρεοειδίτιδα Hashimoto, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, στα οποία το αυτοαντιγόνο είναι γνωστό και μπορεί να ανιχνευθούν αυτοαντισώματα στο αίμα, στην ΠΣ το αυτοαντιγόνο παραμένει άγνωστο. Η συμμετοχή του ανοσοποιητικού στην πορεία της νόσου είναι αδιαμφισβήτητη, ωστόσο δεν είναι σαφές αν η έναρξη της νόσου οφείλεται σε ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού ή αν αυτή αποτελεί ένα επιφαινόμενο (Holmoy and Hestvik, 2008). Ακόμη και τώρα επικρατεί η παραδοσιακή αντίληψη σχετικά με την ανοσοπαθογένεση της ΠΣ, ότι δηλαδή αποτελεί μια αυτοάνοση, οργανοειδική νόσο του ΚΝΣ. Ο αυτοάνοσος χαρακτήρας της ΠΣ, ωστόσο, δεν είναι επίσημα τεκμηριωμένος, αλλά υποδηλώνεται από διάφορες παρατηρήσεις, που σε συνδυασμό υποστηρίζουν ότι τα ανοσολογικά φαινόμενα στην ΠΣ είναι αυτοάνοσης αρχής (Wekerle, 2006). Τέτοιες έμμεσες αποδείξεις είναι: α) η μορφολογία των ενεργών βλαβών, στις οποίες οι περιαγγειακές διηθήσεις από λεμφοκύτταρα είναι ίδιες με αυτές που παρατηρούνται σε βλάβες άλλων, αποδεδειγμένα αυτοάνοσων παθήσεων, όπως η ΠΑΕ (βλ. παρακάτω, 2.2), β) γενετικές, δεδομένου ότι τα γονίδια που επιφέρουν προδιάθεση για τη νόσο ανήκουν σε πρωτεΐνες του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως τα μόρια του MHC II, και γ) η μερική επιτυχία των φαρμάκων που καταστέλλουν ή 49

50 τροποποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα, όπως οι IFNβ και η οξική γλατιραμέρη (Wekerle, 2006). Έτσι, η ΠΣ θεωρείται μια αυτοάνοση ή, εν πάσει περιπτώσει, μια ανοσομεσολαβούμενη νόσος, στην οποία τα αυτοαντιδρώντα Τ- κύτταρα ενεργοποιούνται στην περιφέρεια και στη συνέχεια διασπούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ) για να εισέλθουν στο ΚΝΣ. Αυτό συμβαίνει σε γενετικά προδιατεθιμένα άτομα υπό την επίδραση ενός περιβαλλοντικού παράγοντα που λειτουργεί ως εκλυτικό αίτιο. Στο ΚΝΣ λαμβάνει χώρα τοπική αντιγονοπαρουσίαση από τα μικρογλοιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα να ενεργοποιείται ένας καταρράκτης αυτοανοσίας, που περιλαμβάνει την προσέλκυση μακροφάγων, την ενεργοποίηση των κυτταροτοξικών Τ- κυττάρων, τη διαφοροποίηση Β- κυττάρων σε πλασματοκύτταρα που παράγουν αυτοαντισώματα. Όλη αυτή η διαδικασία στρέφεται κατά του ελύτρου της μυελίνης, χωρίς ωστόσο να έχει προσδιοριστεί μέχρι σήμερα το ειδικό αντιγόνο της μυελίνης που είναι υπεύθυνο για την αυτοάνοση αντίδραση. Η επαναλαμβανόμενη προσβολή της μυελίνης καθιστά το νευράξονα ευάλωτο στις βλαπτικές επιδράσεις νευροτοξικών παραγόντων, με τελικό αποτέλεσμα εκφύλισή του και συσσώρευση νευρολογικού ελλείμματος (Εικόνα 2.1). Η διαταραχή της ισορροπίας που επιτυγχάνεται με την ανοσολογική επιτήρηση και η εμφάνιση ενός καταρράκτη φλεγμονωδών αντιδράσεων οφείλεται στην αποτυχία των ρυθμιστικών μηχανισμών. Έχει φανεί σε μελέτες ότι τα ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα (regulatory T- cells, Tregs) των ασθενών με ΠΣ αποτυγχάνουν στην καταστολή των τελεστικών Τ- κυττάρων (effector T- cells) (Viglietta et al., 2004). Τα αυτοαντιδρώντα αυτά Τ- κύτταρα δεν υφίστανται απόπτωση μετά από διέγερση επειδή υπερεκφράζουν β- arrestin 1, που αποτελεί σημαντικό παράγοντα επιβίωσης των παρθένων και ενεργοποιημένων CD4 + Τ- κυττάρων (Shi et al., 2007). 50

51 Εικόνα 2.1. Αδρή σχηματοποίηση της ακολουθίας των πιθανών βημάτων που οδηγούν τελικά στην απομυελίνωση και στην αξονική βλάβη στην ΠΣ. Η παλαιότερα κρατούσα αντίληψη ότι το ΚΝΣ αποτελεί ένα ανοσολογικά προνομιούχο διαμέρισμα του οργανισμού, όπου δεν υπάρχει ανοσολογική επιτήρηση και οι ανοσολογικές αντιδράσεις είναι περιορισμένες σε σχέση με άλλα όργανα, έχει πλέον ανατραπεί από μελέτες σε πειραματόζωα και ανθρώπους (Fainardi, 2009). Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα είναι σε θέση να διαπεράσουν τον ΑΕΦ ακόμη και σε μη φλεγμαίνοντα εγκέφαλο (Hickey et al., 1991), εγκεφαλικά αντιγόνα ανιχνεύονται στους αυχενικούς λεμφαδένες μέσω των περινευρικών ελύτρων των κρανιακών νεύρων (Kida et al., 1993), κύτταρα του ΚΝΣ που δρουν ως APC ανιχνεύονται στους περιαγγειακούς χώρους, στις λεπτομήνιγγες και στο χοριοειδές πλέγμα (McMenamin, 1999) και ότι όλοι οι κυτταρικοί τύποι εντός του ΚΝΣ μπορούν να εκφράσουν τα μόρια MHC I και II μετά από ενεργοποίηση από τη φλεγμονή (Hemmer et al., 2004). Η είσοδος των ενεγοποιημένων λεμφοκυττάρων εντός του ΚΝΣ μπορεί να επιτευχθεί από διάφορες οδούς, όπως από το αίμα προς το ΕΝΥ μέσω των χοριοειδών πλεγμάτων, προς τον υπαραχνοειδή χώρο και προς το παρέγχυμα. Από την άλλη, αντιγόνα από το ΚΝΣ, μέσω του ΕΝΥ, μεταφέρονται στους επιχώριους αυχενικούς λεμφαδένες, όπου με τη βοήθεια APC ενεργοποιούν παρθένα λεμφοκύτταρα (Fainardi, 2009). 51

52 Από τη στιγμή που η ΠΣ θεωρείται αυτοάνοση νόσος, το ερώτημα είναι πιο αντιγόνο είναι υπεύθυνο για την αυτοάνοση αντίδραση; Η απάντηση, εφόσον η ΠΣ χαρακτηρίζεται από απομυελίνωση, αναζητήθηκε σε κάποια από τα αντιγόνα της μυελίνης. Η βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (Myelin Basic Protein- MBP) έχει αποτελέσει από παλιά έναν από τους κύριους υποψήφιους στόχους της ανοσολογικής αντίδρασης στην ΠΣ. Αυτοαντιδρώντα Τ- κύτταρα έναντι της MBP έχουν εντοπιστεί στο αίμα τόσο υγιών όσο και ασθενών με ΠΣ, πιθανώς σε υψηλότερα επίπεδα στους ασθενείς με ενεργό νόσο. Η MBP, η οποία αντιπροσωπεύει το 30% των πρωτεϊνών της μυελίνης, αποτελεί αντιγόνο για την ανάπτυξη του πειραματικού μοντέλου της ΠΣ στα ποντίκια, της ΠΑΕ (βλ. παρακάτω). Διάφορες άλλες πρωτεΐνες της μυελίνης αποτελούν πιθανούς στόχους αυτοάνοσης επίθεσης. Τέτοιες είναι η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη (Proteolipid Protein- PLP), που αποτελεί το 50% της πρωτεΐνης της μυελίνης, και αποτελεί εγγενές δομικό συστατικό των πτυχών της μυελίνης, η σχετιζόμενη με τη μυελίνη γλυκοπρωτεΐνη (Myelin- Associated Glycoprotein- MAG), η γλυκοπρωτεΐνη της ολιγοδενδροκυτταρικής μυελίνης (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein- MOG) και η κυκλική νουκλεοτιδική φωσφοδιεστεράση (Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase- CNP), που αποτελούν ένα μικρό ποσοστό των πρωτεϊνών της μυελίνης. Ειδικά η MOG και η CNP έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την ΠΣ γιατί απαντώνται μόνο στη μυελίνη του ΚΝΣ (Karabetsos, 2000; Lublin, 2008) Πειραματική Αλλεργική ή Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα- Το ζωικό μοντέλο της ΠΣ Η προσπάθεια διερεύνησης της παθογένεσης της ΠΣ οδήγησε τους επιστήμονες, ήδη από το πρώτο μισό του 20 ου αιώνα, στην πρόκληση μιας νόσου που ομοιάζει προς την ΠΣ σε διάφορα πειραματικά ζωικά μοντέλα (Mix et al., 2010). Ο Rivers και συν. (1933) προκάλεσαν σε πιθήκους παράλυση που σχετιζόταν με περιαγγειακές διηθήσεις και απομυελίνωση μετά από έγχυση εκχυλίσματος εγκεφάλων κουνελιών, νόσο που ονόμασαν οξεία διάσπαρτη 52

53 εγκεφαλομυελίτιδα. Ο όρος αυτός αργότερα αντικαταστάθηκε από τον όρο πειραματική αλλεργική ή αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα- ΠΑΕ (experimental allergic or autoimmune encephalomyelitis- EAE). Με την πάροδο του χρόνου ο αντιγονικός ερεθισμός για την πρόκληση της ΠΑΕ έγινε πιο ειδικός και από τον εγκεφαλικό ιστό και τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα η πολυπλοκότητά του μειώθηκε σε διάφορες πρωτεΐνες της κεντρικής μυελίνης, όπως MBP, MOG, PLP, MAG (Einstein et al., 1962; Lebar et al., 1986; Maatta et al., 1998; Tuohy et al., 1988), και ακόμη περισσότερο σε μικρά εγκεφαλιτιδογόνα πεπτίδια αυτών των πρωτεϊνών, όπως MBP 1-37, MBP 83-89, MOG και PLP (Eylar et al., 1970; Lennon et al., 1970). Με τον τρόπο αυτό προέκυπταν διάφορα μοντέλα ΠΑΕ που μιμούνταν τα διάφορα χαρακτηριστικά της ΠΣ (Wekerle et al., 1994). Τα αντιγόνα, προκειμένου να ενισχυθεί η ανοσολογική αντίδραση, αναμειγνύονταν με πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund (CFA, 1942) και στη συνέχεια με προσθήκη και τοξίνης του κοκκύτη (Munoz et al., 1984). Εκτός από τον παραπάνω, ενεργητικό τρόπο πρόκλησης ΠΑΕ (Ε-ΠΑΕ), υπάρχει και η μέθοδος της θετής μεταφοράς (adoptive transfer, ΘΜ-ΠΑΕ), κατά την οποία διεγερμένα κύτταρα του ανοσοποιητικού, κυρίως λεμφοκύτταρα, έναντι αντιγόνων της μυελίνης, μεταφέρονται στο πειραματόζωο προκαλώντας τη νόσο (Εικόνα 2.2). Επίσης, στα πειραματόζωα, και ιδίως στα ποντίκια, έχουν δημιουργηθεί διαγονιδιακά μοντέλα με απαλειφή ή προσθήκη γονιδίων που σχετίζονται με την παθογένεση της νόσου καθιστώντας τα ανθεκτικά ή ευάλωτα στην πρόκληση ΠΑΕ. Ο κλινικός φαινότυπος της προκαλούμενης ΠΑΕ εξαρτάται από το αντιγόνο που χρησιμοποιήθηκε και από το γενετικό υπόστρωμα του είδους του πειραματοζώου και του στελέχους (π.χ. στα ποντίκια SJL, C57BL, κ.α.) (Mix et al., 2010). Έτσι, οι ερευνητές μπορούν να προκαλέσουν ΠΑΕ που μιμείται την ΠΣ με εξάρσεις και υφέσεις (SJL ποντίκια με PLP ή μοντέλο cuprizone), την προϊούσα μορφή της (C57BL ποντίκια με MOG ), τις φλοιϊκές βλάβες, παραλλαγές όπως η νόσος Devic, κ.α. (Mix et al., 2010). 53

54 Εικόνα 2.2. Τρόποι πρόκλησης ΠΑΕ σε ποντίκια με ενεργητική και εκ μεταφοράς μέθοδο. Στην πρώτη γίνεται υποδόρια έγχυση (sc) του εκάστοτε αυτοαντιγόνου (π.χ. MBP 1-37, MBP 83-89, PLP ), το οποίο είναι διαλυμένο σε γαλάκτωμα με CFA (complete Freund s adjuvant), ορυκτέλαιο και στέλεχος M. Tuberculosis ως ανοσοενιχυτικά, ενώ στη συνέχεια γίνεται και ενδοπεριτοναϊκή έγχυση (ip) τοξίνης του κοκκύτη. Στη μέθοδο της θετής μεταφοράς γίνεται ενδοφλέβια (iv) έγχυση αυτοαντιδρώντων Th κυττάρων (Th1, Th17) έναντι επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης. Οι θεωρίες για την ανοσοπαθογένεση της ΠΣ έχουν τις βάσεις τους στις παρατηρήσεις που προέρχονται από την ΠΑΕ. Μάλιστα, η ίδια η πρόκληση της ΠΑΕ βασίζεται στην ιδέα ότι αυτοαντιδρώντα έναντι αντιγόνων της μυελίνης Τ- κύτταρα είναι απαραίτητα για την πρόκληση της νόσου. Επομένως, το μοντέλο της ΠΑΕ είναι ένα προκαθορισμένο μοντέλο αυτοανοσίας, χωρίς ωστόσο η ίδια η ΠΣ να είναι μια σαφώς αυτοάνοση νόσος. Οι διαφορές της ΠΑΕ και της ΠΣ είναι πολλές και αυτό έχει αποδειχθεί από την αποτυχία της εφαρμογής στον άνθρωπο θεραπειών που είχαν αποδειχθεί εξαιρετικά επιτυχείς στα πειραματόζωα. Οι διαφορές αυτές έχουν κάνει πολλούς ερευνητές να αναφέρονται στην ΠΑΕ ως ένα «παραπλανητικό μοντέλο της ΠΣ» (Sriram and Steiner, 2005). 54

55 2.3. Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού που συμμετέχουν στην παθογένεση της ΠΣ και οι κυτταροκίνες τους Κεντρικό ρόλο στην έναρξη και διατήρηση του παθογενετικού μηχανισμού της ΠΣ θεωρείται ότι έχουν τα Τ- κύτταρα, και ιδίως τα βοηθητικά (helper) Th κύτταρα (Εικόνα 2.3). Τα Τ- λεμφοκύτταρα ωριμάζουν στο θύμο και εξέρχονται στη συνέχεια στην περιφέρεια ως απλά θετικά CD4+ ή CD8+ παρθένα λεμφοκύτταρα (βλ. παρακάτω- Ανοσολογική ανοχή). Ο ρόλος των αυτοαντιδρώντων Τ- κυττάρων είχε ιστορικά αποδοθεί στα Th1 κύτταρα (που εκκρίνουν IFNγ), ωστόσο η ανακάλυψη ενός άλλου υποπληθυσμού των CD4 + Τ- κυττάρων που εκκρίνουν IL-17 και επάγονται από την IL-23, και τα οποία ονομάστηκαν Th17, έστρεψε τα τελευταία χρόνια την προσοχή των ερευνητών σε αυτά (Langrish et al., 2005). Η IL-17 και η IL-22 διαταράσσουν τον ΑΕΦ επιτρέποντας την είσοδο των Th17 κυττάρων στο ΚΝΣ και την πρόκληση φλεγμονής. Εικόνα 2.3. Τα βοηθητικά (CD4+) Τ- κύτταρα (Th) που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της ΠΣ 55

56 Η μετατροπή του παρθένου Τh κυττάρου προς ένα διακριτό υπότυπο (π.χ. Th1, Th2) είναι ένα φαινόμενο που λαμβάνει χώρα στην περιφέρεια και εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, το ίδιο το αντιγόνο και το κυτταροκινικό περιβάλλον (Wekerle, 2006). Στην ΠΣ τα Th1 και Th17 κύτταρα θεωρούνται υπεύθυνα για την έναρξη και διατήρηση της ανοσολογικής αντίδρασης, καθώς στις ενεργές βλάβες έχουν ανιχνευθεί Τ- κύτταρα που εκφράζουν IL-17 ή IL-17 και IFNγ (Kebir et al., 2009; Tzartos et al., 2008). Επίσης, στην περιφέρεια, Τ- κύτταρα απομονωμένα από ασθενείς με ενεργό νόσο όταν καλλιεργηθούν χωρίς εξωτερική διέγερση εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες IFNγ και TNFα (Chatzantoni et al., 2004), αλλά μικρές ποσότητες IL-17 (Edwards et al., 2010). Σε συνθήκες μη ειδικής (anti- CD3 αντισώματα, μιτογόνα) ή ειδικής διέγερσης (συγγενή αντιγόνα) τα Τ- κύτταρα του περιφερικού αίματος εμφανίζουν ισχυρή πόλωση προς Th1 ή Th17 φαινότυπο ή συνεκφράζουν IFNγ και IL-17 (Deraos et al., 2008; Edwards et al., 2010; Kebir et al., 2009). Οι κυτταροκίνες είναι πολυπεπτιδικά μόρια που εκκρίνονται ως απάντηση σε αντιγονική διέγερση και μεσολαβούν και ρυθμίζουν τις ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Η έκκριση των κυτταροκινών είναι μια σύντομη, αυτοπεριοριζόμενη διαδικασία, καθώς η σύνθεσή τους γίνεται κάθε φορά με νέα γονιδιακή μεταγραφή μετά από ενεργοποίηση του κυττάρου, ενώ σε πολλές περιπτώσεις υπάρχει και μετα-μεταγραφική τροποποίηση. Οι δράσεις των κυτταροκινών εμφανίζουν πλειοτροπισμό (δράση σε πολλαπλά κύτταραστόχους) και πλεονασμό (διαφορετικές κυτταροκίνες εμφανίζουν ίδια δράση) (Abbas, 2007). Οι κυτταροκίνες μπορεί να επηρεάσουν τη σύνθεση και τις δράσεις άλλων κυτταροκινών και να έχουν συνεργική ή ανταγωνιστική δράση. Μερικές φορές η ίδια κυτταροκίνη μπορεί να έχει διπλή και αντίθετη δράση, όπως π.χ. η IL-2, μια πλειοτρόπος κυτταροκίνη, που στον άνθρωπο εκκρίνεται από τα άωρα Th κύτταρα όταν ενεργοποιούνται, προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη δράση των Th, CTLs, Β- κυττάρων και NK- κυττάρων, ενώ από την άλλη εμποδίζει τη διαφοροποίηση των Th17 κυττάρων και αποτελεί απαραίτητο αυξητικό 56

57 παράγοντα για τα ρυμιστικά Τ- κύτταρα (Han et al., 2012; Liao et al., 2011). Οι δράσεις τους μπορεί να είναι τοπικές (δρώντας στο ίδιο το κύτταρο που τις εκκρίνει- αυτοκρινής δράση, ή σε γειτονικά κύτταρα- παρακρινής δράση) ή συστηματικές (δράση σε απομακρυσμένα σημεία του οργανισμού- ενδοκρινής δράση). Οι κυτταροκίνες επάγουν τις δράσεις τους στα κύτταρα συνδεόμενες σε αυτά με ειδικούς υποδοχείς υψηλής συγγένειας. Η έκφραση των υποδοχέων των κυτταροκινών επηρεάζεται από εξωτερικά σήματα (π.χ. μικροβιακά αντιγόνα) συμπεριλαμβανομένων των ίδιων των κυτταροκινών (θετική ή αρνητική ανατροφοδότηση). Οι κυτταρικές απαντήσεις στις κυτταροκίνες περιλαμβάνουν συνήθως μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση των κυττάρων- στόχων και μερικές φορές τον πολλαπλασιασμό τους. Σε κάθε περίπτωση, οι απαντήσεις αυτές είναι αυστηρά ρυθμιζόμενες με ύπαρξη μηχανισμών που τις καταστέλλουν (Abbas, 2007). Οι κυτταροκίνες μπορούν να διακριθούν σε αυτές της φυσικής ανοσίας, σε αυτές τις επίκτητης ανοσίας και σε αυτές που διεγείρουν την αιμοποίηση. Η ιντερφερόνη-γ (IFN-γ), μια φλεγμονώδης κυτταροκίνη, αποτελεί τη χαρακτηριστική κυτταροκίνη των Th1 κυττάρων, αν και μπορεί να παραχθεί και από τα ΝΚ και CD8+ T- κύτταρα. Ενεργοποιεί τα μακροφάγα και προάγει τη διαφοροποίηση των άωρων CD4+ κυττάρων προς τον Th1 υπότυπο (μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα T-bet), ενώ εμποδίζει τη στροφή προς τον Th2 υπότυπο (μέσω καταστολής του GATA-3). Τα διεγερμένα από αντιγόνο Th1 κύτταρα μπορούν επίσης να παράγουν τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων-α (Tumor Necrosis Factor- TNF-α), μια φλεγμονώδη κυτταροκίνη που επίσης παράγεται από τα ενεργοποιημένα μονοπυρηνικά φαγοκύτταρα, τα ΝΚ κύτταρα και τα μαστοκύτταρα. Οι κύριες δράσεις του είναι η προσέλκυση ουδετεροφίλων και μακροφάγων στα σημεία της φλεγμονής και η ενεργοποίησή τους προκειμένου να εξαλείψουν τα μικρόβια. Αυτές επιτυγχάνονται μέσω επαγωγής των ενδοθηλιακών κυττάρων για έκφραση μορίων προσκόλλησης (σελεκτίνες και μόρια σύνδεσης των ιντεγκρινών των λευκοκυττάρων), της παραγωγής χημειοκινών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μακροφάγα για τη χημειοταξία 57

58 των λευκοκυττάρων, της παραγωγής IL-1 από τα μακροφάγα και της αύξησης της μικροβιοκτόνου δράσης των ουδετερόφιλων και των μακροφάγων. Ο TNF είναι επίσης υπεύθυνος για τις τοπικές φλεγμονώδεις αντιδράσεις που είναι βλαπτικές για τον ξενιστή (π.χ. στα αυτοάνοσα νοσήματα) (Abbas, 2007). Η ιντερλευκίνη-2 (IL-2) παράγεται κυρίως από τα CD4+ κύτταρα (Th0, Th1) και δρα στον υποδοχέα IL-2R, που είναι ένα τριμερές που αποτελείται από την of IL-2Rα (CD25), την IL- 2Rβ και τη γ c. Δρα στα ενεργοποιημένα CD4+ κύτταρα (αυτοκρινής δράση), τα οποία με την ενεργοποίησή τους εκφράζουν την υπομονάδα CD25, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους, ενώ παράλληλα δρα και στα ρυθμιστικά T-κύτταρα (Tregs), τα οποία εκφράζουν ιδιοσυστασιακά τη CD25, προάγοντας την επιβίωσή τους και τη λειτουργία τους ως κατασταλτικά, αντιφλεγμονώδη κύτταρα. Η IL-6 είναι μια φλεγμονώδης κυτταροκίνη τόσο της φυσικής όσο και της επίκτητης ανοσίας με ποικίλες δράσεις. Διεγείρει τη σύνθεση πρωτεϊνών οξείας φάσης, την παραγωγή ουδετεροφίλων, τον πολλαπλασιασμό των Β-κυττάρων και την παραγωγή φλεγμονωδών κυτταροκινών (π.χ. IL-17), ενώ αναστέλλει την παραγωγή ρυθμιστικών Τ- κυττάρων. Η IL-17 είναι η χαρακτηριστική κυτταροκίνη του νέου υπότυπου των CD4+ κυττάρων, Th17. Η IL-17 περιλαμβάνει μια ομάδα 6 δομικά συγγενών κυτταροκινών (IL-17A- F), από τις οποίες η IL-17A και η IL-17F είναι οι πιο καλά μελετημένες. Η IL-4 είναι η χαρακτηριστική κυτταροκίνη των Th2 κυττάρων. Προάγει την ανάπτυξή τους από τα άωρα CD4+ T-κύτταρα και λειτουργεί ως αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας για τα διαφοροποιημένα Th2 κύτταρα, ενώ εμποδίζει την ανάπτυξη των Th1 και Th17 κυττάρων. Η IL-10 είναι μια αντιφλεγμονώδης κυτταροκίνη που παράγεται από τα ρυθμιστικά Τ- κύτταρα (Tr1) και τα μακροφάγα. Αναστέλλει τη λειτουργία των ενεργοποιημένων μακροφάγων μέσω καταστολής της παραγωγής της IL-12, συνδιεγερτικών και MHC-II μορίων. O μετατρεπτικός αυξητικός παράγων- β1 (TGF-β1) είναι επίσης μια αντιφλεγμονώδης κυτταροκίνη, που παράγεται από μια υποομάδα των ρυθμιστικών Τ- 58

59 κυττάρων (Th3), αλλά παράγεται επίσης και από διεγερμένα από αντιγόνο T- κύτταρα, μακροφάγα και πολλά άλλα είδη κυττάρων. Αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τις δράσεις των Τ- κυττάρων και των μακροφάγων. Ωστόσο, σε παρουσία κυτταροκινών που παράγονται κατά τη διάρκεια αντιδράσεων της φυσικής ανοσίας, όπως η IL-6, μπορεί να προάγει την ανάπτυξη των Th17 κυττάρων, εμφανίζοντας πιο σύνθετες δράσεις στη μεσολαβούμενη από τα Τ- κύτταρα ανοσία (Abbas, 2007; Chatzantoni, 2009). Ένας άλλος κυτταρικός πληθυσμός με σημαντική συμβολή στην παθογένεση της ΠΣ είναι τα Β- κύτταρα. Οι ενδείξεις για τη συμμετοχή της χυμικής ανοσίας είναι πολλές και αδιαμφισβήτητες, αφού η συντριπτική πλειονότητα των ασθενών με ΠΣ εμφανίζουν ενδορραχιαία σύνθεση ανοσοσφαιρινών (αυξημένος δείκτης IgG και ολιγοκλωνικές δέσμες στο ΕΝΥ) (Disanto et al., 2012). Β- κύτταρα με κλωνική έκπτυξη εντοπίζονται στο εγκεφαλικό παρέγχυμα ασθενών με ΠΣ και είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των ολιγοκλωνικών δεσμών (Lovato et al., 2011), ενώ μεγάλος αριθμός πλασματοκυττάρων παρατηρείται στους περιαγγειακούς χώρους εντός των ενεργών και χρόνιων πλακών (Henderson et al., 2009). Η ριτουξιμάμπη, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που δρα στα CD20+ Β- κύτταρα αποδείχθηκε ιδιαίτερα αποτελεσματικό στην RRMS (Hauser et al., 2008). Το αντιγόνο CD20 βρίσκεται σε όλα τα στάδια ανάπτυξης των Β- κυττάρων, εκτός από τα προ- Β κύτταρα και τα πλασματοκύτταρα, κάτι που υποδηλώνει ότι η αποτελεσματικότητα της ριτουξιμάμπης και συνεπώς ο παθογενετικός ρόλος των Β- κυττάρων στην ΠΣ δε μεσολαβείται από τα αυτοαντιγόνα (Disanto et al., 2012). Τα Β- κύτταρα είναι σε θέση να λειτουργήσουν ως επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα στα Τ- κύτταρα, ή να επηρεάσουν την Τ- κυτταρική αντίδραση μέσω χημειοκινών και κυτταροκινών. Τα κυτταροτοξικά Τ- κύτταρα (CTLs ή CD8+ T-cells) έχουν επίσης αποδεδειγμένο ρόλο στην παθογένεση της ΠΣ. Τα CD8+ κύτταρα είναι περισσότερα από τα CD4+ στις πλάκες και μάλιστα εντοπίζονται στο κέντρο των πλακών (Goverman, 2009). Τα CD8+ κύτταρα των 59

60 πλακών της ΠΣ εμφανίζουν ολιγοκλωνική έκπτυξη, κάτι που υποδηλώνει την ενεργό τους συμμετοχή στην ανοσολογική αντίδραση (Weiss et al., 2007). Πολλά άλλα είδη κυττάρων του ανοσοποιητικού (δενδριτικά κύτταρα, μικρογλοιακά κύτταρα, γδ- Τ- κύτταρα, κ.α.) έχουν μελετηθεί ως προς το ρόλο τους στην παθογένεση της ΠΣ. Η περιγραφή τους, ωστόσο, ξεπερνά τους σκοπούς της παρούσας διατριβής. Η σημασία των ρυθμιστικών Τ- κυττάρων στην παθογένεση της ΠΣ συζητείται στην επόμενη παράγραφο και είναι και το αντικείμενο της Μελέτης Α Ανοσολογική ανοχή- Τα ρυθμιστικά κύτταρα Η ανοχή στα αυτοαντιγόνα ή αυτο- ανοχή, η μη ανοσολογική αντίδραση δηλαδή έναντι αντιγόνων του ίδιου του οργανισμού, αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό του φυσιολογικού ανοσοποιητικού συστήματος. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η ανοχή διακρίνονται σε κεντρικούς (κεντρική ανοχή), που επιτελούνται σε κεντρικά λεμφικά όργανα, όπως ο θύμος, και σε περιφερικούς (περιφερική ανοχή) (Abbas, 2007; Chatzantoni, 2009). Κατά την ωρίμανση των Τ- κυττάρων στο θύμο, τα άωρα, διπλά θετικά (CD4+CD8+) κύτταρα υφίστανται αρχικά μια θετική επιλογή στο φλοιό: αυτά που δεν αναγνωρίζουν συμπλέγματα πεπτιδίου- MHC υφίστανται θάνατο από παραμέληση (neglect), ενώ αυτά που αναγνωρίζουν τέτοια συμπλέγματα μετακινούνται στη μυελώδη μοίρα, όπου ωριμάζουν σε απλά θετικά (CD4+ ή CD8+) T- κύτταρα. Στη συνέχεια, από τα κύτταρα που επιβίωσαν της θετικής επιλογής, αυτά που αναγνωρίζουν με μεγάλη συγγένεια συμπλέγματα αυτοαντιγόνου- MHC υφίστανται θάνατο από απόπτωση (αρνητική επιλογή), ενώ αυτά που δεν αναγνωρίζουν ή έχουν χαμηλή συγγένεια επιβιώνουν και μεταναστεύουν στα δευτερογενή λεμφικά όργανα ως ώριμα, παρθένα Τ- κύτταρα (Εικόνα 2.4) (Abbas, 2007). Με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται ότι τα ώριμα πλέον λεμφοκύτταρα δε θα αναγνωρίσουν ως ξένα αντιγόνα του οργανισμού, που τους παρουσιάστηκαν στο θύμο (κεντρική ανοχή). Στο θύμο (για τα Τ- λεμφοκύτταρα, αντίστοιχα στο μυελό των οστών για τα Β- λεμφοκύτταρα) παρουσιάζονται 60

61 στα λεμφοκύτταρα αντιγόνα που εκφράζονται ευρύτατα στον οργανισμό, καθώς και αντιγόνα των περιφερικών ιστών που εκφράζονται στο θύμο. Κάποια αντιγόνα της περιφέρειας δεν παρουσιάζονται κατά την ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων, με αποτέλεσμα να υπάρχουν κλώνοι που αναγνωρίζουν τέτοια αντιγόνα. Στην περίπτωση αυτή η ανοχή επιτυγχάνεται με τους μηχανισμούς της περιφερικής ανοχής. Κύτταρα που έχουν ενδιάμεση συγγένεια για το σύμπλεγμα αντιγόνου- MHC μετατρέπονται σε ρυθμιστικά Τ- κύτταρα (φυσικά, natural, ntregs), και εκφράζουν το CD4, το CD25, καθώς και τον ενδοκυττάριο μεταγραφικό παράγοντα Foxp3 (forkhead family transcription factor 3). Η φάση της ενεργοποίησής τους είναι αντιγονοειδική, ενώ η φάση της κατασταλτικής δράσης μεσολαβείται κυρίως με την επαφή με άλλα κύτταρα (cell- cell contact). Εικόνα 2.4. Ανάπτυξη των Τ- λεμφοκυττάρων στο θύμο και δημιουργία κεντρικής ανοχής, μέσω απόπτωσης των λεμφοκυττάρων που αναγνωρίζουν με υψηλή συγγένεια αυτοαντιγόνα (αρνητική επιλογή) και δημιουργία ρυθμιστικών Τ- κυττάρων (ntregs) από αυτά που έχουν ενδιάμεση συγγένεια με αυτοαντιγόνα, τα οποία στη συνέχεια μετακινούνται στην περιφέρεια. 61

62 Η κεντρική ανοχή δεν είναι πάντα επιτυχής, με αποτέλεσμα στην περιφέρεια να κυκλοφορούν Τ- κύτταρα που είναι ικανά να αντιδράσουν έναντι ιδίων αντιγόνων (Romagnani, 2006). Για το λόγο αυτό υπάρχουν μηχανισμοί περιφερικής ανοχής, οι πιο γνωστοί από τους οποίους είναι (Abbas, 2007): 1. Ανεργία. Συμβαίνει όταν η αντιγονοπαρουσίαση γίνεται μέσω ενός μη επαγγελματικού APC, το οποίο ενώ έχει τη σωστή δομή του MHC για την παρουσίαση του πεπτιδίου στον TCR, δε διαθέτει τα συνδιεγερτικά μόρια CD80 (Β7-1) και CD86 (Β7-2), με αποτέλεσμα να μην μπορεί να μεταχθεί το ενεργοποιητικό σήμα από το CD28. Τα κύτταρα που υφίστανται αυτή τη διαδικασία καθίστανται ανενεργά και χάνουν την ικανότητα ενεργοποίησης όταν το ίδιο αντιγονικό ερέθισμα μεταδοθεί με την κατάλληλη παρουσίαση. Τα κύτταρα αυτά δεν πεθαίνουν αλλά παραμένουν ως λειτουργικά ανενεργά δραστικά κύτταρα. Ένας άλλος μηχανισμός είναι η σύνδεση ανασταλτικών μορίων της οικογένειας του CD28, όπως το CTLA-4, με τα συνδιεγερτικά μόρια CD80 και CD86, ή του PD-1, με αντίστοιχα μόρια, με αποτέλεσμα την επαγωγή ανοχής. Και στις δύο περιπτώσεις, διαφαίνεται η σημασία του ρόλου των APC. Τα εν ηρεμία δενδριτικά κύτταρα των ιστών παρουσιάζουν συνέχεια αυτοαντιγόνα με πολύ χαμηλή έκφραση συνδιεγερτικών μορίων, με αποτέλεσμα την επαγωγή ανοχής, ενώ τα ενεργοποιημένα από μικρόβια δενδριτικά κύτταρα εκφράζουν συνδιεγερτικά μόρια που οδηγούν στην ενεργοποίηση των Τ- κυττάρων. Εντούτοις, τοπικές λοιμώξεις ή φλεγμονές μπορεί να ενεργοποιήσουν τα τοπικά APC, οδηγώντας σε αύξηση της έκφρασης συνδιεγερτικών μορίων, διάσπαση της ανοχής και αυτοάνοση αντίδραση έναντι ιστικών αντιγόνων. 2. Διαγραφή. Όταν τα Τ- κύτταρα συναντήσουν μια πολύ υψηλή συγκέντρωση ενός αντιγόνου και ενεργοποιηθούν ισχυρά, εκφράζουν στην επιφάνειά τους το Fas και FasL. Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση του ενζυμικού καταρράκτη της κασπάσης, με αποτέλεσμα τη διαγραφή τους μέσω μιας διαδικασίας που καλείται επαγόμενος από ενεργοποίηση κυτταρικός θάνατος. 62

63 3. Καταστολή από ρυθμιστικά Τ- κύτταρα. Τα ρυθμιστικά κύτταρα αποτελούν μια ομάδα των Τ- κυττάρων, που καταστέλλουν την ενεργοποίηση άλλων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, με σκοπό τη διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής και τον έλεγχο της υπερβολικής αντίδρασης σε ξένα αντιγόνα. Τα κύτταρα αυτά περιλαμβάνουν διάφορες ομάδες, μεταξύ των οποίων οι πιο σημαντικές είναι: Α) Τα φυσικά ρυθμιστικά Τ- κύτταρα (natural Tregs, ntregs), τα οποία περιγράφηκαν με τους μηχανισμούς της κεντρικής ανοσίας. Αυτά είναι CD4+ T- κύτταρα, τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα της α- υπομονάδας του υποδοχέα της IL-2, IL-2Rα ή CD25. Επίσης, ενδοκυττάρια εκφράζουν το μεταγραφικό παράγοντα FoxP3 (Chatzantoni, 2009). Ο μηχανισμός που προκαλούν ανοχή είναι είτε μέσω άμεσης κυτταρικής επαφής με τα APC ή τα ενεργοποιημένα Τ- κύτταρα, είτε μέσω έκκρισης κατασταλτικών κυτταροκινών (Abbas, 2007). Εκτός του FoxP3, διάφοροι άλλοι δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί για το χαρακτηρισμό αυτής της ομάδας των Tregs, όπως το μόριο CD39, το CD73, το CTLA-4 και το GITR (Gonsette, 2012). Β) Επαγόμενα ρυθμιστικά κύτταρα (inducible Tregs, itregs), που επάγονται στην περιφέρεια από άωρα Τ- κύτταρα. Αυτά διακρίνονται σε δύο ομάδες: i) Τα Th3 κύτταρα, τα οποία έχουν κύριο ρόλο στην από του στόματος ανοχή μέσω της έκκρισης του Transforming growth factor β (TGFβ) και ii) Τα Tr1 κύτταρα, που εκκρίνουν IL-10 και ο κύριος ρόλος τους είναι ο έλεγχος της αυτοανοσίας, μέσω καταστολής των μακροφάγων και δενδριτικών κυττάρων (Chatzantoni, 2009; Gonsette, 2012). Γ) Άλλα κύτταρα με κατασταλτικές ιδιότητες, όπως τα CD8+ Tregs, τα NK Tregs και τα HLA-G+ Tregs, που έχει φανεί ότι παίζουν ρόλο στην αυτοανοσία και στην ανοχή κατά τις μεταμοσχεύσεις (Correale and Villa, 2010; Gonsette, 2012; Huang et al., 2009). 63

64 2.5. Ένα μοντέλο για την παθογένεση της ΠΣ Τα βήματα που ακολουθούνται για την πρόκληση της βλάβης στην ΠΣ μπορούν να συνοψιστούν ως εξής (Εικόνα 2.5): 1. Ενεργοποίηση αυτοαντιδρώντων Τ- κυττάρων (Th1, Th2, Th17, ανάλογα με το κυτταροκινικό προφίλ) στην περιφέρεια (δευτερογενή λεμφικά όργανα) μετά από αντιγονοπαρουσίαση από δενδριτικά κύτταρα μέσω MHC II (μοριακή μιμική;, υπεραντιγόνα;). Είναι ενδεικτικό ότι στους ασθενείς με ΠΣ τα αυτοαντιδρώντα Τ- κύτταρα είναι είτε μνημονικά είτε ενεργοποιημένα, ενώ στους υγιείς μάρτυρες είναι άωρα (naïve) (Kalman, 2008). Τα αυτοαντιδρώντα κύτταρα φυσιολογικά τίθενται υπό έλεγχο από τα ρυθμιστικά Τ- κύτταρα (ntregs, Tr1, Th3, CD56+ NK- κύτταρα, κ.α.) (Holmoy and Hestvik, 2008). 2. Διάσπαση του ΑΕΦ και μετακίνηση εντός του ΚΝΣ. Το βήμα αυτό επιτελείται σε διαδοχικά στάδια που περιλαμβάνουν το κύλισμα (rolling) των λεμφοκυττάρων πάνω στο ενδοθήλιο (με τη βοήθεια σελεκτινών), την προσκόλλησή τους σε αυτό (με την πρόσδεση ιντεγκρινών, π.χ. VLA-4 και LFA-1, των λεμφοκυττάρων σε μόρια- προσδέτες πάνω στο ενδοθήλιο) και στη συνέχεια τη διαπήδησή τους εντός του ΚΝΣ (Holmoy and Hestvik, 2008). 3. Επανενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων εντός του ΚΝΣ από τοπικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (μικρογλοιακά, μακροφάγα, Β-κύτταρα). Τα αυτοαντιδρώντα δραστικά κύτταρα (Th1, Th17), μετά από την είσοδό τους στο εγκεφαλικό παρέγχυμα ενεργοποιούν με τη σειρά τους τα μακροφάγα/ μικρογλοιακά κύτταρα και τα κυτταροτοξικά CD8+ Τ- κύτταρα. Τα CD8+ κύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα που παρουσιάζονται από το MHC I πάνω σε νευρώνες ή άλλα κύτταρα του ΚΝΣ. Τα Th2 κύτταρα ενεργοποιούν τα Β- κύτταρα σε πλασματοκύτταρα, που συμβάλλουν στην παραγωγή αντισωμάτων, τα οποία μαζί με το συμπλήρωμα προκαλούν κυτταρική βλάβη. Άλλοι μηχανισμοί πρόκλησης βλάβης περιλαμβάνουν τις ελεύθερες 64

65 ρίζες, τις κυτταροτοξικές κυτταροκίνες και τη μεσολαβούμενη από το γλουταμικό τοξική διέγερση. Η απελευθέρωση των κυτταροκινών και των μεταλλοπρωτεϊνασών διαταράσσει τον ΑΕΦ και οι χημειοκίνες προσελκύουν και άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού εντός του ΚΝΣ (Holmoy and Hestvik, 2008). Εικόνα 2.5. Τα διαδοχικά στάδια του παθογενετικού μηχανισμού της ΠΣ. Τροποποιημένο από (Holmoy and Hestvik, 2008). 65

66 66

67 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 67

68 3. ΜΕΛΕΤΗ Α ΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ Τ- ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΗΝ ΠΣ ΜΕ ΕΞΑΡΣΕΙΣ ΚΑΙ ΥΦΕΣΕΙΣ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ 3.1. Εισαγωγή- Σκοπός της Μελέτης Με δεδομένη την ανοσολογική αρχή στην παθογένεση της ΠΣ, ένα από τα βασικά στοιχεία που θεωρούνται υπεύθυνα για την ανάπτυξή της είναι η διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής. Όπως αναφέρθηκε, η παρουσία αυτοαντιδρώντων Τ- κυττάρων, ικανών να προκαλέσουν αυτοανοσία, είναι ένα χαρακτηριστικό τόσο των ασθενών όσο και των υγιών ατόμων. Επομένως, η απλή παρουσία τους δεν είναι επαρκής συνθήκη για την ανάπτυξη αυτοανοσίας. Η διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής έναντι αυτοαντιγόνων του ΚΝΣ, σε άτομα με γενετική προδιάθεση, θεωρείται ένα σημαντικό βήμα για την εμφάνιση της ΠΣ (Frohman et al., 2006; Mouzaki et al., 2004; Zozulya and Wiendl, 2008). Πειραματικά δεδομένα των τελευταίων ετών κατέδειξαν το σημαντικό ρόλο των ρυθμιστικών Τ- κυττάρων (Tregs) στην αυτοανοσία του ΚΝΣ (Chatzantoni, 2009; Costantino et al., 2008; Zozulya and Wiendl, 2008). Τα είδη των Tregs που διαδραματίζουν ρυθμιστικό ρόλο στο ΚΝΣ περιλαμβάνουν: τα φυσικά Tregs (ntregs), τα οποία είναι CD4+ Τ- κύτταρα που αναπτύσσονται στο θύμο και εκφράζουν ιδιοσυστασιακά το CD25 (CD25 high ) και το μεταγραφικό παράγοντα forkhead box protein P3 (Foxp3+), και τα επαγόμενα Tregs (itregs), τα οποία επάγονται στην περιφέρεια κατά τη διάρκεια μιας αυτοάνοσης ή φλεγμονώδους αντίδρασης και μπορεί να εκφράζουν ή όχι τον παράγοντα Foxp3. Τα itregs περιλαμβάνουν τα Th3 κύτταρα, τα οποία προέρχονται από άωρα Τ- κύτταρα που είναι είτε CD4+ είτε CD8+ και εκκρίνουν τον TGFβ, τα τύπου 1 (Tr1) Tregs, τα οποία προέρχονται από CD4+ κύτταρα 68

69 και εκκρίνουν IL-10, και τα CD8+CD28- κύτταρα, που προκαλούν ανοχή στην παρουσίαση μέσω των APC μέσω κυτταρικής επαφής (Correale and Villa, 2008; Kreft et al., 2011). Ένας άλλος πληθυσμός των ntregs, που αναγνωρίστηκαν πρόσφατα στο ανθρώπινο αίμα, αποτελείται από CD4+ ή CD8+ Τ- κύτταρα, που στερούνται της έκφρασης του Foxp3, εκφράζουν όμως το αντιγόνο HLA-G (Feger et al., 2007b; Zozulya and Wiendl, 2008). Μολονότι ο Foxp3 θεωρείται ειδικός δείκτης των ntregs, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι, μετά από ενεργοποίηση, τα δραστικά Τ- κύτταρα και τα Tr1 κύτταρα μπορούν να εκφράσουν παροδικά τον Foxp3 (Passerini et al., 2008; Roncarolo and Gregori, 2008), ενώ από την άλλη ρυθμιστικά κύτταρα που είναι CD4+FoxP3+ μπορεί να είναι CD25- και να εκφράζουν και πάλι το CD25 μετά από ομοιοστατική έκπτυξη, αποτελώντας μια δεξαμενή δεσμευμένων ρυθμιστικών T- κυττάρων (Zelenay et al., 2005). Διάφορες μελέτες έχουν ασχοληθεί με το θέμα του αριθμού και της λειτουργίας των Tregs στους ασθενείς με ΠΣ, εστιάζοντας κυρίως στα CD4+CD25 high Τ- κύτταρα. Οι μελέτες αυτές δε βρήκαν διαφορές στη συχνότητα των Tregs ανάμεσα στους ασθενείς με ΠΣ και στους μάρτυρες, ή μεταξύ των ασθενών σε διάφορες φάσεις της νόσου (οξεία φάση ή ύφεση) ή με διάφορους υπότυπους της νόσου (CIS, RRMS, SPMS, PPMS), αν και εντόπισαν μείωση της κατασταλτικής δράσης τους (Feger et al., 2007a; Haas et al., 2005; Putheti et al., 2004; Viglietta et al., 2004). Οι μελέτες που ανίχνευσαν τα CD4+CD25 high Foxp3+ Tregs στους ασθενείς με ΠΣ έδειξαν διαταραχή στη λειτουργία τους (Huan et al., 2005; Stenner et al., 2008; Venken et al., 2008), που συνδεόταν με μειωμένη έκφραση του Foxp3 και μειωμένη συχνότητα των Foxp3+ κυττάρων (Venken et al., 2008), ενώ άλλοι ερευνητές βρήκαν μειωμένους αριθμούς στη διάρκεια της ύφεσης, που αποκαθίσταντο σε φυσιολογικά επίπεδα κατά την οξεία φάση της νόσου (Dalla Libera et al., 2011). Η ιντερφερόνη β (IFNβ) αποτελεί για πολλά χρόνια θεραπεία πρώτης γραμμής στην ΠΣ. Μολονότι ο ακριβής μηχανισμός της προφυλακτικής δράσης της IFNβ στην ΠΣ παραμένει άγνωστος, πολλές μελέτες υποδηλώνουν ότι αυτή θα μπορούσε να οφείλεται στην 69

70 αποκατάσταση των επιπέδων και της λειτουργίας των Tregs (Aristimuno et al., 2009; Chen et al., 2012; Namdar et al., 2010; Saresella et al., 2008). Οι υποτροπές της ΠΣ αντιμετωπίζονται με την ενδοφλέβια χορήγηση υψηλών δόσεων κορτιζόνης (μεθυλπρεδνιζολόνης). Ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς δράσης της κορτιζόνης στην ύφεση των υποτροπών είναι και η αποκατάσταση της κατασταλτικής λειτουργίας των Tregs (Navarro et al., 2006; Xu et al., 2009). Η ναταλιζουμάμπη είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της α4 υπομονάδας των α4β1 (VLA-4) και α4β7 ιντεγκρινών της επιφάνειας των λευκών αιμοσφαιρίων, που δρα παρεμποδίζοντας την προσκόλλησή τους στους ενδοθηλιακούς υποδοχείς, τον VCAM-1 και το MadCAM-1, αντίστοιχα. Ο αποκλεισμός αυτός έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της διείσδυσης των αυτοαντιδρώντων Τ- κυττάρων στο ΚΝΣ μέσω του ΑΕΦ και την καταστολή της φλεγμονής (Lindberg et al., 2008). Η ναταλιζουμάμπη (Tysabri ) έχει εγκριθεί ως προφυλακτική θεραπεία στην RRMS σε ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται σε θεραπείες πρώτης γραμμής, ή σε αυτούς που έχουν βαριά, επιθετική νόσο (Polman et al., 2006; Rudick et al., 2006). Αν και η ναταλιζουμάμπη έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει τις ανοσολογικές αντιδράσεις με πολλούς άλλους τρόπους πέραν του αποκλεισμού των Τ- κυττάρων από την είσοδό τους στο ΚΝΣ, ελάχιστα είναι γνωστά σχετικά με τη δράση της στα Tregs. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να μετρήσουμε τις συχνότητες των CD4+CD25+Foxp3+ Τ- κυττάρων στους ασθενείς με ΠΣ συγκριτικά με υγιείς μάρτυρες και να διαπιστώσουμε τις επιπτώσεις της φάσης της νόσου (οξεία φάση, ύφεση) και των θεραπευτικών παρεμβάσεων (μεθυλπρεδνιζολόνη, IFNβ, ναταλιζουμάμπη) στη συχνότητά τους. Σε μια υποομάδα ασθενών και μαρτύρων μετρήσαμε επίσης τις συχνότητες και άλλων πληθυσμών ρυθμιστικών κυττάρων, όπως των CD3+CD4+HLA-G+, CD3+CD56+ (NKT κύτταρα), CD8+CD28- (CD8+ Tregs) και των CD56 bright. Επιπλέον, εξετάσαμε τις απαντήσεις των Tregs στην επίδραση διαφόρων αντιγονικών πεπτιδίων, προκειμένου να διαπιστώσουμε τη λειτουργικότητά τους στις διάφορες φάσεις της νόσου και υπό διαφορετικές θεραπείες. 70

71 3.2. Υλικό και Μέθοδοι Ασθενείς και μάρτυρες Στη μελέτη περιλήφθηκαν 83 ασθενείς (50 γυναίκες, μέση ηλικία 37.5 έτη) με κλινικά βέβαιη ΠΣ με εξάρσεις και υφέσεις (RRMS), σύμφωνα με τα αναθεωρημένα το 2005 διαγνωστικά κριτήρια του McDonald (Polman et al., 2005). Τα στοιχεία από το ιστορικό και τη νευρολογική εξέταση χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να καθοριστεί η τρέχουσα φάση της νόσου, η πορεία τους, η διάρκεια της νόσου και το επίπεδο αναπηρίας, με βάση την κλίμακα Expanded Disability Status Scale- EDSS- του Kurtzke (Kurtzke, 1983). Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται συνοπτικά στον Πίνακα 3.1. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε 5 ομάδες, με βάση τη φάση της νόσου (οξεία φάση- acute phase, AP, ή ύφεση, remission, Rem) και το είδος της θεραπείας που ελάμβαναν κατά το χρόνο που ελήφθησαν τα δείγματα αίματος (καμία θεραπεία- norx, μεθυλπρεδνιζολόνη- MP, ιντερφερόνη β- IFN, ή ναταλιζουμάμπη- NATA). Οι ομάδες που σχηματίστηκαν με βάση τα παραπάνω χαρακτηριστικά ήταν: (α) ασθενείς στην οξεία φάση της νόσου, που δεν είχαν λάβει καμία θεραπεία (AP-noRx, n= 13), (β) ασθενείς στην οξεία φάση αμέσως μετά από θεραπεία με μεθυλπρεδνιζολόνη (AP-MP, n= 17), (γ) ασθενείς στην οξεία φάση υπό θεραπεία με ιντερφερόνη β (AP-IFN, n= 12), (δ) ασθενείς σε ύφεση χωρίς θεραπεία (Rem-noRx, n= 15) και (ε) ασθενείς σε ύφεση υπό θεραπεία με ναταλιζουμάμπη (Rem-NATA, n=26). Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 45 υγιείς μάρτυρες (HC), αντίστοιχης ηλικίας και φύλου (26 γυναίκες, μέση ηλικία 36.3 έτη). Οι μάρτυρες δεν είχαν ιστορικό νευρολογικής ή αυτοάνοσης νόσου, ενώ κατά την περίοδο της αιμοληψίας δεν εμφάνιζαν σημεία ή συμπτώματα λοίμωξης ή φλεγμονής. Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη υπέγραψαν έντυπο ενημερωμένης συγκατάθεσης πριν την αιμοληψία. Το πρωτόκολλο της μελέτης έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας και το Επιστημονικό Συμβούλιο του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. 71

72 Πίνακας 3.1. Δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων Ομάδα N (Α/Γ) Ηλικία (έτη) Διάρκεια νόσου EDSS (έτη) HC 45 (19/26) ± 9.26 ΔΕ ΔΕ RRMS ασθενείς 83 (33/50) ± ± ± 1.89 AP-noRx 13 (4/9) ± ± ± 1.74 AP-MP 17 (8/9) ± ± ± 1.23 AP-IFN 12 (4/8) ± ± ± 1.55 Rem-noRx 15 (6/9) ± ± ± 2.09 Rem-NATA 26 (11/15) ± ± ± 1.82 Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. A= άνδρες, Γ= γυναίκες, ΔΕ= δεν εφαρμόζει, Ν= αριθμός, για τις υπόλοιπες συντομογραφίες βλ κείμενο Κύτταρα και καλλιέργειες Δείγματα ολικού αίματος (10 ml) συλλέχθηκαν υπό άσηπτες συνθήκες από τους ασθενείς με ΠΣ και από τους υγιείς μάρτυρες σε ηπαρινισμένα φιαλίδια BD Vacutainers (368480, BD, Plymouth, UK). Στη συνέχεια, τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας φικόλλης (L6113, BIOCHROM AG, Berlin, Germany). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες σε μέσο RPMI1640 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), που περιείχε βόειο εμβρυϊκό ορό 10% και 1% πενικιλλίνη/ στρεπτομυκίνη, με συγκέντρωση 10 6 κύτταρα/ ml, επί παρουσίας ή απουσίας των πεπτιδίων PEP1-4 ή cp7 (βλ. παρακάτω), σε συγκέντρωση 10 pg/ ml/ 10 6 κύτταρα. Στο τέλος της περιόδου καλλιέργειας τα PBMC απομονώθηκαν, εκπλύθηκαν με PBS και ο κυτταρικός τους φαινότυπος προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. 72

73 Πεπτίδια αντιγονικών επιτόπων της MOG και MBP Τα πεπτίδια PEP1-4 είναι τροποποιημένοι αντιγονικοί επίτοποι της MOG Η χημική δομή των πεπτιδίων PEP1 και PEP2 είναι H-Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser- Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 -OH και των PEP3 και PEP4 H-Met 35 -Glu-Val- Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 -OH. Τα πεπτίδια PEP1 και PEP3 είναι συνδεδεμένα με αναγμένη μαννάνη και τα PEP2 και PEP4 με οξειδωμένη μαννάνη (Katsara et al., 2009; Tang et al., 2008). Το πεπτίδιο cp7 (c[87-99]mbp [Cit 91,97 Ala 96 ]) είναι ένας κιτρουλλινωμένος, τροποποιημένος αντιγονικός επίτοπος της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης (MBP), που έχουμε περιγράψει σε προηγούμενες μελέτες (Deraos et al., 2008; Mouzaki et al., 2010) Κυτταρομετρία ροής Τα κύτταρα του ολικού αίματος ή τα PBMC σημάνθηκαν με τα παρακάτω μονοκλωνικά αντισώματα: CD3-PC5 (UCHT1, Beckman Coulter-BC, Paris, France ), CD4-FITC (13B8.2, BC), CD8-FITC (B9.11, BC), CD28-PE (B-T3, Abcam, Cambridge, UK), CD25-PE (M- A251, Becton Dickinson-BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA, USA), CD56-PE (N901, BC), HLA-G-PE (MEM-G/9, Abcam) και PE-Cy5 Conjugated anti-human Foxp3 (PCH101, ebiosciences, San Diego, CA, USA). Σε όλες τις διαδικασίες ακολουθήθηκαν πιστά οι οδηγίες των κατασκευαστών. Για την ενδοκυττάρια σήμανση του Foxp3, τα κύτταρα σημάνθηκαν με τα αντισώματα CD4-FITC και CD25-PE, και στη συνέχεια σημάνθηκαν για το Foxp3, μετά από σταθεροποίηση και αύξηση της διαπερατότητάς τους. Τα δείγματα του ολικού αίματος επεξεργάστηκαν με διάλυμα BD Pharma Lyse 1x (BD) για 15 λεπτά, μετά τη χρώση, για τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Η κυτταρομετρία ροής διενεργήθηκε στη συσκευή EPICS Coulter XL-MCL Flow Cytometer (BC). Λήφθηκαν τουλάχιστον 20,000 γεγονότα για την εξωκυττάρια και 100,000 γεγονότα 73

74 για την ενδοκυττάρια χρώση. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος FlowJo V7.5 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA) Μέτρηση κυτταροκινών στα υπερκείμενα των καλλιεργειών Στο υπερκείμενο κάθε καλλιέργειας παρουσία ή απουσία των πεπτιδίων μετρήθηκαν οι κυτταροκίνες IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α και IL-17A. Για τη μέτρηση των κυτταροκινών χρησιμοποιήθηκε η συσκευή BD FACSArray Bioanalyzer και η δοκιμασία Cytometric Bead Array (CBA) assay (human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit, BD Biosciences, San Diego, USA). Με βάση τις μετρήσεις σχηματίστηκαν αναλογίες αντιφλεγμονωδών (IL-4, IL-10) προς τις φλεγμονώδεις κυτταροκίνες (IFN-γ, TNF-α, IL-17A), προκειμένου να προδιοριστεί η στροφή προς ένα φλεγμονώδη ή αντιφλεγμονώδη φαινότυπο κατά τις καλλιέργειες με καθένα από τα αντιγονικά πεπτίδια και να συγκριθεί η μεταβολή αυτή με την αντίστοιχη μεταβολή της αναλογίας των ρυθμιστικών/ δραστικών κυττάρων Στατιστική ανάλυση Οι συγκρίσεις μεταξύ των διαφορετικών ομάδων των ασθενών και των μαρτύρων έγιναν με τη χρήση της one- way analysis of variance (ANOVA) ή της αντίστοιχης μη παραμετρικής δοκιμασίας Kruskal- Wallis test, ανάλογα με την κανονικότητα της κατανομής των δεδομένων. Στις περιπτώσεις που η συνολική διαφορά μεταξύ των ομάδων ήταν στατιστικά σημαντική, οι διάφορες ομάδες συγκρίθηκαν ανά δύο με τη βοήθεια του Student s t- test ή της αντίστοιχης μη παραμετρικής δοκιμασίας Mann- Whitney, με διόρθωση κατά Bonferroni, προκειμένου να διαπιστωθεί η σημαντικότητα της μεταξύ τους διαφοράς. Οι τιμές του p υπολογίστηκαν και προς τις δύο πλευρές (2- tailed) και θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ήταν Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού GraphPad Prism v.5.03 (San Diego, CA, USA). 74

75 3.3. Αποτελέσματα Τα CD4+CD25 high Foxp3+ Tregs (ntregs) Τα επίπεδα των ntregs ήταν χαμηλότερα στην ομάδα των ασθενών στην οξεία φάση χωρίς θεραπεία (AP-noRx) ή μετά από μεθυλπρεδνιζολόνη (AP-MP), συγκριτικά με τις υπόλοιπες ομάδες ασθενών και υγιών μαρτύρων (HC). Τα ntregs αποκαθίσταντο σε φυσιολογικά επίπεδα στην ομάδα των ασθενών στην οξεία φάση υπό ιντερφερόνη (AP-IFN), ενώ οι ασθενείς σε ύφεση και χωρίς θεραπεία (Rem-noRx) εμφάνιζαν επίπεδα ενδιάμεσα μεταξύ HC και AP-noRx. Τα επίπεδα των ntregs των ασθενών σε ύφεση υπό ναταλιζουμάμπη (Rem- NATA) ήταν συγκρίσιμα με αυτά των ασθενών AP-noRx και AP-MP (Εικόνα 3.1 και Πίνακας 3.2) Άλλοι πληθυσμοί Tregs Τα επίπεδα των άλλων πληθυσμών των ρυθμιστικών κυττάρων που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στις Εικόνες και στον Πίνακα 3.2. Το ποσοστό των CD3+CD4+HLA-G+ Τ- κυττάρων ήταν υψηλότερο στην ομάδα των AP-IFN ασθενών συγκριτικά με όλες τις υπόλοιπες ομάδες, με τις διαφορές να είναι στατιστικά σημαντικές μεταξύ AP-IFN και HC, AP-MP και Rem-NATA ασθενών (Εικόνα 3.2). Τα CD3+CD8+CD28- Τ- κύτταρα (CD8+ Tregs) εμφάνισαν την ίδια εικόνα, με τους ασθενείς AP-IFN να έχουν τα υψηλότερα ποσοστά CD8+ Tregs από όλες τις άλλες ομάδες (Εικόνα 3.3). Το αντίθετο συνέβη με τα CD3+CD56+ κύτταρα (ΝΚΤ κύτταρα), με τους ασθενείς AP- IFN να εμφανίζουν τα χαμηλότερα επίπεδα (Εικόνα 3.4). Η συχνότητα των CD56 bright ήταν υψηλότερη σε όλες τις ομάδες των ασθενών συγκριτικά με τους HC, αλλά μόνο η διαφορά μεταξύ Rem-NATA και HC ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 3.4). 75

76 Πίνακας 3.2. Φαινοτυπική ανάλυση των μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος (PBMC) στις διάφορες ομάδες ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων. Ομάδα CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-CD56+ CD3+CD56+ CD8+CD28- CD3+CD4+HLA-G+ CD4+CD25+Foxp3+ CD56 bright HC ± ± ± ± ± ± ± ± 0.49 AP-noRx ± ± ± ± ± ± ± ± 0.40 AP-MP ± ± ± ± ± ± ± ± 0.48 AP-IFN ± ± ± ± ± ± ± ± 0.47 Rem-noRx ± ± ± ± ± ± ± ± 0.32 Rem-NATA ± ± ± ± ± ± ± ± 0.77 Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Για τις συντομογραφίες βλ. κείμενο. 76

77 Εικόνα 3.1. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής γα τον προσδιορισμό των CD4+CD25 high Foxp3+ Tregs στο περιφερικό αίμα. Τα κύτταρα του ολικού αίματος σημάνθηκαν με CD4, CD25 και ενδοκυττάρια με FoxP3- ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε έναν κυτταρομετρητή EPICS-XL-MCL. Παρουσιάζεται μια αντιπροσωπευτική ανάλυση για έναν υγιή μάρτυρα (A1- C1) και για έναν ασθενή σε ύφεση υπό ναταλιζουμάμπη (A2- C2). Τα λευκά ήταν εστιασμένα στα λεμφοκύτταρα, με βάση την προς τα εμπρός και στα πλάγια σκέδαση του φωτός (Α1, Α2) και αναλύθηκαν για την έκφραση του CD4 και του CD25 (Β1, Β2). Τα διπλά θετικά κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω για την έκφραση του FoxP3 (C1, C2). Οι αριθμοί στα στικτά διαγράμματα αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν τον αντίστοιχο δείκτη. Οι πίνακες από κάτω παρουσιάζουν τους απόλυτους αριθμούς των κυττάρων σε κάθε πληθυσμό που αναλύθηκε. Κάτω γράφημα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης όλων των ασθενών (n= 83), ανά ομάδα (βλ. κείμενο) και των υγιών μαρτύρων (n= 45). *p= 0.04, **p= 0.01, ***p=

78 Εικόνα 3.2. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής γα τον προσδιορισμό των CD3+CD4+HLA-G+ Tregs στο περιφερικό αίμα. Τα κύτταρα του ολικού αίματος σημάνθηκαν με CD3, CD4 και HLA-G- ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε έναν κυτταρομετρητή EPICS-XL-MCL. Παρουσιάζεται μια αντιπροσωπευτική ανάλυση για έναν υγιή μάρτυρα (A1- D1) και για έναν ασθενή σε ύφεση υπό ναταλιζουμάμπη (A2- D2). Τα λευκά ήταν εστιασμένα στα λεμφοκύτταρα, με βάση την προς τα εμπρός και στα πλάγια σκέδαση του φωτός (Α1, Α2) και αναλύθηκαν για την έκφραση του CD3 (Β1, Β2) και του CD4 (C1, C2). Τα διπλά θετικά κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω για την έκφραση του HLA-G (D1, D2). Οι αριθμοί στα στικτά διαγράμματα αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν τον αντίστοιχο δείκτη. Οι πίνακες από κάτω παρουσιάζουν τους απόλυτους αριθμούς των κυττάρων σε κάθε πληθυσμό που αναλύθηκε. Κάτω γράφημα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης όλων των ασθενών (n= 83), ανά ομάδα (βλ. κείμενο) και των υγιών μαρτύρων (n= 45). *p= 0.05, **p= 0.01, ***p=

79 Εικόνα 3.3. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής γα τον προσδιορισμό των CD3+CD8+CD28- Tregs στο περιφερικό αίμα. Τα κύτταρα του ολικού αίματος σημάνθηκαν με CD3, CD8 και CD28- ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε έναν κυτταρομετρητή EPICS-XL-MCL. Παρουσιάζεται μια αντιπροσωπευτική ανάλυση για έναν υγιή μάρτυρα (A1- D1) και για έναν ασθενή σε οξεία φάση μετά από μεθυλπρεδνιζολόνη (A2- D2). Τα λευκά ήταν εστιασμένα στα λεμφοκύτταρα, με βάση την προς τα εμπρός και στα πλάγια σκέδαση του φωτός (Α1, Α2) και αναλύθηκαν για την έκφραση του CD3 (Β1, Β2) και του CD8 (C1, C2). Τα διπλά θετικά κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω για την έκφραση του CD28 (D1, D2). Οι αριθμοί στα στικτά διαγράμματα αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν τον αντίστοιχο δείκτη. Οι πίνακες από κάτω παρουσιάζουν τους απόλυτους αριθμούς των κυττάρων σε κάθε πληθυσμό που αναλύθηκε. Κάτω γράφημα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης όλων των ασθενών (n= 83), ανά ομάδα (βλ. κείμενο) και των υγιών μαρτύρων (n= 45). *p=

80 Εικόνα 3.4. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής γα τον προσδιορισμό των CD3+CD56+ και των CD56 bright Tregs στο περιφερικό αίμα. Τα κύτταρα του ολικού αίματος σημάνθηκαν με CD3 και CD56- ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε έναν κυτταρομετρητή EPICS-XL-MCL. Παρουσιάζεται μια αντιπροσωπευτική ανάλυση για έναν υγιή μάρτυρα (A1- C1) και για έναν ασθενή σε οξεία φάση υπό ιντερφερόνη (A2- C2). Τα λευκά ήταν εστιασμένα στα λεμφοκύτταρα, με βάση την προς τα εμπρός και στα πλάγια σκέδαση του φωτός (Α1, Α2) και αναλύθηκαν για την έκφραση του CD3 και του CD56 (Β1, Β2). Τα διπλά θετικά κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω για την έκφραση του CD56 (C1, C2). Οι αριθμοί στα στικτά διαγράμματα αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν τον αντίστοιχο δείκτη. Οι πίνακες από κάτω παρουσιάζουν τους απόλυτους αριθμούς των κυττάρων σε κάθε πληθυσμό που αναλύθηκε. Κάτω αριστερό γράφημα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης όλων των ασθενών (n= 83), ανά ομάδα (βλ. κείμενο) και των υγιών μαρτύρων (n= 45) για τα CD3+CD56+ κύτταρα. *p= Κάτω δεξί γράφημα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης όλων των ασθενών (n= 83), ανά ομάδα (βλ. κείμενο) και των υγιών μαρτύρων (n= 45) για τα CD56 bright κύτταρα. *p=

81 Επίδραση της καλλιέργειας παρουσία πεπτιδίων στη λειτουργία των ntregs Σε μια υποομάδα των υγιών μαρτύρων (HC, n= 19) και των ασθενών με ΠΣ (AP-noRx, n=5, AP-MP, n=5, AP-IFN, n=6, Rem-noRx, n=5, Rem-NATA, n=14) τα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία αντιγονικού πεπτιδίου, προκειμένου να καθοριστεί ποια ρυθμιστικά κύτταρα αντιδρούσαν στα αυτοαντιγόνα. Η μελέτη περιορίστηκε στον πληθυσμό των ntregs, καθώς οι άλλοι πληθυσμοί των ρυθμιστικών κυττάρων ήταν πολύ μικροί για να αναλυθούν. Προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι επιδράσεις της φάσης της νόσου και των θεραπευτικών παρεμβάσεων στις απαντήσεις των ntregs, μετρήσαμε τους αριθμούς των CD4+CD25- και CD4+CD25+ κυττάρων στις καλλιέργειες απουσία και παρουσία πεπτιδίων, για να υπολογίσουμε τις αναλογίες δραστικών προς κατασταλτικά κύτταρα, καθώς και το % ποσοστό των CD4+CD25+Foxp3+ ntregs. Επίσης, υπολογίστηκε η καθαρή εκατοστιαία μεταβολή στην αναλογία δραστικών/ κατασταλτικών κυττάρων στις καλλιέργειες χωρίς και με πεπτίδια, προκειμένου να καθοριστεί η μεταβολή προς ένα δραστικό (effector) ή κατασταλτικό (suppressor) φαινότυπο. Οι θετικές (προς τα πάνω) μεταβολές υποδηλώνουν μεταστροφή προς δραστικό φαινότυπο, ενώ οι αρνητικές (προς τα κάτω) μεταστροφή προς κατασταλτικό φαινότυπο (Εικόνα 3.5). Αντίστοιχα, στην Εικόνα 3.6 (αριστερή στήλη), παρουσιάζονται οι μέσες μεταβολές προς κατασταλτικό ή δραστικό φαινότυπο σε καλλιέργεια με καθένα από τα αντιγονικά πεπτίδια. Οι προς τα πάνω αποκλίσεις υποδηλώνουν ρυθμιστικό φαινότυπο και οι προς τα κάτω δραστικό. Στη δεξιά στήλη παρουσιάζονται οι αντίστοιχες μεταβολές της αναλογίας αντιφλεγμονωδών προς τις φλεγμονώδεις κυτταροκίνες στα υπερκείμενα των καλλιεργειών. Παρατηρείται μια σαφής συσχέτιση μεταξύ της στροφής του κυτταρικού και του κυτταροκινικού φαινότυπου στη συντριπτική πλειονότητα των περιπτώσεων (Εικόνα 3.6). Οι αναλογίες δραστικών/ κατασταλτικών κυττάρων στις καλλιέργειες χωρίς πεπτίδια εμφάνισαν μια αντίστροφη τάση από αυτή που παρατηρήθηκε με τα ntregs στο περιφερικό 81

82 αίμα (Εικόνα 3.7). Οι υψηλότερες αναλογίες παρατηρήθηκαν στους AP-noRx, AP-MP και Rem-NATA ασθενείς, και οι χαμηλότερες στους AP-IFN ασθενείς (Εικόνα 3.7Α). Το εύρημα αυτό επιβεβαιώθηκε από μια ισχυρή αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στις αναλογίες των δραστικών/ κατασταλτικών κυττάρων και στα επίπεδα των CD4+CD25+Foxp3+ κυττάρων (r= -0.64, p< ) (Εικόνα 3.7Β). Συνολικά, όλες οι ομάδες των ασθενών με ΠΣ εμφάνισαν κατασταλτικό φαινότυπο κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας με ένα ή περισσότερα αντιγονικά πεπτίδια, όπως και η ομάδα των υγιών μαρτύρων. Τα πεπτίδια PEP2 και PEP3 προκαλούσαν σχετικά μεγαλύτερη ανοσολογική ανοχή στους HC, ενώ τα πεπτίδια PEP1 και PEP3 στους ασθενείς με ΠΣ (Εικόνα 3.8). Όταν υπολογίστηκαν τα ποσοστά των καλλιεργειών με μεταστροφή προς κατασταλτικό φαινότυπο στην αναλογία δραστικών/ κατασταλτικών κυττάρων, δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες των ασθενών και των υγιών μαρτύρων, με εξαίρεση την ομάδα των Rem-noRx ασθενών, που είχαν μεγαλύτερο από διπλάσιο ποσοστό κατασταλτικών καλλιεργειών συγκριτικά με τις άλλες ομάδες ασθενών και τους HC (Εικόνα 3.9). 82

83 Εικόνα 3.5. Εκατοσταία (%) μεταβολή της αναλογίας δραστικών/κατασταλτικών κυττάρων (CD4+CD25-/ CD4+CD25+) μετά από καλλιέργεια 72 ωρών με τα πεπτίδια PEP1-4 ή cp7. Παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα (1 γράφημα/ ανά ασθενή). Α. Υγιείς μάρτυρες. Β. Ασθενείς με RRMS διαφόρων ομάδων. Οι πράσινες (αρνητικές) στήλες αντιστοιχούν σε κατασταλτική μεταστροφή, οι κόκκινες (θετικές) σε μεταστροφή προς δραστικό φαινότυπο. 83

84 Εικόνα 3.6. Στην αριστερή στήλη παρουσιάζονται οι μεταβολές της αναλογίας ρυθμιστικών/ δραστικών (Tregs/ Teff) κυττάρων στις διάφορες ομάδες της μελέτης μεταξύ των καλλιεργειών απουσία και παρουσία ενός από τα 5 πεπτίδια. Στη δεξιά στήλη παρουσιάζονται οι αντίστοιχες μεταβολές της αναλογίας των αντιφλεγμονωδών/ φλεγμονωδών κυτταροκινών, που μετρήθηκαν στα υπερκείμενα των αντίστοιχων καλλιεργειών. Παρατηρείται μια αντιστοιχία μεταξύ της μεταβολής στην αναλογία των κυττάρων και στη μεταβολή της αναλογίας των κυτταροκινών. 84

85 Εικόνα 3.7. Α. Οι αναλογίες δραστικών/κατασταλτικών κυττάρων των υγιών μαρτύρων και των ομάδων των ασθενών με ΠΣ μετά από καλλιέργεια των PMBC απουσία αντιγονικού πεπτιδίου. Είναι εμφανής η συμπληρωματικότητα με τα ποσοστά των CD4+CD25 high Foxp3+ Tregs στην Εικόνα 3.1. *p= B. Συσχέτιση των αναλογιών δραστικών/κατασταλτικών κυττάρων στην καλλιέργεια με τα ποσοστά των αντίστοιχων CD4+CD25 high Foxp3+ Tregs (Spearman r= -0.64, p<0.0001). Εικόνα 3.8. Μέσες μεταβολές των αναλογιών δραστικών/κατασταλτικών κυττάρων στους (Α) υγιείς μάρτυρες και (Β) στους ασθενείς με ΠΣ, μετά τις καλλιέργειες με τα αντιγονικά πεπτίδια (PEP1-4, cp7) (Τα whiskers αντιπροσωπεύουν ελάχιστες και μέγιστες τιμές). 85

86 Εικόνα 3.9. Τα ποσοστά των καλλιεργειών που εμφανίζουν κατασταλτικό φαινότυπο στους υγιείς και στους ασθενείς με ΠΣ, μετά την καλλιέργεια με τα αντιγονικά πεπτίδια (PEP1-4, cp7). Είναι εμφανής η σημαντική αύξηση στους Rem-noRx ασθενείς Συζήτηση Η κεντρική ανοχή έχει ως στόχο την εξάλειψη των λεμφοκυττάρων (Τ ή Β) που μπορούν να αντιδράσουν με αντιγόνα του ίδιου του οργανισμού, κάτι που επιτυγχάνεται με την απόπτωση των κυττάρων αυτών που αναγνωρίζουν με μεγάλη συγγένεια συμπλέγματα αυτοαντιγόνου- MHC στο θύμο (Τ- κύτταρα) ή στο μυελό (Β- κύτταρα). Η αποτυχία της κεντρικής ανοχής εκφράζεται με την παρουσία στην περιφέρεια αυτοαντιδρώντων Τ- (ή Β) κυττάρων, και μπορεί να οφείλεται είτε σε δυσλειτουργία του TCR, του MHC ή σε πρώιμη υποστροφή του θύμου αδένα (Gonsette, 2012). Η αποτυχία της κεντρικής ανοχής είναι δεδομένη, αφού αυτοαντιδρώντα λεμφοκύτταρα εντοπίζονται τόσο σε ασθενείς με ΠΣ όσο και σε υγιείς. Ωστόσο, η αποτυχία αυτή δεν είναι αρκετή για την εκδήλωση νόσου, εν προκειμένω της ΠΣ, αφού αυτοαντιδρώντα κύτταρα υπάρχουν και σε φυσιολογικά άτομα. Επομένως, τα φώτα 86

87 στράφηκαν προς τους μηχανισμούς της περιφερικής ανοχής, και συγκεκριμένα στα ρυθμιστικά Τ- κύτταρα (Zozulya and Wiendl, 2008). Αρχικά, ο μόνος δείκτης που χρησιμοποιήθηκε για τη διάκριση των ρυθμιστικών Τ- κυττάρων από τα δραστικά CD4+ κύτταρα ήταν η ιδιοσυστασιακή έκφραση του CD25 (IL- 2Rα) (Baecher-Allan et al., 2004), μολονότι ήταν ήδη γνωστό ότι η δεξαμενή των CD4+CD25+ κυττάρων μπορούσε να περιέχει και πρόσφατα ενεργοποιημένα δραστικά Τ- κύτταρα. Ωστόσο, τα CD4+ T- κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD25 (CD25 high ) εμφανίζουν τη μεγαλύτερη κατασταλτική δράση (Baecher-Allan et al., 2001) και αντιπροσωπεύουν ένα μικρό (2-4%) ποσοστό των CD4+ Τ- κυττάρων. Οι αρχικές μελέτες των CD4+ CD25 high Tregs σε ασθενείς με ΠΣ έδειξαν παρόμοια ποσοστά των κυττάρων αυτών στο αίμα των ασθενών με ΠΣ και των υγιών μαρτύρων (Feger et al., 2007a; Haas et al., 2005; Putheti et al., 2004; Viglietta et al., 2004), ανέφεραν ωστόσο μειωμένη κατασταλτική δράση, χρησιμοποιώντας διάφορες λειτουργικές δοκιμασίες (Feger et al., 2007a; Haas et al., 2005; Viglietta et al., 2004). Στο ΕΝΥ, συγκριτικά με το αίμα, τα CD4+ CD25 high Tregs είχαν είτε παρόμοια (Haas et al., 2005) είτε αυξημένη συχνότητα (Feger et al., 2007a) στους ασθενείς με ΠΣ. Μετέπειτα μελέτες χρησιμοποίησαν επιπλέον δείκτες για το χαρακτηρισμό των ntregs από τη δεξαμενή των CD4+ CD25 high Tregs, ο σημαντικότερος των οποίων ήταν ο ενδοκυττάριος μεταγραφικός παράγοντας forkhead box protein P3 (FoxP3). Ο FoxP3 θεωρείται ένας ειδικός δείκτης των ntregs, αν και τα δραστικά Τ- κύτταρα και τα Tr1 κύτταρα μπορούν να τον εκφράσουν παροδικά (Roncarolo and Gregori, 2008), μέσω κυτταροκινών που ενεργοποιούν το STAT-5 (Passerini et al., 2008). Άλλοι δείκτες που έχουν χρησιμοποιηθεί για το χαρακτηρισμό των ntregs είναι το CD39 (ένα εξωένζυμο που διασπά το ATP σε AMP), το CTLA-4 (Cytotoxic T- lymphocyte Antigen 4, μέλος της οικογένειας του CD28) και το GITR (Glucocorticoid- induced tumor necrosis factor receptor, μέλος της υπεροικογένειας του TNF) (Borsellino et al., 2007; Dalla Libera et al., 2011; Fletcher et al., 2009). Οι Huan et al. ανέφεραν παρόμοια επίπεδα CD4+CD25+ T- κυττάρων στους ασθενείς 87

88 με ΠΣ και στους υγιείς, αλλά μειωμένη έκφραση του FoxP3 στους ασθενείς (Huan et al., 2005). Μειωμένα επίπεδα CD4+ CD25 high FoxP3+ Tregs στο αίμα των RRMS (αλλά όχι των SPMS) ασθενών, με παράλληλη αύξηση των επιπέδων στο ΕΝΥ, διαπιστώθηκαν επίσης στη μελέτη των Venken et al. (Venken et al., 2008). Σε μια μελέτη των Michel et al., απομακρύνθηκαν από τη δεξαμενή των CD4+ CD25 high T- κυττάρων τα κύτταρα που εξέφραζαν το CD127 (α άλυσος του υποδοχέα της IL-7), ένας δείκτης που είναι παρόν στα ενεργοποιημένα T- κύτταρα, αλλά όχι στα Tregs. Τα CD4+ CD25 high CD127 low Tregs εμφάνισαν παρόμοια κατασταλτική δράση στους ασθενείς με RRMS και στους υγιείς μάρτυρες (Michel et al., 2008). Οι Dalla Libera et al. ανέφεραν μειωμένα επίπεδα Tregs (χαρακτηρισμένα από την έκφραση των δεικτών CD25, FoxP3, CD39, CTLA-4 και GITR) στους ασθενείς με RRMS κατά τη διάρκεια της ύφεσης, τα οποία αποκαθίσταντο σε φυσιολογικά επίπεδα κατά τις υποτροπές, συμπεραίνοντας ότι τα Tregs δεν ενέχονται στην πρόκληση υποτροπών, αλλά ότι διατηρούν τη λειτουργικότητά τους και αυξάνονται στις υποτροπές προκειμένου να διατηρήσουν την ομοιόσταση (Dalla Libera et al., 2011). Οι Bjerg et al. μελέτησαν ασθενείς με RRMS σε ύφεση και διαπίστωσαν ότι τα CD4+ CD25 high CD127 low FoxP3+ Tregs ήταν περισσότερα από τους μάρτυρες στην ομάδα των ασθενών με λιγότερο βαριά νόσο (χαμηλότερη βαθμολογία στην EDSS και μικρότερη διάρκεια νόσου) και λιγότερα στους ασθενείς με βαρύτερη νόσο (Bjerg et al., 2012). Άλλες μελέτες εστίασαν στην επίδραση των ανοσοτροποποιητικών και ανοσοκατασταλτικών θεραπειών στα Tregs. Μία μελέτη με ασθενείς υπό θεραπεία με IFNβ- 1α έδειξε αυξημένα επίπεδα CD4+ CD25 high Tregs (CTLA-4+ και GITR+) καθώς και αύξηση της λειτουργικότητάς τους μετά από 6 μήνες θεραπείας (de Andres et al., 2007). Άλλες μελέτες σε ασθενείς με RRMS υπό θεραπεία με IFNβ (β- 1α ή β- 1β) έδειξαν αυξημένη συχνότητα και λειτουργικότητα των CD4+ CD25 high FoxP3+ Tregs (Chen et al., 2012; Namdar et al., 2010). Η θεραπεία με ναταλιζουμάμπη δεν είχε κάποια επίδραση στους αριθμούς ή στη λειτουργικότητα των CD4+ CD25 high FoxP3+ Tregs (Ramos-Cejudo et al., 2011; Stenner et 88

89 al., 2008), με την εξαίρεση μίας μελέτης ενός περιστατικού, που ανέφερε αυξημένα ποσοστά και αποκατάσταση της λειτουργικότητας των ntregs σε έναν ασθενή που έλαβε ναταλιζουμάμπη μετά από υποτροπή και αφού είχε υποβληθεί σε μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (Mouzaki et al., 2010). Η θεραπεία με γλυκοκορτικοειδή μετά από υποτροπή οδηγεί σε αύξηση της συχνότητας και της λειτουργικότητας των CD4+ CD25 high (Navarro et al., 2006) και των FoxP3+ Tregs (Xu et al., 2009). Η σημαντική ετερογένεια των παρατηρήσεων στις διάφορες μελέτες, όσον αφορά στο μέγεθος των υπό μελέτη πληθυσμών, στα χαρακτηριστικά της νόσου, στις ομάδες σύγκρισης, στους δείκτες ταυτοποίησης των Tregs και στις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των Tregs και την εξέταση της λειτουργικότητάς τους, καθιστά την άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων εξαιρετικά δύσκολη. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν μειωμένα επίπεδα CD4+ CD25 high FoxP3+ Tregs στους ασθενείς στην οξεία φάση της νόσου (εκτός από αυτούς που ήταν υπό θεραπεία με ιντερφερόνη) και μία αύξηση της συχνότητάς τους κατά την ύφεση (εκτός και αν ελάμβαναν ναταλιζουμάμπη). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των Dalla Libera et al., που έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα κατά την ύφεση και αύξηση σε φυσιολογικά επίπεδα κατά τις υποτροπές της νόσου (Dalla Libera et al., 2011). Ωστόσο, οι συγκεκριμένοι ερευνητές δεν αποσαφηνίζουν πόσοι, και αν, από τους ασθενείς που μελέτησαν ήταν υπό προφυλακτική θεραπεία, ενώ χρησιμοποίησαν την έκφραση του mrna του FoxP3 και άλλων δεικτών Treg στον πληθυσμό των CD4+ κυττάρων, που όπως έχει δειχθεί, εκφράζονται επίσης από τα δραστικά Τ- κύτταρα και τα Tr1 κύτταρα κατά την ενεργοποίησή τους (Roncarolo and Gregori, 2008). Οι Haas et al. έδειξαν μειωμένη κατασταλτική λειτουργία των CD4+ CD25 high Tregs στους ασθενείς με RRMS κατά την οξεία φάση (Haas et al., 2005). Σε μια μικρή υποομάδα ασθενών που μετέπεσαν σε ύφεση, η κατασταλτική λειτουργία των Tregs εμφάνισε αύξηση, αν και μη στατιστικά σημαντική. Όλες οι άλλες μελέτες αφορούσαν ασθενείς σε ύφεση και δεν υπήρχε σκέλος με ασθενείς σε οξεία φάση ώστε να γίνει μεταξύ 89

90 τους σύγκριση (Bjerg et al., 2012; Huan et al., 2005; Putheti et al., 2004; Venken et al., 2008; Viglietta et al., 2004). Η μειωμένη συχνότητα των ntregs κατά την οξεία φάση της νόσου μπορεί να εξηγηθεί από τη μετανάστευσή τους στα σημεία φλεγμονής στο ΚΝΣ, όπως έχει υποτεθεί από διάφορες μελέτες (Feger et al., 2007a; Fritzsching et al., 2011; Venken et al., 2008). Το εύρημα της αυξημένης συχνότητας των ntregs στους ασθενείς υπό θεραπεία με IFNβ που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας είναι σύμφωνο με τα ευρήματα των περισσότερων μελετών (Aristimuno et al., 2009; Chen et al., 2012; de Andres et al., 2007; Korporal et al., 2008; Namdar et al., 2010; Penton-Rol et al., 2008; Venken et al., 2008). Αντίθετα, η θεραπεία με ναταλιζουμάμπη δεν αποκαθιστά τα επίπεδα των ntregs στα φυσιολογικά, εύρημα που διαπιστώθηκε και από άλλους ερευνητές (Ramos-Cejudo et al., 2011; Stenner et al., 2008). Η μεθυλπρεδνιζολόνη δε διαπιστώθηκε να αυξάνει τα επίπεδα των ntregs συγκριτικά με τους ασθενείς σε οξεία φάση χωρίς θεραπεία, όπως διαπιστώθηκε από άλλους (Navarro et al., 2006; Xu et al., 2009). Στη μελέτη μας δείξαμε, επίσης, ότι μετά την καλλιέργεια με τουλάχιστον ένα από τα αντιγονικά πεπτίδια της MOG ή της MBP, η λειτουργικότητα των ntregs κυμαίνεται σε επίπεδα ίδια με αυτά των υγιών μαρτύρων, ακόμη και στην οξεία φάση της νόσου. Το εύρημα αυτό είναι ενδιαφέρον και μπορεί να υποδηλώνει ότι η έλλειψη κατασταλτικής δράσης των ntregs που είχε παρατηρηθεί σε προηγούμενες μελέτες (Haas et al., 2005; Viglietta et al., 2004) ίσως να οφείλεται στο αντιγονικό ερέθισμα που χρησιμοποιήθηκε στις λειτουργικές δοκιμασίες. Ιδίως οι ασθενείς σε ύφεση χωρίς θεραπεία εμφανίζουν τα μεγαλύτερα ποσοστά κατασταλτικής δράσης στις καλλιέργειες, φαινόμενο που μπορεί να αποδοθεί στην επαναφορά στην κυκλοφορία των ntregs, που είχαν μεταναστεύσει στα σημεία φλεγμονής στο ΚΝΣ κατά την οξεία φάση της νόσου (Feger et al., 2007a; Fritzsching et al., 2011). Μια μελέτη των Schneider- Hohendorf et al., έδειξε ότι τα ntregs των ασθενών με ΠΣ εμφανίζουν μειωμένη μεταναστευτική ικανότητα στο ΚΝΣ σε μη φλεγμονώδεις συνθήκες, ενώ αυτή 90

91 αυξάνεται σημαντικά όταν υπάρχει φλεγμονή και αυξημένη διαπερατότητα του ΑΕΦ, όπως συμβαίνει με την παρουσία IFNγ και TNFα (Schneider-Hohendorf et al., 2010). Εξετάσαμε επίσης τις συχνότητες και άλλων φαινοτύπων των Tregs, που μπορεί να έχουν ρόλο στον έλεγχο αυτοάνοσων αντιδράσεων. Τα CD3+CD4+HLA-G+ και τα CD3+CD8+CD28- (CD8+ Tregs) ήταν αυξημένα κυρίως στους ασθενείς στην οξεία φάση που ελάμβαναν IFN (AP-IFN), ενώ στην ίδια ομάδα τα CD3+CD56+ (NKT κύτταρα) ήταν σημαντικά μειωμένα. Τα HLA-G+ κύτταρα έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως μια νέα υποομάδα, φυσικών, προερχόμενων από το θύμο ρυθμιστικών Τ- κυττάρων, τα οποία έχουν ανιχνευθεί στο αίμα και στα σημεία φλεγμονής, γεγονός που τα καθιστά σημαντικά για τη ρύθμιση των φλεγμονωδών αντιδράσεων (Feger et al., 2007b; Huang et al., 2009). Τα CD8+ Tregs είναι επίσης σημαντικά στη ρύθμιση των φλεγμονωδών αντιδράσεων, και η οξική γλατιραμέρη, ένα άλλο φάρμακο πρώτης γραμμής για τη θεραπεία της RRMS, έχει φανεί ότι βελτιώνει τη λειτουργία τους (Tennakoon et al., 2006). Οι ασθενείς υπό θεραπεία με ναταλιζουμάμπη στη μελέτη μας, παρόλο που είχαν χαμηλότερα επίπεδα ntregs, εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα HLA-G+ και CD8+ Tregs, καθώς και CD56 bright NK κυττάρων, μιας υποομάδας των ΝΚ κυττάρων με κατασταλτική δράση, η έκπτυξη των οποίων έχει προταθεί ως μηχανισμός δράση του μονοκλωνικού αντισώματος έναντι του CD25 (daclizumab), το οποίο αναμένεται να εγκριθεί για τη θεραπεία της RRMS (Bielekova, 2013) Συμπεράσματα Στους ασθενείς με ΠΣ με εξάρσεις και υφέσεις, οι διάφοροι πληθυσμοί των ρυθμιστικών Τ- κυττάρων εμφανίζουν ποικίλη εικόνα ανάλογα με το στάδιο της νόσου και την ακολουθούμενη θεραπεία. Τα επίπεδα των ntregs ήταν χαμηλότερα στην ομάδα των ασθενών στην οξεία φάση με ή χωρίς θεραπεία με μεθυλπρεδνιζολόνη (AP-noRx, AP-MP), αποκαταστάθηκαν ωστόσο σε επίπεδα παρόμοια με αυτά των υγιών μαρτύρων (HC) στους ασθενείς στην οξεία φάση που ελάμβαναν ιντερφερόνη (AP-IFN). Οι ασθενείς σε ύφεση που 91

92 δεν ελάμβαναν θεραπεία (Rem-noRx) είχαν επίπεδα παρόμοια με αυτά των υγιών, ενώ υπό θεραπεία με ναταλιζουμάμπη (Rem-NATA) είχαν επίπεδα ενδιάμεσα μεταξύ αυτών στην οξεία φάση και σε ύφεση χωρίς θεραπεία. Τα ntregs εμφάνισαν κατασταλτική δράση όταν καλλιεργήθηκαν παρουσία ενός τουλάχιστον αντιγονικού πεπτιδίου, διατήρησαν δηλαδή τη λειτουργικότητά τους όταν αναγνώρισαν το συγγενές προς αυτά αντιγόνο. 92

93 4. ΜΕΛΕΤΗ Β ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΠΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ 4.1. Εισαγωγή- Σκοπός της μελέτης Όπως αναφέρθηκε ήδη στο Γενικό Μέρος, πρωταρχικό ρόλο στην έναρξη και διατήρηση της απομυελίνωσης διαδραματίζουν οι πληθυσμοί των Τ- κυττάρων με φλεγμονώδη φαινότυπο, κυρίως τα Th1 και Th17 κύτταρα, ενώ στον αντίποδα βρίσκονται τα ρυθμιστικά Τ- κύτταρα που στόχο έχουν τον περιορισμό της φλεγμονής και την αποκατάσταση της ιστικής καταστροφής που προκαλείται από τα πρώτα (Chen and O'Shea, 2008; Langrish et al., 2005; Sriram and Steiner, 2005; Weissert, 2013; Zamvil and Steinman, 1990; Zozulya and Wiendl, 2008). Τα αυτοαντιδρώντα Τ-κύτταρα δίνουν το έναυσμα για την έναρξη ενός ανοσολογικού καταρράκτη εντός του ΚΝΣ, στον οποίο συμμετέχουν μακροφάγα, Β- κύτταρα, ΝΚ- κύτταρα, κυτταροτοξικά Τ- κύτταρα (CTLs), μικρογλοιακά κύτταρα, με τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή του ελύτρου της μυελίνης και τη συσσώρευση νευρολογικού ελλείμματος (Langrish et al., 2005; Tzartos et al., 2008). Οι ποικίλες δράσεις των κυττάρων αυτών μεσολαβούνται από διαλυτά μόρια, τις κυτταροκίνες, οι οποίες δρουν είτε τοπικά σε γειτονικά κύτταρα, είτε σε απομακρυσμένα σημεία του οργανισμού. Οι κυτταροκίνες εκκρίνονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού και εν πολλοίς οι δράσεις τους στα κύτταρα- στόχους χαρακτηρίζονται από τα κύτταρα που τις εκκρίνουν. Έτσι, διακρίνουμε τις κυτταροκίνες με φλεγμονώδεις δράσεις, όπως οι IFNγ, TNFα (Th1 κύτταρα), IL-17 (Th17), IL-2 (Th0/ Th1), IL-6 (φυσική και επίκτητη ανοσία), και τις κυτταροκίνες με αντιφλεγμονώδεις δράσεις, όπως οι IL-4 (Th2), IL-10 (Tr1), TGFβ (Th3) (Gonsette, 2012). Η ποσοτική μέτρηση αυτών των κυτταροκινών στα βιολογικά υγρά μπορεί να δώσει μια έμμεση 93

94 εικόνα της ενεργοποίησης των κυττάρων του ανοσοποιητικού και επομένως του σχετικού ρόλου που διαδραματίζουν τα κύτταρα αυτά στις διάφορες φάσεις μιας ανοσομεσολαβούμενης νόσου όπως η ΠΣ. Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι πανταχού παρόν στον οργανισμό και εκτός από την άμυνα έναντι ξένων εισβολέων, όπως τα μικρόβια, είναι επίσης υπεύθυνο για την ανοσολογική επιτήρηση σε περιπτώσεις ιστικής βλάβης, υπερβολικής αντίδρασης σε αντιγόνα και νεοπλασιών. Η ΠΣ είναι μια φλεγμονώδης νόσος του ΚΝΣ η οποία πρέπει να διαφοροδιαγνωστεί από άλλες παθήσεις του ΚΝΣ, φλεγμονώδεις ή μη, πριν τεθεί η διάγνωση (Miller et al., 2008). Μία από τις εργαστηριακές μεθόδους που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη διαδικασία είναι και η ανάλυση του ΕΝΥ για ανεύρεση ολιγοκλωνικών δεσμών ή αυξημένου δείκτη IgG (IgG index), εύρημα που έχει σχετικά υψηλή ευαισθησία για την ΠΣ, αλλά χαμηλότερη ειδικότητα, μιας και απαντάται σε πολλές άλλες παθήσεις του ΚΝΣ, φλεγμονώδεις, λοιμώδεις ή δομικές (Awad et al., 2010). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αναλυθεί ο ορός και το ΕΝΥ ασθενών με ΠΣ και μαρτύρων με διάφορες παθήσεις του νευρικού συστήματος, φλεγμονώδεις και μη φλεγμονώδεις, καθώς και συμπτωματικών μαρτύρων χωρίς κάποια συγκεκριμένη διάγνωση, για να εξεταστεί η παρουσία των διαφόρων φλεγμονωδών και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών. Απώτερος στόχος ήταν να διαπιστωθεί εάν υπάρχει κάποιο πρότυπο έκφρασης των κυτταροκινών που να διαφοροποιεί την ΠΣ από τις άλλες νευρολογικές παθήσεις, γεγονός που θα μπορούσε να έχει προεκτάσεις για την αποσαφήνιση της παθογένεσης και τη διαφοροδιάγνωση της νόσου, καθώς και στη θεραπεία της Υλικό και Μέθοδοι Ασθενείς με ΠΣ (RRMS) και μάρτυρες με νευρολογικές παθήσεις Συνολικά περιλήφθηκαν στη μελέτη 46 ασθενείς (27 γυναίκες, μέση ηλικία έτη), οι οποίοι νοσηλεύθηκαν στη Νευρολογική Κλινική με συμπτώματα υποδηλωτικά ΠΣ, και στους 94

95 οποίους τέθηκε τελικά η διάγνωση της RRMS, σύμφωνα με τα αναθεωρημένα διαγνωστικά κριτήρια του McDonald (Polman et al., 2005). Υποβλήθηκαν όλοι σε εκτενή παρακλινικό έλεγχο, που περιλάμβανε MRI εγκεφάλου και νωτιαίου μυελού, οσφυονωτιαία παρακέντηση (ΟΝΠ) και ανάλυση του ΕΝΥ για υπολογισμό του IgG index και/ ή ανίχνευση ολιγοκλωνικών δεσμών (OCB), οπτικά προκλητά δυναμικά (ΟΠΔ) και ορολογικές εξετάσεις για τον αποκλεισμό άλλων διαγνώσεων που θα μπορούσαν να εξηγήσουν τα συμπτώματα των ασθενών (π.χ. συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, σαρκοείδωση, αγγειΐτιδα, ιογενείς λοιμώξεις, ανεπάρκεια βιταμίνης Β 12, κ.α.). Τα κριτήρια αποκλεισμού περιλάμβαναν διαγνώσεις άλλες πλην της ΠΣ, οποιαδήποτε ενεργό λοίμωξη ή φλεγμονή και τρέχουσα ή πρόσφατη χρήση ανοσοκατασταλτικών ή ανοσοτροποποιητικών φαρμάκων. Ελήφθη λεπτομερές ιστορικό, προκειμένου να συλλεγούν δεδομένα σχετικά με τη διάρκεια της νόσου, άλλα συμπτώματα στο παρελθόν υποδηλωτικά ΠΣ, το οικογενειακό ιστορικό και άλλες παθήσεις. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε λεπτομερή νευρολογική εξέταση και υπολογίστηκε η βαθμολογία τους με βάση την κλίμακα Expanded Disability Status Scale (EDSS) του Kurtzke (Kurtzke, 1983) στην οξεία φάση. Οι ασθενείς με ΠΣ που επιλέχθηκαν τελικά για εισαγωγή στη μελέτη είχαν πρόσφατη έναρξη νόσου (πρώτα συμπτώματα υποδηλωτικά της νόσου τους τελευταίους 2 μήνες) (Πίνακας 4.1). Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε MRI εγκεφάλου και νωτιαίου μυελού και υπολογίστηκε ο συνολικός αριθμός των αυξημένου σήματος εστιών στις Τ2 ακολουθίες, των υπόπυκνων εστιών στις Τ1 ακολουθίες (μαύρες οπές) και ο αριθμός των ενεργών βλαβών που προσλάμβαναν γαδολίνιο (Gd). Στη μελέτη περιλήφθηκαν 60 μάρτυρες (35 γυναίκες, μέση ηλικία έτη). Όλοι οι μάρτυρες υποβλήθηκαν επίσης σε νευροαπεικονιστικές εξετάσεις, ΟΝΠ και άλλες εξετάσεις προκειμένου να τεθεί η διάγνωση. Οι μάρτυρες χωρίστηκαν σε 3 ομάδες, ανάλογα με τη διάγνωση που έλαβαν. Η πρώτη ομάδα περιλάμβανε ασθενείς (n= 36) με μη φλεγμονώδεις παθήσεις του νευρικού συστήματος (Non- Inflammatory Neurological Disease- NIND), η 95

96 δεύτερη ασθενείς (n= 11) με φλεγμονώδεις παθήσεις του νευρικού συστήματος (Inflammatory Neurological Disease- IND), ενώ η τρίτη ομάδα (n= 13) περιλάμβανε συμπτωματικούς μάρτυρες (Symptomatic Controls- SC), στους οποίους δεν τέθηκε κάποια διάγνωση. Οι ορισμοί που χρησιμοποιήθηκαν για τις ομάδες των μαρτύρων είναι πλήρως εναρμονισμένοι με τους ορισμούς που συμφωνήθηκαν από το δίκτυο ειδικών για την ΠΣ BioMS-eu και δημοσιεύθηκαν πρόσφατα στο περιοδικό Multiple Sclerosis (Teunissen et al., 2013). Οι συμπτωματικοί μάρτυρες είχαν συμπτώματα όπως ίλιγγο, κεφαλαλγία τύπου τάσεως, διαταραχές όρασης, κατάθλιψη, άγχος, και κανένα εύρημα από τη νευρολογική εξέταση ή τις απεικονιστικές ή εργαστηριακές εξετάσεις δεν έδειξε κάποια παθολογική διεργασία. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των ομάδων μαρτύρων παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.1, ενώ οι διαγνώσεις των NIND και IND μαρτύρων στον Πίνακα 4.2. Όλοι οι ασθενείς και οι μάρτυρες υπέγραψαν έντυπο ενημερωμένης συγκατάθεσης πριν την έναταξή τους στο πρωτόκολλο της μελέτης. Το πρωτόκολλο της μελέτης έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας και το Επιστημονικό Συμβούλιο του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών Μέτρηση κυτταροκινών στα βιολογικά δείγματα Αίμα και ΕΝΥ συλλέχθηκαν από τους ασθενείς και τους μάρτυρες, φυγοκεντρήθηκαν και ο ορός και το ΕΝΥ αποθηκεύτηκαν σε καταψύκτη σε θερμοκρασία -60 ο C μέχρι την ημέρα της ανάλυσης. Οι κυτταροκίνες που αναλύθηκαν περιλάμβαναν τις IFN-γ, TNF-α, TGF-β1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 και IL-17A. Η ανάλυση των κυτταροκινών έγινε με τη χρήση μικροσφαιριδίων σημασμένων με αντισώματα έναντι των αντίστοιχων κυτταροκινών. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Cytometric Bead Assay Human Th1/ Th2/ Th17 (BD Biosciences, San Diego, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και οι αναλύσεις έγιναν στον κυτταρομετρητή BD FACSArray Bioanalyzer. Η συγκέντρωση του TGF-β1 προσδιορίστηκε 96

97 με ενζυμική ανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA- R&D Systems Quantikine TM, Minneapolis, MN, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και τα δεδομένα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα CurveExpert V Αναλογίες Κυτταροκινών στον Ορό και στο ΕΝΥ Οι κυτταροκίνες χαρακτηρίστηκαν ως φλεγμονώδεις και αντιφλεγμονώδεις καθώς και ως προς τον τύπο των Th κυττάρων που αποτελούν την κύρια πηγή τους. Οι Τύπου 1 (Type 1) κυτταροκίνες περιλάμβαναν τις φλεγμονώδεις (IFNγ, TNFα, IL-2, IL-6 και IL-17A) και οι Τύπου 2 (Type 2) τις αντιφλεγμονώδεις (IL-4, IL-10, TGFβ1). Οι αναλογίες των κυτταροκινών που μετρήθηκαν ήταν οι: Th1/ Th2, Th1/ Th17, Th17/ Th2, Type 1/ Type 2, IFNγ/ IL-10 και IL-17A/ IL-10 (Πίνακας 4.3) Στατιστική Ανάλυση Οι κυτταροκίνες στον ορό και στο ΕΝΥ καθώς και οι αναλογίες των κυτταροκινών μεταξύ των τεσσάρων ομάδων συγκρίθηκαν με τη μη παραμετρική δοκιμασία Kruskal- Wallis. Όταν η συνολική διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική, οι ανά δύο ομάδες μεταβλητές συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία Mann- Whitney ενώ εφαρμόστηκε και διόρθωση κατά Bonferroni. Οι συσχετίσεις μεταξύ των μεταβλητών έγιναν με τη δοκιμασία Spearman r. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν το p ήταν Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα GraphPad Prism v.5.03 (San Diego, CA, USA). 97

98 Πίνακας 4.1. Δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων Ασθενείς N (Γ/ Α)) Ηλικία EDSS ΠΣ (RRMS) 46 (27/ 19) ± ±1.04 Μάρτυρες 60 (35/ 25) ± ΔΕ NIND 36 (23/ 13) ±12.06 ΔΕ IND 11 (6/ 5) ±12.15 ΔΕ SC 13 (6/ 7) ±9.01 ΔΕ Οι τιμές για την ηλικία, τη διάρκεια νόσου και την EDSS παρέχονται ως μέσος όρος ± SD. Α= άνδρες, Γ= γυναίκες, N= αριθμός, ΔΕ= δεν εφαρμόζει. Πίνακας 4.2. Διαγνώσεις των ασθενών με μη φλεγμονώδη (NIND) και με φλεγμονώδεις (IND) νευρολογικές παθήσεις NIND IND Διάγνωση n Διάγνωση n Ισχαιμική νόσος (βοθρυωτά, εμβολικά έμφρακτα) 14 Ιογενής μυελίτιδα 4 Ημικρανία 12 Ιογενής εγκεφαλίτιδα 3 Ιδιοπαθής ενδοκράνια υπέρταση 3 Πολλαπλή ριζονευρίτιδα 3 Περιφερική νευροπάθεια 3 CIDP 1 Επιληψία (ιδιοπαθής) 2 Χορεία 1 Κύστη γέφυρας 1 Σύνολο 36 Σύνολο 11 CIDP= Χρόνια Φλεγμονώδης Απομυελινωτική Πολυρριζονευροπάθεια. 98

99 Πίνακας 4.3. Κυτταροκίνες και αναλογίες κυτταροκινών που μετρήθηκαν στους ασθενείς με ΠΣ και στους μάρτυρες Μετρήσεις (στον ορό και στο ΕΝΥ) Κυτταροκίνες Th1/ Th2 Th1/ Th17 Th17/ Th2 Type 1/ Type 2 IFNγ, TNFα, TGFβ1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 και IL-17A [IFNγ + TNFα]/ IL-4 [IFNγ + TNFα]/ IL-17A IL17A/ IL-4 [IL-2 + IFNγ + TNFα + IL-17A + IL-6]/ [IL-4 + IL-10 + logtgfβ1] Άλλες αναλογίες IFNγ/ IL-10, IL17A/ IL Αποτελέσματα Κυτταροκίνες στον ορό και στο ΕΝΥ Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις κυτταροκινών στον ορό παρατηρήθηκαν στους ασθενείς της ομάδας IND. Οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές για την IFNγ, την IL-17A και την IL-4 έναντι των ασθενών με ΠΣ και των άλλων δύο ομάδων μαρτύρων (NIND και SC), για την IL- 6 έναντι των ασθενών με ΠΣ και των NIND και για τον TNFα και TGFβ1 έναντι των ασθενών με ΠΣ και των NIND μαρτύρων, αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις των IL-2 και IL-10 ήταν επίσης υψηλότερες στην ομάδα των IND, αλλά οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Πίνακας 4.4 και Εικόνα 4.1). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι ασθενείς με ΠΣ εμφάνισαν τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις σχεδόν σε όλες τις κυτταροκίνες που μετρήθηκαν, τόσο φλεγμονώδεις όσο και αντιφλεγμονώδεις, συγκριτικά με όλες τις ομάδες των μαρτύρων. Στο ΕΝΥ οι διαφορές ήταν περισσότερο ποικίλες, με τις περισσότερες να μην είναι στατιστικά σημαντικές. Η IL-2 ήταν χαμηλότερη στους ασθενείς με ΠΣ συγκριτικά με τους SC, οι οποίοι είχαν τη χαμηλότερη IL-10 σε σχέση με τους NIND, ενώ οι IND είχαν τον 99

100 υψηλότερο TGFβ1 συγκριτικά με τους ασθενείς με ΠΣ και τους SC (Πίνακας 4.4 και Εικόνα 4.2) Αναλογίες κυτταροκινών στον ορό και στο ΕΝΥ Στον ορό η αναλογία Th1/ Th2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με ΠΣ συγκριτικά με όλες τις ομάδες των μαρτύρων. Η αναλογία Th1/ Th17 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα των NIND συγκριτικά με τους ασθενείς με ΠΣ και τους IND, αλλά όχι με τους SC. Η αναλογία Type 1/ Type 2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με ΠΣ απ ότι στους IND, αλλά η διαφορά με τους NIND και SC μάρτυρες δεν ήταν στατιστικά σημαντκή (Πίνακας 4.5 και Εικόνα 4.3). Η αναλογία Th17/ Th2 ήταν χαμηλότερη στους ασθενείς με ΠΣ συγκριτικά με όλες τις άλλες ομάδες, οι διαφορές όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Η αναλογία IFNγ/ IL-10 ήταν χαμηλότερη στους ασθενείς με ΠΣ απ ότι στους IND και η αναλογία IL-17A/ IL-10 ήταν υψηλότερη στους IND συγκριτικά με όλες τις άλλες ομάδες (Πίνακας 4.5 και Εικόνα 4.3). Στο ΕΝΥ οι αναλογίες Th1/ Th2, Th1/ Th17, Type 1/ Type 2, Th17/ Th2 και IL-17A/ IL-10 δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. Η αναλογία IFNγ/ IL-10 ήταν υψηλότερη στους SC μάρτυρες απ ότι στους ασθενείς με ΠΣ και στους IND μάρτυρες (Πίνακας 4.5 και Εικόνα 4.4) IgG index και συσχετίσεις με τις κυτταροκίνες Οι ασθενείς με ΠΣ είχαν τις υψηλότερες τιμές του IgG index (Εικόνα 4.5) συγκριτικά με όλες τις άλλες ομάδες. Στη μελέτη μας ο θετικός IgG index (> 0.660) είχε μια ευαισθησία 75% και ειδικότητα 95% για τη διάγνωση της ΠΣ. Ο IgG index εμφάνισε καλή συσχέτιση με την IL-4 του ΕΝΥ των ασθενών με ΠΣ (r= 0.50, p= ). Δεν παρατηρήθηκαν συσχετίσεις του IgG index με οποιαδήποτε άλλη κυτταροκίνη ή αναλογία κυτταροκινών στον ορό και στο ΕΝΥ, με εξαίρεση την αναλογία Th1/ Th17 στο ΕΝΥ των SC (Πίνακες 4.6 και 4.7). 100

101 Πίνακας 4.4. Μετρήσεις κυτταροκινών στον ορό και στο ΕΝΥ των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων Ομάδα Κυτταροκίνες ορού IFNγ TNFα IL-2 IL-6 IL-17A IL-4 IL-10 TGFβ1 ΠΣ (n= 46) 6.02 ± ± ± ± ± ± ± ± NIND (n= 36) 9.50 ± ± ± ± ± ± ± ± 6005 IND (n= 11) ± ± ± ± ± ± ± ± SC (n= 13) 8.33 ± ± ± ± ± ± ± ± Κυτταροκίνες ΕΝΥ ΠΣ (n= 46) 5.67 ± ± ± ± ± ± ± ± NIND (n= 36) 8.70 ± ± ± ± ± ± ± ± IND (n= 11) 5.07 ± ± ± ± ± ± ± ± SC (n= 13) 6.92 ± ± ± ± ± ± ± ± Οι τιμές των μετρήσεων παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, σε pg/ml. 101

102 Πίνακας 4.5. Αναλογίες κυτταροκινών στον ορό και στο ΕΝΥ των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων Ομάδα Ορός Th1/ Th2 Th1/ Th17 Type 1/ Type 2 Th17/ Th2 IFNγ/ IL-10 IL-17A/ IL-10 ΠΣ (n= 46) 2.05 ± ± ± ± ± ± 2.05 NIND (n= 36) 3.64 ± ± ± ± ± ± 2.38 IND (n= 11) 3.69 ± ± ± ± ± ± 6.61 HC (n= 13) 2.84 ± ± ± ± ± ± 2.26 ΕΝΥ Th1/ Th2 Th1/ Th17 Type 1/ Type 2 Th17/ Th2 IFNγ/ IL-10 IL-17A/ IL-10 ΠΣ (n= 46) 2.50 ± ± ± ± ± ±4.07 NIND (n= 36) 3.02 ± ± ± ± ± ± 3.07 IND (n= 11) 1.65 ± ± ± ± ± ± 8.34 HC (n= 13) 3.24 ± ± ± ± ± ± 3.47 Οι τιμές των μετρήσεων παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. 102

103 IgG index Πίνακας 4.6. Συσχετίσεις μεταξύ IgG index και κυτταροκινών στον ορό και στο ΕΝΥ των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων Κυτταροκίνες IFNγ TNFα IL-2 IL-6 IL-17A IL-4 IL-10 TGFβ1 ΠΣ Ορός (0.98) (0.64) 0.30 (0.07) 0.21 (0.17) (0.69) (0.68) (0.99) (0.26) ΕΝΥ 0.01 (0.96) 0.25 (0.23) (0.28) 0.08 (0.59) (0.98) 0.50 (0.0004) (0.50) 0.02 (0.90) NIND Ορός 0.11 (0.53) 0.28 (0.12) (0.30) 0.07 (0.71) (0.90) (0.23) (0.91) 0.01 (0.95) ΕΝΥ 0.06 (0.71) (0.71) 0.17 (0.35) 0.05 (0.75) (0.20) 0.22 (0.24) 0.26 (0.16) 0.01 (0.95) IND Ορός 0.28 (0.55) 0.42 (0.35) 0.75 (0.06) 0.0 (1.0) 0.57 (0.20) 0.75 (0.06) 0.53 (0.23) 0.65 (0.17) ΕΝΥ 0.21 (0.66) 0.0 (1.0) (0.20) (0.83) 0.13 (0.78) (0.27) (0.56) 0.20 (0.78) SC Ορός (0.89) (0.59) (0.08) (0.36) (0.17) 0.01 (0.95) (0.09) 0.15 (0.70) ΕΝΥ (0.90) 0.13 (0.68) (0.90) (0.35) 0.36 (0.26) 0.43 (0.18) (0.61) 0.06 (0.86) Τιμές Spearman r (p) 103

104 IgG index Πίνακας 4.7. Συσχετίσεις μεταξύ IgG index και αναλογιών κυτταροκινών στον ορό και στο ΕΝΥ των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων Αναλογίες κυτταροκινών Th1/ Th2 Th1/ Th17 Type 1/ Type 2 Th17/ Th2 IFNγ/ IL-10 IL-17A/ IL-10 ΠΣ Ορός (0.72) 0.11 (0.46) (0.88) (0.45) 0.09 (0.95) (0.31) ΕΝΥ (0.10) (0.62) 0.24 (0.12) 0.20 (0.18) (0.75) 0.12 (0.40) NIND Ορός 0.20 (0.28) 0.09 (0.61) 0.18 (0.33) 0.09 (0.63) 0.20 (0.28) (0.59) ΕΝΥ 0.09 (0.96) 0.28 (0.13) 0.04 (0.81) (0.46) (0.41) (0.75) IND Ορός (0.23) (0.56) (0.26) 0.03 (0.96) (0.16) 0.03 (0.96) ΕΝΥ (0.96) (0.90) 0.0 (1.0) 0.29 (0.49) 0.66 (0.10) 0.29 (0.49) SC Ορός 0.10 (0.75) 0.0 (1.0) (0.59) (0.29) 0.31 (0.34) 0.02 (0.93) ΕΝΥ (0.80) (0.01) 0.13 (0.68) 0.30 (0.36) (0.26) 0.49 (0.12) Τιμές Spearman r (p) 104

105 Εικόνα 4.1. Συγκεντρώσεις στον ορό (σε pg/ ml) των διαφόρων κυτταροκινών. Α. IFNγ Β. TNFα C. IL-2 D. IL-6 E. IL-17A F. IL-4 G. IL-10 H. TGFβ1. Οι στήλες αντιστοιχούν στο μέσο όρο ± SE. *p< 0.01, **p< 0.001, ***p<

106 Εικόνα 4.2. Συγκεντρώσεις στο ENY (σε pg/ ml) των διαφόρων κυτταροκινών. Α. IFNγ Β. TNFα C. IL-2 D. IL-6 E. IL-17A F. IL-4 G. IL-10 H. TGFβ1. Οι στήλες αντιστοιχούν στο μέσο όρο ± SE. *p< 0.01, **p<

107 Εικόνα 4.3. Αναλογίες κυτταροκινών στον ορό των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων. A. Th1/ Th2, B. Th1/ Th17, C. Type 1/ Type 2, D. Th17/ Th2, E. IFN-γ/ IL-10, F. IL-17A/ IL-10. Οι στήλες αντιστοιχούν στο μέσο όρο ± SE. *p <0.01, **p<

108 Εικόνα 4.4. Αναλογίες κυτταροκινών στο ΕΝΥ των ασθενών με ΠΣ και των μαρτύρων. A. Th1/ Th2, B. Th1/ Th17, C. Type 1/ Type 2, D. Th17/ Th2, E. IFN-γ/ IL-10, F. IL-17A/ IL-10. Οι στήλες αντιστοιχούν στο μέσο όρο ± SE. *p <

109 Εικόνα 4.5. Μέσος όρος του IgG index (± SE) στους ασθενείς με ΠΣ και στους μάρτυρες. *p= 0.01, ***p= Συζήτηση Από τότε που τα Τ- κύτταρα διακρίθηκαν σε δύο υποομάδες, τα Th1, που εκκρίνουν IFNγ και TNFα, και τα Th2, που εκκρίνουν IL-4 (Mosmann and Coffman, 1989), ο παθογενετικός ρόλος στην ΠΣ αποδόθηκε στα Th1 κύτταρα. Η αντίληψη αυτή υποστηρίχθηκε από τα πειραματικά δεδομένα στο ζωικό μοντέλο της ΠΣ, την Πειραματική Αλλεργική Εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ), μια νόσο που αρχικά θεωρούταν ως Th1 επαγόμενη, στην οποία η νόσος μεταδίδεται σε υγιή ποντίκια με ευαισθητοποίηση με πρωτεΐνες της μυελίνης ή με μεταφορά αυτοαντιδρώντων Τ- κυττάρων. Το πρότυπο αυτό, ωστόσο, αμφισβητήθηκε στη συνέχεια με την ανακάλυψη ότι τα Th1 κύτταρα δεν είναι απαραίτητα για την πρόκληση ΠΑΕ, αλλά ότι μία άλλη υποομάδα CD4+ T- κυττάρων, που παράγουν IL-17 είναι σε θέση να επάγουν ΠAE σε ποντίκια στα οποία έχει διαγραφεί η IL-12 (Langrish et al., 2005), ένα εύρημα που επιβεβαιώθηκε και σε άλλες μελέτες (Komiyama et al., 2006; Lees et al., 2008). Ο ρόλος αυτής της νέας υποομάδας CD4+ T- κυττάρων, που ονομάστηκαν Th17, στην 109