artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο

Transcript

1 Σεπτέμβριος 2009 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 24 (Αρ.Καταλόγου ) 96 (Αρ.Καταλόγου ) Εκδοση 1 Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με όργανα Rotor-Gene Q , EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R EL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής τεχνολογιών δειγμάτων και εξετάσεων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προϊόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι τα αποτελέσματα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα για: Απομόνωση του DNA, RNA και πρωτεϊνών Συστήματα εξετάσεων για νουκλεϊνικά οξέα και πρωτεΐνες Ερευνα microrna και RNAi Αυτοματοποίηση τεχνολογίας δειγμάτων και εξετάσεων Σκοπός μας είναι να σας δοθεί η δυνατότητα να έχετε έξοχες επιτυχίες και σημαντικές ανακαλύψεις. Για περισσότερες πληροφορίες επισκευθείτε την ιστοσελίδα

3 Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 4 Σύμβολα 4 Αποθήκευση 5 Προοριζόμενη χρήση 5 Περιορισμοί χρήσης προїόντος 6 Τεχνική εξυπηρέτηση 6 Ποιοτικός έλεγχος 6 Πληροφορίες ασφάλειας 7 Εισαγωγή 8 Αρχή 8 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες 8 Ειδικά χαρακτηριστικά 9 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια 13 Σημαντικές σημειώσεις 14 Γενικά μέτρα ασφάλειας 14 Απομόνωση DNA 14 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου 15 Ποσοτικοποίηση 15 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση 17 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 26 Παραπομπές 29 Πληροφορίες παραγγελιών 30 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009 3

4 Περιεχόμενα του κιτ artus BK Virus RG PCR Kit (24) (96) Αρ. καταλόγου Αριθμός αντιδράσεων Μπλε BK Virus RG Master 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κίτρινο BK Virus RG Mg-Sol* 400 µl 400 µl Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο BK Virus RG QS1 (1 x 10 4 copies/µl) BK Virus RG QS 2 (1 x 10 3 copies/µl) BK Virus RG QS 3 (1 x 10 2 copies/µl) BK Virus RG QS 4 (1 x 10 1 copies/µl) 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Πράσινο BK Virus RG IC 1000 µl 2 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl Εγχειρίδιο 1 1 * Διάλυμα μαγνησίου. Πρότυπο ποσοτικοποίησης. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. Σύμβολα <N> Το περιεχόμενο επαρκεί για <N> τεστ Ημερομηνία λήξης Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας 4 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

5 Αριθμός υλικού Συστατικά Περιεχόμενα Αριθμός Περιορισμοί θερμοκρασίας Νόμιμος κατασκευαστής Παραπομπή στις πληροφορίες που δίνονται στο εγχειρίδιο Σημαντικές οδηγίες Αποθήκευση Τα υλικά του artus BK Virus RG PCR Kit αποθηκεύονται στους -20 C και διατηρούνται μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέττα. Επαναληπτική απόψυξη/ψύξη (>2x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με τον τρόπο ααυτό μειώνεται η ευαισθησία. Εάν τα αντιδραστήρια δεν χρησημοποιούνται τακτικά, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός τους. Αποθήκευση στους 2 8 C δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. Προοριζόμενη χρήση Το artus BK Virus RG PCR Kit είναι ένα σύστημα πολλαπλασιασμού νουκλεϊνικών οξέων in vitro για τον ποσοτικό προσδιορισμό του DNA του ιού BK σε ανθρώπινο πλάσμα και ούρο. Το διαγνωστικό αυτό κιτ εξέτασης χρησιμοποιεί την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και είναι διαμορφωμένο για τη χρήση με τα όργανα Rotor-Gene Q. Το artus BK Virus RG PCR Kit δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τα όργανα Rotor-Gene Q 2plex. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009 5

6 Περιορισμοί χρήσης προїόντος Η χρήση πρέπει να γίνεται μόνο από ειδικά εκπαιδευμένο και καταρτισμένο προσωπικό στις διαγνωστικές διαδικασίες in vitro (EN375). Η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. Προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στη συσκευασία και στις ετικέττες των επιμέρους στοιχείων. Τα αντιδραστήρια των οποίων έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Τεχνική εξυπηρέτηση Στη QIAGEN είμαστε υπερήφανοι για την ποιότητα και την διαθεσιμότητα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης. Το τμήμα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης είναι πλαισιωμένο με έμπειρους επιστήμονες με ευρεία πρακτική και θεωριτική γνώση στις τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου και τη χρήση προїόντων της QIAGEN. Εάν έχετε γενικά ερωτήσεις που αφορούν το artus BK Virus RG PCR Kit ή προїόντα της QIAGEN, μην καθυστερείτε να έρθετε σε επαφή μαζί μας. Οι πελάτες της QIAGEN αποτελούν μια μεγάλη πηγή πληροφοριών όσον αφορά την προώθηση και τις ειδικές χρήσεις των προїόντων μας. Οι πληροφορίες αυτές είναι χρήσιμες για άλλους επιστήμονες καθώς και τους ερευνητές της QIAGEN. Για το λόγο αυτό λάβετε το θάρρος να επικοινωνήστε με μας εάν έχετε οποιεσδήποτε προτάσεις που αφορούν την παρουσίαση των προїόντων ή καινούργιες εφαρμογές κια τεχνικές. Για τεχνική εξυπηρέτηση και περισσότερες πληροφορίες παρακαλούμε επισκευθείτε το κέντρο τεχνικής υποστήριξής μας στην ιστοσελίδα ή τηλεφωνήστε μια από τις τεχνικές υπηρεσίες της QIAGEN ή τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλέπε το πίσω εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα ). Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το σύστημα πιστοποιητικού ποιοτικής διαχείρησης ISO της QIAGEN, ελέγχεται κάθε παρτίδα του artus BK Virus RG PCR Kit υπό καθορισμένα κριτήρια ελέγχου, για την εξασφάλιση μιας ομοιόμορφης ποιότητας του προϊόντος. 6 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

7 Πληροφορίες ασφάλειας Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs). Στην επιγραμμική συλλογή μας των φυλλαδίων δεδομένων ασφάλειας, στην ιστοσελίδα μπορείτε να βρείτε για κάθε κιτ και κάθε περιεχόμενο του κιτ το εκάστοτε MSDS ως PDF αρχείο, το οποίο μπορείτε να διαβάζετε και να εκτυπώνετε. Καταστρέψτε τα απορρίματα δειγμάτων και ανάλυσης σύμφωνα με τους κανονισμούς σας ασφάλειας. Κλήση κινδύνου σε 24ωρη βάση Σε περίπτωση κινδύνου μπορείτε να πάρετε ιατρικές πληροφορίες όλο το 24ωρο στην αγγλική, γαλλική και γερμανική γλώσσα: Κέντρο πληροφοριών δηλητηριάσεων στο Mainz, Γερμανία Tel: artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009 7

8 Εισαγωγή To artus BK Virus RG PCR Kit είναι ένα σύστημα έτοιμο προς χρήση για την ανίχνευση του DNA του ιού ΒΚ μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στα όργανα Rotor-Gene Q. To BK Virus RG Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 274 bp, του γονιδιώματος του ιού ΒΚ καθώς και για την άμεση ανίχνευση του ειδικού προϊόντος πολλαπλασιασμού στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene Πέραν αυτού, το artus BK Virus RG PCR Kit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Orange του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene Το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του ιού ΒΚ δεν επηρεάζεται αρνητικά (βλέπε Αναλυτική ευαισθησία, σελίδα 9). Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (BK Virus RG QS 1-4), με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός της ποσότητας του DNA του ιού. Για περισσότερες πληροφορίες, δείτε Ποσοτικοποίηση, σελίδα 15. Αρχή Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού, κατά την εξέλιξη της PCR (που σημαίνει πραγματικού χρόνου), επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR. * Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Ο ιός BK (BKV) είναι ένας ιός DNA που ανήκει στους ιούς polyoma. Η αρχική λοίμωξη παρουσιάζεται κυρίως κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας και είναι συνήθως χωρίς συμπτώματα. Ο οροεπιπολασμός στους ενήλικες είναι μέχρι 90%. Μετά την αρχική λοίμωξη ο ιός BK παραμένει αφανής στα νεφρικά κύττατα και μπορεί να επανεργοποιηθεί υπό συνθήκες έλλειψης ανοσίας, όπως σε μία μεταμόσχευση. Η λοίμωξη από ιό ΒΚ μπορεί να συσχετίζεται με τη διάμεση σωληναριακή νεφρίτιδα και στένωση ουρητήρα σε δέκτες νεφρικής μεταμόσχευσης, καθώς και με αιμοραγική κυστίτιδα σε δέκτες μεταμόσχευσης μυελού των οστών. Επίσης έχει σχέση με μορφές ασθενειών όπως αγγειοπάθεια, πνευμονία, εγκεφαλίτιδα, φλεγμονή αμφιβληστροειδούς και ακόμα με ανεπάρκεια πολλών οργάνων. Επίμονη υψηλού επιπέδου αναπαραγωγή του ιού BK είναι τυπικό χαρακτηριστικό νεφροπάθειας από ιούς polyoma σε ασθενείς που έχουν υποστεί μεταμόσχευση * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

9 νεφρού. Κλινικές σχετικές λοιμώξεις περιορίζονται κυρίως σε άτομα με ανοσοποιητική καταστολή. Ειδικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία Για τον προσδιορισμό της αναλυτικής ευαισθησίας του artus BK Virus RG PCR Kit δημιουργήθηκε μία του σειρά αραιώσεων από 10 ως 0,001 ισοδύναμα αντιγράφων/µl και αναλύθηκε στο Rotor-Gene 6000 σε συνδυασμό με artus BK Virus RG PCR Kit. Οι έλεγχοι εκτελέστηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Συνεπώς, το αναλυτικό όριο ανίχνευσης του artus BK Virus RG PCR Kit, σε συνδυασμό με το Rotor-Gene Q/6000, βρίσκεται στα 0,195 αντίγραφα/µl (p = 0,05). Αυτό σημαίνει ότι 0,195 αντίγραφα/µl μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95 %. Εικόνα 1. Ανάλυση Probit: BK Virus (Rotor-Gene 6000). Αναλυτική ευαισθησία του artus BK Virus RG PCR Kit στο Rotor-Gene Ειδικότητα Η ειδικότητα του artus BK Virus RG PCR Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Η ανιχνευσιμότητα όλων των σχετικών στελεχών διασφαλίστηκε τόσο μέσω διάταξης με μία τράπεζα δεδομένων, όσο και μέσω μιας PCR στα όργανα Rotor-Gene με τα ακόλουθα στελέχη (Πίνακας 1). artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009 9

10 Πίνακας 1. Ειδικός έλεγχος σχετικών στελεχών Ιός Στέλεχος Πηγή Ιός ΒΚ (Cycling Green) πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Orange)) Ιός BK Dunlop ATCC* + + Ιός BK Gardner ATCC + + Ιός BK AB Geneart + + Ιός BK S72390 Geneart + + * American Type Culture Collection. Επιπλέον, η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 30 διαφορετικών αρνητικών δειγμάτων πλάσματος στον ιό ΒΚ. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για τον ιό ΒΚ εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στο BK Virus RG Master. Μία ενδεχόμενη διασταυρωμένη αντίδραση του artus BK Virus RG PCR Kit εξετάσθηκε με τη χρήση της ομάδας ελέγχου που αναφέρεται στον πίνακα 2. Κανένας απο τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Καμμία διασταυρωμένη αντίδραση δεν εμφανίστηκε με μικτές λοιμώξεις. Πίνακας 2. Ειδικός έλεγχος του κιτ με δυνητικά διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες. Ομάδα ελέγχου Ιός ΒΚ (Cycling Green)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Orange) Κυτταρομεγαλοϊός + Ιός Epstein-Barr + Ανθρώπινος ιός έρπητα 1 (Ιός απλού έρπητα 1) Ανθρώπινος ιός έρπητα 2 (Ιός απλού έρπητα 2) Ανθρώπινος ιός έρπητα 3 (ιός ανεμοβλογιάς έρπητα ζωστήρα) Ανθρώπινος ιός έρπητα 6 + Ιός JC + Ιός πιθήκου 40 Candida albicans 10 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

11 Ακρίβεια Τα δεδομένα ακριβείας, για το artus BK Virus RG PCR Kit, συνελέχθηκαν μέσω των οργάνων Rotor-Gene και επιτρέπουν την εξακρίβωση της ολικής διακύμανσης (ολική διασπορά) του συστήματος ανάλυσης. Η ολική διακύμανση προέρχεται από την μεταβλητότητα intra-assay (διασπορά δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης μέσα σε ένα πείραμα), την μεταβλητότητα inter-assay (διασπορά λόγω της χρήσης διαφόρων συσκευών του ίδιου τύπου από διάφορα άτομα εντός ενός εργαστηρίου) και την μεταβλητότητα inter-batch (διασπορά μέσω της χρήσης διαφορετικών παρτίδων). Τα αποκτώμενα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της τυπικής απόκλισης, της διακύμανσης και του συντελεστή μεταβλητότητας για την PCR του συγκεκριμένου παθογόνου παράγοντα και προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Τα δεδομένα ακριβείας συνελέχθηκαν, για το artus BK Virus RG PCR Kit, βάσει του προτύπου ποσοτικοποίησης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση (QS 4: 1 x 10 1 αντίγραφα/µl). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε βάσει των τιμών Ct των καμπύλων πολλαπλασιασμού. (C T : threshold cycle, Πίνακας 3, σελίδα 12). Βάσει των αποτελεσμάτων αυτών η ολική διασπορά ενός τυχαίου δείγματος της αναφερομένης συγκέντρωσης ανέρχεται στο 2,11% (C T ) και για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο 3,59% (C T ). Οι τιμές αυτές βασίζονται στο σύνολο των επιμέρους τιμών των εξεταζομένων μεταβλητοτήτων. Πίνακας 3 : Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των τιμών C T. Intra-assay μεταβλητότητα: BK Virus RG QS 4 Intra-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-assay μεταβλητότητα: BK Virus RG QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-batch μεταβλητότητα: BK Virus RG QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Ολική διακύμανση: BK Virus RG QS 4 Ολική διακύμανση: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Τιμή CT Τυπική απόκλιση Συντελεστής μεταβλητότητας [%] 29,45 0,17 0,56 24,31 0,12 0,49 29,42 0,25 0,85 23,30 0,77 3,30 30,31 0,64 2,10 22,53 0,40 1,78 29,80 0,63 2,11 23,12 0,83 3,59 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

12 Ανθεκτικότητα Ο έλεγχος της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον προσδιορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus BK Virus RG PCR Kit. 30 αρνητικά στον ιό ΒΚ δείγματα αναμίχθηκαν με 1 αντίγραφο/µl όγκου έκλουσης του DNA του ιού ΒΚ (περίπου τριπλή συγκέντρωση των αναλυτικών ορίων ευαισθησίας). Μετά την εκχύλιση με το EZ1 DSP Virus Kit (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 14) τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με το artus BK Virus RG PCR Kit. Το ποσοστό αποτυχίας για όλα τα 30 δείγματα ήταν 0%. Επιπλέον, η ανθεκτικότητα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ελέγχθηκε μέσω της απομόνωσης και της ανάλυσης 30 αρνητικών στον ιό ΒΚ δειγμάτων. Το συνολικό ποσοστό αποτυχίας ήταν 0%. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Έτσι η ανθεκτικότητα του artus BK Virus RG PCR Kit ανέρχεται στο 99 %. Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα της επαναληψιμότητας, επιτρέπουν μια τακτική αξιολόγηση της απόδοσης του artus BK Virus RG PCR Kit καθώς και σύγκριση της απόδοσής του με άλλα προϊόντα. Τα δεδομένα αυτά αποκτώνται με τη συμμετοχή σε καθιερωμένα ειδικά προγράμματα. Διαγνωστική αξιολόγηση Το artus BK Virus RG PCR Kit υποβάλλεται ήδη σε μια σειρά από αξιόλογες μελέτες. 12 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

13 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 14) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Οργανο Rotor-Gene Q ή Rotor-Gene* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και Cycling Orange Rotor-Gene Q software version (Rotor-Gene 6000 software version , , ) Σειρές σωληναρίων και καλλυμάτων, 0,1 ml, για τη χρήση με κεφαλή 72 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Προαιρετικά: Σωληνάρια PCR, 0,2 ml, for για τη χρήση με κεφαλή 36 υποδοχών (αριθ.κατ ή ) Μονάδα ψύξης (Loading Block 72 x 0,1 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ή Loading Block 96 x 0,2 ml σωληναρίων, αριθ.κατ ) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα ελέγχονται, συντηρούνται και βαθμονομούνται τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Το artus BK Virus RG PCR Kit δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τα όργανα Rotor-Gene Q 2plex. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

14 Σημαντικές σημειώσεις Γενικά μέτρα ασφάλειας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου(15 25 C), πριν αρχίσετε μια διαδικασία. Μετά την απόψυξη, ανάμιξη των υλικών (με επαναληπτική αναρρόφηση με πιπέτα ή με γρήγορο στροβιλισμό) και σύντομη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μονάδα ψύξης (72/96 well loading block). Απομόνωση DNA Το EZ1 DSP Virus Kit (QIAGEN, αριθ.κατ )* είναι επικυρωμένο για τον καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων από ανθρώπινο πλάσμα και ούρο, χρησιμοποιώντας την EZ1 Advanced DSP Virus Card (αριθ.κατ ) στο EZ1 Advanced (αριθ.κατ ), για τη χρήση με το artus BK Virus RG PCR Kit. Εκτελέστε τον καθαρισμό των νουκλεϊνικών οξέων του ιού σύμφωνα με τις οδηγίες του EZ1 DSP Virus Kit Handbook. Το artus BK Virus RG PCR Kit δεν πρέπει να χρησιμοποιείται με μεθόδους απομόνωσης που έχουν βάση την φαινόλη. Η χρήση του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της απομόνωσης και επομένως για την απόδοση του DNA/RNA. Προσθέστε την απαιτούμενη ποσότητα φορέα RNA σε κάθε εκχύλιση ακολουθώντας τις οδηγίες του EZ1 DSP Virus Kit Handbook. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus BK Virus RG PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, σελίδα 16) ). Συνιστούμε επιτακτικά τη χρήση των καθαρισμένων νουκλεϊνικών οξέων για τη PCR αμέσως μετά την εκχύλιση χρησιμοποιώντας το EZ1 DSP Virus Kit. Προαιρετικά, εκλούματα μπορούν να αποθηκευθούν για μέχρι 3 ημέρες στους 4 C πριν από την PCR ανάλυση. * Το EZ1 DSP Virus Kit διατίθεται επίσης ως σημασμένο CE-IVD EASYartus BK Virus RG PCR Kits, σε συνδυασμό με το artus BK Virus RG PCR Kit (βλέπε σελίδα 31 για πληροφορίες παραγγελιών). 14 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

15 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (BK Virus RG IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το EZ1 DSP Virus Kit, εάν τα νουκλεϊνικά οξέα του ιού εκλούονται σε 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης (AVE), τότε αρχικά προσθέστε 6 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και εάν είναι απαραίτητο ο φορέας RNA (βλέπε Απομόνωση, σελίδα 14) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης). Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Προαιρετικά, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR. Για το σκοπό αυτό, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο μίγμα του BK Virus RG Master και BK Virus RG Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδa 19). Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (BK Virus RG QS 1-4) χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και εισάγονται στον ίδιο όγκο (15 µl). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης στα όργανα Rotor-Gene Q, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και τα τέσσερα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και να ορισθούν ως πρότυπα στο πλαίσιο διαλόγου Edit Samples με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις (βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου). Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/µl. Για τη μετατροπή των τιμών που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη σε αντίγραφα/ml υλικού δείγματος πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσμα (αντίγραφα/ml) = Αποτέλεσμα (αντίγραφα/µl)x Όγκος έκλουσης (µl) Όγκος δείγματος (ml) artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

16 Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). Σχετικές οδηγίες για την ποσοτική ανάλυση παθογόνων στα ανιχνευτικά συστήματα στο Rotor-Gene διατίθενται από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN (Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments). 16 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

17 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση Σημαντικές υποδείξεις πριν από την εκκίνηση Πριν αρχίσετε τη διαδικασία, διαβάστε Σημαντικές σημειώσεις, σελίδες Εξοικονομήστε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το όργανο Rotor-Gene Q πριν αρχίσετε με το πρωτόκολλο. Βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Σιγουρευτείτε ότι σε κάθε ανάλυση PCR συμπεριλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης καθώς και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιήστε και τα τέσσερα πρότυπα ποσοτικοποίησης που παρέχονται για κάθε ανάλυση PCR (BK Virus RG QS 1-4). Πράγματα που πρέπει να γίνουν πριν από την εκκίνηση Βεβαιωθείτε ότι η μονάδα ψύξης (εξάρτημα του Rotor-Gene Q) έχει προψυχθεί περίπου στους 2 8 C. Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης, να αναμιγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και τελικά να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. Εκτέλεση 1. Τοποθετήστε τον αριθμό σωληναρίων PCR στις υποδοχές της μονάδας ψύξης. 2. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου για την επιτήρηση τηςδιαδικασίας απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2a. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου επιλεκτικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2b. 2a. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου έχει ήδη προστεθεί στην απομόνωση (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου, σελίδα 14). Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον πίνακα 4. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

18 Πίνακας 4. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου για τον έλεγχο της απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR). Αριθμός δειγμάτων 1 12 BK Virus RG Master 7 µl 84 µl BK Virus RG Mg-Sol 3 µl 36 µl BK Virus RG IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 10 μl 120 μl 2b. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο μίγμα του BK Virus RG Master και BK Virus RG Mg-Sol. Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον πίνακα 5. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. Πίνακας 5. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 BK Virus RG Master 7 µl 84 µl BK Virus RG Mg-Sol 3 µl 36 µl BK Virus RG IC 1,5 µl 18 µl Συνολικός όγκος 11,5 μl* 138 μl* * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 3. Εισάγετε με πιπέτα σε κάθε σωληνάριο PCR 10 μl του master mix. Στη συνέχεια εισάγετε 15 µl από το έκλουμα του DNA του δείγματος (βλέπε πίνακα 6). Αντίστοιχα πρέπει να προστεθούν ως θετικό πρότυπο ελέγχου 15 µl από ένα τουλάχιστον πρότυπο ποσοτικοποίησης (BK Virus RG QS 1-4) και ως αρνητικό πρότυπο ελέγχου 15 µl νερό (Water, PCR grade). 18 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

19 Πίνακας 6. Παρασκευή αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Master mix 10µl 10 µl για κάθε ένα Δείγμα 15µl 15 µl για κάθε ένα Συνολικός όγκος 25 μl 25 μl για κάθε ένα 4. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Λάβετε υπόψη ότι στην κεφαλή θα πρέπει να τοποθετείται ένας ένας δακτύλιος ασφάλειας (εξάρτημα του Rotor-Gene), για να εμποδίζεται το τυχαίο άνοιγμα των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. 5. Για την ανίχνευση του DNA του ιού ΒΚ δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα εργασίας. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων της μεθόδου Εικόνες 2, 3, 4 Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start Εικόνα 5 Πολλαπλασιασμός του DNA Εικόνα 6 Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού Εικόνα 7 Εκκίνηση της διαδικασίας Εικόνα 8 Ολες οι τεχνικές προδιαγραφές αναφέρονται στο Rotor-Gene Q software version και Rotor-Gene 6000 software versions Παρακαλούμε βρείτε περαιτέρω πληροφορίες πάνω στον προγραμματισμό των οργάνων Rotor-Gene στο εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Στις απεικονίσεις οι ρυθμίσεις αυτές πλαισιώνονται με έντονο μαύρο. Για τα όργανα Rotor-Gene Q περιλαμβάνονται απεικονίσεις. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

20 6. Αρχικά, ανοίξτε το πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 2). Ελέγξτε το πλαίσιο Locking Ring Attached και πατήστε Next. Εικόνα 2. Πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard. 7. Επιλέξτε 50 για τον όγκο αντίδρασης της PCR και πατήστε Next (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων της μεθόδου. Αν και ο φυσικός όγκος αντίδρασης είναι 25 µl, σιγουρευθείτε ότι επιλέγετε 50 για τον όγκο αντίδρασης στο λογισμικό του Rotor-Gene. 20 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

21 8. Πατήστε το κουμπί Edit Profile στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 4) και προγραμματείστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως φαίνεται στις εικόνες 4 6). Εικόνα 4. Επεξεργασία του προφίλ. Εικόνα 5. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

22 Εικόνα 6. Πολλαπλασιασμός του DNA. Σιγουρευτείτε ότι έχετε ενεργοποιήσει την λειτουργία touchdown στο βήμα υβριδισμού για 10 κύκλους. 22 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

23 9. Η περιοχή ανίχνευσης των καναλιών φθορισμού πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με τις εντάσεις φθορισμού στα σωληνάρια της PCR. Πατήστε Gain Optimisation στο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (βλέπε Εικόνα 4) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου Auto-Gain Optimisation Setup. Ορίστε τη θερμοκρασία ένδειξης στους 65 για να αντιπαραθέσετε τη θερμοκρασία υβριδισμού στο πρόγραμμα πολλαπλασιασμού (Εικόνα 7). Εικόνα 7. Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

24 10. Οι τιμές gain που εξάγονται από τη βαθμονόμηση του καναλιού αποθηκεύονται αυτόματα και εμφανίζονται στο τελευταίο παράθυρο μενού της διαδικασίας προγραμματισμού (βλέπε Εικόνα 8). Πατήστε Start Run. Εικόνα 8. Εκκίνηση της διαδικασίας. 11. Μετά το τέλος της διαδικασίας, αναλύστε τα δεδομένα. Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα (11a, 11b a 11c). Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR εμφανίζονται στις εικόνες 9 και a. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει DNA του ιού ΒΚ. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι Cycling Orange είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του DNA του ιού ΒΚ (θετικό σήμα στο κανάλι Cycling Green) ενδέχεται να οδηγούν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Orange (Ανταγωνισμός). 11b. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Την ίδια στιγμή εμφανίζεται στο κανάλι Cycling Orange σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο DNA του ιού ΒΚ. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η BK Virus PCR είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. 24 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

25 11c. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια Cycling Green ή Cycling Orange. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, σελίδα 27. Εικόνα 9. Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (BK Virus RG QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). Εικόνα 10. Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Orange με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (BK Virus RG QS 1-4). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

26 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Στον οδηγό αυτό αντιμετώπισης προβλημάτων θα βρείτε χρήσιμες υποδείξεις οι οποίες μπορούν να σας βοηθήσουν στην επίλυση τυχόν προβλημάτων που μπορούν να εμφανισθούν. Για περισσότερες πληροφορίες βλέπε επίσης τη σελίδα συχνών ερωτήσεων στο κέντρο τεχνικής σας υποστήριξης: επιστήμονες της τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN απαντά ευχαρίστως στις ερωτήσεις σας σχετικά με το περιεχόμενο και τα πρωτόκολλα του εγχειριδίου αυτού ή τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου (πληροφορίες επαφής, βλέπε οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα Παρατηρήσεις και προτάσεις Κανένα σήμα με θετικά πρότυπα ελέγχου (BK Virus RG QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green a) Το κανάλι φθορισμού που επιλέξατε για την ανάλυση των δεδομένων της PCR, δεν ανταποκρίνεται στα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου. Για την ανάλυση των δεδομένων διαλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green για την αναλυτική PCR του ιού BK και το κανάλι φθορισμού Cycling Orange για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. b) O προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας του οργάνου Rotor-Gene είναι εσφαλμένος c) Εσφαλμένη διάταξη της αντίδρασης της PCR d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus BK Virus RG PCR Kit έχει λήξει Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με τα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 17). Ελέγξτε τα στάδια εργασίας σας με τη βοήθεια του σχήματος επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 17) και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. 26 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

27 Παρατηρήσεις και προτάσεις Ασθενές ή ανύπαρκτο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αρνητικού δείγματος πλάσματος και ούρου που εξετάστηκε με τη χρήση του artus BK Virus RG PCR Kit στο κανάλι φθορισμού Cycling Orange με ταυτόχρονη απουσία ενός σήματος στο κανάλι Cycling Green a) Οι συνθήκες της PCR δεν συμφωνούν με το πρωτόκολλο Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε ανωτέρω) και επαναλάβετε την PCR με διορθωμένες ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. b) Έγινε αναστολή της PCR c) Υφίσταται απώλεια DNA κατά την εκχύλιση d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus BK Virus RG PCR Kit έχει λήξει Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Εάν το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει προστεθεί στην απομόνωση, μπορεί η απουσία του σήματος του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να σημαίνει απώλειες DNA κατά την εκχύλιση. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 14) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

28 Παρατηρήσεις και προτάσεις Σήματα με τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green της αναλυτικής PCR a) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Εισάγετε με πιπέτα τα θετικά πρότυπα ελέγχου κατά κανόνα στο τέλος. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. b) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την εκχύλιση Επαναλάβετε την εκχύλιση και την PCR των εξεταζόμενων δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση νέων αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. 28 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

29 Παραπομπές Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη ενημερωμένη επιγραμμική βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιευμάτων σχετικά με τη χρήση των προїόντων της QIAGEN. Επιλεκτικές αναλυτικές αναζητήσεις σας επιτρέπουν να βρείτε το άρθρο που χρειάζεστε είτε κατά την αναζήτηση με μία απλή κωδική λέξη είτε ειδικότερα βάσει της εφαρμογής, ερευνητικού πεδίου, τίτλου, κ.τ.λ. Για μία πλήρη λίστα παραπομπών, επισκευθείτε την QIAGEN Reference Database online στην ιστοσελίδα ή ελάτε σε επαφή με την τεχνική υπηρεσία της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

30 Πληροφορίες παραγγελιών Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. artus BK Virus RG PCR Kit (24) artus BK Virus RG PCR Kit (96) Για 24 αντιδράσεις: Master, διάλυμα Mg, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) Για 96 αντιδράσεις : Master, διάλυμα Mg, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) EASYartus BK Virus RG PCR Kits για πλήρη σύμμορφο με τους κανονισμούς CE-IVD ενιαία αυτόματη απομόνωση δειγμάτων και ανίχνευση παθογόνων οργανισμών EASYartus BK Virus RG PCR Kit 1 EASYartus BK Virus RG PCR Kit 2 Για 48 παρασκευές νουκλεϊνικών οξέων ιού και 24 διαδικασίες: EASYartus BK Virus RG PCR Kit 1 Για 48 παρασκευές νουκλεϊνικών οξέων ιού και 48 διαδικασίες: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 2 x artus BK Virus RG PCR Kit (24) EA11423 EA11424 EZ1 DSP Virus Kit για αυτόματη, ταυτόχρονη απομόνωση DNA και RNA ιών από 1 6 δείγματα ανθρώπινου πλάσματος, ορού ή ΕΝΥ με τη χρήση του EZ1 Advanced EZ1 DSP Virus Kit (48) EZ1 Advanced DSP Virus Card EZ1 Advanced Για 48 παρασκευές νουκλεϊνικών οξέων ιού: προγεμισμένα φυσίγγια αντιδραστηρίων, αναλώσιμες βάσεις στήριξης ρυγχών πιπετών, αναλώσιμα ρύγχη πιπετών με φίλτρο, σωληνάρια δείγματος, σωληνάρια έκλουσης, ρυθμιστά διαλύματα, φορέας RNA Προγραμματισμένη κάρτα για το πρωτόκολλο του EZ1 DSP Virus Για την in vitro διαγνωστική χρήση στην Ευρώπη: ρομποτική τράπεζα εργασίας για την αυτόματο καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων με τη χρήση των EZ1 DSP Kits, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

31 Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. Rotor-Gene Q και εξαρτήματα Rotor-Gene Q 5plex Real-time PCR cycler με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Ζητείστε πληροφορίες Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10000) Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), συν κανάλι HRM, φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Real-time PCR όργανο με 6 κανάλια (μπλέ πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης με πιπέτα ενός καναλιού σε 72 x 0,1 ml σωληνάρια Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης σε μία πρότυπη σειρά 8 x 12 με τη χρήση 96 x 0,2 ml σωληναρίων 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 1000 αντιδράσεις 10 x 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για αντιδράσεις 1000 λεπτά σωληνάρια για 1000 αντιδράσεις 10 x 1000 λεπτά σωληνάρια για αντιδράσεις Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες Για πρόσφατες πληροφορίες αδείας χρήσης και ειδικές αποποιήσεις προϊόντων, ανατρέξτε στο αντίστοιχο εγχειρίδιο του QIAGEN kit ή του χρήστη. Αυτά είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα ή μπορούν να ζητηθούν από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/

32 Η σελίδα αυτή παραμένει σκόπιμα κενή 32 artus BK Virus RG PCR Kit Εγχειρίδιο 09/2009

33 Η αγορά του προϊόντος αυτού επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για την εκτέλεση διαγνωστικών εξετάσεων του ανθρώπου στη διαγνωστική in-vitro. Καμμιά γενική πατέντα ή άλλη άδεια κάθε είδους δεν παρέχεται επί του παρόντος εκτός αυτής του ειδικού δικαιώματος της χρήσης από τον αγοραστή. Μάρκες και αποποιήσεις: QIAGEN, artus, EASYartus, EZ1 (QIAGEN Group); Rotor-Gene (Corbett Research Pty Ltd). Το artus BK Virus RG PCR Kit είναι σημασμένο CE διαγνωστικό κιτ σύμφωνα με τον ευρωπαïκό κανονισμό 98/79/EC σχετικό με τη διαγνωστική in vitro. Δεν είναι διαθέσιμο σε όλες τις χώρες. Limited License Agreement Use of this product signifies the agreement of any purchaser or user of the artus BK Virus RG PCR Kit to the following terms: 1. The artus [pathogen] RG [RT]-PCR Kit may be used solely in accordance with the artus BK Virus RG PCR Kit Handbook and for use with components contained in the Kit only. QIAGEN grants no license under any of its intellectual property to use or incorporate the enclosed components of this Kit with any components not included within this Kit except as described in the artus BK Virus RG PCR Kit Handbook and additional protocols available at 2. Other than expressly stated licenses, QIAGEN makes no warranty that this Kit and/or its use(s) do not infringe the rights of third-parties. 3. This Kit and its components are licensed for one-time use and may not be reused, refurbished, or resold. 4. QIAGEN specifically disclaims any other licenses, expressed or implied other than those expressly stated. 5. The purchaser and user of the Kit agree not to take or permit anyone else to take any steps that could lead to or facilitate any acts prohibited above. QIAGEN may enforce the prohibitions of this Limited License Agreement in any Court, and shall recover all its investigative and Court costs, including attorney fees, in any action to enforce this Limited License Agreement or any of its intellectual property rights relating to the Kit and/or its components. For updated license terms, see QIAGEN, all rights reserved.

34 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) EL Sample & Assay Technologies