artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο

Transcript

1 Απρίλιος 2009 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο Εκδοση 1 24 (Αρ.Καταλόγου ) 96 (Αρ.Καταλόγου ) Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με όργανα Rotor-Gene Q , EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R EL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής τεχνολογιών δειγμάτων και εξετάσεων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προϊόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι τα αποτελέσματα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα για: Απομόνωση του DNA, RNA και πρωτεϊνών Συστήματα εξετάσεων για νουκλεϊνικά οξέα και πρωτεΐνες Ερευνα microrna και RNAi Αυτοματοποίηση τεχνολογίας δειγμάτων και εξετάσεων Σκοπός μας είναι να σας δοθεί η δυνατότητα να έχετε έξοχες επιτυχίες και σημαντικές ανακαλύψεις. Για περισσότερες πληροφορίες επισκευθείτε την ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 4 Σύμβολα 4 Αποθήκευση 5 Προοριζόμενη χρήση 5 Περιορισμοί χρήσης προїόντος 5 Τεχνική εξυπηρέτηση 6 Πληροφορίες ασφάλειας 6 Ποιοτικός έλεγχος 6 Εισαγωγή 7 Αρχή 7 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες 7 Ειδικά χαρακτηριστικά 8 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια 15 Σημαντικές σημειώσεις 16 Γενικά μέτρα ασφάλειας 16 Συλλογή, φύλαξη και μεταφορά δειγμάτων 16 Απομόνωση DNA 17 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου 18 Ποσοτικοποίηση 18 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση 20 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 30 Παραπομπές 33 Πληροφορίες παραγγελιών 34 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 3

4 Περιεχόμενα του κιτ artus CMV RG PCR Kit (24) (96) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων Μπλε CMV RG Master 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κίτρινο CMV Mg-Sol* 600 µl 600 µl Κόκκινο CMV QS 1 (1 x 10 4 copies/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο CMV QS 2 (1 x 10 3 copies/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο CMV QS 3 (1 x 10 2 copies/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο CMV QS 4 (1 x 10 1 copies/µl) 200 µl 200 µl Πράσινο CMV IC 1000 µl 2 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl Εγχειρίδιο 1 1 * Διάλυμα μαγνησίου. Πρότυπο ποσοτικοποίησης. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. Σύμβολα <N> Το περιεχόμενο επαρκεί για <N> τεστ Ημερομηνία λήξης Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά 4 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

5 Περιεχόμενα Αριθμός Περιορισμοί θερμοκρασίας Νόμιμος κατασκευαστής Παραπομπή στις πληροφορίες που δίνονται στο εγχειρίδιο Σημαντικές οδηγίες Αποθήκευση Τα υλικά του artus CMV RG PCR Kit αποθηκεύονται στους -20 C και διατηρούνται μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέττα. Επαναληπτική απόψυξη/ψύξη (>2x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με τον τρόπο αυτό μειώνεται η ευαισθησία. Εάν τα αντιδραστήρια δεν χρησημοποιούνται τακτικά, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός τους. Αποθήκευση στους 2 8 C δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. Προοριζόμενη χρήση Το artus CMV RG PCR Kit ένα σύστημα πολλαπλασιασμού νουκλεϊνικών οξέων in vitro για τον ποσοτικό προσδιορισμό τουdna του CMV σε πλάσμα ανθρώπου. Το διαγνωστικό αυτό κιτ εξέτασης χρησιμοποιεί την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και είναι διαμορφωμένο για τη χρήση με τα όργανα Rotor-Gene Q. Περιορισμοί χρήσης προїόντος Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro. Η χρήση πρέπει να γίνεται από ειδικά εκπαιδευμένο και καταρτισμένο προσωπικό στις διαγνωστικές διαδικασίες in vitro (EN375). Η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. Προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στη συσκευασία και στις ετικέττες των επιμέρους στοιχείων. Τα αντιδραστήρια των οποίων έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 5

6 Τεχνική εξυπηρέτηση Στη QIAGEN είμαστε υπερήφανοι για την ποιότητα και την διαθεσιμότητα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης. Το τμήμα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης είναι πλαισιωμένο με έμπειρους επιστήμονες με ευρεία πρακτική και θεωριτική γνώση στις τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου και τη χρήση προїόντων της QIAGEN. Εάν έχετε γενικά ερωτήσεις που αφορούν το artus CMV RG PCR Kit ή προїόντα της QIAGEN, μην καθυστερείτε να έρθετε σε επαφή μαζί μας. Οι πελάτες της QIAGEN αποτελούν μια μεγάλη πηγή πληροφοριών όσον αφορά την προώθηση και τις ειδικές χρήσεις των προїόντων μας. Οι πληροφορίες αυτές είναι χρήσιμες για άλλους επιστήμονες καθώς και τους ερευνητές της QIAGEN. Για το λόγο αυτό λάβετε το θάρρος να επικοινωνήστε με μας εάν έχετε οποιεσδήποτε προτάσεις που αφορούν την παρουσίαση των προїόντων ή καινούργιες εφαρμογές κια τεχνικές. Για τεχνική εξυπηρέτηση και περισσότερες πληροφορίες παρακαλούμε επισκευθείτε το κέντρο τεχνικής υποστήριξής μας στην ιστοσελίδα ή τηλεφωνήστε μια από τις τεχνικές υπηρεσίες της QIAGEN ή τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλέπε το πίσω εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα ). Πληροφορίες ασφάλειας Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs). Στην επιγραμμική συλλογή μας των φυλλαδίων δεδομένων ασφάλειας, στην ιστοσελίδα μπορείτε να βρείτε για κάθε κιτ και κάθε περιεχόμενο του κιτ το εκάστοτε MSDS ως PDF αρχείο, το οποίο μπορείτε να διαβάζετε και να εκτυπώνετε. Καταστρέψτε τα απορρίματα δειγμάτων και ανάλυσης σύμφωνα με τους κανονισμούς σας ασφάλειας. Κλήση κινδύνου σε 24ωρη βάση Σε περίπτωση κινδύνου μπορείτε να πάρετε ιατρικές πληροφορίες όλο το 24ωρο στην αγγλική, γαλλική και γερμανική γλώσσα: Κέντρο πληροφοριών δηλητηριάσεων στο Mainz, Γερμανία Tel: Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το σύστημα πιστοποιητικού ποιοτικής διαχείρησης ISO της QIAGEN, ελέγχεται κάθε παρτίδα του artus CMV RG PCR Kit υπό καθορισμένα κριτήρια ελέγχου, για την εξασφάλιση μιας ομοιόμορφης ποιότητας του προϊόντος. 6 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

7 Εισαγωγή To artus CMV RG PCR Kit είναι ένα σύστημα έτοιμο προς χρήση για την ανίχνευση του DNA του CMV μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στο Rotor-Gene Q. To CMV RG Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 105 bp, του γονιδιώματος του CMV καθώς και για την άμεση ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.FAM του Rotor-Gene Πέραν αυτού, το artus CMV RG PCR Kit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Yellow του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.JOE του Rotor-Gene Το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του CMV δεν επηρεάζεται αρνητικά (βλέπε Αναλυτική ευαισθησία, σελίδα 8). Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (CMV QS 1-4), με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός της ποσότητας του DNA του ιού. Ανατρέξτε σχετικά στην ενότητα Ποσοτικοποίηση, σελίδα 18. Αρχή Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού, κατά την εξέλιξη της PCR (που σημαίνει πραγματικού χρόνου), επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR. * Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (CMV) μπορεί να ανιχνευτεί στο αίμα, στους ιστούς και πρακτικά σε όλα τα εκκρίματα των ατόμων που έχουν προσβληθεί. Συνεπώς, ο ιός μπορεί να μεταδοθεί δια του στόματος με σταγονίδια, με τη σεξουαλική επαφή, με μετάγγιση αίματος ή μεταμόσχευση οργάνων, ενδομήτρια ή περιγεννητικά. Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός προκαλεί κατά κανόνα μία ασυμπτωματική λοίμωξη, που παραμένει στο ανθρώπινο σώμα. Στην περίπτωση εμφάνισης συμπτωμάτων σε νέους ή ενήλικες, αυτά είναι παρόμοια με αυτά της μονοπυρήνωσης με εμφάνιση πυρετού, ελαφράς ηπατίτιδας και γενικό αίσθημα αδιαθεσίας. Περιστατικά βαρειάς λοίμωξης από κυτταρομεγαλοϊό παρατηρούνται κυρίως μετά από ενδομήτρια μετάδοση και σε άτομα που βρίσκονται σε ανοσοκαταστολή. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 7

8 Ειδικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία Τόσο το αναλυτικό όριο ανίχνευσης όσο και το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (όρια ευαισθησίας) υπολογίσθηκαν για το artus CMV RG PCR Kit. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση καθορίστηκε με τη βοήθεια κλινικών θετικών στον CMV δειγμάτων σε συνδυασμό με την ειδική μέθοδο εκχύλισης. Απεναντίας, το αναλυτικό όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε ανεξάρτητα από την επιλεγμένη μέθοδο εκχύλισης με τη χρήση του DNA του CMV γνωστής συγκέντρωσης. Για τον προσδιορισμό της αναλυτικής ευαισθησίας του artus CMV RG PCR Kit δημιουργήθηκε μία σειρά αραιώσεων γονιδιωματικού DNA του CMV από 10 ως την ονομαστική τιμή 0,00316 αντίγραφα/µl και αναλύθηκε στα όργανα Rotor-Gene σε συνδυασμό με το artus CMV RG PCR Kit. Οι έλεγχοι εκτελέστηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Η γραφική της αξιολόγηση στο Rotor-Gene 6000 εμφανίζεται στην Εικόνα 1. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης του artus CMV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Q/6000 και το Rotor-Gene 3000 βρίσκεται στα 0,36 αντίγραφα/µl (p = 0,05) και 0,24 αντίγραφα/µl (p = 0,05) αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι 0,36 αντίγραφα/µl ή 0,24 αντίγραφα/µl μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95 %. Εικόνα 1. Ανάλυση Probit: CMV (Rotor-Gene 6000). Αναλυτική ευαισθησία του artus CMV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Η αναλυτική ευαισθησία, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (QIAamp DSP Virus Kit) του artus CMV RG PCR Kit, στα όργανα Rotor-Gene, καθορίστηκε με μία σειρά αραιώσεων ιικού υλικού του CMV από 1000 ως την ονομαστική τιμή 0,316 αντίγραφα/ml του CMV σε κλινικά δείγματα πλάσματος. Αυτά υποβλήθηκαν σε μία εκχύλιση DNA με το QIAamp DSP Virus Kit (όγκος εκχύλισης: 0,5 ml, όγκος 8 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

9 έκλουσης: 60 μl). Κάθε ένα από τα οκτώ συνολικά στάδια αραίωσης αναλύθηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες, με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών, με τη βοήθεια του artus CMV RG PCR Kit. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Η γραφική της αξιολόγηση εμφανίζεται στην Εικόνα 2. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση του artus CMV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene 3000 βρίσκεται στα 57,1 αντίγραφα/ml (p = 0,05). Αυτό σημαίνει ότι 57,1 αντίγραφα/ml μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95 %. Εικόνα 2. Ανάλυση Probit: CMV (Rotor-Gene 3000). Αναλυτική ευαισθησία λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (QIAamp DSP Virus Kit, QIAGEN) του artus CMV RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Ειδικότητα Η ειδικότητα του artus CMV RG PCR Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο έχει ελεγχθεί η ανιχνευσιμότητα όλων των σχετικών στελεχών. Επιπλέον,η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 100 διαφορετικών δειγμάτων πλάσματος τα οποία ήταν αρνητικά στον CMV. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για τον CMV εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στο CMV RG Master. Μία ενδεχόμενη διασταυρωμένη αντίδραση του artus CMV RG PCR Kit, εξετάστηκε με τη χρήση της ομάδας ελέγχου που αναφέρεται στον πίνακα 1 (σελίδα 10). Κανένας απο τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Καμμία διασταυρωμένη αντίδραση δεν εμφανίστηκε με μικτές λοιμώξεις. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 9

10 Πίνακας 1. Ειδικός έλεγχος του κιτ με δυνητικά διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες. Ομάδα ελέγχου Ανθρώπινος ιός έρπητα 1 (Ιός απλού έρπητα 1) Ανθρώπινος ιός έρπητα 2 (Ιός απλού έρπητα 2) Ανθρώπινος ιός έρπητα 3 (Ιός ανεμοβλογιάς-έρπητα ζωστήρα) Ανθρώπινος ιός έρπητα 4 (Ιός Epstein-Barr) CMV (Cycling Green ή Cycling A.FAM)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Ανθρώπινος ιός έρπητα 6A + Ανθρώπινος ιός έρπητα 6B + Ανθρώπινος ιός έρπητα 7 + Ανθρώπινος ιός έρπητα 8 (Kaposi s sarcoma-associated + herpesvirus) Ιός ηπατίτιδας Α + Ιός ηπατίτιδας B + Ιός ηπατίτιδας C + Ανθρώπινος μη ανοσοποιητικός ιός 1 + Ανθρώπινος ιός Τ-κυτταρικής λευχαιμίας τύπος 1 + Ανθρώπινος ιός Τ-κυτταρικής λευχαιμίας τύπος 2 + Ιός δυτικού Νείλου + Εντεροϊός + Παρβοϊός B artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

11 Ακρίβεια Τα δεδομένα ακριβείας, για το artus CMV RG PCR Kit, συνελέχθηκαν μέσω των οργάνων Rotor-Gene και επιτρέπουν την εξακρίβωση της ολικής διακύμανσης του συστήματος ανάλυσης. H ολική διακύμανση προέρχεται από την μεταβλητότητα intra-assay (διασπορά δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης μέσα σε ένα πείραμα), την μεταβλητότητα inter-assay (διασπορά λόγω της χρήσης διαφόρων συσκευών του ίδιου τύπου από διάφορα άτομα εντός ενός εργαστηρίου) και την μεταβλητότητα inter-batch (διασπορά μέσω της χρήσης διαφορετικών παρτίδων). Τα αποκτώμενα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της τυπικής απόκλισης, της διακύμανσης και του συντελεστή μεταβλητότητας για την PCR του συγκεκριμένου παθογόνου παράγοντα και προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Τα δεδομένα αυτά συνελέχθηκαν, για το artus CMV RG PCR Kit, βάσει του προτύπου ποσοτικοποίησης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση (QS 4: 10 αντίγραφα/µl). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε βάσει των τιμών Ct των καμπύλων πολλαπλασιασμού. (C T : threshold cycle, Πίνακας 2, σελίδα 12) και των εξ αυτών δεδομένων ποσοτικών τιμών σε αντίγραφα/µl (Πίνακας 3, σελίδα 12). Βάσει των αποτελεσμάτων αυτών η ολική διασπορά ενός τυχαίου δείγματος της αναφερομένης συγκέντρωσης ανέρχεται στο 1,21% (C T ) ή 14,38% (συγκέντρωση) και για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο 1,93% (C T ). Οι τιμές αυτές βασίζονται στο σύνολο των επιμέρους τιμών των εξεταζομένων μεταβλητοτήτων. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

12 Πίνακας 2 : Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των τιμών C T. Intra-assay μεταβλητότητα: CMV QS 4 Intra-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-assay μεταβλητότητα: CMV QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-batch μεταβλητότητα: CMV QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Ολική διακύμανση: CMV QS 4 Ολική διακύμανση: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 Πίνακας 3. Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των ποσοτικών τιμών (σε αντίγραφα/µl). Intra-assay μεταβλητότητα: CMV QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: CMV QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: CMV QS 4 Ολική διακύμανση: CMV QS 4 Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 12 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

13 Ανθεκτικότητα Ο έλεγχος της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον προσδιορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus CMV RG PCR Kit. 100 αρνητικά στον CMV δείγματα πλάσματος αναμίχθηκαν με CMV με μία τελική συγκέντρωση των 170 αντιγράφων/ml (περίπου τριπλή συγκέντρωση των αναλυτικών ορίων ευαισθησίας). Μετά την εκχύλιση με το QIAamp DSP Virus Kit αναλύθηκαν με το artus CMV RG PCR Kit. Το ποσοστό αποτυχίας για τον CMV ανήλθε, για το σύνολο των δειγμάτων, στο 0 %. Η ανθεκτικότητα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ελέγχθηκε επιπλέον μέσω της απομόνωσης και της ανάλυσης 100 αρνητικών στον CMV δειγμάτων πλάσματος. Έτσι η ανθεκτικότητα του artus CMV RG PCR Kit ανέρχεται στο 99 %. Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα της επαναληψιμότητας, επιτρέπουν μια τακτική αξιολόγηση της απόδοσης του artus CMV RG PCR Kit καθώς και σύγκριση της απόδοσής του με άλλα προϊόντα. Τα δεδομένα αυτά αποκτώνται με τη συμμετοχή σε καθιερωμένα ειδικά προγράμματα. Διαγνωστική αξιολόγηση Το artus CMV RG PCR Kit αξιολογήθηκε σε μία μελέτη. Στη σύγκριση του artus CMV RG PCR Kit με το COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test, εξετάσθηκαν 156 αρχικά και αναδρομικά κλινικά δείγματα EDTA-πλάσματος. Τα δείγματα εξετάσθηκαν προηγουμένως στο πλαίσιο της διαγνωστικής ρουτίνας με θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, με το COBAS AMPLICOR CMV MONITOR. Το DNA του CMV για τον έλεγχο του artus CMV RG PCR Kit απομονώθηκε με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit, με την προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου του artus CMV RG PCR Kit στην απομόνωση και στη συνέχεια η ανάλυση έγινε στο Rotor-Gene Ο καθαρισμός και η ανάλυση των δειγμάτων για το COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή εντός της συσκευασίας. Και τα 11 δείγματα, τα οποία εξετάσθηκαν θετικά με το COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test, έδειξαν επίσης θετικό αποτέλεσμα με το artus CMV RG PCR Kit. Εξετάσθηκαν 123 αρνητικά από 145 δείγματα τόσο με το COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test όσο και με το artus CMV RG PCR Kit. Εμφανίστηκαν 22 αποκλίνοντα αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 4. Πίνακας 4. Αποτελέσματα της συγκριτικής έγκυρης μελέτης COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test + Αθροισμα artus CMV RG PCR Kit artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

14 Εάν τα αποτελέσματα του COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test λαμβάνονται ως αναφορά, η διαγνωστική ευαισθησία για το σύνολο των δειγμάτων του artus CMV RG PCR Kit είναι 100 % και η διαγνωστική ειδικότητα 84,8 %. H επανεξέταση των 22 δειγμάτων που παρουσίασαν απόκλιση με συμπληρωματικά τεστ, επικύρωσε τα αποτελέσματα των artus PCR Kits. Ετσι μπορεί να εξαχθεί ως αποτέλεσμα ότι η απόκλιση αυτή είναι εξαρτημένη από την υψηλότερη ευαισθησία του artus CMV RG PCR Kit. 14 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

15 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 17) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Οργανο Rotor-Gene Q ή Rotor-Gene* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και Cycling Yellow ή με κανάλια φθορισμού για Cycling A.FAM και Cycling A.JOE Rotor-Gene Q software version (Rotor-Gene 6000 software version , , ; Rotor-Gene 3000 software version ) Σειρές σωληναρίων και καλλυμάτων, 0,1 ml, για τη χρήση με κεφαλή 72 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Προαιρετικά: Σωληνάρια PCR, 0,2 ml, for για τη χρήση με κεφαλή 36 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Μονάδα ψύξης (Loading Block 72 x 0,1 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ή Loading Block 96 x 0,2 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα ελέγχονται, συντηρούνται και βαθμονομούνται τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

16 Σημαντικές σημειώσεις Γενικά μέτρα ασφάλειας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου(15 25 C), πριν αρχίσετε μια διαδικασία. Μετά την απόψυξη, ανάμιξη των υλικών (με επαναληπτική αναρρόφηση με πιπέτα ή με γρήγορο στροβιλισμό) και σύντομη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μονάδα ψύξης (72/96 well loading block). Συλλογή, φύλαξη και μεταφορά δειγμάτων Όλα τα δείγματα πρέπει να χειρίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι το EDTA ή κιτρικό πλάσμα ως το καταλληλότερο υλικό δείγματος για την ανίχνευση του CMV. Για αυτό το λόγο συνιστούμε τη χρήση των υλικών αυτών με το artus CMV RG PCR Kit. Η εγκυρότητα του artus CMV RG PCR Kit έγινε με τη χρήση δειγμάτων EDTAπλάσματος ανθρώπου. Δείγματα άλλων υλικών δεν ενδεικνύονται. Χρησιμοποιήστε μόνο το προτεινόμενο κιτ απομόνωσης νουκλεϊνικού οξέος (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 17) για την προετοιμασία των δειγμάτων. Για την ασφαλή χρήση υλικών δειγμάτων πρέπει να ακολουθούνται αυστηρά ειδικές οδηγίες που αφορούν τη συλλογή, φύλαξη και τη μεταφορά των δειγμάτων. Δειγματοληψία Κάθε αιματοληψία έχει σαν αποτέλεσμα τον τραυματισμό αιματοφόρων αγγείων (αρτηρίες, φλέβες, τριχοειδή αγγεία). Επιτρέπεται μόνο η χρήση άψογου και αποστειρωμένου υλικού. Για τη λήψη αίματος διατίθενται υλικά μιας χρήσης. Κατά την παρακέντηση των φλεβών δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται πολύ λεπτές βελόνες. Η φλεβική αιματοληψία πρέπει να γίνεται σε κατάλληλα σημεία της περιοχής του εσωτερικού του αγκώνα, του αντιβραχίου ή του μετακαρπίου. Το αίμα παραλαμβάνεται με τυποποιημένα σωληνάρια (κόκκινο κάλυμμα, Sarstedt ή ομοιότυπα σωληνάρια άλλου κατασκευαστή). Πρέπει να παραλαμβάνονται 5-10 ml μίγματος EDTA-αίματος. Τα σωληνάρια πρέπει, αμέσως μετά την παραλαβή του αίματος, να αναμειγνύονται με αναστροφή πολλές φορές (8 x, όχι ανατάραξη). Δείγματα από άτομα που λαμβάνουν ηπαρίνη δεν πρέπει να ελέγχονται (βλέπε Ανεπιθύμητες ουσίες, σελίδα 17). 16 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

17 Φύλαξη δειγμάτων Το ολικό αίμα θα πρέπει να διαχωρισθεί στο πλάσμα και τα κυτταρικά του στοιχεία μέσα σε διάστημα έξι ωρών, με φυγοκέντρηση στους x g για 20 λεπτά. Το διαχωρισμένο πλάσμα πρέπει να μεταφερθεί σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου. Η ευαισθησία της εξέτασης μπορεί να μειωθεί μέσω επαναληπτικής κατάψυξης ή μακροχρόνιας φύλαξης των δειγμάτων. Μεταφορά δειγμάτων Το υλικό των δειγμάτων θα πρέπει βασικά να αποστέλλεται σε μη εύθραυστα δοχεία, για να αποφεύγεται μία πιθανή μόλυνση από διαρροή του δείγματος. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού *. Ο χρόνος μεταφοράς δεν πρέπει να υπερβεί τις έξι ώρες. Δεν συνιστάται αποθήκευση των δειγμάτων στον τόπο λήψης τους. Ταχυδρομική αποστολή είναι δυνατή. Στο σημείο αυτό πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι νομικές υποδείξεις. Συνιστούμε την μεταφορά των δειγμάτων με υπηρεσία courier. Τα δείγματα αίματος πρέπει να αποστέλλονται υπό ψύξη (2 C μέχρι 8 C) και του πλάσματος υπό κατάψυξη (-15 C μέχρι 30 C). Ανεπιθύμητες ουσίες Υψηλές τιμές χολερυθρίνης ( 4,5 mg/dl) και λιπιδίων ( mg/dl) καθώς και αιμολυτικά δείγματα δεν επηρεάζουν καθόλου το αναλυτικό σύστημα. Η ηπαρίνη επηρεάζει την PCR. Δείγματα, τα οποία συλλέχθηκαν σε σωληνάρια που περιείχαν ηπαρίνη ως αντιπηκτικό, δεν ενδείκνυνται. Επίσης δείγματα από πρόσωπα που λαμβάνουν ηπαρίνη δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Απομόνωση DNA Το QIAamp DSP Virus Kit (QIAGEN, αριθ.κατ ) είναι επικυρωμένο για τον καθαρισμό ιικού DNA από πλάσμα ανθρώπου για τη χρήση με το artus CMV RG PCR Kit. Εκτελέστε τον καθαρισμό του ιικού DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του QIAamp DSP Virus Kit Handbook. Η προσθήκη του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης και επομένως για την απόδοση του DNA/RNA. Για να επιτύχουμε υψηλότερη σταθερότητα του φορέα RNA, ο οποίος παρέχεται μαζί με το QIAamp DSP Virus Kit, ακολουθήστε τις οδηγίες για την νέα παρασκευή και αποθήκευση του φορέα RNA που περιέχονται στο σχετικό εγχειρίδιο ( Preparing reagents and buffers ). Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus CMV RG PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης. Βεβαιωθείτε ότι ένα αρνητικό δείγμα πλάσματος περιλαμβάνεται στη διαδικασία απομόνωσης. Το σήμα του εντός αυτού περιεχομένου προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποτελεί τη βάση για την αξιολόγηση της απομόνωσης (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, παρακάτω). * International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

18 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (CMV IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το QIAamp DSP Virus Kit το DNA εκλούεται σε 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (AVE). Κατά συνέπεια πρέπει αρχικά να προστεθεί 6µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Η ποσότητα του προστιθέμενου προτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται μόνο από τον όγκο έκλουσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και ο φορέας DNA (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 17) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της εκχύλισης. Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Για να εκτιμηθεί μία απομόνωση ως επιτυχής πρέπει η τιμή Ct του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ενός αρνητικού δείγματος πλάσματος που περιλαμβάνεται στη διαδικασία της απομόνωσης (QIAamp DSP Virus Kit) με τη χρήση των οργάνων Rotor-Gene Q, να κυμαίνεται στους Ct = 27 ± 3 (threshold: 0,03). Η αναφερόμενη διασπορά οφείλεται σε διακύμανση μεταξύ μηχανημάτων και της απομόνωσης. Μία υψηλότερη απόκλιση υποδεικνύει την παρουσία προβλημάτων κατά την απομόνωση. Σε αυτή την περίπτωση, η απομόνωση πρέπει να ελεγχθεί και εάν είναι απαραίτητο να επικυρωθεί εκ νέου. Στην περίπτωση που προκύψουν άλλα ερωτήματα ή προβλήματα, παρακαλούμε επικοινωνήστε με την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN. Προαιρετικά, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR. Για το σκοπό αυτό, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο μίγμα του CMV RG Master και CMV Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 21). Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (CMV QS 1-4) χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και εισάγονται στον ίδιο όγκο (20 µl). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης στα όργανα Rotor-Gene Q, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και τα τέσσερα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και να ορισθούν ως πρότυπα στο στο πλαίσιο διαλόγου Edit Samples με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις (βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου). 18 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

19 Για την εγγύηση μιας ακριβούς ποσοτικοποίησης, συνιστούμε την πρόσθεση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο CMV RG Master και CMV Mg-Sol που χρησιμοποιούνται για τα πρότυπα ποσοτικοποίησης. Για αυτή την εφαρμογή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο CMV RG Master και CMV Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 21) και χρησιμοποιήστε αυτό το master mix για κάθε πρότυπο ποσοτικοποίησης (CMV QS 1 4). Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/µl. Για τη μετατροπή των τιμών που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη σε αντίγραφα/ml υλικού δείγματος πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσμα (αντίγραφα/ml) = Αποτέλεσμα (αντίγραφα/µl) x Όγκος έκλουσης (µl) Όγκος δείγματος (ml) Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). Σχετικές οδηγίες για την ποσοτική ανάλυση παθογόνων στα ανιχνευτικά συστήματα στα όργανα Rotor-Gene διατίθενται από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ( Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments ). artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

20 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση Σημαντικές υποδείξεις πριν από την εκκίνηση Πριν αρχίσετε τη διαδικασία, διαβάστε Σημαντικές σημειώσεις, σελίδες Εξοικονομήστε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το όργανο Rotor-Gene Q πριν αρχίσετε με το πρωτόκολλο. Βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Σιγουρευτείτε ότι σε κάθε ανάλυση PCR συμπεριλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης καθώς και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιήστε και τα τέσσερα πρότυπα ποσοτικοποίησης που παρέχονται για κάθε ανάλυση PCR (CMV QS 1-4). Πράγματα που πρέπει να γίνουν πριν από την εκκίνηση Βεβαιωθείτε ότι η μονάδα ψύξης (εξάρτημα του Rotor-Gene Q) έχει προψυχθεί περίπου στους 2 8 C. Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης, να αναμιγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και τελικά να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. Εκτέλεση 1. Τοποθετήστε τον αριθμό σωληναρίων PCR στις υποδοχές της μονάδας ψύξης. 2. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου για την επιτήρηση της διαδικασίας απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2a. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου επιλεκτικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2b. Συνιστούμε επιτακτικά την πρόσθεση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο CMV RG Master και CMV Mg-Sol που χρησιμοποιούνται για τα πρότυπα ποσοτικοποίησης. Για τα πρότυπα ποσοτικοποίησης, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο CMV RG Master και CMV Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου και χρησιμοποιήστε αυτό το master mix για κάθε πρότυπο ποσοτικοποίησης (CMV QS 1 4). 2a. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου έχει ήδη προστεθεί στην απομόνωση (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου, σελίδα 18). Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον πίνακα 5. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. 20 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

21 Πίνακας 5. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου για την επιτήρηση της απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR). Αριθμός δειγμάτων 1 12 CMV RG Master 25 µl 300 µl CMV Mg-Sol 5 µl 60 µl CMV IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 30 µl 360 µl 2b. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο μίγμα του CMV RG Master και CMV Mg-Sol. Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον πίνακα 6. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. Πίνακας 6. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 CMV RG Master 25 µl 300 µl CMV Mg-Sol 5 µl 60 µl CMV IC 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 32 µl* 384 µl* * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 3. Εισάγετε με πιπέτα σε κάθε σωληνάριο PCR 30 μl του master mix. Στη συνέχεια εισάγετε 20 µl από το έκλουμα του DNA του δείγματος (βλέπε πίνακα 7). Αντίστοιχα πρέπει να προστεθούν ως θετικό πρότυπο ελέγχου 20 µl από ένα τουλάχιστον πρότυπο ποσοτικοποίησης (CMV QS 1-4) και ως αρνητικό πρότυπο ελέγχου 20 µl νερό (Water, PCR grade). artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

22 Πίνακας 7. Παρασκευή αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Master mix 30µl 30 µl για κάθε ένα Δείγμα 20µl 20 µl για κάθε ένα Συνολικός όγκος 50 μl 50 μl για κάθε ένα 4. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Λάβετε υπόψη ότι στην κεφαλή θα πρέπει να τοποθετείται ένας δακτύλιος ασφάλειας (εξάρτημα του Rotor-Gene), για να εμποδίζεται το τυχαίο άνοιγμα των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. 5. Για την ανίχνευση του DNA του CMV δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα εργασίας. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων PCR Εικόνα 3, 4, 5 Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot start Εικόνα 6 Πολλαπλασιασμός του DNA (touchdown PCR) Εικόνα 7 Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού Εικόνα 8 Εκκίνηση της διαδικασίας Εικόνα 9 Ολες οι τεχνικές προδιαγραφές αναφέρονται στο Rotor-Gene Q software version και Rotor-Gene 6000 software versions , , και Rotor-Gene 3000 software version Παακαλούμε βρείτε περαιτέρω πληροφορίες πάνω στον προγραμματισμό των οργάνων Rotor-Gene στο εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Στις απεικονίσεις αυτές οι ρυθμίσεις πλαισιόνονται με έντονο μαύρο. Για τα όργανα Rotor-Gene Q πελιλαμβάνονται απεικονίσεις. Οπου απαιτούνται διαφορετικές τιμές για το Rotor-Gene 3000, οι διαφορές αυτές περιγράφονται στο κείμενο. 22 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

23 6. Αρχικά, ανοίξτε το πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 3). Ελέγξτε το πλαίσιο Locking Ring Attached και πατήστε Next. Εικόνα 3. Πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard. 7. Επιλέξτε 50 για τον όγκο αντίδρασης της PCR και πατήστε Next (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων αντίδρασης. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

24 8. Πατήστε το κουμπί Edit Profile στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 5), και προγραμματείστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως φαίνεται στις εικόνες 5 7. Εικόνα 5. Επεξεργασία του προφίλ Εικόνα 6. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start. 24 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

25 Εικόνα 7. Πολλαπλασιασμός του DNA. Σιγουρευτείτε ότι έχετε ενεργοποιήσει την λειτουργία touchdown στο βήμα υβριδισμού για 10 κύκλους. Σημειώστε ότι στο Rotor- Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr, JOE. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

26 9. Η περιοχή ανίχνευσης των καναλιών φθορισμού πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με τις εντάσεις φθορισμού στα σωληνάρια της PCR. Πατήστε Gain Optimisation στο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (βλέπε Εικόνα 5) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου Auto-Gain Optimisation Setup. Ορίστε τη θερμοκρασία ένδειξης στους 65 για να αντιπαραθέσετε τη θερμοκρασία υβριδισμού στο πρόγραμμα πολλαπλασιασμού (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr και JOE. 26 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

27 10. Οι τιμές gain που εξάγονται από τη βαθμονόμηση του καναλιού αποθηκεύονται αυτόματα και εμφανίζονται στο τελευταίο παράθυρο μενού του προγραμματισμού (βλέπε Εικόνα 9). Πατήστε Start Run. Εικόνα 9. Εκκίνηση της διαδικασίας. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr και JOE. 11. Μετά το τέλος της διαδικασίας, αναλύστε τα δεδομένα. Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα (11a, 11b a 11c). Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR εμφανίζονται στις εικόνες 10 και a. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει DNA του CMV. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι Cycling Yellow είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του DNA του CMV (θετικό σήμα στο κανάλι Cycling Green) ενδέχεται να οδηγήσουν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Yellow (Ανταγωνισμός). Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM για θετικό σήμα και Cycling A.JOE για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. 11b. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Παράλληλα εμφανίζεται ένα σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Yellow. Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο DNA του CMV. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η PCR του CMV είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

28 Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.JOE για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και έλλειψη σήματος για Cycling A.FAM. 11c. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια Cycling Green ή Cycling Yellow. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, σελίδα 31. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM και Cycling A.JOE. Εικόνα 10. Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (CMV QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). 28 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

29 Εικόνα 11. Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (CMV QS 1-4). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

30 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Στον οδηγό αυτό αντιμετώπισης προβλημάτων θα βρείτε χρήσιμες υποδείξεις οι οποίες μπορούν να σας βοηθήσουν στην επίλυση τυχόν προβλημάτων που μπορούν να εμφανισθούν. Για περισσότερες πληροφορίες βλέπε επίσης τη σελίδα συχνών ερωτήσεων στο κέντρο τεχνικής σας υποστήριξης: επιστήμονες της τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN απαντά ευχαρίστως στις ερωτήσεις σας σχετικά με το περιεχόμενο και τα πρωτόκολλα του εγχειριδίου αυτού ή τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου (πληροφορίες επαφής, βλέπε οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα Παρατηρήσεις και προτάσεις Κανένα σήμα με θετικά πρότυπα ελέγχου (CMV QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM a) Το κανάλι φθορισμού που επιλέξατε για την ανάλυση των δεδομένων της PCR, δεν ανταποκρίνεται στα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου. Για την ανάλυση των δεδομένων διαλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM για την αναλυτική PCR του CMV και το κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. b) O προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας του οργάνου Rotor-Gene είναι εσφαλμένος c) Εσφαλμένη διάταξη της αντίδρασης της PCR d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus CMV RG PCR Kit έχει λήξει Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με τα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 20). Ελέγξτε τα στάδια εργασίας σας με τη βοήθεια του σχήματος επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 20) και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. 30 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

31 Παρατηρήσεις και προτάσεις Ασθενές ή ανύπαρκτο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ενός αρνητικού δείγματος πλάσματος που υποβλήθηκε σε καθαρισμό με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit (C T = 27 ± 3; threshold, 0,03) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE με ταυτόχρονη απουσία ενός σήματος στο κανάλι Cycling Green ή Cycling A.FAM: a) Οι συνθήκες της PCR δεν συμφωνούν με το πρωτόκολλο Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε ανωτέρω) και επαναλάβετε την PCR με διορθωμένες ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. b) Έγινε αναστολή της PCR c) Υφίσταται απώλεια DNA κατά την εκχύλιση d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus CMV RG PCR Kit έχει λήξει Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Εάν το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει προστεθεί στην απομόνωση, μπορεί η απουσία του σήματος του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να σημαίνει απώλειες DNA κατά την εκχύλιση. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 17) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

32 Παρατηρήσεις και προτάσεις Σήματα με τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM της αναλυτικής PCR a) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Εισάγετε με πιπέτα τα θετικά πρότυπα ελέγχου κατά κανόνα στο τέλος. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. b) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την εκχύλιση Επαναλάβετε την εκχύλιση και την PCR των εξεταζόμενων δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση νέων αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. 32 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

33 Παραπομπές Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη ενημερωμένη επιγραμμική βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιευμάτων σχετικά με τη χρήση των προїόντων της QIAGEN. Επιλεκτικές αναλυτικές αναζητήσεις σας επιτρέπουν να βρείτε το άρθρο που χρειάζεστε είτε κατά την αναζήτηση με μία απλή κωδική λέξη είτε ειδικότερα βάσει της εφαρμογής, ερευνητικού πεδίου, τίτλου, κ.τ.λ. Για μία πλήρη λίστα παραπομπών, επισκευθείτε την QIAGEN Reference Database online στην ιστοσελίδα ή ελάτε σε επαφή με την τεχνική υπηρεσία της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

34 Πληροφορίες παραγγελιών Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. artus CMV RG PCR Kit (24) artus CMV RG PCR Kit (96) Για 24 αντιδράσεις: Master, διάλυμα Mg, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) Για 96 αντιδράσεις: Master, διάλυμα Mg, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) QIAamp DSP Virus Kit για τον καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων του ιού από πλάσμα ανθρώπου για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro QIAamp DSP Virus Kit Για 50 αντιδράσεις: QIAamp MinElute Spin Columns, ρυθμιστικά διαλύματα, αντιδραστήρια, σωληνάρια, επεκτάσεις στήλης και VacConnectors Rotor-Gene Q και εξαρτήματα Rotor-Gene Q 5plex Real-time PCR cycler με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Ζητείστε πληροφορίες Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex Rotor-Gene Q 2plex Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), συν κανάλι HRM, φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Real-time PCR όργανο με 6 κανάλια (μπλέ πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο), φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες 34 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

35 Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. Rotor-Gene Q 2plex HRM Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο) συν κανάλι HRM, φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης με πιπέτα ενός καναλιού σε 72 x 0,1 ml σωληνάρια Ζητείστε πληροφορίες Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10000) Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης σε μία πρότυπη σειρά 8 x 12 με τη χρήση 96 x 0,2 ml σωληναρίων 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 1000 αντιδράσεις 10 x 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για αντιδράσεις 1000 λεπτά σωληνάρια για 1000 αντιδράσεις 10 x 1000 λεπτά σωληνάρια για αντιδράσεις Για πρόσφατες πληροφορίες αδείας χρήσης και ειδικές αποποιήσεις προϊόντων, ανατρέξτε στο αντίστοιχο εγχειρίδιο του QIAGEN kit ή του χρήστη. Αυτά είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα ή μπορούν να ζητηθούν από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/

36 Η σελίδα αυτή παραμένει σκόπιμα κενή 36 artus CMV RG PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

37 Η αγορά του προϊόντος αυτού επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για την εκτέλεση διαγνωστικών εξετάσεων του ανθρώπου στη διαγνωστική in-vitro. Καμμιά γενική πατέντα ή άλλη άδεια κάθε είδους δεν παρέχεται επί τουπαρόντος εκτός αυτής του ειδικού δικαιώματος της χρήσης από τον αγοραστή. Μάρκες και αποποιήσεις: QIAGEN, QIAamp, artus, MinElute (QIAGEN Group); AMPLICOR, COBAS, MONITOR (Roche Group); FAM, JOE (Applera Corporation or its subsidiaries); Rotor-Gene (Corbett Research); SYBR (Molecular Probes, Inc.). Το artus CMV RG PCR Kit και το QIAamp DSP Virus Kit είναι σημασμένα CE διαγνωστικά κιτ σύμφωνα με τον ευρωπαïκό κανονισμό 98/79/EC σχετικό με τη διαγνωστική in vitro. Δεν είναι διαθέσιμα σε όλες τις χώρες. Limited License Agreement Use of this product signifies the agreement of any purchaser or user of the artus CMV RG PCR Kit to the following terms: 1. The artus CMV RG PCR Kit may be used solely in accordance with the artus CMV RG PCR Kit Handbook and for use with components contained in the Kit only. QIAGEN grants no license under any of its intellectual property to use or incorporate the enclosed components of this Kit with any components not included within this Kit except as described in the artus CMV RG PCR Kit Handbook and additional protocols available at 2. Other than expressly stated licenses, QIAGEN makes no warranty that this Kit and/or its use(s) do not infringe the rights of third-parties. 3. This Kit and its components are licensed for one-time use and may not be reused, refurbished, or resold. 4. QIAGEN specifically disclaims any other licenses, expressed or implied other than those expressly stated. 5. The purchaser and user of the Kit agree not to take or permit anyone else to take any steps that could lead to or facilitate any acts prohibited above. QIAGEN may enforce the prohibitions of this Limited License Agreement in any Court, and shall recover all its investigative and Court costs, including attorney fees, in any action to enforce this Limited License Agreement or any of its intellectual property rights relating to the Kit and/or its components. For updated license terms, see QIAGEN, all rights reserved.

38 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) EL Sample & Assay Technologies