artus Mycobac. diff. LC PCR Kit Εγχειρίδιο

Transcript

1 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit Εγχειρίδιο 24 (Αρ. Καταλόγου ) 96 (Αρ. Καταλόγου ) Διαγνωστικό προϊόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με τα όργανα LightCycler 1.1/1.2/1.5 και LightCycler 2.0 Μαρτιος 2015 Εκδοση 1η , EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, ΓΕΡΜΑΝΙΑ R EL Sample & Assay Technologies

2 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit Μάρκες και αποποιήσεις QIAGEN, QIAamp, artus (QIAGEN Group); LightCycler (Roche Group); Triton (Union Carbide Corporation). Εμπορικά ονόματα, σήματα κ.τ.λ. που αναφέρονται στο εγχειρίδιο αυτό είναι κατοχυρωμένα ακόμα και αν αυτά δεν έχουν χαρακτηρισθεί. Το artus Mycobac. diff. LC PCR Kit είναι σημασμένο CE διαγνωστικό κιτ σύμφωνα με τον ευρωπαïκό κανονισμό 98/79/EC σχετικό με τη διαγνωστική in vitro. Δεν είναι διαθέσιμο σε όλες τις χώρες. Για τις τρέχουσες πληροφορίες άδειας και αποποιήσεις σχετικά με συγκεκριμένα προϊόντα, ανατρέξτε στο σχετικό εγχειρίδιο ή οδηγίες χρήσης του κιτ QIAGEN. Τα εγχειρίδια και οι οδηγίες χρήσης των κιτ QIAGEN είναι διαθέσιμα στη διεύθυνση Μπορείτε επίσης να τα ζητήσετε από το Τμήμα τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. Η αγορά αυτού του προϊόντος παρέχει στον αγοραστή τη δυνατότητα της χρήσης του για την εκτέλεση διαγνωστικών υπηρεσιών για in vitro διάγνωση σε ανθρώπους. Με τον παρόν δεν παρέχεται κανένα γενικό δικαίωμα ευρεσιτεχνίας ή άλλη άδεια οποιουδήποτε είδους, εκτός από το παρόν, συγκεκριμένο δικαίωμα χρήσης από την αγορά. Η ΑΓΟΡΑ ΑΥΤΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΪΌΝΤΟΣ ΠΑΡΕΧΕΙ ΣΤΟΝ ΑΓΟΡΑΣΤΗ ΔΙΚΑΙΩΜΑΤΑ ΥΠΟ ΕΝΑ Ή ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΑ ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΑΣ ΤΩΝ Η.Π.Α. ΜΕ ΑΡ. 6,174,670, 7,160,998, 6,569,627, 6,245,514, 5,804,375, 5,210,015, 5,487,972, 6,214,979 ΚΑΙ 7,141,377 ΚΑΙ ΤΑ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑ ΤΗΣ ΑΛΛΟΔΑΠΗΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΑΥΤΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΟΧΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ ΥΠΗΡΕΣΙΩΝ IN VITRO ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΚΑΙ ΖΩΑ. ΜΕ ΤΟ ΠΑΡΟΝ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ ΚΑΝΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΚΑΙΩΜΑ ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΑΣ Ή ΑΛΛΗ ΑΔΕΙΑ ΟΠΟΙΟΥΔΗΠΟΤΕ ΕΙΔΟΥΣ, ΕΚΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟ ΠΑΡΟΝ, ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟ ΔΙΚΑΙΩΜΑ ΧΡΗΣΗΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΓΟΡΑ. Άδεια περιορισμένης χρήσης Η χρήση αυτού του προϊόντος ισοδυναμεί με την αποδοχή από πλευράς οποιουδήποτε αγοραστή ή χρήστη του κιτ artus Mycobac. diff. LC PCR των εξής όρων: 1. Η χρήση του κιτ artus M. tuberculosis LC PCR επιτρέπεται μόνο σύμφωνα με το Εγχειρίδιο κιτ artus Mycobac. diff. LC PCR και μόνο μαζί με τα συστατικά που περιέχει το κιτ. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του κιτ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ, εκτός και αν περιγράφεται διαφορετικά στο Εγχειρίδιο κιτ artus Mycobac. diff. LC PCR και πρόσθετα πρωτόκολλα στη διεύθυνση 2. Με την εξαίρεση των ρητά αναφερόμενων αδειών, η QIAGEN δεν εγγυάται πως αυτό το κιτ και/ή η χρήση/-εις του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το κιτ και τα συστατικά του φέρουν άδεια χρήσης για μια μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επανάχρηση, η εκ νέου επεξεργασία ή η μεταπώλησή τους. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά οποιεσδήποτε άλλες άδειες, ρητές ή έμμεσες εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής ή ο χρήστης του κιτ συμφωνεί να μην λάβει ή να μην επιτρέψει σε κανέναν να εκτελέσει βήματα που θα μπορούσαν να οδηγήσουν ή να διευκολύνουν τις ενέργειες που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και θα αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δαπανών υπεράσπισης στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή αυτής της Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε των πνευματικών δικαιωμάτων της σχετικά με το κιτ και/ή τα συστατικά του. Για τους ενημερωμένους όρους της άδειας, βλ QIAGEN, με την επιφύλαξη κάθε δικαιώματος.

3 Πίνακας περιεχομένων 1. Περιεχόμενο Αποθήκευση Πρόσθετα απαιτούμενα υλικά και συσκευές Γενικά μέτρα ασφάλειας Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Αρχή της αντίδρασης Real-Time PCR Περιγραφή προϊόντος Πρωτόκολλο Απομόνωση DNA Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Ποσοτικοποίηση Προετοιμασία της PCR Προγραμματισμός των οργάνων LightCycler Προγραμματισμός του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/ Προγραμματισμός του οργάνου LightCycler Αξιολόγηση Αξιολόγηση των δεδομένων της PCR στο όργανο LightCycler 1.1/1.2/ Αξιολόγηση των δεδομένων της PCR στο όργανο LightCycler Αντιμετώπιση προβλημάτων Ειδικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία Ειδικότητα artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015 3

4 11.3 Ακρίβεια Ανθεκτικότητα Επαναληψιμότητα Διαγνωστική αξιολόγηση Ειδικές υποδείξεις για τη χρήση του προϊόντος Πληροφορίες ασφάλειας Ποιοτικός έλεγχος Βιβλιογραφία Ερμηνεία των συμβόλων artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

5 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit Για τη χρήση με το όργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 ή LightCycler Περιεχόμενο Ονομασία και περιεχόμενο Αρ. είδους αντιδράσεις Αρ. είδους αντιδράσεις Μπλε Mycobac. diff. LC Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Κίτρινο Mycobac. diff. LC Mg-Sol 1 x 400 µl 1 x 400 µl Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο M. tuberculosis LC QS 1 5 x 10 4 cop/µl M. tuberculosis LC QS 2 5 x 10 3 cop/µl M. tuberculosis LC QS 3 5 x 10 2 cop/µl M. tuberculosis LC QS 4 5 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Κόκκινο M. avium LC Control 1 x 200 µl 1 x 200 µl Κόκκινο M. intracellulare LC Control 1 x 200 µl 1 x 200 µl Πράσινο Mycobac. diff. LC IC 1 x µl 2 x µl Λευκό Water (PCR grade) 1 x µl 1 x µl QS = Πρότυπο ποσοτικοποίησης IC = Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Mg-Sol = Διάλυμα μαγνησίου 2. Αποθήκευση Τα συστατικά του artus Mycobac. diff. LC PCR Kit θα πρέπει να φυλάσσονται στους 15 C έως 30 C και είναι σταθερά έως την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Η επαναληπτική ψύξη/απόψυξη (> 2 x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με αυτόν τον τρόπο μειώνεται η ευαισθησία. Για το λόγο αυτό, εάν η χρήση δεν είναι τακτική, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός των αντιδραστηρίων. Εάν παραστεί ανάγκη αποθήκευσης των υλικών στους +4 C, το χρονικό διάστημα αποθήκευσης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015 5

6 3. Πρόσθετα απαιτούμενα υλικά και συσκευές Γάντια εργαστηρίου χωρίς πούδρα Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε 8.1 Απομόνωση DNA) Μίγμα λυσοζύμης (βλέπε 8.1 Απομόνωση DNA) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες) Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex Επιτραπέζια φυγόκεντρος με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Color Compensation Set (Roche Diagnostics, Αρ. κατ ) για την εγκατάσταση ενός αρχείου Crosstalk Color Compensation για το όργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 ή LightCycler 2.0 LightCycler Multicolor Demo Set (Roche Diagnostics, Αρ. κατ ) για το όργανο LightCycler 2.0 Τριχοειδείς σωλήνες LightCycler (20 µl) Cooling Block LightCycler Οργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 (Software Version 3.5) ή LightCycler 2.0 (Software Version 4.0) Capping Tool LightCycler 4. Γενικά μέτρα ασφάλειας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου, πριν από τη χρήση τους. Στη συνέχεια καλή ανάμιξη των υλικών και εκτέλεση μιας σύντομης φυγοκέντρησης. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή σε Cooling Block LightCycler. 6 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

7 5. Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Η φυματίωση (ΤΒ) είναι, όπως παλιά, μία από τις σοβαρότερες μολυσματικές ασθένειες του κόσμου. Υπολογίζεται ότι περίπου δύο δισεκατομμύρια άνθρωποι, το ένα τρίτο του πληθυσμού της γης, έχει μολυνθεί με το Mycobacterium tuberculosis, τον παθογόνο παράγοντα της φυματίωσης. Κάθε χρόνο αναφέρονται περισσότερες από οκτώ εκατομμύρια νέες μολύνσεις και περίπου τρία εκατομμύρια θάνατοι. Εάν και προσβάλλει ιδιαίτερα τις χώρες του Τρίτου Κόσμου, η φυματίωση είναι μία επανεμφανιζόμενη νόσος στς βιομηχανοποιημένες χώρες, κυρίως λόγω της μετανάστευσης προσβεβλημένων ανθρώπων και της ανάπτυξης φυματίωσης ανθεκτικής στα φάρμακα. Μειονότητες, όπως οι άστεγοι, οι τοξικομανείς και οι ανοσοκατασταλμένοι ασθενείς προσβάλλονται δυσανάλογα συχνά. Η φυματίωση είναι μία χρόνια μολυσματική ασθένεια με κυκλική πορεία. Στο αρχικό στάδιο, η μόλυνση προσβάλλει κατά κύριο λόγο περοιχές τωνς πνευμόνων και τα αντίστοιχα λεμφογάγγλια. Ωστόσο, ανάλογα με την ανοσολογική κατάσταση του ασθενούς ενδέχεται να πραγματοποιηθεί εγκατάσταση του Mycobacterium tuberculosis και σε άλλα όργανα. Η φυματίωση μεταδίδεται κυρίως από άνθρωπο σε άνθρωπο με τη μορφή αερολύματος, και αυξημένος κίνδυνος μετάδοσης υπάρχει κυρίως στην ανοικτή φυματίωση. Μία εξασθένηση της άμυνας του οργανισμού του πάσχοντος ενδέχεται να προκαλέσει επανενεργοποίηση του παθογόνου παράγοντα ακόμη και μετά από σειρά ετών (μεταπρωτοπαθής φυματίωση). Τα μυκοβακτηρίδια Mycobacterium avium και Mycobacterium intracellulare υπάρχουν στο φυσικό περιβάλλον, δηλαδή στο νερό και στο έδαφος. Σε αντίθεση με το M. Tuberculosis, η μετάδοση των Mycobacterium avium και Mycobacterium intracellulare στον άνθρωπο πραγματοποιείται κυρίως με την πρόσληψη νερού ή τροφής που έχουν μολυνθεί από μυκοβακτηρίδια. Η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο αποκλείεται σχεδόν εντελώς. Σε άτομα με ανοσοεπάρκεια, η μόλυνση από M. avium και M. intracellulare έχει κατά κανόνα ασυμπτωματική εξέλιξη. Διαφορετική είναι η εικόνα σε ό,τι αφορά τα άτομα με ανοσοκαταστολή και artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015 7

8 ιδιαίτερα τους φορείς του ιού HIV, στους οποίους η μόλυνση από τους δύο αυτούς παθογόνους παράγοντες αποτελεί τη συχνότερη βακτηριακή νόσο. Στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις, πραγματοποιείται μαζική διασπορά των βακτηρίων σε ολόκληρο το σώμα, προκαλώντας συχνά το θάνατο. 6. Αρχή της αντίδρασης Real-Time PCR Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό (ενίσχυση) συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου, η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού, κατά την εξέλιξη της PCR πραγματικού χρόνου, επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR (Mackay, 2004). 7. Περιγραφή προϊόντος To artus Mycobac. diff. LC PCR Kit είναι ένα σύστημα έτοιμο προς χρήση για την ανίχνευση του DNA όλων των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. pinnipedii) και του συμπλέγματος M. avium (M. avium subsp. avium, M. avium subsp. paratuberculosis, M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis, M. intracellulare), μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στο όργανο LightCycler. Το Mycobac. diff. LC Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 163 bp, του μυκοβακτηριδιακού γονιδιώματος καθώς και για την άμεση ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού με το όργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 ή LightCycler 2.0. Πέραν αυτού, το 8 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

9 artus Mycobac. diff. LC PCR Κit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Προϊόν PCR Σύμπλεγμα Μ. tuberculosis/m. avium Εκλογή των καναλιών φθορισμού Οργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 Οργανο LightCycler 2.0 F2/Back-F1 640/Back 530 Mycobac. diff. LC IC F3/Back-F1 705/Back 530 Ο πολλαπλασιασμός και ή ανίχνευση αυτού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) δεν επηρεάζει αρνητικά το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis ή M. avium (βλέπε 11.1 Αναλυτική ευαισθησία). Για τη διαφοροποίηση του συμπλέγματος M. tuberculosis από τα διάφορα υποείδη του M. avium και από το M. intracellulare το σύστημα χρησιμοποιεί τις ειδικές θερμοκρασίες τήξης των ανιχνευτών. Αυτοί παράγουν, κατά την εξέλιξη μιας καμπύλης τήξης στο κανάλι φθορισμού F2 ή 640, ένα σήμα στους 60 C για τα μέλη του συμπλέγματος M. Tuberculosis, στους 63,5 C για όλα τα υποείδη του M. avium και στους 55 C για το M. intracellulare. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούνται διαφορετικές συσκευές μπορεί να παρουσιασθούν αποκλίσεις του 1-2 C, οι οποίες όμως είναι ίδιες και για τα τρία σημεία τήξης. Διάφορες συνθήκες εκχύλισης και οι από αυτές προκύπτουσες καταστάσεις ρυθμιστικών διαλυμάτων μπορούν να οδηγήσουν σε μικρή απόκληση του σημείου τήξης ενός δείγματος από εκείνου των παρεχομένων προτύπων. Η διαδικασία της PCR πρέπει να επαναλαμβάνεται στη περίπτωση απόκλησης του σημείου τηξης ενός δείγματος μεγαλύτερες από ± 1 C από εκείνου των παρεχομένων προτύπων. Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (M. avium LC Control, M. intracellulare LC Control) για την ανίχνευση όλων των υποειδών του M. avium και του M. intracellulare. Ενας προσδιορισμός του φορτίου του παθογόνου παράγοντα για το σύμπλεγμα του M. tuberculosis μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη βοήθεια των προτύπων ποσοτικοποίησης του artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015 9

10 M. tuberculosis που περιέχονται επιπλέον στο κιτ (M. tuberculosis LC QS 1-4) vorgenommen werden. Ανατρέξτε σχετικά στην ενότητα 8.3 Ποσοτικοποίηση. 8. Πρωτόκολλο 8.1 Απομόνωση DNA Πριν από την κυρίως απομόνωση DΝΑ, κατά την εξέταση μεγάλου όγκου ή ισχυρών όξυνων δειγμάτων, είναι απαραίτητη μία συγκέντρωση ή εξουδετέρωση των υλικών, αντίστοιχα. Κατά την εξέταση πτυέλου προτείνουμε μία απολύμανση με NALC-NAOH, ενώ το γαστρικό υγρό θα πρέπει να εξουδετερωποιηθεί με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού άλατος. Μετά από τη φυγοκέντρηση που ακολουθεί, μπορεί το βακτηριακό ίζημα να επεξεργασθεί περεταίρω. Κιτ απομόνωσης DNA διατίθενται από διάφορους κατασκευαστές. Ανάλογα με το πρωτόκολλο του επιλεγμένου κατασκευαστή, χρησιμοποιήστε την καθορισμένη ποσότητα δείγματος για απομόνωση και εκτελέστε την απομόνωση DNA σύμφωνα με τις οδηγίες. Συνιστώνται τα ακόλουθα κιτ απομόνωσης: Υλικό δείγματος Κιτ απομόνωσης Αρ. καταλόγου Κατασκευαστής Φορέας RNA Πτύελο, BΚΕ, βρογχιακό έκκριμα, ΕΝΥ, γαστρικό υγρό, υγρό περιτοναïκής παρακέντησης QIAamp DNA Mini Kit (50) QIAGEN δεν περιέχεται Σημαντικό: Είναι σημαντικό να ακολουθήσετε τις οδηγίες του Παραρτήματος D ( Protocols for bacteria [Πρωτόκολλα για βακτήρια]) που περιγράφονται στο Εγχειρίδιο των κιτ QIAamp DNA Mini και Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). Για την εξασφάλιση μιας αποτελεσματικής μη μολυσματικής επαφής με τα μυκοβακτηρίδια, προτείνουμε να ακολουθήσετε 10 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

11 επειγόντως τις ακόλουθες αλλαγές (έντονα τυπωμένες) του QIAamp DNA Mini Kit πρωτοκόλλου D: Σημαντικό: Όλα τα στάδια επεξεργασίας με πιπέτα, πριν από την επώαση στους 95 C, πρέπει να εκτελούνται σε θάλαμο ασφάλειας της κλάσης 2, λόγω των δυνητικά μολυσματικών δειγμάτων. Μεταφέρετε μεταξύ 250 µl και 500 µl του με NALC-NaOH επεξεργασμένου δείγματος σε σωληνάρια 1,5 ml με βιδωτό κάλυμμα. Φυγοκεντρήστε σε x g ( στρ./λεπτό) για 10 λεπτά σε επιτραπέζια φυγόκεντρο. Παραλάβετε το υπερκείμενο υγρό με πιπέτα και απομακρύνετέ το. Προσθέστε 180 µl μίγμα λυσοζύμης (20 mg/ml λυσοζύμη; 20 mm Tris-HCl (ph 8,0); 2 mm EDTA; 1,2 % Triton ) και αναμίξτε το ίζημα με τη χρήση πιπέτας. Επωάστε το δείγμα στους 37 C, το λιγότερο για μία ώρα, σε μονάδα θέρμανσης. Φυγοκεντρήστε το δείγμα για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Προσθέστε 20 μl Πρωτεϊνάσης Κ και 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΑL συμπληρωμένου με RNA φορέα (2 μg RNA Homopolymer Poly[rA], δεν περιλαμβάνεται στο κιτ QIAamp DNA Mini, ανά 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος AL) και προαιρετικά 10 μl προτύπου εσωτερικού ελέγχου (βλ. 8.2 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου). Αναμίξτε το δείγμα καλά με αναδευτήρα Vortex. Επωάστε το δείγμα στους 56 C για 30 λεπτά σε μονάδα θέρμανσης. Τελικά, φυγοκεντρήστε το δείγμα για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Επωάστε το δείγμα στους 95 C για 15 λεπτά (ο χρόνος επώασης δεν πρέπει να υπερβαίνεται, γιατί το DNA μπορεί να αποικοδομηθεί). Σημαντικό: Παρακαλούμε λάβετε υπόψη ότι τα δείγματα δεν είναι πλέον μολυσματικά, μόνο μετά το τέλος της επώασης στους 95 C. Αφήστε το δείγμα να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

12 Φυγοκεντρήστε το δείγμα για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Ακολουθήστε το "Protocol: DNA Purification from Tissues" (Πρωτόκολλο: Καθαρισμός DNA από ιστούς) στο Εγχειρίδιο κιτ QIAamp DNA Mini και Blood Mini (Δεύτερη έκδοση, Νοέμβριος 2007) ξεκινώντας με την προσθήκη αιθανόλης στο βήμα 6 και εκτελέστε την τελική έκλουση DNA χρησιμοποιώντας 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος AE. Σημαντικές παρατηρήσεις για την αποφυγή διασταυρωμένων μολύνσεων: a) Σχετικά με τη λύση των βακτηρίων: Η χρησιμοποίηση σωληναρίων με βιδωτά καλύμματα είναι απολύτως απαραίτητη. Τα σωληνάρια πρέπει πάντοτε να είναι καλά κλεισμένα. Φυγοκεντρήστε το δείγμα για μικρό χρονικό διάστημα μετά από κάθε στάδιο επώασης, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Μην έρχεστε σε επαφή με το εσωτερικό του καλύμματος των σωληναρίων. Εάν συμβεί αυτό, παρακαλούμε αλλάξτε αμέσως τα δυνητικά μολυσμένα γάντια. Γενικά δεν προτείνεται η χρησιμοποίηση λουτρού ύδατος. Σιγουρευτείτε ότι τα δείγματα ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου μετά το βήμα των 95 C, γιατί διαφορετικά ο κίνδυνος μιας μόλυνσης μέσω αερολυμάτων είναι πολύ υψηλός. b) Σχετικά με την απομόνωση του DNA: Σιγουρευτείτε ότι το υγρό της πιπέτας δεν έρχεται σε επαφή με τα τοιχώματα μιας στήλης QIAamp. Μην έρχεστε σε επαφή με το εσωτερικό του καλύμματος μιας στήλης QIAamp. Εάν συμβεί αυτό, παρακαλούμε αλλάξτε αμέσως τα δυνητικά μολυσμένα γάντια. Μη χρησιμοποιείτε το ίδιο ρύγχος πιπέτας για διαφορετικά δείγματα, καθώς και για την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης AW1 και AW2 ή του ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης AE. Έτσι 12 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

13 αποφεύγεται μία διασταρωμένη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων καθώς και μία μόλυνση ενός ρυθμιστικού διαλύματος. Χρησιμοποιείτε κάθε 2 ml Collection Tube μόνο μία φορά. Εάν δεν έχετε στη διάθεση σας ικανή ποσότητα Collection Tubes, χρησιμοποιήστε αντί αυτών σωληνάρια 2 ml, των οποίων το κάλυμμα μπορεί να απομακρυνθεί. Γενικές παρατηρήσεις Η προσθήκη του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της απομόνωσης και επομένως για την παραλαβή του DNA/RNA. Εάν το επιλεγμένο κιτ δεν περιέχει RNA φορέα, λάβετε υπόψη πως συνιστάται επισταμένως η προσθήκη φορέα (RNA Homopolymer Poly[rA]) για την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων από σωματικά υγρά χωρίς κύτταρα και υλικό με χαμηλή περιεκτικότητα DNA/RNA (π.χ. ΕΝΥ). Παρακαλούμε συνεχίστε κατά τον ακόλουθο τρόπο: a) Αναμίξτε το λυοφιλοποιημένο φορέα RNA με το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης (όχι με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) του κιτ απομόνωσης (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα AE του QIAamp DNA Mini Kit) και παρασκευάστε μία αραίωση με συγκέντρωση 1 µg/µl. Διαμοιράστε το διάλυμα αυτό του φορέα RNA στον ανάλογο αριθμό ποσοτήτων που αντιστοιχεί στις ανάγκες σας και φυλάξτε αυτές στους -20 C. Αποφύγετε την επαναληπτική απόψυξη (> 2 x) των ποσοτήτων του φορέα RNA. b) Πριν από κάθε απομόνωση προσθέστε 1 µg φορέα RNA ανά 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Εάν π χ το πρωτόκολλο εκχύλισης προβλέπει 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ανά δείγμα, τότε προσθέστε 2 µl φορέα RNA (1 µg/µl) κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Πριν από την έναρξη κάθε απομόνωσης πρέπει να παρασκευασθεί ένα πρόσφατο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA (και εάν είναι απαραίτητο προτύπου εσωτερικού ελέγχου, βλέπε 8.2 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου) σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

14 Αριθμός δειγμάτων 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης π.χ. 200 µl π.χ µl Φορέας RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 202 µl µl Όγκος για την απομόνωση 200 µl ανά 200 µl c) Για την απομόνωση χρησιμοποιήστε το πρόσφατα παρασκευασμένο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA αμέσως. Αποθήκευση του μίγματος δεν είναι δυνατή. Σε διαδικασίες απομόνωσης, στις οποίες χρησιμοποιείται ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης που περιέχει αιθανόλη, βεβαιωθείτε οπωσδήποτε ότι πριν από την εκχύλιση εκτελείται ένα επιπλέον βήμα φυγοκέντρησης (3 λεπτά, στρ./λεπτό) για την απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Αυτό εμποδίζει πιθανές αναστολές της PCR. Το artus M. tuberculosis LC PCR Kit δεν είναι κατάλληλο για διαδικασίες απομόνωσης που λειτουργούν με βάση τη φαινόλη. Formatiert: Nummerierung und Aufzählungszeichen Σημαντικό: Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus Mycobac. diff. LC PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε 8.2 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου). 8.2 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Mycobac. diff. LC IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR (βλέπε Εικ. 1). Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου εκχύλισης. Χρησιμοποιήστε, για παράδειγμα, το QIAamp DNA Mini Kit και εκτελέστε την εκχύλιση του DNA σε 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος AE και στη συνέχεια προσθέστε 10 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Η ποσότητα του προστιθέμενου προτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται μόνο από τον όγκο εκχύλισης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και εάν είναι απαραίτητο ο φορέας RNA (βλέπε 8.1 Απομόνωση DNA) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή 14 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

15 κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης). Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Προαιρετικά, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR (βλέπε Εικ. 2). Για το σκοπό αυτό, προσθέστε για κάθε αντίδραση 0,5 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και 2 µl Mycobac. diff. LC Mg-Sol απευθείας σε 13 µl Mycobac. diff. LC Master. Χρησιμοποιήστε για κάθε αντίδραση PCR 15 µl του όπως αναφέρεται παρασκευαζόμενου Master Mix * και στη συνέχεια προσθέστε 5 µl του καθαρισμένου δείγματος. Εάν θέλετε να εκτελέσετε μία διαδικασία για πολλά δείγματα, αυξήστε τις απαραίτητες ποσότητες του Mycobac. diff. LC Master, του Mycobac. diff. LC Mg-Sol και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ανάλογα με τον αριθμό δειγμάτων (βλέπε 8.4 Προετοιμασία της PCR). 8.3 Ποσοτικοποίηση Παρακαλούμε λάβετε υπόψη την τελευταία παράγραφο στο κεφάλαιο 7. Περιγραφή προϊόντος. Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (Mycobac. diff. LC QS 1-4) επιτρέπουν τον προσδιορισμό του φορτίου του παθογόνου παράγοντα του * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

16 συμπλέγματος M. Tuberculosis. Χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και προστίθενται στον ίδιο όγκο (5 µl). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης στο όργανο LightCycler, τοποθετήστε και τα τέσσερα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης, ως ακολούθως: Οργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 Ορίστε τα Mycobac. diff. LC QS 1-4 ως πρότυπα στην Sample Loading Screen και προσθέστε τις καθορισμένες συγκεντρώσεις (βλέπε LightCycler Operator s Manual, Version 3.5, Chapter B, 2.4. Sample Data Entry). Οργανο LightCycler 2.0 Για τον ορισμό των προτύπων ενεργοποιήστε στη γραμμή του μενού του παραθύρου Samples τη λειτουργία Analysis Type και επιλέξτε Absolute Quantification. Ετσι μπορούν τα Mycobac. diff. LC QS 1-4 να ορισθούν ως πρότυπα και να καταχωρηθούν οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις (βλέπε LightCycler Operator s Manual, Version 4.0, Chapter 2.2 Entering Sample Information). Βεβαιωθείτε, ότι η λειτουργία Enable Controls δεν είναι ενεργοποιημένη, γιατί διαφορετικά αυτή οδηγεί σε περιορισμούς στην εκλογή των επιλογών της ανάλυσης, κατά την αξιολόγηση των δεδομένων (βλέπε 9.2 Αξιολόγηση των δεδομένων της PCR στο όργανο LightCycler 2.0). Αυτή η πρότυπη καμπύλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τις επόμενες ποσοτικοποιήσεις, όταν στην τρέχουσα ανάλυση περιλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο μιας συγκεκριμένης συγκέντρωσης. Για το σκοπό αυτό είναι αναγκαία η εισαγωγή της πρότυπης καμπύλης που είχε δημιουργηθεί προηγουμένως (βλέπε LightCycler Operator s Manual, Version 3.5, Chapter B, Quantification with an External Standard Curve ή Version 4.0, Chapter Saving a Standard Curve). Ωστόσο, σε αυτήν τη μορφή ποσοτικοποίησης πρέπει να ληφθεί υπόψη η πιθανότητα απόκλισης στο αποτέλεσμα λόγω της μεταβλητότητας μεταξύ των διαδικασιών PCR. Λάβετε υπόψη: Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/µl. Για τη μετατροπή των τιμών που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη σε αντίγραφα/ml υλικού δείγματος πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: 16 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

17 Αποτέλεσμα (αντίγρ/ml) = Αποτέλεσμα (αντίγρ/µl) x Όγκος εκχύλισης (µl) Όγκος δείγματος (ml) Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). Σημαντικό: Για την απλούστευση της ποσοτικής αξιολόγησης συστημάτων artus στο όργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 ή LightCycler 2.0 θα βρείτε σχετικές οδηγίες στην ιστοσελίδα (Technical Note for quantitation on the LightCycler 1.1/1.2/1.5 or LightCycler 2.0 Instrument). 8.4 Προετοιμασία της PCR Βεβαιωθείτε ότι το Cooling Block (μονάδα ψύξης) με τους περιεχόμενους προσαρμογείς (εξάρτημα του οργάνου LightCycler) έχει προψυχθεί στους +4 C. Τοποθετήστε τον απαραίτητο για τις προγραμματισμένες αντιδράσεις αριθμό τριχοειδών σωληναρίων LightCycler στον προσαρμογέα του Cooling Block. Φροντίστε για κάθε διαδικασία PCR να υπάρχει τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1 4) ή ένα θετικό πρότυπο ελέγχου (M. avium LC Control, M. intracellulare LC Control) καθώς και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, για τον προσδιορισμό του φορτίου του παθογόνου παράγοντα του συμπλέγματος M. Tuberculosis, χρησιμοποιήστε για κάθε διαδικασία PCR όλα τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης σε θερμοκρασία δωματίου, να αναμιγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και τελικά να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

18 Για την περίπτωση που με το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου θέλετε να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία πιθανή ενδεχομένη αναστολή της PCR, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου πρέπει ήδη να έχει προστεθεί για την απομόνωση (βλέπε 8.2 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου). Στην περίπτωση αυτή, χρησιμοποιήστε το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε και τη σχηματική επισκόπηση στην Εικ. 1): 1. Προετοιμασία του Master Mix 2. Προετοιμασία της αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Mycobac. diff. LC Master 13 µl 156 µl Mycobac. diff. LC Mg-Sol 2 µl 24 µl Mycobac. diff. LC IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl ανά 15 µl Δείγμα 5 µl ανά 5 µl Συνολικός όγκος 20 µl ανά 20 µl Εάν θέλετε να χρησιμοποιήσετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, θα πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο Mycobac. diff. LC Master. Στην περίπτωση αυτή, χρησιμοποιήστε το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε και τη σχηματική επισκόπηση στην Εικ. 2): 1. Προετοιμασία του Master Mix 2. Προετοιμασία της αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Mycobac. diff. LC Master 13 µl 156 µl Mycobac. diff. LC Mg-Sol 2 µl 24 µl Mycobac. diff. LC IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 15 µl * 180 µl Master Mix 15 µl ανά15 µl Δείγμα 5 µl ανά 5 µl Συνολικός όγκος 20 µl ανά 20 µl Εισαγάγετε με την πιπέτα στο πλαστικό δοχείο κάθε τριχοειδούς σωλήνα 15 µl του Master Mix. Στη συνέχεια προσθέστε 5 µl από το εκχύλισμα του * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 18 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

19 απομονωμένου DNA. Αντίστοιχα πρέπει να προστεθούν ως θετικό πρότυπο ελέγχου 5 µl από ένα τουλάχιστον πρότυπο ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4) ή ένα από τα πρότυπα ελέγχου (M. avium LC Control, M. intracellulare LC Control) και ως αρνητικό πρότυπο ελέγχου 5 µl νερό (Water, PCR grade). Κλείστε τους τριχοειδείς σωλήνες. Για να μεταφέρετε το μίγμα από το πλαστικό δοχείο στους τριχοειδείς σωλήνες, φυγοκεντρήστε τους προσαρμογείς με τους τριχοειδείς σωλήνες που περιέχονται σε αυτούς σε μία επιτραπέζια φυγόκεντρο για δέκα δευτερόλεπτα σε 400 x g (2.000 στρ./λεπτό) κατ' ανώτατο όριο. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

20 Προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στην απομόνωση καθαρισμός μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/ υλικού δείγματος + 0,1 μl IC* ανά 1 μl όγκου εκχύλισης 2 µl Mg-Sol* 13 µl artus Master* 5 μl καθαρού δείγματος* 15 µl Master Mix* γυάλινοι τριχοειδείς σωλήνες LightCycler Εικ. 1: Σχηματική απεικόνιση της ροής εργασιών για τον έλεγχο της απομόνωσης και της αναστολής της PCR. * Σε κάθε βήμα επεξεργασίας με πιπέτα πρέπει οπωσδήποτε να φροντίσετε για την πλήρη απόψυξη, την καλή ανάμιξη και τη σύντομη φυγοκέντρηση των διαλυμάτων που θα χρησιμοποιηθούν. 20 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

21 Προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο artus Master 2 µl Mg-Sol* 0,5 µl IC* 13 µl artus Master* καθαρισμός 15,5 µl Master Mix* 5 μl καθαρού δείγματος* 15 µl Master Mix* γυάλινοι τριχοειδείς σωλήνες LightCycler Εικ. 2: Σχηματική απεικόνιση της ροής εργασιών για τον έλεγχο της αναστολής της PCR. * Σε κάθε βήμα επεξεργασίας με πιπέτα πρέπει οπωσδήποτε να φροντίσετε για την πλήρη απόψυξη, την καλή ανάμιξη και τη σύντομη φυγοκέντρηση των διαλυμάτων που θα χρησιμοποιηθούν. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

22 8.5 Προγραμματισμός των οργάνων LightCycler Προγραμματισμός του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 Για την ανίχνευση του DNA των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis και M. avium δημιουργήστε στο όργανό σας LightCycler 1.1/1.2/1.5 ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα πέντε στάδια εργασίας (βλέπε Εικ. 3-7). A. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου Hot Start Εικ. 3 B. Στάδιο Touch Down Εικ. 4 C. Πολλαπλασιασμός του DNA Εικ. 5 D. Καμπύλη τήξης Εικ. 6 E. Ψύξη Εικ. 7 Προσέξτε ιδιαίτερα τις ρυθμίσεις που αφορούν τις παραμέτρους Analysis Mode (Τρόπος λειτουργίας ανάλυσης), Cycle Program Data (Δεδομένα προγράμματος κυκλοποίησης) και Temperature Targets (Στόχοι θερμοκρασίας). Στις εικόνες οι ρυθμίσεις αυτές επισημαίνονται με μαύρο πλαίσιο. Οδηγίες για τον προγραμματισμό του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 θα βρείτε στο LightCycler Operator s Manual. 22 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

23 Εικ. 3: Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου Hot Start. Εικ. 4: Στάδιο Touch Down. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

24 Εικ. 5: Πολλαπλασιασμός του DNA. Εικ. 6: Καμπύλη τήξης. 24 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

25 Εικ. 7: Ψύξη. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

26 8.5.2 Προγραμματισμός του οργάνου LightCycler 2.0 Για τον προγραμματισμό μιας διαδικασίας PCR με το όργανο LightCycler 2.0 ενεργοποιήστε στη γραμμή του μενού την επιλογή New και κατόπιν επιλέξτε LightCycler Experiment. Ακολούθως, για την ανίχνευση του DNA των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis και M. avium στο δικό σας όργανο LightCycler 2.0, μπορείτε να δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα πέντε στάδια (βλέπε Πίνακας 1). A. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου Hot Start B. Στάδιο Touch Down C. Πολλαπλασιασμός του DNA D. Καμπύλη τήξης E. Ψύξη Σιγουρευτείτε ότι αρχικά έχει καταχωρηθεί ο αριθμός των προετοιμασμένων τριχοειδών σωλήνων, γι αυτή την διαδικασία της PCR (Max. Seek Pos.) (βλέπε Εικ. 8). Πίνακας 1: Δημιουργία του προφίλ θερμοκρασίας. Program Ενεργοποίηση Touch Down Πολλαπλασιασμός του DNA Καμπύλη τήξης Target [ C] Hold [hh:mm:ss] Ramp Rate [ C/s] Sec Target Step Size [ C] Step Delay [cycles] Acq. Mode Cycles Analysis Mode 95 00:00: None 1 None 95 00:00: None 65 00:00: None 72 00:00: None 95 00:00: None 55 00:00: Single 72 00:00: None 95 00:00: None 45 00:00: None 80 00:00:00 0, Cont. 10 None 40 1 Quantification Melting Curves Ψύξη 40 00:00: None 1 None Στην καταχώρηση των ειδικών χαρακτηριστικών των δειγμάτων ενεργοποιήστε το πλήκτρο Samples. 26 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

27 Ακολούθως καταχωρήστε στο παράθυρο Fenster Capillary View τον ολικό αριθμό προβλεπομένων μιγμάτων PCR για την διαδικασία PCR (Sample Count). Τελικά μπορείτε να καταχωρήσετε τα ονόματα των δειγμάτων υπό την επιλογή Sample Name. Διαλέξτε ακόμα, υπό την επιλογή Selected Channels, τα κανάλια φθορισμού 640 για την ανίχνευση της αναλυτικής PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium και 705 για την ανίχνευση της PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Για τον ορισμό των προτύπων και την καταχώρηση των αντιστοίχων συγκεντρώσεων, επιλέξτε υπό την Analysis Type την επιλογή Absolute Quantification (βλέπε 8.3 Ποσοτικοποίηση). Βεβαιωθείτε, ότι η λειτουργία Enable Controls δεν είναι ενεργοποιημένη, γιατί διαφορετικά αυτή οδηγεί σε περιορισμούς στην εκλογή των επιλογών της ανάλυσης κατά την αξιολόγηση των δεδομένων (μέθοδος Fit Points δεν είναι διαθέσιμη, βλέπε 9.2 Αξιολόγηση των δεδομένων της PCR στο όργανο LightCycler 2.0). Υπό την επιλογή Target Name μπορείτε να καταχωρήστε τις τελικές αλληλουχίες (Συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium ή Προτύπου εσωτερικού ελέγχου) που ανιχνεύονται στα επιλεγμένα κανάλια φθορισμού 640 και 705. Η συμπλήρωση της στήλης Target Name μπορεί να γίνει ευκολότερα με τη λειτουργία Auto Copy... Ο ορισμός του Target Name βοηθά στην καλύτερη επισκόπηση, αλλά δεν είναι οπωσδήποτε απαραίτητος για την ανάλυση των δεδομένων. Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης κατά την ανάλυση των δεδομένων, πρέπει τα πρότυπα ποσοτικοποίησης να καθορισθούν με τις αντιστοίχες συγκεντρώσεις τους. Για τον λόγο αυτό επιλέξτε Standard υπό την επιλογή Sample Type και καταχωρήστε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις υπό την επιλογή Concentration. Το προγραμματισμένο προφίλ θερμοκρασίας μπορεί να αποθηκευθεί στον σκληρό δίσκο του υπολογιστή, για να μπoρεί να χρησιμοποιηθεί ξανά σε επόμενες διαδικασίες. Για τον σκοπό αυτό ενεργοποιήστε υπό το μενού File τη λειτουργία Save As... Στο παράθυρο που ανοίγεται στη συνέχεια, artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

28 επιλέξτε υπό τις επιλογές Templates and Macros το υπομενού Run Templates και αποθηκεύστε εκεί τα δεδομένα υπό ένα κατάλληλο όνομα. Για να ξεκινήσετε την διαδικασία της PCR, πηγαίνετε στην επιφάνεια Run και ενεργοποιήστε τη λειτουργία Start Run (βλέπε Εικ. 8). Το πρόγραμμα της PCR θα ξεκινήσει μετά τον καθορισμό του μέρους για την αποθήκευση των δεδομένων. Εικ. 8: Εναρξη της διαδικασίας PCR. 28 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

29 9. Αξιολόγηση 9.1 Αξιολόγηση των δεδομένων της PCR στο όργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5 Για την ανάλυση των δεδομένων της PCR που συλλέχθηκαν με το όργανο LightCycler 1.1/1.2/1.5, προτείνουμε την χρησιμοποίηση του λογισμικού του LightCycler έκδοση 3.5. Στις αναλύσεις πολλών χρωμάτων προκύπτουν παρεμβολές μεταξύ των φθοριομετρικών καναλιών. Το λογισμικό του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 περιέχει ένα αρχείο με το χαρακτηρισμό Color Compensation File, το οποίο αντισταθμίζει αυτές τις παρεμβολές. Το αρχείο αυτό μπορείτε να το ανοίξετε πριν, κατά τη διάρκεια ή μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης της PCR με το πάτημα του πλήκτρου Choose CCC File ή Select CC Data.Εάν δεν υπάρχει εγκατεστημένο αρχείο Color Compensation File, δημιουργήστε το οι ίδιοι με βάση τις οδηγίες που υπάρχουν στο LightCycler Operator s Manual. Μετά την ενεργοποίηση του Color Compensation File εμφανίζονται στα φθοριομετρικά κανάλια F1, F2 και F3 ξεχωριστά σήματα. Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της PCR, η οποία επιτυγχάνεται με το artus Mycobac. diff. LC PCR Kit, παρακαλούμε επιλέξτε τις λειτουργίες προβολής F2/Back-F1 για την αναλυτική PCR του του συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium, ή F3/Back-F1 για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Για την ανάλυση ποσοτικών διαδικασιών παρακαλούμε να λάβετε οπωσδήποτε υπόψη την ενότητα 8.3 Ποσοτικοποίηση, καθώς και την Technical Note for quantitation on the LightCycler 1.1/1.2/1.5 Instrument, στην ιστοσελίδα Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα: 1. Στο φθοριομετρικό κανάλι F2/Back-F1 ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει DΝΑ ενός ή περισσοτέρων μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis και/ή του συμπλέγματος M. avium. artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

30 Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι F3/Back-F1 είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης μυκοβακτηριακό-dna (θετικό σήμα στο κανάλι F2/Back-F1) ενδέχεται να οδηγούν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι F3/Back-F1 (Ανταγωνισμός). Μία διαφοροποίηση του συμπλέγματος M. tuberculosis από τα διάφορα υποείδη του M. avium και από το M. intracellulare μπορεί να εκτελεσθεί βάσει του σημείου τήξης (κανάλι F2/Back-F1, πρόγραμμα Melting Curve). Ετσι ένα σημείο τήξης 60 C παραπέμπει στα μέλη του συμπλέγματος M. tuberculosis, ένα 63,5 C στο M. avium και ένα 55 C στο M. intracellulare. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούνται διαφορετικές συσκευές μπορεί να παρουσιασθούν αποκλίσεις του 1-2 C, οι οποίες όμως είναι ίδιες και για τα τρία σημεία τήξης. Διάφορες συνθήκες εκχύλισης και οι από αυτές προκύπτουσες καταστάσεις ρυθμιστικών διαλυμάτων μπορούν να οδηγήσουν σε μικρή απόκληση του σημείου τήξης ενός δείγματος από εκείνου των παρεχομένων προτύπων. Η διαδικασία της PCR πρέπει να επαναλαμβάνεται στη περίπτωση απόκλησης του σημείου τηξης ενός δείγματος μεγαλύτερες από ± 1 C από εκείνου των παρεχομένων προτύπων. Για μερικά μυκοβακτηριακά είδη μπορεί να παρατηρηθούν αποκλίσεις των σημείων τήξης από τις δεδομένες θερμοκρασίες (βλέπε 10. Αντιμετώπιση προβλημάτων). 2. Στο φθοριομετρικό κανάλι F2/Back-F1 δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα, παρά μόνο στο κανάλι F3/Back-F1 (σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου). Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο DΝΑ των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis ή M. avium. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis ή M. avium είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. 30 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

31 3. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια F2/Back-F1 ή F3/Back- F1. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο 10. Αντιμετώπιση προβλημάτων. Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR εμφανίζονται στις εικόνες Εικ. 9: Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4) και των θετικών προτύπων ελέγχου (M. avium LC Control, M. intracellulare LC Control) στο φθοριομετρικό κανάλι F2/Back-F1 του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5. NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

32 Εικ. 10: Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο φθοριομετρικό κανάλι F3/Back-F1 του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4) και των θετικών προτύπων ελέγχου (M. avium LC Control, M. Intracellulare LC Control). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). 32 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

33 Εικ. 11: Διαφοροποίηση μεταξύ του συμπλέγματος M. tuberculosis και M. avium στο φθοριομετρικό κανάλι F3/Back-F1 του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 (Πρόγραμμα Melting Curve). artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

34 9.2 Αξιολόγηση των δεδομένων της PCR στο όργανο LightCycler 2.0 Για την ανάλυση των δεδομένων της PCR που συλλέχθηκαν με το όργανο LightCycler 2.0 χρησιμοποιήστε το λογισμικό του LightCycler έκδοση 4.0. Ακόμα, λάβετε υπόψη τις υποδείξεις στο LightCycler 2.0 Instrument Operator's Manual Version 4.0. Κατά την ανάλυση των δεδομένων της PCR, ακολουθήστε το επόμενο σχήμα (βλέπε Εικ. 12): Ενεργοποιήστε στη γραμμή του μενού τη λειτουργία Analysis και επιλέξτε την επιλογή Absolute Quantification, με την οποία κατά κανόνα πρέπει να αναλυθούν όλα τα δεδομένα του πολλαπλασιασμού που έχουν εξαχθεί με το artus LC PCR Kit. Το λογισμικό του LightCycler έκδοση 4.0 περιέχει ένα αρχείο με το χαρακτηρισμό Color Compensation File, το οποίο αντισταθμίζει τις παρεμβολές των σημάτων μεταξύ των καναλιών φθορισμού. Το αρχείο αυτό μπορείτε να το ανοίξετε κατά τη διάρκεια ή μετά την ολοκλήρωση της εκτέλεσης της PCR με το πάτημα του Color Comp (On/Off) και ακολούθως του Select Color Compensation πλήκτρου (βλέπε Εικ. 12). Εάν δεν υπάρχει εγκατεστημένο αρχείο Color Compensation File, δημιουργήστε το οι ίδιοι με βάση τις οδηγίες που υπάρχουν στο LightCycler Operator s Manual. Μετά την ενεργοποίηση του Color Compensation File εμφανίζονται ξεχωριστά σήματα στα κανάλια φθορισμού. Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της PCR, η οποία διεξάγεται με το artus Mycobac. diff. LC PCR Kit, παρακαλούμε επιλέξτε τις λειτουργίες προβολής 640/Back 530 για την αναλυτική PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium ή 705/back 530 για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. 34 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

35 Εικ. 12: Ενεργοποίηση του Color Compensation File και επιλογή του καναλιού φθορισμού. Για την ανάλυση ποσοτικών διαδικασιών παρακαλούμε να λάβετε ακόμη υπόψη την ενότητα 8.3 Ποσοτικοποίηση καθώς και την Technical Note for quantitation on LightCycler 2.0 Instrument στην ιστοσελίδα Μετά την ολοκλήρωση της ρύθμισης των επιλογών της ανάλυσης, ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα: 4. Στο κανάλι φθορισμού 640/Back 530 ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει DNA ενός ή περισσοτέρων μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis ή/και Μ. avium. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι 705/Back 530 είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του μυκοβακτηριακού- DNA (θετικό σήμα στο κανάλι 640/Back 530) ενδέχεται να οδηγούν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι 705/Back 530 (Ανταγωνισμός). artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

36 Μία διαφοροποίηση του συμπλέγματος M. tuberculosis από τα διάφορα υποείδη του M. avium και από το M. intracellulare μπορεί να εκτελεσθεί βάσει του σημείου τήξης (κανάλι 640/Back 530, πρόγραμμα Melting Curve). Ετσι ένα σημείο τήξης 60 C παραπέμπει στα μέλη του συμπλέγματος M. tuberculosis, ένα 63,5 C στο M. avium και ένα 55 C στο M. intracellulare. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούνται διαφορετικές συσκευές μπορεί να παρουσιασθούν αποκλίσεις του 1-2 C, οι οποίες όμως είναι ίδιες και για τα τρία σημεία τήξης. Διάφορες συνθήκες εκχύλισης και οι από αυτές προκύπτουσες καταστάσεις ρυθμιστικών διαλυμάτων μπορούν να οδηγήσουν σε μικρή απόκληση του σημείου τήξης ενός δείγματος από εκείνου των παρεχομένων προτύπων. Η διαδικασία της PCR πρέπει να επαναλαμβάνεται στη περίπτωση απόκλησης του σημείου τηξης ενός δείγματος μεγαλύτερες από ± 1 C από εκείνου των παρεχομένων προτύπων. Για μερικά μυκοβακτηριακά είδη μπορεί να παρατηρηθούν αποκλίσεις των σημείων τήξης από τις δεδομένες θερμοκρασίες (βλέπε 10. Αντιμετώπιση προβλημάτων). 5. Στο κανάλι φθορισμού 640/Back 530 δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα, παρά μόνο στο κανάλι 705/Back 530 (σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου). Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο DΝΑ μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis ή M. avium. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. 6. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια 640/Back 530 ή 705/Back 530. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο 10. Αντιμετώπιση προβλημάτων. Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR καθώς και για την ανάλυση της καμπύλης τήξης εμφανίζονται στις εικόνες artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

37 Εικ. 13: Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού 640/Back 530 του οργάνου LightCycler 2.0. NTC: nontemplate control (αρνητικό πρότυπο). Εικ. 14: Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού 705/Back 530 του οργάνου LightCycler 2.0 με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4). NTC: nontemplate control (αρνητικό πρότυπο). artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

38 Εικ. 15: Διαφοροποίηση μεταξύ του συμπλέγματος M. tuberculosis και M. avium στο κανάλι φθορισμού 640/Back 530 του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 (Πρόγραμμα Melting Curve). 38 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015

39 10. Αντιμετώπιση προβλημάτων Κανένα σήμα στα πρότυπα ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis LC QS 1-4) και στα θετικά πρότυπα ελέγχου (M. avium LC Control, M. intracellulare LC Control) στο κανάλι φθορισμού F2/Back-F1 ή 640/Back 530: Το κανάλι φθορισμού που επιλέξατε, κατά την ανάλυση των δεδομένων της PCR, δεν ανταποκρίνεται στα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου. Διαλέξτε, για την ανάλυση των δεδομένων, στο κανάλι φθορισμού F2/Back-F1 ή 640/Back 530 για την αναλυτική PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium και στο κανάλι φθορισμού F3/Back-F1 ή 705/Back 530 για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. O προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας του οργάνου LightCycler 1.1/1.2/1.5 ή LightCycler 2.0 είναι εσφαλμένος. Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με τα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου (βλέπε 8.5 Προγραμματισμός του οργάνου LightCycler). Εσφαλμένη διάταξη της αντίδρασης της PCR. Ελέγξτε τα στάδια εργασίας σας με τη βοήθεια του σχήματος επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε 8.4 Προετοιμασία της PCR) και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν αντιστοιχούν στις αναφερόμενες προδιαγραφές του κεφαλαίου 2. Αποθήκευση ή η ημερομηνία λήξης του artus Mycobac. diff. LC PCR Kit έχει περάσει. Παρακαλούμε ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ασθενές ή ανύπαρκτο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι φθορισμού F3/Back-F1ή 705/Back 530 με ταυτόχρονη απουσία ενός σήματος στο κανάλι F2/Back-F1 ή 640/Back 530 για την ειδική PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis/m. avium: artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/

40 Οι συνθήκες της PCR δεν αντιστοιχούν στο πρωτόκολλο. Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε ανωτέρω) και επαναλάβετε την PCR με διορθωμένες ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. Έγινε αναστολή της PCR. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε 8.1 Απομόνωση DNA) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Βεβαιωθείτε ότι κατά την απομόνωση του DNA το επιπλέον προτεινόμενο βήμα φυγοκέντρησης, για την απόλυτη απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης πριν από την εκχύλιση, έχει εκτελεστεί (βλέπε 8.1 Απομόνωση DNA). Υφίστανται απώλειες DNA κατά τον καθαρισμό. Εάν το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει προστεθεί στην απομόνωση, μπορεί η απουσία του σήματος του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να σημαίνει απώλειες DNA κατά τον καθαρισμό. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε 8.1 Απομόνωση DNA) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Οι συνθήκες αποθήκευσης για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ δεν αντιστοιχούν στις αναφερόμενες προδιαγραφές του κεφαλαίου 2. Αποθήκευση ή η ημερομηνία λήξης του artus Mycobac. diff. LC PCR Kit έχει περάσει. Παρακαλούμε ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέτα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Σήματα στα αρνητικά πρότυπα ελέγχου στο κανάλι φθορισμού F2/Back- F1 ή 640/Back 530 της αναλυτικής PCR. Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR. Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Εισάγετε με πιπέτα τα θετικά πρότυπα ελέγχου κατά κανόνα στο τέλος. 40 artus Mycobac. diff. LC PCR Kit 03/2015