Χημική ανάλυση και ανίχνευση βαρέων μετάλλων σε διαφορετικά εμπορικά σκευάσματα ΜΤΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Χημική ανάλυση και ανίχνευση βαρέων μετάλλων σε διαφορετικά εμπορικά σκευάσματα ΜΤΑ Αθανασία Καρυπίδου Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία Θεσσαλονίκη, Ιούνιος 2016

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗ» ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΕΝΔΟΔΟΝΤΟΛΟΓΙΑ Εργαστήριο: ΕΝΔΟΔΟΝΤΟΛΟΓΙΑΣ Χημική ανάλυση και ανίχνευση βαρέων μετάλλων σε διαφορετικά εμπορικά σκευάσματα ΜΤΑ Αθανασία Καρυπίδου Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία Επιβλέπων: Παναγιώτης Μπελτές, Καθηγητής Εγκρίθηκε από την τριμελή επιτροπή αξιολόγησης την: 27/06/2016 Παναγιώτης Μπελτές, Καθηγητής, επιβλέπων Ελισάβετ Κουλαουζίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, μέλος Νικόλαος Οικονομίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής, μέλος Θεσσαλονίκη, Ιούνιος 2016 i

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF HEALTH SCIENCES SCHOOL OF DENTISTRY POSTGRAGUATE PROGRAM «DENTISTRY» DISCIPLINE: ΕNDODONTOLOGY Department: ENDODONTOLOGY Chemical analysis and trace metals contents of different commercial types of MTA Athanasia Karypidou Postgraduate thesis Thessaloniki, June 2016 ii

4 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία αποτελεί επιστέγασμα του μεταπτυχιακού κύκλου των σπουδών μου στην Οδοντιατρική Σχολή του ΑΠΘ και από τη θέση αυτή θα ήθελα να ευχαριστήσω, πέραν αυτών που συνετέλεσαν στην εκπόνηση της, όλους εκείνους που στάθηκαν δίπλα μου στη φοιτητική μου πορεία. Πρωτίστως, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους καθηγητές της τριμελούς επιτροπής της εργασίας, για καθέναν από τους οποίους τρέφω ιδιαίτερη εκτίμηση. Τον επιβλέποντα, Καθηγητή κ. Μπελτέ Παναγιώτη, που ήταν και ο άνθρωπος που στάθηκε για μένα πρότυπο και με ώθησε να επιλέξω την κατεύθυνση της Ενδοδοντολογίας και το συγκεκριμένο πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε από την πρώτη στιγμή της συνεργασίας μας. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Κουλαουζίδου Ελισάβετ, την οποία θαυμάζω για την ανιδιοτέλεια, την υπομονή και την ικανότητα της να κάνει τα προβλήματα να φαίνονται πολύ απλά, για τη βοήθεια που μου προσέφερε σε όλα τα στάδια του πειράματος και της συγγραφής, ακόμα και πριν προλάβω να της την ζητήσω. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Οικονομίδη Νικόλαο, το ήθος και η επιστημονική κατάρτιση του οποίου τον καθιστούν πρότυπο δασκάλου, για το ενδιαφέρον και τη συμβολή του στην εκπόνηση της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στους υπεύθυνους της κλινικής μας άσκησης, κ. Λαμπριανίδη Θεόδωρο, Καθηγητή και κ. Μολυβδά Ιωάννη, Αναπληρωτή Καθηγητή, οι οποίοι με έκαναν να νιώθω περήφανη καθημερινά για το μεταπτυχιακό πρόγραμμα που παρακολουθούσα. Μοιράστηκαν μαζί μας εμπειρία και γνώση, μας πρόσφεραν συνεχώς κίνητρα για εξέλιξη και ήταν δίπλα μας σε οποιαδήποτε δυσκολία προέκυπτε. Μέρος του πειράματος της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του ΑΠΘ, με την iii

5 προσφορά του Καθηγητή κ. Παπαδογιάννη Ιωάννη, του Καθηγητή κ. Ζαχαριάδη Γεώργιου και του Υποψ. Διδάκτορα κ. Τρίκα Ευάγγελου, τους οποίους και ευχαριστώ θερμά. Το δεύτερο μέρος του πειράματος έγινε στη μονάδα κυτταροκαλλιεργειών του Εργαστηρίου Βασικών Οδοντιατρικών Επιστημών του Τομέα Παθολογίας και Θεραπευτικής των Οδοντικών Ιστών του Τμήματος Οδοντιατρικής του Α.Π.Θ, με την βοήθεια της Μεταπτυχιακής φοιτήτριας κ. Δημοσιάρη Γαρυφαλλιά, την οποία επίσης ευχαριστώ. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω όλα τα μέλη ΔΕΠ του Εργαστηρίου για την ξεχωριστή συνδρομή του καθενός στην εκπαίδευση μου και τους συμφοιτητές μου, Λία, Κώστα και Γιώργο, για την εύρυθμη συνεργασία και τις ευχάριστες στιγμές που μοιραστήκαμε. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστάω στους γονείς μου και στον κ. Κομνή Θανάση, οι οποίοι στήριξαν πρακτικά τις επιλογές μου, αν και μπορεί να τις θεωρούσαν παράλογες και τους ανθρώπους που ήταν περισσότερο απ όλους κοντά μου αυτά τα χρόνια, τη Βάσω, τον Λευτέρη και τη Σιλένα. iv

6 Περίληψη Σκοπός: Η χημική ανάλυση, η ανίχνευση βαρέων μετάλλων και η διερεύνηση της κυτταροτοξικότητας έξι σκευασμάτων κονιών με βάση το πυριτικό ασβέστιο. Οι μηδενικές υποθέσεις ήταν ότι δεν υπήρχε διαφορά στις περιεκτικότητες σε βαρέα μέταλλα μεταξύ των σκευασμάτων που εξετάστηκαν και στην κυτταροτοξικότητα τους. Μεθοδολογία: Τα υλικά που μελετήθηκαν ήταν το MTA-CAPS, το White MTA Angelus, το ΜΤΑ+ Cerkamed, το Masterdent MTA, το Biodentine και το White ProRoot MTA. To πειραματικό μέρος της παρούσας εργασίας περιλαμβάνει δύο πειραματικά στάδια. Στο πρώτο στάδιο έγινε πολυστοιχειακή ανάλυση των υλικών για την ανίχνευση βαρέων μετάλλων με την τεχνική της φασματομετρίας ατομικής εκπομπής επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP- AES). Παρασκευάστηκαν τέσσερα δείγματα από το κάθε υλικό (n=4). Η πέψη των υλικών έγινε με τη χρήση μίγματος οξέων (HNO3 65% - HCl 37% - HF 48% και θέρμανσης. Η σάρωση των δειγμάτων έγινε για έντεκα μέταλλα τα οποία ήταν το νικέλιο (Ni), το χρώμιο (Cr), ο σίδηρος (Fe), ο μόλυβδος (Pb), το κάδμιο (Cd), ο ψευδάργυρος (Zn), ο χαλκός (Cu), το αργίλιο (Al), το αρσενικό (As), το μαγγάνιο (Mn) και το βισμούθιο (Bi). Στο δεύτερο στάδιο έγινε μελέτη της πιθανής κυτταροτοξικής δράσης των ίδιων σκευασμάτων in vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες ανθρώπινων ινοβλαστών MRC 5. Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε σε τυπικές συνθήκες επώασης (37 C, 5% CO 2, 100% σχετική υγρασία). Από τα εξετασθέντα υλικά παρασκευάστηκαν εκχυλίσματα σε θρεπτικό υλικό (DMEM) και ακολούθως η κυτταροτοξικότητα μελετήθηκε σε δύο χρόνους έκθεσης (24 και 72 ώρες) με τη χρωματομετρική μέθοδο της Σουλφοροδαμίνης Β (SRB) συγκριτικά με τους μάρτυρες. Τo πείραμα έγινε σε τριπλά δείγματα και επαναλήφθηκε τουλάχιστον 2 φορές. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τις δοκιμασίες One-way analysis of variance (ANOVA) και t-paired test, ενώ για τις πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκαν το Tukey multiple comparison και το v

7 Βonferroni test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε p<0.05. Για την ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό IBMSPSS 21. Αποτελέσματα: Σε όλες τις κονίες πυριτικού ασβεστίου ανιχνεύθηκαν αργίλιο και βισμούθιο σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Σίδηρος ανιχνεύθηκε στο MTA- CAPS, στο Masterdent και στο White ProRoot MTA, σε επίπεδα με μη στατιστικώς σημαντικές διαφορές. Επιπλέον, στο MTA-CAPS ανιχνεύθηκε μόλυβδος, ψευδάργυρος και αρσενικό. Όσον αφορά στην κυτταροτοξικότητα, στις 24 ώρες το White MTA Angelus φάνηκε να έχει στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με τα υπόλοιπα σκευάσματα (p<0,05), ενώ στις 72 ώρες η δράση όλων των εξετασθέντων υλικών ήταν παρόμοια. Συμπεράσματα: Όλα τα εξετασθέντα υλικά περιείχαν βαρέα μέταλλα σε διάφορες συγκεντρώσεις, μικρότερες όμως από τα όρια ασφαλείας. Το MTA- CAPS παρουσίασε τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε βαρέα μέταλλα και ήταν το μόνο στο οποίο ανιχνεύθηκε αρσενικό, μόλυβδος και ψευδάργυρος. Κανένα στοιχείο απ αυτά για τα οποία σαρώθηκαν τα δείγματα δεν ανιχνεύθηκε στο Biodentine. Όλα τα σκευάσματα έδειξαν καλή βιοσυμβατότητα, με εξαίρεση το White MTA Angelus στις 24 ώρες, το οποίο παρουσίασε μέτρια κυτταροτοξικότητα. Παρόλο που είναι γνωστή η κυτταροτοξική δράση των βαρέων μετάλλων, στις πειραματικές συνθήκες της παρούσας εργασίας δεν επιβεβαιώθηκε άμεση συσχέτιση μεταξύ της ύπαρξης τους στη σύσταση των δειγμάτων και της κυτταροτοξικότητας των κονιών πυριτικού ασβεστίου. Λέξεις-κλειδιά: κονίες πυριτικού ασβεστίου, ΜΤΑ, Biodentine, βαρέα μέταλλα, κυτταροτοξικότητα vi

8 Abstract Introduction: Mineral trioxide aggregate (MTA) was developed in 1993 as a root perforation repair material at Loma Lida University (Loma Lida, CA, USA). Since its approval by the US Food and Drug Administration in 1998, it has been used in Endodontics for numerous clinical procedures such as root perforation repair, one-visit apexification, periapical surgery as a retrogate filling material, vital pulp therapy as pulp capping material and pulpotomy of primary teeth. The first mineral trioxide aggregate formulation, commercialized under the name ProRoot MTA (Dentsply, Tulsa, OK, USA), was a mixture of Portland cement and bismuth oxide in 4:1 ratio. Several new calcium-silicate materials have been introduced aiming to alleviate the drawbacks of MTA, with minor variations in composition among those available on the market, such as the inclusion of calcium chloride, calcium carbonate, silicon dioxide, or the omission of calcium sulfate. The fact that mineral trioxide aggregate is refined from Portland cement leads to suspicion of possible contaminants or trace metals constituents in the commercial products. To ensure lack of contamination, MTA manufacturers claim to use materials derived from pure laboratory-grade materials. However, several researchers have detected traces of arsenic, lead and chromium in MTA cements. The variation of the results of the relative studies could be attributed to the different methods and apparatus used. Given the clinical applications of calcium-silicate cements and the fact that they are placed in direct contact with pulpal or periradicular tissues, it is essential for them to be non-toxic and biocompatible regarding host tissues. There are several in vitro and in vivo studies evaluating the biocompatibility of MTAs and alternative calcium silicate cements. In fact, the results of a meta-analysis on retrograde filling materials showed that MTA is more appropriate in terms of vii

9 biocompatibility than Super-EBA, IRM and silver amalgam. Nevertheless, studies comparing the biocompatibility of different MTA brands and new calciumsilicate cements, such as Biodentine, remain sparse. Aim: The aim of this study is to assess the cytotoxicity of six calcium-silicate endodontic cements currently available on the market by evaluating their effect on the cell viability of human cultured fibroblasts and to evaluate the concentrations of eleven heavy metals (Ni, Cr, Fe, Pb, Cd, Zn, Cu, Al, As, Mn, Bi) in the same materials using inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES). The null hypotheses are that the tested materials had no differences in cytotoxicity and in the levels of these eleven heavy metals. Methodology: The tested materials were MTA-CAPS, White MTA Angelus, MTA+, MASTERDENT MTA, Biodentine and ProRoot MTA White. The present study consists of two parts. At the first part a total of 0.2 g of each MTA was digested using a mixture of strong acids (HNO3 65% - HCl 37% - HF 48%) and filtered. Eleven heavy metals in the resulting filtrates were analysed by inductively coupled-plasma atomic emission spectrometry (n=4). All ICP-AES measurements were carried out using a Perkin Elmer (MA, USA) Optima 3100XL axial viewing spectrometer. At the second part extracts derived from the calcium silicate-based cements were incubated with MRC5 cells (human lung fibroblasts) for 24 and 72 h. The cytotoxicity was assessed by sulforhodamine-b assay. Each experiment was carried out at least twice. The results were expressed as survival fraction, which was calculated as the percentage of test OD to control OD (plain medium was added to the control wells). The statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOVA) and t- paired test and, since these tests resulted in significant differences, Tukey multiple comparison and Bonferroni post-hoc tests. Significance level for hypothesis rejection was set to p=0.05. viii

10 Results: Aluminiun and bismuth were detected in different concentrations in all the materials tested. Iron was detected in MTA-CAPS, Masterdent and White ProRoot MTA in similar concentrations. Moreover, in MTA-CAPS we found traces of lead, zinc and arsenic. Concerning to the cytotoxicity, White MTA Angelus showed the highest cytotoxic effect at 24 hours incubation, whereas at 72 hours all the cements had similar effects on cell viability. Conclusions: This study indicated that all the cements, except Biodentine, contain traces of heavy metals, although in concentrations below the safety limits. Furthermore, all the calcium silicate-based cements tested exerted similar cytotoxic profile, except for White MTA Angelus that had a significantly higher effect. A remarkable observation is that although MTA-CAPS contains heavy metals in higher concentrations, it did not exert the highest cytotoxic effect, suggesting that the underlying mechanism of the interaction between the heavy metal content and the cytotoxic effect is not clear. Keywords: calcium-silicate cements, cytotoxicity, ICP-AES, mineral trioxide aggregate, heavy metals, Biodentine ix

11 Περιεχόμενα Εξώφυλλο Εσώφυλλο Εσώφυλλο στην αγγλική Ευχαριστίες Περίληψη Περίληψη στην αγγλική Πίνακας Περιεχομένων i ii iii v vi x Εισαγωγή 1 Υλικά και μέθοδοι 11 Αποτελέσματα 26 Συζήτηση 31 Συμπεράσματα 38 Βιβλιογραφία 39 x

12 Εισαγωγή Το MTA (Mineral Trioxide Aggregate ή συσσωμάτωμα ορυκτών τριοξειδίων) κατασκευάστηκε το 1993 από την ομάδα του καθηγητή Torabinejad (Lee και συν., 1993) στο Πανεπιστήμιο Loma Linda (Καλιφόρνια, ΗΠΑ) και προτάθηκε αρχικά για χρήση ως υλικό έμφραξης διατρήσεων ρίζας. Έχει ευρύτατη χρήση μέχρι σήμερα στην Οδοντιατρική, σε πολυάριθμες κλινικές διαδικασίες, όπως έμφραξη διατρήσεων (Ford και συν., 1995, Nakata και συν., 1998, Mente και συν., 2014), ακρορριζοαπόφραξη (Shabahang και συν., 1999, Hayashi και συν., 2004, Simon και συν., 2007), ανάστροφη έμφραξη ριζικού σωλήνα σε περιστατικά περιακρορριζικής χειρουργικής (Torabinejad και συν., 1995b, Toraninejad και συν., 1995), άμεση κάλυψη πολφού (Ford και συν., 1996, Parikokh και συν., 2011) και πολφοτομή νεογιλών δοντιών (Asgary και συν., 2014). Η πρώτη κονία πυριτικού ασβεστίου που κυκλοφόρησε στην αγορά ήταν το ProRoot MTA (Dentsply, Tulsa, OK, USA) και η σύσταση της περιελάμβανε τσιμέντο Portland σε ποσοστό 80% και οξείδιο του βισμουθίου σε ποσοστό 20%. Η βασική διαφορά μεταξύ του τσιμέντου Portland και του ΜΤΑ είναι, εκτός από την προσθήκη του οξειδίου του βισμουθίου, η έλλειψη καλίου. Τα βασικά συστατικά των κονιών πυριτικού ασβεστίου είναι το πυριτικό ασβέστιο και το αργιλικό ασβέστιο (Asgary και συν., 2005, Camilleri και συν., 2006, Asgary και συν., 2006). Εξαιτίας της πρόκλησης δυσχρωμίας που παρατηρήθηκε από τη χρήση του πρώτου σκευάσματος ΜΤΑ, η κατασκευάστρια εταιρεία προχώρησε στην παρασκευή του λευκού ΜΤΑ (Kratchman, 2004). Το πρωτότυπο σκεύασμα αποτελείται κυρίως από διπυριτικό και τριπυριτικό ασβέστιο και οξείδιο του βισμουθίου, ενώ η λευκή έκδοση από τριπυριτικό ασβέστιο και οξείδιο του βισμουθίου (Camilleri και συν., 2005). Οι έρευνες έχουν δείξει, επίσης, μικρότερη ποσότητα σιδήρου, 1

13 αργιλίου και μαγνησίου στην λευκή έκδοση (Asgary και συν., 2005, Camilleri και συν., 2005). Η σκόνη του ΜΤΑ αναμιγνύεται με υγρό σε αναλογία 3:1 (Torabinejad και συν., 1993). Το υγρό που χρησιμοποιείται συνήθως και περιλαμβάνεται στη συσκευασία των ΜΤΑ των περισσότερων εταιρειών είναι το νερό. Κατά την αντίδραση ενυδάτωσης, τα υδρόφιλα άτομα διπυριτικού και τριπυριτικού ασβεστίου αντιδρούν και σχηματίζουν μια ενυδατωμένη γέλη πυριτικού ασβεστίου (C-S-H), η οποία σκληραίνει με την πάροδο του χρόνου, και υδροξείδιο του ασβεστίου (Camilleri, 2007). To υδροξείδιο του ασβεστίου που σχηματίζεται είναι υπεύθυνο για την υψηλή αλκαλικότητα του ΜΤΑ κατά την πήξη του (Camilleri, 2008). Ο μέσος χρόνος πήξης των σκευασμάτων ΜΤΑ είναι 165±5 λεπτά, και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την αναλογία σκόνης/υγρού και είναι από τα μεγαλύτερα μειονεκτήματα του, καθώς δυσχεραίνει τις θεραπείες μιας συνεδρίας (Torabinejad και συν., 1995). Το γκρι ΜΤΑ έχει μεγαλύτερο χρόνο αρχικής και τελικής πήξης από το λευκό. Πολλοί ερευνητές έχουν επιχειρήσει την μείωση του χρόνου πήξης με την προσθήκη διάφορων επιταχυντών πήξης, όπως υποχλωριώδες νάτριο, λιπαντικό υγρό Κ-Y, χλωριούχο ασβέστιο, λιδοκαϊνη, γέλη χλωρεξιδίνης και μυρμικικό ασβέστιο (Kogan και συν., 2006, Ber και συν., 2007, Wiltbank και συν., 2007, AlAnezi και συν., 2011). Η διαλυτότητα του ΜΤΑ είναι ένα θέμα που απασχόλησε πολλές έρευνες, οι οποίες οδήγησαν σε αντικρουόμενα αποτελέσματα, με τις περισσότερες να υποστηρίζουν ότι το υλικό παρουσιάζει μικρή ή καθόλου διαλυτότητα (Toraninejad και συν., 1995, Islam και συν., 2006a, Danesh και συν., 2006, Poggio και συν., 2007), ενώ μία μακροπρόθεσμη έρευνα να δείχνει σημαντική διαλυτότητα (Fridland & Rosado, 2005). H διαλυτότητα του έχει αποδοθεί στο σχηματισμό και την απελευθέρωση υδροξειδίου του ασβεστίου (Shie και συν., 2009). 2

14 Όσον αφορά στην αλκαλικότητα του υλικού, η τιμή του ph είναι 10,2 αμέσως μετά την ανάμιξη σκόνης και υγρού, και στη συνέχεια φτάνει το 12,5 μέσα σε 3 ώρες (Torabinejad και συν., 1995). Οι Fridland και Rosado (Fridland & Rosado, 2005) έδειξαν ότι η τιμή του ph διατηρείται σε υψηλές τιμές για μεγάλο χρονικό διάστημα, γεγονός που απέδωσαν στη συνεχή απελευθέρωση ασβεστίου και στο σχηματισμό υδροξειδίου του ασβεστίου. Στο υψηλό ph αποδίδονται και οι αντιμικροβιακές του ιδιότητες. Παρουσιάζει επαρκή αντιμικροβιακή δράση για τα προαιρετικά αναερόβια βακτήρια, ενώ για τα υποχρεωτικά αναερόβια η δράση του είναι αμελητέα σε σχέση με το Super EBA και την κονία ZOE (Torabinejad και συν., 1995a). Η αποτελεσματικότητα του απέναντι στους μύκητες είναι σχετικά περιορισμένη, ενώ έχει βρεθεί ότι εξαρτάται από τη συγκέντρωση του (Estrela και συν., 2000, Al-Hezaimi και συν., 2005). Αρκετές έρευνες έχουν δείξει ότι το ΜΤΑ έχει καλή αποφρακτική ικανότητα (Lee και συν., 1993, Torabinejad και συν., 1995, Wu και συν., 1998, Weldon και συν., 2002, Gandolfi και συν., 2007) και οριακή προσαρμογή (Torabinejad και συν., 1995), εξαιρετικές βιολογικές ιδιότητες (Koh και συν., 1997, Koh και συν., 1998) και ικανότητα να προάγει το σχηματισμό σκληρού ιστού και τη διαφοροποίηση των οδοντινοβλαστών (Min και συν., 2008, Maeda και συν., 2010). Ο ακριβής μηχανισμός της βιολογικής του συμπεριφοράς δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά από ό,τι είναι γνωστό μέχρι σήμερα το ΜΤΑ αφού τοποθετηθεί σε επαφή με ιστό σχηματίζει υδροξείδιο του ασβεστίου που απελευθερώνει ιόντα ασβεστίου για προσκόλληση και πολλαπλασιασμό κυττάρων, δημιουργεί αντιμικροβιακό περιβάλλον λόγω του αλκαλικού ph, ρυθμίζει την παραγωγή κυτοκίνης και παράγει υδροξείδιο του απατίτη στην επιφάνεια του (Parikokh & Torabinejad 2010b). Η ακτινοσκιερότητα είναι άλλη μια ιδιότητα των κονιών πυριτικού ασβεστίου που τις καθιστά υλικό εκλογής για ανάστροφη έμφραξη. Όπως είναι 3

15 κατανοητό, ένα υλικό ανάστροφης έμφραξης θα πρέπει να διαθέτει μεγάλη ακτινοσκιερότητα, καθώς τοποθετείται σε μικρότερο πάχος σε σχέση με άλλα υλικά έμφραξης (πχ γουταπέρκα και φύραμα έμφραξης των ριζικών σωλήνων). Το συστατικό που προσδίδει την ακτινοσκιερότητα είναι το οξείδιο του βισμουθίου (Bi 2 O 3 ). Στη βιβλιογραφία έχουν εκφραστεί ανησυχίες σχετικά με την παρουσία το οξειδίου στου βισμουθίου, καθώς δεν συμμετέχει στην αντίδραση πήξης του υλικού (Camilleri, 2008) και έχει αποδειχθεί τοξικό για τα κύτταρα του πολφού (Min και συν., 2007). Οι Coomaraswamy και συν. έδειξαν ότι η προσθήκη οξειδίου του βισμουθίου στο τσιμέντο Portland αλλάζει δραματικά τις φυσικές ιδιότητες του, δημιουργώντας ατέλειες μέσα στη μάζα του τσιμέντου και καθιστώντας το περισσότερο πορώδες (Coomaraswamy και συν., 2007). Τα ευρήματα αυτά οδηγούν πιθανότατα σε μεγαλύτερη διαλυτότητα και αποδόμηση του υλικού. Tα μειονεκτήματα που αφορούν στη χρήση του ΜΤΑ περιλαμβάνουν το μεγάλο χρόνο πήξης, τη δυσκολία στο χειρισμό του υλικού, περιορισμένη αντίσταση στο διάλυση πριν την πήξη και την πρόκληση δυσχρωμίας (Parikokh & Torabinejad 2010b, Torabinejad & Parikokh, 2010, Parikokh & Torabinejad, 2010a). Πολλά καινούρια υλικά με βάση το πυριτικό ασβέστιο έχουν παραχθεί, με στόχο να βελτιωθούν τα μειονεκτήματα του ΜΤΑ. Παρόλα αυτά, έχουν γίνει ελάχιστες τροποποιήσεις στη σύσταση τους, όπως η προσθήκη χλωριούχου ασβεστίου, ανθρακικού ασβεστίου, διοξειδίου του πυριτίου ή η αφαίρεση του θειικού ασβεστίου (Wilitbank και συν., 2007, Akbari και συν., 2013, Bramante και συν., 2013). Πρόσφατα κυκλοφόρησε στην αγορά το Biodentine από την Septodont (Septodont, Saint Maur des Faussés, France) ως υλικό υποκατάστασης της οδοντίνης με όμοιες κλινικές εφαρμογές με το ΜΤΑ. Σύμφωνα με τους 4

16 ισχυρισμούς της κατασκευάστριας εταιρείας χρησιμοποιήθηκε η καινοτόμος τεχνολογία «Βιο-ενεργού πυριτίου», η οποία στοχεύει στον έλεγχο του κάθε σταδίου της παραγωγής του προϊόντος ξεκινώντας από την καθαρότητα των πρώτων υλών. H σκόνη του Biodentine αποτελείται από τριπυριτικό ασβέστιο, ανθρακικό ασβέστιο και οξείδιο του ζιρκονίου, ενώ το υγρό με το οποίο γίνεται η ανάμιξη περιέχει χλωρίδιο του ασβεστίου για την επιτάχυνση της πήξης και ένα υδατοδιαλυτό πολυμερές. Το υλικό διατίθεται στην μορφή κάψουλας, η οποία αφού προστεθεί το υγρό, τοποθετείται σε συσκευή ανάμειξης με ταχύτητα της τάξης των ταλαντώσεων/ λεπτό για 30 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια το περιεχόμενο της τοποθετείται στην κοιλότητα με τη χρήση εργαλείου χειρός. Στις βελτιωμένες ιδιότητες του συγκαταλέγονται, εκτός από τον μικρότερο χρόνο πήξης (9 λεπτά), η βιοσυμβατότητα (Zhou και συν., 2013), οι καλύτερες μηχανικές ιδιότητες σε σχέση με το ProRoot MTA και το ΜΤΑ Angelus (Natale και συν., 2015, Kayahan και συν., 2013) και η πρόκληση σχηματισμού γέφυρας οδοντίνης σε περιπτώσεις κάλυψης πολφού (Tran και συν., 2012, Nowicka και συν., 2013). Το συστατικό που προσδίδει ακτινοσκιερότητα στο Biodentine είναι το οξείδιο του ζιρκονίου, το οποίο σε αντίθεση με το οξείδιου του βισμουθίου, είναι απόλυτα βιοσυμβατό και προσδίδει καλές μηχανικές ιδιότητες και αντίσταση στη διάλυση (Piconi & Maccauro, 1999). Ωστόσο, οι Tanalp και συν. βρήκαν ότι έχει σημαντικά χαμηλότερη ακτινοσκιερότητα σε σχέση με το MTA-Angelus και το ΜΜ-ΜΤΑ, και μάλιστα ελαφρώς χαμηλότερη από αυτήν που ορίζει η προδιαγραφή ISO 6876:2001 για τις κονίες που χρησιμοποιούνται στην Ενδοδοντία (Tanalp και συν., 2013). Ακόμη μία εταιρεία που στόχευσε στην παραγωγή κονίας πυριτικού ασβεστίου με βελτιωμένες ιδιότητες χειρισμού είναι η Acteon (Merignac, France), η οποία κατασκεύασε το MTA-CAPS. Το υλικό αυτό κυκλοφορεί επίσης σε κάψουλες μίας δόσης, που αναμειγνύονται σε δονητή αμαλγάματος. Πρόκειται για πολύ 5

17 νέο υλικό για το οποίο δεν υπάρχουν πληροφορίες στη βιβλιογραφία σχετικά με τις βιολογικές και φυσικομηχανικές ιδιότητες του. Η σύσταση του είναι παρόμοια με του πρωτότυπου ΜΤΑ, με τη διαφορά ότι η ουσία που του προσδίδει ακτινοσκιερότητα είναι το βολφραμικό ασβέστιο (Setbon και συν., 2014). Το γεγονός ότι στην πρωτότυπη σύσταση του ΜΤΑ περιλαμβάνονταν τσιμέντο Portland οδηγεί σε υπόνοιες για την ύπαρξη βαρέων μετάλλων στη σύσταση των εμπορικών σκευασμάτων ΜΤΑ. Για την παρασκευή του τσιμέντου Portland αναμιγνύονται σε κλίβανο ασβεστώδη και αργιλώδη υλικά σχηματίζοντας εξυαλώμενο άνθρακα, ο οποίος στη συνέχεια αλέθεται με γύψο. Συχνά κατά την διαδικασία της παραγωγής τα πρωτογενή καύσιμα αντικαθίσταται από άλλα κατώτερης ποιότητας με στόχο τη μείωση του κόστους ή χρησιμοποιούνται απόβλητα ως πρώτες ύλες. Με τον τρόπο αυτό, ίχνη βαρέων μετάλλων μπορεί να ενσωματωθούν στη σύσταση του τελικού προϊόντος (Achternbosch και συν., 2005). Για να διασφαλίσουν την απουσία προσμίξεων, οι κατασκευαστές των οδοντιατρικών κονιών πυριτικού ασβεστίου ισχυρίζονται ότι χρησιμοποιούν πρώτες ύλες που παράγονται εργαστηριακά, ελέγχοντας κάθε στάδιο μέχρι την παραγωγή του τελικού προϊόντος (Chen και συν., 2009). Ωστόσο, αρκετοί ερευνητές έχουν ανιχνεύσει ίχνη βαρέων μετάλλων σε σκευάσματα ΜΤΑ (Duarte και συν., 2005, Monteiro και συν., 2008, De-Deus και συν., 2009, Chang και συν., 2010, Matsunaga και συν., 2010, Schembri και συν., 2010). Τα αντικρουόμενα αποτελέσματα και οι διαφορετικές τιμές που παρουσιάζουν οι διάφορες μελέτες οφείλονται πιθανόν στις διαφορετικές πειραματικές μεθόδους και τον εξοπλισμό που χρησιμοποιήθηκε. Χημική ανάλυση του ΜΤΑ, όπως και του τσιμέντου Portland, έχει επιχειρηθεί με διάφορες μεθόδους, όπως φασματοσκοπία της Ενέργειας Διασποράς των ακτινών-χ (Energy dispersive analysis with X-ray), Φασματομετρία Ατομικής Εκπομπής Επαγωγικά Συζευγμένου Πλάσματος (Inductively Coupled Plasma 6

18 Atomic Emission Spectrometry, ICP-AES), ανάλυση διάθλασης ακτίνων-χ (X-ray diffraction analysis) και φασματομετρία φθορισμού ακτινών-χ (X-ray fluorescence spectrometry) (Torabinejad και συν., 1995, Asgary και συν., 2004, Asgary και συν., 2005, Dammaschke και συν., 2005, Camilleri και συν., 2005, Camilleri και συν., 2005, Song και συν., 2006, Islam και συν., 2006, Oliviera και συν., 2007). Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η φασματομετρία ατομικής εκπομπής με πηγή διέγερσης επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα, η οποία είναι μία από τις πιο αξιόπιστες μεθόδους πολυστοιχειακής ανάλυσης. Η βασική αρχή στην οποία στηρίζεται είναι η διέγερση ατόμων σε ένα δείγμα από επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα και η καταγραφή της έντασης της ακτινοβολίας που εκπέμπεται κατά την αποδιέγερση των ατόμων. Το πλάσμα πλεονεκτεί σε σχέση με τις άλλες πηγές διέγερσης (φλόγα, βολταϊκό τόξο, σπινθήρες, πλάσμα, laser) λόγω της υψηλότερης θερμοκρασίας του, που επιτρέπει ποσοτικά μεγαλύτερη διέγερση στοιχείων. Η υψηλότερη θερμοκρασία του πλάσματος σε συνδυασμό με τη σχετικά μεγάλη διάρκεια αλληλεπίδρασης με το δείγμα επιτυγχάνει καλύτερη ατομοποίηση των στοιχείων μέσα στο δείγμα. Καθώς τα διεγερμένα άτομα αποδιεγείρονται επιστρέφοντας στη βασική τους κατάσταση, εκπέμπουν ακτινοβολία χαρακτηριστικού μήκους κύματος για το κάθε στοιχείο. Η ένταση της ακτινοβολίας αυτής είναι το μέτρο του αριθμού των ατόμων που διεγέρθηκαν και κατά συνέπεια της ποσότητας των στοιχείων αυτών στο αρχικό νέφος. Συνοπτικά ένα φασματόμετρο ατομικής εκπομπής με απαγωγικά συζευγμένο πλάσμα λειτουργεί ως εξής: το υγρό δείγμα μετατρέπεται σε αερόλυμα σε έναν εκνεφωτή και εισέρχεται μέσα στο πλάσμα το οποίο συντηρείται από την ισχύ που παρέχεται από μια γεννήτρια ραδιοσυχνότητας. Το πλάσμα είναι το μερικώς ιονισμένο αέριο υψηλής θερμοκρασίας που είναι ικανό να ατομοποιήσει και να διεγείρει τα περισσότερα στοιχεία του περιοδικού πίνακα. 7

19 Τα αέρια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ύλη του πλάσματος είναι το αργό, το ήλιο, το οξυγόνο καθώς και ο αέρας. Από αυτά, το αργό είναι το πιο διαδεδομένο, αφού έχει ικανοποιητικά χαρακτηριστικά ατομοποίησης, ιονισμού και διέγερσης, λαμβάνεται σε σχετικά καθαρή μορφή, έχει λογικό κόστος και είναι εύκολα διαθέσιμο. Το αερόλυμα μέσα στο πλάσμα αποδιαλυτώνεται, διασπάται, ατομοποιείται και διεγείρεται. Τα διεγερμένα άτομα κατά την αποδιέγερση τους εκπέμπουν χαρακτηριστικές φασματικές γραμμές οι οποίες αναλύονται στο οπτικό σύστημα, στη συνέχεια ανιχνεύονται από κατάλληλο ανιχνευτή και τέλος ενισχύονται και καταγράφονται ως σήματα έντασης της ακτινοβολίας. Σχηματική αναπαράσταση φασματοφωτόμετρο ICP-AES ( Μετατροπή απο διπλωματική εργασία Τρίκα Ευάγγελου, Υπ. Διδάκτορα του Τμήματος Αναλυτικής Χημείας του ΑΠΘ) 8

20 Οι κλινικές εφαρμογές των κονιών πυριτικού ασβεστίου και το γεγονός ότι τοποθετούνται σε άμεση επαφή με τον πολφικό ή τους περιακρορριζικούς ιστούς καθιστούν ιδιαίτερα σημαντική την βιοσυμβατότητα τους. Έχουν γίνει αρκετές in vitro και in vivo μελέτες σχετικές με την κυτταροτοξικότητα των ΜΤΑ και των διάφορων κονιών πυριτικού ασβεστίου. Οι μέθοδοι με τις οποίες έχει ελεχθεί η βιοσυμβατότητα του υλικού είναι ο έλεγχος της τοξικότητας του σε κυτταροκαλλιέργειες, δοκιμασίες εμφύτευσης και δοκιμασίες χρήσης σε πειραματόζωα. Τα αποτελέσματα μιας σχετικής μετα-ανάλυσης κατέδειξαν την υπεροχή του ΜΤΑ σε σχέση με το Super-EBA, το IRM και το αμάλγαμα (Sanchez και συν., 2008). Ωστόσο, δεν υπάρχουν μελέτες που να αξιολογούν την κυτταροτοξικότητα των νεώτερων σκευασμάτων κονιών πυριτικού ασβεστίου. Η τοξικότητα ενός υλικού μπορεί να ελεγχθεί με τις κυτταροκαλλιέργειες, παρατηρώντας τα κύτταρα άμεσα μετά την επαφή τους με το υλικό ή έμμεσα με την έκθεση τους στο εκχύλισμα του. Οι παράμετροι που αξιολογούνται είναι ο αριθμός των κυττάρων που επιβίωσαν, την πρωτεϊνική σύνθεση, την ενζυμική δραστηριότητα ή τη σύνθεση διαμεσολαβητών φλεγμονής (Schmalz, 1994). Στα πλεονεκτήματα των δοκιμασιών τοξικότητας με κυτταροκαλλιέργειες περιλαμβάνονται οι σταθερές και ελεγχόμενες συνθήκες, η τυποποίηση και ο απόλυτος έλεγχος της δόσης-συγκέντρωσης και του χρόνου έκθεσης. Τα μειονεκτήματα τους είναι η ανάγκη ύπαρξης ακριβού εξοπλισμού και αναλώσιμων και κατάλληλα καταρτισμένου προσωπικού, καθώς και η αδυναμία να απεικονίζουν τις in vivo μεταβολικές, φλεγμονώδεις και ανοσολογικές αντιδράσεις. Οι δοκιμασίες αυτές θεωρούνται κατάλληλες ως αρχική αξιολόγηση (προκλινικές μελέτες) των βασικών βιολογικών ιδιοτήτων των υλικών. Η εκτίμηση της επιβίωσης των κυττάρων μετά από έκθεση τους σε υπό εξέταση υλικά γίνεται με μεθόδους που μετρούν το τελικό αποτέλεσμα μεταβολικών, βιοχημικών, φυσικών ή χημικών παραγόντων. Τέτοιες μέθοδοι είναι ο 9

21 αποκλεισμός χρωστικών, οι μέθοδοι αλάτων τετραζολίου και η μέθοδος σουλφοροδαμίνης-β (SRB). H σουλφοροδαμίνη-β είναι μία κόκκινη, φθορίζουσα, στερεά και υδροδιαλυτή χρωστική αμινοξανθίνης που χρησιμοποιείται για τη χρώση των κυτταρικών πρωτεϊνών στις κυτταροκαλλιέργειες, και με τον τρόπο αυτό υπολογίζεται η συνολική πρωτεϊνική μάζα των κυττάρων. Σε όξινο περιβάλλον, δεσμεύεται από τα βασικά αμινοξέα των πρωτεϊνών σε κύτταρα που έχουν μονιμοποιηθεί και γίνεται ποσοτικοποίηση των κυτταρικών πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα της ποσοτικοποίησης αυτής, μπορούν να αναχθούν με ασφάλεια (Skehan και συν., 1990). Στα πλεονεκτήματα της συγκαταλέγονται η υψηλή ευαισθησία, η χρωματική σταθερότητα, η γραμμικότητα με τον αριθμό των κυττάρων και οι περιορισμένες απαιτήσεις της σε εξοπλισμό (Keepers και συν., 1991). Η κυτταροτοξικότητα του ΜΤΑ έχει ελεγχθεί σε αρκετές μελέτες και έχει συγκριθεί με διάφορα υλικά, όπως αμάλγαμα, Super EBA, IRM, υαλοϊονομερείς κονίες, γουταπέρκα, φυράματα έμφραξης ριζικών σωλήνων, κυανοακρυλικές κονίες και πάστες υδροξειδίου του ασβεστίου (Torabinejad και συν., 1995, Osorio και συν., 1998, Thomson και συν., 2003, Pistorius και συν., 2003, Balto, 2004, Pelliccioni και συν., 2004, Koulaouzidou και συν., 2005, Takita και συν., 2006, Yoshimine και συν., 2007, Koh και συν., 1998, Torabinejad & Parikokh 2010). Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών έδειξαν μια καλή βιολογική συμπεριφορά του ΜΤΑ και την υπεροχή του σε σχέση με τα άλλα υλικά. Εξαιτίας της διαφορετικής χημικής σύστασης μεταξύ του γκρι και λευκού ΜΤΑ, κρίθηκε σκόπιμο από πολλούς ερευνητές να ασχοληθούν με τη σύγκριση της κυτταροτοξικότητας τους και τα αποτελέσματα των ερευνών τους είναι αντικρουόμενα. Με τη χρήση οστεοβλαστών και MG-63 κυττάρων από οστεοσάρκωμα, το λευκό ΜΤΑ βρέθηκε πιο κυτταροτοξικό σε σύγκριση με το γκρι (Perez και συν., 2003), ενώ με τη χρήση κερατινοκυττάρων και οστεϊνοβλαστών συνέβη το αντίθετο (Oviir και συν., 2006). 10

22 Ο στόχος αυτής της διπλωματικής εργασίας είναι η χημική ανάλυση και η ανίχνευση βαρέων μετάλλων (Ni, Cr, Fe, Pb, Cd, Zn, Cu, Al, As, Mn, Bi) σε έξι σκευάσματα κονιών πυριτικού ασβεστίου διαφορετικών εταιρειών που πρόσφατα κυκλοφόρησαν στην αγορά και ο έλεγχος της κυτταροτοξικότητας των ίδιων σκευασμάτων. Οι υποθέσεις εργασίας είναι ότι δεν υπάρχουν διαφορές στην περιεκτικότητα των σκευασμάτων σε βαρέα μέταλλα και στην κυτταροτοξικότητα τους. Υλικά και μέθοδοι Φασματομετρία Ατομικής Εκπομπής Επαγωγικά Συζευγμένου Πλάσματος (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry, ICP-AES) Η χημική ανάλυση των κονιών πυριτικού ασβεστίου έγινε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με την τεχνική ICP-AES. Παρασκευή των δειγμάτων Τα υλικά που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι το ΜΤΑ-CAPS (Acteon, Merignac, France), το White MTA Angelus (Angelus, Londrina, parana, Brazil), το ΜΤΑ+ (Cerkamed, StalowaWola, Polska), το ΜΑSTERDENT MTA (Dentonics, Inc., Monroe, North Carolina, USA), το Biodentine (Septodont, Saint Maur des Fausses, France) και το White ProRoot MTA (Mailfer, Dentsply, Switzerland) (Πίνακας 1). Από κάθε υλικό ετοιμάστηκαν 4 δείγματα (n=4). Για το κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 0,2 γρ. σκόνης από το κάθε υλικό και μεταφέρθηκαν στα ειδικά ποτηράκια Teflon του συστήματος πέψης (Sanplatec, Osaka, Japan). Σε κάθε ποτηράκι προστέθηκαν 2 ml HNO 3 (HNO3 65%, Chem-Lab, Zedelgem, Belgium), 3 ml HCl (HCl 37%, Carlo Erba Reagents, Italy) και 2 ml HF (HF 48%, 11

23 Merck Millipore, Massachusetts, USA). Στη συνέχεια τα ποτηράκια κλειστά τοποθετήθηκαν στο μεταλλικό block, το οποίο κλείστηκε σφικτά, και τοποθετήθηκε σε θερμαντική επιφάνεια στους 220 ⁰C για 2 ώρες. Το σύστημα αφέθηκε να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου πριν ανοιχτεί και μεταφερθεί το διαλυμένο περιεχόμενο από τα ποτηράκια σε ογκομετρικές φιάλες των 25 ml. Οι ογκομετρικές φιάλες συμπληρώθηκαν με απιονισμένο νερό μέχρι τη χαραγή και τα δείγματα μεταφέρθηκαν για ανάλυση στο σύστημα ICP-AES. 12

24 Υλικό LOT / Εταιρεία MTA CAPS LOT: / Acteon, Merignac, France MTA Angelus LOT: 32317/ White Angelus, Londrina, parana, Brazil MTA + Cerkamed MASTERDENT MTA LOT: / Cerkamed, Stalowa Wola, Polska LOT: / Dentonics, Inc., Monroe, North Carolina, USA Biodentine LOT: B10981/ Septodont, Saint Maur des Faussés, France ProRoot MTA White Πίνακας 1 LOT: / Maillfer, Dentsply, Switzerland Σύσταση Σκόνη Mixing of mineral oxides based on calcium and tungstate Tricalcium silicate Dicalcium silicate Tricalcium aluminate Tetracalciumaluminoferrite Bismuth oxide Calcium hydroxide Silicon Iron Aluminium Sodium Potassium Bismuth Magnesium oxides Calcium phosphate Tricalcium silicate Dicalcium silicate Tricalcium silicate Dicalcium silicate Calcium Carbonate Calcium Oxide Iron oxide Zirconium oxide Portland cement Tricalcium silicate Bismuth oxide Dicalcium silicate Tricalciumaluminoferrite Tetracalciumaluminoferrite Calcium sulfate dehydrate or gypsum Υγρό Water Water Calcium chloride Hydrosoluble polymer 13

25 Όργανα Για τον προσδιορισμό των στοιχείων με την τεχνική της φασματομετρίας ατομικής εκπομπής με επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο ORTIMA 3100 XL (axial view) της εταιρίας Perkin Elmer. To όργανο αυτό αποτελείται από τη μονάδα εισαγωγής και διέγερσης του δείγματος, τη γεννήτρια ραδιοσυχνοτήτων, το φασματοφωτόμέτρο και τον ανιχνευτή. Η μονάδα εισαγωγής δείγματος αποτελείται από έναν θάλαμο ψεκασμού Ryton τύπου Scott διπλής κατεύθυνσης, ένα εκνεφωτή διασταυρούμενης ροής και ένα πυρσό τοποθετημένο οριζόντια και στον ίδιο άξονα με το φασματοφωτόμετρο. Η γεννήτρια ραδιοσυχνοτήτων είναι ελεύθερης διαδρομής των 40 MHz και παρέχει ισχύ Watt. Το φασματοφωτόμετρο συνδυάζει έναν πολυχρωμάτορα τύπου Echelle και έναν ανιχνευτή στερεής κατάστασης της εταιρίας Perkin Elmer. Στον πολυχρωμάτορα υπάρχουν δύο δακτυλιοειδής καθρέπτες που κατευθύνουν την εκπεμπόμενη ακτινοβολία μέσα στη σχισμή της εισόδου του. Ο πρώτος καθρέπτης ελέγχεται από ηλεκτρονικό υπολογιστή και μπορεί να περιστραφεί κατακόρυφα ή οριζόντια. Ανάμεσα από το φράγμα τύπου Echelle και τον ανιχνευτή UV παρεμβάλλεται μία συσκευή σταυρωτής διασποράς τύπου Schmidt. Η συσκευή αυτή είναι ένα φράγμα με πυκνότητα γραμμών 374 γραμμές ανά mm. Ο ανιχνευτής είναι συζευγμένου φορτίου και καλύπτει την περιοχή υπεριώδους ακτινοβολίας από nm. Αποτελείται από ένα chip σιλικόνης με εμβαδόν mm. Όλο το οπτικό σύστημα του οργάνου είναι εσώκλειστο μέσα σε ένα θερμοστατούμενο χώρο (36-40 C). Ο ανιχνευτής περιβάλλεται από ένα χώρο που θερμοστατείται σε χαμηλότερη θερμοκρασία (-40 0 C). 14

26 Απαραίτητη προϋπόθεση για τα όργανα με οριζόντιο πλάσμα είναι το αέριο διάτμησης (shear gas) το οποίο ρέει κάθετα και μέσα από το πλάσμα. Το αέριο είναι συνήθως συμπιεσμένος αέρας ή αέριο άζωτο και ο ρόλος του είναι να εκφορτίζει την κορυφή του πλάσματος ώστε να μειώνονται τα φαινόμενα αυτοαπορρόφησης. Το όργανο διαθέτει ακόμη ένα σύστημα ασφαλείας (interlocks) το οποίο προκαλεί την διακοπή του πλάσματος μόλις αντιληφθεί κάποιο σφάλμα ή πρόβλημα κατά τη λειτουργία του οργάνου. Τέλος οι χειρισμοί του οργάνου, οι διάφορες συνθήκες λειτουργίας και οι παράμετροι καθορίζονται με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή με κατάλληλο λογισμικό. Οι παράμετροι λειτουργίας του οργάνου καθορίστηκαν όπως αυτές φαίνονται στον πίνακα 2. Ισχύς γεννήτριας ραδιοσυχνοτήτων Παροχή αερίου αργού εκνέφωσης Παροχή αερίου αργού ψύξης Βοηθητική παροχή αερίου αργού Παροχή εισαγωγής δείγματος 1300W 0,85 L/min 15 L/min 0,5 L/min 2 ml/min Πίνακας 2 Τα μήκη κύματος των φασματικών γραμμών οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των μετάλλων Ni, Cr, Fe, Pb, Cd, Zn, Cu, Al, As, Mn και Bi ήταν 341,476, 357,869, 259,939, 217,000, 226,502, 202,548, 324,752, 308,215, 193,696, 257,610 και 306,766 αντίστοιχα. 15

27 Αντιδραστήρια Για την παρασκευή των διαλυμάτων τα οποία μετρήθηκαν με την τεχνική ICP- AES, χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα του οίκου Merck (Darmstadt, Germany), συγκέντρωσης 1000 mg/l, των στοιχείων Ni, Cr, Fe, Pb, Cd, Zn, Cu, Al, As, Mn και Bi. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν όλα αναλυτικώς καθαρά. Για την παρασκευή των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε απιονισμένο νερό και HCl οξύ συγκέντρωσης 3Μ. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα τα οποία πάρθηκαν από τη μέτρηση των διαλυμάτων χαράχτηκαν οι καμπύλες αναφοράς για το κάθε στοιχείο, οι οποίες παρατίθενται στη συνέχεια. 16

28 Emission Emission Ni y = 16173x + 652,25 R² = Concentration (mg/l) Cr y = 99783x R² = 0, Concentration (mg/l) 17

29 Emission Emission Fe y = 16318x R² = 0, Concentration (mg/l) Pb y = 449,17x + 351,04 R² = 0, Concentration (mg/l) 18

30 Emission Emission Cd y = 3722,1x ,8 R² = 0, Concentration (mg/l) Zn y = 520,42x ,3 R² = 0, Concentration (mg/l) 19

31 Emission Emission Cu y = x R² = 0, Concentration (mg/l) Al y = 14164x ,1 R² = 0, Concentration (mg/l) 20

32 Emission Emission As y = 109,11x + 116,73 R² = 0, Concentration (mg/l) Mn y = 72759x R² = 0, Concentration (mg/l) 21

33 Κυτταροτοξικότητα Ο έλεγχος της κυτταροτοξικότητας των έξι οδοντιατρικών κονιών με βάση το πυριτικό ασβέστιο πραγματοποιήθηκε στη μονάδα κυτταροκαλλιεργειών του Εργαστηρίου Βασικών Οδοντιατρικών Επιστημών του Τομέα Παθολογίας και Θεραπευτικής των Οδοντικών Ιστών του Τμήματος Οδοντιατρικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Όλες οι διαδικασίες καλλιέργειας κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε απαγωγό κάθετης νηματικής ροής (Laminar- Flow Hood, ESCO Airstream, Biotech, USA). Κυτταροκαλλιέργεια Για τις πειραματικές διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα MRC5 (ATCC, American Type Culture Collection, Middlesex, UK). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Τ-75 φλάσκες (Costar/Corning, NY, USA), πραγματοποιώντας ανακαλλιέργειες δύο φορές την εβδομάδα, στους 37 ⁰C σε ατμόσφαιρα αποτελούμενη από CO 2 σε ποσοστό 5% και σε συνθήκες 100% σχετικής υγρασίας. Ως θρεπτικό υλικό της καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκε Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM, Life, NY, USA), ενισχυμένο με 10% ορό βόειου εμβρύου (FBS, Gibco, Glascow, UK) και αντιβιοτικά (100IU/ml πενικιλίνη και 100mg/ml στρεπτομυκίνη). Το DMEM είναι ένα ισότονο διάλυμα ανόργανων αλάτων εμπλουτισμένο με αμινοξέα, βιταμίνες και άλλα βιολογικά προϊόντα όπως ορό, αλβουμίνη σε ιδανικές αναλογίες (Dulbecco & Freeman, 1959). Τα κύτταρα εξετάζονταν καθημερινά και όταν πλησίαζαν το 80% της κάλυψης της βάσης της φλάσκας (δύο φορές την εβδομάδα) υποβάλλονταν σε ανακαλλιέργεια, προκειμένου να συνεχιστεί ομαλά ο πολλαπλασιασμός τους. Ενοφθαλμισμός κυττάρων Μεταξύ του όγδοου και του ένατου κύκλου, έγινε έλεγχος της πυκνότητας των κυττάρων με τη χρήση της μεθόδου αποκλεισμού χρωστικής κυανό του 22

34 τρυπανίου (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) σε αιμοκυτόμετρο (Newbauer Improved Bright-line, HBG, Western Germany) και αναγωγή των αποτελεσμάτων σε αριθμό κυττάρων/ml. Το κυανό του τρυπανίου (ΤΒ) είναι μία μπλε χρωστική που χρωματίζει επιλεκτικά τα νεκρά κύτταρα. Τα ζωντανά κύτταρα δεν χρωματίζονται, επειδή διατηρούν ακέραιες τις κυτταρικές τους μεμβράνες και η συγκεκριμένη χρωστική δεν μπορεί να τις διαπεράσει (Louis & Siegel, 2011). Αφού επιβεβαιώθηκε ότι τα κύτταρα βρίσκονταν στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης, αποκολλήθηκαν από την επιφάνεια της φλάσκας με την προσθήκη 2-3 ml μίγματος τρυψίνης (Gibco, 1:250) και 0,02% EDTA για 5 λεπτά στους 37 ⁰C. Στη συνέχεια τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης των 96 θέσεων (φρεατίων) με πυκνότητα 3000 κύτταρα ανά φρεάτιο (περιοχή ανάπτυξης 0,32 cm 2 ) σε 100 μl καλλιεργητικό μέσο. Οι πλάκες αφέθηκαν για 24 ώρες σε κλίβανο επώασης για να επαναλάβουν την εκθετική αύξηση. Παρασκευή εκχυλισμάτων των κονιών Οι κονίες παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών κάτω από άσηπτες συνθήκες και τοποθετήθηκαν σε κυλινδρικούς σωλήνες από τεφλόν (15 χιλ σε διάμετρο και 3 χιλ σε ύψος). Τα δείγματα αφέθηκαν να φτάσουν σε πλήρη πήξη στους 37 ⁰C και σε συνθήκες 100% σχετικής υγρασίας για 24 ώρες. Στη συνέχεια ζυγίστηκαν με ακρίβεια 0,001 g, εκτέθηκαν σε υπεριώδες φως για 20 λεπτά προς αποστείρωση και μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια που περιείχαν 5 ml DMEM. Η αναλογία βάρους προς όγκο που επιλέχθηκε για την παρασκευή των εκχυλισμάτων ήταν 0,2 gr/ml, σύμφωνα με την προδιαγραφή ISO Από κάθε φιαλίδιο αντλήθηκαν 5 ml εκχυλίσματος μετά από επώαση 24 ωρών σε θερμοκρασία 37 ⁰C και σε συνθήκες 100% σχετικής υγρασίας. Το κάθε εκχύλισμα αποστειρώθηκε με ένα 0,22 μm φίλτρο σύριγγας. 23

35 Έκθεση των κυττάρων στα εκχυλίσματα των υλικών Σε κάθε φρεάτιο με κύτταρα στις πλάκες μικροτιτλοδότησης προστέθηκαν 100 μl εκχυλίσματος και αφέθηκαν στον κλίβανο επώασης για 24 ή 72 ώρες. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν φρεάτια στα οποία προστέθηκαν 100 μl DMEM. Τα δείγματα ήταν τριπλά για κάθε υλικό και για κάθε χρόνο έκθεσης (24 και στις 72 ώρες). Στο τέλος του κάθε χρόνου έκθεσης, τα κύτταρα μετρήθηκαν με την δοκιμασία της σουλφοροδαμίνης-β (SRB). Χρωματομετρική δοκιμασία SRB H χρωματομετρική διαδικασία SRB πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε από τους Skenan και συν. (Skehan και συν., 1990) και τροποποιήθηκε από τους Παπαζήσης και συν. (Papazisis και συν., 1997). Συνοπτικά, το μέσο της καλλιέργειας αναρροφήθηκε από τα φρεάτια πριν από τη μονιμοποίηση των κυττάρων και 75 μl τριχλωρο-οξικού οξέος 10% προστέθηκε σε αυτά. Οι πλάκες αφέθηκαν για 30 λεπτά στους 4 ⁰C, ξεπλύθηκαν πέντε φορές με απιονισμένο νερό και αφέθηκαν να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Στη συνέχεια, σε κάθε φρεάτιο προστέθηκαν 70 μl 0,4% (w/v) της χρωστικής σουλφοροδαμίνης-β (Sigma Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) σε διάλυμα οξικού οξέος 1% και αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Στην συνέχεια οι πλάκες αδειάστηκαν και ξεπλύθηκαν 5 φορές με διάλυμα οξικού οξέος 1% πριν αφεθούν να στεγνώσουν για τουλάχιστον 24 ώρες. Η χρωστική που έμεινε δεσμευμένη με τα αμινοξέα, διαλυτοποιήθηκε με την προσθήκη 70 μl ανά φρεάτιο 10mΜ μη-ρυθμισμένου διαλύματος Tris-base (E.Merck, Darmstadt, Germany). Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε μηχανικό αναδευτήρα για δέκα λεπτά, πριν την είσοδο τους σε φασματοφωτόμετρο μικροπλακών τύπου ELISA (StatFax 2100, Awareness Technology, ClinPro, CA, USA). Η μέτρηση της οπτικής απορρόφησης έγινε σε μήκος κύματος 492 nm (μήκος κύματος 24

36 ελέγχου), αφαιρώντας τη μέτρηση υποβάθρου στα 620 nm (μήκος κύματος αναφοράς). Στο φασματοφωτόμετρο μετρήθηκε η απορρόφηση του φωτός σε κάθε φρεάτιο. Η τιμή της απορρόφησης του φωτός του κάθε φρεατίου ονομάζεται οπτική πυκνότητα (OD= Optical Density), αντιστοιχεί σε μάζα πρωτεΐνης και είναι ενδεικτική του αριθμού των κυττάρων. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε ο μέσος όρος (mean) των τιμών απορρόφησης κάθε τριάδας φρεατίων (το εκχύλισμα του κάθε υλικού που εξετάστηκε τοποθετήθηκε σε τρία φρεάτια με κύτταρα). Ο μέσος όρος, όπως και η τυπική απόκλιση (standard deviation) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (coefficient of variation) υπολογίζονται αυτόματα από το φασματοφωτόμετρο. Ο μέσος όρος των τιμών της οπτικής πυκνότητας στα φρεάτια ελέγχου (φρεάτια που τοποθετήθηκε μόνο θρεπτικό υλικό) θεωρήθηκε ότι αντιστοιχούσε σε επιβίωση 100% των κυττάτων (OD C ). Η τιμή της οπτικής πυκνότητας των φρεατίων στα οποία τοποθετήθηκε δείγμα ονομάστηκε ΟD X. Το ποσοστό επιβίωσης (survival fraction) είναι ο λόγος OD X *100/OD C. Στατιστική ανάλυση Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση ήταν το IBMSPSS 21. Για το πρώτο μέρος του πειράματος έγινε one-way analysis of variance (ANOVA) και μετά την απόρριψη της μηδενικής υπόθεσης έγιναν πολλαπλές συγκρίσεις με το Tukey multiple comparison test. Για το δεύτερο μέρος του πειράματος ελέγξαμε αν υπήρχε διαφορά στο ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων μετά τον ενοφθαλμισμό του κάθε σκευάσματος μεταξύ των 24 και των 72 ωρών, αλλά και αν υπήρχε διαφορά μεταξύ των σκευασμάτων για τον κάθε χρόνο έκθεσης που μελετήσαμε. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τις δοκιμασίες t-paired και one-way analysis of variance (ANOVA) αντίστοιχα, και οι 25

37 post-hoc αναλύσεις με το Bonferroni test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε p =0,05. Αποτελέσματα Οι συγκεντρώσεις των Ni, Cr, Fe, Pb, Cd, Zn, Cu, Al, As, Mn και Bi φαίνονται στον πίνακα 3. σε μορφή ποσοστού βάρους του στοιχείου επί του συνολικού βάρους του δείγματος. Αφού μετατράπηκαν σε ppm, υπολογίστηκε ο μέσος όρος των τεσσάρων μετρήσεων και η τυπική απόκλιση (πίνακας 4). Η μηδενική υπόθεση ήταν ότι δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά στις συγκεντρώσεις των μετάλλων που ανιχνεύθηκαν και διατηρήθηκε για τον σίδηρο (p=0,111), ενώ απορρίφθηκε για το αργίλιο (p=0,002) και το βισμούθιο (p=0,005). Από τη στιγμή που η μηδενική υπόθεση απορρίφθηκε για τα συγκεκριμένα στοιχεία πραγματοποιήθηκαν επιπρόσθετες δοκιμασίες για να προσδιοριστούν τα υλικά στα οποία εντοπίστηκαν οι διαφορές. Έτσι, βρέθηκε ότι η συγκέντρωση του Al είναι στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στο White MTA Angelus συγκριτικά με το Masterdent (p=0,04) και το White ProRoot MTA (p=0,002). Eπίσης, όσον αφορά στη συγκέντρωση του Bi, το MTA-CAPS διαφέρει από το White ProRoot MTA (p=0,041) και το White MTA Angelus (p=0,028). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας SRB (μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις) φαίνονται στον πίνακα 5 και εκφρασμένα σε κλάσματα επιβίωσης στο ραβδόγραμμα. Η κυτταροτοξική δράση όλων των σκευασμάτων με εξαίρεση το White MTA Angelus ήταν μεγαλύτερη στις 72 ώρες, ενώ στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε στο MTA-CAPS και στο Cerkamed MTA+ (p=0,008 και 0,037 αντίστοιχα). Όσον αφορά τις διαφορές στην κυτταροτοξικότητα μεταξύ των σκευασμάτων που μελετήθηκαν, η μηδενική υπόθεση απορρίφθηκε για τις 24 ώρες και συγκεκριμένα για το White MTA Angelus, το οποίο παρουσίασε τη μεγαλύτερη τοξική δράση. Στις 72 ώρες δεν υπήρξαν στατιστικά σημαντικές 26

38 ProRoot MTA White Biodentine Masterdent MTA+ Cerkamed MTA Angelus White MTA-CAPS διαφορές στην επιβίωση των κυττάρων μετά την έκθεση τους στα εκχυλίσματα των υλικών. Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης παρουσιάζονται στους πίνακες 6 αι 7. Δείγμα Ni Cr Fe Pb Cd Zn Cu Al As Mn Bi Unknown/ Undissolved A <0,01 <0,01 0,02 0,80 <0,01 0,18 <0,01 0,58 0,18 <0,01 9,85 28,2 B <0,01 <0,01 0,02 0,76 <0,01 0,16 <0,01 0,48 0,17 <0,01 8,65 27,7 Γ <0,01 <0,01 0,02 0,78 <0,01 0,18 <0,01 0,68 0,17 <0,01 10,00 27,3 Δ <0,01 <0,01 0,02 0,70 <0,01 0,17 <0,01 0,52 0,15 <0,01 8,25 28,9 Α <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,70 <0,01 <0,01 18,80 20,1 Β <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,85 <0,01 <0,01 21,63 22,6 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,82 <0,01 <0,01 19,53 22,5 Γ Δ <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,67 <0,01 <0,01 20,28 22,8 Α <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,41 <0,01 <0,01 13,15 21,1 Β <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,52 <0,01 <0,01 14,60 22,0 Γ <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,56 <0,01 <0,01 14,55 20,4 Δ <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,47 <0,01 <0,01 13,38 21,8 Α <0,01 <0,01 0,02 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,08 <0,01 <0,01 18,90 26,5 Β <0,01 <0,01 0,02 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,07 <0,01 <0,01 21,63 24,3 Γ <0,01 <0,01 0,02 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,09 <0,01 <0,01 18,03 23,5 Δ <0,01 <0,01 0,02 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,07 <0,01 <0,01 21,03 25,4 Α <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 28,8 Β <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 31,5 Πίνακας 3 Γ <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 28,9 Δ <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 32,8 Α <0,01 <0,01 0,03 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,06 <0,01 <0,01 21,30 17,7 Β <0,01 <0,01 0,02 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,04 <0,01 <0,01 19,35 17,1 Γ <0,01 <0,01 0,03 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,06 <0,01 <0,01 18,48 17,5 % Δ <0,01 <0,01 0,02 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 0,07 <0,01 <0,01 21,40 16,4 % 27

39 MTA-CAPS MTA Angelus MTA+ Cerkamed Masterdent Biodentine ProRoot MTA White White Ni ND ND ND ND ND ND Cr ND ND ND ND ND ND Fe 200±0 ND ND 200±0 ND 250±57 Pb 7600±4320 ND ND ND ND ND Cd ND ND ND ND ND ND Zn 1725±95 ND ND ND ND ND Cu ND ND ND ND ND ND Al 5650± ± ± ±95 ND 575±125 As 1675±125 ND ND ND ND ND Mn ND ND ND ND ND ND Bi 91900± ± ± ±17100 ND ±14500 Πίνακας 4 28

40 N Mean Std. Deviation ODx 24hrs MTA-CAPS MTA Angelus White Cerkamed Masterdent Biodentine ProRoot White Total SF 24hrs MTA-CAPS MTA Angelus White Cerkamed Masterdent Biodentine ProRoot White Total ODx 72hrs MTA-CAPS MTA Angelus White Cerkamed Masterdent Biodentine ProRoot White Total SF 72hrs MTA-CAPS MTA Angelus White Cerkamed Masterdent Biodentine ProRoot White Πίνακας 5 Total