«Παρασκευή, χαρακτηρισμός και μελέτη τοξικότητας υβριδικών νανοκολλοειδών μαγνητίτη»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Παρασκευή, χαρακτηρισμός και μελέτη τοξικότητας υβριδικών νανοκολλοειδών μαγνητίτη» Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» ΤΖΑΒΑΡΑ Π. ΔΗΜΗΤΡΑ Χημικός - Φαρμακοποιός Πάτρα

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Παρασκευή, χαρακτηρισμός και μελέτη τοξικότητας υβριδικών νανοκολλοειδών μαγνητίτη» ΤΖΑΒΑΡΑ Π. ΔΗΜΗΤΡΑ Χημικός - Φαρμακοποιός ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιμησιάρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Παύλος Κλεπετσάνης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Μπακανδρίτσος Αριστείδης Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης Υλικών 2

3 3 Σε όλους όσους ήταν δίπλα μου

4 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών, σε συνεργασία με το Τμήμα Επιστήμης Υλικών, του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Ειδίκευσης του Τμήματος Φαρμακευτικής στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» κατά τα έτη Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Σ. Αντιμησιάρη, Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής για την ανάθεση του θέματος, για την πολύτιμη καθοδήγησή της, τις κατευθυντήριες γραμμές που έθεσε και τις γνώσεις που μου μετέδωσε κατά τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Θα ήθελα επίσης, να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Α. Μπακανδρίτσο για την πολύ καλή συνεργασία, για την πολύτιμη διδαχή του και για τη βοήθεια και τις ερευνητικές δυνατότητες που μου προσέφερε, όλη αυτή την περίοδο. Σημαντική βεβαίως ήταν η συμβολή των εξωτερικών συνεργατών μας, και γι αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Μ. Φαρδή, Ερευνητή στο Ινστιτούτο Πυρηνικών & Ραδιολογικών Επιστημών, «Δημόκριτος», τον κ. Α. Μάρκου, υποψήφιο διδάκτορα του Τμήματος Επιστήμης Υλικών, του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, καθώς και την Λαμπροπούλου Παρασκευή, μέλος του διοικητικού προσωπικού, του Τμήματος Γεωλογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Π. Κλεπετσάνη για τις πολύτιμες συμβουλές του και όλα τα μέλη των εργαστηρίων, για την συνεργασία τους και την βοήθεια που προσέφεραν σε τεχνικό και επιστημονικό επίπεδο και τη στήριξή τους όλο αυτό το διάστημα. 4

5 Πίνακας περιεχομένων 1. Θεωρητικό Μέρος Εισαγωγή στη νανοτεχνολογία και τις νανοεπιστήμες Νανοφορείς Τύποι νανοφορέων Υβριδικοί νανοφορείς Κολλοειδή Οξείδια του σιδήρου Μαγνητικές ιδιότητες Μαγνητισμός Τύποι μαγνητισμού Μαγνητικές περιοχές Weiss Μαγνητισμός σε νανοκλίμακα Απόκριση σε εξωτερικά μαγνητικά πεδία Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (ΜΝΣ) Μέθοδοι σύνθεσης ΜΝΣ Σταθεροποίηση ΜΝΣ [] Οργάνωση σε νανοπλειάδες Βασικές τεχνικές χαρακτηρισμού ΜΝΣ Εφαρμογές απεικόνισης και θεραπείας των ΜΝΣ Αποβολή ΜΝΣ από τον οργανισμό - φαρμακολογική προσέγγιση Χρήση in vitro / in vivo μοντέλων για μελέτες τοξικότητας In vitro: κυτταρικές σειρές In vivo: Caenorhabditis Elegans Στόχος της μεταπτυχιακής διατριβής Πειραματικό Μέρος ΟΡΓΑΝΑ ΥΛΙΚΑ Υλικά για παρασκευή ΜΝΣ και για τις μεθόδους χαρακτηρισμού που χρησιμοποιήθηκαν Υλικά για τις κυτταρικές σειρές hcmec/d3 και B Υλικά για την καλλιέργεια και τη μελέτη του C. Elegans Μέθοδοι Σύνθεση ΜΝΣ

6 Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός Μελέτη σταθερότητας Μελέτη μαγνητικών ιδιοτήτων Μελέτη τοξικότητας Αποτελέσματα Μαγνητικά Νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου Παρασκευή ΜΝΣ Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός ΜΝΣ Μελέτη σταθερότητας Μελέτη μεγέθους και ζ- δυναμικού των ΜΝΣ Μελέτη μαγνητικών ιδιοτήτων των ΜΝΣ Επιλογή σύνθεσης και προγραμματισμός επόμενου σταδίου Σταθεροποιημένα νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου ΜΝΣ-PEG Σύνθεση ΜΝΣ-PEG Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός ΜΝΣ-PEG Μελέτη σταθερότητας των ΜΝΣ-PEG Μέγεθος και ζ- δυναμικό Μελέτη μαγνητικών ιδιοτήτων των ΜΝΣ-PEG Σύγκριση ΜΝΣ και ΜΝΣ-PEG Συγκριτικά δεδομένα φασματοσκοπίας υπερύθρου Σύγκριση διασποράς μεγέθους και ζ-δυναμικού Συγκριτικά δεδομένα θερμοσταθμικής ανάλυσης Συγκριτικά δεδομένα μαγνητικών ιδιοτήτων Μελέτη τοξικότητας in vitro σε κυτταρικές σειρές in vivo Μοντέλο C. Elegans Συζήτηση Συζήτηση αποτελεσμάτων ως προς τη σύνθεση των ΜΝΣ και των σταθεροποιημένων MNΣ Συζήτηση αποτελεσμάτων ως προς τη χρήση τους στις διάφορες εφαρμογές που μελετήθηκαν Συζήτηση αποτελεσμάτων ως προς την τοξικότητα των ΜΝΣ και των σταθεροποιημένων MNΣ Συμπεράσματα Βιβλιογραφία

7 Πίνακας Συντομογραφιών ΜΝΣ : Μαγνητικά Νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου PAA-co-MA: πολυ(ακρυλικό οξύ-co-μηλεϊνικό οξύ) PEG: πολυαιθυλενογλυκόλη mpeg-nh 2 : ω-άμινο μεθόξυ πολυαιθυλενογλυκόλη EDC: N- (3-διμέθυλ άμινο πρόπυλ)-ν -αίθυλ καρβοδιιμίδιο υδροχλωρικό S-NHS: N- ύδροξυ-σούλφο-ηλεκτριμίδιο(ή σουκινιμίδιο) άλας νατρίου MRI: Magnetic Resonance Imaging, Απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού XRD: Χ-Ray Diffraction, Περίθλαση ακτίνων Χ TEM: Transmission Electron Microscopy, Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης DLS: Dynamic Light Scattering, Δυναμική σκέδαση φωτός ζ: Zeta Potential, ζ-δυναμικό D h: Υδροδυναμική διάμετρος UV Vis: Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού TGA: Thermo Gravimetric Analysis, Θερμοσταθμική ανάλυση VSM: Vibrating Sample Magnetometry, Μαγνητομετρία δονούμενου δείγματος MLV: MultiLamellar Vesicles, Πολυστοιβαδιακά σωματίδια LUV: Large Unilamellar Vesicles, Μεγάλα μονοστοιβαδιακά σωματίδια SUV: Small Unilamellar Vesicles, Mικρά μονοστοιβαδιακά σωματίδια MTT: (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, (3-(4, 5- διμεθυλοθειαζολυλο-2)-2, 5 διμεθυλοτετραζολιο βρωμίδιο PR : Pumping Rate, Ρυθμός διαδοχικής συστολής- διαστολής του μυ του φάρυγγα BB: Body Bends, Συχνότητα Κάμψεων 7

8 Περίληψη Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου παρασκευάσθηκαν μέσω της αλκαλικής συμπύκνωσης και ελεγχόμενης καταβύθισης συμπλόκων ιόντων Fe II, υπό την παρουσία τυχαίου συμπολυμερούς PAA-co-MA. Οι παράμετροι της σύνθεσης μεταβλήθηκαν με σκοπό την απομόνωση προϊόντων που να εμφανίζουν τις καλύτερες μαγνητικές ιδιότητες. Όλα τα προϊόντα εμφάνισαν υψηλή κολλοειδή σταθερότητα σε υδατικά μέσα χαμηλής ιοντικής ισχύος, ενώ ο σιδηρομαγνητικός τους χαρακτήρας έδειξε να ποικίλει από ασθενής μέχρι αρκετά ισχυρός, όπως προέκυψε μετά τον χαρακτηρισμό τους με μαγνητοφόρηση και μαγνητική υπερθερμία με εναλλασόμενο μαγνητικό πεδίο. Το μέσο μέγεθος των νανοκρυσταλλιτών ήταν διαφορετικό σε κάθε προϊόν κυμαινόμενο από περίπου 3 έως 14 nm, όπως προσδιορίστηκε μέσω XRD. Η ανάλυση με ΤΕΜ έδειξε ότι στο προϊόν που εμφανίζει τις καλύτερες μαγνητικές ιδιότητες σχηματίζονται πλειάδες νανοσωματιδίων πυκνής διάταξης, και στις οποίες αποδίδεται η βελτιωμένη απόκριση σε μαγνητικά πεδία. Τα άλλα προϊόντα εμφάνισαν μικρότερα μεγέθη κρυσταλλιτών και διαφορετικά δομικά χαρακτηριστικά. Τα κολλοειδή καταβυθίζονταν κατόπιν αύξησης της ιοντικής ισχύος του διαλύτη. Για τον λόγο αυτό αποφασίστηκε η μελέτη της αντίδρασης σύζευξης των εξωτερικών καρβοξυλικών ομάδων του πολυμερικού φλοιού με mpeg-nh 2, δεδομένου ότι η PEG αυξάνει σημαντικά τη σταθερότητα των κολλοειδών. Παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιήθηκαν κοινά αντιδραστήρια σύζευξης, μόνο υπό πολύ ειδικές συνθήκες η απόδοση της αντίδρασης ήταν ικανοποιητική, οπότε και προέκυψαν σταθερά κολλοειδή σε συνθήκες υψηλής ιοντικής ισχύος. Τέλος, τα προϊόντα αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να επάγουν υπερθερμία και μελετήθηκε ο χρόνος χαλάρωσης Τ 2, ο οποίος σχετίζεται άμεσα με την ενίσχυση της αντίθεσης στην απεικόνιση μέσω μαγνητικού συντονισμού. Τέλος, ένα από τα προϊόντα, μελετήθηκε in vitro και in νίνο, προκειμένου να αξιολογηθεί η βιοσυμβατότητα του. Τα συστήματα αυτά παρουσιάζουν πολύ ενδιαφέρουσες ιδιότητες ώστε να τροποποιηθούν και να μελετηθούν περεταίρω ως θεραπευτικά ή/και διαγνωστικά νανοϋλικά. 8

9 Abstract Μagnetic nanoparticles of iron oxides were synthesized through condensation and controlled precipitation of a Fe II complex, in alkaline environment, in the presence of a random copolymer PAA-co-MA, as polymeric corona. The synthetic parameters were varied with the aim of isolating products exhibiting the best magnetic properties. All products displayed high colloidal stability in low ionic strength aqueous media, while their ferromagnetic properties varied from weak to quite strong, as deduced after the characterization with magnetophoresis and magnetic hyperthermia with alternating magnetic field. The average crystallite size, as determined through XRD, varied from 8 to 14 nm depending on the product. TEM analysis showed that the product displaying the best magnetic properties formed clusters of densely packed nanocrystallites, leading to interesting superstructural motifs. All the other products displayed smaller crystallite sizes and different structural characteristics. The colloids precipitated upon increase of the ionic strength of the solvent (H 2 O) with NaCl. Therefore, it was decided to study the conjugation of the outer carboxyl groups of the polymeric corona with mpeg-nh 2, since PEG is known to increase significantly the stability of colloids. Despite the fact that common conjugation reagents were used, only under specific conditions the yied of the reaction was appropriately high in order the resultant colloids to be stable in a high ionic strength (isotonic) medium. Finally the products were evaluated for their performance in magnetic hyperthermia and for contrast enhancement in magnetic resonance imaging, by studying the T 2 relaxation time. One of the products was furthermore studied by in vitro and in vivo systems, in order to evaluate its biocompatibility. These colloidal systems exhibit very interesting properties in order to be further modified and studied as therapeutic and / or diagnostic (theragnostic) nanomaterials. 9

10 1. Θεωρητικό Μέρος 1.1. Εισαγωγή στη νανοτεχνολογία και τις νανοεπιστήμες Η νανοτεχνολογία και οι νανοεπιστήμες αφορούν στη μελέτη, το δομικό σχεδιασμό, την παραγωγή και τον χειρισμό της ύλης σε διαστάσεις νανομέτρων (10-9 m). Ο επαναστατικός χαρακτήρας της νανοτεχνολογίας έγκειται στις πιθανές δυνατότητες, για ανάπτυξη υλικών με νέες ιδιότητες, βελτιστοποιημένες μεθοδολογίες και νέες εφαρμογές. Σε αυτά τα μεγέθη τα υλικά παρουσιάζουν ιδιότητες οι οποίες είναι διαφορετικές από αυτές των ίδιων υλικών σε μεγαλύτερες διαστάσεις. Οι δυο βασικότεροι λόγοι για αυτή την αλλαγή είναι η αύξηση της επιφάνειας σε σχέση με τον συνολικό όγκο και η επικράτηση των κβαντικών φαινομένων, με αποτέλεσμα να αλλάζουν σημαντικά οι οπτικές, ηλεκτρικές και μαγνητικές ιδιότητες του υλικού. Είναι γνωστό πως η επιφάνεια ενός υλικού καθορίζει σε πολύ μεγάλο βαθμό τις αλληλεπιδράσεις με το περιβάλλον και πολλές φορές τη δραστικότητά του. Για παράδειγμα επιφανειακές μεταβολές σε ένα χημικό νανοσύμπλεγμα πιθανώς να οδηγήσει σε αύξηση της επιθυμητής δραστικότητας ή και να του προσδώσει νέες ιδιότητες. Η νανοτεχνολογία έχει αναπτυχθεί πολύ τα τελευταία χρόνια [ 1 ], και έτσι διάφορα νανοσυστήματα βρίσκουν ολοένα και περισσότερες εφαρμογές σε διάφορους τομείς [2], όπως στα ηλεκτρονικά συστήματα, στην οπτική, στην κατάλυση χημικών αντιδράσεων και φυσικά την βιολογία και την ιατρική [3]. Αναφερόμαστε στις εφαρμογές στον τομέα της ιατρικής με τον όρο νανοϊατρική. Σκοπός των εφαρμογών αυτών, είναι η ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων για διάγνωση, πρόληψη, αλλά και θεραπεία ασθενειών, στις οποίες είτε συναντώνται εμπόδια, είτε υπάρχει ανάγκη αντικατάστασης της ήδη υπάρχουσας μεθόδου, με κάποια πιο αποτελεσματική, πιο εξειδικευμένη και λιγότερο τοξική [ 4 ]. Για παράδειγμα συνεχώς αναπτύσσονται νανοσωματιδιακά συστήματα με διαφορετική σύσταση και δομή, με στόχο την συνδυασμένη απεικόνιση και θεραπεία του καρκίνου (theragnostic nanoparticles) [ 5 ]. Τα κολλοειδή υβριδικά νανοσωματίδια είναι μία κατηγορία υλικών η οποία μπορεί να βρει εφαρμογή σε αυτόν τον τομέα Νανοφορείς Οι νανοφορείς είναι υπερμοριακά συστήματα (ειδικά σχεδιασμένα νανοσωματίδια) που έχουν μέγεθος από nm, και μπορούν να έχουν ανάλογα με τη σύστασή τους και τη δομή τους, κατάλληλες ιδιότητες για βιοχημικές και φαρμακολογικές εφαρμογές. Για παράδειγμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να γίνει στόχευση καρκινικών όγκων [6,7], για μεταφορά θεραπευτικών ενώσεων, γονιδίων, ή σκιαγραφικών μέσων [8] για την in vivo παρακολούθηση της θεραπευτικής διαδικασίας [6]. Επίσης μπορεί να εμφανίζουν απόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα (ακτινοβολία, ph, μαγνητικά πεδία) για χρονικά ελεγχόμενη αποδέσμευση των βιοδραστικών ενώσεων τις οποίες μεταφέρουν Τύποι νανοφορέων Παρόλο που ο αριθμός των διαφορετικών τύπων νανοφορέων αυξάνεται διαρκώς, διακρίνονται σε δύο βασικές κατηγορίες: σωματίδια που περιέχουν οργανικά μόρια ως βασικό δομικό συστατικό και σε αυτά που περιέχουν και ανόργανα συστατικά, όπως μέταλλα. Δηλαδή: 10

11 Οργανικά νανοσωματίδια Υβριδικά (οργανικά/ανόργανα) νανοσωματίδια Λιποσώματα, δενδριμερή, νανοσωλήνες άνθρακα και διάφορα πολυμερή αποτελούν τον κορμό των οργανικών νανοφορέων (Εικόνα 1.1). Η χρήση αυτών των νανοφορέων ως τώρα, έχει επιφέρει εντυπωσιακά αποτελέσματα [ 9 ]. Τα λιποσώματα χρησιμοποιούνται ως οχήματα για τη μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων, ενώ τα δενδριμερή έχουν χρησιμοποιηθεί στη μαγνητική τομογραφία ως σκιαγραφικά μέσα. Εικόνα 1. 1: Τύποι νανοφορέων Νανοφορείς που είναι συζευγμένοι με φαρμακολογικούς παράγοντες και μόρια στόχευσης, αποτελούν πολύτιμα οχήματα για τη μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων. Οι περισσότεροι υβριδικοί νανοφορείς παρουσιάζουν την ίδια βασική δομή, η οποία συνίσταται σε ένα πυρήνα που καθορίζει το φθορισμό, τις οπτικές, μαγνητικές και ηλεκτρονικές ιδιότητες του σωματιδίου, με μια προστατευτική οργανική επένδυση στην επιφάνεια. Αυτή η εξωτερική στοιβάδα προστατεύει τον πυρήνα από το επιθετικό περιβάλλον του σώματος και μπορεί να σχηματίσει ηλεκτροστατικούς ή ομοιοπολικούς δεσμούς, ή και τα δύο, με κατάλληλα (μακρο)μόρια και βιομόρια που διαθέτουν βασικές λειτουργικές ομαδές, όπως αμίνες και θειόλες. Τα νανοσωματίδια έχουν το πλεονέκτημα της ασφαλέστερης ενδοφλέβιας χορήγησης, σε σχέση με μεγάλα μικροσωματίδια, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μεταφορά τόσο υδρόφιλων όσο και υδρόφοβων βιοδραστικών ενώσεων, πρωτεϊνών, βιολογικών μακρομορίων, κ.α.. Επίσης μπορούν να τροποποιηθούν για στοχευμένη χορήγηση σε διάφορα όργανα του σώματος. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται πολλά πρωτόκολλα παρασκευής νανοσωματιδίων που βασίζονται στον τύπο της βιοδραστικής ένωσης που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί και τη συγκεκριμένη θεραπευτική εφαρμογή. Μετά την επιλογή του πρωτοκόλλου, κρίνεται απαραίτητη η επιλογή των παραμέτρων που καθορίζουν την επίτευξη των βέλτιστων χαρακτηριστικών των νανοφορέων. Το μέγεθος (Πίνακας 1.1), η αποτελεσματικότητα εγκλωβισμού-φόρτωσης ουσιών, το επιφανειακό φορτίο, ο τρόπος απελευθέρωσης βιοδραστικών ενώσεων, η φυσικοχημική σταθερότητα και η βιοκατανομή είναι μόνο μερικά από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των νανοφορέων. 11

12 Πίνακας 1. 1: Χαρακτηριστικά νανοφορέων που χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά φαρμάκων [10] Δομή Μέγεθος (nm) Ρόλος στη μεταφορά βιοδραστικών μορίων Μαγνητικά νανοσωματίδια Μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων και στοχευμένη αποικοδόμηση κυττάρων Δενδριμερή 1-20 Συγκράτηση θεραπευτικών παραγόντων Κεραμικά νανοσωματίδια ~35 Αποκλειστική συσσώρευση σε καρκινικό ιστό και θεραπεία Νανοσωματίδια κιτοζάνης Υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού Λιποσώματα Μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων Χαμηλής πυκνότητας Βιοδραστικές ενώσεις στο λιπιδικό λιποπρωτείνες πυρήνα ή προσκολλημένα στην επιφάνεια Νανογαλακτώματα Βιοδραστική ένωση στη λιπιδική ή υδατική φάση για αύξηση της απορρόφησης Μεταφορά λιπόφιλων ή υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων Νανολιπιδικά σφαιρίδια (SLN) Υβριδικά νανοσωματίδια ~40 Πρόσδεση σε μόρια για στοχευμένη μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων Νανοσωματίδια Συνεχή μήτρα που περιέχει διεσπαρμένη ή διαλυμένη βιοδραστική ένωση Μικύλλια Μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων σε συγκεκριμένες δομές εσωτερικά του κυττάρου Νανοσφαιρίδια Κοιλότητα που δημιουργείται από υπερήχους Νανοκάψουλες Σφαίρες μονών ή πολλαπλών στοιβάδων που περιέχουν βιοδραστική ένωση στο λιπίδιο Πολυμερικές νανοκάψουλες Εγκλωβισμός βιοδραστικών ενώσεων Υβριδικοί νανοφορείς Οι υβριδικοί νανοφορείς αποτελούν το συνδυασμό οργανικών και ανόργανων ενώσεων και υλικών, κατάλληλα επιλεγμένων με σκοπό να συνδυαστούν οι ιδιότητες των δύο αυτών φάσεων στη στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων. Τα νανοσωματίδια χρυσού αποτελούν ένα πολύ διαδεδομένο σύστημα για τη μεταφορά φαρμάκων, γονιδίων και πρωτεϊνών αφού χαρακτηρίζονται από αυξημένη βιοσυμβατότητα διότι ανήκουν στα αδρανή μέταλλα και έχουν πολύ μικρή τοξικότητα. Επιπλέον η διαδικασία σύνθεσής τους είναι απλή και παρουσιάζουν υψηλή χημική σταθερότητα. Ανάλογα τη μέθοδο παρασκευής τους, το μέγεθος τους μπορεί να κυμανθεί από 1 έως 150 nm. Μία επιπλέον εφαρμογή τους, βασίζεται στην πολύ μεγάλη απορρόφηση που επιδεικνύουν στο εγγύς υπέρυθρο. Έτσι μόλις συσσωρευτούν στην περιοχή του καρκινικού όγκου μπορούν να διεγερθούν και να προκαλέσουν τοπική υπερθερμία, καταστρέφοντας έτσι τον καρκινικό ιστό [11]. 12

13 Παρόμοιες ιδιότητες έχουν και τα μαγνητικά νανοσωματίδια, γι αυτό και βρίσκονται στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος όσων αφορά στις βιοϊατρικές εφαρμογές, μαζί με άλλα νανοσωματίδια. Σημαντικό είναι πως διαθέτουν επίσης εύκολα τροποποιήσιμη επιφάνεια όπου να μπορούν να προσκολληθούν βιομόρια και φάρμακα, και να έχουν πολύ μικρό μέγεθος. Τέλος, οι μαγνητικές τους ιδιότητες είναι ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα, καθώς τους προδίδουν πολύ σημαντικές επιπλέον ιδιότητες, όπως ένα εγγενές είδος στόχευσης, μεταφέροντάς τα στον ιστό στόχο με την επίδραση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τη χρήση τους ως σκιαγραφικά μέσα στη μαγνητική τομογραφία και τη δυνατότητα να επάγουν μαγνητική υπερθερμία αν εφαρμοστεί εναλλασσόμενο μαγνητικό πεδίο. Εικόνα 1. 2 Απλουστευμένη σχηματική απεικόνιση μαγνητικού νανοσωματιδίου. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια απαρτίζονται από τρία βασικά μέρη (εικόνα 1.2) : το μαγνητικό πυρήνα, το πολυμερικό κέλυφος και την τροποποιημένη επιφάνεια τους, η οποία είναι απαραίτητη προκειμένου να αποκτήσουν οι μαγνητικοί νανοφορείς την απαραίτητη σταθερότητα σε βιοσυστήματα (π.χ. αίμα) και την ικανότητα να μεταφέρουν φαρμακευτικές ουσίες. Υπάρχουν πολλά υλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση των μαγνητικών νανοσωματιδίων. Πολλά από αυτά όμως όπως το κοβάλτιο και το χρώμιο είναι πολύ τοξικά. Για αυτόν το λόγο τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα είναι τα νανοσωματίδια που παρασκευάζονται από οξείδια του σιδήρου όπως ο μαγνητίτης (Fe 3 O 4 ) και ο μαγκεμίτης (γ Fe 2 O 3 ) τα οποία είναι βιοσυμβατά και εξετάζονται αναλυτικότερα παρακάτω [12,13] Κολλοειδή Τα κολλοειδή είναι διασπορές σωματιδίων μιας ουσίας (διασπαρμένη φάση) στη μάζα μίας άλλης ουσίας (μέσο διασποράς ή συνεχής φάση). Όλοι οι νανοφορείς, για παράδειγμα, είναι κολλοειδή συστήματα. Τα κολλοειδή χαρακτηρίζονται σύμφωνα με την κατάσταση της διεσπαρμένης φάσης και του μέσου διασποράς σε στερεά, υγρά και αέρια. Ένα κολλοειδές διαφέρει από ένα πραγματικό διάλυμα, στο ότι τα διεσπαρμένα σωματίδια είναι μεγαλύτερα από κανονικά μόρια. Το μέγεθος των σωματιδίων κυμαίνεται περίπου από nm. Τα κολλοειδή, στα οποία το μέσο διασποράς είναι το νερό, μπορούν να διακριθούν σε δύο κατηγορίες, τα υδρόφιλα και τα υδρόφοβα [14]. α) Υδρόφιλο κολλοειδές είναι ένα κολλοειδές στο οποίο υπάρχει ισχυρή έλξη μεταξύ διεσπαρμένης φάσης και μέσου διασποράς (νερό). Εμφανίζουν σταθερότητα, διότι έλκουν τα μόρια του νερού μέσα στο διάλυμα (ενυδατώνονται). Τυπικά παραδείγματα υδρόφιλων κολλοειδών είναι τα τασιενεργά μόρια (π.χ. σαπούνια), οι πολυσακχαρίτες (π.χ. άμυλο) και οι πρωτεΐνες (π.χ. ο ορός του αίματος, το γάλα). 13

14 β) Υδρόφοβο κολλοειδές, είναι ένα κολλοειδές στο οποίο υπάρχει έλλειψη έλξεων μεταξύ διεσπαρμένης φάσης και μέσου διασποράς (νερό). Τα υδρόφοβα κολλοειδή δεν έχουν συγγένεια με το νερό και η σταθερότητά τους, δηλαδή η παραμονή τους εν αιωρήσει, εξαρτάται από το μοριακό, οργανικό ή ιοντικό στρώμα που τα περιβάλλει. Έτσι, αν δοθεί επαρκής χρόνος, η διεσπαρμένη φάση συσσωματώνεται σε μεγαλύτερα σωματίδια. Τα κολλοειδή παρουσιάζουν μεγάλη προσροφητική ικανότητα, μπορούν δηλαδή εύκολα να συγκρατούν στην επιφάνειά τους μόρια και άτομα άλλων ουσιών. Η προσροφητική τους ικανότητα είναι αυξημένη, καθώς οι διαστάσεις τους είναι αρκετά μικρές και η επιφάνειά τους μεγάλη. Έχουν μεγάλο ιξώδες, μικρή δηλαδή ρευστότητα, όπως επίσης μικρή ταχύτητα διάχυσης και διαπίδυσης. Επίσης δε διαχέονται μέσω μεμβράνης επειδή τα διασπαρμένα σωματίδια είναι μεγαλύτερα από τους πόρους της μεμβράνης [15]. Χαρακτηριστικό των κολλοειδών είναι ότι το μέγεθός τους εμπίπτει σε τέτοια κλίμακα μεγέθους, ώστε να υπόκεινται σε κίνηση Brown (παράγραφος ). Ένα κολλοειδές διάλυμα μακροσκοπικά εμφανίζεται να είναι ομογενές επειδή τα διεσπαρμένα σωματίδια είναι πολύ μικρά, όμως και αρκετά μεγάλα σε σχέση με τα μακρομοριακά διαλύματα. Όταν μάλιστα το μέγεθος εμπίπτει στην κλίμακα του μήκους κύματος του ορατού φωτός, τότε προκαλούν σκέδαση του φωτός (περίθλαση) μετατρεπόμενα σε δευτερογενείς πηγές φωτός. Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό ως φαινόμενο Tyndall [14], και έχει ως αποτέλεσμα το κολλοειδές να εμφανίζεται θολό. Εξαιτίας του μεγέθους τους, ο λόγος της επιφάνειας προς τον όγκο, είναι πολύ μεγάλος και συνεπώς πολλά άτομα βρίσκονται στη διεπιφάνεια ανάμεσα στη μια και στην άλλη φάση (π.χ. στερεή-υγρή σε μια διασπορά στερεών κολλοειδών σωματιδίων σε διαλύτη). Έτσι, τα επιφανειακά φαινόμενα και οι αλληλεπιδράσεις με το περιβάλλον, παίζουν σημαντικό ρόλο στη συμπεριφορά των κολλοειδών συστημάτων. Η χημεία της επιφάνειάς τους και οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης καθορίζουν την ευστάθεια των κολλοειδών διασπορών. Το ζητούμενο αποτέλεσμα είναι η υπερίσχυση των απωστικών δυνάμεων [16 ] έναντι των ελκτικών δυνάμεων Van der Waals [ 17 ] που είναι η κύρια αιτία συσσωμάτωσης στα κολλοειδή. Τα κολλοειδή συστήματα είναι είτε σταθερά, με αποτέλεσμα να παραμένουν σε διασπορά, είτε ασταθή, όποτε κροκκιδώνονται [18]. Συμφωνά με τις βασικές αρχές της θερμοδυναμικής, οι μεταβολές σε ένα θερμοδυναμικό σύστημα συμβαίνουν στην κατεύθυνση ελαττώσεως της ελεύθερης ενέργειας. Γενικώς τα κολλοειδή συστήματα είναι ασταθή θερμοδυναμικά, λόγω της μεγάλης διεπιφάνειας που εμφανίζουν μεταξύ μέσου διασποράς και διεσπαρμένης φάσης. Λόγω αυτής της μεγάλης επιφάνειας η θερμοδυναμική ισορροπία επιτάσσει μείωση της ελεύθερης επιφανειακής ενέργειας μέσω συσσωμάτωσης. Τα κολλοειδή σωματίδια που έχουν υψηλό ομώνυμο ηλεκτρικό φορτίο συνεισφέρει στην σταθερότητά τους και είναι κινητικά σταθερά σε συστήματα χαμηλής ιονικής ισχύος. Απώτερος σκοπός είναι τα κολλοειδή νανοσωματίδια να διατηρούν απόσταση μεταξύ τους (βλ. δεύτερο ελάχιστο στην εικόνα 1.3.) μέσω της παρουσίας απωστικών δυνάμεων [14]. Οι απωστικές δυνάμεις δημιουργούν ένα ενεργειακό φράγμα (V max, εικόνα 1.3.), χωρίς την παρουσία του οποίου τα κολλοειδή θα πλησιάζαν αρκετά ώστε να μειωθεί η ελεύθερη ενέργεια του συστήματος, όπως φαίνεται στο πρώτο ελάχιστο του ενεργειακού διαγράματος (1.1) 14

15 Διάγραμμα 1. 1: Δυναμικό αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο σωματιδίων. Η επιθυμητή περιοχή για την ύπαρξη σταθερού κολλοειδούς διαλύματος είναι στο δεύτερο ελάχιστο του δυναμικού αλληλεπίδρασης [19] Κίνηση Brown Η κίνηση Brown είναι μια από τις πιο σημαντικές ιδιότητες των κολλοειδών. Τα διεσπαρμένα σωματίδια ενός κολλοειδούς, βρίσκονται σε συνεχή κίνηση προς τις τρεις διευθύνσεις του χώρου και σε περιστροφή λόγω των συγκρούσεών τους με τα μόρια του διαλύτη, του μικρού τους μεγέθους και της μάζας. Η κίνηση αυτή είναι άτακτη και χαρακτηρίζεται ως κίνηση Brown. Ο Einstein μελέτησε πρώτος την κίνηση κολλοειδών σωματιδίων χρησιμοποιώντας θεωρία πιθανοτήτων. Κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η μέση τιμή του τετραγώνου της μετατόπισης του σωματιδίου, που πραγματοποιεί κίνηση Brown, είναι συνάρτηση του χρόνου t, της θερμοκρασίας T, της ακτίνας του σωματιδίου r και του ιξώδους του μέσου n, βάση της εξίσωσης 1.1 [20] : π (εξίσωση 1.1) όπου, R η σταθερά των αερίων (8,31 J/mol K), Ν ο αριθμός Avogadro (6, /mol) και π η μαθηματική σταθερά (3,14159). Η κίνηση Brown των σωματιδίων, έχει ως συνέπεια την διάχυσή τους προς περιοχές του μέσου με μικρότερη συγκέντρωση σωματιδίων. Η ποσότητα α (σε mol) των σωματιδίων που διαχέονται στη μονάδα του χρόνου ανά μονάδα επιφανείας (mol s -1 m -2 ) δίνεται από το νόμο του Fick (εξίσωση 1.2): (εξίσωση 1.2) 15

16 όπου, D ο συντελεστής διάχυσης των σωματιδίων στο μέσο και dc/dx η βαθμίδα της συγκέντρωσης των σωματιδίων στη διεύθυνση x. Συνδυάζοντας τις δύο παραπάνω σχέσεις ο Einstein υπολόγισε τη σταθερά διάχυσης D των κολλοειδών σωματιδίων, συναρτήσει της θερμοκρασίας Τ του κολλοειδούς, της ακτίνας του σωματιδίου r και του ιξώδους του μέσου n (εξίσωση 1.3): (εξίσωση 1.3) όπου, Κ η σταθερά του Boltzmann ( J K -1 ), D ο συντελεστής διάχυσης, r η υδροδυναμική ακτίνα, T η απόλυτη θερμοκρασία, η το ιξώδες. Η εξίσωση αυτή, χρησιμοποιείται ευρέως για την εκτίμηση των διαστάσεων κολλοειδών σωματιδίων με την τεχνική της δυναμικής σκέδασης ακτινοβολίας [21] Οξείδια του σιδήρου Ο μαγνητίτης (Fe 3 O 4 ), είναι ένα από τα τρία σημαντικότερα οξείδια του σιδήρου μαζί με τον αιματίτη (Fe 2 O 3 ) και τον βουστίτη (FeO) Μαγνητίτης και μαγκεμίτης Ο μαγνητίτης ανήκει σε μια σημαντική κατηγορία μεταλλικών οξειδίων, που ονομάζονται φερρίτες, και εμφανίζει τις εντονότερες μαγνητικές ιδιότητες από οποιοδήποτε άλλο οξείδιο του σιδήρου. Αποτελεί ένα από τα κυριότερα μεταλλεύματα του σιδήρου. Το σημαντικότερο δομικό χαρακτηριστικό του μαγνητίτη, είναι ότι διαθέτει ιόντα σιδήρου σε δισθενή και τρισθενή οξειδωτική βαθμίδα, με αποτέλεσμα να μπορεί να λειτουργήσει και ως οξειδωτικό και ως αναγωγικό μέσο. Το ορυκτό αυτό είναι μέλος της ομάδας των σπινελίων ΑΒ 2 Ο 4 ( Α= δισθενές άτομο και Β= τρισθενές άτομο) και περιέχει περίπου 72,4% σίδηρο (Fe) και 27,6% οξυγόνο (O 2 ). Ο μαγνητίτης κρυσταλλώνεται σε ολοεδρία κατά το κυβικό σύστημα (Εικόνα 1.3), έχει χρώμα σκούρο καφέ έως μαύρο και μεταλλική λάμψη. Βρίσκεται σε κοκκώδη και φλοιώδη συσσωματώματα υπό μορφή κόκκων με το όνομα «μαγνητίτης άμμος» [13]. Εικόνα 1. 3: Δομή του μαγνητίτη (α) Πολυεδρικό μοντέλο με εναλλασσόμενα οκταεδρικά και τετραεδρικά επίπεδα. (β) Μοντέλο σφαιρών με σκιαγραφημένη την μοναδιαία κυψελίδα. (γ) Μοντέλο σφαιρών όπου απεικονίζονται τρείς οκτάεδρικες και δύο τετράεδρικές θέσεις 22. Ο μαγκεμίτης (γ-fe 2 O 3 ) είναι μέλος της οικογένειας των οξειδίων. Έχει παρόμοια δομή με αυτή του μαγνητίτη, αλλά μόνο τα 5/6 των συνολικών τετραεδρικών και οκταεδρικών θέσεων καταλαμβάνονται από άτομα σιδήρου. Αποτελείται περίπου από 69,9% σίδηρο και 30,1% οξυγόνο [22]. Σε θερμοκρασία δωματίου, ο μαγνητίτης οξειδώνεται σε μαγκεμίτη με αργό ρυθμό, οδηγώντας σε ασθενέστερο μαγνητισμό. Ο μηχανισμός οξείδωσης είναι αρκετά 16

17 περίπλοκος. H βασική διαφορά του με τον μαγνητίτη, είναι ότι όλα τα κατιόντα σιδήρου του μαγκεμίτη βρίσκονται στην τρισθενή κατάσταση (Fe +3 ) [23] Μαγνητικές ιδιότητες Οι μαγνητικές ιδιότητες, οφείλονται στα φαινόμενα μαγνητισμού που παρουσιάζουν τα υλικά Μαγνητισμός Ο μαγνητισμός είναι ένα φαινόμενο, κατά το οποίο υλικά και φορτισμένα-κινούμενα σωματίδια, ασκούν ελκτικές και απωστικές δυνάμεις, καθώς και ροπές σε άλλα υλικά ή φορτισμένα σωματίδια. Ένα άτομο χαρακτηρίζεται ως μαγνητικό, όταν έχει μη μηδενική μαγνητική ροπή, και ως μη μαγνητικό στην αντίθετη περίπτωση. Μερικά υλικά που διαθέτουν μαγνητικές ιδιότητες οι οποίες είναι εύκολα ανιχνεύσιμες, είναι το νικέλιο (Ni), ο σίδηρος (Fe), το κοβάλτιο (Co), το γαδολίνιο (Gd) και τα κράματά τους. Όλα τα υλικά επηρεάζονται, σε μεγαλύτερο ή μικρότερο ποσοστό, από την παρουσία ενός μαγνητικού πεδίου. Η ύπαρξη μαγνητικών φαινομένων αποδίδεται στην τροχιακή κίνηση και στο spin των ηλεκτρονίων. Ειδικότερα, ο μαγνητισμός έχει διπολική φύση, δηλαδή υπάρχουν πάντα δύο μαγνητικοί πόλοι ή κέντρα των μαγνητικών πεδίων, τα οποία βρίσκονται σε καθορισμένη απόσταση μεταξύ τους. Η διπολική αυτή συμπεριφορά, επεκτείνεται και στα μικροσκοπικά μαγνητικά δίπολα που εντοπίζονται σε ορισμένα άτομα. Τα ηλεκτρόνια των ατόμων, σαν κινούμενα ηλεκτρικά φορτισμένα σωματίδια, δημιουργούν μαγνητικά πεδία γύρω τους, τόσο από τη κίνησή τους γύρω από τον πυρήνα των ατόμων όσο και από την περιστροφική κίνηση γύρω από τον άξονά τους (spin). Μαγνητική ροπή ονομάζεται το διανυσματικό μέγεθος της έντασης του μαγνητικού πεδίου που δημιουργεί η κίνηση του ηλεκτρονίου [14]. Έτσι κάθε ηλεκτρόνιο έχει δύο μαγνητικές ροπές οφειλόμενες στις δύο περιστροφικές κινήσεις του. Στα διάφορα άτομα η συνισταμένη μαγνητική ροπή των ηλεκτρονίων μπορεί να είναι μηδενική ή και διάφορη του μηδενός. Όπως είναι γνωστό από την ενεργειακή κατανομή των ηλεκτρονίων στα άτομα, σε κάθε τροχιακό συγκεκριμένου ενεργειακού επιπέδου υπάρχουν το πολύ δύο ηλεκτρόνια με αντίθετους κβαντικούς αριθμούς του spin, δηλαδή δύο ηλεκτρόνια τα οποία περιστρέφονται με αντίθετη φορά γύρω από τον άξονά τους. Επομένως, τα ηλεκτρόνια αυτά θα έχουν αντίθετες μαγνητικές ροπές και όταν τα τροχιακά είναι πλήρη, η συνολική μαγνητική ροπή στο άτομο θα είναι ίση με μηδέν. Στην περίπτωση τώρα που ο αριθμός των ηλεκτρονίων σε ένα άτομο είναι μονός, θα περιμέναμε με βάση τα παραπάνω το άτομο να έχει μαγνητική ροπή διαφορετική του μηδενός, λόγω του μονήρους ασύζευκτου ηλεκτρονίου. Όμως, επειδή στα περισσότερα άτομα των στοιχείων το μονήρες ηλεκτρόνιο, είναι ηλεκτρόνιο της εξωτερικής ενεργειακής στάθμης (ηλεκτρόνιο σθένους), παρατηρείται αλληλεπίδραση των ηλεκτρονίων σθένους των διαφορετικών ατόμων, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους και σχηματίζουν χημικούς δεσμούς, με αποτέλεσμα οι μαγνητικές τους ροπές να αλληλοεξουδετερώνονται και έτσι να μην παρουσιάζεται μαγνητική ροπή στα υλικά αυτά. Ωστόσο, ορισμένα στοιχεία έχουν εσωτερικά ενεργειακά επίπεδα ασυμπλήρωτα. Συγκεκριμένα, τα μεταβατικά στοιχεία, παρουσιάζουν μερικώς συμπληρωμένα τα 3d τροχιακά τους, ενώ διαθέτουν ηλεκτρόνια και στη τέταρτη κύρια ενεργειακή στάθμη. Για παράδειγμα, ο χαλκός και το χρώμιο έχουν από ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο σθένους στο 4s τροχιακό τους, του οποίου η μαγνητική ροπή εξουδετερώνεται από τα ηλεκτρόνια σθένους των άλλων ατόμων. Επίσης, ο χαλκός έχει συμπληρωμένα και τα πέντε 3d τροχιακά 17

18 του και επομένως δεν εμφανίζει μόνιμη διπολική ροπή. Στοιχεία όπως ο σίδηρος, έχουν στα 3d τροχιακά τους ασύζευκτα ηλεκτρόνια με παράλληλα spin και επομένως τα άτομα αυτά παρουσιάζουν μόνιμη μαγνητική ροπή, έντασης ανάλογης του αριθμού των ασύζευκτων ηλεκτρονίων και συμπεριφέρονται σαν μαγνητικά δίπολα. Τα περισσότερα από τα μεταβατικά στοιχεία, αντιδρούν κατά τέτοιο τρόπο ώστε το άθροισμα των ατομικών μαγνητικών ροπών να είναι ίσο με μηδέν. Ο σίδηρος, το κοβάλτιο και το νικέλιο όμως, εάν βρεθούν υπό την επίδραση ενός μαγνητικού πεδίου, προκαλούν ενίσχυση του πεδίου, διότι λαμβάνει χώρα προσανατολισμός των μαγνητικών ροπών των ατόμων, των υλικών αυτών, παράλληλα με το εφαρμοζόμενο πεδίο [24]. Όταν μαγνητικό πεδίο, Η, εφαρμόζεται σε υλικό, η απόκριση του υλικού ονομάζεται μαγνητική επαγωγή, Β. Η σχέση μεταξύ Η και Β είναι ιδιότητα του ίδιου του υλικού. Σε μερικά υλικά (όπως και στο κενό) το Β είναι γραμμικά ανάλογο του Η, αλλά εν γένει η σχέση τους είναι αρκετά πιο πολύπλοκη. Η σχέση (εξίσωση 1.4) που συνδέει αυτές τις δύο ποσότητες σε μονάδες SI είναι : Όπου μ μ (εξίσωση 1.4) είναι η μαγνητική διαπερατότητα του κενού και Μ είναι η μαγνήτιση του μέσου. Το πεδίο ενός υλικού, παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου ονομάζεται μαγνήτιση Μ και ορίζεται ως η μαγνητική ροπή (m) ανά μονάδα όγκου V (εξίσωση 1.5), Μ (εξίσωση 1.5) H μαγνήτιση (Μ) εκφράζει την πυκνότητα των προσανατολισμένων στη διεύθυνση του μαγνητικού πεδίου μαγνητικών διπολικών ροπών και σχετίζεται με την ηλεκτρονική δομή του στερεού. Άρα, αποτελεί ιδιότητα του υλικού και εξαρτάται τόσο από τις επιμέρους μαγνητικές ροπές των ιόντων, ατόμων ή μορίων, όσο και από τον τρόπο που οι ροπές αυτές αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Όλα τα υλικά είναι μαγνητικά ως ένα βαθμό. Η απόκρισή τους, εξαρτάται από την ατομική τους δομή, την θερμοκρασία και το πεδίο. Παρουσία μαγνητικού πεδίου οι μαγνητικές ροπές των ατόμων τείνουν να διευθετηθούν παράλληλα με αυτό, όμως η τάση αυτή αντισταθμίζεται από τις θερμικές τους κινήσεις. Ο βαθμός απόκρισης ενός υλικού σε ένα εφαρμοζόμενο πεδίο ποσοτικοποιείται μέσα από τη μαγνητική επιδεκτικότητα χ και καθορίζεται από την εξίσωση (1.6) (νόμος Curie-Weiss) [25]. χ Μ Η (εξίσωση 1.6) Τύποι μαγνητισμού Συναντώνται οι παρακάτω τύποι μαγνητισμού (Εικόνα 1.4), ανάλογα με τη συμπεριφορά των υλικών στην επίδραση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου [26]. Ο διαμαγνητισμός είναι μια πολύ ασθενής μορφή μαγνητισμού, η οποία είναι αντιστρεπτή και διαρκεί μόνο όσο εφαρμόζεται ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Στα διαμαγνητικά υλικά, χωρίς την παρουσία κάποιου εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, σε κάθε άτομο, οι ροπές λόγω των ηλεκτρονιακών spin είναι αντίρροπες μεταξύ τους, καθώς και οι μαγνητικές ροπές λόγω της τροχιακής κίνησης των ηλεκτρονίων, με αποτέλεσμα, μακροσκοπικά, η ολική μαγνητική ροπή να είναι μηδενική. Υπό την επίδραση ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τα τροχιακά των ηλεκτρονίων των ατόμων τροποποιούνται, 18

19 διότι σύμφωνα με το νόμο του Laplace, ένα ηλεκτρικό φορτίο, όταν κινείται εντός ενός μαγνητικού πεδίου αποκλίνει από την πορεία του. Aυτή η τροποποίηση των τροχιακών και επομένως των μαγνητικών ροπών των ατόμων, οδηγεί στο σχηματισμό μικρών μαγνητικών διπόλων μέσα στα άτομα, που αντιτίθενται στο εξωτερικό πεδίο, με συνέπεια ένα αρνητικό μαγνητικό αποτέλεσμα. Αυτό έχει σαν συνέπεια, την άπωση των διαμαγνητικών υλικών από κάποιο μόνιμο μαγνήτη. Η σχετική μαγνητική διαπερατότητα των διαμαγνητικών υλικών είναι λίγο μικρότερη της μονάδας και η μαγνητική επιδεκτικότητά τους είναι αρνητική και πολύ μικρή της τάξης του χ Παράδειγμα διαμαγνητικών υλικών, είναι ο χαλκός, ο άργυρος, ο χρυσός, το βισμούθιο. Τα υλικά τα οποία παρουσιάζουν μαγνητική διαπερατότητα λίγο μεγαλύτερη της μονάδας και πολύ μικρή και θετική μαγνητική επιδεκτικότητα (χ ) ονομάζονται παραμαγνητικά υλικά και το μαγνητικό φαινόμενο ονομάζεται παραμαγνητισμός. Στα παραμαγνητικά υλικά, οι μαγνητικές ροπές που σχετίζονται με τα ηλεκτρόνια και τα spin τους μέσα σ ένα άτομο, δεν αλληλοαναιρούνται απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Συνεπώς, κάθε άτομο έχει μια μικρή μαγνητική ροπή, η διεύθυνση της οποίας όμως είναι τυχαία, γι αυτό και η ολική μαγνητική ροπή μιας μεγάλης περιοχής δείγματος, όπως και η ολική μαγνήτιση Μ, είναι μηδενικές απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Ο παραμαγνητισμός, δημιουργείται από τον προσανατολισμό των μαγνητικών ροπών των ατόμων ή των μορίων, κατά τη διεύθυνση του εφαρμοζόμενου εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, με αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης του ασκούμενου μαγνητικού πεδίου. Τα παραμαγνητικά υλικά έλκονται ελαφρά από ένα μόνιμο μαγνήτη. Όπως ο διαμαγνητισμός, έτσι και ο παραμαγνητισμός είναι ένα αντιστρεπτό φαινόμενο. Παράδειγμα παραμαγνητικών υλικών είναι το αλουμίνιο, το μαγγάνιο και ο λευκόχρυσος. Σε αντίθεση με τα παραμαγνητικά και τα διαμαγνητικά υλικά, κατά το σιδηρομαγνητισμό στα σιδηρομαγνητικά υλικά, τα άτομα, απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, έχουν πολύ ισχυρές μαγνητικές ροπές που οφείλονται στα ασύζευκτα ηλεκτρονιακά spin στα 3d τροχιακά. Αυτές οι μαγνητικές ροπές συσχετίζονται και δημιουργούν περιοχές μαγνητικών περιοχών ή περιοχών Weiss, διαφόρων μεγεθών και σχημάτων, από ομόρροπα spin. Οι διαστάσεις των περιοχών εξαρτώνται από την προηγούμενη μαγνητική κατάσταση του υλικού και την προέλευσή του και ποικίλουν από 1 μm μέχρι και μερικά χιλιοστά. Σε μακροσκοπική κλίμακα όμως, η ολική μαγνήτιση Μ απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου είναι μηδέν, διότι οι περιοχές είναι τυχαία προσανατολισμένες και οι μαγνητικές ροπές των διαφόρων ατόμων αλληλοαναιρούνται. Όταν εφαρμοστεί εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, η συνολική μαγνήτιση είναι μεγάλη δίνοντας πολύ μεγάλες επιδεκτικότητες χ = Στη συνέχεια, όταν το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο απομακρυνθεί, οι μαγνητικές ροπές των διαφόρων ατόμων διατηρούν τον προηγούμενο προσανατολισμό τους και παραμένει μια ολική μόνιμη μαγνήτιση Μ. Βλέπουμε λοιπόν ότι η μαγνήτιση ενός σιδηρομαγνητικού υλικού, είναι διαφορετική σε μακροσκοπική κλίμακα μετά την απομάκρυνση ενός εξωτερικού πεδίου, δηλαδή η μαγνητική του κατάσταση εξαρτάται από την προηγούμενή του ιστορία. Έτσι, η εξάρτηση της μαγνήτισης Μ από το εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο, δεν είναι γραμμική αλλά σχηματίζει ένα βρόγχο υστέρησης. Επιπλέον, οι τιμές της επιδεκτικότητας και της διαπερατότητας δεν είναι σταθερές, αλλά μεταβάλλονται. Παράδειγμα σιδηρομαγνητικών υλικών είναι ο σίδηρος, το κοβάλτιο και το νικέλιο. 19

20 Εικόνα 1. 4: Πυκνότητα των δυναμικών γραμμών εντός του σωματιδίου ανάλογα με το είδος του υλικού. Κατά τον αντισιδηρομαγνητισμό, στα υλικά, παρουσία μαγνητικού πεδίου, παρατηρείται αντιπαράλληλος προσανατολισμός των μαγνητικών ατομικών ροπών, με αποτέλεσμα το μηδενισμό της εσωτερικής τους μαγνητικής ροπής. Τέτοια συμπεριφορά, παρουσιάζουν τα μεταβατικά στοιχεία Cr και Mn όπως και ενώσεις των μεταβατικών στοιχείων με αμέταλλα, όπως MnO, NiO και MnS. Η διαφορά μεταξύ σιδηρομαγνητισμού και αντισιδηρομαγνητισμού βρίσκεται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ γειτονικών ατόμων, δηλαδή εάν αυτά ενισχύονται ή αντιτίθενται το ένα στο άλλο αντίστοιχα. Η εφαρμογή εξωτερικού πεδίου έχει μικρή επίδραση σ αυτά τα υλικά και οι σχετικές διαπερατότητες είναι λίγο μεγαλύτερες από τη μονάδα. Αν οι γειτονικές αντίρροπες μαγνητικές ροπές ενός υλικού είναι μεγάλες και άνισες, απουσία εξωτερικού πεδίου, τότε το υλικό ονομάζεται σιδηριμαγνήτης. Οι μόνιμες μαγνητικές ροπές στα σιδηριμαγνητικά υλικά, προέρχονται από τις ατομικές μαγνητικές ροπές, εξαιτίας της ροπής λόγω spinτου ηλεκτρονίου (μη εξουδετερωμένες στροφορμές του spin του ηλεκτρονίου ως συνέπεια της ηλεκτρονιακής δομής). Υπάρχει επίσης και η συνεισφορά της τροχιακής μαγνητικής ροπής, που είναι μικρή σε σχέση με την ροπή του spin. Όταν το υλικό αυτό βρίσκεται μέσα σε πεδίο, τότε παρουσιάζει μεγάλες τιμές διαπερατότητας, όχι όμως τόσο μεγάλες όσο των σιδηρομαγνητών. Οι φερρίτες αποτελούν μια ομάδα σιδηριμαγνητών με χαμηλές αγωγιμότητες. Τα μαγνητικά πεδία που παράγονται σε αυτούς, είναι αρκετά ισχυρά και για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται σε διάφορες εφαρμογές Μαγνητικές περιοχές Weiss Ο σιδηρομαγνητισμός σε έναν κρύσταλλο προκύπτει από την αλληλεπίδραση των μαγνητικών ροπών λόγω του spin και της τροχιακής κίνησης των ηλεκτρονίων γύρω από τον πυρήνα των ατόμων. Μακροσκοπικά όμως η εικόνα του κρυστάλλου είναι επίσης πολύπλοκη. Θεωρούμε ότι ο κρύσταλλος χωρίζεται σε μαγνητικές περιοχές, τις οποίες ονομάζουμε περιοχές Weiss. Μέσα σε κάθε περιοχή, όλα τα spin είναι παράλληλα διευθετημένα δίνοντας ένα μόνο συνολικό spin. Τo spin όμως της κάθε περιοχής, είναι τυχαία διευθετημένα το ένα σε σχέση με το άλλο. Τα όρια ανάμεσα στις μαγνητικές περιοχές ονομάζονται τοιχώματα Bloch. Εκεί η διεύθυνση των μαγνητικών ροπών αλλάζει συνεχώς και σταδιακά. Στο παρακάτω σχήμα (Εικόνα 1.5) φαίνεται η εναλλαγή της κατεύθυνσης των spin μεταξύ δύο περιοχών Weiss και ενός τοιχώματος Bloch. 20

21 Εικόνα 1. 5 Τοίχωμα Bloch ανάμεσα σε δυο μαγνητικές περιοχές Weiss [20]. Τα spin τείνουν να διευθετηθούν παράλληλα λόγω των αλληλεπιδράσεων ανταλλαγής (επικάλυψη των τροχιακών), αλλά οι αλληλεπιδράσεις μαγνητικού διπόλου τείνουν να τα διευθετήσουν αντιπαράλληλα. Άρα, οι αλληλεπιδράσεις ανταλλαγής διευθετούν τα spin εντός μιας περιοχής παράλληλα, ενώ οι αλληλεπιδράσεις μαγνητικού διπόλου τείνουν να διευθετήσουν τα spin των διαφορετικών περιοχών σε διαφορετικές κατευθύνσεις. Όταν εφαρμοστεί εξωτερικό μαγνητικό πεδίο,το υλικό μαγνητίζεται, οι περιοχές τείνουν να γίνουν παράλληλες προς αυτό, κάτι που οφείλεται σε δύο μηχανισμούς. Σύμφωνα με τον πρώτο, η αύξηση οφείλεται στην αύξηση του όγκου των περιοχών εκείνων, που η μαγνητική τους ροπή σχηματίζει μικρότερη γωνία με τη διεύθυνση του εξωτερικού πεδίου, κάτι που αποδίδεται στη μετατόπιση των τοιχωμάτων Bloch. Σύμφωνα με τον δεύτερο, η αύξηση οφείλεται στη στροφή των ροπών των περιοχών Weiss [20] Μαγνητισμός σε νανοκλίμακα Τα φαινόμενα μαγνητισμού στη νανοκλίμακα, εξηγούνται εστιάζοντας στα σύγχρονα νανομαγνητικά υλικά και στα σχετικά με τις διαστάσεις τους φαινόμενα, όπως είναι ο υπερπαραμαγνητισμός, δηλαδή, η σύζευξη ανταλλαγής και τα φαινόμενα υβριδισμού που οδηγούν σε εμφάνιση μαγνητικής ροπής, σε μη μαγνητικά υλικά. Είναι γνωστό ότι ο μαγνητισμός μικροσκοπικής κλίμακας, επηρεάζεται πολύ από τα επιφανειακά άτομα (surface & interface). Αξίζει να σημειωθεί επιπλέον, ότι σε νανοσωματίδια με μέση διάμετρο ~3 nm αντιστοιχούν ~ 1400 άτομα ανά νανοσωματίδιο εκ των οποίων το 40% βρίσκεται στην επιφάνεια του νανοσωματιδίου. Το πρόβλημα της μείωσης των διαστάσεων, δηλαδή πόσα άτομα είναι απαραίτητα για να διαχωρίσουμε μια νανοδομή από ένα συμπαγή μαγνήτη, δεν εξαρτάται μόνο από τη γεωμετρία της δομής, αλλά και από τις ενδογενείς και εξωγενείς ιδιότητες. Οι ενδογενείς ιδιότητες, όπως η αυθόρμητη μαγνήτιση, ο όρος ανισοτροπία και η ισχύς των αλληλεπιδράσεων παρακείμενων μαγνητικών «στιγμών». Αυτή η αλληλεπίδραση, αποτελεί την πηγή της σιδηρομαγνητικής συμπεριφοράς και χαρακτηρίζεται ως «αναταλλαγή ακαμψίας» (exchange stiffness), αναφέρονται στην ατομική προέλευση του μαγνητισμού. Οι εξωγενείς ιδιότητες, όπως η παραμένουσα μαγνήτιση και το συνεκτικό πεδίο, σχετίζονται με τη μαγνητική υστέρηση και παρουσιάζουν δομική εξάρτηση. Οι μαγνητικές νανοδομές παρουσιάζουν μια πλούσια εξωγενή συμπεριφορά, περιλαμβάνοντας φαινόμενα όπως η διαβάθμιση της ανισοτροπίας με τυχαίο τρόπο (random anisotropy scaling), η ενίσχυση της παραμένουσας μαγνήτισης, ο εντοπισμός της μικρομαγνητικής συμπεριφοράς (micromagnetic localization) αλλά και πλήθος φαινομένων, που σχετίζονται με τη σύζευξη ανταλλαγής. 21

22 Η μαγνητική ανισοτροπία, που συνδέεται άμεσα με τη μαγνητική ροπή, είναι μια ιδιότητα που αποτελεί συνάρτηση της κατεύθυνσης και οφείλεται στην κρυσταλλική συμμετρία, ή στην ατομική διάταξη των spin (atomic pair ordering). Η κύρια συνεισφορά στην μαγνητική ανισοτροπία αναφέρεται ως μαγνητοκρυσταλλική ανισοτροπία. Η μαγνητοκρυσταλλική ανισοτροπία είναι μια εγγενής, εσωτερική ιδιότητα ενός υλικού, ανεξάρτητη από το μέγεθος των σωματιδίων και τη μορφή τους. Σε κάθε κρυσταλλικό μαγνητικό υλικό υπάρχουν ορισμένοι άξονες, οι οποίοι είναι εύκολο να προσανατολιστούν με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο (εύκολοι άξονες μαγνήτισης) και κάποιοι άλλοι οι οποίοι παρουσιάζουν αντίσταση στο να προσανατολισθούν (δύσκολοι άξονες μαγνήτισης). Για να μαγνητιστεί ένας κρύσταλλος σε ένα δύσκολο άξονα, απαιτείται περισσότερο έργο απ ότι σε έναν εύκολο. Η επιπλέον απαιτούμενη ενέργεια που χρειάζεται για να αποκλίνει η μαγνητική ροπή σε ένα κρύσταλλο, από την εύκολη στη δύσκολη κατεύθυνση, ονομάζεται ενέργεια ανισοτροπίας. Οι εύκολες και οι δύσκολες κατευθύνσεις προκύπτουν από την αλληλεπίδραση των μαγνητικών ροπών spin τροχιάς. Συγκεκριμένα η ανισοτροπία προκαλείται από μία ζεύξη των τροχιών των ηλεκτρονίων σε ένα πλέγμα, και σε μία απλή κατεύθυνση μαγνητισμού. Αυτή η ζεύξη είναι τέτοια, που αυτές οι τροχιές είναι σε σημείο κατώτατης ενεργειακής κατάστασης. Η απλή κατεύθυνση μαγνητισμού, για έναν μόνιμο μαγνήτη, βασισμένο στον φερρίτη, πρέπει να είναι μονοαξονική, όμως είναι δυνατό να υπάρχουν υλικά με πολλαπλούς εύκολους άξονες ή υλικά στα οποία ο εύκολος άξονας μπορεί να βρίσκεται παντού, σε ένα συγκεκριμένο επίπεδο ή στην επιφάνεια ενός κώνου. H ενέργεια ανισοτροπίας παριστά ένα ενεργειακό φράγμα, το οποίο εμποδίζει τα spin να αλλάξουν προσανατολισμό. Όταν η ενέργεια αυτή γίνει συγκρίσιμη με την θερμική ενέργεια, τότε το υλικό γίνεται υπερπαραμαγνητικό. Ο υπερπαραμαγνητισμός [26] είναι μία μοναδική ιδιότητα που εμφανίζουν οι νανοδομές βασισμένες σε σιδηρομαγνητικά ή σιδηριμαγνητικά υλικά και βρίσκονται κάτω από ένα ορισμένο μέγεθος (10 20 nm). Η ονομασία αυτή έχει δοθεί, επειδή τα σωματίδια δείχνουν συμπεριφορά παρόμοια με αυτή των παραμαγνητικών υλικών, αλλά με πολύ μεγαλύτερες μαγνητικές ροπές. Πιο συγκεκριμένα, ο υπερπαραμαγνητισμός είναι το αποτέλεσμα μιας ευαίσθητης ισορροπίας ανάμεσα στη μαγνητική και τη θερμική ενέργεια. Γενικά, στα σιδηρομαγνητικά υλικά οι μαγνητικές ροπές των μονήρων ηλεκτρονίων παρατάσσονται παράλληλα με τις ροπές των ηλεκτρονίων γειτονικών τους ατόμων. Για να μειωθεί η ενέργεια του συστήματος τα υλικά σχηματίζουν αυθόρμητα μαγνητικές περιοχές (περιοχές Weiss - παράγραφος 1.3.3), με μέγεθος μερικές δεκάδες nm, στις οποίες όλες οι ατομικές μαγνητικές ροπές έχουν την ίδια κατεύθυνση. Μακροσκοπικά, ένα σιδηρομαγνητικό υλικό δεν παρουσιάζει μαγνήτιση γιατί οι ροπές των περιοχών Weiss προσανατολίζονται τυχαία. Με την εφαρμογή, όμως, εξωτερικού μαγνητικού πεδίου το υλικό μαγνητίζεται. Κάτω από μια συγκεκριμένη θερμοκρασία (blocking temperature), η θερμική ενέργεια δεν είναι αρκετά μεγάλη ώστε να στρέψει τις μαγνητικές ροπές, με αποτέλεσμα να παγιώνονται σε συγκεκριμένες κατευθύνσεις και να έχουμε την εμφάνιση σιδηρομαγνητικής συμπεριφοράς. Η θερμοκρασία αυτή, έχει ιδιαίτερη σημασία καθώς αντιστοιχεί στη μέγιστη τιμή επιδεκτικότητας και στο ελάχιστο όριο υπερπαραμαγνητικής συμπεριφοράς. Επιπλέον, όσο μειώνεται το μέγεθος του σωματιδίου, τόσο μειώνεται και η θερμοκρασία μετάβασης από τον σιδηρομαγνητισμό στον υπερπαραμαγνητισμό. 22

23 Απόκριση σε εξωτερικά μαγνητικά πεδία Σημαντικό ρόλο στις εφαρμογές των νανοκολλοειδών παίζει η μαγνητική τους ροπή. Τα νανοκολλοειδή που παρασκευάζονται, έχουν συνήθως μεγέθη της τάξης των 10 nm. Σε αυτά τα μεγέθη, ένα σημαντικό μέρος των ατόμων βρίσκεται στην επιφάνεια των σωματιδίων. Τα spin όμως αυτών των ατόμων τείνουν να δυσκολεύονται να ευθυγραμμιστούν με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, παρουσιάζοντας έτσι μία ελαφριά απόκλιση, σε αντίθεση με τα spin των εσωτερικών ατόμων. Έτσι, στην επιφάνεια του νανοσωματιδίου δημιουργείται ένα στρώμα μη-ευθυγραμμισμένων spin, που έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση της συνολικής μαγνήτισης του νανοσωματιδίου (Εικόνα 1.6). Εικόνα 1. 6: Σχηματική απεικόνιση της διαταραγμένης επιφάνειας των spin στην νανοκλίμακα και της εξάρτησης της μαγνήτισης κορεσμού από το μέγεθος των νανοσωματιδίων [27]. Αυτό, δυσχεραίνει τον έλεγχο της κίνησης τους στον οργανισμό με την χρήση μαγνητικών πεδίων. Επομένως, περιορίζει και την χρήση τους σε εφαρμογές στοχευμένης θεραπείας. Ένας τρόπος για να αυξηθεί η μαγνητική ροπή των σωματιδίων, είναι να αυξηθεί αρκετά το μέγεθος τους. Κάτι τέτοιο όμως, θα σήμαινε την μετάβαση των ΜΝΣ από την υπερπαραμαγνητική στη σιδηρομαγνητική συμπεριφορά (κρίσιμη διάμετρος ~20nm για Fe 3 O 4 ), με αποτέλεσμα τα νανοσωματίδια να μην διασπείρονται πλέον αποτελεσματικά. Μία στρατηγική για την αντιμετώπιση αυτού του εμποδίου, είναι η σύνθεση κολλοειδών πλειάδων (colloidal clusters) μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών. Με αυτόν τον τρόπο, εξασφαλίζεται το πλεονέκτημα της αύξησης της μαγνητικής ροπής ανά κολλοειδές σωματίδιο (δηλαδή του όγκου μαγνητικού υλικού ανά κολλοειδές σωματίδιο), με ταυτόχρονη διατήρηση των υπερπαραμαγνητικών χαρακτηριστικών. Η σημασία της αύξησης του όγκου μαγνητικού υλικού ανά κολλοειδές σωματίδιο, γίνεται καλύτερα αντιληπτή, αν ληφθεί υπόψη πως η απόκριση ενός μαγνητικού σωματιδίου σε βαθμίδα μαγνητικού πεδίου περιγράφεται από την παρακάτω εξίσωση [28]. (εξίσωση 1.7) όπου F η μαγνητική δύναμη που ασκείται στο μαγνητικό υλικό, Vt ο συνολικός όγκος του μαγνητικού υλικού που υπάρχει σε κάθε σωματίδιο, B η μαγνητική επαγωγή και Ms η μαγνήτιση κόρου. Οπότε, η παράμετρος που υπαγορεύει το πως αποκρίνεται το σωματίδιο είναι το ποσό του μαγνητικού υλικού που συμμετέχει σε κάθε πλειάδα. 23

24 1.4. Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (ΜΝΣ) Υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) με την κατάλληλη χημική επεξεργασία της επιφανείας τους, έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί πειραματικά για πολλές in νίνο εφαρμογές, όπως στην ενίσχυση της αντίθεσης στην απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI), στην επισκευή των ιστών, στην ανοσοδοκιμασία, στην αποτοξίνωση από βιολογικά υγρά, στην υπερθερμία, στη χορήγηση φαρμάκων, στον διαχωρισμό των κυττάρων, κλπ. Όλες αυτές οι βιοϊατρικές και βιοτεχνολογικές εφαρμογές, απαιτούν αυτά τα νανοσωματίδια να έχουν υψηλές τιμές μαγνητισμού και το μέγεθός τους να είναι από περίπου 100 nm και κάτω, με συνολικά περιορισμένη κατανομή μεγέθους σωματιδίων, έτσι ώστε, τα σωματίδια να έχουν ομοιόμορφη δομή και ίδιες φυσικές και χημικές ιδιότητες. Επιπλέον, αυτές οι εφαρμογές χρειάζονται ειδική επιφανειακή επικάλυψη των μαγνητικών σωματιδίων, τα οποία πρέπει να είναι όχι μόνο μη-τοξικά και βιοσυμβατά, αλλά επίσης να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συστήματα στοχευμένης αποδέσμευσης, με τον εντοπισμό δηλαδή των σωματιδίων σε μια συγκεκριμένη περιοχή. Η φύση της επιφανειακής επικάλυψης και συνεπακόλουθα, η γεωμετρική διευθέτηση των μακρομορίων αυτών στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων, όχι μόνο καθορίζουν το συνολικό μέγεθος του κολλοειδούς, αλλά παίζουν επίσης ένα σημαντικό ρόλο στην βιοκινητική του και την κατανομή του στο σώμα. Οι τύποι των ειδικών επικαλύψεων, ή παραγωγοποίηση, όπως μπορεί να περιγραφεί αυτή η χημική διεργασία, εξαρτάται από την τελική εφαρμογή. Για παράδειγμα, είτε προορίζονται για την αντιμετώπιση μιας φλεγμονής, είτε αν πρόκειται για αντικαρκινικούς παραγόντες, η επιφανειακή τροποποίηση, θα πρέπει να επιλέγεται με βάση τη διατήρηση συγκεκριμένων ιδιοτήτων που αφορούν στην εφαρμογή αυτή. Μαγνητικά νανοσωματίδια, μπορούν να συνδεθούν με φάρμακα, πρωτεΐνες, ένζυμα, αντισώματα, ή και νουκλεοτίδια και μπορεί να κατευθύνονται σε ένα όργανο, ιστό ή όγκο χρησιμοποιώντας ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο ή τέλος μπορεί να θερμαίνονται με εφαρμογή εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων για χρήση σε υπερθερμία. Απαραίτητη λοιπόν καθίσταται η χρήση της συνθετικής χημείας, για την επιφανειακή τροποποίηση των υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου, και συνεπακόλουθα για τη χρήση τους για την πιο πάνω βιοϊατρικές εφαρμογές [29] Μέθοδοι σύνθεσης ΜΝΣ Πολυάριθμες χημικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων για βιοϊατρικές εφαρμογές: μικρογαλακτώματα [30], συνθέσεις διαλύματος-γέλης [31], χημικές αντιδράσεις με χρήση υπερήχων [32], υδροθερμικές αντιδράσεις, μέσω υδρόλυσης και θερμόλυσης πρόδρομων ουσιών [33], συνθέσεις μέσω ένεσης ροής [34] και συνθέσεις ηλεκτροψεκασμού [35]. Η σύνθεση των υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων είναι μια πολύπλοκη διαδικασία εξαιτίας της κολλοειδούς φύσης των σωματιδίων, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Η πρώτη και κύρια χημική πρόκληση, συνίσταται στον ορισμό των πειραματικών συνθηκών, που οδηγεί σε ένα πληθυσμό μονοδιεσπαρμένων μαγνητικών σωματιδίων, κατάλληλου μεγέθους. Το δεύτερο κρίσιμο σημείο, είναι να επιλεχθεί μια διαδικασία που μπορεί να είναι επαναλήψιμη και μπορεί να αναπτυχθεί σε βιομηχανική κλίμακα, χωρίς πολύπλοκη διαδικασία καθαρισμού, αλλά με μεθόδους όπως η υπερφυγοκέντριση, η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους, το φιλτράρισμα με μαγνήτες, ή η μέθοδος του βαθμιδωτού πεδίου ροής. Οι παραπάνω μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή σωματιδίων με ομογενή σύσταση και ομοιόμορφη κατανομή μεγέθους. Ωστόσο, η πιο κοινή 24

25 μέθοδος για την παραγωγή νανοσωματιδίων μαγνητίτη, είναι η τεχνική της χημικής συγκαταβύθισης αλάτων σιδήρου Χημική συγκαταβύθιση αλάτων σιδήρου [36] : Η τεχνική της συγκαταβύθισης είναι ίσως η πιο απλή και η πιο αποτελεσματική μέθοδος για την απόκτηση μαγνητικών σωματιδίων. Οξείδια του σιδήρου (Fe 3 O 4 είτε ή γfe 2 O 3 ) παρασκευάζονται συνήθως, αφήνοντας το στοιχειομετρικό μείγμα αλάτων δισθενούς και τρισθενούς σιδήρου σε υδατικό μέσο. Η χημική αντίδραση σχηματισμού Fe 3 O 4 μπορεί να γραφεί όπως παρακάτω (αντίδραση 1.1): (αντίδραση 1.1) Σύμφωνα με τη θερμοδυναμική της αντίδρασης αυτής, η πλήρης καθίζηση του Fe 3 O 4 θα πρέπει να αναμένεται σε ένα pη μεταξύ 8 και 14, με στοιχειομετρική αναλογία 2:1 (Fe 3+ / Fe 2+ ) σε ένα μη-οξειδωτικό περιβάλλον οξυγόνου [37] (αντίδραση 1.2) Η οξείδωση στον αέρα δεν είναι ο μόνος τρόπος για να μετατραπεί ο μαγνητίτης (Fe 3 O 4 ) σε μαγκεμίτη (γfe 2 O 3 ). Σε αυτή τη διεργασία εμπλέκονται μεταφορές ηλεκτρονίων ή ιόντων, ανάλογα με το pη του εναιωρήματος, σύμφωνα με την αντίδραση 1.2. Σε όξινες και αναερόβιες συνθήκες, επιφανειακά ιόντα Fe 2+, προσροφούνται ως εξαένυδρα σύμπλοκα στο διάλυμα, ενώ, υπό βασικές συνθήκες, η οξείδωση του μαγνητίτη, περιλαμβάνει διεργασίες οξείδωσης αναγωγής στην επιφάνειά του. Η οξείδωση των ιόντων δισθενούς σιδήρου συσχετίζεται με τη απομάκρυνση κατιόντων από το κρυσταλλικό πλέγμα, δημιουργώντας κενές κατιονικές θέσεις, για τη διατήρηση του ισοζυγίου φορτίου, δίνοντας μια εξήγηση για τη δομή του μαγκεμίτη. Στο μαγκεμίτη, τα ιόντα σιδήρου καταλαμβάνουν τις οκταεδρικές (Οh) και τετραεδρικές (Td) θέσεις μιας δομής σπινελίου, αλλά ο μαγκεμίτης διαφέρει από μαγνητίτη στην ύπαρξη κενών κατιονικών θέσεων μέσα στην οκταεδρική δομή. Η ύπαρξη αυτών των κενών θέσεων, εξαρτάται από τη μέθοδο παρασκευής του δείγματος και οδηγεί σε μείωση της συμμετρίας του προϊόντος και ενδεχομένως, σε υπερδομές. Οι κενές θέσεις μπορεί να έχουν εντελώς τυχαία διασπορά, ή εν μέρει τυχαία, ή να είναι πλήρως διατεταγμένες. Έχει αποδειχθεί από τη συνδυασμένη μελέτη IR φασμάτων και περίθλασης ακτίνων-χ (XRD), ότι αυτά τα κενά υπάρχουν μόνο για νανοσωματίδια που υπερβαίνουν τα 5 nm. Παρακάτω παρατίθενται οι δομές του μαγνητίτη και του μαγκεμίτη Fe 3 O 4 : [Fe 3+ ] Td [Fe 3+ Fe 2+ ] Oh O 4 γfe 2 O 3 : 0.75[Fe 3+ ] Td [Fe 5/3 3+ V 1/3 ] Oh O 4 Το κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου συγκαταβύθισης, είναι ότι μπορεί να συντεθεί μεγάλη ποσότητα νανοσωματιδίων. Ωστόσο, ο έλεγχος της κατανομής μεγέθους σωματιδίων είναι περιορισμένος, γιατί μόνο κινητικοί παράγοντες ελέγχουν την ανάπτυξη του κρυστάλλου. Κατά τη διαδικασία της συγκαταβύθισης, τα δύο στάδια που εμπλέκονται είναι: αρχικά ένα σύντομο στάδιο σχηματισμού πυρήνων, όταν η συγκέντρωση των αντιδρώντων φτάνει στην κρίσιμη τιμή του υπερκορεσμού, και στη συνέχεια, υπάρχει ένα δεύτερο αργό στάδιο, όπου γίνεται περεταίρω ανάπτυξη των πυρήνων με διάχυση των διαλυμένων ουσιών 25

26 στην επιφάνεια του κρυστάλλου. Για την παραγωγή μονοδιασποράς ΜΝΣ, αυτά τα δύο στάδια θα πρέπει να διαχωρίζονται, δηλαδή, η δημιουργία πυρήνων θα πρέπει να αποφεύγεται κατά τη διάρκεια της περιόδου ανάπτυξής τους [ 38 ]. Γενικά, ο έλεγχος του μεγέθους μονοδιασπαρμένων σωματίδιων πρέπει κανονικά να γίνεται κατά τη διάρκεια της πολύ σύντομης περιόδου, του σχηματισμού των πυρήνων, γιατί ο τελικός αριθμός σωματιδίων προσδιορίζεται στο τέλος αυτού του σταδίου και δεν αλλάζει κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των σωματιδίων. Μια μεγάλη ποικιλία παραγόντων, εμπλεκόμενων στη σύνθεση ΜΝΣ, μπορεί να επηρεάσει το μέγεθος, τις μαγνητικές ιδιότητες, ή ακόμα και τις φυσικοχημικές ιδιότητες της επιφάνειάς τους [39]. Το μέγεθος και το σχήμα των νανοσωματιδίων μπορεί να ελεγχθούν, με σχετική επιτυχία, με τη ρύθμιση του pη, της ιοντικής ισχύος, τη θερμοκρασίας, τη φύση των αλάτων που προστίθενται (υπερχλωρικά, χλωριούχα, θειικά και νιτρικά άλατα), τη σύσταση του μέσου διασποράς, ή ακόμα και με την προσαρμογή της αναλογίας της συγκέντρωσης Fe II / Fe III. Έτσι, μπορούν να συντεθούν σωματίδια με μέγεθος που κυμαίνεται από 2 μέχρι 17 nm. Η προσθήκη χηλικών οργανικών ανιόντων (καρβοξυλικών ή α-υδρόξυ καρβοξυλικών ιόντων, όπως κιτρικό, γλυκονικό, ή ελαϊκό οξύ) ή πολυμερών, με σκοπό την συμπλοκοποίηση της επιφάνειας (όπως δεξτράνη, καρβοξυδεξτράνη, άμυλο, πολυβινυλική αλκοόλη), κατά τη διάρκεια του σχηματισμού του μαγνητίτη, μπορεί να βοηθήσει τον έλεγχο του μεγέθους των νανοσωματίδιων. Αυτή η μέθοδος βέβαια, αφορά περισσότερο στη σταθεροποίηση των πολυμερών. Ανάλογα με την μοριακή αναλογία των οργανικών ιόντων και των αλάτων σιδήρου, η δημιουργία χηλικών δεσμών στην επιφάνεια του ΜΝΣ μπορεί είτε να συντελέσει στην πρόληψη σχηματισμού πυρήνων και στη συνέχεια να οδηγήσει σε μεγαλύτερα σωματίδια, είτε να αναστείλει την ανάπτυξη των πυρήνων των κρυστάλλων και να οδηγήσει σε μικρότερα νανοσωματίδια Μέθοδος αλκαλικής καταβύθισης συμπλόκων του σιδήρου [20] : Η μέθοδος αυτή αφορά στην αλκαλική καταβύθιση ενός μόνο πρόδρομου συμπλόκου του σιδήρου σε υδάτινο φορέα. Παρασκευάζονται νανοκολλοειδή μαγνητίτη με εξίσου καλές μαγνητικές ιδιότητες, αλλά και πιο σταθερά όσον αφορά στην οξείδωση τους προς μαγκεμίτη, σύμφωνα με την αντίδραση 1.3. (αντίδραση 1.3) Αντιδράσεις σε χωρικά περιορισμένα περιβάλλοντα Δεδομένου ότι τα σωματίδια που λαμβάνονται με τη μέθοδο συγκαταβύθισης έχουν πιο ευρύ μέγεθος σωματιδίων, από το βέλτιστο, πολλές άλλες μέθοδοι αναπτύσσονται σήμερα για να παραχθούν νανοσωματίδια με περισσότερο ομοιόμορφες διαστάσεις. Έχουν αναφερθεί αρκετές προσπάθειες για το σχηματισμό νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου καλά καθορισμένου μεγέθους με χρήση συνθετικών και βιολογικών νανοαντιδραστήρων. Ως αντίδραση σε περιορισμένο περιβάλλον, ορίζεται μια αντίδραση που στα αντιδραστήρια περιλαμβάνονται αμφοτερίζουσες επιφανειοδραστικές ουσίες, που δημιουργούν ανάστροφες 26

27 μικυλλιακές δομές. Αυτές οι δομές, διογκώνονται παρουσία νερού σε μη πολικούς διαλύτες [ 40 ] και σχηματίζουν για παράδειγμα, «κλουβιά» πρωτεΐνης με αποφεριτίνη [ 41 ], δενδριμερή [42], κυκλοδεξτρίνες [43], ακόμα και μεμβράνες φωσφολιπιδίων που σχηματίζουν κυστίδια, με νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου, να χρησιμοποιούνται σαν στερεά υποστρώματα [44]. Έχουν χρησιμοποιηθεί καρβοξυλιωμένα δενδριμερή οξειδίου του σιδήρου, σταθεροποιημένα με ΡΑΜΑΜ (γενιάς 4,5). Η οξείδωση του Fe 2+ σε ελαφρά ανυψωμένη τιμή pη και θερμοκρασία, έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό υδατοδιαλυτών μαγνητοδενδριμερών (νανοσύνθεση οξειδίων του σιδήρου και δενδριμερών), με συνολική διάμετρο ΤΕΜ 8nm και υδροδυναμική διάμετρο 20-30nm. Η βασική υδρόλυση των ιόντων Fe 2+, παρουσία της υδατοδιαλυτής γ-κυκλοδεξτρίνης, επιτρέπει το σχηματισμό νανοσωματιδίων με διάμετρο 1,8 nm. Η φερριτίνη, μπορεί να απιονιστεί δίνοντας αποφερριτίνη με εσωτερική κοιλότητα 8nm, η οποία χρησιμοποιείται ως νανοαντιδραστήρας, οξειδώνοντας αργά σιδηρούχα άλατα με τον αέρα, παρέχοντας σφαιρικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου 6nm σε διάμετρο που εγκλωβίζουν μαγνητο-φερριτίνη. Μόρια επιφανειοδραστικών ενώσεων, μπορούν αυθόρμητα να σχηματίσουν νανοσταγόνες διαφόρων μεγεθών, μικκύλια (1-10nm), ή γαλακτώματα νερού σε έλαιο (10-100nm). Υδατικά διαλύματα αλάτων σιδήρου σχηματίζουν δομές νανοσταγόνων, μέσω ενός επιφανειοδραστικού μέσου, που εγκλωβίζει το υδατικό διάλυμα στο εσωτερικό της δομής και αποφεύγεται έτσι η επαφή του με το περιβαλλόμενο οργανικό διάλυμα. Κατά συνέπεια, το σύστημα αυτό μπορεί να επιβάλλει κινητικούς και θερμοδυναμικούς περιορισμούς στο σχηματισμό σωματιδίων, όπως ένας νανοαντιδραστήρας. Έτσι, ο επιφανειοδραστικά σταθεροποιημένος νανοαντιδραστήρας, περιορίζει την πυρήνωση και την ανάπτυξη σωματιδίων. Το κύριο πλεονέκτημα της τεχνολογίας των ανάστροφων μικκυλίων ή γαλακτωμάτων, είναι η ποικιλομορφία των νανοσωματιδίων που μπορούν να ληφθούν με μεταβολή της φύσης και της ποσότητας των επιφανειοδραστικών στην ελαιώδη φάση, ή των συνθηκών αντίδρασης. Τα γαλακτώματα νερού σε έλαιο, χρησιμοποιούνται σήμερα για την σύνθεση υπερπαραμαγνητικών ΜΝΣ με στενό εύρος μεγέθους και ομοιόμορφες φυσικές ιδιότητες λόγω της ικανότητας του ελέγχου του μεγέθους και το σχήματος των νανοσωματιδίων. Αυτό το σύστημα σχηματίζεται με καλά καθορισμένες νανοσταγόνες της υδατικής φάσης, που διασπείρονται από τη συγκρότηση επιφανειοδραστικών μορίων σε μία συνεχή υδρογονανθρακική φάση. Το κύριο πλεονέκτημα της χρήσης αυτού του τύπου συστήματος γαλακτώματος, είναι ότι το μέγεθος των νανοσωματιδίων μπορεί να ελεγχθεί με τη ρύθμιση του μεγέθους του πυρήνα των υδατικών σταγονιδίων, ρυθμίζοντας τις συγκεντρώσεις του μετάλλου και της βάσης. Οι φάσεις ελαίου και νερού, συχνά περιέχουν διάφορα αδιάλυτα συστατικά, και ως εκ τούτου, η επιλογή του επιφανειοδραστικού (και του συνεπιφανειοδραστικού) εξαρτάται από τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του συστήματος. Yπάρχουν 4 είδη επιφανειοδραστικών ουσιών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ταξινομούνται ανάλογα με την φύση του υδρόφιλου μέρους: - Τα ανιονικά επιφανειοδραστικά : το υδρόφιλο μέρος έχει αρνητικό φορτίο ανιόν) - Τα κατιονικά επιφανειοδραστικά : το υδρόφιλο μέρος έχει θετικό φορτίο (κατιόν) - Τα αμφοτερικά επιφανειοδραστικά : που περιέχουν δυο φορτία ένα θετικό και ένα αρνητικό και - Τα μη-ιονικά επιφανειοδραστικά : που δεν περιέχουν κανένα φορτίο. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται συχνά η χρήση δι-(2-ethylhexysulfosuccinate) νατρίου (ΑΟΤ), βρωμιούχου κετυ-λοτριμεθυλαμμώνιου (CTAB), ή δωδεκυλθειϊκού νατρίου (SDS), 27

28 σαν ιοντικά επιφανειο-δραστικά. Δυστυχώς, η λειτουργική ομάδα των ιοντικών επιφανειοδραστικών στον ενυδατωμένο πυρήνα, φαίνεται να περιορίζει την ικανότητα του σχηματισμού υψηλά κρυσταλλικών νανοσωματιδίων μαγνητίτη [45 ]. Με τη χρήση των μη ιονικών επιφανειοδραστικών, όπως πολυαιθοξυλικά (Triton Χ-100, Igepal CO-520 και Brij- 97), αποφεύγεται η παρουσία τέτοιων λειτουργικών ομάδων και προσφέρει μεγάλες μελλοντικές δυνατότητες. Μία ενδιαφέρουσα προσέγγιση, αποτελεί ο εγκλεισμός νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου σε λιποσώματα (μαγνητολιποσώματα). Δύο είναι τα είδη μαγνητολιποσωμάτων: μικρά λιποσώματα που αποτελούνται από νανοσωματίδια που σταθεροποιούνται με μια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα, χωρίς εσωτερικά υδατικό συστατικό (lipoparticles) ή φωσφολιπιδικά κυστίδια που εγκλωβίζουν οξείδια του σιδήρου σε ένα υδατικό διαμέρισμα (magnetovesicles). Διαφορετικές μέθοδοι έχουν προταθεί για τη σύνθεσή τους: με διαπίδυση μονοστιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) παρουσία ενός νανοσωματιδίου επικαλυμμένου με λαουρικό οξύ, μπορούν να παρασκευαστούν μαγνητολιποσώματα που περιέχουν 1-6 κρυστάλλους ανά λιπόσωμα. Στη διαδικασία αυτή, τα μόρια επιφανειοδραστικού ανταλλάσσονται με τα μόρια φωσφολιπιδίων και κατά συνέπεια, αυξάνεται ο ρυθμός διαπίδυσης. Αυτά τα μαγνητολιποσώματα, έχουν PEG στην επιφάνειά τους, για να παρατείνουν την ημιζωή τους στο αίμα [46]. Παραλλαγές αυτής της διαδικασίας, έχουν περιγραφεί χρησιμοποιώντας διαφορετικό επιφανειοδραστικό (πχ ολεϊκό οξύ) ή διαφορετική φωσφολιπιδική σύσταση. με ενυδάτωση λιπιδικού φιλμ [ 47 ], που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους ή εξώθηση μέσω φίλτρων, εξάτμιση αντίστροφης φάσης, αφυδάτωση/επανενυδάτωση, ή σύνθεση νανοαντιδραστήρων. Μαγνητολιποσώματα μικρού μεγέθους, μπορούν να παρασκευαστούν απευθείας, χρησιμοποιώντας κυστίδια φωσφολιπιδίων που εγκλωβίζουν ιόντα Fe 2+ ως νανοαντιδραστήρες. Η αργή διάχυση των ιόντων υδροξειδίου, στο εσωτερικό των κυστιδίων προκαλεί το σχηματισμό μαγνητικών νανοσωματιδίων. Τα μαγνητολιποσώματα, διαχωρίζονται από το ελεύθερο λιποσώματα με εφαρμογή ενός μαγνητικού πεδίου υψηλής βαθμίδωσης. Οι μέθοδοι καθαρισμού που μπορούν να εφαρμοστούν είναι: φυγοκέντρηση, μαγνητική διαλογή, ή η χρωματογραφία αποκλεισμού πηκτής (GEC). Υπερπαραμαγνητικά οξείδια του σιδήρου έχουν εγκλωβιστεί σε στερεά λιπιδικά νανοσωματίδια (SLNs), που παρασκευάστηκαν από θερμά γαλακτώματα λαδιού-σε-νερό, τα οποία διασπείρονται σε κρύο νερό [48]. Ανάλογα με την διαδικασία που ακολουθείται κατά τον εγκλωβισμό των οξειδίων του σιδήρου, προκύπτουν μαγνητικά SLNs διαφορετικού μεγέθους και διαφορετικής φόρτωσης σιδήρου. Αρκετά συχνά, χρησιμοποιούνται παράγοντες συμπλοκοποίησης, αλλά η χρήση τους έχει κυρίως επίδραση στη μορφολογία των νανοσωματιδίων. Τέλος, μια νέα μέθοδος παραγωγής μαγνητικών νανοσωματιδίων, μπορεί να αποτελέσει η βιοσύνθεσή τους (biomineralization) [ 49 ]. Mαγνητικά σωματίδια παρασκευάστηκαν από κύτταρα του μαγνητικού βακτηρίου Magnetospirillum Grysphiswaldense. Στη βιβλιογραφία περιγράφεται μια μέθοδος, κατά τη οποία, καλλιεργούνται βακτήρια σε ένα μέσο που περιέχει κιτρικό σίδηρο, και στη συνέχεια τα κύτταρά τους, διασπώνται με πρέσα, για την απόκτηση μαγνητολιποσωμάτων με πολύ στενό εύρος κατανομής μεγέθους (μέση διάμετρο 42 ± 9 nm). 28

29 Υδροθερμικές μέθοδοι και αντιδράσεις θερμοκρασίας [50] Οι υδροθερμικές συνθέσεις των νανοσωματιδίων Fe 3 O 4 και των πολύ λεπτής υφής κόνεων, πραγματοποιούνται σε υδατικά μέσα σε αντιδραστήρες ή αυτόκλειστα δοχεία όπου η πίεση μπορεί να είναι μεγαλύτερη από 2000 psi και η θερμοκρασία μπορεί να είναι πάνω από 200 C. Υπάρχουν δύο κύριες οδοί για το σχηματισμό των φερριτών μέσω υδροθερμικών συνθηκών: η υδρόλυση και η οξείδωση ή εξουδετέρωση των μικτών μεταλλικών υδροξειδίων. Αυτές οι δύο αντιδράσεις, είναι όμοιες, εκτός από τα άλατα δισθενούς σιδήρου που χρησιμοποιούνται στην πρώτη μέθοδο. Στη διαδικασία αυτή, οι συνθήκες αντίδρασης, όπως ο διαλύτης, η θερμοκρασία και ο χρόνος, έχουν συνήθως σημαντικές συνέπειες στα προϊόντα. Πράγματι, παρατηρήθηκε ότι το μέγεθος σωματιδίου των κόνεων Fe 3 O 4, αυξήθηκε με αντίδραση σε παρατεταμένο χρόνο και ότι η υψηλότερη περιεκτικότητα σε νερό, είχε ως αποτέλεσμα την καταβύθιση μεγαλύτερων σωματιδίων Fe 3 O 4. Κατά την υδροθερμική διαδικασία, το μέγεθος των σωματιδίων στην κρυστάλλωση ελέγχεται κυρίως μέσω του ρυθμού του σχηματισμού πυρήνων και ανάπτυξης κόκκων. Ο ρυθμός αυτός, εξαρτάται από τη θερμοκρασία αντίδρασης, με τις άλλες συνθήκες να είναι σταθερές. Ο σχηματισμός πυρήνων θα μπορούσε να είναι πιο γρήγορος από την ανάπτυξη των κόκκων σε υψηλότερες θερμοκρασίες και αυτό θα είχε σαν αποτέλεσμα, τη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων. Από την άλλη πλευρά, παράταση του χρόνου αντίδρασης, θα μπορούσε να ευνοήσει την ανάπτυξη κόκκων Αντιδράσεις κολλοειδών-γέλης (sol-gel) [51] Η μέθοδος sol-gel είναι επίσης μια τεχνική, για την σύνθεση νανοκρυσταλλιτών οξειδίου μετάλλου. Η διαδικασία αυτή, βασίζεται στην υδροξυλίωση και συμπύκνωση προδρόμων μορίων σε διάλυμα, που προέρχονται από κολλοειδή νανοσωματίδια. Περαιτέρω συμπύκνωση και ανόργανος πολυμερισμός, οδηγούν σε ένα τρισδιάστατο δίκτυο μεταλλικών οξειδίων σε μορφή υγρής γέλης. Επειδή αυτές οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε θερμοκρασία δωματίου, απαιτούνται περαιτέρω θερμικές επεξεργασίες, για να αποκτηθεί η τελική κρυσταλλική δομή. Από τη βιβλιογραφία, είναι σαφές στη μέθόδο sol-gel, οι ιδιότητες του πηκτώματος, εξαρτώνται πολύ από τη δομή που σχηματίζεται κατά τη διάρκεια σχηματισμού του κολλοειδούς. Οι κύριες παράμετροι που επηρεάζουν την κινητική της μεθόδου, δηλαδή τις αντιδράσεις ανάπτυξης, την υδρόλυση, τις αντιδράσεις συμπύκνωσης και κατά συνέπεια, τη δομή και τις ιδιότητες της γέλης, είναι ο διαλύτης, η θερμοκρασία, η φύση και η συγκέντρωση των προδρόμων αλάτων, το ph, και οι συνθήκες που εφαρμόζονται κατά την ανάμειξη [52] Μέθοδοι πολυόλης [53] Η μέθοδος πολυόλης, η οποία μπορεί επίσης να θεωρηθεί ως μια μέθοδος sol-gel, είναι μια ευέλικτη χημική προσέγγιση για την σύνθεση νάνο- και μικροσωματιδίων με σαφώς καθορισμένα σχήματα και ελεγχόμενο μέγεθος. Οι διαλύτες ως πολυόλες (για παράδειγμα, PEG) προσφέρουν ενδιαφέρουσες ιδιότητες: χάρη στις υψηλές διηλεκτρικές τους σταθερές, μπορούν να διαλύουν ανόργανες ενώσεις. Επίσης, λόγω των σχετικά υψηλών σημείων βρασμού τους, προσφέρουν ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών (από 25 C έως το σημείο βρασμού) για την παρασκευή ανόργανων ενώσεων. Οι πολυόλες, χρησιμεύουν επίσης ως αναγωγικοί παράγοντες καθώς και ως σταθεροποιητές για τον έλεγχο της ανάπτυξης των σωματιδίων και την πρόληψη σχηματισμού συσσωματωμάτων. 29

30 Σε αυτή τη μέθοδο, μια πρόδρομη ένωση εναιωρείται σε υγρή πολυόλη. Το εναιώρημα αναδεύεται και θερμαίνεται σε μια δεδομένη θερμοκρασία, που μπορεί να φθάσει το σημείο βρασμού της πολυόλης. Κατά τη διάρκεια αυτής της αντίδρασης, το πρόδρομο μέταλλο διαλυτοποιείται στην διόλη, σχηματίζει ένα ενδιάμεσο, και στη συνέχεια ανάγεται και σχηματίζει μεταλλικούς πυρήνες που θα μετατραπούν σε μεταλλικά νανοσωματίδια. Σωματίδια της τάξης των μικρομέτρων, μπορούν να συντεθούν με αύξηση της θερμοκρασίας αντίδρασης, ή με συσσωμάτωση ετερογενών πυρήνων, ή μέσω της προσθήκης ξένων πυρήνων ή σχηματισμού ξένων πυρήνων in situ. Η τελευταία μέθοδος, είναι πιο βολική διότι η αύξηση της θερμοκρασίας, οδηγεί σε πιο σημαντική θερμική αποικοδόμηση της πολυόλης. Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια εύκολη μέθοδος για την παραγωγή μη συσσωματωμένων νανοσωματιδίων μαγνητίτη, χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη διαδικασία εναιωρήματος σε πολυόλη. Τέσσερις τύποι πολυολών, συμπεριλαμβανομένης της αιθυλενογλυκόλης (EG), διαιθυλενογλυκόλης (DEG), τριαιθυλενογλυκόλης (TREG) και τετρααιθυλενογλυκόλης (TEG), αντέδρασαν άμεσα με τρι(ακετυλοακέτο)fe (III) σε αυξημένη θερμοκρασία. Μόνο η αντίδραση με TREG απέδωσε μη συσσωματωμένα σωματίδια μαγνητίτη, με ομοιόμορφο σχήμα και στενό εύρος μεγέθους. Αυτό το αποτέλεσμα οφείλεται στην ύπαρξη κατάλληλου αριθμού διαθέσιμων χημικών ομάδων στα μόρια του διαλύτη της πολυόλης [54], οι οποίες μπορούν να δράσουν ως συναρμοτές προς τα επιφανειακά μεταλλικά ιόντα των νανοσωματιδίων και της κατάλληλης θερμοκρασίας στην οποία έγινε η αντίδραση. Η παρουσία των συνδέσμων με πολυόλη, στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων του μαγνητίτη, επιβεβαιώνεται από μετρήσεις θερμοσταθμικής ανάλυσης και ανάλυση με φασματοφωτομετρία υπερύθρου FTIR. Σε σύγκριση με την υδατική μέθοδο, η προσέγγιση αυτή παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα: Πρώτον, η επιφάνεια των παρασκευασμένων νανοσωματιδίων μαγνητίτη είναι επικαλυμμένη με υδρόφιλους συνδέτες πολυόλης in situ: ως εκ τούτου, τα νανοσωματίδια μπορούν εύκολα να διασπείρονται σε υδατικά μέσα και άλλους πολικούς διαλύτες. Δεύτερον, η σχετικά υψηλότερη θερμοκρασία αντίδρασης αυτού του συστήματος, ευνοεί σωματίδια με υψηλότερη κρυσταλλικότητα και επομένως με υψηλότερη μαγνήτιση. Τέλος, η κατανομή μεγέθους των νανοσωματιδίων, είναι πολύ στενότερη των σωματιδίων που παράγονται με παραδοσιακές μεθόδους Συνθέσεις με τεχνική εισαγωγής αντιδραστηρίων σε ροή [35] Η διενέργεια της αντίδρασης σε στενά οριοθετημένες "μήτρες", όπως γαλακτώματα, κλπ., έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή σωματιδίων με στενές κατανομές μεγέθους και σε ορισμένες περιπτώσεις, με πολύ συγκερκιμένη μορφολογία. Ωστόσο, ο κατάλληλος σχεδιασμός της αντίδρασης, μπορεί να χρησιμεύσει ως εναλλακτική λύση της "μήτρας". Έχει αναπτυχθεί μια νέα μέθοδος σύνθεσης νανοσωματιδίων μαγνητίτη, που βασίζεται σε μια τεχνική έγχυσης των αντιδραστηρίων σε ροής (Flow Injection Synthesis). Η τεχνική αυτή, συνίσταται από συνεχή ή τμηματική ανάμειξη των αντιδραστηρίων, υπό το καθεστώς σταθερής ροής σε ένα τριχοειδή αντιδραστήρα. Η τεχνική FIS έχει κάποια πλεονεκτήματα, όπως υψηλή επαναληψιμότητα λόγω της συνεχούς ροής, της υψηλής ομοιογένειας ανάμειξης και της δυνατότητας ακριβούς εξωτερικού ελέγχου της διαδικασίας. Τα νανοσωματίδια μαγνητίτη που συντίθενται με αυτή τη μέθοδο έχουν μια στενή κατανομή μεγέθους 2-7 nm. Ηλεκτροχημική μέθοδος [55] Με βάση ηλεκτροχημικές μεθόδους, έχουν παρασκευαστεί σωματίδια μαγκεμίτη 3-8 nm από ένα ηλεκτρόδιο σιδήρου, μέσα σε ένα υδατικό διάλυμα DMF και κατιονικών επιφα- 30

31 νειοδραστικών μέσων. Η προσαρμογή της πυκνότητας ελέγχει το μέγεθος των σωματιδίων. Για την παρασκευή νανοσωματιδίων Fe 2 O 3 και Fe 3 O 4 έχει χρησιμοποιηθεί η ηλεκτροχημική εναπόθεση υπό οξειδωτικές συνθήκες Μέθοδος σύνθεσης αέριας φάσης [56] Τεχνολογίες αερολυμάτων, όπως η πυρόλυση ψεκασμού και λέιζερ, είναι ενδιαφέρουσες, επειδή οι τεχνολογίες αυτές, είναι συνεχής χημικές διαδικασίες, που επιτρέπουν την υψηλού ρυθμού παραγωγή. Στην πυρόλυση με σπρέι, ένα διάλυμα αλάτων τρισθενούς σιδήρου και ένας αναγωγικός παράγοντας σε οργανικό διαλύτη, ψεκάζονται διαδοχικά, όπου το διαλυτό αερόλυμα συμπυκνώνεται και ο διαλύτης εξατμίζεται. Σαν αποτέλεσμα, το ξηρό υπόλειμμα αποτελείται από σωματίδια, το μέγεθος των οποίων εξαρτάται από το αρχικό μέγεθος των αρχικών σταγονιδίων. Πυρόλυση με λέιζερ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μείωση του όγκου της αντίδρασης. Το λέιζερ θερμαίνει ένα αέριο μίγμα του προδρόμου σιδήρου, και μια ροή μείγματος αερίων παράγει μικρά, στενού εύρους μεγέθους, μη συσσωματωμένα νανοσωματίδια. Όταν οι πειραματικές συνθήκες της πυρόλυσης ρυθμίζονται, το μέγεθος των κρυστάλλων των νανοσωματιδίων μαγκεμίτη μεταβάλλεται σε εύρος από 2 έως 7 nm με μια πολύ στενή κατανομή μεγέθους. Η πυρόλυση με λέιζερ αποτελεί εργαλείο για σύνθεση νανοσωματιδίων αέριας φάσης. Σημαντική είναι η εξάρτηση των φυσικοχημικών και μορφολογικών χαρακτηριστικών του προϊόντος, από τις συνθήκες της διαδικασίας Μέθοδος σύνθεσης μέσω υπερήχων [57] Μπορούν να παρασκευαστούν οξείδια του σιδήρου από την αποσύνθεση (από θερμόλυση ή υπερηχόλυση) οργανομεταλλικών προδρόμων ουσιών. Πολυμερή, οργανικοί παράγοντες κάλυψης και διάφορα προστατευτικά της νανοδομής, χρησιμοποιούνται για να περιορίσουν την ανάπτυξη των νανοσωματιδίων. Το σημείο πολύ υψηλής θερμοκρασίας που παράγεται κατά την ταχεία κατάρρευση των κοιλοτήτων που δημιουργούνται από τους υπέρηχους, επιτρέπει την μετατροπή των σιδηρούχων αλάτων σε μαγνητικά νανοσωματίδια. Η υπερήχηση ενός υδατικού διαλύματος Fe(CO) 5, παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου, οδηγεί στο σχηματισμό μιας σταθερής υδρογέλης νανοσωματιδίων άμορφου Fe 3 O 4. Έχουν συντεθεί υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου που έχουν υψηλή μαγνήτιση και κρυσταλλικότητα, χρησιμοποιώντας μια χημική μέθοδο με συνδυασμό υπερήχων. Τέλος, έχουν συντεθεί νανοδομές μέσω επεξεργασίας με υπερήχους, πτητικών οργανομεταλλικών πρόδρομων ουσιών. Με την προσθήκη σταθεροποιητών ή πολυμερών κατά τη διάρκεια της υπερήχησης ή μετά από αυτήν, παράγονται μεταλλικά κολλοειδή Σταθεροποίηση ΜΝΣ [58] Η σταθεροποίηση των ΜΝΣ είναι πολύ σημαντική για την παραγωγή σταθερών κολλοειδών νανοκρυσταλλιτών, που να μη συσσωματώνονται τόσο σε βιολογικά μέσα όσο και σε μαγνητικά πεδία. Η σταθερότητα ενός κολλοειδούς εναιωρήματος προκύπτει από την ισορροπία μεταξύ των ελκτικών και απωστικών δυνάμεων. Πιο αναλυτικά, στα κολλοειδή συστήματα, τέσσερα είδη δυνάμεων, είναι πιθανό θεωρητικά να συμβάλουν στη δημιουργία δυναμικού ανάμεσα στα σωματίδια, ανάλογα με τις ιδιότητες του κολλοειδούς συστήματος. Αρχικά, μπορούν να αναπτυχθούν οι δυνάμεις Van Der Waals που επάγουν ισχυρές, μικρής εμβέλειας, ισότροπες έλξεις και οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις, που μπορούν να ελεγχθούν μερικώς με την προσθήκη άλατος στο εναιώρημα, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο

32 Η περιγραφή των δύο αυτών δυνάμεων, είναι γνωστή ως η θεωρία των Derjaguin - Landau - Verwey Overbeek (DLVO) [59] και απεικόνίζεται σχηματικά στην Εικόνα 1.7. Εικόνα 1. 7: Θεωρία DLVO. Η συσσωμάτωση ευνοείται Van Der Waals από τις ελκτικές δυνάμεις παρεμποδίζεται από ηλεκτροστατικές απωστικές δυνάμεις. Για μαγνητικά κολλοειδή εναιωρήματα, θα πρέπει να συμπεριληφθούν οι δυνάμεις διπόλου- διπόλου μεταξύ δύο γειτονικών σωματιδίων, οι οποίες προκαλούν ανισοτροπικές αλληλεπιδράσεις. Διαπιστώθηκε ότι οι δυνάμεις αυτές είναι ελκτικές, αν το ανισοτροπικό δυναμικό ανάμεσα στα σωματίδια έχει όλες τις δυνατές κατευθύνσεις. Τέλος, σε συστήματα σωματιδίων με πολυμερική επικάλυψη μπορούν να αναπτυχθούν στερεοχημικές απωστικές δυνάμεις. Το συνολικό δυναμικό λοιπόν του σωματιδίου, εκφράζεται ως άθροισμα του δυναμικού των ελκτικών δυνάμεων μεταξύ της διπλοστιβάδας φορτίων (V A ) και του δυναμικού των απωστικών δυνάμεων (V R ) και περιγράφεται από την εξίσωση 1.8 και το διάγραμμα 1.2 (εξίσωση 1.8) 32

33 Διάγραμμα 1. 2: Συνολικό δυναμικό ενός κολλοειδούς σύμφωνα με τη θεωρεία DLVO [60]. Μπορεί να επιτευχθεί η σταθεροποίηση μαγνητικών σωματιδίων, ρυθμίζοντας μία ή και τις δύο απωστικές δυνάμεις: την ηλεκτροστατική και τη στερεοχημική άπωση. Ο έλεγχος των δυνάμεων αυτών είναι μια βασική παράμετρος της κολοειδούς σταθερότητας των προϊόντων. Η στερεοχημική άπωση είναι δύσκολο να προβλεφθεί και να ποσοτικοποιηθεί, ενώ έχει περιγραφεί θεωρητικά για τα πολυμερή. Εξαρτάται, μεταξύ άλλων παραμέτρων, από το μοριακό βάρος του πολυμερούς και την πυκνότητά του. Η ηλεκτροστατική άπωση οφείλεται στο δυναμικό διάχυσης, το οποίο μπορεί να είναι πολύ κοντά στην τιμή δυναμικού επιφάνειας (ζ), και στο μήκος Debye-Huckel, το οποίο εξαρτάται κυρίως από το ιοντική ισχύ και το ph του διαλύματος. Ένας τρόπος για να ελεγχθεί η ηλεκτροστατική σταθερότητα [59], είναι να μελετηθεί η κινητική συσσωμάτωσης των κολλοειδών εναιωρημάτων, με μεταβολή της συγκέντρωση άλατος. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί, μέσω του παράγοντα σταθερότητας (W), ο οποίος μετρά την αποτελεσματικότητα του φράγματος δυναμικού για αποφυγή πιθανής συσσωμάτωσης. Σαν W ορίζεται ο λόγος του αριθμού των συγκρούσεων, μεταξύ των σωματιδίων και ο αριθμός των συγκρούσεων που οδηγούν σε συσσωμάτωση. Συνεπώς, μπορεί να εκφράζεται ως W = k fast / k, όπου k fast είναι η σταθερά ρυθμού που περιγράφει την ταχεία συσσωμάτωση (κάθε σύγκρουσης που οδηγεί σε συσσωμάτωση), και k είναι η σταθερά ρυθμού συσσωμάτωσης στη συγκέντρωση άλατος που χρησιμοποιείται. Αυτός ο παράγοντας σταθερότητας, μπορεί να μετρηθεί μέσω της σκέδασης του φωτός (στατικής ή δυναμικής) ή μέσω μετρήσεων θολερότητας. Ο παράγοντας σταθερότητας ως συνάρτηση του προστιθέμενου άλατος, παρέχει τη δυνατότητα υπολογισμού της κρίσιμης συγκέντρωσης της συσσωμάτωσης. Σε αυτή τη συγκέντρωση, η διπλή ηλεκτροστατική στιβάδα συμπιέζεται τελείως και ισχύει k= k fast, άρα ο παράγοντας καθίσταται ανεξάρτητος από τη συγκέντρωση άλατος. Στα ΜΝΣ, τα επιφανειακά άτομα σιδήρου, ενεργούν ως οξέα κατά Lewis και συζεύγνυνται με μόρια που δίνουν μονά ζεύγη ηλεκτρονίων. Άρα, σε υδατικά διαλύματα, τα άτομα σιδήρου συμπλέκονται (coordinate) με αυτά του νερού, το οποίο διασπάται εύκολα, αφήνοντας την επιφάνεια του οξειδίου του σιδήρου υδροξυλιωμένη. Αυτές οι ομάδες υδροξυλίου έχουν επαμφοτερίζοντα χαρακτήρα, και μπορούν να αντιδράσουν με οξέα ή βάσεις. Ανάλογα το ph του διαλύματος, η επιφάνεια του μαγνητίτη θα είναι θετικά ή 33

34 αρνητικά φορτισμένη. Το ισοηλεκτρικό σημείο παρατηρείται σε ph 6.8. Γύρω από αυτό το σημείο [σημείο μηδενικού φορτίου (PZC)], η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου (σ) είναι πολύ μικρή και τα σωματίδια δεν είναι πλέον σταθερά σε νερό, οπότε παρατηρούνται φαινόμενα κροκίδωσης. Αλλαγές στην ηλεκτροστατική και τη στερεοχημική συμπεριφορά, είναι πιθανό να οδηγήσουν στη σταθεροποίηση των ΜΝΣ. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται διάφοροι σταθεροποιητές, κάποιοι από τους οποίους είναι: (α) οι μονοδραστικοί (monovalent) σταθεροποιητές: στην επιφάνεια του μαγνητίτη μπορούν να συνδεθούν λειτουργικές ομάδες, συμπεριλαμβανομένων των καρβοξυλικών, φωσφορικών, και θειικών ομάδων. Επιπλέον, η σταθεροποίηση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της ικανότητας διασποράς σε φορέα ελαίου/υδρογονάνθρακα ή σε υδατικά μέσα. (β) τα ανόργανα υλικά: νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου μπορούν να επικαλυφθούν με διοξείδιο του πυριτίου, χρυσό, ή γαδολίνιο (ΙΙΙ). Αυτές οι επικαλύψεις, όχι μόνο παρέχουν σταθερότητα στα νανοσωματίδια σε διάλυμα, αλλά επίσης βοηθούν στη σύνδεση διαφόρων βιολογικών προσδετών στην επιφάνειά τους. Σε αυτά τα νανοσωματίδια, ο πυρήνας οξειδίου του σιδήρου επικαλύπτεται από ένα εξωτερικό μεταλλικό κέλυφος, των ανόργανων αυτών υλικών. (γ)οι πολυδραστικοί σταθεροποιητές: η επικάλυψη μπορεί να γίνει in situ ή και μετά την σύνθεση. Στην πρώτη προσέγγιση, τα νανοσωματίδια επικαλύπτονται κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, για παράδειγμα, με μια διαδικασία συγκαταβύθισης παρουσία δεξτράνης. Στη μέθοδο επικάλυψης μετά την σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα πολυμερικά επιφανειοδραστικά. Με βάση τη βιβλιογραφία, οι πιο κοινές επικαλύψεις είναι η δεξτράνη, η καρβοξυμεθυλιωμένη δεξτράνη, η καρβοξυδεξτράνη, το άμυλο, η αραβινογαλακτάνη, η γλυκοσαμινογλυκάνη, το σουλφονιωμένο στυρένιοδιβινυλβενζόλιο, η πολυβινυλική αλκοόλη (PVA), και η πολύαιθυλενογλυκόλη (PEG) Πολυαιθυλενογλυκόλες (PEG) [60] Όπως αναφέρθηκε, η PEG είναι ένα από τα πιο σημαντικά επιφανειοδραστικά της κατηγορίας των πολυμερικών σταθεροποιητών, η οποία, μετά τη σύνθεση των ΜΝΣ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επιφανειακός τροποποιητής προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι ιδιότητές τους. Οι PEG, δεν προσδίδουν βέβαια μόνο επιθυμητές ιδιότητες στα νανοσωματίδια με τα οποία συζεύγνυνται, γι αυτό πριν τη χρήση τους θα πρέπει να έχουν μελετηθεί οι ιδιότητες αυτής της κατηγορίας πολυμερών. Πλεονεκτήματα της PEG: Η PEG είναι μη-ιοντικό, υδρόφιλο πολυμερές. Τα δομικά χαρακτηριστικά του, όπως η γραμμομοριακή μάζα καθώς και η πολυδιασπορά του πολυμερούς, μπορούν να επηρεάσουν την βιολογική συμπεριφορά του, τη βιοσυμβατότητά του καθώς και τις ιδιότητες σταθερότητας που μπορεί να προσδώσει. Στις φαρμακευτικές και ιατρικές εφαρμογές χρησιμοποιούνται PEG με γραμμομοριακή μάζα που κυμαίνεται από 400 Da έως περίπου 50 kda. Οι PEG με μοριακή μάζα 20 kda έως 50 kda χρησιμοποιούνται κυρίως για τη σύζευξη με προσδέτες χαμηλής μοριακή μάζας, όπως ολιγονουκλεοτίδια. Μικρή μοριακή μάζα οδηγεί σε ταχεία νεφρική κάθαρση και μπορεί να αποφευχθεί με την αύξηση του μεγέθους των συζυγών μορίων πάνω από το απαιτούμενο για την κάθαρση, όριο μεγέθους. Οι PEG με χαμηλότερες μοριακές μάζες, μεταξύ 1 kda και 5 kda συχνά χρησιμοποιούνται για τη 34

35 σύζευξη μεγαλύτερων προσδετών, όπως τα αντισώματα ή τα νανοσωματιδιακά συστήματα. Με αυτό τον τρόπο, ο μεταβολισμός και η επακόλουθη αποβολή από το τον οργανισμό, μπορεί να αποφευχθεί, καθώς μειώνεται η ενζυματική αποικοδόμηση και τα κατιονικά φορτία των ενεργών ομάδων πρόσδεσης επικαλύπτονται. Οι PEG από περίπου 3 kda έως 4 kda δίνονται από το στόμα ως καθαρτικό (όπως Golytely και MoviPrep ). Από θεωρητική άποψη, ένα βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές θα ήταν πιο πολύ επωφελές σε εφαρμογές, δεδομένου ότι με τη σύζευξή του με έναν νανοφορέα, μπορούν να αποφευχθούν τα προβλήματα που αφορούν στον πρώτο μεταβολισμό και μπορεί να μειωθεί η τοξικότητα των προϊόντων αποικοδόμησης και να αυξηθεί ο χρόνος ημιζωής. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η απέκκριση του πολυμερούς, δεν εξαρτάται άμεσα από την μοριακή μάζα του πολυμερούς, αλλά από τον υδροδυναμικό του όγκο, ο οποίος επηρεάζεται από την αρχιτεκτονική του πολυμερούς. Για παράδειγμα, αστεροειδή και δενδριμερή πολυμερή έχουν μικρότερη υδροδυναμική διάμετρο από γραμμικά πολυμερή με παρόμοιες μοριακές μάζες. Σε γενικές γραμμές, ένας χαμηλός δείκτης πολυδιασποράς (PDI) είναι μια βασική προϋπόθεση, για να έχει το πολυμερές φαρμακευτικές εφαρμογές. Μια τιμή PDI χαμηλότερη του 1.1, παρέχει ένα πολυμερές με αποδεκτή ομοιογένεια ώστε να εξασφαλίζεται η επαναληψιμότητα ιδιοτήτων, όπως ο χρόνος παραμονής στο σώμα και η ανοσογονικότητα του φορέα που έχει συζευχθεί με το πολυμερές. Αυτή η προϋπόθεση τηρείται από τις PEG, δεδομένου ότι PEG με δείκτη πολυδιασποράς 1 είναι εύκολο να συντεθούν με τον ανιονικό πολυμερισμό αιθυλενοξειδίου. Επιπλέον, οι PEG έχουν υψηλή διαλυτότητα σε οργανικούς διαλύτες και οι ακραίες ομάδες τους είναι σχετικά εύκολο να τροποποιηθούν χημικά. Όμως, οι PEG είναι διαλυτές και στο νερό και εμφανίζουν χαμηλή εγγενή τοξικότητα, που καθιστά τα πολυμερή αυτά ιδανικά για βιολογικές εφαρμογές. Όταν συνδέονται με υδρόφοβα φάρμακα ή φορείς, η υδροφιλικότητα των PEG, αυξάνει τη διαλυτότητα του συστήματος σε υδατικά μέσα. Σχηματίζονται έτσι φάρμακα, με μεγαλύτερη φυσική και θερμική σταθερότητα, καθώς και μειώνεται η συσσωμάτωση των φαρμάκων είτε in νίνο, είτε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσής τους, ως αποτέλεσμα μιας στερεοχημικής επικάλυψης, που προστατεύει τις ευαίσθητες ενεργές ομάδες και τα φορτία του φαρμάκου. Αυτή η στερεοχημική προστατευτική επικάλυψη σχηματίζεται από τις ευέλικτες αλυσίδες του πολυμερούς, τα οποία μπορούν να πάρουν ένα μεγάλο συνολικό αριθμό πιθανών διαμορφώσεων. Όσο υψηλότερος είναι ο ρυθμός μετάβασης από τη μια διαμόρφωση στην άλλη, τόσο πιο εύκολα μπορεί να σχηματιστεί αυτή η δομή, η οποία εμποδίζει τις αλληλεπιδράσεις με τα συστατικά του αίματος, καθώς και την ενζυμική υδρόλυση πρωτεϊνών, και άλλες βιολογικές μεταβολικές διεργασίες. Όμως, ο σχηματισμός μιας τέτοιας στερεοχημικής προστατευτικής δομής στην επιφάνεια νανοσωματιδίων, δεν επηρεάζεται μόνο από τη γραμμομοριακή μάζα της PEG, αλλά και από την πυκνότητά της στην επιφάνεια του νανοσωματιδίου και τον τρόπο που έχει συζευχθεί με αυτό. Τα συζευγμένα με PEG προϊόντα παρουσιάζουν μειωμένη ανοσοαπόκριση, αλλά και μειωμένη αναγνώρισή τους ως αντιγόνα. Η προστασία φορτίων, έχει επίσης ως αποτέλεσμα την μη αναγνώρισή τους από το ανοσοποιητικό σύστημα. Από τη βιβλιογραφία προκύπτει, ότι PEG διαφορετικής μοριακής μάζας, έχουν ουσιαστικά παρόμοιες τοξικότητες, με την τοξικότητα να είναι αντίστροφη προς τη γραμμομοριακή μάζα, αφού η απορρόφηση από το γαστρεντερικό μειώνεται με την αύξηση της μοριακής μάζας. Η συγκέντρωση PEG που δεν προκάλεσε καμία τοξικολογική επίδραση σε αρουραίους ήταν ppm σε δόση 1 g/kg του σωματικού τους βάρους. Μια εκτίμηση της μη τοξικής ημερήσιας δόσης για τον άνθρωπο είναι 0-10 mg/kg του σωματικού του βάρους. 35

36 Η επιτυχία της PEG σε εφαρμογές χορήγησης φαρμάκου, οδήγησε επίσης στη χρήση της σε άλλα ιατρικά πεδία. Έτσι, οι PEG χρησιμοποιούνται για την αποθήκευση αίματος και οργάνων, αφού μειώνουν την συσσωμάτωση των ερυθροκυττάρων του αίματος και βελτιώνουν την συμβατότητα του αίματος με τις σακούλες αποθήκευσης πολυβινυλοχλωρίου. Συμπολυμερή PEG που εμφυτεύονται σε καρδιαγγειακές συσκευές, όπως stent, μειώνουν τη θρόμβωση. Μειονεκτήματα της PEG: Η αυξανόμενη χρήση του PEG και των συζευγμένων με PEG προϊόντων στη φαρμακευτική έρευνα και σε κλινικές εφαρμογές εμφάνισε κάποιες δυσμενείς επιπτώσεις, όπως ανεπιθύμητες παρενέργειες στο σώμα, που μπορεί να προκληθούν από το ίδιο το πολυμερές ή από παραπροϊόντα που πιθανόν να σχηματιστούν κατά τη διάρκεια σύνθεσης και μπορούν να οδηγήσουν σε υπερευαισθησία. Επιπλέον, απρόβλεπτες αλλαγές στην φαρμακοκινητική των συζευγμένων με PEG συστημάτων, μπορεί να προκύψει από μεταφορείς που βασίζονται σε PEG και τέλος, σημαντική είναι η ανταγωνιστική πορεία που προκύπτει σε περιβάλλον πλούσιο σε οξυγόνο, ανάμεσα στη βιοαποικοδόμηση της PEG από τον οργανισμό, και την εύκολη καταστροφής της Οργάνωση σε νανοπλειάδες Λόγω του μεγάλου ενδιαφέροντος που παρουσιάζουν τα ΜΝΣ, έγιναν διάφορες έρευνες για την καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ δομής και ιδιοτήτων τους. Έτσι, βρέθηκε, πως τα κολλοειδή οργανώνονται σε δομές υψηλότερης τάξης, σχηματίζοντας συνεργατικούς σχηματισμούς νανοκρυστάλλων, τις λεγόμενες πλειάδες Colloidal Nanocrystal Clusters (CNCs) [ 61, 62 ]. Τέτοιες δομές, έχουν συντεθεί είτε με μέθοδο ενός σταδίου και απ ευθείας ανάπτυξη μέσα σε διάλυμα [ 63 ], είτε με συνθετική πορεία δύο σταδίων, αξιοποιώντας προσχηματισμένες μαγνητικές νανοδομές. Στην δεύτερη περίπτωση, η οργάνωση σε πλειάδες επιτυγχάνεται για παράδειγμα με σύζευξη με νανοσίλικα [64], ή μέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων [ 65 ] ή με πολυμερισμό [ 66 ], ή τέλος με λιποσώματα [ 67 ]. Οι νανοαλύσιδες, είναι ένας επιπλέον τρόπος σχηματισμού συνεκτικών δομών, που εμφανίζει ιδιαίτερα πλεονεκτήματα στην απεικόνιση και στη στόχευση. Μια διαφορετική και ταυτόχρονα πολύ ενδιαφέρουσα κατηγοριοποίηση αυτής της οργάνωσης θα μπορούσε να θεωρηθεί ο σχηματισμός πολύ πυκνών σταθερών δομών των ΜΝΣ και η οργάνωσή τους σε πλειάδες, που αποτελούνται από κρυστάλλους που υιοθετούν τον ίδιο προσανατολισμό. Δηλαδή πρόκειται για νανοκρυσταλλίτες μεγέθους περίπου nm, οι οποίοι δείχνουν να έχουν δομή ενός ενιαίου κρύσταλλου σε όλο τον όγκο τους, αλλά από την άλλη πλευρά συμπεριφέρονται σαν σύνολα μικρότερων νανοκρυσταλλιτών των 5-15 nm, που εμφανίζουν υπερπαραμαγνητισμό [68]. Πρακτικά οι δομές αυτές διαχωρίζονται ως νανοπλειάδες πυκνής διάταξης, από εκείνες που οι μαγνητικοί νανοκρυσταλλίτες οργανώνονται σε πλειάδες μεν, αλλά δεν φαίνεται να έχουν επαφή μεταξύ τους και ομοιομορφία στον προσανατολισμό τους δε, και χαρακτηρίζονται ως νανοπλειάδες χαλαρής διάταξης. Οι μαγνητικές νανοπλειάδες βρίσκουν πολλές εφαρμογές στον τομέα της βιοιατρικής, ως theragnostics [69]. Παρουσιάζουν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσες μαγνητικές ιδιότητες όπως πολύ μεγαλύτερη απόκριση σε εφαρμοζόμενο εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, είτε αυτό αφορά σε διαχωρισμό μέσω μαγνητικού πεδίου είτε στο χειρισμό τους ως μέσα στόχευσης. Επίσης, έχουν πολύ σημαντικά πλεονεκτήματα ως σκιαγραφικοί παράγοντες στην μαγνητική τομογραφία, αφού οι νανοπλειάδες επάγουν μεγαλύτερη αύξηση του εγκάρσιου ρυθμού χαλάρωσης των πυρηνικών spin των υδρογόνων του νερού [70]. 36

37 Βασικές τεχνικές χαρακτηρισμού ΜΝΣ Για τον χαρακτηρισμό των ΜΝΣ χρησιμοποιούνται κάποιες πολύ συνηθισμένες φυσικοχημικές τεχνικές χαρακτηρισμού, καθώς και κάποιες μέθοδοι που ελέγχουν τη δυνατότητα χρήσης του σε διάφορες εφαρμογές. Για κάθε σύνθεση ΜΝΣ, είναι σημαντικό να χαρακτηριστούν η σύστασή του, το μέγεθος του μαγνητικού πυρήνα, η υδροδυναμική του διάμετρος και οι μαγνητικές ιδιότητες Φασματοφωτομετρία Yπεριώδους- Oρατού (UV-Vis) [71] Η φασματοφωτομετρία απορροφήσεως αποτελεί μια από τις πιο χρήσιμες τεχνικές στη χημική ανάλυση. Πολλές χημικές ουσίες απορροφούν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία, ιδιαίτερα στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος και με χρήση του κατάλληλου οργάνου και τεχνικής είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός τους σε ένα μίγμα. Το τμήμα του μορίου που είναι υπεύθυνο για την απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, ονομάζεται χρωμοφόρο και η εμφάνιση των χαρακτηριστικών ταινιών απορροφήσεως των διαφόρων χρωμοφόρων ομάδων σε ένα φάσμα απορροφήσεως είναι ενδεικτική για την ύπαρξη των ομάδων αυτών στο μόριο. Η φασματοφωτομετρία υπεριώδους ορατού ( nm) χρησιμοποιείται ευρέως για τον ποσοτικό προσδιορισμό ουσιών Όταν μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από ένα διάλυμα το οποίο περιέχει μια ουσία που απορροφά, η ισχύς της ακτινοβολίας ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής, λόγω απορροφήσεώς της από την ουσία. Η ελάττωση της ισχύος εξαρτάται από την συγκέντρωση της ουσίας και από την απόσταση που διένυσε η δέσμη μέσα στο διάλυμα. Οι σχέσεις αυτές εκφράζονται με το νόμο των Lambert-Beer, που συνήθως αναφέρεται ως νόμος του Beer και διατυπώνεται με τη μορφή (εξίσωση 1.9): A= log(p 0 /P) = -logt = αbc (g/l) = εbc (mol/l) (εξίσωση 1.9) Όπου, Α η απορρόφηση, Ρ 0 η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, Ρ η ισχύς της ακτινοβολίας μετά τη διέλευσή της από το διάλυμα, Τ η διαπερατότητα, α μια σταθερά αναλογίας που ονομάζεται απορροφητικότητα, b το μήκος της διαδρομής που διανύθηκε από την ακτινοβολία μέσα στο διάλυμα, ε μια σταθερά αναλογίας που ονομάζεται μοριακή απορροφητικότητα και c η συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά στο διάλυμα. Ο νόμος του Beer προϋποθέτει ότι: (α)ο μόνος μηχανισμός αλληλεπίδρασης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και διαλυμένης ουσίας είναι η απορρόφηση. (β) η προσπίπτουσα ακτινοβολία είναι μονοχρωματική. (γ) η απορρόφηση γίνεται σε ένα όγκο διαλύματος ομοιόμορφης διατομής. (δ) τα σωματίδια που απορροφούν δρουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και άσχετα από τον αριθμό και το είδος τους. Οι βασικές δομικές μονάδες ενός φασματοφωτομέτρου είναι: (α) μια πηγή ακτινοβολίας σταθερής ισχύος, (β) ένας μονοχρωμάτορας για την απομόνωση της επιθυμητής ακτινοβολίας, (γ) μια κυψελίδα για την τοποθέτηση του δείγματος, (δ) ένας ανιχνευτής ακτινοβολίας που μετατρέπει το οπτικό σήμα σε ηλεκτρικό και (ε)ένα σύστημα μετρήσεως που περιλαμβάνει ενισχυτή του σήματος και όργανο αναγνώσεως. Στην υπεριώδη περιοχή ( nm) χρησιμοποιείται η λυχνία εκκενώσεως δευτερίου, ενώ στην ορατή ( nm) λυχνία πυρακτώσεως βολφραμίου, στην οποία σπείραμα από 37

38 σύρμα βολφραμίου, ευρισκόμενο σε γυάλινο περίβλημα, πυρακτώνεται με ηλεκτρικό ρεύμα και φωτοβολεί. Για να αποφευχθεί απόθεση του βολφραμίου στα τοιχώματα της λυχνίας και επομένως ελάττωση της διαπερατότητας του περιβλήματος και του χρόνου ζωής της λυχνίας, προστίθεται μικρή ποσότητα ιωδίου σε χαμηλή πίεση, οπότε το σχηματιζόμενο σπείρωμα και τα άτομα του βολφραμίου επανατοποτίθενται σε αυτό. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται από την πηγή, κατευθύνεται μέσω κατόπτρων στο μονοχρωμάτορα, όπου ένα φράγμα περιθλάσεως μπλοκάρει τα μήκη κύματος που δεν είναι επιθυμητά, επιτρέποντας τη διέλευση μόνο της προεπιλεγμένης μονοχρωματικής ακτινοβολίας. Στη συνέχεια, η δέσμη διχάζεται σε δύο τμήματα, ένα για το διάλυμα του δείγματος και ένα για το τυφλό ή διάλυμα αναφοράς. Καθεμία από τις δέσμες διέρχεται από μια κυψελίδα (που περιέχει το δείγμα και το τυφλό αντίστοιχα) όπου λαμβάνει χώρα απορρόφηση. Οι κυψελίδες είναι κατασκευασμένες από χαλαζία για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους ή από γυαλί είτε πλαστικό για μετρήσεις στο ορατό, έχουν συγκεκριμένο πάχος, συνήθως 1cm και θα πρέπει να δείχνουν την ίδια απορρόφηση όταν περιέχουν το ίδιο διάλυμα. Μετά τη διέλευσή τους από τις κυψελίδες, οι δέσμες κατευθύνονται προς τους αντίστοιχους ανιχνευτές για την μετατροπή του οπτικού σήματος σε ηλεκτρικό και την ενίσχυσή του. Ως ανιχνευτές χρησιμοποιούνται φωτοδίοδοι πυριτίου. Αυτοί αποτελούνται από ένα επίπεδο ηλεκτρόδιο Cu ή Fe, στο οποίο έχει αποτεθεί στρώμα ημιαγωγού, Si. Στην επιφάνεια του ημιαγωγού υπάρχει διαφανές μεταλλικό στρώμα Ag που δρα ως δεύτερο ηλεκτρόδιο (συλλέκτης). Όταν προσπίπτει ακτινοβολία στην επιφάνεια του ημιαγωγού, προκαλεί ροή ηλεκτρονίων από τον αγωγό προς το μεταλλικό στρώμα, το οποίο συνδέεται με εξωτερικό αγωγό και το κύκλωμα διαρρέεται από ασθενές ρεύμα Δυναμική σκέδαση φωτός και μικροηλεκτροφόρηση [72] H τεχνική δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS), και η μικροηλεκτροφόρηση είναι οι πιο διαδεδομένες τεχνικές για τη μέτρηση του μεγέθους κολλοειδών νανοσωματιδίων και του φαινόμενου επιφανειακού τους φορτίου. Συσκευή Μέτρησης υδροδυναμικής διαμέτρου: Η συσκευή αυτή είναι εφοδιασμένη με πηγή ακτινοβολίας laser He/Ne 25 mw και προσδιορίζει το μέγεθος μετρώντας την θερμική κίνηση Brown των σωματιδίων στο δείγμα. Ως κίνηση Brown, ορίζεται η τυχαία κίνηση των σωματιδίων σε ένα υγρό εξαιτίας των συγκρούσεων με τα μόρια που τα περιβάλλουν, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Αυτή με τη σειρά της εξαρτάται από το μέγεθος των σωματιδίων (όσο μικρότερα τα σωματίδια τόσο γρηγορότερη είναι η κίνηση Brown) και από το ιξώδες του διαλύτη. Το ιξώδες ενός υγρού συσχετίζεται άμεσα με την θερμοκρασία του, άρα για μετρηθεί η κινητικότητα των σωματιδίων μέσα σε ένα διάλυμα είναι απαραίτητο οι μετρήσεις να διεξάγονται κάτω από μια γνωστή και σταθερή θερμοκρασία. Ένα τυπικό σύστημα δυναμικής σκέδασης φωτός αποτελείται από έξι κύρια τμήματα. Την πηγή φωτός (laser), η ακτίνα της οποίας θα περάσει μέσα από την κυψελίδα με το δείγμα, την κυψελίδα με το δείγμα και τον ανιχνευτή για να μετρηθεί η σκεδαζόμενη ακτινοβολία. Επίσης μία ψηφιακή πλατφόρμα επεξεργάζεται το σήμα της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας και το μοτίβο τρεμοπαίγματος. Τέλος, η πληροφορία αυτή περνά σε ένα ηλεκτρονικό υπολογιστή όπου με το κατάλληλο λογισμικό, αναλύονται τα δεδομένα και δίνονται πληροφορίες για το μέγεθος των σωματιδίων. 38

39 Η τεχνική μέτρησης στο Nano Zetasizer της εταιρείας Malvern είναι η NIBS (Non- Invasive Back-Scatter) η οποία επεκτείνει το εύρος των μεγεθών και των συγκεντρώσεων που μπορούν να μετρηθούν. Η δυνατότητα του Zetasizer Nano S και του Nano ZS instruments να διακρίνουν τις πληροφορίες σκέδασης σε γωνία 173⁰ ονομάζεται backscatter ανίχνευση. Επιπλέον το οπτικό σύστημα δεν είναι σε επαφή με το δείγμα γι αυτό και χαρακτηρίζεται ως μη επεμβατική τεχνική. Η θέση μέτρησης μέσα στην κυψελίδα του Nano ZS ρυθμίζεται αυτόματα ώστε να διευθετούνται οι απαιτήσεις για υψηλή ευαισθησία ή για υψηλή συγκέντρωση. Αυτή η θέση αλλάζει με την μετακίνηση των φακών εστίασης. (Εικόνα 1.8). Εικόνα 1. 8: Σχηματική απεικόνιση σκέδασης για: (α) μικρά και (β) μεγάλα σωματίδια Υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα της χρήσης της τεχνικής NIBS. Η ευαισθησία της μεθόδου είναι βελτιωμένη. Ο όγκος του δείγματος που επεξεργάζεται από το σύστημα μπορεί να είναι περίπου δέκα φορές μεγαλύτερος από των κοινών συστημάτων 90 μοιρών. Σε συνδυασμό με την ικανότητα συλλογής δεδομένων από το οπτικό σύστημα NIBS, η ευαισθησία αυξάνεται κατά δύο τάξεις μεγέθους επιτρέποντας τη μέτρηση του μεγέθους αραιωμένων διασπορών σε σωματίδια μεγέθους μικρότερου και από ένα νανόμετρο. Μπορεί να μετρηθεί ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων δειγμάτων. Στην περίπτωση πυκνών δειγμάτων η ακτίνα λέιζερ δεν χρειάζεται να περάσει μέσα από όλο το δείγμα. Μετρώντας τα σωματίδια που βρίσκονται κοντά στο τοίχωμα της κυψελίδας, το φώς περνά με μικρότερο μήκος στο δείγμα, μειώνοντας ή εξαλείφοντας το φαινόμενο της πολλαπλής σκέδασης, όπου η ακτίνα του φωτός από ένα σωματίδιο σκεδάζεται και από άλλα σωματίδια. Αυτό κάνει δυνατή τη μέτρηση και πιο πυκνών δειγμάτων. Η προετοιμασία των δειγμάτων είναι απλούστερη και η επίδραση της σκόνης είναι αισθητά μειωμένη, καθώς η σκόνη σκεδάζει περισσότερο φως στην αντίθετη κατεύθυνση. Η θέση μέτρησης μέσα στην κυψελίδα του Nano ZS, ρυθμίζεται αυτόματα ώστε να διευθετούνται οι απαιτήσεις μέτρησης δείγματος μικρής ή υψηλής συγκέντρωσης. Αυτή η θέση αλλάζει με την μετακίνηση των φακών εστίασης. Για μια κολλοειδή διασπορά προσδιορίζονται οι μέσοι διάμετροι των σωματιδίων και οι κατανομές μεγέθους. Η διάμετρος που μετριέται μέσω της τεχνικής DLS, ονομάζεται υδροδυναμική διάμετρος και είναι η διάμετρος μιας ιδεατής σφαίρας που έχει τον ίδιο συντελεστή διάχυσης με το σωματίδιο. 39

40 Μέτρηση φαινόμενου επιφανειακού φορτίου [73] : Όταν σωματίδια διασπείρονται σε ένα υδατικό σύστημα, συχνά εμφανίζουν επιφανειακό φορτίο εξαιτίας ιονισμού των επιφανειακών χημικών ομάδων τους ή προσρόφησης φορτισμένων μορίων ή ιόντων. Η ανάπτυξη τέτοιων φορτίων, έχει σαν αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων του διαλύματος κοντά στην επιφάνεια των σωματιδίων δημιουργώντας ένα στρώμα γύρω από αυτά, με διαφορετική κατανομή ιόντων από αυτή του κυρίου όγκου του διαλύματος, το οποίο αποτελείται από δύο μέρη. Το εσωτερικό μέρος ονομάζεται στρώμα Stern (Stern layer) και αποτελείται από ιόντα τα οποία είναι ισχυρά συνδεδεμένα με τα σωματίδια, λόγω των αντίθετων φορτίων τους. Στο εξωτερικό μέρος, δημιουργείται διάχυση ασθενέστερα συνδεδεμένων ιόντων του μίγματος. Στο διάχυτο στρώμα υπάρχει ένα νοητό όριο μέσα στο οποίο ιόντα και μόρια διαλύτη αλληλεπιδρούν αρκετά ισχυρά με τη φορτισμένη επιφάνεια του σωματιδίου, ώστε σχηματίζουν μια σταθερή διπλοστιβάδα φορτίων με το σωματίδιο. Το όριο αυτό ονομάζεται επίπεδο ολίσθησης. Όταν ένα σωματίδιο κινείται, τα ιόντα μέσα σε αυτό το όριο κινούνται μαζί του. Το ηλεκτρικό δυναμικό το οποίο υπάρχει στο εξωτερικό μέρος αυτού του ορίου (επίπεδο ολίσθησης), ονομάζεται δυναμικό ζ (ζ potential) και αποτελεί ένδειξη του επιφανειακού φορτίου του σωματιδίων. Για αυτό απαντάται και με τον όρο φαινόμενο επιφανειακό φορτίο. Η εξίσωση Helmholtz Smoluchowski που ακολουθεί δίνει την τιμή του ζ δυναμικού, (εξίσωση 1.10) όπου u (cm/sec) η ταχύτητα μετακίνησης του σωματιδίου στο σωλήνα του κελιού ηλεκτροφόρησης, n (dyne sec/cm 2 ) το ιξώδες του μέσου, ε η διηλεκτρική σταθερά του μέσου και Ε (V/cm) η ένταση του εφαρμοζόμενου δυναμικού. Το ζ - δυναμικό σχετίζεται με το δυναμικό επιφάνειας των σωματιδίων και επηρεάζει μεγάλο φάσμα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστημάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους με ηλεκτρολύτες και φάρμακα καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρημάτων. Η τιμή του ζ-δυναμικού αποτελεί ένδειξη για την καλή εκτίμηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Η σταθεροποίηση των κολλοειδών συστημάτων μπορεί να οφείλεται είτε σε ηλεκτροστατικούς είτε σε στερεοχημικούς παράγοντες [60] όπως φαίνεται στην Εικόνα

41 Εικόνα 1. 9: Σταθεροποίηση κολλοειδών διασπορών λόγω ηλεκτροστατικών ή στερεοχημικών παραγόντων Σύμφωνα με τη θεωρία DLVO (παράγραφος 1.4.2), η ηλεκτροστατική σταθεροποίηση εξαρτάται από το δυναμικό του στρώματος Stern και από το πάχος της διπλοστιβάδας αντίθετων φορτίων που σχηματίζεται γύρω από το σωματίδιο.. Οι κολλοειδής διασπορές με μεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ δυναμικό εμφανίζουν απωστικές δυνάμεις που εμποδίζουν τη συσσωμάτωση και κατακρήμνιση των σωματιδίων τους. Τιμές από -30mV έως 30mV υποδηλώνουν γενικά σταθερές κολλοειδής διασπορές. Σε τιμές μεγαλύτερες των 70 mv εμφανίζεται το φαινόμενο της περικινητικής συσσωμάτωσης και οι κολλοειδής διασπορές χάνουν τη σταθερότητά τους. Ωστόσο, αν τα σωματίδια έχουν τιμή δυναμικού ζ κοντά στο μηδέν, τότε δεν υπάρχει καμία δύναμη να τα αποτρέψει από το να έρθουν κοντά και να συσσωματωθούν. Σε αυτή την περίπτωση, αν πρόκειται για σωματίδια με πολυμερική επικάλυψη, η σταθερότητα της κολλοειδούς διασποράς εξηγείται με βάση τους στερεοχημικούς παράγοντες (Εικόνα 1.2). Για να πλησιάσουν κολλοειδή σωματίδια που έχουν προσροφήσει στην επιφάνειά τους ένα πολυμερές, θα πρέπει να συμπλεχθούν οι πολυμερικές στιβάδες τους, με αποτέλεσμα να μειωθεί η εντροπία του συστήματος. Αυτό απαγορεύεται λόγω του δεύτερου θερμοδυναμικού νόμου και έτσι τα σωματίδια «αναγκάζονται» να διατηρηθούν σε διασπορά. Βέβαια για να μπορεί να προβλεφθεί η αποτελεσματικότητα της σταθεροποίησης της διασποράς με την προσρόφηση κάποιου πολυμερούς, πρέπει να μελετηθεί η ισόθερμος της προσρόφησης καθώς και το πάχος της πολυμερικής στιβάδας που σχηματίζεται. Το ζ-δυναμικό των σωματιδίων είναι μοναδικό για κάθε διάλυμα στο οποίο είναι διεσπαρμένα και επηρεάζεται από διάφορες παραμέτρους όπως το ph του διαλύματος, η ιοντική ισχύς του και η παρουσία σταθεροποιητικών ουσιών (π.χ. γαλακτωματοποιητές), οι οποίες πρέπει να ληφθούν υπόψη για την διασφάλιση μιας μακροχρόνιας σταθερότητας στο τελικό προϊόν. Όταν η τιμή του δυναμικού ζ δεν αφρορά συγκερκιμένη τιμή του ph, είναι ουσιαστικά ένας αριθμός χωρίς νόημα, κυρίως όταν πρόκειται για φορτισμένα-ιοντικά κολλοειδή όπως τα οξείδια του σιδήρου. Κατά συνέπεια, ένα διάγραμμα δυναμικού ζ ως προς το ph θα είναι θετικό σε χαμηλά ph και μικρότερο ή αρνητικό σε υψηλότερα. To σημείο όπου η καμπύλη περνά από μηδενικό δυναμικό ζ ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο (IsoElectric Point, I.E.P.) (παράγραφος 1.1.3) και είναι πολύ σημαντικό για μια πρώτη εκτίμηση της σταθερότητας του κολλοειδούς σε φυσιολογικά ph. Είναι συνήθως το σημείο 41

42 στο οποίο το κολλοειδές σύστημα είναι λιγότερο σταθερό. Ακολουθεί ένα χαρακτηριστικό διάγραμμα δυναμικού ζ ως προς το ph (διάγραμμα 1.3) Διάγραμμα 1. 3: Διάγραμμα δυναμικού ζ προς ph για ιοντικά κολλοειδή που προσροφούν αντιστρεπτά υδρογονοκαντιόντα στην επιφάνειά τους [ 74 ] Η τεχνική περίθλασης ακτίνων Χ (X-Ray diffraction, XRD) [72] Eίναι μία αναλυτική τεχνική, μέσω της οποίας μπορούμε να αντλήσουμε ποιοτικές πληροφορίες ως προς την κρυσταλλογραφική δομή, το μέγεθος των κρυσταλλιτών, την χημική σύσταση και τις φυσικές ιδιότητες ενός στερεού δείγματος, σε μορφή σκόνης ή ακόμη και λεπτού φιλμ. Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στην παρατήρηση της έντασης μίας σκεδαζόμενης ακτίνας Χ, η οποία χτυπά στο δείγμα, σαν συνάρτηση της γωνίας της προσπίπτουσας και ανακλώμενης ακτινοβολίας, της πόλωσης, του μήκους κύματος ή της ενέργειας. Τα κρυσταλλικά υλικά, όπως ο μαγνητίτης, αποτελούνται από σειρές ατόμων τακτικά τοποθετημένες μέσα στον κρύσταλλο. Από ένα θερμαινόμενο σύρμα παράγονται ηλεκτρόνια, τα οποία επιταχύνονται λόγω μεγάλης διαφοράς δυναμικού (~ 40 kv) και προσκρούουν σε μια άνοδο από χαλκό. Η άνοδος, σαν αποτέλεσμα της κρούσης, χάνει ηλεκτρόνια από την εσωτερική Κ στοιβάδα. Οι οπές που δημιουργούνται καταλαμβάνονται από ηλεκτρόνια της εξωτερικής στοιβάδας μεταβαίνοντας από υψηλότερη σε χαμηλότερη ενεργειακή στάθμη. Η μετάπτωση των ηλεκτρονίων σε χαμηλότερη ενεργειακή στάθμη, λόγω αυτής της μετάβασης, αποδίδεται ως ακτίνες Χ. Η ακτινοβολία Χ προσκρούει πάνω στο δείγμα, τα άτομα στα επίπεδα Miller του κρυστάλλου την περιθλούν και στη συνέχεια προσπίπτει σε έναν ανιχνευτή. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του ηλεκτρικού διανύσματος της ακτινοβολίας Χ και των ηλεκτρονίων της ύλης, μέσα από την οποία διέρχεται, προκαλεί σκέδαση. Όταν μία δέσμη ακτίνων Χ, σκεδάζεται στο οργανωμένο περιβάλλον του κρυστάλλου (διάταξη κρυσταλλογραφικών επιπέδων που περιέχουν τα περιοδικά διατεταγμένα άτομα, τα προαναφερθέντα επίπεδα Miller), συμβαίνει συμβολή (ενισχυτική ή καταστρεπτική) των σκεδαζόμενων ακτίνων, επειδή οι αποστάσεις μεταξύ των κέντρων σκέδασης είναι του ίδιου μεγέθους με το μήκος κύματος της ακτινοβολίας. Αποτέλεσμα αυτού του τύπου σκέδασης, είναι η περίθλαση της ακτινοβολίας, η δημιουργία δηλαδή σφαιρικών κυμάτων, χαρακτηριστικών της ατομικής διάταξης του κρυστάλλου και συνεπώς του προς εξέταση υλικού. 42

43 Όταν μία δέσμη ακτίνων Χ προσκρούει στην επιφάνεια του κρυστάλλου με κάποια γωνία θ, ένα τμήμα της σκεδάζεται από το επιφανειακό στρώμα των ατόμων. Το μη σκεδαζόμενο τμήμα της δέσμης, εισέρχεται στο δεύτερο στρώμα ατόμων όπου και πάλι ένα τμήμα σκεδάζεται, το υπόλοιπο εισέρχεται στο τρίτο στρώμα κ.ο.κ. Το αθροιστικό αποτέλεσμα της σκέδασης αυτής, από τα τακτικά χωροθετημένα κέντρα του κρυστάλλου είναι η περίθλαση της δέσμης. Το φάσμα περίθλασής των ακτίνων Χ, είναι μοναδικό για κάθε κρυσταλλική ουσία Θερμοσταθμική ανάλυση (Thermogravimetric Analysis, TGA) [75] Η θερμοσταθμική ανάλυση, είναι η τεχνική χαρακτηρισμού υλικών αλλά και ποσοτικής ανάλυσης. Βασίζεται στην απώλεια μάζας μίας ουσίας η οποία μετράται ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, καθώς η ουσία υποβάλλεται σε προγραμματισμένη μεταβολή της θερμοκρασίας, συνήθως με σταθερό ρυθμό. Η ατμόσφαιρα παίζει σημαντικό ρόλο στα πειράματα θερμοσταθμικής ανάλυσης και μπορεί να είναι οξειδωτική, αδρανής ή δραστική (reactive). Το μέγεθος του δείγματος είναι μικρό (2 έως 5 mg), για να αποφευχθούν σφάλματα λόγω θερμικών συνιστωσών. Οι μετρήσεις εκτελούνται με τη βοήθεια μικροζυγού ακριβείας, σε κλίβανο, όπου η θερμοκρασία μπορεί να προγραμματιστεί και να ελεγχθεί απόλυτα. Η θερμοκρασία του δείγματος μετράται και καταγράφεται με ακρίβεια. Το διάγραμμα της μάζας ή του ποσοστού της μάζας, ως συνάρτηση του χρόνου ή/και της θερμοκρασίας, ονομάζεται θερμογράφημα ή καμπύλη θερμικής αποδόμησης. Μία εναλλακτική και συμπληρωματική παρουσίαση, είναι η χρήση της πρώτης παραγώγου της καμπύλης TGA σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία ή το χρόνο. Αυτό δείχνει το ρυθμό με τον οποίο η μάζα μεταβάλλεται και είναι γνωστή ως διαφορική θερμοσταθμική καμπύλη (Differential Thermo gravimetric curve DTG) [76] Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) [77] Η ηλεκτρονική μικροσκοπία διάδοσης, είναι μία μικροσκοπική τεχνική, όπου μια ακτίνα ηλεκτρονίων διαδίδεται μέσω ενός πολύ λεπτού δείγματος, αλληλεπιδρώντας με αυτό. Η εικόνα σχηματίζεται από την αλληλεπίδραση των ηλεκτρονίων, που περνούν μέσα από το δείγμα. Σε μικρότερες μεγεθύνσεις, η αντίθεση στις εικόνες από ΤΕΜ, οφείλεται στην δίοδο των ηλεκτρονίων μέσω του υλικού, εξαιτίας της λεπτότητας και της σύνθεσης του υλικού, με συνέπεια να λαμβάνει χώρα ελαστική, ή και καθόλου σκέδαση των ηλεκτρονίων. Σε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις, πολύπλευρες αλληλεπιδράσεις κυμάτων διαμορφώνουν την ένταση της εικόνας. Στα σημεία εκείνα, που το δείγμα δεν είναι διαπερατό από τα ηλεκτρόνια, δημιουργούνται σκοτεινές περιοχές, ενώ αντίθετα τα διαπερατά σημεία δίνουν φωτεινές περιοχές. Ο τρόπος με τον οποίο λειτουργεί το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης, θέτει πολλούς περιορισμούς ως προς τη φύση των δειγμάτων που μπορούν να μελετηθούν. Κάποιες από τις ιδιότητες που θα πρέπει να έχει ένα δείγμα, ώστε να μπορεί να παρατηρηθεί με ΤΕΜ, είναι οι ακόλουθες: να μην είναι πτητικό, να αντέχει σε υψηλό κενό, να είναι σταθερό στο βομβαρδισμό ηλεκτρονίων και να είναι αρκετά λεπτό για να μπορούν να το διαπερνούν τα ηλεκτρόνια. Εναλλακτικοί τρόποι χρήσης, επιτρέπουν την παρατήρηση διαμορφώσεων στη χημική ταυτότητα, τον κρυσταλλικό προσανατολισμό και στην ηλεκτρονιακή δομή. 43

44 Μαγνητομετρία δονούμενου συστήματος (Vibrating System Magnetometry, VSM) Το μαγνητόμετρο ταλαντούμενου δείγματος αποτελεί μια πολύ ευαίσθητη τεχνική με διακριτική ικανότητα περίπου ίση με 109 Am -2[78], για τη μέτρηση σκληρών και μαλακών μαγνητικών υλικών. Στο VSM μπορούν να μετρηθούν μακρισκοπικά υλικά, σκόνες και λεπτά υμένια. Όταν ένα δείγμα τοποθετείται σε ένα ομογενές μαγνητικό πεδίο, επάγεται σε αυτό διπολική μαγνητική ροπή, ανάλογη με την μαγνητική επιδεκτικότητα του δείγματος. Αν το δείγμα υποβληθεί σε μια ημιτονοειδή κίνηση, επάγεται ηλεκτρικό σήμα. Η συχνότητα ταλάντωσης που εκφράζεται ως τέτοιο σήμα, είναι ανάλογη της μαγνητικής ροπής, του πλάτους ταλάντωσης και της συχνότητας της ταλάντωσης. Σε αυτή την αρχή, βασίζεται η λειτουργία του μαγνητομέτρου ταλαντούμενου δείγματος. Το εξεταζόμενο υλικό, τοποθετείται στο άκρο μιας μη μαγνητικής ράβδου, ενώ το άλλο άκρο της ράβδου είναι στερεωμένο σε ένα κώνο ή σε ένα σύστημα μηχανικής κίνησης, το οποίο βρίσκεται πάνω από το μαγνήτη, έτσι ώστε το δείγμα, να υποβάλλεται κάθετα σε μια ημιτονοειδή κίνηση, συχνότητας κάτω από 100Hz, μέσα στο ομογενές μαγνητικό πεδίο. Κατάλληλα πηνία σε τετραπολική διάταξη, που είναι τοποθετημένα στους πόλους του μαγνήτη συλλέγουν το επαγόμενο σήμα. Αυτό το εναλλασσόμενο σήμα της συχνότητας ταλάντωσης, είναι ανάλογο του μεγέθους της μαγνητικής ροπής του δείγματος. Ωστόσο, το εναλλασσόμενο σήμα είναι, επίσης, ανάλογο του πλάτους ταλάντωσης και της συχνότητας. Οι τιμές της μαγνητικής ροπής που λαμβάνονται, απλά με τη μέτρηση του εύρους του σήματος, υπόκεινται σε λάθη, ως αποτέλεσμα των αποκλίσεων του πλάτους και της συχνότητας ταλάντωσης. Για να υπερνικηθεί το παραπάνω πρόβλημα, χρησιμοποιείται σαν αναφορά, σήμα που παράγεται από μόνιμο μαγνήτη, που βρίσκεται σε υψηλότερο σημείο της ράβδου, εκτός του μαγνητικού πεδίου, το οποίο θα ποικίλλει με το πλάτος ταλάντωσης και τη συχνότητα ταλάντωσης, όπως ακριβώς συμβαίνει με το σήμα που λαμβάνεται από τα τροφοδοτούμενα εξ επαφής πηνία Το VSM αποτελεί την καλύτερη τεχνική για τη μέτρηση της μαγνήτισης κόρου, σε οποιοδήποτε σιδηρομαγνητικό υλικό, επειδή η μέτρηση δεν επηρεάζεται από φαινόμενα απομαγνήτισης και επιπλέον επειδή υψηλά πεδία, μέχρι 2 Τ (ή και παραπάνω), μπορούν να εφαρμοστούν, ώστε να επιτευχθεί κορεσμός [ 79 ]. Δεδομένου ότι η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη, επιβάλλεται το μέγεθος του δείγματος να είναι μικρότερο σε σύγκριση με τις διαστάσεις της διάταξης των πηνίων. Επομένως, μόνο η διπολική ροπή του δείγματος καταγράφεται και τα φαινόμενα υψηλότερων ροπών καταστέλλονται. Η συσκευή είναι λιγότερο ωφέλιμη για τη μέτρηση των βρόχων υστέρησης, σε μαλακά μαγνητικά υλικά, εξαιτίας των φαινομένων απομαγνήτισης, Όμως, για τα υψηλής ανισοτροπίας ή σκληρά μαγνητικά υλικά το VSΜ αποτελεί το πιο κατάλληλο όργανο για διάφορα είδη μαγνητικών μετρήσεων [80] Μέθοδος προσδιορισμού αποδοτικότητας για χρήση ΜΝΣ ως σκιαγραφικά μέσα ( 1 HNMR) [81] Οι παράγοντες αντίθεσης για την μαγνητική τομογραφία (MRI), προκαλούν ενίσχυση του ρυθμού χαλάρωσης των πρωτονίων του νερού σε ιστούς ή όργανα, 1/Τ 1, και ταυτόχρονα το σήμα αυτών των πρωτονίων στη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Άμεση συνέπεια αυτού, είναι να μεταβάλλουν την ένταση του σήματος στην εικόνα 44

45 που λαμβάνεται από τη μαγνητική τομογραφία, στα σημεία όπου έχει συσσωρευτεί ο παράγοντας αντίθεσης, σε σχέση με την εικόνα που λαμβάνεται στα σημεία που ο παράγοντας αντίθεσης δεν είναι παρόν. Ο μηχανισμός στον οποίο οφείλεται η 1/Τ 1, χαλάρωση των πρωτονίων του νερού, είναι η διπολική χαλάρωση που προκύπτει από την αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτονίων του νερού και της μαγνητικής ροπής των μη συζευγμένων ηλεκτρονίων του παράγοντα αντίθεσης. Η ενίσχυση του σήματος, εξαρτάται από τη συγκέντρωση των παραμαγνητικών ιόντων, και έτσι η αποτελεσματικότητα του παράγοντα αντίθεσης, που μετράται σύμφωνα με τη μέθοδο 1 HNMR και ορίζεται από τον παράγοντα χαλάρωσης 1/Τ 1, ορίζεται από την εξίσωση 1.11: 1/Τ 1 (C) = 1/Τ 1 (0) + r 1 C (εξίσωση 1.11 ) όπου 1/Τ 1 (C) είναι ο ρυθμός χαλάρωσης πρωτονίου παρουσία του παράγοντα αντίθεσης, 1/Τ 1 (0) είναι ο ρυθμός χαλάρωσης πρωτονίου του καθαρού διαλύτη, C είναι η συγκέντρωση του παράγοντα αντίθεσης και r 1 είναι η χαλάρωση πρωτονίου σε μονάδες mm -1 s -1. Πιο συγκεκριμένα, δύο έιναι οι χρόνοι χαλάρωσης, που μελετώνται συνήθως στα πειράματα 1 Η NMR [82] : Ο χρόνος χαλάρωσης spin-πλέγματος, T 1 και ο χρόνος χαλάρωσης spin-spin, Τ 2. Ο Τ 1 συνδέεται με μη αντιστρεπτές διεργασίες μετατροπής ενέργειας (dissipation) του συστήματος των spin του πλέγματος, απο μια κατάσταση, σε μία άλλη που ευνοείται θερμοδυναμικά. Ο Τ 2 συνδέεται με την διαταραχή (dephasing) μέσα στο σύστημα περιστροφής. Η διαταραχή αυτή, είναι ένα κβαντικό φαινόμενο, το οποίο αφορά στην κυμματική φύση της ύλης και εκφράζεται ως ο ρυθμός μετατροπής της διάταξης της ύλης, από μια στατική κατάσταση σε μια τυχαία κατάσταση, ως επίδραση διαφόρων παραγόντων. Αυτοί οι χρόνοι διαφέρουν ως προς χημικώς δεσμευμένα άτομα υδρογόνου, άτομα υδρογόνου προσροφημένα πάνω σε επιφάνειες, και άτομα υδρογόνου που εισέρχονται σε μικρούς πόρους του νερού. Επιπλέον, οι χρόνοι αυτοί επηρεάζονται σημαντικά από τη διάχυση του νερού μέσω μεγάλων διαβαθμίσεων μαγνητικού πεδίου, που προκύπτουν από ασυνέχειες στην μαγνητική επιδεκτικότητα στα σημεία επαφής του τοιχώματος των πόρων. Η ερμηνεία των μετρήσεων της χαλάρωσης περιπλέκεται περαιτέρω σε παραμαγνητικά υλικά. Έχουν μελετηθεί διάφορα συστήματα υπερπαραμαγνητικών οξειδίων του σιδήρου για την ενίσχυση της αντίθεσης εικόνας κατά την απεικόνιση ιστών με μαγνητική τομογραφία, λόγω της μείωσης που προκαλούν στο ρυθμό χαλάρωσης spin-πλέγματος, 1/Τ 1 ή στο ρυθμό χαλάρωσης spin-spin, 1/Τ [83] 2. Ωστόσο, στις περισσότερες μελέτες χρησιμοποιούνται υψηλά μαγνητικά πεδία. Συστήματα υπερπαραμαγνητικών οξειδίων του σιδήρου, χαμηλής συγκέντρωσης, που προκαλούν ικανοποιητική ενίσχυση της αντίθεσης της εικόνας, σε χαμηλά μαγνητικά πεδία (ultra low field), είναι πολύ χρήσιμα, αφού μειώνεται η επιβάρυνση του οργανισμού, από την ποσότητα σκιαγραφικών παραγόντων που χρειάζονται για δεδομένο αποτέλεσμα και συνεπώς να μετριάζονται τα προβλήματα της τοξικότητας που προκύπτουν. Επίσης, σε χαμηλά μαγνητικά πεδία, η διάκριση των ιστών κατά την απεικόνιση με βάση το ρυθμό χαλάρωσης spin-πλέγματος, είναι πολύ πιο σαφής από αυτή που λαμβάνεται σε υψηλά μαγνητικά πεδία. Τόσο ο ρυθμός χαλάρωσης spin-πλέγματος, 1/Τ 1, όσο και ο ρυθμός χαλάρωσης spinspin, 1/Τ 2, αυξάνονται γραμμικά όσο αυξάνεται η μαγνητική επιδεκτικότητα των υπερπαραμαγνητικών οξειδίων του σιδήρου, αυξάνοντας δηλαδή, τη συγκέντρωσή τους στην υδατική διασπορά. Σε εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο, οι μαγνητικές ροπές των υπερπαραμαγνητικών οξειδίων του σιδήρου, επάγουν τοπικά βαθμιδωτά πεδία, τα οποία 45

46 χαλούν την ομοιογένεια του εφαρμοζόμενου πεδίου και διαταράσσουν, έτσι, τα πυρηνικά spin των γειτονικών πρωτονίων και ενισχύουν την αντίθεση του σήματος Επαγωγή υπερθερμίας με ΜΝΣ με εναλασσόμενα μαγνητικά πεδία Η υπερθερμία μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας χωρητική ή επαγωγική σύζευξη πεδίων ραδιοσυχνοτήτων (10-100MHz), μικροκυμάτων (>300MHz), υπερήχων, λέιζερ ή εξωτερικής θέρμανσης. Μακροσκοπικά μεταλλικά εμφυτεύματα υψηλής αγωγιμότητας μετάλλων, χρησιμοποιούνται για να ενισχύσουν τη θέρμανση στόχων μέσω των ρευμάτων Eddy. Η απορροφούμενη ενέργεια ανά μονάδα μάζας υλικού, καλείται ειδικός ρυθμός απορρόφησης (Specific Absorption Rate, SAR) και ορίζεται ως [84] : (εξίσωση 1.12) όπου m ox είναι η μαγνητική μάζα του υλικού η οποία είναι διεσπαρμένη σε μέσο ειδικής θερμοχωρητικότητας CV. Ο SAR καλείται και ως ειδικός συντελεστής απώλειας ενέργειας και περιγράφεται ως την ενέργεια της θέρμανσης ενός μαγνητικού υλικού ανά γραμμάριο: (εξίσωση 1.13) όπου c είναι η ειδική θερμότητα και dτ/dt είναι ο ρυθμός μεταβολής της θερμοκρασίας. Η σύζευξη ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, με τα μαγνητικά σωματίδια εντός του σώματος έχει ως αποτέλεσμα τη μεταφορά ενέργειας στον ιστό-στόχο από: (α) Θερμότητα λόγω ρευμάτων Eddy (β) Θερμότητα λόγω υστέρησης: η θερμότητα που επάγεται όταν ένα μαγνητικό υλικό διαγράφει ένα μέρος του βρόχου υστέρησης ή ολόκληρο το βρόχο υστέρησης (γ) Θερμότητα ιξώδους: θερμότητα που επάγεται από την κίνηση ενός σωματιδίου μέσα σε ένα ιξώδες συνεχές μέσο (δ) Μαγνητικό συντονισμό Τυπικά μαγνητικά πεδία, που έχουν χρησιμοποιηθεί σε σύζευξη με νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου, έχουν συχνότητες στο εύρος kHz και πλάτος 1-15kA/m. Όμως, είναι αναγκαίο τα υλικά τα οποία αποσκοπούν σε in vivo εφαρμογές να μελετώνται σε συχνότητες ~100kHz, ώστε να αποφεύγονται παρενέργεις στον οργανισμό, όπως για παράδειγμα η θέρμανση των ιστών ιστούς λόγω ρευμάτων Εddy. Σε πολλά συστήματα υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων, σε συχνότητες εύρους Hz και στην περίπτωση νανοσωματιδίων με πολυδιασπορά μεγαλύτερη του 0.1, έχει αποδειχθεί ότι ο δείκτης SAR είναι συνάρτηση μόνο της συχνότητας και του τετραγώνου της έντασης του μαγνητικού πεδίο (] R.E. Rosensweig, J. Magn. Magn. Mater. 252 (2002) 370) και εξάγεται καλύτερα από τη σχέση: 46 (εξίσωση 1.14) όπου f είναι η συχνότητα, H η ένταση του πεδίου και k μια σταθερά εξαρτώμενη από τη χρησιμοποιούμενη διάταξη. Στο διάγραμμα 1.4 περιγράφονται τα αποτελέσματα μιας μελέτης [85] που επιβεβαιώνει αυτή τη συσχέτιση.

47 Διάγραμμα 1. 4: Οι τιμές του μεγέθους SAR συναρτήσει της συχνότητας για το δείγμα της Micromod nanomag-d (100nm). Οι μετρήσεις έγιναν σε πεδίο έντασης H=5.66kA/m. Επομένως, οι μετρήσεις κατά τη μελέτη των μελλοντικών μαγνητικών νανoσωματιδίων, είναι συγκρίσιμες, μόνο όταν γίνονται από ένα σύστημα με την ίδια διαμόρφωση πεδίου (ίδια συχνότητα, ένταση και γεωμετρία). Αυτός ο σημαντικός περιορισμός της συγκρισιμότητας, οδήγησε στην ανάγκη ορισμού μιας νέας παραμέτρου, η οποία ονομάζεται εσωτερική απώλεια ισχύος (Intrinsic Loss Power, ILP). Η ILP δεν είναι εντελώς ενδογενής (όμως είναι σαφώς περισσότερο από το SAR) και δύναται να χρησιμοποιηθεί μόνο αν ισχύουν οι ακόλουθες υποθέσεις: Το μέγεθος του κρυσταλλίτη έχει δείκτη πολυδιασποράς μεγαλύτερο από 0.1, συχνότητες αρκετών MHz, το πεδίο είναι πολύ μεγαλύτερο από το πεδίο κορεσμού των νανοσωματιδίων και υπάρχουν παρόμοιες περιβαλλοντικές θερμοδυναμικές απώλειες. Επομένως, σύμφωνα και με τις παραπάνω υποθέσεις, ο ILP ορίζεται ως: (εξίσωση 1.15) Ο SAR που μπορεί να επιτευχθεί για ένα συνδυασμό πεδίου, συχνότητας και τύπου σωματιδίου, συνήθως πρέπει να καθοριστεί πειραματικά. Οι τιμές του SAR ποικίλουν μέσα σε ένα εύρος από μερικά W/g σε μερικές εκατοντάδες W/g για βελτιστοποιημένα συστήματα πεδίων-σωματιδίων (χρησιμοποιώντας δηλαδή τα πεδία και τις συχνότητες, που επιφέρουν τα καλύτερα αποτελέσματα στο συγκεκριμένο μελετώμενο σύστημα). Σημαντική είναι η βελτιστοποίηση των ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων, έτσι ώστε να μειωθεί η απαιτούμενη συγκέντρωση του μαγνητικού υλικού. Ο SAR, εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως η επικάλυψη της επιφάνειας των νανοσωματιδίων, το spin, η επίδραση των ιδιοτήτων της τροποποιημένης επιφάνειας στην αποκατάσταση της κίνησης Brown (Brownian relaxation), το μέγεθος και η κρυσταλλικότητα της νανοδομής Εφαρμογές απεικόνισης και θεραπείας των ΜΝΣ Τα τελευταία χρόνια, οι μαγνητικές ιδιότητες νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου έχουν μελετηθεί ευρέως και παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον επειδή τα μαγνητικά νανοσωματίδια μπορούν να βρουν ένα πλήθος βιοϊατρικών εφαρμογών. Χαρακτηριστικό 47

48 παράδειγμα, είναι η χρήση μαγνητικών νανοσωματιδίων συνδυαστικά για διάγνωση και θεραπεία (theragnostics). Theragnostics είναι μια κατηγορία νανοκολλοειδών τα οποία επιτρέπουν την ταυτόχρονη in-vivo απεικόνιση και διάγνωση και την ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκων. Περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα θεμάτων, συμπεριλαμβανομένης της εξατομικευμένης ιατρικής, της φαρμακο-γονιδιωματικής, και της μοριακή απεικόνισης, με σκοπό την ανάπτυξη αποτελεσματικών νέων στοχευμένων θεραπειών με κατάλληλη αναλογία οφέλους/κινδύνου για τους ασθενείς και την παρακολούθησης της ανταπόκρισης στη θεραπεία, ώστε να βελτιστοποιηθεί η διαδικασία επιλογής του φαρμάκου και να αυξηθεί η αποτελεσματικότητά του [86] Συστήματα στόχευσης και ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκου Υπάρχει η δυνατότητα επιφανειακής τροποποίησης των ΜΝΣ, με την πρόσδεση σε αυτά ειδικών ομάδων στόχευσης. Με αυτή τη μέθοδο τα ΜΝΣ, αποκτούν την ικανότητα να αναγνωρίσουν ένα βιολογικό στόχο. Για το σκοπό αυτό, θα πρέπει τα νανοσωματίδια να είναι εξαιρετικά σταθερά σε υδατικά ιοντικά διαλύματα, σε φυσιολογικό pη, και να μην είναι τοξικά, αλλά και να μπορούν να παραμείνουν στην κυκλοφορία του αίματος για αρκετό χρονικό διάστημα ή όσο χρειάζεται για να προσεγγίσουν τον ιστό-στόχο. Βιολογικά μόρια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν γι αυτό το σκοπό, είναι τα αντισώματα ή θραύσματα αυτών, κάποιοι ολιγοσακχαρίτες, πρωτεΐνες, πεπτίδια, μόρια που μιμούνται πεπτίδια καθώς και πολλοί άλλοι μικροί προσδέτες. Τα συστήματα στόχευσης, αποτελούνται από τη δραστική ουσία, που είναι κυρίως ισχυρά φάρμακα με αυξημένη τοξικότητα όπως τα αντικαρκινικά, από μία μη - ανοσολογική βιοδιασπώμενη πολυμερική αλυσίδα, στην οποία έχει προσδεθεί μια κατευθυντήρια ομάδα (targeting moiety), ένα διαλυτοποιητή (solubiliser) ο οποίος θα ενισχύσει τη διαλυτότητα του συστήματος στα βιολογικά υγρά και τέλος, από ένα βραχίονα (spacer) που φέρει χημικούς δεσμούς με τους οποίους συνδέονται τα μόρια του φαρμάκου και μπορούν να διασπαστούν μόνο από ένζυμα τα οποία βρίσκονται στα κύτταρα στόχους [87]. Η εκλεκτική διάθεση του φαρμακοφόρου συστήματος στον ιστό-στόχο συμβαίνει είτε παθητικά (passive targeting) είτε ενεργητικά (active targeting). Για τη σύζευξη αυτών των βιολογικών μορίων (φαρμακοφόρα) στην επιφάνεια των ΜΝΣ, έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες διεργασίες κάποιες από αυτές αναφέρονται παρακάτω [59] : (α) η τεχνική ηλεκτροστατικής χημικής προσρόφησης αντισώματος ή πρωτεΐνης στην επιφάνεια ΜΝΣ. Ωστόσο, αυτή η μη-ομοιοπολική σύζευξη δεν ήταν πολύ αποτελεσματική, γιατί είναι δύσκολο να ελεγχθεί η επαναληψιμότητα και η απόδοση της διαδικασίας, η σταθερότητα του προϊόντος σε βιολογικά μέσα, και, εξ αιτίας της αύξησης της ιοντικής ισχύος, είναι δύσκολη η προσρόφηση ικανοποιητικής ποσότητας φαρμακοφόρου. (β) η μη ομοιοπολική σύζευξη στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. ΜΝΣ με επικάλυψη στρεπταβιδίνης συζεύχθηκαν με βιοτινυλιωμένους προσδέτες ή βιοτυνιλιωμένα ΜΝΣ με την πρωτείνη στρεπταβιδίνη. (γ) η συζευξη αντισωματων με ΜΝΣ πουέχουν τροποποιηθεί στην επιφάνεια τους με άμινο PEG μέσω σχηματισμόυ βάσης Schiff (δ) η σύζευξη καρβοξυλιωμάδων ΜΝΣ με γλουταραλδεϋδη ή μέσω σχηματισμού αμιδίου, με πεπτίδια και πρωτεΐνες (ε) η ομοιοπολική πρόσδεση πεπτιδίων, αντισωμάτων, πρωτεϊνών και ολιγονουκλεϊτιδίων, καταλυόμενη από πληθώρα αντιδραστηρίων σύζευξης, για παράδειγμα με τη χρήση των αντιδραστηρίων καρβοδιϊμιδίου/ηλεκτριμίδιου 48

49 (στ) η αντίδραση αζιδίου- αλκυνίου, που περιγράφεται με τον όρο click chemistry, κατά την οποία σταθερά ΜΝΣ που φέρουν αζιδικές ή αλκινικές ομάδες αντιδρούν με τα αντίστοιχα τροποποιημένα λειτουργικά μόρια (ζ) η χρήση μαγνητολιποσωμάτων στην επιφάνεια των οποίων ενσωματώνονται αντισώματα ή πεπτίδια Η ανάπτυξη τέτοιων συστημάτων έχει ως αποτέλεσμα την βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των δραστικών ουσιών και τη συμμόρφωση των ασθενών. Παράλληλα συντελεί στη μείωση της εμφάνισης των παρενεργειών, αφού ο στόχος αυτών των συστημάτων είναι η καταστροφή των κυττάρων που βρίσκονται στον ιστό στόχο χωρίς να προκαλούν βλάβες στα υγιή κύτταρα Μαγνητική τομογραφία (Magnetic Resonance Imaging, MRI) [88] Ως παράγοντες αντίθεσης στη μαγνητική τομογραφία (MRI), ονομάζεται μια ομάδα σκιαγραφικών μέσων που χρησιμοποιείται για τη βελτίωση της ορατότητας των εσωτερικών δομών του σώματος και την απεικόνισή τους, καθώς και επιτρέποντας την έγκαιρη ανίχνευση διαφόρων παθολογιών. Ο σίδηρος, εμφανίζοντας πολύ μεγάλη μαγνήτιση κόρου, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα από τα πιο σημαντικά σκιαγραφικά μέσα για την μαγνητική τομογραφία. Μάλιστα η μαγνήτιση κόρου που παρουσιάζει, είναι περίπου διπλάσια από το ισχυρότερο οξείδιό του. Παρόλα αυτά τα υπερπαραμαγνητικά σωματίδια οξειδίου του σιδήρου διαδραματίζουν το πιο σημαντικό ρόλο ως σκιαγραφικοί παράγοντες, για την ενίσχυση της αντίθεσης του σήματος στην MRI. Αυτό συμβαίνει γιατί ο σίδηρος παρουσιάζει το μειονέκτημα ότι οξειδώνεται εύκολα, έτσι η χρήση του θα ήταν εφικτή μόνο αν επικαλυπτόταν με ένα υλικό που θα απέτρεπε την οξείδωσή του και θα εξασφάλιζε την παραμονή του, ως διασπαρμένες μεμονωμένες δομές στο αίμα. Τα κολλοειδή που χρησιμοποιούνται, αποτελούνται από στερεούς πυρήνες διαμέτρου 5-15 nm και γενικά επικαλύπτονται συνήθως με ένα παχύ πολυσακχαριδικό ή πολυμερικό στρώμα, υδροδυναμικής διαμέτρου nm. Λόγω της πολύ μεγάλης εγκάρσιας χαλάρωσης πρωτονίων στο εσωτερικό τους, της υψηλής μαγνήτισης κόρου που εμφανίζουν και της αλληλεπίδρασης με συγκεκριμένο τρόπο με τους βιολογικούς οργανισμούς [89], οι κολλοειδής διασπορές των υπερπαραμαγνητικών νανοκρυστάλλων, είναι από τα πιο σημαντικά σκιαγραφικά μέσα. Η βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας αυτών των παραγόντων αντίθεσης, απαιτεί το συσχετισμό της χαλάρωσης των πρωτονίων και των μορφολογικών ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων Υπερθερμία [90] Στην πιο διαδεδομένη κλινική χρήση της, η μέθοδος της υπερθερμίας είναι μια θεραπευτική μέθοδος, κατά την οποία οι ιστοί θερμαίνονται παραπάνω από τα κανονικά όρια. Θεωρείται ως η καλύτερη εναλλακτική αντικαρκινική θεραπεία της χημειοθεραπείας και της ακτινοβολίας, αφού στερείται πολλών παρενεργειών. Εφαρμόζεται αυξάνοντας την θερμοκρασία ανάμεσα σε δύο διακριτές θερμοκρασίες, η οποία αύξηση μπορεί να προκαλέσει διαταραχή στα κύτταρα σε διαφορετικούς βαθμούς. Αύξηση θερμοκρασίας σε μεσαίες περιοχές ( C), μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών των κυττάρων και να οδηγήσει σε κυτταρική αποικοδόμηση και σε απόπτωση. Παρόλα αυτά, για αποτελεσματική θεραπεία, συνήθως απαιτείται μέτριου εύρους θερμοκρασιών υπερθερμία, που διαρκεί για ώρες και συνδυάζεται με χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία. Αντιθέτως, εφαρμογή θεραπείας με υπερθερμία σε θερμοκρασίες άνω των 46 49

50 0 C, μπορεί να προκαλέσει αιφνίδια κυτταρική θανάτωση και να διαρκέσει ακόμα και μερικά λεπτά. Η θεραπεία μέσω υπερθερμία,ς σε αυτές τις θερμοκρασίες, συνήθως αναφέρεται με τον όρο «θερμοκατάλυση» και χαρακτηρίζεται από νέκρωση του ιστού, πήξη και απανθράκωση. Πολλά μοντέλα θεραπείας με υπερθερμία, είναι διαθέσιμα για αντικαρκινική θεραπεία, αλλά τα περισσότερα χωλαίνουν στην έλλειψη επιλεκτικής στόχευσης στους καρκινικούς όγκους και έτσι στοχευμένη απελευθέρωση θερμικής ενέργειας. Όταν στην θεραπεία με υπερθερμία εκτίθεται όλο το σώμα σε θερμοκρασίες πάνω από τις κανονικές, μπορεί να εμφανιστούν πολλές ανεπιθύμητες συνέπειες στους υγιείς ιστούς. Τεχνικές που περιλαμβάνουν την ελεγχόμενη εφαρμογή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, είναι περισσότερο περιορισμένες, αλλά και πάλι δεν έχουν εξειδίκευση στον επιθυμητό ιστό. Διαδερμικές θεραπείες με ραδιοσυχνότητες ή μικροκύματα ή με πήξη μέσω ακτινών λέιζερ, προσφέρουν καλύτερο εντοπισμό, αλλά προϋποθέτουν πρόσβαση στην περιοχή του όγκου και εκ των προτέρων βεβαιότητα της ακριβής θέσης του στον οργανισμό. Ο ιδανικός μηχανισμός αποδέσμευσης της θερμικής ενέργειας της υπερθερμίας, θα έπρεπε να είναι μη επεμβατικός, να έχει εξειδίκευση στον πάσχοντα ιστό και διαθέτει την ικανότητα της πολύ ειδικής και ταυτόχρονα μεγάλης έντασης θέρμανση, σε ιστούς που δεν βρίσκονται κοντά στην επιδερμίδα, αλλά σε σημεία πιο δύσκολα προσβάσιμα. Έτσι προτάθηκαν τα μαγνητικά νανοσωματίδια, τα οποία μπορούν να ικανοποιήσουν συνδυαστικά κάποιες από αυτές τις απαιτήσεις. Μπορούν να κατευθυνθούν με την εφαρμογή εξωτερικών μαγνητικών πεδίων, το οποία δεν επηρεάζουν τους υγιείς ιστούς. Με κατάλληλη χημική τροποποίηση, μπορούν επίσης να αποκτήσουν την απαραίτητη επιλεκτικότητα για τους ιστούς στόχους και επίσης έχουν την ιδιότητα να συσσωματώνονται με συγκεκριμένους τύπους όγκων. Τέλος, έχουν χρησιμοποιηθεί, ως συστήματα στοχευμένης αποδέσμευσης φαρμάκων, με αποτέλεσμα το συνδυασμό της θεραπείας με υπερθερμία, με άλλες θεραπείες. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια που έχουν χρησιμοποιηθεί για αυτό το σκοπό, αποτελούνται σχεδόν αποκλειστικά από νανοκολλοειδή μαγνητίτη, και διάφορα σύμπλοκα αυτού, σε μορφή σπινελίου με κοβάλτιο νικέλιο ή άλλους υποκατάστατες. Έχουν εύρος μεγέθους από μερικά νανόμετρα, έως μερικές δεκάδες μικρόμετρων. Απαραίτητη είναι η βελτιστοποίηση αυτών των νανοσωματιδίων, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές υπερθερμίας, αν και ακόμα δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί προς πια κατεύθυνση μπορούν να επιτευχθούν τα βέλτιστα αποτελέσματα. Συμπερασματικά τα νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (ΜΝΣ), είτε μαγνητίτη είτε μαγκεμίτη, είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα σωματίδια στο τρέχον πεδίο της κλινικής υπερθερμίας, πέρα από τις ιδιότητες που τους προσδίδει το μικρό τους μέγεθος, η κολλοειδής τους φύση η κρυσταλλικότητα τους και ο παραμαγνητισμός που εμφανίζουν, για επιπλέον δύο λόγους: (α) την αποδεδειγμένη βιοσυμβατότητά τους και (β) την ευκολία της σύνθεσής τους. Τα ΜΝΣ θεωρούνται βιοσυμβατά και έχει αποδειχθεί ότι μεταβολίζονται από την αίμη οξυγενάση-1 προς σχηματισμό αιμοσφαιρίνης [91]. Επιπλέον χημικές τροποποιήσεις των ΜΝΣ, μπορούν να συμβάλλουν στη βελτίωση τις σταθερότητάς τους, σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές ενός οργανισμού, και να επεκτείνουν το χρόνο παραμονής τους στην κυκλοφορία του αίματος. Υπάρχουν πολλοί παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την αποδοτικότητα της επαγόμενης αύξησης της θερμοκρασίας των μαγνητικών νανοσωματιδίων και αφορούν τόσο στις φυσικές, όσο και στις μαγνητικές τους ιδιότητες, αλλά και τη μαγνήτιση και την συχνότητα του εφαρμοζόμενου πεδίου. Επιγραμματικά, οι παράγοντες αυτοί είναι : 50

51 (α) τα χαρακτηριστικά του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου (β) το μέγεθος και η συγκέντρωση των μαγνητικών νανοσωματιδίων (γ) η μαγνητική ανισοτροπία των μαγνητικών νανοσωματιδίων, και (δ) η συνεργική συμπεριφορά που μπορούν να εμφανίσουν τα μαγνητικά νανοσωματίδια, ως αποτέλεσμα των χαρακτηριστικών τους και της αλληλεπίδρασης υπό τις εφαρμοζόμενες συνθήκες Αποβολή ΜΝΣ από τον οργανισμό - φαρμακολογική προσέγγιση [59] Η πρόσληψη των ΜΝΣ εξαρτάται από το μέγεθος των νανοσωματιδίων που χορηγούνται. Τα μεγαλύτερα νανοσωματίδια, μεγέθους > 200 nm, εύκολα αποβάλλονται από τον σπλήνα, και συνεπώς αποβάλλονται από το σύστημα φαγοκυττάρωσης και μειώνεται η διάρκεια της κυκλοφορίας τους στο αίμα. Τα μικρά νανοσωματίδια με διάμετρο μικρότερη των 10 νανομέτρων, αποβάλλονται άμεσα μέσω αγγείων και νεφρών. Τα νανοσωματίδια με διάμετρο ανάμεσα στα 10 και τα 100 nm, είναι τα πιο κατάλληλα για ενέσιμη χορήγηση, αφού έχουν την πιο μεγάλη διάρκεια κυκλοφορίας στο αίμα. Είναι αρκετά μικρά ώστε να εισβάλλουν στο ενδοθηλιακό δίκτυο καθώς και στα τριχοειδή αγγεία των ιστών και γι αυτό εμφανίζουν την καλύτερη διασπορά στους ιστούς Χρήση in vitro / in vivo μοντέλων για μελέτες τοξικότητας Οι ζωντανοί οργανισμοί είναι εξαιρετικά πολύπλοκα λειτουργικά συστήματα που αποτελούνται από, τουλάχιστον, πολλές δεκάδες χιλιάδων γονιδίων, μορίων πρωτεΐνης, RNA μόρια, μικρές οργανικές ενώσεις, ανόργανα ιόντα και διάφορα σύμπλοκα, σε ένα περιβάλλον που οργανώνεται από μεμβράνες και στην περίπτωση των πολυκύτταρων οργανισμών, σε συστήματα οργάνων. Αυτή η πολυπλοκότητα της δομής τους, καθιστά αδύνατη τη μελέτη της λειτουργίας τους και της εξειδικευμένης απόκρισής τους σε διάφορους παράγοντες, καθώς και την κατανόηση των μηχανισμών επέκτασης διαφόρων σημάτων στο σύνολο τους. Έτσι, οι ανάγκες τις εξέλιξης της επιστήμης, επέταξαν την ανάπτυξη μεθόδων που επιτρέπουν την πιο στοχευμένη μελέτη της συμπεριφοράς ενός ζώντος οργανισμού. Οι μέθοδοι αυτές χωρίζονται σε in vitro και in vivo In vitro: κυτταρικές σειρές In vitro μελέτες είναι εκείνες που διεξάγονται χρησιμοποιώντας συστατικά ενός οργανισμού που έχουν απομονωθεί από το συνηθισμένο περιβάλλον τους, προκειμένου να καταστεί δυνατή μια πιο λεπτομερής πειραματική μελέτη, απ ότι θα ήταν δυνατόν να πραγματοποιηθεί στο σύνολο ενός οργανισμού. Τα in vitro πειράματα μπορούν να γίνουν σε (α) κύτταρα που προέρχονται από πολυκύτταρους οργανισμούς (κυτταρική καλλιέργεια ή καλλιέργεια ιστού), (β) υποκυτταρικά συστατικά (π.χ. μιτοχόνδρια ή ριβοσώματα), (γ) κυτταρικό ή υποκυτταρικό εκχυλισμάτων, ή (δ) μόρια που έχουν απομονωθεί σε δοκιμαστικό σωλήνα (συχνά πρωτεΐνες, DNA, ή RNA, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό). Στην παρούσα διατριβή, ως in vitro μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν η κυτταρική σειρά ανθρώπινων αθανατοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων του εγκεφάλου, hcmec/d3 [92] και η καρκινική κυτταρική σειρά μελανώματος Β16 [93]. 51

52 In vivo: Caenorhabditis Elegans [94,95] Αντίθετα in vivo μελέτες, είναι αυτές που διεξάγονται σε ζωντανούς οργανισμούς, στην κανονική τους κατάσταση. Το απλούστερο μοντέλο in vivo μελέτης που είναι διαθέσιμο αυτή τη στιγμή σε ερευνητικό επίπεδο, αποτελεί το Caenorhabditis Εlegans. Το Caenorhabditis elegans (C. elegans ) είναι ένα μικροσκοπικό σκουλήκι, που ζει στα πρώτα στρώματα του εδάφους σε εύκρατα κλίματα. Απομονώθηκε αρχικά στη Γαλλία (στέλεχος Bergerac), μετά στην Αγγλία (στέλεχος Bristol) και στη συνέχεια σε όλη τον κόσμο από τη Χαβάη στην Αυστραλία. Οι διαστάσεις του φθάνουν περίπου στο 1mm, όταν φτάσει στην φάση της ενηλικίωσης. Ανήκει στην οικογένεια των νηματωδών, η οποία περιλαμβάνει μια σειρά από τα χερσαία και θαλάσσια είδη, καθώς και διάφορα παράσιτα των ζώων και των φυτών. Κατά τα τελευταία σαράντα χρόνια, έχει γίνει μεγάλη πρόοδος στον τομέα της νευροβιολογίας, της αναπτυξιακής και εξελικτικής βιολογίας χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο. Έδωσε σημαντικές πληροφορίες για βασικούς βιολογικούς μηχανισμούς όπως για τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, για τη μετάδοση σημάτων μεταξύ κυττάρων, για την οργάνωση των γονιδίων, το μεταβολισμό, καθώς και τον καθορισμό του φύλου. Τα πλεονεκτήματα του C. Elegans, που το καθιστούν πολύ σημαντικό μοντέλο στη μελέτη της συμπεριφοράς και του νευρικού συστήματος, πέρα από τις ομοιότητες που παρουσιάζει με τους ανώτερους οργανισμούς, αφορούν στο μικρό κόστος της καλλιέργειάς τους σε εργαστηριακό επίπεδο, την ευκολία της φύλαξης τους, και της μεγάλης διάρκειας που δύναται να αποθηκευθεί. Παράλληλα, ο μικρός κύκλος ζωής, παρέχει τη δυνατότητα της γρήγορης αναπαραγωγής τους, καθώς και της σύντομης διάρκειας επανάληψης των πειραμάτων. Επιπλέον, είναι ο μόνος πολυκύτταρος οργανισμός που είναι σήμερα γνωστό πως ανθίσταται στην κατάψυξη: τα ζώα μπορούν να καταψυχθούν και να διατηρούνται σε υγρό άζωτο για χρόνια. Το πιο σημαντικό όμως πλεονέκτημα που παρουσιάζουν, είναι η διαφανής τους επιδερμίδα, που καθιστά δυνατή την παρατήρηση κάθε οργανιδίου ή κυττάρου τους στο μικροσκόπιο, σε συνδυασμό βέβαια με το μικρό τους μέγεθος. Τέλος πρέπει να σημειωθεί η απλότητα του γονιδιώματος. Οργανώνονται σε μόνο 6 χρωμοσώματα και το γεγονός πως είναι ερμαφρόδιτα και μπορούν να παράγουν ένα μεγάλο αριθμό απογόνων ταυτόσημων γενετικά, κάνουν τα C. elegans ιδιαίτερα χρήσιμα για μελέτες στη γενετική. Γενικά χαρακτηριστικά: Έχει κυλινδρικό σώμα, κύκλο ανάπτυξης λιγότερο από 3 μέρες και διάρκεια ζωής περίπου 2-3 εβδομάδες κάτω από κατάλληλες συνθήκες. Είναι ευκαρυωτικός πολυκύτταρος οργανισμός: έχει παραπλήσιες κυτταρικές και μοριακές δομές (οργανίδια, σύμπλεγμα DNA με χρωματίνη και οργανωμένο σε διακεκριμένα χρωμοσώματα κτλ) και μονοπάτια ελέγχου με ανώτερους οργανισμούς. Στη φύση, το C. Elegans τρέφεται από τους διαθέσιμους στο περιβάλλον του μικροοργανισμούς, ενώ στο εργαστήριο, καλλιεργείται σε τρυβλία με άγαρ, και τρέφονται με Escherichia coli. Υπάρχουν δύο διαφορετικές φύλα: τα ερμαφρόδιτα και τα αρσενικά. Διαφέρουν φαινοτυπικά στην διαφορετική μορφολογία της ουράς, αποτέλεσμα των διαφορών που παρουσιάζονται στην οργάνωση του αναπαραγωγικού συστήματος (Εικόνα 1.10). Τα ερμαφρόδιτα, που παράγουν τόσο σπέρμα, αλλά και ωοκύτταρα, μπορούν να αναπαραχθούν με αυτό-γονιμοποίηση, με αποτέλεσμα να προκύπτουν στελέχη πανομοιότυπα μεταξύ τους ("Κλώνοι"), ή μπορούν να ζευγαρώσουν με τα αρσενικά (διασταύρωση). 52

53 Εικόνα 1. 10: Σχηματική αναπαράσταση της ανατομίας του C. Elegans Η αυτογονιμοποίηση είναι η επικρατέστερη αναπαραγωγική πορεία, ενώ τα αρσενικά υπο-εκπροσωπούνται στον πληθυσμό (μόλις 0,1%). Σε δυσμενείς συνθήκες, όπως η αύξηση της θερμοκρασίας, ο υπερπληθυσμός, ή έλλειψη τροφής, προκύπτει αυθόρμητα αύξηση του ποσοστού των αρσενικών στον πληθυσμό. Αυτό διευκολύνει την διασταύρωση των φύλων και την αναπαραγωγή και επιτρέπει να αναμιγνύεται η γενετική πληροφορία και αυξάνεται η πιθανότητα αναπαραγωγής στελεχών που έχουν υποστεί μεταλλάξεις εξ αιτίας περιβαλλοντικών συνθηκών. Ο κύκλος ζωής: Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της χρήσης του C. elegans ως πειραματικό μοντέλο αφορά στη σύντομη διάρκεια του κύκλου ζωής του, λιγότερο από τρεις ημέρες παρουσία βέλτιστων συνθηκών σε διαθεσιμότητα τροφίμων και θερμοκρασίας ( 25 C). Πριν φτάσει σε στάδιο ενήλικα περνάει μέσω τεσσάρων σταδίων αναπτυξης, που παίρνουν το όνομά τους από το εξελικτικό στάδιο της προνύμφης, και χωρίζονται σε L1, L2, L3 και L4. Η διάρκεια κάθε σταδίου (και κατά συνέπεια, ολόκληρος ο κύκλος ζωής) ποικίλλει ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Σε γενικές γραμμές, τα C. elegans μπορούν να ζήσουν και να αναπαραχθούν σε περιβάλλοντα όπου η θερμοκρασία κυμαίνεται μεταξύ 12 C και 25 C. Θερμοκρασίες μεταξύ 26 C και 30 C είναι ανεκτές για σύντομες περιόδους, αλλά θα γίνονται αντιληπτές ως "καταστάσεις στρες" (που είναι μία από τις αιτίες της αύξησης της εμφάνισης των αρσενικών στον πληθυσμό). Στους 25 C, απαιτείται χρονικό διάστημα συνολικά 37 ωρών, μετά την εκκόλαψη αυγών, μέχρι το στέλεχος να αποκτήσει καθορισμένο φύλο (Εικόνα 1.11). Ως ενήλικο άτομο, είναι σε θέση να επιβιώσει για περίπου 20 ημέρες. Εικόνα 1. 11: Κύκλος ανάπτυξης του C. Elegans Μόνο το 10% των κυττάρων του C. Elegans γεννιέται κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, και υπόκειται σε περαιτέρω κυτταρικές διαιρέσεις κατά τη διάρκεια των τεσσάρων σταδίων ανάπτυξης. Όμως, στο στάδιο της εκκόλαψης των αυγών, έχει διαφοροποιηθεί η πλειονότητα των κυττάρων που απαρτίζουν τον οργανισμό και μόνο ένα 53

54 μικρό μέρος θα διαιρεθεί εκ νέου και θα αποτελέσει μέρος κάποιου ιστού, όπως η υποδερμίδα, το νευρικό σύστημα, οι μύες, και ιδιαίτερα οι γονάδες. Πηγαίνοντας από το L1 στάδιο ανάπτυξης στο L4, το ζώο αυξάνεται σταδιακά τους μέγεθος μέχρι χιλιοστού. Η κύρια διαφορά ανάμεσα στα διάφορα στάδια, εκτός από το μέγεθός του, αποτελεί ο σχηματισμός του αναπαραγωγικού συστήματος. Το πέρασμα από το ένα στάδιο ανάπτυξης στο επόμενο χαρακτηρίζεται από μια διαδικασία, κατά την οποία η παλιά επιδερμίδα δηλαδή η αδιάβροχη επικάλυψή του που το απομονώνει απόλυτα από το εξωτερικό περιβάλλον, αντικαθίσταται με μία νέα επικάλυψη, η οποία προσαρμόζεται σταδιακά στο νέο μέγεθος του οργανισμού. Το στάδιο ανάπτυξης dauer: Σε δυσμενείς καιρικές συνθήκες, όπως η έλλειψη τροφίμων, ο υπερπληθυσμός, η χαμηλή υγρασία ή η υψηλή θερμοκρασία, τα C. elegans μπορούν να εισέλθουν σε ένα εναλλακτικό στάδιο ανάπτυξης, το στάδιο dauer. Αυτό ισχύει μόνο για τα στελέχη που βρίσκονται στο στάδιο L2. Πρόκειται για ένα στάδιο ανάπτυξης στο εξελικτικό επίπεδο της προνύμφης, εξειδικευμένο για να τους δίνει μεγάλη αντοχή (ακόμα και για αρκετούς μήνες) σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες. Όταν ένα στέλεχος περάσει στο στάδιο dauer, σταματά τη σίτιση, κλείνει όλες τις διόδους επικοινωνίας με το περιβάλλον και επιβραδύνει το μεταβολισμό του και την ανάπτυξή του. Γενικά, είναι σχεδόν ακίνητο, σε «λήθαργο» και έχει την τάση να στέκεται στην ουρά και να κινεί το κεφάλι μπρος πίσω. Αυτή η συμπεριφορά θα μπορούσε να διευκολύνει σύζευξη με έντομα και τη διασπορά σε άλλα περιβάλλοντα. Όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες γίνουν ευνοϊκές και πάλι, το C. Elegans, είναι σε θέση να βγει από το στάδιο dauer αρκετά γρήγορα και στη συνέχεια εμπίπτει στο κανονικό κύκλο ανάπτυξης στο στάδιο L4. Ο χρόνος που δαπανάται στο στάδιο dauer δεν επηρεάζει τη διάρκεια ζωής του οργανισμού ως ενήλικο μέλος. Ανατομία: Ως μέλος της οικογένειας των νηματωδών, παρουσιάζει μια πολύ απλή οργάνωση. Μπορεί να περιγραφεί σαν δύο ομόκεντρους σωλήνες, τον έναν μες τον άλλον. Ο εξωτερικός σωλήνας αντιπροσωπεύεται από την επιδερμίδα, από τα κύτταρα και από τους υποδόριους μύες, ενώ το εσωτερικό από το έντερο. Σε αυτούς τους δύο σωλήνες προστίθεται ένας τρίτος, ο οποίος αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια της μετα-εμβρυϊκής περιόδου και αποτελεί το αναπαραγωγικό σύστημα. Το C. Elegans αποτελεί ένα οργανισμό με μία "ψεύτικη" εσωτερική κοιλότητα (pseudocoelom). Στην πραγματικότητα, το έντερο και οι μυες είναι κοντά μεταξύ τους (λόγω της ισχυρής εσωτερικής υδροστατικής πίεσης) οπότε το pseudocoelom, είναι απλά ένας εικονικός χώρος. Από τα τμήματα που το απαρτίζουν, πολύ σημαντικός είναι ο φάρυγγας. Είναι ένα πολύπλοκο όργανο, που βρίσκεται στην κεφαλή του ζώου, και αποτελείται από μυϊκά, επιθηλιακά και νευρικά κύτταρα. Λειτουργεί ως αντλία, που του επιτρέπει να προσλάβει την τροφή. Στην πραγματικότητα, είναι ένας οργανισμός που φιλτράρει τα βακτήρια που βρίσκονται προσκολλημένα στο έδαφος για να τραφεί. Μέσα από το φάρυγγα, καταφέρνει να αφυδατώσει, να συγκεντρώσει και να καταστρέψει τα βακτήρια, τα οποία στη συνέχεια περνούν στον εντερικό αυλό. Στο φάρυγγα, διακρίνονται δύο λοβοί, δηλαδή δύο κυκλικές πτυχωτές ζώνες. Ο δεύτερος λοβός του φάρυγγα, επίσης γνωστός ως μύλος, συσπόμενος ρυθμικά, μπορεί να θρυμματίσει τα βακτήρια, πριν προωθηθούν στο έντερο. Αυτή η διαδικασία, ευνοείται από το γεγονός ότι το σύνολο του αυλού του φάρυγγα, επικαλύπτεται από ένα στρώμα επιδερμίδας. 54

55 Σε κανονικές συνθήκες, είναι σε θέση να επικοινωνήσει με το δεύτερο λοβό του φάρυγγα περίπου 225 φορές ανά λεπτό Στόχος της μεταπτυχιακής διατριβής Στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής, ήταν η σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων, οξειδίων του σιδήρου, με υδροδυναμική διάμετρο στην περιοχή των 100 nm, που να παρουσιάζουν υψηλή κρυσταλλικότητα και να συνδυάζουν καλές μαγνητικές ιδιότητες με σταθερότητα σε περιβάλλον που προσωμοιάζει το αίμα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αλκαλικής καταβύθισης ενός μόνο συμπλόκου δισθενούς σιδήρου, παρουσία υδρόφιλου πολυμερούς και μελετήθηκαν παράμετροι που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τις ιδιότητες του τελικού προϊόντος. Στη συνέχεια, σημαντική κρίθηκε η αύξηση της σταθερότητάς και της βιοσυμβατότητάς τους, η οποία επιτεύχθηκε με την κατάλληλη τροποποίηση της επιφάνειάς τους, με σύζευξη μορίων πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Τέλος, έγιναν μελέτες της αποδοτικότητάς τους για χρήση σε διάφορες εφαρμογές, όπως η μαγνητική τομογραφία και η θεραπεία μέσω υπερθερμίας, και της τοξικότητας που παρουσιάζουν σε in vitro και in vivo μοντέλα. Αντικείμενο μελλοντικής μελέτης, μπορεί να αποτελέσει η σύζευξή τους με κάποιο προσδέτη στόχευσης, η φόρτωσή τους με κάποιο φαρμακομόριο, και η μελέτη της συνδυαστικής τους δράσης ως συστηματα theragnostics. 55

56 2.1. ΟΡΓΑΝΑ 2. Πειραματικό Μέρος Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας (Mettler AE 166, Deltarange) Μηχανικός αναδευτήρας θερμοελεγχόμενη πλάκα (Wisestir) Μαγνητάκια Φυγόκεντρος (Κendro Laboratory Products, Biofuge pico-heraeus rpm max) Φυγόκεντρος (Kendro Laboratory Products, Megafuge 1.0R- Heraeus rpm max) Υπερφυγόκεντρος (Τhermo Scientific WX Ultra 100 Centrifuge) Λουτρό Υπερήχων (Branson, Bransonic ultrasonic 2510) ph-μετρο (WTW, ph 522) Μηχανικός αναδευτήρας vortex (A-100 Micrel) Tεχνική της θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA) (Q500 της TA Instrument) Zeta-sizer δυναμικός σκεδασμός φωτός (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument, UK) Φασματοφωτόμετρο, Spectrophotometer UV-Vis (Shimadzu UV-mini 1240) Φασματόμετρο (Hitachi Digilab U-2800) Φθορισμόμετρο (Shimadzu, RF-5301 PC) Περίθλαση ακτίνων Χ (XRD) (Bruker D8 Advance) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης TEM (JEM-2100) Υδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας (JULABO, FS18) Επωαστικός θάλαμος (Thermo Forma, Series II, Water Jacketed, CO2 Incubator, Hepa Filter, model 3121) Laminar Flow Hood (Astec Microflow, BIOQUELL Medical Limited Lynx Crescent) Οπτικό μικροσκόπιο (ZEIS Axiovert 40 CFL) Autoclave Επιπλέον μικροσυσκευές που χρησιμοποιήθηκαν στην διαδικασία της σύνθεσης των μαγνητικών νανοφορέων είναι: μία τρίλαιμη σφαιρική φιάλη των 200 ml, ένας ψυκτήρας, ένα θερμόμετρο και μαγνήτες 0,5 tesla Μετρήσεις υπερθερμίας στο όργανο Magnetherm (Nanotherics, UK) Οι μαγνητικες μετρήσεις έγιναν στο Lakeshore 7300 Vibrating Sample Magnetometer (VSM) Οι μετρήσεις 1 H NMR spin-lattice T1 και Τ2 έγιναν σε μαγνήτη κυκλικής διάταξης Halbach, που έχει την ικανότητα να παίρνει μετρήσεις NMR χαμηλού πεδίου ΥΛΙΚΑ Τα υλικά που χρησιμοποίηθηκαν παρατίθενται παρακάτω Υλικά για παρασκευή ΜΝΣ και για τις μεθόδους χαρακτηρισμού που χρησιμοποιήθηκαν Επτά-ένυδρος θειϊκός σίδηρος (FeSO 4 x7h 2 O) (Chem Lab NV) Έξα-ένυδρος τριχλωριούχος (FeCl 3 x6h 2 O) σίδηρος (Sigma-Aldrich) Υδροχλωρικό οξύ (HCl) 37% ( Carlo Erba ) Απιονισμένο νερό αγωγιμότητας 1μS / cm. 56

57 ω-άμινο μεθόξυ πολυαιθυλενογλυκόλη, σε σκόνη, μέσης μοριακής μάζας 2000 (Creative PEGworks) N- ύδροξυ-σούλφο-ηλεκτριμίδιο(ή σουκινιμίδιο) άλας νατρίου,98% καθαρότητα (HPLC) (Sigma- Aldrich ) N- (3-διμέθυλ άμινο πρόπυλ)-ν -αίθυλ καρβοδιιμίδιο υδροχλωρικό Χλωριούχο νάτριο (NaCl) από την Merck Chemicals Υλικά για τις κυτταρικές σειρές hcmec/d3 και B16 Ισότονο Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS: Σε 1L περιέχονται: NaH 2 PO4 (δισόξινο φωσφορικό νάτριο) 1,44gr; KH 2 PO4 (δισόξινο φωσφορικό κάλιο) 0,24gr; NaCl (χλωριούχο νάτριο) 8gr; KCl (χλωριούχο κάλλιο) 0,2gr. Το ph ρυθμίστηκε στο 7.4 Κολλαγόνο τύπου Ι, (100μg/ml) Τρυψίνη/EDTA (Sigma) MTT (3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma) Πλήρες θρεπτικό μέσο για hcmec/d3 [93] Πλήρες θρεπτικό μέσο για την καρκινική σειρά Β16 [94] Υλικά για την καλλιέργεια και τη μελέτη του C. Elegans Τρυβλία Πετρί Χλωριούχο νάτριο (NaCl) Άγαρ (bacto-agar) Πεπτόνη (bacto peptone) Χλωριούχο ασβέστιο ( CaCl 2 ) Ουρακίλη 1Μ (11g/100ml) Χοληστερόλη ( 5mg/ml σε απόλυτη αιθανόλη) Θειϊκό μαγνήσιο 1Μ (MgSO 4 24,65 g/100ml) Δισόξινο φωσφορικό κάλιο 1Μ (KH 2 PO 4 136g /L) Ρυθμιστικό διάλυμα Μ9 : Σε 1L περιέχονται: NaH 2 PO4 (δισόξινο φωσφορικό νάτριο) 6gr; KH 2 PO4 (δισόξινο φωσφορικό κάλλιο) 6gr; NaCl (χλωριούχο νάτριο) 5gr; MgSO 4 1Μ (Θειϊκό μαγνήσιο) 1ml. Επιφανειοδραστικό TWEEN 20 Θρεπτικό μέσο για τα βακτήρια E.Coli OP50, Lysogeny Broth 2.3. Μέθοδοι Στην παρούσα διατριβή παρασκευάσθηκαν και χαρακτηρίστηκαν ΜΝΣ καθώς και σταθεροποιημένα ΜΝΣ. Στη συνέχεια μελετήθηκε η τοξικότητα που παρουσιάζουν σε in vivo και in vitro μοντέλα. Όλες οι μέθοδοι που χρησιμοποίηθηκαν περιγράφονται αναλυτικά στη συνέχεια: 57

58 Σύνθεση ΜΝΣ Η σύνθεση των διαφόρων ΜΝΣ, έγινε σε δύο στάδια. Αρχικά παρασκευάσθηκαν μαγνητικοί νανοκρυσταλλίτες και στη συνέχεια παρασκευάσθηκε το σταθεροποιημένο προϊον Σύνθεση μαγνητικού υβριδικού κολλοειδούς (Υδρολυτική αλκαλική καταβύθιση μίας πρόδρομης ένωσης σιδήρου) [30] Η μέθοδος που ακολουθήθηκε για τον σχηματισμό των μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών, ήταν η υδρολυτική αλκαλική καταβύθιση μιας πρόδρομης ένωσης σιδήρου [ 96 ] παρουσία του πολυμερούς πολυ(ακρυλικό οξύ-co-μηλεϊνικό οξύ) σε διαλύμα (PAA-co-MA) [50 wt. % σε H2O], ως επιφανειακού τροποποιητή. Το PAA-co-MA είναι ένας ασθενής πολυηλεκτρολύτης με βαθμό διάστασης εξαρτώμενο από το ph. Ο βαθμός διάστασης των καρβοξυλικών ομάδων του, δίνεται από τη σχέση α = [ COO ]/([ COO ] +[ COOH]) (εξίσωση 2.1) ενώ η χημική του δομή δίνεται στην Εικόνα 2.1 Εικόνα 2. 1: Χημική δομή PAA-co-MA Κάθε επαναλαμβανόμενη δομική μονάδα του, περιέχει τρεις καρβοξυλομάδες, δύο εκ των οποίων ανήκουν στο μηλεϊνικό οξύ και είναι ικανές να συμπλεχθούν. Παρασκευάζεται υδατικό διάλυμα άλατος σιδήρου σε όξινες συνθήκες (πυκνό HCl (37%)), υπό μαγνητική ανάδευση. Στη συνέχεια, υδατικό διάλυμα PAA-co-MA αναδεύεται σε κατάλληλη διάταξη, που αποτελείται απο (ι) έναν μηχανικό αναδευτήρα που προσαρμόζεται στη μεγάλη εσμυρισμένη υποδοχή μιας τρίλαμης σφαιρικής φιάλης που περιέχει το μίγμα και περιστρέφεται, (ιι) μια θερμαντική πλάκα με αισθητήρα, πάνω στην οποία τοποθετείται ελαιόλουτρο του οποίου ελέγχεται η θερμοκρασία και (ιιι) στις δύο άλλες εσμυρισμένες υποδοχές της τρίλαιμης σφαιρικής φιάλης τοποθετούνται ένα θερμόμετρο (ώστε να ελέγχεται η θερμοκρασία του διαλύματος στο εσωτερικό της φιάλης) και ένας ψυκτήρας (Εικόνα 2.2/2.3) Αφού το διάλυμα του πολυμερούς PAA-co-MA φτάσει στη θερμοκρασια των 40 0 C, προστίθεται το διάλυμα του άλατος του σιδήρου, υπό θέρμανση και ανάδευση, και στη συνέχεια προστίθεται η ποσότητα της βάσης. Η θερμοκρασία αυξάνεται σταδιακά μέχρι τους C και παραμενει σταθερή καθ όλη την διάρκεια της αντίδρασης. Στη συνέχεια η φιάλη αφήνεται να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου, και στο σημείο αυτό παρατηρείται η μαγνητική απόκριση των ρευστών με μόνιμους μαγνήτες χειρός Nd-Fe-B. Στη συνέχεια το κολλοειδές, καθαρίζεται μέσω διαδοχικών φυγοκεντρήσεων (13000 rpm, Heraeus, Biofuge pico) και το ίζημα συλλέγεται και επαναδιασπείρεται σε H 2 O. Ακολούθεί ανάδευση και υποβολή του προϊόντος σε λουτρό υπερήχων, με σκοπό να μειωθούν τα συσσωματώματα που δημιουργήθηκαν κατά τη φυγοκέντρηση. Η διαδικασία 58

59 της έκπλυσης επαναλαμβάνεται όσες φορές χρειαστεί, για την καλύτερη απομάκρυνση των παραπροϊόντων. Το κολλοειδές αποθηκεύεται στο ψυγείο (στους 5 ο C). Mηχανικός αναδευτήρας FeSO 4 / FeCl 2 NH 4 / NaOH 55 ο C, 100 λεπτά Κλασμάτωση κολλοειδούς Φυγοκέντρηση στα rpm Επαναδιασπορά ιζήματος και ανάδευση/υπερήχηση Φυγοκέντρηση στα 4.000rpm Έκπλυση κολλοειδ Συλλογή υπερκείμενου υπερκείμενου MagPAA-co-MA Εικόνα 2. 2 Σχηματική απεικόνιση της συνθετικής πορείας των νανοκολλοειδών Εικόνα 2. 3 Διάταξη για τη σύνθεση του προϊόντος ΜΝΣ που αποτελείται από τρίλαιμη σφαιρική φιάλη, θερμόμετρο, ψυκτήρα, μηχανικό ανδευτήρα θερμαντική πλάκα και ελεόλουτρο. Το προϊόν στους 60 0 C μετά την προσθήκη της βάσης, παίρνει το χαρακτηριστικό σκούρο καφέ χρώμα. 59

60 Στο δείγμα μετράται η συγκέντρωση σιδήρου με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο. Στη συνέχεια προσδιορίζεται το μέγεθος του μαγνητικού πυρήνα. Για το σκοπό αυτό, μια ποσότητα του κολλοειδούς ξηραίνεται στην επιφάνεια επίπεδου υάλινου πλακιδίου σε φούρνο στους 80 ο C και στη συνέχεια συλλέγεται και λειοτριβείται σε σκόνη για μετρήσεις περίθλασης ακτίνων-x (XRD). Επίσης, προετοιμάζονται δείγματα, σε κατάλληλες αραιώσεις για τη μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου, του ζ δυναμικόυ και για τη μέτρηση της μαγνητοφόρησης. Τελος, μια άλλη ποσότητα δείγματος ξηραίνεται στην επιφάνεια επίπεδου υάλινου πλακιδίου σε φούρνο στους 80 ο C και στη συνέχεια συλλέγεται και λειοτριβείται σε σκόνη, με σκοπό να γίνει η θερμοσταθμική ανάλυση (TGA) του δείγματος και να υπολογισθεί το οργανικό περιεχόμενό του σε πολυμερές. Μεταβάλλοντας διάφορετικές παράμέτρους κατά την διάρκεια της σύνθεσης, παρασκευάσθηκαν διαφορετικά κολλοειδή, με σκοπό να διαπιστωθεί η επίδρασή τους στις στα δομικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των υβριδικών κολλοειδών. Οι συνθέσεις πραγματοποιήθηκαν παραπάνω από μία φορά για να ελεγθεί η επαναληψιμότητα του τελικού προϊόντος. Οι παράμετροι που ελέχθησαν ήταν: (i) Το διαφορετικό άλας του πρόδρομου σιδήρου. Χρησιμοποιήθηκαν, ο επτάένυδρος θειϊκός σίδηρος (FeSO 4 x7h 2 O) και ο έξα-ένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος (Fe 2 Cl 3 x6h 2 O), κρατώντας σταθερή τη μάζα σιδήρου. (ii) Η διαδοχή της προσθήκης των αντιδραστηρίων, (iii) Το είδος της ανάδευσης, (μαγνητική /μηχανική), (iv) Η μέγιστη θερμοκρασία στην οποία παρέμενε η αντίδραση, (v) Ο χρόνος παραμονής υπο θέρμανση και ανάδευση, (vi) Η ένταση της ανάδευσης, (vii) Η χρησιμοποιούμενη βάση καθώς και ο συνολικός της όγκος, (viii) Ο καθαρισμός του προϊόντος με φυγοκέντρηση αλλά και με τη χρήση ημεδιαπερατών μεμβρανών (dialysis) (ο καθαρισμός επιβεβαιώθηκε με μέτρηση αγωγιμότητας στο υπερκείμενο, ~0). Η εκτενής μελέτη των παραμέτρων της συνθετικής πορείας κολλοειδών νανοφορέων οξειδίων του σιδήρου με πολυμερική επικάλυψη, Εικόνα 2.4, κατέληξε στην παραγωγή τριών προϊόντων με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Ετσι αναφερόμαστε: (1) Στο προϊον Mag PAA-co-MA FeSO 4 4NH 3 το οποίο παρασκευάζεται από επτάένυδρο θειϊκο σίδηρο (Fe 2 SO 4 x7h 2 O) και PAA-co-MA, σε αλκαλικό περιβάλλαον με προσθήκη 4ml ΝΗ 3 30%, σε μέγιστη θερμοκρασία 70 0 C και συνολική διάρκεια αντίδρασης 3 ώρες και 40 λεπτά. (2) Το δεύτερο προς μελέτη προϊον Mag PAA-co-MA FeSO 4 10NaOH το οποίο παρασκευάζεται από επτά-ένυδρο θειϊκο σίδηρο (FeSO 4 x7h 2 O) με PAA-co-MA, σε αλκαλικό περιβάλλον με προσθήκη 10ml ΝαΟΗ 1Μ, σε μέγιστη θερμοκρασία 50 0 C και συνολική διάρκεια αντίδρασης 1 ώρα και 40 λεπτά. (3) Τέλος παρασκευάσθηκε το προϊον Mag PAA-co-MA FeCl 2 15NaOH το οποίο παρασκευάζεται από έξα-ένυδρο τριχλωριούχο σίδηρο (Fe 2 Cl 3 x6h 2 O) με PAA-co- MA, σε αλκαλικό περιβάλον με προσθήκη 15ml ΝαΟΗ 1Μ, σε μέγιστη θερμοκρασία 60 0 C και συνολική διάρκεια αντίδρασης 1 ώρα και 40 λεπτά. 60

61 Η διακασία του καθαρισμού για όλα τα προϊόντα, έγινε με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις με ενδιάμεση επαναδιασπορά/ υπερήχηση. Οι κωδικές ονομασίες των προϊόντων που θα χρησιμοποιηθούν και στην ανάλυση των αποτελεσμάτων και των συμπερασμάτων, αναγράφονται σχηματικά στον πίνακα 2.1 Εικόνα 2. 4: Απεικόνιση του νανοσυμπλέγματος σιδήρου με το πολυμερές PAA-co-MA Πίνακας 2. 1: Τρία προϊόντα σύνθεσης που χρησιμοποιήθηκαν για περεταίρω μελέτη. Ονομασία σύνθεσης με βάση τη σύσταση Mag PAA-co-MA FeSO 4 4NH3 Κωδική ονομασία σύνθεσης ΜΝΣ1 Mag PAA-co-MA FeSO 4 10NaOH ΜΝΣ2 Mag PAA-co-MA FeCl 2 15NaOH ΜΝΣ Πρόσδεση ω-άμινο μεθόξυ πολυαιθυλενογλυκόλη (mpeg-nh 2 ) [97,98] Το δεύτερο στάδιο της σύνθεσης περιλαμβάνει τη σύζευξη των ελεύθερων καρβοξυλομάδων του PAA-co-MA με την αμινομάδα της mpeg-nh 2 με τη δημιουργία αμιδικού δεσμού. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια σύζευξης N- (3- διμέθυλ άμινο πρόπυλ)-ν -αίθυλοκαρβοδιιμίδιο (EDC) και N- ύδροξυ σούλφο ηλεκτριμίδιο (S-NHS), τα οποία μπορούν να συμμετέχουν στη δημιουργία σταθερού αμιδικού δεσμού μεταξύ στερεοχημικά διαθέσιμων καρβοξυλομάδων και αμινομάδων, μέσω του μηχανισμού που περιγράφεται στην Εικόνα

62 Εικόνα 2. 5: Μηχανισμός σχηματισμού αμιδικού δεσμού μέσω αντιδραστηρίων σύζευξης EDC/ S- NHS [99] Η πορεία τροποποίησης της επιφάνειας των νανοφορέων που παρασκευάσθηκαν στο προηγούμενο στάδιο, γίνεται ως εξής: Ποσότητα μαγνητικού κολλοειδούς τοποθετείται σε υάλινο δοκιμαστικό σωλήνα και αναδεύεται με λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά, και στη συνέχεια προστίθεται σε αυτό ποσότητα στερεής mpeg-nh 2. Η ποσότητα mpeg-nh 2 υπολογίζεται θεωρητικά ώστε να αντιστοιχεί στο 8% των καρβοξυλομάδων που περίεχει το πολυμερές. Η μάζα του πολυμερούς PAA-co-MA υπολογίζεται με βάση τη μάζα του σιδήρου και το πολυμερικό περιεχόμενό του, όπως αυτό προκύπτει από τη θερμοσταθμική ανάλυση. Γνωρίζοντας επιπλέον, οτι κάθε μακρομόριο του πολυμερούς PAA-co-MA περιέχει κατά προσέγγιση 57 καρβοξυλομάδες, υπολογίζονται τα μόρια των καρβοξυλομάδων του πολυμερούς τα οποία μπορούν να αντιδράσουν προς δημιουργία αμιδικού δεσμού (με την αμινομάδα της mpeg-nh 2 ) Πρακτικά, λόγω της στερεοδιάταξης της πολυμερικής κορώνας, μεγάλο μέρος των καρβοξυλομάδων θα είναι στερεοχημικά παρεμποδισμένες στο εσωτερικό μέρος της πολυμερικής κορώνας. Έπειτα από καλή ανακίνηση, προστίθενται στάγδην τα αντιδραστήρια σύζευξης σε στοιχειομετρική αναλογία 1:1:0.1 COOH/EDC/S-NHS, όπου COOH αναφέρονται οι ελεύθερες καβοξυλομάδες του PAA-co-MA. Αφού προστεθεί όλη η ποσότητα των αντιδραστηρίων σύζευξης, το δείγμα αφήνεται για 15 λεπτά σε ηρεμία και στη συνέχεια μεταφέρεται σε ειδικό δοχείο και αφήνεται σε ήπια ανακίνηση, μέχρι να ολοκληρωθεί η αντίδραση. Ο καθαρισμός του προϊόντος γίνεται με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις (13.000rpm για 40 λεπτά). Το άχρωμο υπερκείμενο, απορρίπτεται ενώ το ίζημα επναδιασπείρεται σε νερό. Το πρωτόκολλο που περιγράφτηκε, οριστικοποιήθηκε ύστερα από τον έλεγχο μιας σειράς παραμέτρων (σειρά προσθήκης αντιδραστηρίων, στοιχειομετρική αναλογία COOH/EDC/S-NHS, ποσότητα της mpeg-nh 2 που προστίθεται συναρτήσει της ποσότητας που αντιδρά, το ph του διαλύματος των αντιδραστηρίων EDC/S-NHS, καθώς και η επίδραση της αντικατάστασης του υδατικού μέσου στον οποίο διαλύονται τα αντιδραστήρια με διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα, των οποίων η επίδραση μελετήθηκε όσον αφορά στη σταθερότητα του προϊόντος, στο μέγεθός του, καθώς και στην απόδοση της αντίδρασης. Τέλος ο καθαρισμός της περίσσειας των αντιδραστηρίων και των παραπροϊόντων, έγινε με απομάκρυνση του μαγνητικού κολλοειδούς από μίγμα της αντίδρασης με μόνιμους μαγνήτες 62

63 χειρός Nd-Fe-B για 48 ώρες (ο καθαρισμός επιβεβαιώθηκε με μέτρηση αγωγιμότητας στο υπερκείμενο), καθώς και με φυγοκέντρηση και υπερφυγοκέντρηση. Στο δείγμα, μετράται η συγκέντρωση σιδήρου με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο όπως και στο προηγούμενο στάδιο, ώστε να υπολογιστεί η απώλεια ποσότητας μαγνητικού υλικού κατά τους καθαρισμούς. Προετοιμάζεται επίσης δείγμα, για τη μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του ζ- δυναμικού. Τέλος, μια ποσότητα του κολλοειδούς ξηραίνεται στην επιφάνεια επίπεδου υάλινου πλακιδίου, σε φούρνο στους 80 0 C και στη συνέχεια, συλλέγεται και λειοτριβείται σε σκόνη με σκοπό τη θερμοσταθμική ανάλυση (TGA) και τον υπολογισμό του περιεχόμενου σε πολυμερές και σύγκριση με τα προηγούμενα αποτελέσματα. Ακολουθεί μελέτη του προϊόντος με φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR), ώστε να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη αμιδικού δεσμού Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός Ο προσδιορισμός των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των ΜΝΣ είναι απαραίτητος ώστε να η επιτυχία της συνθετικής πορείας. Αφορά στον προσδιορισμό της σύστασης των ΜΝΣ σε σίδηρο, αλλά και επιπλέον των σταθεροποιημένων ΜΝΣ σε mpeg-nh 2. Σημαντικές επίσης, είναι οι πληροφορίες της περιεκτικότητας των ΜΝΣ σε οργανικό και ανόργανο μέρος, το μέγεθος του μαγνητικού πυρήνα καθώς και το σχήμα και η οργάνωση τους Προσδιορισμός συγκέντρωσης σιδήρου [100] Η περιεκτικότητα του μαγνητικού κολλοειδούς σε Fe +2 προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά με δύο μεθόδους. (i) Η πρώτη μέθοδος προσδιορισμού αναπτύχθηκε μέσω της σύμπλεξής των ΜΝΣ με την 1,10 φαινανθρολίνη (το φασματοφωτόμετρο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Hitachi Digilab U-2800). 100 μl από το κολλοειδές αναμίχθηκαν με 200 μl πυκνού υδροχλωρίου (HCl 37%) με σκοπό να διαλυθούν πλήρως τα μαγνητικά νανοσωματίδια σε ιόντα σιδήρου. Ύστερα από 20 λεπτά, το δείγμα έγινε κίτρινο και αραιώθηκε σε νερό, με την χρήση ογκομετρικής φιάλης. Σε 1 ml αυτού του διαλύματος προστέθηκαν 100 μl υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης (NH 2 OH HCl) (100 g / L), για αναγωγή του σιδήρου, και στη συνέχεια 1 ml 1,10-φαινανθρολίνης (1g / L) και 1 ml CH 3 COONa (1.2 M) προστέθηκαν στο διάλυμα, το οποίο αραιώθηκε με νερό σε τελικό όγκο 10 ml, και μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 510 nm. Η αντίδραση που γίνεται είναι η εξής: 2 Fe NH 2 OH HCl + 2 OH - 2 Fe 2+ + N H2O + H + + Cl - (αντίδραση 2.1) Η συγκέντρωση σιδήρου υπολογίστηκε μέσω πρότυπης καμπύλης (Διάγραμμα 2.1) που είχε κατασκευαστεί προηγουμένως από άνυδρο FeCl 2. Με βάση το Fe +2, η συγκέντρωση των διαλυμάτων αναφέρεται ως wt % σε Fe 2 O 3. 63

64 Απορρόφηση στα 510nm 0,8 Πρότυπη καμπύλη συγέντρωσης σιδήρου με τη μέθοδο φαινανθρολίνης 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,1949x + 0,0009 R² = 0,9999 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 ppm σιδήρου Διάγραμμα 2. 1: Πρότυπη καμπύλη για τον προσδιορισμό συγκέντρωσης σιδήρου μέσω φαιναφθρολίνης και οξικού οξέος (ii) Για τη δεύτερη μέθοδο: σε 100μl διαλύματος σιδήρου προστίθενται 200μl πυκνού διαλύματος HCl (με θέρμανση στους 80 0 C). Αφού επανέλθουν σε θερμοκρασία δωματίου προστίθενται Η 2 Ο 2 και διάλυμα θειοκυανιούχου καλίου (KSCN) 1% w/v και μετριέται η οπτική πυκνότητα στα 480 nm ( UV-Vis mini 1240 Shimadzu). Στον Πίνακα 2.2 παρατίθενται οι τιμές απορρόφησης των πρότυπων διαλυμάτων σιδήρου και στο Διάγραμμα 2.2 μια τυπική πρότυπη καμπύλη. Πίνακας 2. 2: Πρότυπα διαλύματα για Παρασκευή πρότυπης καμπύλης για τον προσδιορισμό συγκέντρωσης πρωτεΐνης Συγκέντρωση σιδήρου (ppm) Απορρόφηση 1 Aπορρόφηση 2 Aπορρόφηση 3 Μέση τιμή (average) τυπική απόκλιση (sd) 200 0,2784 0,2617 0,2691 0,2697 0, ,139 0,1516 0,1283 0,1396 0, ,0677 0,0681 0,0679 0,0679 0, ,0345 0,0297 0,0305 0,0316 0, ,0156 0,0127 0,0181 0,0155 0,

65 Απορρόφηση στα 480nm 0,3 Πρότυπη καμπύλη συγέντρωσης σιδήρου με τη μέθοδο θειοκυανιούχου καλίου 0,2 0,1 0,0 y = 0,0013x + 0,0033 R² = 0, ppm σιδήρου Διάγραμμα 2. 2: Πρότυπη καμπύλη για τον προσδιορισμό συγκέντρωσης σιδήρου μέσω συμπλοκοποίησης με θειο- κυανιούχο ανιον Προσδιορισμός συγκέντρωσης mpeg-nh 2 [101] Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης mpeg-nh 2 παρασκευάστηκαν αρχικά: ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (0.13M, ph=7.4), ένα διάλυμα I 2 (10g/L)/KI (20g/L) και ένα διάλυμα mpeg-nh 2 (100ppm). Στη συνέχεια, σε ειδικά καλυμμένους δοκιμαστικούς σωλήνες, που περιήχαν συγκεκριμένη ποσότητα ΜΝΣ, ώστε να συνυπολογιστεί τυχόν παρεμπόδιση του σιδήρου στη μέτρηση, προστίθεται πυκνό HCl και τοποθετούνται στους 80 C για 30 λεπτά. Μετά από 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου προστίθενται οι αντίστοιχες ποσότητες του προπαρασκευασθέντος διαλύματος mpeg-nh 2 (100ppm) και ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών μέχρι τελικού όγκου 1ml, ώστε να προκύψουν πρότυπα διαλύματα συγκεντρώσεων mpeg-nh 2 2, 4, 6, 8, 10 ppm. Τέλος, προστίθενται 25 μl διαλύματος I 2 (10g/L) / KI (20g/L). Ακολουθεί ελαφριά ανακίνηση και αφήνονται σε ηρεμία 10 λεπτά για την ανάπτυξη του χρώματος. Μετράται η οπτική πυκνότητα των πρότυπων διαλυμάτων στα 535nm. Ως φάσμα υποβάθρου χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, ενώ παρασκευάστηκε και διάλυμα ελέγχου που δεν περιείχε mpeg- NH 2. Η μέση τιμή απορρόφησης για τριάδες δειγμάτων, και η πρότυπη καμπύλη αναφοράς που προκύπτει από τις διορθωμένες τιμές απορρόφησης συνοψίζονται στον Πίνακα 2.3 και στο Διάγραμμα 2.3 που ακλουθούν. Πίνακας 2. 3: Πρότυπα διαλύματα για Παρασκευή πρότυπης καμπύλης για τον προσδιορισμό συγκέντρωσης mpeg-nh 2 Συγκέντρωση mpeg-nh 2 (ppm) Μέση τιμή μετρήσεων απορρόφησης Απορρόφηση δείγματος ελέγχου Τυπική απόκλιση

66 Απορρόφηση στα 535nm 0,5 Πρότυπη καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό της mpeg-nh 2 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0322x + 0,0821 R² = 0, ppm PEG Διάγραμμα 2. 3: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς για τη συγκέντρωση της mpeg-nh 2 σε δείγμα νανοφορέων Θερμοσταθμική ανάλυση (TGA) Οι μετρήσεις θερμοσταθμικής ανάλυσης (Thermo Gravimetric Analysis, TGA) πραγματοποιήθηκαν με την χρήση του οργάνου Q500 της TA Instruments. H θερμοκρασία αυξανόταν με ταχύτητα 10 ο C/min από τους 20 ο C μέχρι τους 110 ο C όπου και παρέμενε σταθερή για 60 λεπτά για την απομάκρυνση της υγρασίας. Στη συνέχεια αυξανόταν πάλι με ταχύτητα 10 ο C/min μέχρι τους 700 ο C όπου και παρέμενε σταθερή για 5 λεπτά. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν υπό ροή αζώτου (Ν 2 flow). Πρώτα μελετήθηκε το πολυμερές PAA-co- MA με σκοπό να προσδιοριστεί η υπολειμματική του μάζα. Έχοντας αυτό ως δεδομένο, προσδιορίστηκε τελικώς το ποσοστό του πολυμερούς που είχε συνδεθεί στην επιφάνεια των νανοφορέων Μελέτη μεγέθους μαγνητικού πυρήνα Περίθλαση ακτίνων Χ (XRD) Η ανάλυση μέσω περίθλασης ακτίνων-χ (X-Ray defragment, XRD) πραγματοποιήθηκε σε ένα περιθλασίμετρο Bruker D8 Advance με φίλτρο νικελίου (Ni) και ακτινοβολία CuKa (1,54 Å). Ως δειγματοφορέας χρησιμοποιήθηκε πλακίδιο πυριτίου. Τα δείγματα αφού ξηράνθηκαν σε γυάλινη επιφάνεια, συλλέχθηκαν και λειοτριβήθηκαν, με σκοπό να έχουμε όσο το δυνατόν μικρότερα σωματίδια με τυχαίο προσανατολισμό των κρυσταλλογραφικών τους επιπέδων. Στη συνέχεια η σκόνη τοποθετήθηκε σε βάση πυριτίου (ο δειγματοφορέας που χρησιμοποιήθηκε ήταν κατάλληλος για δείγματα μικρού όγκου), απλώθηκε ομοιόμορφα με χρήση αιθανόλης και τοποθετήθηκε εντός του περιθλασιμέτρου για ανάλυση Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (TEM) Τα μικρογραφήματα ΤΕΜ (Transmission electron microscopy) ελήφθησαν με την χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης της εταιρίας JEOL, μοντέλο JEM-2100, χρησιμοποιώντας δυναμικό επιτάχυνσης 200 kv. Τα δείγματα για ΤΕΜ, προετοιμάστηκαν ρίχνοντας μία σταγόνα αραιωμένου κολλοειδούς (0,01% w/v σε Fe 2 O 3 ) των νανοφορέων σε δειγματοφορείς χαλκού, καλυμμένων με υμένιο άνθρακα (formvar). 66

67 Μελέτη σταθερότητας Πέρα από τον χαρακτηρισμό της σύστασης των ΜΝΣ, σημαντικό είναι να παρουσιάζουν σταθερότητα σε διάφορες συνθήκες. Μέτρο της σταθερότητας αυτής μπορεί να αποτελέσει η υδροδυναμική διάμετρος του νανοκρυσταλλίτη καθώς και η τιμή του ζ- δυναμικού μπορεί να μας δώσει χρήσιμες πληροφορίες για την κατανομή του φορτίου στην επιφάνειά του. Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS): Η υδροδυναμική διάμετρος των σωματιδίων μετρήθηκε σε σύστημα της εταιρίας Malvern (Nano Zeta Sizer) εφοδιασμένο με λέιζερ He-Ne 4mW μήκους κύματος λ=633 nm. Χρησιμοποιεί μία φωτοδίοδο ως ανιχνευτή και η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετριέται σε γωνία Οι μετρήσεις DLS πραγματοποιήθηκαν σε αραιωμένα διαλύματα των νανοφορέων (~0,08% w/v σε Fe 2 O 3 ), όπου το ph και η συγκέντρωση σε NaCl είχαν προρυθμιστεί στις επιθυμητές τιμές. Τα δείγματα μετρήθηκαν μετά από 24 h, ώστε να έρθουν σε ισορροπία. Οι αναφερόμενες υδροδυναμικές διάμετροι είναι ο μέσος όρος τεσσάρων μετρήσεων, κάθε μία από τις οποίες είναι το αποτέλεσμα 12 διαγραμμάτων αυτοσυσχέτισης και προσαρμογών. ζ-δυναμικό και ηλεκτροκινητικές μετρήσεις (ζ-potential, ζ): Οι ηλεκτροκινητικές μετρήσεις για τον προσδιορισμό της κινητικότητας και των τιμών ζ των κολλοειδών, πραγματοποιήθηκαν με το ίδιο όργανο με χρήση της LDV (Laser Doppler Velocimetry) και με την προσέγγιση κατά Smoluchowski. Οι αναφερόμενες τιμές ζ είναι το άθροισμα 50 μετρήσεων Μελέτη μαγνητικών ιδιοτήτων Οι μαγνητικές ιδιότητες είναι αυτές που καθορίζουν τη σπουδαιότητα των ΜΝΣ στις διάφορες εφαρμογές. Ανάλογα με τον κάθε τομέα στον οποίο μπορούν να βρουν εφαρμογή, υπάρχουν και διαφορετικές τεχνικές προσδιορισμού της καταλληλότητας των ΜΝΣ για χρήση Μαγνητοφόρηση Οι μετρήσεις μαγνητοφόρησης πραγματοποιήθηκαν με την χρήση του φασματοφωτομέτρου Hitachi Digilab U-2800 και με την εφαρμογή ενός μαγνήτη χειρός Nd- Fe-B (διαστάσεις: διάμετρος = 20 mm, πάχος = 10 mm) δίπλα στην κυψελίδα που περιείχε το προς μέτρηση δείγμα. Τα κολλοειδή μετρήθηκαν σε συγκέντρωση (0,0125 % w/v) σε Fe 2 O 3. Το μήκος κύματος ρυθμίστηκε στα 450 nm και η απορρόφηση καταγράφηκε για ~4h, παίρνοντας μετρήσεις κάθε 100 sec Μαγνητομετρία δονούμενου δείγματος (VSM) Οι μετρήσεις έγιναν με μαγνητόμετρο ταλαντωμένου δείγματος Model 7312 του οίκου Lake Shore Cryotronics, Inc. Το μαγνητόμετρο αυτό έχει τη δυνατότητα να μετρήσει σε θερμοκρασίες μέχρι και 700 ο C. H διάταξη παράγει μαγνητική ροπή με τα εξής χαρακτηριστικά: Δυναμική περιοχή: 5x10-6 emu έως 103 emu Σταθερές χρόνου: 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0 sec 67

68 Σταθερότητα εξόδου: Καλύτερη από ±0.05% για σταθερή θερμοκρασία και γεωμετρία σπειρών σε σταθερό πεδίο για εργασία επί 24-ώρου. Επαναληψιμότητα: Καλύτερη από ±1% Περιοχή δυναμικού πεδίου: 0.05 έως 300 kg Σταθερότητα πεδίου: Καλύτερη από ±0.05% Ακρίβεια πεδίου: Καλύτερη από ±1% και αποτελείται από τα παρακάτω τμήματα: Ηλεκτρομαγνήτη Model EM7-HV. Κρυοστάτη Φούρνο και σύστημα ελέγχου θερμοκρασίας. Περιοχή θερμοκρασιών: Κ, Κ Τροφοδοτικό ισχύος Model 665 Bipolar. Υποδοχείς στερεών και υγρών δειγμάτων. Ηλεκτρονικό υπολογιστή ελέγχου και εκτυπωτή. Πραγματοποιήθηκε βαθμονόμηση του οργάνου με δείγμα νικελίου που ζυγίστηκε και τοποθετήθηκε στη ράβδο. Έπειτα, η ράβδος τοποθετήθηκε στο μαγνητόμετρο κατά τέτοιο τρόπο, έτσι ώστε το δείγμα να βρίσκεται στο κέντρο των πηνίων τετραπολικής διάταξης όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Τέλος, ορίζεται σε ένα πρόγραμμα το μέγιστο πεδίο που θα ανέβει η συσκευή και το βήμα αύξησης-μείωσης πεδίου. Στα αποτελέσματα που λαμβάνονται στον άξονα των χ είναι το πεδίο (Η) και στον άξονα των ψ η μαγνήτιση σε αυθαίρετες μονάδες (emu). Τον άξονα της μαγνήτισης τον διαιρούμε με το βάρος του δείγματος, έτσι ώστε να έχουμε τη μαγνήτιση σε (emu/g). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν από συνεργάτη, στο τμήμα Επιστήμης Υλικών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων Μελέτη του χρόνου χαλάρωσης spin-πλέγματος (spin- lattice relaxation time), T 1 /T 2 μέσω 1 HNMR 1 H NMR πειράματα μέτρησης του χρόνου χαλάρωσης spin-πλέγματος, Τ 1 /Τ 2, (spinlattice relaxation time) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μαγνήτη κυκλικής διάταξης Halbach, που έχει την ικανότητα να παίρνει μετρήσεις NMR χαμηλού πεδίου (circular Halbach array magnet, capable of low-field NMR measurements).το πεδίο στο κέντρο του μαγνήτη ήταν 0.29 T, το οποίο αντιστοιχεί σε συχνότητα συντονισμού ενός πρωτονίου MHz. Ο μαγνήτης Halbach, συνδέθηκε με φασματοφωτόμετρο ευρείας ζώνης που λειτουργούσε σε εύρος συχνοτήτων MHz. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος χαλάρωσης spin-πλέγματος, Τ 1, μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία πρότυπη τεχνική ανάκτησης κορεσμού [ (π/2) τ -(π/2) ] με καθυστέρηση παλμών, τ, που κυμαίνονται από 100 μs σε 6 s.το σήμα καταγράφηκε από την κοινή ακολουθία παλμών Hahn echo. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε μια εκθετική συνάρτηση τριών παραμέτρων χρησιμοποιώντας μια μη-γραμμική ελαχίστων τετραγώνων συνάρτηση προσαρμογής. To μέγεθος ρυθμός χαλάρωσης r 1 σε mm -1 s -1, αξιολογήθηκε από την κλίση του 1/Τ 1 έναντι στη μοριακή συγκέντρωση των ενώσεων χρησιμοποιώντας συνάρτηση προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων. Για τον χρόνο χαλάρωσης spin-πλέγματος, Τ 2, ακολουθείται το ίδιο πρωτόκολλο αλλά μετράται ακολουθία παλμών Hahn echo, [ (π/2) τ -(π) ]. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε 68

69 μια εκθετική συνάρτηση δύο παραμέτρων χρησιμοποιώντας μια μη-γραμμική ελαχίστων τετραγώνων συνάρτηση προσαρμογής. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε συνεργασία με το ινστιτούτο «Δημόκριτος» Μελέτη μαγνητικής υπερθερμίας Δείγματα όγκου 1ml και συγκέντρωσης ~1% wt σε Fe 2 O 3, μεταφέρονται σε ειδικό δοχείο σε θερμοκρασία δωματίου και τοποθετούνται σε μια ειδική συσκευή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου (Magnetherm, Nanotherics, UK) σε συχνότητα 110 khz και μαγνητικό πεδίο έντασης 25mT (19.9 ka/m). Παρακολουθείται η αύξηση της θερμοκρασίας του δείγματος στα 5 λεπτά και οι τιμές καταγράφονται ανά 15 δευτερόλεπτα σε διάγραμμα. Οι τιμές της συχνότητας και της έντασης του εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου είναι πολύ κοντά στα 100 khz και 20mT που χρησιμοποιούνται στην κλινικές πειραματικές φάσεις. Σχεδιάζεται γραφικά η συνάρτηση της θερμοκρασίας με την αύξηση του χρόνου, χαράσσεται η εφαπτομένη και από την κλίση της υπολογίζεται ο ρυθμός ειδικής απορρόφησης (SAR Specific Absorption Rate) που περιγράφεται από την εξίσωση 1.13 και εξαρτάται από την συχνότητα (f) και την ένταση του πεδίου (H). Επίσης υπολογίστηκε η εγγενής απώλεια ισχύος (ILP Intrinsic Loss of Power), που δίνεται από την εξίσωση Μελέτη τοξικότητας Άλλος ένας παράγοντας που πρέπει να μελετηθεί για να κριθούν τα ΜΝΣ κατάλληλα για χρήση σε διάφορες εφαρμογές, είναι η τοξικότητα που εμφανίζουν. Στην αύξηση της βιοσυμβατότητάς τους, μεταξύ άλλων, συμβάλλει και η σύζευξη με την mpeg-nh 2. Επομένως, η τοξικότητα των σταθεροποιημένων ΜΝΣ θα μελετηθεί αρχικά in vιtro σε δύο κυτταρικές σειρές και στη συνέχεια ακολουθούν και in vivo μελέτες in vitro σε κυτταρικές σειρές Η κυτταρική σειρά που επιλέχθηκε προς μελέτη είναι η hcmec/d3, αθανατοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ στη συνέχεια επιλέχθηκε και μια καρκινική σειρά, συγκεκριμένα η σειρά Β16 του μελανώματος. Αθανατοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα ( hcmec/d3): Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε φλάσκες με πλήρες θρεπτικό μέσο EBM-2 στους 37 0 C σε ατμόσφαιρα 5% CO 2 και 100% υγρασία. Όταν τα κύτταρα καταλάβουν το 100% της επιφάνειας προσκόλλησης (confluency), τότε αποκολλώνται ενζυμικά από τη φλάσκα, αραιώνονται με υγρό θρεπτικό μέσο και ανακαλλιεργούνται σε 3 καινούριες φλάσκες. Αρχικά γίνεται παρατήρηση της φλάσκας στο μικροσκόπιο. Η εικόνα των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους. Τα κύτταρα που είναι προσκολλημένα στον πυθμένα της φλάσκας θεωρούνται υγιή. Τα κύτταρα που έχουν πιο σφαιρική δομή και επιπλέουν στο υγρό θρεπτικό μέσο θεωρούνται νεκρά. Εκτός από τη θέση και τη μορφολογία των κυττάρων, παρατηρείται και η συγκέντρωση τους από την οποία εξαρτάται το αν θα πραγματοποιηθεί η ανακαλλιέργεια. Εφόσον τηρούνται οι προϋποθέσεις για ανακαλλιέργεια, η φλάσκα μεταφέρεται σε θάλαμο νηματικής ροής για να επιτευχθούν οι στείρες συνθήκες για την πραγματοποίηση της διαδικασίας. Ακολουθεί ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα της φλάσκας 2 φορές με αποστειρωμένο PBS. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της 69

70 τρυψίνης. Για την αποκόλληση των κυττάρων προστίθεται διάλυμα τρυψίνης, το οποίο διασπά τους δεσμούς μεταξύ των κυττάρων και της επιφάνειας. Η παραμονή των κυττάρων στην τρυψίνη δεν πρέπει να γίνεται για μεγάλο χρονικό διάστημα, ώστε να μη μειώνεται η βιωσιμότητα των κυττάρων, ενώ η αποκόλληση των κυττάρων παρατηρείται στο μικροσκόπιο. Όταν τα κύτταρα έχουν στρογγυλή μορφή, τότε απομακρύνεται η τρυψίνη με κενό με προσοχή ώστε να μην προσροφηθούν και κύτταρα. Τα ίχνη της τρυψίνης που παραμένουν απενεργοποιούνται με την προσθήκη του υγρού θρεπτικού μέσου. Τα κύτταρα επαναιωρούνται σε νέο θρεπτικό μέσο με αναρροφήσεις με σιφώνι. Καρκινικά κύτταρα μελανώματος (B16): Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε φλάσκες με πλήρες θρεπτικό μέσο RPMI που περιέχει 10% FBS και 5% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη, στους 37 ο C, σε ατμόσφαιρα 5% CO 2 και 100% υγρασία και ακολουθείται ακριβώς η ίδια διαδικασία. H δοκιμασία κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ [102] : H δοκιμασία ΜΤΤ είναι μια χρωματομετρική μέθοδος για τη μέτρηση της δραστικότητας ενζύμων που τροποποιούν το ΜΤΤ σε φορμαζάνη, δίνοντας ιώδες χρώμα. Για την επώαση των κυττάρων με τα νανοφορείς χρησιμοποιούνται πλάκες 96 πηγαδιών. Μετά την επώαση των κυττάρων με τα νανοσωματίδια, ακολουθεί υπολογισμός της βιωσιμότητάς τους. Σε κάθε κυψελίδα τοποθετούνται 50μl διαλύματος ΜΤΤ (5mg/ml), το οποίο μετατρέπεται σε κρυστάλλους φορμαζάνης από μιτοχονδριακά ένζυμα, μόνο όταν το κύτταρο βρίσκεται σε φυσιολογική κατάσταση και ακολουθεί επώαση για 2 ώρες για τον σχηματισμό των κρυστάλλων. Στη συνέχεια το θρεπτικό μέσο αναρροφάται με αντλία κενού και σε κάθε κυψελίδα προστίθενται 200μl DMSO για την διάλυση των κρυστάλλων φορμαζάνης. Η μετατροπή του ΜΤΤ σε κρυστάλλους φορμαζάνης είναι ένδειξη της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων. Για τη διάλυση των κρυστάλλων μετά την προσθήκη του DMSO, γίνεται επώαση στους 37 ο C και ανάδευση. Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 590nm χρησιμοποιώντας φωτόμετρο Elisa. Σε ένα από τα πηγάδια έχουν τοποθετηθεί 200 μl DMSO, η απορρόφηση του οποίου χρησιμοποιείται ως «τυφλό». Από τις οπτικές απορροφήσεις υπολογίζεται το επί τις εκατό ποσοστό βιωσιμότητας Ιn vivo μοντέλο - C. Elegans [103] Η μελέτη έγινε σε συνεργασία με το Ινστιτούτο Φαρμακολογικών Ερευνών Mario Negri, στο Μιλάνο της Ιταλίας, στα πλαίσια προγράμματος Erasmus Placemnets. Τα πρωτόκολλα για την καλλιέργεια και τη μελέτη του C. Elegans που χρησιμοποιήθηκαν είναι: (i) Καλλιέργεια C. Elegans: Για την προετοιμασία θρεπτικού μέσου (ΝΜG), σε 1 l Η 2 Ο, προστίθενται NaCl, άγαρ και πεπτόνη. Το διάλυμα αποστειρώνεται και στη συνέχεια προστίθενται CaCl 2, ουρακίλη, χοληστερόλη, θεϊκό μαγνήσιο (MgSO 4) 1M και μονόξινο φωσφορικό κάλιο (KH 2 PO 4) 1M που έχει ph=6. Περίπου 10ml του θρεπτικού μέσου μεταφέρονται σε τρυβλία Πετρί των 60 mm, και αφήνονται μέχρι να πάρουν θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια σε ειδικό περιέκτη μεταφέρονται βακτήρια E.Coli OP50 και θρεπτικό μέσο LB Broth, επωάζονται στους 37 0 C για 3-4 ώρες και στη συνέχεια ψύχονται (4 0 C). Σταγόνες των βακτηρίων προστίθενται στο κέντρο του τρυβλίου. 70

71 (ii) Συγχρονισμός των σειρών C. Elegans: Είναι σημαντικό να συγχρονιστούν τα σκουλήκια στο ίδιο στάδιο του κύκλου ζωής, ώστε μελετώντας την επίδραση διάφορων παραγόντων, να μην παρατηρούνται διαφορές που να οφείλονται στο ότι βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης. Έτσι, συλλέγουμε ενήλικα μέλη, από τρυβλία στα οποία έχουν καλλιεργηθεί για την αποθήκευση των σειρών C. Elegans, με Η 2 Ο και TWEEN 20. Ακολουθεί ήπια φυγοκέντρηση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και στη συνέχεια με χρήση αραιού λευκαντικού απολυμαντικού διαλύματος και έντονη ανακίνηση, θανατώνονται τα ενήλικα μέλη. Προσοχή, η συγκέντρωση του διαλύματος αυτού και η διάρκεια της διαδικασίας πρέπει να οριστούν στην οριακή τιμή, ώστε να θανατώνονται τα ενήλικα μέλη, αλλά να μην καταστρέφονται τα αυγά. Αυτό εξασφαλίζεται διακόπτοντας τη διαδικασία και παρατηρώντας το διάλυμα στο μικροσκόπιο. Μετά την προσεκτική απομάκρυνση του λευκαντικού απολυμαντικού διαλύματος, με φυγοκέντρηση, το ίζημα επαναδιασπείρεται σε ρυθμιστικό διάλυμα Μ9 και αφήνεται σε αργή κυκλική κίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη μέρα παραλαμβάνονται τα σκουλήκια στο στάδιο L1 του κύκλου ζωής, αφού όταν σκάσουν τα αυγά, τα σκουλήκια δεν μπορούν να αναπτυχθούν στο ρυθμιστικό διάλυμα εξ αιτίας της έλλειψης τροφής, μέχρι να μεταφερθούν στα τρυβλία που έχουν εμποτιστεί με E.Coli όπως περιγράφηκε. (iii) Δοκιμασία μέτρησης συχνότητας κάμψεων (body bends, BB) [104] : Αυτή η μέθοδος προϋποθέτει την παρατήρηση κάθε αρνητικής επίπτωσης στην κινητικότητα του C. Elegans. Οποιαδήποτε παρακώλυση της κίνησης της ουράς του, άρα και μείωσης της κινητικότητάς του στη μονάδα του χρόνου, προδίδει κάποια νευροεκφυλιστική επίδραση του μελετώμενου δείγματος. Για το σκοπό αυτό προετοιμάζεται μία φλάσκα 96 πηγαδίων με νερό. Από τρυβλίο που έχει επωαστεί με δείγμα, με τη βοήθεια μικροσκοπίου, συλλέγονται ένα ένα σκουλήκια, που βρίσκονται στο στάδιο του κύκλου ανάπτυξης L3- L4 και βυθίζονται σε κάθε πηγάδι. Μετράται με ακρίβεια ο αριθμός των σπασμών της ουράς τους, αφού βυθιστούν στο νερό, για 20 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια η τιμή αυτή ανάγεται στο 1 λεπτό. Η δοκιμασία επαναλαμβάνεται για 10 με 20 μέλη από το κάθε τρυβλίο. (iv) Δοκιμασία μέτρησης ρυθμού διαδοχικής συστολής διαστολής του μυ του φάρυγγα του C. Elegans (pumping rate, PR): Αυτή η μέθοδος αφορά την αλλαγή του ρυθμού σύσπασης του μυ του φάρυγγα, που είναι ζωτικής σημασίας για το C. Elegans, εξ αιτίας της επίδρασης κάποιου τοξικού παράγοντα. Για το σκοπό αυτό, τρυβλίο που έχει επωαστεί με δείγμα και περιέχει σκουλήκια στο L3- L4 του κύκλου ζωής τους, παρατηρείται σε μικροσκόπιο με πολύ μεγάλη δυνατότητα μεγέθυνσης. Απομονώνεται ο μυς του φάρυγγα και μετρώνται με ακρίβεια οι συσπάσεις σε 20 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια η τιμή αυτή ανάγεται στο 1 λεπτό. Η δοκιμασία επαναλαμβάνεται για 10 με 20 μέλη από το κάθε τρυβλίο. (v) Δοκιμασία παράλυσης (paralysis test): Αυτή η μέθοδος αφορά τη στατιστική μελέτη θανάτωσης μελών, μετά από κατεργασία με δείγμα. Για το σκοπό αυτό, τρυβλίο που έχει επωαστεί με δείγμα και περιέχει σκουλήκια στο L3- L4 του κύκλου ανάπτυξής τους, παρατηρείται σε μικροσκόπιο και καταγράφεται ο αριθμός των θανατωμένων και των τελείως ακίνητων μελών (που βρίσκονται σε παράλυση). Η δοκιμασία επαναλαμβάνεται για περισσότερα από ένα τρυβλία που έχουν κατεργαστεί με το ίδιο δείγμα. 71

72 Άγριου τύπου (wild type) Ν2 σκουλήκια συλλέχθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο, προκειμένου να μελετηθούν στο L3 στάδιο ανάπτυξης των σκουληκιών. Προετοιμάστηκαν 8 μικρά τρυβλία Πετρί που περιείχαν 100 σκουλήκια καθένα. Τα τρυβλία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μl από κάθε δείγμα. Μελετήθηκε η τοξικότητα που παρουσιάζουν τα νανοσωματίδια στα σκουλήκια, επωάζοντας για διαφορετικά χρονικά διαστήματα και με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΜΝΣ και παρατηρώντας την θνησιμότητά τους (paralysis test) στο τρυβλίο και την επίδραση που έχει η επώαση αυτή, στη συχνότητα κάμψεών τους (body bends) όταν μεταφερθούν σε νερό, και στο ρυθμό διαδοχικής συστολής-διαστολής του μυ του φάρυγγα (pumping rate). 72

73 3. Αποτελέσματα 3.1. Μαγνητικά Νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου Παρασκευή ΜΝΣ Αρχικά παρασκευάστηκαν οι ΜΝΣ όπως περιγράφηκε στο πειραματικό μέρος και ακολούθησε ο πλήρης χαρακτηρισμός τους σε κάθε στάδιο της συνθετικής πορείας. Σύνθεση διαφορετικών νανοφορέων με την τεχνική της αλκαλικής καταβύθισης: Διερευνήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν τις φυσικοχημικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος ώστε να προκύψει το βέλτιστο σύμφωνα με το στόχο της μεταπτυχιακής διατριβής. Οι δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν για το κάθε προϊόν ΜΝΣ1/2/3 συνοψίζονται στους πίνακες 3.1/2/3 αντίστοιχα. Ποσότητα βάσης (ml) Πίνακας 3. 1: Διερεύνηση των συνθηκών της σύνθεσης των νανοσωματιδίων ΜΝΣ1 Σύνθεση ΜΝΣ1: πρόδρομο σύμπλοκο σιδήρου -> FeSO 4 πρστιθέμενη βάση NH 3 37% Μέγιστη θερμοκρασία αντίδρασης ( 0 C) Διάρκεια αντίδρασης (λεπτά) Υδροδυναμική διάμετρος (nm) Κλίση καμπύλης μαγνητοφόρησης X καμία απόκριση σε μαγνητικό πεδίο Χ καμία απόκριση σε μαγνητικό πεδίο * * * * ,68* X καμία απόκριση σε μαγνητικό πεδίο Πίνακας 3. 2: Διερεύνηση των συνθηκών της σύνθεσης των νανοσωματιδίων ΜΝΣ2 Σύνθεση ΜΝΣ2: πρόδρομο σύμπλοκο σιδήρου -> FeSO 4 πρστιθέμενη βάση NaOH 1M Ποσότητα βάσης (ml) Μέγιστη θερμοκρασία αντίδρασης ( 0 C) Διάρκεια αντίδρασης (λεπτά) Υδροδυναμική διάμετρος (nm) Κλίση καμπύλης μαγνητοφόρησης * * καμία απόκριση σε μαγνητικό πεδίο * 10-6 Επιπλέον εξετάστηκε η επίδραση της προσθήκης του πολυμερούς στο τέλος της αντίδρασης καμία απόκριση σε μαγνητικό πεδίο Επιπλέον εξετάστηκε η επίδραση της προσθήκης 2 συμπλόκων σιδήρου FeSO 4 /FeCl 2 σε αναλογία 1: ΠΟΛΥ ΚΑΛΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ 73

74 Με βάση τη μεγάλη αύξηση μαγνητικών ιδιοτήτων που παρατηρήθηκε με την αλλαγή του πρόδρομου συμπλόκου σιδήρου, μελετήθηκε η σύνθεση του προϊόντος ΜΝΣ3. Πίνακας 3. 3: : Διερεύνηση των συνθηκών της σύνθεσης των νανοσωματιδίων ΜΝΣ2 Σύνθεση ΜΝΣ3: πρόδρομο σύμπλοκο σιδήρου -> FeCl 2 πρστιθέμενη βάση NaOH 1M Ποσότητα βάσης (ml) Μέγιστη θερμοκρασία αντίδρασης ( 0 C) Διάρκεια αντίδρασης (λεπτά) Υδροδυναμική διάμετρος (nm) Κλίση καμπύλης μαγνητο φόρησης Μηχανική ανάδευση (rpm) ,48 * ,40 * Ύστερα από αυτή την διερεύνηση, οι συνθήκες που κρίθηκαν ως βέλτιστες για το κάθε προϊόν, με βάση τα παραπάνω δεδομένα μεγέθους και απόκρισης σε μαγνητικό πεδίο, περιγράφονται στον πίνακα 3.4. Πίνακας 3. 4: Τρία προϊόντα σύνθεσης που χρησιμοποιήθηκαν για περεταίρω μελέτη και οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη συνθετική τους πορεία. ονομασία σύνθεσης Άλας σιδήρου Bάση Μέγιστη θερμοκρασία Διάρκεια αντίδρασης ΜΝΣ1 FeSO 4 x7h 2 O 4ml ΝΗ3 30% 70 0 C 3.6 ώρες ΜΝΣ2 FeSO 4 x7h 2 O 10ml NaOH 1M 50 0 C 1.6 ώρες ΜΝΣ3 FeCl 3 x6h 2 O 15mlΝαΟΗ 1Μ 60 0 C 1.6 ώρες Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός ΜΝΣ Ακολούθησε ο πλήρης φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των προϊόντων Προσδιορισμός συγκέντρωσης σιδήρου των ΜΝΣ Η συγκέντρωση του σιδήρου του κάθε ΜΝΣ που συντέθηκε, ως χαρακτηριστική του μαγνητικού περιεχομένου του προϊόντος, προσδιορίστηκε με ακρίβεια. Επίσης χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά σε ποσότητα νανοσωματιδίων για όλα τα πειράματα που έγιναν Προσδιορισμός οργανικού περιεχομένου των ΜΝΣ Μέσω μετρήσεων θερμοσταθμικής ανάλυσης, προσδιορίστηκε το ποσοστό του πολυμερούς PAA-co-MA που συνδέθηκε στην επιφάνεια των μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών. Εκτός από τους νανοφορείς, εξετάστηκε και το σκέτο πολυμερές, με σκοπό να προσδιοριστεί η μάζα που χάνεται σε αυτή την διαδικασία. Το πολυμερές και οι νανοφορείς αναλύθηκαν σε ατμόσφαιρα αζώτου. Επιλέχθηκε ατμόσφαιρα αζώτου, αφού παρουσία αέρα ο σίδηρος οξειδώνεται και αλλάζει η μάζα του. 74

75 Απώλεια μάζας (mg) Απώλεια μάζας (mg) Επίσης, το πολυμερές παρουσία αέρα αποικοδομείται με διαφορετικό τρόπο όταν είναι ελεύθερο απ ότι όταν είναι συνδεδεμένο με κάποιο μέταλλο. Το μέταλλο δρα σαν ένα είδος παρεμποδιστή στη διαδικασία αποικοδόμησης. Σε όλα τα δείγματα (συμπεριλαμβανομένου και του σκέτου πολυμερούς) που μετρήθηκαν παρατηρήθηκε μια αρχική μείωση της μάζας τους στους ~ C η οποία οφείλεται στην απομάκρυνση προσροφημένου H 2 O. Από τους ~160 ο C άρχιζε η αποδόμηση των οργανικών συστατικών και η μάζα του δείγματος σταθεροποιούνταν περίπου στους C. Έτσι, από αυτά τα γραφήματα (Διάγραμμα 3.1 και 3.2) προσδιορίστηκε το ποσοστό του πολυμερούς που αποδομήθηκε σε αυτές τις συνθήκες. Έχοντας αυτό το δεδομένο και λαμβάνοντας υπ όψιν το ποσοστό της υπολειπόμενης μάζας του πολυμερούς κατά την αποδόμησή του, χωρίς την παρουσία νανοσωματιδίων, υπολογίστηκε το οργανικό κλάσμα στους υβριδικούς νανοφορείς. 100 PAA-co-MA Θερμοκρασία ( 0 C) Διάγραμμα 3. 1: Θερμογράφημα του πολυμερούς PAA-co-MA σε ατμόσφαιρα αζώτου. 100 ΜΝΣ3 ΜΝΣ1 ΜΝΣ Θερμοκρασία ( 0 C) Διάγραμμα 3. 2: Θερμογράφημα των τριών νανοφορέων σε ατμόσφαιρα αζώτου. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων TGA δείχνουν ότι το οργανικό κλάσμα των υβριδικών νανοφορέων κυμαινόταν από ~14 20 % wt (Πίνακας 3.5). 75

76 Απώλεια μάζας (mg) Πίνακας 3. 5 Αποτελέσματα θερμοσταθμικής ανάλυσης για τις τρεις διαφορετικές συνθέσεις νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου Κωδική ονομασία σύνθεσης Περιεκτικότητα σε πολυμερές PAA-co-MA (%) ΜΝΣ1 20 ± 2 % ΜΝΣ2 16 ± 2 % ΜΝΣ3 14 ± 2 % Τέλος, δείγμα ΜΝΣ2, υπόκειται σε θερμοσταθμική ανάλυση αμέσως μετά τη σύνθεση και μετά από κάθε πλύση. Ακολουθούν τρεις διαδοχικές πλύσεις. Όγκος δείγματος, αφήνεται σε κυψελίδα για 2 μέρες, στη μία πλευρά της οποίας, εφαρμόζεται μαγνήτης. Όλο το μαγνητικό περιεχόμενο του δείγματος, προσκολλάται στην πλευρά του μαγνήτη, το υπερκείμενο απορρίπτεται και το ίζημα επαναδιασπείρεται. Μέρος του ιζήματος που συλλέγεται, ξηραίνεται και μετράται το οργανικό του περιεχόμενο. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 3 φορές. Ακολουθεί το Διάγραμμα 3.3, όπου φαίνονται τα αποτελέσματα της θερμοσταθμικής ανάλυσης ΜΝΣ2 1η πλύση 2η πλύση 3η πλύση Θερμοκρασία ( o C) Διάγραμμα 3. 3: Απώλεια μάζας % με την άνοδο της θερμοκρασίας, στο δείγμα ΜΝΣ2, αμέσως μετά τη σύνθεση του δείγματος και μετά από κάθε μία από τρεις διαδοχικές πλύσεις. Γίνεται φανερό πως αμέσως μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης η απώλεια μάζας του δείγματος μειώθηκε από το 45% στο 10% και στις επόμενες διαδοχικές πλύσεις δεν μειώθηκε καθόλου. Αυτό αποτελεί και απόδειξη πως το πολυμερές PAA-co-MA έχει συνδεθεί πολύ ισχυρά στον μαγνητικό πυρήνα του νανοσωματιδίου, καθώς και πως οι πλύσεις του δείγματος και η επαναδιασπορά τους είναι απαραίτητες, ώστε να συλλεχθεί τελικά το προϊόν, με το συνδεδεμένο πολυμερές, και να απορριφθούν τυχόν μή προσροφημένα μαρκομόρια PAA-co-MA. 76

77 Μέγεθος μαγνητικών νανοσωματιδίων - XRD Για τον προσδιορισμό του μέσου μεγέθους των νανοσωματιδίων χρησιμοποιήθηκε η εμπειρική σχέση του Scherrer (εξίσωση 3.1) βάσει της οποίας μπορεί να εκτιμηθεί το μέσο μέγεθος των νανοκρυσταλλιτών από την διαπλάτυνση των κορυφών του διαγράμματος περίθλασης. Η συγκεκριμένη εξίσωση έχει βέβαια μια πιθανότητα σφάλματος, αλλά δίνει μια αρκετά καλή τάξη του μέσου μεγέθους, ειδικά όταν πρόκειται για μεγέθη της τάξης των 20 nm και κάτω. Για την εφαρμογή της εξίσωσης Scherrer επιλέχθηκε η ανάκλαση του διαγράμματος με τη μεγαλύτερη ένταση [δηλαδή η ανάκλαση (311)]. (εξίσωση 3.1) Όπου, t η μέση διάμετρος των νανοκρυσταλλιτών, K η σταθερά που εξαρτάται από το σχήμα των νανοκρυσταλλιτών (~0,89), λ το μήκος κύματος της ακτινοβολίας, B το εύρος της κορυφής στο μέσο του ύψους της (Full Width at Half Maximum) και θ Β η γωνία Bragg. Υπολογίστηκε το μέσο μέγεθος των νανοκρυσταλλιτών ανάλογα με τις συνθήκες που επιλέχθηκαν για τη σύνθεση κάθε νανοκρυσταλλίτη. Οι τιμές του μέσου μεγέθους που προκύπτουν με εφαρμογή της εξίσωση Scherrer, συνοψίζονται στον Πίνακα 3.6. Πίνακας 3. 6 :Μέσο μέγεθος μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών όπως προέκυψε από τις μετρήσεις XRD Κωδική ονομασία σύνθεσης Μέσο μέγεθος μαγνητικού πυρήνα των νανοκρυσταλλιτών (nm) ΜΝΣ1 4 ± 1 ΜΝΣ2 8 ± 1 ΜΝΣ3 14 ± 1 Ανάλογα, λοιπόν με την πρόδρομη ένωση σιδήρου, την επιλεγόμενη βάση, τη μέγιστη θερμοκρασία της αντίδρασης, μπορεί να επιτευχθεί η σύνθεση νανοσωματιδίων με μεγαλύτερο μέσο μέγεθος πυρήνα μαγνήτισης. Οι τρεις νανοφορείς που παρασκευάσθηκαν και μελετήθηκαν καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα μεγεθών από ~3-14 nm. Αυτό μας δίνει τη δυνατότητα να μελετήσουμε την επίδραση του μέσου μεγέθους πυρήνα μαγνήτισης σε διάφορες ιδιότητες και εφαρμογές των νανοφορέων. Στο διάγραμμα 3.4 παρουσιάζεται συγκριτικά η διαφορά στην διαπλάτυνση της ανάκλασης (311) των δειγμάτων αυτών. 77

78 Ένταση (a.u) MagpAcMaFeSO ΜΝΣ1 ~4nm 4 NH 3, ~4nm MagpAcMaFeSO MNΣ2 ~8nm 4 10NaOH, ~8nm MagpAcMaFeCl MNΣ3 ~13nm 2 15NaOH, ~13nm θ o Διάγραμμα 3. 4: Σύγκριση της διαπλάτυνσης της κορυφής (311) για τα 3 δείγματα ΜΝΣ Ηλεκτρονική μικροσκοπία (TEM) των ΜΝΣ Στις εικόνες 3.1, 3.2 και 3.3 φαίνονται αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα TEM των ΜΝΣ1, ΜΝΣ2 και ΜΝΣ3 αντίστοιχα. Σε αυτές τις εικόνες φαίνεται η προτίμηση της οργάνωσης των νανοκρυσταλλιτών σε πλειάδες (clusters) του δείγματος ΜΝΣ3. Παρατηρείται δηλαδή μια μεγάλη τάση για αυτοσυνάθροιση των νανοκρυσταλλιτών προς καλύτερα ορισμένες και διακριτές δομές. Από τις εικόνες TEM των δειγμάτων είναι αρκετά δύσκολο να μετρηθεί το μέγεθος των διακριτών νανοκρυσταλλιτών λόγω αυτής τους της συνάθροισής. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η εκτίμηση του μεγέθους των κρυσταλλιτών από το XRD είναι αρκετά αξιόπιστη όταν πρόκειται για πολύ μικρούς κρυστάλλους (μερικών νανομέτρων όπως στην παρούσα περίπτωση). Αυτή η παραδοχή βασίζεται στο ότι σε αυτά τα μεγέθη, η διαπλάτυνση των ανακλάσεών τους, εξαιτίας του περιορισμένου αριθμού των επαναλαμβανομένων κρυσταλλικών επιπέδων, είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτή του οργάνου, και άρα το σφάλμα στον υπολογισμό είναι πολύ μικρό. Επίσης, πρέπει πάντοτε να λαμβάνεται υπ' όψη πως το μέγεθος από το XRD είναι βασισμένο στη μάζα ή στον όγκο των σωματιδίων, ενώ το μέγεθος από τη μικροσκοπία είναι βασισμένο στον αριθμό. Συνεπάγεται πως το μέγεθος από το XRD είναι συνήθως λίγο μεγαλύτερο από αυτό που προκύπτει από την μικροσκοπία. 78

79 Εικόνα 3. 1: Εικόνες ΤΕΜ του προϊόντος ΜΝΣ1. Εικόνα 3. 2: Εικόνες ΤΕΜ του προϊόντος ΜΝΣ2. Εικόνα 3. 3: Εικόνες ΤΕΜ του προϊόντος ΜΝΣ3. 79