Η ΑΛΗΘΙΝΗ ΚΑΙ Η ΕΙΚΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΑ ΒΗΜΑ ΠΡΟΣ ΒΗΜΑ

Transcript

1 Η ΑΛΗΘΙΝΗ ΚΑΙ Η ΕΙΚΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΑ ΒΗΜΑ ΠΡΟΣ ΒΗΜΑ DNA μικροσυστοιχίες: βήμα προς βήμα Παραγωγή DNA ανιχνευτών Οι επιστήμονες μπορούν να παράγουν «σπιτικές» μικροσυστοιχίες χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (βλ. σχέδιο) που δημιουργεί χιλιάδες μικρά κομμάτια DNA με τη μορφή της διπλής έλικας ή, εάν γνωρίζουν τη νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός γονιδίου, μπορούν να ζητήσουν από μια εταιρεία να δημιουργήσει μονόκλωνες αλυσίδες νουκλεοτιδίων με την ίδια αλληλουχία. Εκτύπωση Οι μικροσυστοιχίες DNA είναι πολύ μικρές και μπορούν να φτιαχτούν στο εργαστήριο χρησιμοποιώντας γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, όπως αυτές που χρησιμοποιούνται στη μικροσκοπία. Όπως μπορείτε να φανταστείτε, η εκτύπωση μικροσκοπικών κουκίδων DNA (κάθε κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο) σε μια τόσο μικρή επιφάνεια είναι μια δύσκολη δουλειά. Όχι μόνο πρέπει οι κουκίδες να έχουν το ίδιο σχήμα, αλλά θα πρέπει να ισαπέχουν από τις άλλες. Αυτά τα προβλήματα έχουν λυθεί με τη ρομποτική. Η εικονική μικροσυστοιχία: βήμα προς βήμα Το χαλί Μπορείτε είτε να δημιουργήσετε το δικό σας ειδικό χαλί, ή να γράψετε στο για να παραγγείλετε μια ειδική έκδοση («lite version») του χαλιού (1 x 2.5 m) με κόστος 40 Ευρώ (μη συμπεριλαμβανομένου του κόστους αποστολής). Εκτύπωση Στην εικονική μικροσυστοιχία, ένα χαλί αντιπροσωπεύει την αντικειμενοφόρο πλάκα με μια συστοιχία 10 κουκίδων που περιέχουν μονόκλωνο DNA με αλληλουχίες από 10 γονίδια: alexander fleming, jacques monod, thomas morgan, barbara mcclintock, leo szilárd, john kendrew, francis crick, rosalind franklin, maurice wilkins, james watson. Τα μόρια του DNA αντιπροσωπεύονται με Velcro διαφορετικών χρωμάτων π.χ. για το γονίδιο alexander fleming υπάρχει το μπλε χρώμα. Θα πρέπει να κολλήσετε το δικό σας Velcro στους κύκλους. Ένας ρομποτικός βραχίονας καθοδηγεί ένα ειδικό σετ 48 ακίδων (τριχοειδή) σε μικρές δεξαμενές που περιέχουν τους ανιχνευτές DNA που θα εκτυπωθούν στις πλάκες (επειδή οι ακίδες είναι πολύ ευαίσθητες και υπερβολικά ακριβές, το μηχάνημα είναι εξοπλισμένο μόνο με 48, οι οποίες

2 χρησιμοποιούνται ξανά και ξανά). Ο βραχίονας βυθίζει τις ακίδες στα δείγματα, τις αφαιρεί και τις μεταφέρει πάνω σε μια σειρά από πλάκες, οι οποίες έχουν κατάλληλα επεξεργαστεί. Στη συνέχεια πιέζει τις ακίδες μαλακά προς τα κάτω για λιγότερο από ένα δευτερόλεπτο, εκτυπώνοντας 200 μl DNA από κάθε ακίδα στην επιφάνεια. Όταν εκτυπωθεί η πρώτη γραμμή κουκίδων, ο βραχίονας μετακινείται στην επόμενη πλάκα κ.ο.κ., μέχρι όλες οι πλάκες αποκτήσουν μια αντίστοιχη σειρά κουκίδων. Στο τέλος της σειράς, ο βραχίονας καθαρίζει τις ακίδες, τις βουτά σε μια καινούργια σειρά δειγμάτων, επιστρέφει στην πρώτη πλάκα, και εκτυπώνει μια νέα σειρά. Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται ξανά και ξανά μέχρι να δημιουργηθεί μια σειρά πλακών οι οποίες έχουν μια «μικροσυστοιχία» κουκίδων. Μετά την εκτύπωση οι πλάκες θερμαίνονται για να μονιμοποιηθεί το DNA. Απομόνωση του mrna Για ένα πείραμα με μικροσυστοιχίες, οι επιστήμονες πρέπει απομονώσουν πρώτα το mrna από τα κύτταρα που θέλουν να μελετήσουν. Αυτή η διαδικασία είναι σχετικά εύκολο να πραγματοποιηθεί. Για κάθε πείραμα, απαιτείται mrna από δυο διαφορετικά είδη κυττάρων: από κύτταρα «ελέγχου» και κύτταρα προς μελέτη. Για παράδειγμα, εάν ενδιαφέρεστε να μελετήσετε καρκινικά κύτταρα, θα απομονώνατε mrna από κανονικά (μη καρκινικά) κύτταρα ως κύτταρα «ελέγχου» και mrna από καρκινικά κύτταρα από τον ίδιο ιστό. Μετά την απομόνωση, τα μόρια mrna πρέπει να σημανθούν με φθορίζουσες χρωστικές 1 ώστε να ανιχνευτούν αργότερα στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας. mrna από τα κύτταρα «ελέγχου» σημαίνεται με πράσινη φθορίζουσα χρωστική και mrna των κυττάρων υπό μελέτη με κόκκινη φθορίζουσα χρωστική. Απομόνωση του mrna Το mrna αντιπροσωπεύεται από έναν αριθμό μικρών φακών. Κάθε φακός αντιπροσωπεύει μια μονόκλωνη αλυσίδα mrna από ένα συγκεκριμένο γονίδιο (μπλε velcro για το γονίδιο alexander fleming) και κάθε φακός έχει ένα καρτελάκι ονόματος. Ο ακριβής αριθμός και τα ονόματα των φακών θα συζητηθούν αργότερα. Για την ώρα, είναι αρκετό να γνωρίζετε ότι υπάρχουν φακοί που αντιστοιχούν σε mrna από τα κύτταρα ελέγχου και από τα κύτταρα προς μελέτη. Οι φακοί πρέπει να σημανθούν με πράσινη και κόκκινη διάφανη αυτοκόλλητη ταινία, που αντιπροσωπεύει τα σημασμένα mrna από τους αντίστοιχους κυτταρικούς τύπους: κόκκινο που υποδηλώνει mrna από καρκινικά κύτταρα και πράσινο από κανονικά κύτταρα (κύτταρα «ελέγχου»). 1 Σημειώστε ότι οι χρωστικές δεν είναι ορατές κάτω από φυσιολογικό φωτισμό.

3 Υβριδοποίηση Σε αυτό το βήμα, το mrna ελέγχου (σημασμένο πράσινο) αναμιγνύεται με το mrna προς μελέτη (σημασμένο κόκκινο). To μίγμα εφαρμόζεται την επιφάνεια της αντικειμενοφόρου, η οποία επωάζεται στους 42 C, ώστε οι μονόκλωνες αλυσίδες του mrna στο μίγμα υβριδοποιηθούν με το συμπληρωματικό DNA στη μικροσυστοιχία. Μετά από 12 ώρες, η μικροσυστοιχία πλένεται ώστε να αφαιρεθούν τα μόρια mrna που δεν έχουν βρει το συμπληρωματικό τους στόχο. Η μικροσυστοιχία είναι τώρα έτοιμη για σάρωση-διάβασμα. Υβριδοποίηση Έφτασε η ώρα να υβριδοποιηθούν τα σημασμένα mrnas (φακοί) με τους DNA ανιχνευτές (κύκλοι). Η μικροσυστοιχία πλημμυρίζεται με το μίγμα mrna (φακοί) αλλά μόνο αυτοί οι φακοί που έχουν το κατάλληλα χρωματισμένο velcro θα υβριδοποιηθούν με το συμπληρωματικό μονόκλωνο DNA στη μικροσυστοιχία (χαλί), π.χ. φακοί με κόκκινο velcro θα υβριδοποιηθούν με κόκκινο velcro στη μικροσυστοιχία, κίτρινο με κίτρινο κλπ. Φακοί που περιέχουν χρωματισμένο velcro το οποίο δεν βρίσκεται στο χαλί δεν θα κολλήσουν. Πολλαπλά χρωματισμένο velcro στους φακούς αντιπροσωπεύει μια περίπτωση κατά την οποία μόνο ένα μικρό μέρος της αλληλουχίας του mrna είναι συμπληρωματικό με το DNA και η υβριδοποίηση είναι ασθενής. Κατά τη διάρκεια του βήματος του πλυσίματος, ασθενώς κολλημένα μόρια mrna απομακρύνονται.

4 Τώρα, κολλήστε τους φακούς στο κατάλληλο Velcro στους κύκλους της μικροσυστοιχίας. Οι φακοί θα πρέπει να είναι σβησμένοι σε αυτό το σημείο.

5 Σάρωση/διάβασμα της μικροσυστοιχίας η δημιουργία μιας εικόνας Τώρα είναι ώρα να κοιτάξουμε τα αποτελέσματα του πειράματος, για να δούμε ποιο mrna έχει υβριδοποιηθεί σε ποιο στόχο. Αυτό γίνεται με έναν ειδικό σαρωτή laser, ο οποίος δουλεύει περίπου με τον ίδιο τρόπο που δουλεύει ο σαρωτής ενός ηλεκτρονικού υπολογιστή. Το laser σαρώνει την πλάκα και δημιουργεί μια εικόνα όμοια με αυτή στη φωτογραφία. Σάρωση/διάβασμα της μικροσυστοιχίας η δημιουργία μιας εικόνας Για να σαρώσετε την εικονική μικροσυστοιχία, ανάψτε τους φακούς που βρίσκονται στο χαλί και προσέξτε να μην τους μετακινήσετε. Σβήστε τα φώτα στο δωμάτιο και κοιτάξτε τη μικροσυστοιχία. Ελέγξτε τη μικροσυστοιχία κουκίδα προς κουκίδα (κύκλο προς κύκλο). Τι μπορείτε να πείτε σχετικά με το χρώμα και την ένταση των κύκλων; Προσέξτε, όμως, διότι στην εικονική μικροσυστοιχία δεν είναι δυνατόν να αναπαραγετε κίτρινες κουκίδες. Εντούτοις, κόκκινες και πράσινες κουκίδες θα πρέπει να φαίνονται. Σημειώστε τον αριθμό των κόκκινων και πράσινων κουκίδων για κάθε γονίδιο. Οι αριθμοί θα χρησιμεύσουν αργότερα για την ανάλυση. Αλλά για μια στιγμή! Δεν υπάρχουν μόνο κόκκινες και πράσινες κουκίδες αλλά και κίτρινες και πορτοκαλί επίσης! Αυτό μπορεί να εξηγηθεί εύκολα. Είναι φανερό ότι οι κόκκινες κουκίδες περιέχουν mrna από καρκινικό κύτταρο και πράσινες κουκίδες mrna από μη καρκινικά κύτταρα «ελέγχου». Αλλά τι συμβαίνει όταν ισόποσα μόρια mrna από κυτταρικές σειρές ελέγχου και καρκινικές σειρές υβριδοποιηθούν με το ίδιο DNA στόχο; Τα πράσινα και τα κόκκινα σήματα θα συνδυαστούν και θα δώσουν κίτρινο! Θυμηθείτε ότι mrnα υβριδοποιείται με το συμπληρωματικό του DNA και μια κουκίδα (DNA) στη μικροσυστοιχία αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο. Με άλλα λόγια, όταν μια κουκίδα είναι κίτρινη, υπάρχουν ίσες ποσότητες mrna του γονιδίου σε καρκινικά και κύτταρα «ελέγχου». Εάν μια κουκίδα είναι πορτοκαλί, αυτό σημαίνει ότι υπάρχει περισσότερο mrna από το γονίδιο σε καρκινικά κύτταρα από ότι σε κύτταρα «ελέγχου». Και μαύρο σημαίνει ότι δεν υπάρχει καθόλου mrna του γονιδίου είτε σε καρκινικά είτε σε κύτταρα «ελέγχου». Όπως και στην αληθινή μικροσυστοιχία, οι κύκλοι δείχνουν μια διαβάθμιση χρώματος. Σε έναν κύκλο που εμφανίζεται κόκκινος, μόνο mrna από καρκινικά κύτταρα (κόκκινοι φακοί) έχει υβριδοποιηθεί με μόρια DNA. Με τον ίδιο τρόπο, πράσινοι κύκλοι αντιστοιχούν σε αποκλειστική υβριδοποίηση με mrna ελέγχου. Κίτρινοι κύκλοι αντιστοιχούν σε ίση ποσότητα mrna καρκινικών και ελέγχου. Βέβαια, αυτό είναι πολύ απλουστευτικό καθώς εάν επιστρέψετε στη μικροσυστοιχία θα διαπιστώσετε μια μεγάλη ποικιλομορφία στον χρωματισμό (κοιτάξτε την εικόνα στην ιστοσελίδα), η οποία μπορεί να αποκωδικοποιηθεί μόνο από ένα πρόγραμμα σάρωσης laser.

6 Κανονικοποίηση Σε μια μικροσυστοιχία DNA, η ένταση των κουκίδων δεν αντιπροσωπεύει πάντα το αληθινό ποσό του υβριδοποιημένου mrna, επειδή η σήμανση του mrna επηρεάζεται από το μέγεθος της αλυσίδας του mrna και τον τύπο του σημαντή που χρησιμοποιείται. Μια μαθηματική διαδικασία που ονομάζεται κανονικοποίηση (normalisation) διορθώνει τις εντάσεις των σημάτων του κουκίδων, ώστε αυτές να αντικατοπτρίζουν άμεσα το ποσό του mrna στο υβριδοποιημένο μόριο. Αφού τα δεδομένα έχουν κανονικοποιηθεί, η ανάλυση μπορεί να αρχίσει. Ανάλυση και ομαδοποίηση Θα χρειαζόταν χρόνια να αναλύσετε μια μικροσυστοιχία κουκίδα προς κουκίδα. Έτσι, οι επιστήμονες έχουν δημιουργήσει έναν τρόπο ομαδοποίησης των γονιδίων που έχουν παρόμοια συμπεριφορά σε ομάδες (clusters). Και όπως συνήθως, πολύπλοκα υπολογιστικά προγράμματα έχουν δημιουργηθεί για να εκτελεστούν αυτά τα βήματα με αυτόματο τρόπο. Κανονικοποίηση Σύμφωνα με όσα γνωρίζετε μέχρι στιγμής, οι επιστήμονες μπορούν να μιλήσουν για την ποσότητα του mrna από το χρώμα της κουκίδας σε μια μικροσυστοιχία. Εν παραλλήλω, μπορείτε να μαντέψετε τον αριθμό των φακών σε κάθε κύκλο από την ένταση του φωτός. Αλλά ας αναλογιστούμε το ακόλουθο παράδειγμα. Εάν υπάρχει μόνο ένας φακός σε έναν κύκλο και υπάρχουν δυο φακοί σε έναν άλλο, και εάν όλοι οι φακοί έχουν τις ίδιες μπαταρίες, τότε θα αναμένατε το φως από τους δυο φακούς να είναι διπλάσιο σε ένταση από ότι σε αυτό με τον ένα φακό. Αλλά τι θα γινόταν εάν οι δυο φακοί έχουν μπαταρίες, οι οποίες λειτουργούν στο μισό της έντασης τους; Τότε θα έδιναν την ίδια ένταση φωτός όπως ο απλός φακός. Με άλλα λόγια, η ένταση του φωτός που βλέπετε στην εικονική μικροσυστοιχία δεν σχετίζεται μόνο στο πόσους φακούς έχετε, αλλά και στην κατάσταση της μπαταρίας σε κάθε έναν από αυτούς. Ανάλυση και ομαδοποίηση Θα εξηγηθεί στην ενότητα για την τάξη: ασκήσεις ομαδοποίησης για την τάξη.