ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟY ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. Ενότητα ε. Κινητική των Ενζύμων ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟY ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ Ενότητα ε Κινητική των Ενζύμων ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

2 Μέρος Α Γενικές παρατηρήσεις για την κινητική ενζυμικών αντιδράσεων

3 Ορισμοί Για μια χημική αντίδραση S P Ορίζουμε ότι η ταχύτητα αντιδράσεως είναι ίση με το ρυθμό εξαφάνισης αντιδρώντος (S) ή το ρυθμό εμφάνισης προϊόντος (P) S d dt P d dt S είναι η σταθερά ταχύτητος

4 Έστω η αντίδραση: S P Αντίδραση χωρίς ένζυμο: γραμμική καμπύλη μεταβολής της ταχύτητος αντιδράσεως S

5 Έστω η αντίδραση: E S P E S S Η δίνει καμπύλη υπερβολής σε σχέση με την [S] Η δίνει γραμμική καμπύλη σε σχέση με την [E]

6 Η δίνει γραμμική καμπύλη σε σχέση με την [E] για διαφορετικές [S], αλλά πάντα υπερβολή παρουσία σταθερών συγκεντρώσεων Ε E S S

7 Μεταβολή ταχύτητος αντιδράσεως με το χρόνο Έστω η αντίδραση: E S P Για την ίδια [S], η μεταβάλλεται με το χρόνο Μετρούμε 0 (αρχική ταχύτητα)

8 Η παρατηρούμενη ελάττωση της με το χρόνο (t) οφείλεται πχ: Στη μείωση του κορεσμού του ενζύμου από υπόστρωμα Στην αντιστροφή της αντίδρασης με την προσέγγιση του σημείου ισορροπίας Στην αναστολή του ενζύμου από τα προϊόντα Μετράμε πάντα αρχική ( 0 ) σε t 0, ειδάλλως θα υποεκτιμήσουμε την ενεργότητα του ενζύμου

9 Αριθμός αντιδρώντων και ταχύτητα αντίδρασης E S P ds dp dt dt S Α + B E P A db dp d dt dt Αντίδραση πρώτης τάξεως dt A B Αντίδραση δευτέρας τάξεως είναι η σταθερά ταχύτητος

10 Για σταθερή συγκέντρωση του ενζύμου, η ταχύτητα αντιδράσεως περιγράφεται από την καμπύλη ορθόγώνιας υπερβολής = max Η ασύμπτωτη τιμή της είναι η max

11 Ο Brown to 902 παρατήρησε ότι η ταχύτητα () υδρόλυσης της σακχαρόζης σε γλυκόζη και φρουκτόζη από την ινβερτάση, περιγράφεται από ορθογώνια υπερβολή που πρέπει να ικανοποιεί την μαθηματική σχέση S S α είναι η μέγιστη τιμή της ( max ) β είναι η τιμή [S] για την οποία η τιμή της ισούται με max /2 To β αργότερα συμβολίστηκε με K m Για πολύ χαμηλές τιμές του [S], S Δηλαδή η αντίδραση ικανοποιεί κινητική πρώτης τάξης

12 S S Για πολύ υψηλές τιμές του [S], ct Η γίνεται ανεξάρτητη του [S], άρα έχουμε κινητική μηδενικής τάξεως Ενώ η ορθογώνια υπερβολή δεν είναι χαρακτηριστικό όλων των ενζύμων, Όλα τα ένζυμα φθάνουν σε μέγιστη ταχύτητα max με την αύξηση του [S] Η θεωρία σχηματισμού ενζύμου-υποστρώματος από τον Brown αποδείχθηκε πειραματικά το 936

13 Μέρος Β Απλά μαθηματικά μοντέλα για τις ενζυμικές αντιδράσεις

14 . Henri 903, Michaelis και Menten 93: θεωρία συμπλόκου E S Περιγραφή ενζυμικής αντίδρασης στα αρχικά στάδια E S 2 ES d d 3 E ES dt ES dt = = P E S ES ES 2 3 Στην αρχή η [P] είναι πολύ μικρή ώστε να αντιστραφεί η δεύτερη αντίδραση

15 E S 2 ES 3 E P Στην αρχή της αντίδρασης: Yπάρχει ισορροπία ανάμεσα στα [S], [E] αι [ES] Η διάσπαση του ES σε E και S είναι ασήμαντη [S] [S 0 ] Οπότε E S ES 0 2

16 E S ES 0 2 E S ES 2 KD Km ES E E 0 ES E S 0 S Km Ωστόσο η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης καθορίζεται από την ταχύτητα διάσπασης του ES σε Ρ 0 3 ES καταλήγουμε...

17 0 3 S E 0 S Km Επειδή στο 3 E0 η δε μπορεί νάναι μεγαλύτερη, όπότε το συμμετέχει όλο το ένζυμο της αντίδρασης, 3 E0 είναι η max 0 3 E0 max 3 S E 0 S Km 0 S max S Km

18 2. Briggs & Haldane 925: κινητικό μοντέλο κατάστασης δυναμικής ισορροπίας (steady state) [ES]=σταθερή οπότε d ES dt = 0 Η κατάσταση αυτή ισχύει για την αρχή της αντίδρασης (πειραματικά δεδομένα)

19 κατάσταση δυναμικής ισορροπίας d ES dt 0 d ES dt 0 Κατάσταση προ της δυναμικής ισορροπίας d ES 0 dt

20 Reaction Time κατάσταση δυναμικής ισορροπίας S P Concentration E ES =ct d ES dt 0

21 d ES dt = 0 E S 2 ES 3 E P E S= ES ES 2 3 E S ES 2 3 Km

22 επειδή ES E E 0 E S ES Km ES E S 0 S Km 0 3 ES 0 max 3 E0 E 0 max max S ES 0 S Km

23 0 S max S Km Ισχύει όταν. Η αντίδραση είναι πολυ-υποστρωματική, αλλά μεταβάλλεται η συγκέντρωση μόνο ενός υποστρώματος, ενώ οι άλλες παραμένουν σταθερές 2. Υπάρχουν ένζυμα με πολλές θέσεις πρόσδεσης υποστρώματος, που δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους 3. Ισχύει για αντιδράσεις του τύπου E S 2 ES 3 EP 4 E P Με την προϋπόθεση ότι το ES EP είναι το περιοριστικό στάδιο

24 Μέρος Γ Οι έννοιες των K m και cat

25 Km

26 Οι K m δεν είναι πανομοιότυπες στα δύο μοντέλα Briggs & Haldane: Ο λόγος 2 Km Michaelis & Menten: E S 2 3 Km καθορίζει το σημείο ισορροπίας της αντίδρασης 2 ES 2

27 Όσο μικρότερος είναι ο λόγος 2 τόσο μικρότερη είναι και η διάσταση του ΕS Άρα η K m στο μοντέλο Michaelis & Menten αντιστοιχεί στην K D του ΕS Για αντιδράσεις με 3 << 2, η K m αποτελεί το μέτρο της συγγένειας υποστρώματος και ενζύμου E S 2 ES 3 E P Όσο μεγαλύτερη η K m, τόσο μικρότερη η συγγένεια με το υπόστρωμα

28 Το μοντέλο Michaelis & Menten ισχύει για αντιδράσεις με 3 << 2 Το μοντέλο Briggs & Haldane έχει γενικότερη ισχύ

29 Γενικότερος ορισμός της K m Από τη συνάρτηση f ( S ) Η K m ισούται με τη συγκέντρωση υποστρώματος [S] που δίνει Στην εξίσωση ορθογώνιας υπερβολής Η σταθερά α είναι η max Η σταθερά β είναι το K m S S max 2 Βιολογική σημασία της K m Προσδιορίζει πιο ένζυμο δρα πρώτο σε μεταβολικά μονοπάτια με ίδια υποστρώματα

30 cat

31 Ξέρουμε ότι 3 E0 max Η 3 αφορά την ταχύτητα διάσπασης του ES σε Ρ και Ε, οπότε ελέγχει τη συνολική ταχύτητα της αντίδρασης E S 2 ES 3 E P Γι αυτό η 3 ονομάζεται και καταλυτική σταθερά ή cat cat E0 max μονάδες cat s max mol ( ) l s mol l E 0 ( )

32 Ευρύτερη έννοια cat Η cat δηλώνει τον αριθμό μορίων υποστρώματος που καταλύει ένα μόριο ενζύμου ανά μονάδα χρόνου (sec - ) όταν είναι κορεσμένο με υπόστρωμα οπότε είναι ενδεικτική της μέγιστης ταχύτητας καταλύσεως του ενζύμου Κάθε αντίδραση πραγματοποιείται σε χρόνο / cat

33 Κριτήριο cat /K m (σταθερά εξειδικεύσεως) E S 2 ES 3 E P 0 3 E S K m ES ES 0 K 3 m S E Ο παράγοντας 3 /K m ονομάζεται καταλυτική αποτελεσματικότητα και έχει ως ανώτατο όριο την τιμή K 3 m 3 (M - s - ) 2 3 Σημασία Ο παράγοντας cat /K m συγκρίνει την εξειδίκευση διαφορετικών ενζύμων για το ίδιο υπόστρωμα

34 Κινητική τελειότητα Στην αντίδραση E S 2 ES 3 E P Το προσδιορίζει την ταχύτητα σχηματισμού του ΕS, που δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από την ταχύτητα διάχυσης των Ε, S που παίρνει τιμές M - s - Ωστόσο υπάρχουν και ένζυμα που έχουν πετύχει την κινητική τελειότητα πχ ανθρακική ανυδράση, ισομεράση των φωσφοτριοζών, ακετυλχολινεστεράση Με 3 /K m M - s -. Τα ένζυμα αυτά έχουν πετύχει κινητική τελειότητα καθότι η ταχύτητα της αντιδράσεως περιορίζεται από το ρυθμό που συναντούν το υπόστρωμά τους

35 Αναγωγή δισουλφιδίων CH 3 CH 2 S-SG J Biol Chem. (997) 272,

36

37 Μέρος Δ Πειραματικός υπολογισμός των K m και max

38 Γραφική παράσταση Lineweaver-Br (διπλών αντιστρόφων) 0 max S Km S K m 0 max S max y x Αλλά: Χαμηλή [S] δίνει υψηλή /[S] που οδηγεί σε ανακρίβεια το /[S] με συνέπεια την ανακρίβεια στον υπολογισμό της κλίσεως «α» Aπόκλιση από γραμμικότητα δε γίνεται εύκολα αντιληπτή

39 Γραφική παράσταση Ηanes 0 K m max S max S 0 max S K m max Μεγαλύτερη ακρίβεια στη μέτρηση της K m

40 Γραφική παράσταση Eadie-Hofstee 0 K m max S max επί 0 max m 0 0 K S max Δεν παρουσιάζει το πρόβλημα του διπλού αντιστρόφου όσον αφορά τις τιμές /[S], οι οποίες μεταφράζονται σε σημεία ευθείας με ίσες αποστάσεις από το καθένα

41 Γραφική παράσταση Eisenthal & Cornish-Bowden K S Km m S max S K m 2K S 2 S m max 2 K S m Km 2 2 S S 2 max S S 2 S Από 2 διαφορετικές και [S] έχουμε max S 2 S 2

42 Οπότε μπορούμε να πάρουμε διάφορες τιμες K m και max από τιμές και [S] max S S S S S S Km

43 S max S K m K m max S max max K m S max K m S

44 Στις μέρες μας: Ο προσδιορισμός τιμες K m και max γίνεται με χρήση κατάλληλου λογισμικού προγράμματος και χρήση ηλεκτρονικών υπολογιστών

45 Μέρος Ε Σημείο ισορροπίας της αντιδράσεως

46 Εφόσον οι ενζυμικές αντιδράσεις είναι σε κάποιο βαθμό αναστρέψιμες, έχει νόημα ο υπολογισμός της σταθεράς ισορροπίας K eq της αντιδράσεως Από την K eq λαμβάνουμε πληροφορίες για έκταση αντίδρασης, ποσοστιαία ισορροπία Έστω E S 2 ES 3 4 E P

47 E S 2 ES 3 4 E P Σε κατάσταση ισορροπίας: E S ES 2 3 Keq E P ES 3 Aλλά οι ταχύτητες () εκατέρωθεν δύσκολα προσδιορίζονται οπότε υπολογίζουμε την K eq από τις από K m, max των αντιδράσεων προς τα δεξιά προς τα αριστερά και αντιστρόφως

48 4 3 2 ) ( K l m 3 2 ) ( K r m 4 ) ( ) ( K K r m l m E r 3 max ) max( ) max( E E l r E l 2 max

49 ) ( ) max( ) ( ) max( r m l l m r eq K K K Keq 4 ) ( ) ( K K r m l m 2 3 ) max( ) max( l r Σχέση του Haldane

50 ΤΕΛΟΣ