ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. Eνότητα α εισαγωγή ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ Eνότητα α εισαγωγή ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

2 Σκοπός του μαθήματος: βασικές γνώσεις για τα ένζυμα Ιστορία της Ενζυμολογίας και ονοματολογία των ενζύμων Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας και απομόνωση των ενζύμων Μηχανισμοί ενζυμικής κατάλυσης Κινητική των Ενζύμων και αναστολή Λειτουργικά χαρακτηριστικά του ενεργού κέντρου των ενζύμων Αλλοστερισμός και Συνέργεια Ρύθμιση ενζυμικής ενεργότητας μετά από ομοιοπολική τροποποίηση Αλληλεπίδραση με ξενοβιοτικές ενώσεις Ενζυμική μηχανική

3 Ενότητα α Ορισμοί Ιστορία της επιστήμης της ενζυμολογίας Κατάταξη και ονομασία των ενζύμων

4 Ένζυμα: Γενικα χαρακτηριστικά ΑΠΟΕΝΖΥΜΟ (χωρίς συμπαράγοντα) Αδρανές ΟΛΟΕΝΖΥΜΟ (με συμπαράγοντα) Ενεργό Βιολογικοί καταλύτες, δρούν στα υποστρώματα. Αυξάνουν την ταχύτητα των χημικών αντιδράσεων, ώστε αυτές να φτάνουν σε ισορροπία συντομότερα Τα ένζυμα παραμένουν αναλλοίωτα στο τέλος της αντίδρασης Σχεδόν όλα τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες Μερικά ένζυμα για να είναι δραστικά απαιτούν συμπαράγοντες μη ενζυμικής φύσης Συμπαράγοντες: οργανικά μόρια (συνένζυμα) ή μεταλοϊόντα απαραίτητα για την ενεργότητα του ενζύμου Συνένζυμο: συμπαράγοντας οργανικής φύσης Προσθετική ομάδα: Συνένζυμο στερεά δεσμευμένο στο ένζυμο Ένζυμο και συμπαράγοντας μετέχουν στην καταλυτική αντίδραση Ένζυμο

5 Ένζυμο + Συμπαράγοντες Μεταλοϊόντα Συνένζυμα Συνυποστρώματα Προσθετικές ομάδες

6 Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) LDH R NAD + R NADH Ο ρόλο της φλαβίνης (FMN/FAD) ως συνένζυμο:

7 ΝΑDΡ(Η): συνένζυμο-συνυπόστρωμα

8 Ενζυμολογία : η συστηματική ενασχόληση με τα ένζυμα από οποιοδήποτε οργανισμό, πολυκυττάριο ή μονοκυττάριο, φυτό, ζώο ή ιό Αναφέρεται σε Ονοματολογία Ταξινόμηση Δομή Καθαρισμός Κινητική Μηχανισμούς Ρύθμιση της ενζυμικής δραστικότητας Απομόνωση και χαρακτηρισμός πολυενζυμικών συστημάτων

9 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 1783 Spallanzani: παρατηρεί ότι το γαστρικό υγρό γερακιού και άλλων ζώων (και άνθρωπος) ρευστοποιεί το κρέας (πεψίνη) 1814 Kirchoff: το εκχύλισμα από σιτάρι διαλυτοποιεί το άμυλο σε δεξτρίνες και σάκχαρα (αμυλάση) 1833 Payen κ Persoz: 1 η απομόνωση ενζύμου. Προσθήκη αλκοόλης σε υδάτινο εκχύλισμα βύνης δίνει θερμοευαίσθητο ίζημα ικανό να υδρολύει άμυλο σε διαλυτά σάκχαρα. «Διαστάση», σήμερα αμυλάση Schwann: απομόνωση ενζύμου από στομάχι ζώου κατόπιν όξινης εκχύλισης (πεψ 1860 Berthelot: απομόνωση ενζύμου από αλκοολικό ίζημα ζύμης ικανό να μετατρέπει τη ζάχαρη (σουκρόζη) σε γλυκόζη και φρουκτόζη (ινβερτάση). «Φυράματα» Liebig: τα «φυράματα» είναι «ανοργάνωτα»μη ζώντα συστατικά, Pasteur: τα «φυράματα» είναι «οργανωμένα» 1878 Kühne: εισάγει τον όρο ένζυμο για να αποδώσει τα «φυράματα», που βρίσκονται «εν τη ζύμη» και προκαλούν τις προηγούμενες διαδικασίες μετατροπών 1897 Buchner: επιτυγχάνει αλκοολική ζύμωση χρησιμοποιώντας εκχύλισμα ζύμης ελεύθερο από ακέραια κύτταρα.

10 Lazzaro Spallanzani (10 January February 1799) was an Italian Catholic priest, biologist and physiologist

11 Justus von Liebig (12 May April 1873) was a German chemist who made major contributions to agricultural and biological chemistry, and worked on the organization of organic chemistry

12 1894 Fisher: χρησιμοποιεί την αντιστοιχία κλειδιού-κλειδαριάς για να αποδώσει την εκλεκτικότητα/εξειδίκευση των ενζύμων 1897 Bertrand : ανακαλύπτει την ύπαρξη μακρομοριακών ενώσεων (συνένζυμα), που η παρουσία τους είναι απαραίτητη για να δράσουν κάποια ένζυμα και που μπορούν να απομακρυνθούν από το παρασκεύασμα με διαπίδυση 1898 Duclaux: βάζει τις βάσεις για τη συστηματική ονομασία των ενζύμων και προτείνει την κατάληξη -άση (-ase), από τη λέξη «διάσταση» για να υπογραμμισει τη λειτουργία τους. Η υπόλοιπη λέξη (ρίζα) θα αφορά το υπόστρωμα στο οποίο δρα το ένζυμο 1902 Brown: υπόθεση της ύπαρξης συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος 1903 Henri: μαθηματικο πρότυπο για την κινητική ενζύμων 1913 Michaelis Menten: θεωρία κινητικής ενζύμων 1925 Briggs & Haldane: θεωρία σταθεροποιημένης κατάστασης 1926 Sumner: πρώτη κρυστάλλωση ενζύμου (ουρεάση από φασόλι) που αναγνωρίζεται ως πρωτεΐνη η οποία καταλύει τη μετατροπή της ουρίας σε αμμωνία και διοξείδιο του άνθρακα 1946 Pauling: διατυπώνει τη θεωρία της μεταβατικής κατάστασης που διέρχεται το υπόστρωμα, οπότε και έχει ισχυρή πρόσδεσησταθεροποίηση με το εύκαμπτο ένζυμο (ES ).

13 Leonor Michaelis (January 16, 1875 October 8,1949) was a German-born American biochemist, physical chemist, and physician Maud Leonora Menten (March 20, 1879, Ontario July 26, 1960, Ontario) was a Canadian medical scientist Despite suffering from arthritis she was also an accomplished musician and painter; there were several exhibitions of her paintings.

14 Linus Carl Pauling (February 28, 1901 August 19, 1994) was an American chemist, biochemist, peace activist, author and educator. He was one of the most influential chemists in history and ranks among the most important scientists of the 20th century. Pauling was among the first scientists to work in the fields of quantum chemistry and molecular biology. Pauling is one of only four individuals to have won more than one Nobel Prize. He is one of only two people awarded Nobel Prizes in different fields (the Chemistry and Peace prizes), the other being Marie Curie (the Chemistry and Physics prizes), and the only person awarded two unshared prizes.

15 1951 Pauling & Corey: δομές α-έλικας και β-πτυχωτής επιφάνειας 1951 Perutz: δομή μυοσφαιρίνης με ακτίνες Χ 1953 Sanger : πρώτη αλληλούχιση αμινοξέων, ινσουλίνη 1958 Koshland: διατυπώνει τη θεωρία της επαγώμενης προσαρμογής στο μόριο του ενζύμου 1960 Moore & Stein: αλληλούχιση του ενζύμου ριβονουκλεάση 124 αμινοξέων 1963 Monod, Changeaux & Jacob: ανακάλυψη φαινομένου αλλοστερισμού στα ένζυμα 1986 Cech & Altman: ανακάλυψη καταλυτικών ριβόζυμων 1986 Lerner & Schultz: δημιουργία καταλυτικών αντισωμάτων (abzymes)

16 ΟΝΟΜΑΤΟΛΟΓΙΑ ΕΝΖΥΜΩΝ Η Επιτροπή Ενζύμων (Enzyme Commission) χώρισε τα ένζυμα σε έξι κατηγορίες σύμφωνα με την καταλυτική τους φύση (την αντίδραση που καταλύουν). Σε κάθε ένζυμο αντιστοιχεί ένας κωδικός αριθμός (Enzyme code: EC) ο οποίος αποτελείται από 4 επιμέρους αριθμούς Ο πρώτος τέτοιος αριθμός ή ψηφίο δηλώνει την κύρια κατηγορία αντίδρασης που ανήκει το ένζυμο Πρώτο ψηφίο Κύρια κατηγορία 1 Οξειδοαναγωγάσες Οξείδωση και αναγωγή Είδος καταλυώμενης αντίδρασης 2 Μεταφοράσες Μεταφορά ατόμου ή ομάδας μεταξύ δύο μορίων 3 Υδρολάσες Υδρολύσεις 4 Λυάσες Απομάκρυνση μιας ομάδας από το υπόστρωμα χωρίς υδρόλυση 5 Ισομεράσες Ισομεριώσεις 6 Λιγάσες ή συνθετάσες Συνένωση δύο μορίων με διάσπαση πυροφωσφορικού δεσμού τρισφορο-νουκλεοζίτη Το δεύτερο και τρίτο ψηφίο δηλώνει το είδος της καταλυτικής αντίδρασης. Το τέταρτο διαφοροποιεί ένζυμα που καταλύουν πολύ παρόμοιες αντιδράσεις, πχ υδρόλυση διαφορετικών εστέρων ενός καρβοξυλικού οξέος

17 Κατηγορία 1: Οξειδοαναγωγάσες Μεταφορά ατόμων Η, Ο ή και ηλεκτρονίων από ένα υπόστρωμα σε κάποιο άλλο. Το δεύτερο ψηφίο δηλώνει το δότη των αναγωγέων (Η ή e - ), ενώ το τρίτο ψηφίο δηλώνει τον αποδέκτη των αναγωγέων Δεύτερο ψηφίο Δότης Η ή e - Τρίτο ψηφίο 1 CH-OH αλκοόλη 1 NAD +, NADP + Αποδέκτης Η ή e - 2 C=O Αλδεΰδη ή κετόνη 2 Fe 3+ (κυτοχρώματα) 3 CH-CH 3 O 2 διοξυγόνο 4 CH-NH 2 Πρωτοταγής αμίνη 4 S-S δισουλφίδια 5 CH-NH- Δευτεροταγής αμίνη 5 Κινόνη ή συγγενής ένωση 6 NADH, NADPH 9 Αίμη 10 Διφαινόλες 11 H 2 O 2 13 Μόριο στο οποίο εισάγεται Ο (οξυγονάσες)

18 Κατηγορία 1: Οξειδοαναγωγάσες Παραδείγματα Γαλακτική αφυδρογονάση ή αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος ή NAD + οξειδοαναγωγάση του S-γαλακτικού EC CH 3 CHCOO - + NAD + CH 3 CHCOO - +NADH + H + OH O αμινοξική οξειδάση ή οξειδάση D-αμινοξέων EC R CH COO - + H 2 O + O 2 RC COO NH 4 + H 2 O 2 + NH 3 O

19 Οξειδάση της κατεχόλης

20 Κατηγορία 2: Μεταφοράσες (τρανσφεράσες) Καταλύουν αντιδράσεις της μορφής ΑΧ + Β Α + ΒΧ εξαιρουμένων οξειδοαναγωγικών και υδρολυτικών αντιδράσεων Το δεύτερο ψηφίο δηλώνει το είδος της μεταφερόμενης ομάδας, Δεύτερο ψηφίο Μεταφερόμενη ομάδα 1 Μονο-ανθρακική 2 Αλδεΰδη, κετόνη >C=O 3 Ακύλιο R-C=O 4 Γλυκοζύλιο, υδατάνθρακας 5 Αλκύλιο ή αρύλιο εκτός μεθυλίου 6 αζωτούχος 7 φωσφορική 8 Θειική, θειούχος

21 Κατηγορία 2: Μεταφοράσες (τρανσφεράσες) το τρίτο προσδιορίζει ειδικότερα τη μεταφερόμενη ομάδα 2.1 Τρίτο ψηφίο Μονο-ανθρακική 1 μεθύλιο Μονοανθρακική ομάδα 2 Υδρόξυμεθύλιο, φορμύλιο 3 Καρβοξύλιο, καρβαμύλιο EC μέθυλο μεταφοράσες EC υδρόξυ μέθυλο μεταφοράσες

22 Κατηγορία 2: Μεταφοράσες (τρανσφεράσες) 2.4 Τρίτο ψηφίο γλυκοζύλιο Γλυκοζύλιο, υδατάνθρακας 1 εξόζη 2 πεντόζη EC εξόζυλο EC πεντόζυλο

23 Εξαίρεση 2.7 Φωσφο μεταφοράσες/κινάσες Η φωσφορική ομάδα δεν επιδέχεται εξειδίκευση οπότε το τρίτο στοιχείο υποδηλώνει το υπόστρωμα-δέκτη EC κινάσες με δέκτη αλκοολομάδα EC κινάσες με δέκτη καρβοξυλομάδα Εξοκινάση ή εξοζοκινάση ΑΤΡ : D-έξοζο-6-φώσφορο-μεταφοράση EC Β + ΑΧ ΒΧ + Α C 5 H 9 O 5 CH 2 OH + ATP C 5 H 9 O 5 CH 2 OPO ADP D-εξόζη D -έξοζο-6-φωσφορικό 6-φώσφορο-D-εξόζη

24 Κατηγορία 3: Υδρολάσες Καταλύουν αντιδράσεις της μορφής ΑΧ + Η 2 0 ΑΗ + Χ-ΟΗ Το δεύτερο ψηφίο δηλώνει το είδος γενικά του δεσμού που υδρολύεται. Το τρίτο ψηφίο δηλώνει το είδος του δεσμού που υδρολύεται ειδικά από τα είδη δεσμών που αντιστοιχούν στο δεύτερο ψηφίο Δεύτερο ψηφίο Δεσμός που υδρόλύεται 1 εστερικός 2 Γλυκοζιτικός 4 Πεπτιδικός (-ίνη) 5 Δεσμός C-N (όχι πεπτιδικός) 7 C-C 10 C-S 11 C-P

25 Κατηγορία 3: Υδρολάσες Το τρίτο ψηφίο δηλώνει την περαιτέρω εξιδίκευση του δεύτερου ψηφίου Αν το δεύτερο ψηφίο είναι 1 τότε: Τρίτο ψηφίο Παράδειγμα Εστερικός δεσμός 1 Καρβοξυλοεστερικός 2 θειεστερικός 3 φωσφομονοεστερικός 4 φωσφοδιεστερικός ΕC αλκαλική φωσφατάση, ορθοφώσφορο-μονοέστερο-φώσφορο-υδρολάση O - O - R--O-P-O - + H 2 O R-OH + HO-P-O - O O Χ Α + Η 2 O Χ-ΟΗ + ΗΑ

26 Κατηγορία 4: Λυάσες Καταλύουν τη μη υδρολυτική απομάκρυνση ομάδων από υποστρώματα, σχηματίζοντας συχνά διπλούς δεσμούς Το δεύτερο ψηφίο δηλώνει το είδος του δεσμού που σπάει. Δεύτερο ψηφίο Δεσμός που σπάζει 1 C-C 2 C-Ο 3 C-Ν 4 C-S 6 Ρ-Ο Το τρίτο ψηφίο δηλώνει την ομάδα που απομακρύνεται από το σπάσιμο του δεσμού, που αναφέρεται στο δεύτερο ψηφίο Τρίτο ψηφίο Ομάδα που απομακρύνεται 1 Καρβοξυλική: COO - 2 Αλδεϋδική: -C=O 3 Κετοξική: -C=O-COO -

27 Κατηγορία 4: Λυάσες Παράδειγμα ΕC L-ιστίδινο-καρβόξυλο-λυάση ή αποκαρβοξυλάση της ιστιδίνης C 3 N 2 H 3 CH 2 CH-NH 3 + C 3 N 2 H 3 CH 2 CH-NH CO 2 COO - Ιστιδίνη Ισταμίνη

28 Κατηγορία 5: Ισομεράσες Καταλύουν αντιδράσεις ισομεριώσεως Το δεύτερο ψηφίο δηλώνει το είδος της αντιδράσεως ισομεριώσεως Δεύτερο ψηφίο Αντίδραση 1 Ρακεμίωση και επιμερίωση (αντιστροφή ασύμμετρου C) 2 cis-trans ισομεριώση 3 Ενδομοριακή οξειδοαναγωγή 4 Ενδομοριακή μεταφορά (μετάθεση) 5 Ενδομοριακή διάσπαση δεσμού (τύπου λυάσης) 99 Άλλες ισομερειώσεις

29 Κατηγορία 5: Ισομεράσες Το τρίτο ψηφίο δηλώνει το είδος του μορίου ή την ομάδα, που υφίσταται την ισομερίωση Πχ για μια ρακεμίωση και επιμερίωση (δεύτερο ψηφίο 1), το υπόστρωμα που υφίσταται την ισομερίωση ειδικεύεται ως εξής: Τρίτο ψηφίο 1 αμινοξύ 2 υδροξυοξύ υπόστρωμα 3 υδατάνθρακας Παραδείγμα ΕC Ρακεμάση αλανίνης L-Ala D-Ala

30 Κατηγορία 5: Ισομεράσες Πχ για μια ενδομοριακή οξειδοαναγωγή (δεύτερο ψηφίο 3), Τρίτο ψηφίο ομάδα 1 Αλδόζη σε κετόζη 2 Κετομάδα σε ενολομάδα 3 Μετάθεση C=C Παραδείγμα ΕC ισομεράση ξυλόζης

31 Κατηγορία 6: Λιγάσες ή συνθετάσες Καταλύουν το σχηματισμό νέων δεσμών, σε συνδιασμό με τη διάσπαση ΑΤΡ ή άλλου τριφοσφωρικού νουκλεοζίτη X + Y + ATP X-Y + ADP + P i X + Y + ATP X-Y + AMP + PP i Το δεύτερο ψηφίο δηλώνει το γενικό είδος του δεσμού που σχηματίζεται Δεύτερο ψηφίο Δεσμός 1 C-O 2 C-S 3 C-N 4 C-C 5 Ρ-Ο (φωσφορικού εστέρα)

32 Κατηγορία 6: Λιγάσες ή συνθετάσες Το τρίτο ψηφίο: το είδος μορίων που συνενώνονται σε σχέση με το δεύτερο ψηφίο Τρίτο ψηφίο Μόρια με νέο δεσμό C-Ο αμινοάκυλο trna) Το τέταρτο ψηφίο δηλώνει το είδος αμινοξέως Τέταρτο ψηφίο αμινοξύ 1 L-τυροσίνη Παραδείγματα ΕC Συνθετάση τυροσίνυλο-trna L-Tyr + trna tyr + ATP L-Tyr-tRNA tyr + AMP + PP i X + Y + ATP X-Y + AMP + PP i

33 Κατηγορία 6: Λιγάσες ή συνθετάσες Τρίτο Ψηφίο Μόρια με νέο δεσμό C-N οξύ-αμμωνία (αμίδια) 2 οξύ-αμινοξύ (πεπτίδια) 3 κυκλοποίηση Το τέταρτο ψηφίο δηλώνει το είδος αμινοξέως Τέταρτο ψηφίο Παραδείγματα αμινοξύ 2 L-γλουταμικό οξύ ΕC Συνθετάση L-γλουταμίνης L-Glu + ATP + NH 3 L-Gln + ADP + P i X + Y + ATP X-Y + ADP + P i

34 Ονομασία και Κατάταξη των Ενζύμων Συστηματικό όνομα Αποτελείται από δύο μέρη Το όνομα του υποστρώματος σε περίπτωση διμοριακών υποστρωμάτων τα ονόματα και των δύο χωρισμένα με δίστιγμο (αν απαιτούνται περισσότερες πληροφορίες αυτές συμπληρώνονται σε μια παρένθεση) Τη φύση της αντίδρασης που έχει την κατάληξη -αση Πχ Γαλακτική αφυδρογονάση ή αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος ή NAD + οξειδοαναγωγάση του S-γαλακτικού

35 Ονομασία και Κατάταξη των Ενζύμων Κοινό όνομα Μοιάζει με το συστηματικό, αλλά περιέχει πολύ λιγότερη λεπτομέρεια και τις απόλυτα απαραίτητες πληροφορίες Πολλά πρωτεολυτικά ένζυμα έχουν την κατάληξη ινη αντί για αση καθαρά για ιστορικούς λόγους Πχ Γαλακτική αφυδρογονάση ή αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος ή NAD + οξειδοαναγωγάση του S-γαλακτικού

36 ΤΕΛΟΣ