ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΡΑΓΕΩΡΓΟΥ ΕΥΤΥΧΙΑΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ. M.Sc. ΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ-ΕΛΕΓΧΟΥ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ, ΕΚΠΑ «ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΤΟ ΓΑΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΤΗΛΩΝ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΝΕΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τομέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: Τρίτη 24 Σεπτεμβρίου 2013 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Παπαδογιάννης Ιωάννης (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής), Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Σαμανίδου Βικτωρία (Επιβλέπουσα καθηγήτρια), Αναπληρωτής Καθηγητής Θεοδωρίδης Γεώργιος (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής), Καθηγήτρια Παππά-Λουίζη Αδριανή, Αναπληρωτής Καθηγητής Ζαχαριάδης Γεώργιος, Αναπληρωτής Καθηγητής Ανθεμίδης Αριστείδης, Επίκουρη Καθηγήτρια Κοβάτση Λήδα.

2 Η επταμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της Διδακτορικής Διατριβής της κ. Ευτυχίας Καραγεώργου, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την Τρίτη 24/9/2013, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της Διατριβής με τίτλο «Ανάπτυξη μεθόδων για τον προσδιορισμό διαφόρων κατηγοριών αντιβιοτικών στο γάλα με τεχνικές προκατεργασίας και χρωματογραφικής ανάλυσης με χρήση υλικών και στηλών συμβατικής και νέας τεχνολογίας». Η επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της επιστήμης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ: Καθηγητής Παπαδογιάννης Ιωάννης (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Σαμανίδου Βικτωρία (Επιβλέπουσα καθηγήτρια) Αναπληρωτής Καθηγητής Θεοδωρίδης Γεώργιος (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγήτρια Παππά-Λουίζη Αδριανή Αναπληρωτής Καθηγητής Ζαχαριάδης Γεώργιος Αναπληρωτής Καθηγητής Ανθεμίδης Αριστείδης Επίκουρη Καθηγήτρια Κοβάτση Λήδα 2

3 Ευτυχία Γ. Καραγεώργου Α.Π.Θ. «ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΤΟ ΓΑΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΤΗΛΩΝ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΝΕΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ» ISBN «Η έγκριση της Διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5345/1932, άρθρο 202, παράγραφος 2) 3

4 4 Στην κόρη μου, Χριστίνα

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ HPLC ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΕΙΔΗ HPLC ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HPLC Αναλυτικές στήλες Ανιχνευτές ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΣΤΗΛΕΣ ΝΕΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Μονολιθικές στήλες Εισαγωγή Κατασκευή μονολιθικών στατικών φάσεων στην HPLC Συνθηκες που επηρεαζουν τις πορωδεις ιδιοτητες των μονολιθικων στηλων Σύγκριση των μονολίθων με τις συμβατικές στήλες Εφαρμογές των μονολίθων Στήλες τεχνολογίας συμπαγούς πυρήνα (core-shell columns) ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Κλασικές τεχνικές προκατεργασίας δείγματος Εκχύλιση Υγρού-Υγρού Εκχύλιση Soxhlet Σύγχρονες τεχνικές προκατεργασίας δείγματος Εκχύλιση Στερεάς Φάσης- Υγρού (Solid Phase Extraction) Εκχύλιση Διασποράς Στερεάς Φάσης Υποστρώματος (Matrix Solid Phase Dispersion) Μικρο-εκχύλιση Στερεάς Φάσης (Solid Phase Micro Extraction) Εκχύλιση υπερκρίσιμου ρευστού Εκχύλιση υποβοηθούμενη από μικροκύματα ΣΥΓΧΡΟΝΑ ΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Υλικό QuEChERS-Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Ταξινόμηση αντιμικροβιακών παραγόντων Ταξινόμηση αντιμικροβιακών με βάση το μηχανισμό δράσης τους Μικροβιακή αντίσταση Βασικές αρχές ορθολογικής αντιμικροβιακής θεραπείας ΠΕΝΙΚΙΛΛΙΝΕΣ (Penicillins) Φυσικοχημικές ιδιότητες Κατάταξη πενικιλλινών Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες Τοξικότητα - ανεπιθύμητες ενέργειες ΚΕΦΑΛΟΣΠΟΡΙΝΕΣ (Cephalosporins) Φυσικοχημικές ιδιότητες

6 3.3.2 Κατάταξη κεφαλοσπορινών Φαρμακοδυναμική Φαρμακοκινητική Τοξικότητα -ανεπιθύμητες ενέργειες ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΚΑΙ ΔΟΣΟΛΟΓΙΑ ΚΕΦΑΛΟΣΠΟΡΙΝΩΝ ΑΜΦΕΝΙΚΟΛΕΣ Χλωραμφενικόλη (Chloramphenicol) Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Τοξικότητα-ανεπιθύμητες ενέργειες Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες ΘΕΙΑΜΦΕΝΙΚΟΛΗ (Thiamphenicol) ΚΙΝΟΛΟΝΕΣ (Quinolones) Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες TΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΕΣ (Tetracyclines) Φυσικοχημικές ιδιότητες - κατάταξη Φαρμακοδυναμική Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Τοξικότητα-παρενέργειες ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ ΓΑΛΑ ΕΙΔΗ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΔΙΑΤΡΟΦΙΚΗ ΑΞΙΑ ΝΩΠΟ ΓΑΛΑ (RAW MILK) ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ-ΠΑΣΤΕΡΙΩΣΗ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΚΑΘΕ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΝΩΠΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΕ ΠΟΙΟΤΗΤΕΣ ΣΥΝΗΘΙΣΜΕΝΟΙ ΕΛΕΓΧΟΙ ΓΙΑ ΥΓΕΙΟΝΟΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟ ΓΑΛΑ ΣΤΗΝ ΑΓΡΟΤΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΟΙΚΟΝΟΜΙΑ ΤΟ ΓΑΛΑ ΣΤΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΤΗΣ Ε.Ε. ΓΙΑ ΤΑ ΚΑΤΑΛΟΙΠΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΜΕΓΙΣΤΑ ΕΠΙΤΡΕΠΟΜΕΝΑ ΟΡΙΑ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΜΕΛΕΤΗΘΕΝΤΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΟΝ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ 37/2010/ΕΕ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΔΟΣΗΣ, ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΔΟΣΗΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΜΙΑΣ ΕΝΩΣΗΣ ΜΕ LC ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ UV/VIS ΠΛΗΡΟΥΣ ΣΑΡΩΣΗΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΑΜΦΕΝΙΚΟΛΕΣ β-λακταμεσ

7 6.2.1 Πενικιλλίνες Kεφαλοσπορίνες ΚΙΝΟΛΟΝΕΣ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΕΣ ΠΟΛΥ-ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΥΣΚΕΥΕΣ-ΟΡΓΑΝΑ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Οργανολογία χρωματογραφικού συστήματος με ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων Όργανα και συσκευές Αντιδραστήρια και διαλύτες ΦΑΣΜΑΤΑ UV ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΚΕΦΑΛΟΣΠΟΡΙΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Επιλογή μήκους κύματος ανίχνευσης Επιλογή εσωτερικού προτύπου Επιλογή κατάλληλης αναλυτικής στήλης Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων-σταθερότητα προτύπων διαλυμάτων Εξισώσεις Παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ Εύρεση βέλτιστου πρωτοκόλλου εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) Εφαρμογή εκχύλισης διασποράς υποστρώματος (MSPD) Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα σε διάρκεια πέντε ημερών (inter-day precision) Όριο απόφασης (CC α ) και ικανότητα ανίχνευσης (CC β ) Εκλεκτικότητα Σταθερότητα των κεφαλοσπορινών σε δείγματα γάλακτος Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα γάλακτος της Ελληνικής Αγοράς ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΛΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΜΦΕΝΙΚΟΛΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ, ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Επιλογή μήκους κύματος ανίχνευσης Επιλογή εσωτερικού προτύπου Επιλογή κατάλληλης αναλυτικής στήλης

8 Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων-σταθερότητα προτύπων διαλυμάτων Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα σε διάρκεια τεσσάρων ημερών (inter-day precision) Ανάλυση εμπορικά διαθέσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων πενικιλλινών-αμφενικολών ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ Εύρεση βέλτιστου πρωτοκόλλου εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) Εφαρμογή εκχύλισης διασποράς υποστρώματος (MSPD) Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα σε διάρκεια πέντε ημερών (inter-day precision) Όριο απόφασης (CCα ) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) Εκλεκτικότητα Σταθερότητα πενικιλλινών και αμφενικολών σε δείγματα γάλακτος Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα γάλακτος της Ελληνικής Αγοράς Ανθεκτικότητα μεθόδου-υπολογισμός με την προσέγγιση Youden ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ β-λακταμων ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Επιλογή μήκους κύματος ανίχνευσης Επιλογή εσωτερικού προτύπου Αναλυτική στήλη-πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων-σταθερότητα προτύπων διαλυμάτων Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ Εύρεση βέλτιστου πρωτοκόλλου εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) Εφαρμογή εκχύλισης διασποράς υποστρώματος (MSPD) Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα σε διάρκεια πέντε ημερών (inter-day precision) Όριο απόφασης (CCα ) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) Εκλεκτικότητα Σταθερότητα β-λακταμών σε δείγματα γάλακτος

9 Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα γάλακτος της Ελληνικής Αγοράς Ανθεκτικότητα μεθόδου-υπολογισμός με την προσέγγιση Youden ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΚΑΙ ΚΕΦΑΛΟΣΠΟΡΙΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΜΕ LC-MS/MS. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΣΤΗ ΔΙΑΤΑΞΗ HPLC-DAD Επιλογή μήκους κύματος ανίχνευσης Επιλογή εσωτερικού προτύπου Αναλυτική στήλη-πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων-σταθερότητα προτύπων διαλυμάτων Οργανολογία LC-MS/MS Συνθήκες χρωματογραφίας και φασματομέτρου μαζών ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ Εύρεση βέλτιστου πρωτοκόλλου εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) Εφαρμογή εκχύλισης διασποράς υποστρώματος (MSPD) Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα σε διάρκεια πέντε ημερών (inter-day precision) Όριο απόφασης (CC α ) και ικανότητα ανίχνευσης (CC β ) Σταθερότητα κινολονών και κεφαλοσπορινών σε δείγματα γάλακτος Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα γάλακτος της Ελληνικής Αγοράς Ανθεκτικότητα μεθόδου-υπολογισμός με την προσέγγιση Youden ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Επιλογή μήκους κύματος ανίχνευσης Επιλογή εσωτερικού προτύπου Αναλυτική στήλη-πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων-σταθερότητα προτύπων διαλυμάτων Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/ΕΕ Εύρεση βέλτιστου πρωτοκόλλου εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) Εφαρμογή εκχύλισης διασποράς υποστρώματος (MSPD) Εξισώσεις παλινδρόμησης Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability)

10 Ακρίβεια και πιστότητα σε διάρκεια πέντε ημερών (inter-day precision) Όριο απόφασης (CC α ) και ικανότητα ανίχνευσης (CC β ) Εκλεκτικότητα Σταθερότητα τετρακυκλινών σε δείγματα γάλακτος Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα γάλακτος της Ελληνικής Αγοράς Ανθεκτικότητα μεθόδου-υπολογισμός με την προσέγγιση Youden Έλεγχος της ακρίβειας της μεθόδου με πιστοποιημένο υλικό αναφοράς (Certified Reference Material BCR -492) ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ EXTENDED SUMMARY ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΩΝ Ερευνητικές εργασίες σε διεθνή περιοδικά με συντελεστές απήχησης Άρθρα επισκόπησης Κεφάλαια σε επιστημονικά συγγράματα Επιστημονικά συγγράματα Ανακοινώσεις σε διεθνή συνέδρια ΥΠΟΤΡΟΦΙΕΣ-ΔΙΑΚΡΙΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Μία από τις ευρέως χρησιμοποιούμενες, σημαντικότερες και χαμηλού κόστους κατηγορίες τροφίμων παγκοσμίως είναι τα γαλακτοκομικά προϊόντα, με κυριότερο εκπρόσωπό τους το γάλα. Το γάλα περιέχει απαραίτητα διατροφικά στοιχεία για τους έμβιους οργανισμούς, όπως κορεσμένα λίπη, πρωτεΐνες και ασβέστιο. Στη δεκαετία του 1950 ξεκίνησε η χορήγηση αντιβιοτικών στα ζώα και πλέον είναι από τα πια διαδεδομένα φαρμακευτικά σκευάσματα. Τα αντιβιοτικά είναι φυσικές αντιμικροβιακές ουσίες που παράγονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις από συγκεκριμένους μικροοργανισμούς, μύκητες και βακτήρια, για να αποτρέψουν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών. Κυριότεροι εκπρόσωποι είναι οι β-λακτάμες (πενικιλλίνες και κεφαλοσπορίνες), οι κινολόνες, οι αμφενικόλες, οι τετρακυκλίνες, τα σουλφοναμίδια, τα νιτροφουράνια κ.α. που χρησιμοποιούνται σε φαρμακευτικά σκευάσματα που προορίζονται, τόσο για κτηνιατρική, όσο και για ανθρώπινη χρήση. Κάθε κατηγορία έχει διαφορετική δομή, ιδιότητες και διαφορετικές μεταβολικές οδούς, καθώς και πολλούς ενεργούς μεταβολίτες. Ως κτηνιατρικά σκευάσματα χρησιμοποιούνται για: Θεραπευτικούς λόγους, ενάντια σε μολύνσεις στα ζώα. Πρόληψη μολύνσεων. Συμπληρώματα διατροφής, με σκοπό τη μυοσκελετική αύξηση των ζώων και τέλος, Προστίθενται απ ευθείας στο γάλα, για να παραμένει φρέσκο περισσότερες μέρες. Γίνεται αμέσως αντιληπτό ότι υπολείμματα αντιβιοτικών περνούν στο γάλα, επηρεάζοντας αρνητικά την ποιότητά του. Επίσης ανεπιθύμητα συμπτώματα αυτών μπορούν να φανούν στον άνθρωπο για παράδειγμα ως μια αλλεργική αντίδραση. Κατ επέκταση, η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των υπολειμμάτων των αντιβιοτικών στα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι επιβεβλημένα για τη διασφάλιση της ποιότητάς τους, πριν αυτά καταναλωθούν από τον άνθρωπο. Η ανάπτυξη μιας μεθόδου προσδιορισμού υπολειμμάτων αντιβιοτικών στο γάλα, απαιτεί μια ειδική, ευαίσθητη και αξιόπιστη αναλυτική τεχνική που να μπορεί να ανιχνεύει τα αντιβιοτικά, ακόμα και σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από τα νόμιμα όρια που έχουν θεσπίσει οι ελεγκτικοί μηχανισμοί της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Το 11

12 ζητούμενο είναι να αναπτύσσονται και να βελτιστοποιούνται μέθοδοι ανάλυσης πολλών αντιβιοτικών ταυτόχρονα (multi-residue analysis), με σκοπό να προσδιορίζονται ταυτόχρονα αντιβιοτικά και μεταβολίτες διαφόρων κατηγοριών, ενισχύοντας έτσι τον ήδη υπάρχοντα, αλλά και μελλοντικό έλεγχο της ποιότητας των τροφίμων. Το γάλα αποτελεί ένα πολύπλοκο υπόστρωμα, αφού περιέχει τόσο πρωτεΐνες, όσο και λίπη που μπορούν να παρεμποδίσουν την ανάλυση. Επίσης και ο προσδιορισμός αντιβιοτικών στο γάλα δεν είναι εύκολη υπόθεση αφού: Έχουν πολλούς ενεργούς μεταβολίτες. Κάθε κατηγορία έχει διαφορετικές ιδιότητες και τέλος, Εμφανίζονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις (ppb). Επομένως στόχος είναι να αναπτυχθεί μια κατάλληλη προκατεργασία των δειγμάτων που θα εξουδετερώσει όλα τα παραπάνω προβλήματα και θα εξασφαλίσει ευκολότερο και αποτελεσματικότερο προσδιορισμό των αντιβιοτικών. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή αναπτύχθηκαν πολυ-υπολειμματικές αναλυτικές μέθοδοι (multi-residue) Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης (HPLC), που είναι σε θέση, αφενός να προσδιορίζουν τα αντιβιοτικά μέσα στα επιτρεπτά όρια και αφετέρου να επιβεβαιώνουν την ύπαρξή τους σε πολύπλοκα υποστρώματα, όπως το γάλα. Σημαντικό κομμάτι στην ανάπτυξη αυτών των μεθόδων ήταν η διερεύνηση και τελικά η χρήση υλικών νέας τεχνολογίας σε δύο τομείς: α) στην προκατεργασία των δειγμάτων και β) στο γρήγορο και αποτελεσματικό διαχωρισμό των συστατικών, μέσω των αναλυτικών στηλών που χρησιμοποιήθηκαν. Η διεξαγωγή του ερευνητικού μέρους της διατριβής έγινε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Βικτωρίας Σαμανίδου. Μέσα σε αυτές τις λίγες γραμμές θα ήθελα να της εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες για την συμπαράστασή της, ηθικής και πνευματικής καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της έρευνας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Ι. Παπαδογιάννη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γ. Θεοδωρίδη, μέλη της τριμελούς εισηγητικής επιτροπής για τη βοήθεια τους μέχρι την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. E. Στεφάνου του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Κρήτης με έδρα το Ηράκλειο, καθώς και τον Υποψ. 12

13 Διδάκτορα κ. Αντώνη Μυριδάκη, για τη συνεργασία τους στην ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού αντιβιοτικών στη διάταξη LC-MS/MS που διαθέτουν στο εργαστήριό τους. Κλείνοντας θα ήθελα να αναφερθώ στους γονείς μου, αλλά και στον σύζυγό μου, που με στήριξαν έμπρακτα όλα αυτά τα χρόνια και με βοήθησαν καθοριστικά στην ολοκλήρωση αυτής της πολύ σημαντικής προσπάθειας. Τους ευχαριστώ θερμά και τους ευγνωμονώ που είναι στη ζωή μου. Ευτυχία Γ. Καραγεώργου MSc. Χημικός 13

14 1. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ 1.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η υγρή χρωματογραφία ανακαλύφθηκε από το Ρώσο βοτανολόγο Mikhail Tswet, το 1906, κατά τη διάρκεια της έρευνάς του σχετικά με χρωστικές ουσίες των φυτών. Χρησιμοποίησε χρωματογραφική στήλη με ανθρακικό ασβέστιο, ως πληρωτικό υλικό και ένα μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα και αιθανόλης, ως εκλουστικό για το διαχωρισμό χλωροφυλλών και καροτενοειδών. Το έργο του Tswet αγνοήθηκε επί πολλές δεκαετίες και αναβίωσε δέκα χρόνια μετά το θάνατό του, χάρη στο Γερμανό επιστήμονα Edgar Lederer, τον Αυστριακό βιοχημικό Richard Kuhn και το έργο των Martin και Synge, οι οποίοι μάλιστα πήραν το βραβείο Nobel Χημείας για τις ανακαλύψεις τους στο πεδίο της χρωματογραφίας. Οι τελευταίοι κατά τη δεκαετία του 40 έθεσαν ουσιαστικά τις αρχές και τις βασικές τεχνικές της χρωματογραφίας κατανομής και το έργο τους ενθάρρυνε την ταχεία ανάπτυξη των διαφόρων τύπων χρωματογραφίας, όπως η χρωματογραφία επί χάρτου, η αέρια χρωματογραφία και αυτή που θα γινόταν αργότερα γνωστή ως υγρή χρωματογραφίας υψηλής πίεσης. Στο τέλος της δεκαετίας του 1960 αναπτύχθηκε η τεχνολογία παραγωγής και χρήσης πληρωτικών υλικών με σωματίδια διαμέτρου από 3 έως 10 μm. Η τεχνολογία αυτή απαιτούσε εξελιγμένα όργανα, με δυνατότητα λειτουργίας σε υψηλές πιέσεις που δεν ήταν δυνατόν να επιτευχθεί με τις κλασικές γυάλινες στήλες και με βαρυτική ροή. Η ονομασία «υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης» χρησιμοποιήθηκε για να διακρίνει τις νεότερες αυτές τεχνικές από τις παλαιότερες. Οι εφαρμογές της χρωματογραφίας αυξήθηκαν με εντυπωσιακό ρυθμό τα τελευταία πενήντα χρόνια και αυτό οφείλεται, τόσο στην ανάπτυξη νέων χρωματογραφικών τεχνικών, όσο και στην ολοένα και αυξανόμενη απαίτηση για ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματικών μεθόδων για το διαχωρισμό και την ταυτοποίηση πολύπλοκων μιγμάτων. Αξίζει να σημειωθεί ότι δώδεκα βραβεία Nobel Χημείας έως το 1972, δόθηκαν σε επιστήμονες, η έρευνα των οποίων βασίσθηκε σε σημαντικό βαθμό σε χρωματογραφικές τεχνικές [1, 2]. 14

15 1.2 ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ Τα τελευταία 30 χρόνια η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) έχει καθιερωθεί ως μια από τις πλέον διαδεδομένες αναλυτικές τεχνικές παγκοσμίως. Ο λόγος είναι ότι πρόκειται για μια δυναμική μέθοδο με αρκετές δυνατότητες. Έχει εφαρμοσθεί με επιτυχία σε αναλύσεις διαφορετικής κλίμακας, παρέχοντας αποτελέσματα για πολύ μεγάλη ποικιλία χημικών ενώσεων και δυνατότητες που έχουν πλέον αναγνωρισθεί από την πλειοψηφία των ερευνητών [3]. H υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης είναι σήμερα η πιο διαδεδομένη από όλες τις αναλυτικές τεχνικές διαχωρισμού, με ετήσιες πωλήσεις σε όργανα που είναι της τάξης των δισεκατομμυρίων δολαρίων. Οι κύριοι λόγοι για την τόσο ευρεία αποδοχή που έχει η HPLC είναι η ευαισθησία της, η εύκολη προσαρμογή της σε ποσοτικούς προσδιορισμούς, η καταλληλότητά της για διαχωρισμούς ενώσεων που έχουν επιστημονικό ενδιαφέρον, όπως για παράδειγμα τα αμινοξέα, οι πρωτεΐνες, τα βαρβιτουρικά, οι κατεχολαμίνες, οι βιταμινές, οι πρωτεΐνες, οι προσταγλανδίνες, τα ένζυμα, τα νουκλεϊκά οξέα, οι υδρογονάνθρακες, οι υδατάνθρακες, τα φαρμακευτικά, τα τερπενοειδή, τα φυτοφάρμακα, τα αντιβιοτικά, τα στεροειδή, οι οργανομεταλλικές ενώσεις και ένα πλήθος ανόργανων ενώσεων [4]. 1.3 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ HPLC Η HPLC ανήκει στις χρωματογραφικές τεχνικές, άρα ο διαχωρισμός είναι το αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης μιας στατικής και μιας κινητής φάσης. Στην υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης, το δείγμα εισάγεται στην κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά του μετακινούνται με τη μορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα μετά το άλλο. Οι ενώσεις που αναλύονται κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης, με αποτέλεσμα να μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της στήλης. Στην υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης είναι δυνατή η χρήση μίγματος διαλυτών, καθώς και η βαθμιαία μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης. Τέλος είναι δυνατή η χρησιμοποίηση αναλυτικών στηλών σε σειρά, ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερος διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος. 15

16 Ο χρόνος ανάλυσης με την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης είναι συνήθως μικρός, της τάξης των μερικών λεπτών, ενώ η ακρίβεια και η επαναληψιμότητά της είναι πολύ καλές. Γενικά, η HPLC είναι μια ευαίσθητη ποιοτική και ποσοτική αναλυτική τεχνική που υπερέχει σε σχέση με τις υπόλοιπες χρωματογραφικές τεχνικές [5]. 1.4 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΕΙΔΗ HPLC Στην υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης μπορούν να εφαρμοστούν όλα τα είδη των μηχανισμών που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς, με την κατάλληλη χρήση υλικού πλήρωσης της στήλης (στατική φάση), και του διαλύτη έκλουσης (κινητή φάση). 1. Χρωματογραφία Προσρόφησης Ο διαχωρισμός των διαφόρων ενώσεων βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησης στη στατική φάση. Οι κυριότερες αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης. Η χρωματογραφία προσρόφησης βρίσκει εφαρμογή στο διαχωρισμό ενώσεων με παρόμοια δομή, αλλά διαφορετική πολικότητα. Ανάλογα με τη σχέση πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φάση διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης. 1Α. Χρωματογραφία κανονικής φάσης (Normal Phase Chromatography) Στη χρωματογραφία κανονικής φάσης η στατική φάση (συνήθως SiO 2 ή Al 2 O 3 ) είναι πολικότερη από την κινητή, η οποία αποτελείται από μη πολικούς διαλυτές όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο κ.α. Για ενώσεις πολύ πολικές που δεν συγκρατούνται στην πολική στατική φάση, χρησιμοποιείται η χρωματογραφία HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography). 1Β. Χρωματογραφία αντίστροφης φάσης ( Reversed Phase Chromatography) Η χρωματογραφία αντίστροφης φάσης αποτελεί την πιο διαδεδομένη τεχνική υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης, αφού χρησιμοποιείται στο 80% περίπου των αναλυτικών εφαρμογών. Η στατική φάση, η οποία είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από διοξείδιο του πυριτίου, συζευγμένο με διάφορες ομάδες (bonded phase), όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο) φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.α., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μίγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό. Τα υλικά 16

17 συζευγμένης φάσης πλεονεκτούν ως προς τη σταθερότητα, αλλά και τη συμβατότητα με μεγάλη ποικιλία εκλουστικών συστημάτων. 2. Χρωματογραφία κατανομής (Partition ή Liquid-Liquid Chromatography) O διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος, μεταξύ της κινητής και της υγρής στατικής φάσης και εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων μη ιονικών ενώσεων. 3. Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (Ion Exchange Chromatography) Ο διαχωρισμός στηρίζεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσδιοριζόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Οι κυριότερες παραμέτροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής, είναι το αντίθετο ιόν της στατικής ομάδα, η ιονική ισχύς, το ph, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία. 4. Χρωματογραφία συγγένειας (Affinity Chromatography) Για την επίτευξη διαχωρισμού, οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η χρωματογραφία εναντιομερών, η οποία αποκτά αυξανόμενο ενδιαφέρον και με την οποία διαχωρίζονται και εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία. 5. Χρωματογραφία Αποκλεισμού μεγέθους ή διάχυσης πηκτής (Size Exclusion SEC ή Gel Permeation Chromatography) Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των προσδιοριζόμενων ενώσεων. Βρίσκει εφαρμογές στην ανάλυση και στο χαρακτηρισμό των πολυμερών. 1.5 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HPLC Η διεργασία του χρωματογραφικού διαχωρισμού αρχίζει με την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη, με τη βοήθεια ειδικής βαλβίδας. Κάθε ένα από τα συστατικά του δείγματος εκλούεται και εμφανίζεται ως κορυφή (κωδωνοειδής καμπύλη του Gauss) στο σύστημα καταγραφής. Η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών αποτελεί μια πολύ σημαντική παράμετρο και μπορεί να είναι είτε εκλεκτική, είτε όχι, ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή. Η απόκριση του ανιχνευτή για καθένα 17

18 από τα συστατικά του δείγματος, είτε καταγράφεται σε χαρτί, είτε απεικονίζεται στην οθόνη υπολογιστή και αποτελεί το τελικό χρωματογράφημα του διαχωρισμού, ενώ η αποθήκευση των αναλυτικών δεδομένων γίνεται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Στο Σχήμα 1.1 φαίνεται η οργανολογία ενός συστήματος HPLC [5]. Ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης περιλαμβάνει: Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών. Αντλία (σταθερής ροής και πίεσης). Μονάδα εισαγωγής δείγματος (βαλβίδα, αυτόματος δειγματολήπτης). Χρωματογραφική Στήλη (αποτελεί την καρδιά του διαχωρισμού). Ανιχνευτής. Σύστημα καταγραφής των ληφθέντων αποτελεσμάτων με χρήση κατάλληλου λογισμικού. Μία τυπική διάταξη ενός χρωματογράφου υψηλής πίεσης, φαίνεται στο Σχήμα 1.1. Σχήμα 1.1: Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλή Πίεσης Αναλυτικές στήλες Η αναλυτική στήλη θεωρείται «η καρδιά» του χρωματογραφικού συστήματος. Με την πάροδο των χρόνων, οι στήλες έχουν βελτιωθεί σημαντικά, εξασφαλίζοντας καλύτερο διαχωρισμό μεγαλύτερη ταχύτητα και αποτελεσματικότητα, και 18

19 βελτιωμένη σταθερότητα και επαναληψιμότητα. Στο Σχήμα 1.2 φαίνονται διάφοροι τύποι αναλυτικών στηλών. Σχήμα 1.2: Τύποι αναλυτικών στηλών. Οι σύγχρονες αναλυτικές στήλες υπερτερούν των συμβατικών στηλών χρωματογραφίας, γιατί επιτυγχάνουν ταχύτερους και πιο αποτελεσματικούς διαχωρισμούς μιγμάτων. Στο Κεφάλαιο 1.8 γίνεται μία εκτενής παρουσίαση δύο τύπων αναλυτικών στηλών νέας τεχνολογίας με σημαντικά πλεονεκτήματα, τα οποία και αποδείχτηκαν μέσω της πειραματικής έρευνας της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής. Στην αναλυτική στήλη λαμβάνει χώρα ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος, ενώ η προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου του μικρόκοκκου υλικού πλήρωσης της στήλης επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλίας υψηλής πίεσης. Για να αναπτυχθούν ικανοποιητικές ταχύτητες ροής, οι αναπτυσσόμενες πιέσεις από τις αντλίες φτάνουν τις μερικές χιλιάδες psi (pounds per square inch). Ως συνέπεια αυτών των υψηλών πιέσεων, η οργανολογία της HPLC είναι πολυπλοκότερη και δαπανηρότερη από την οργανολογία άλλων ειδών χρωματογραφίας Ανιχνευτές Μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί διάφοροι τύποι ανιχνευτών, όπως ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού, αγωγιμομετρικοί και φθορισμομετρικοί ανιχνευτές, ανιχνευτές 19

20 δείκτου διάθλασης, ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές, ανιχνευτές φασματοφωτομετρίας μάζας κ.α. Ο τύπος του ανιχνευτή που έδωσε νέα διάσταση στις αναλυτικές δυνατότητες της HPLC, είναι ο ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων (photodiode array detector) (Σχήμα 1.3), o οποίος συλλέγει τα δεδομένα της απορρόφησης της προσδιοριζόμενης ένωσης, σε όλο το φάσμα του ορατού ή του υπεριώδους. Τα πλεονεκτήματα ενός τέτοιου ανιχνευτή είναι η συνεχής καταγραφή του ολικού φάσματος, καθώς και η δυνατότητα ποσοτικής εκτίμησης της ανάλυσης σε περισσότερα του ενός μήκη κύματος, γεγονός που αυξάνει την εκλεκτικότητα του προσδιορισμού. Επίσης μπορεί να γίνει ταυτοποίηση των κορυφών ενός χρωματογραφήματος και να υπολογιστεί ο βαθμός καθαρότητάς τους, στοιχεία που βοηθούν σε άγνωστα και πολύπλοκα δείγματα [6]. Σχήμα 1.3: Ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων. Τα τελευταία χρόνια επανάσταση στου ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στις χρωματογραφικές τεχνικές, έφερε ο ανιχνευτής φασματοφωτομετρίας μαζών (Mass Spectrometer Detector). Η λειτουργία του βασίζεται στην αρχή της τεχνικής της φασματοφωτομετρίας μαζών κατά την οποία, τα συστατικά ενός δείγματος μετατρέπονται σε ταχύτατα κινούμενα ιόντα και διαχωρίζονται τελικά σε σχέση με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z). Προσφέρει πληροφορίες για την ποιοτική και ποσοτική σύσταση αγνώστων δειγμάτων, για τη χημική δομή μεγάλου αριθμού ενώσεων, την παρουσία ισοτόπων και τέλος για τη δομή και τη σύσταση στερεών επιφανειών. Λειτουργεί ως ολικός ανιχνευτής εξασφαλίζοντας την μεγάλη 20

21 εκλεκτικότητα και την υψηλή ευαισθησία της χρωματογραφικής μεθόδου που αναπτύσσεται. Ο ανιχνευτής MS αποτελείται από τα ακόλουθα μέρη (Σχήμα 1.4): 1. Σύστημα εισαγωγής δείγματος. 2. Πηγή ιόντων. 3. Αναλυτής μαζών. 4. Ανιχνευτής. 5. Σύστημα κενού [4, 7]. Σχήμα 1.4: Τα βασικά μέρη ενός ανιχνευτή μαζών. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή ήταν δυνατή η ανάπτυξη μίας μεθόδου πολύ-υπολειμματικής ανάλυσης αντιμικροβιακών παραγόντων στο γάλα σε διάταξη LC-MS/MS, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Δοκιμών, του Τμήματος Χημείας, του Πανεπιστημίου Κρήτης. Στη διάταξη αυτή η πηγή ιόντων, ήταν ο ψεκασμός σε ηλεκτρικό δυναμικό και ως αναλυτής μαζών χρησιμοποιήθηκε ο τετραπολικός ανιχνευτής Ψεκασμός σε ηλεκτρικό δυναμικό (electrospray ionization) 21

22 Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ως η κυριότερη τεχνική σύζευξης υγρής χρωματογραφίας με φασματομετρία μαζών. Βασίζεται στην παρατήρηση κατά την οποία, όταν ένα υγρό ψεκάζεται μέσω τριχοειδούς σωλήνα σε πεδίο μερικών χιλιάδων V, το υγρό διασπείρεται σε ένα νέφος από πολύ μικρές φορτισμένες σταγόνες. Η είσοδος του διαλύματος στο σύστημα γίνεται εν ροή μέσα από τριχοειδή σωλήνα. Παράλληλα με τον τριχοειδή, βρίσκεται εξωτερικός σωλήνας, μέσα από τον οποίο διαβιβάζεται αέριο, με σκοπό τη δημιουργία εκνεφώματος στην άκρη του τριχοειδούς. Ο τριχοειδής είναι γειωμένος, ενώ στο απέναντι ηλεκτρόδιο εφαρμόζεται δυναμικό της τάξης των 3,5-5 kv. Κατά τον ψεκασμό του διαλύματος σε περιβάλλον υψηλού ηλεκτρικού δυναμικού, ο διαλύτης εξατμίζεται ταχύτατα, ιονίζοντας τις διάφορες ενώσεις. Κατά τον ιοντισμό, πολύ μικρό ποσοστό θραύσης λαμβάνει χώρα, και τα φάσματα που λαμβάνονται είναι απλά, καθαρά και εύκολα για εκτίμηση. Για τους λόγους αυτούς, καθώς και για το γεγονός ότι επιτρέπει τον προσδιορισμό μεγαλομορίων (π.χ. πρωτεΐνες και νουκλεοτίδια), η διάδοση αυτής της τεχνικής είναι ταχύτατη και χρησιμοποιείται πλέον στα περισσότερα νέα όργανα [7] Τετραπολικός ανιχνευτής Οι τετραπολικοί ανιχνευτές είναι οι πιο διαδεδομένοι αναλυτές μαζών, λόγω των πλεονεκτημάτων που παρουσιάζουν: σχετικά χαμηλή τιμή, συμπαγή κατασκευή, μεγαλύτερες ανοχές, ταχύτερη σάρωση, δυνατότητα συμμετοχής σε υβριδικά όργανα και τέλος αμεσότερη συμβατότητα με χρωματογραφικές τεχνικές. Ο τετραπολικός αναλυτής, επιτρέπει μόνο σε ιόντα συγκεκριμένου m/z να περάσουν και να φτάσουν στον ανιχνευτή. Όλα τα άλλα ιόντα εξουδετερώνονται και απομακρύνονται, και γι αυτό το λόγο καλείται συχνά και φίλτρο μαζών. Στο Σχήμα 1.5 δίνεται μια απλοποιημένη μορφή ενός τετραπολικού αναλυτή. 22

23 Σχήμα 1.5: Τετραπολικός ανιχνευτής. Το τριπλό τετράπολο (triple quadrupole) είναι ένας συνδυασμός τριών τετραπόλων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.6. Η αρχή λειτουργίας του έχει ως εξής: τα δύο τετράπολα συνεισφέρουν στο συνδυασμό της δέσμης των ιόντων και ο διαχωρισμός γίνεται στο τρίτο. Η μεγάλη χρησιμότητα του συστήματος έγκειται στη δυνατότητα της διαδοχικής φασματομετρίας μαζών. Στο πρώτο τετράπολο, επιλέγεται ένα μόνο ιόν, στο δεύτερο, οδηγείται το μητρικό ιόν, όπου και θραυσματοποιείται και στο τρίτο τετράπολο, γίνεται ο διαχωρισμός και η μέτρηση των θυγατρικών ιόντων. Η παρακολούθηση των ιόντων μπορεί να γίνει με πολλούς τρόπους: με την πλήρη σάρωση (full scan), με την παρακολούθηση επιλεγμένου ιόντος (single ion monitoring-sim), με την παρακολούθηση επιλεγμένης αντίδρασης (multiple reaction monitoring-mrm), με τη σάρωση θυγατρικών ιόντων (product ion scanning) και τη τέλος με τη σάρωση του μητρικού ιόντος (precursor ion scanning) [7]. Σχήμα 1.6: Τριπλό τετράπολο (QQQ). 1.6 ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ Η κινητή φάση στην HPLC είναι συνήθως μίγμα, ενός η περισσότερων οργανικών διαλυτών και νερού ή ρυθμιστικού διαλύματος με συγκεκριμένη τιμή ph, στην περίπτωση της HPLC αντίστροφης φάσης, ή μίγμα μη πολικών διαλυτών στην περίπτωση της HPLC κανονικής φάσης. Για να μπορεί ένας οργανικός διαλύτης να χρησιμοποιηθεί στην υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης πρέπει να πληροί ορισμένες προϋποθέσεις: Να είναι υψηλής καθαρότητας και ειδικός για χρωματογραφία. 23

24 Να είναι σχετικά φθηνός. Να έχει χαμηλή τοξικότητα. Να είναι δραστικός σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Να μην καταστρέφει το δείγμα. Να μην αποσυντίθεται εύκολα. Να μην είναι πτητικός. Να έχει χαμηλό ιξώδες, χαμηλή πίεση επαναφοράς και μεγαλύτερη ικανότητα διαχωρισμού. Ο οργανικός διαλύτης που συνήθως προτιμάται είναι η μεθανόλη, η οποία είναι οικονομικότερη σε σχέση με το ακετονιτρίλιο και έχει μικρότερο ιξώδες από την αιθανόλη. Όταν λαμβάνει χώρα ανάμιξη διαλυτών ή όταν χρησιμοποιούνται μίγματα διαλυτών, κυρίως υδατικά, είναι απαραίτητη η απαέρωσή τους, γιατί δημιουργούνται φυσαλίδες αέρα από το διαλυμένο οξυγόνο και άζωτο του αέρα. Οι φυσαλίδες αυτές είναι δυνατό να προκαλέσουν θόρυβο στην ανίχνευση (αστάθεια στη βασική γραμμή) και απώλεια της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης. Η απαέρωση γίνεται συνήθως με διαβίβαση ηλίου, το οποίο έχει τη δυνατότητα να απομακρύνει το διαλυμένο οξυγόνο και άζωτο από τους διάφορους διαλύτες, χωρίς να διαλύεται το ίδιο και να δημιουργεί φυσαλίδες στο σύστημα. Εναλλακτικό τρόπο απαέρωσης αποτελεί η χρήση υπερήχων και η εφαρμογή κενού, η οποία όμως δεν αποτελεί μόνιμη λύση, αφού μετά την απομάκρυνση του διαλύτη από τη συσκευή δημιουργούνται και πάλι φυσαλίδες από τον ατμοσφαιρικό αέρα. 1.7 ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ Η επιλογή κινητής φάσης αποτελεί μια πολύ σημαντική παράμετρο, όσον αφορά στην ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων. Είναι γνωστό, από τη χρωματογραφική θεωρία, ότι η διαχωριστική ικανότητα R s εξαρτάται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών Ν, τον παράγοντα συγκράτησης k, και τον παράγοντα διαχωρισμού α. Η βελτιστοποίηση των παραμέτρων k και α γίνεται, κυρίως, με αλλαγές στη σύσταση της κινητής φάσης. Έτσι μετά την επιλογή της στατικής φάσης (βελτιστοποίηση του Ν), η οποία πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με τις προσδιοριζόμενες ενώσεις, επιλέγεται η κινητή φάση, έτσι ώστε -1< k <1. Η βελτιστοποίηση της σύστασης της 24

25 κινητής φάσης αποτελεί επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία. Οι ιδιότητες της κινητής φάσης που εξετάζονται είναι: Πολικότητα Ελουοτροπική ισχύς Βασικότητα ή δυνατότητα διπολικών αλληλεπιδράσεων Τοξικότητα Συμβατότητα με το χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή και Κόστος Η έκλουση των προσδιοριζόμενων συστατικών μπορεί να είναι ισοκρατική ή βαθμωτή. Ισοκρατική Έκλουση: Ονομάζεται η έκλουση, κατά την οποία διατηρείται σταθερή η σύσταση της κινητής φάσης σε όλη τη διάρκεια της ανάλυσης. Η ισοκρατική έκλουση επιτρέπει τη γρήγορη ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων, έχει χαμηλότερο κόστος, σε σχέση με τη βαθμωτή, και παρέχει σταθερότερη βασική γραμμή. Το κύριο μειονέκτημά της είναι ότι δεν εξασφαλίζει το διαχωρισμό ενώσεων με παρόμοιες ιδιότητες και παρόμοια δομή. Βαθμωτή έκλουση: Χαρακτηρίζεται από μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης με το χρόνο, για το διαχωρισμό μιγμάτων ενώσεων, οι οποίες συνήθως παρουσιάζουν παρόμοια δομή και ιδιότητες. Γενικότερα σκοπός της βαθμωτής έκλουσης είναι η ταχύτερη μετακίνηση των συστατικών που συγκρατούνται ισχυρά στη στήλη και ο ικανοποιητικός διαχωρισμός αυτών που συγκρατούνται ελάχιστα. Συνήθως η αρχική σύσταση της κινητής φάσης χαρακτηρίζεται από μικρό ποσοστό οργανικού διαλύτη, γεγονός που επιτρέπει το διαχωρισμό των συστατικών που δε συγκρατούνται ισχυρά στη στατική φάση. Τα συστατικά που συγκρατούνται ισχυρότερα, δε μετακινούνται, παρά μόνο, όταν αρχίσει να αυξάνεται το ποσοστό του οργανικού διαλύτη (ακετονιτρίλιο, μεθανόλη) στην κινητή φάση, λόγω των ανταγωνιστικών δράσεων που λαμβάνουν χώρα. Η μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης μπορεί να επιτευχθεί αναμιγνύοντας δύο ή περισσότερους διαλύτες, σύμφωνα με προκαθορισμένο πρόγραμμα. Για να είναι δυνατό να γίνει βαθμωτή έκλουση απαιτούνται ειδικές αντλίες. Κλείνοντας αυτή τη σύντομη παρουσίαση της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης, προκύπτει το υμπέρασμα ότι αποτελεί αναμφισβήτητα μια 25

26 ανταγωνιστική τεχνική στο χώρο των σύγχρονων διαχωριστικών τεχνικών και αυτό οφείλεται στα πλεονεκτήματα που παρουσιάζει: Επαναληψιμότητα. Ακρίβεια. Εκλεκτικότητα. Χαμηλά όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού. Σύντομος χρόνος ανάλυσης. Απλότητα και ευκολία εφαρμογής. Δυνατότητα προσδιορισμού οργανικών και ανόργανων ενώσεων σε ευρύ φάσμα υποστρωμάτων. Είναι πλέον ευνόητο ότι η HPLC δίνει τη δυνατότητα χρήσης της σε πολλούς τομείς της χημικής ανάλυσης: προσδιορισμοί ρουτίνας, σε αναλυτική και παρασκευαστική κλίμακα. Πιο συγκεκριμένα βρίσκει εφαρμογές: Σε Φαρμακοβιομηχανίες. Στη Βιοχημεία. Στη Χημεία Τροφίμων. Σε Χημικές Βιομηχανίες. Στην Κλινική Χημεία. Σε Δικονομικές - Τοξικολογικές μελέτες. Σε Περιβαλλοντικές μελέτες [5]. 1.8 ΣΤΗΛΕΣ ΝΕΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Μονολιθικές στήλες Εισαγωγή Ο μικρός χρόνος ανάλυσης και ταυτόχρονα η υψηλή απόδοση, αποτελούν κύριο στόχο της επιστημονικής κοινότητας στις μέρες μας, γι αυτό αναζητώνται συνεχώς καινούργιες μέθοδοι και οργανολογίες που θα συμβάλουν στο σκοπό αυτό. Οι πρώτες ύλες συσκευασίας έχουν βελτιωθεί από μεγάλου μεγέθους σε μικρό, από ακανόνιστου σχήματος σε σφαιρικές και από χαμηλής απόδοσης σε υψηλής. Πρόσφατα, ένας καινούργιος τύπος στατικής φάσης χρωματογραφικών στηλών, οι μονόλιθοι, συγκεντρώνουν αυξημένο ενδιαφέρον στην υγρή χρωματογραφία, λόγω της εύκολης 26

27 παρασκευής, των εξαιρετικών ιδιοτήτων και της υψηλής απόδοσης που προσφέρουν, συγκρινόμενες με τις συμβατικές χρωματογραφικές στήλες, ειδικά στο διαχωρισμό βιοπολυμερών [8]. Μονολιθική στατική φάση, ονομάζεται η συνεχής, ομοιογενής δομή ενός πορώδους υλικού, που παρασκευάζεται με in situ πολυμερισμό ή σταθεροποίηση, μέσα στο σωλήνα μιας στήλης. Αν είναι απαραίτητο, η επιφάνεια του υλικού ενεργοποιείται για να μετατραπεί σε ένα απορροφητικό που θα έχει τις επιθυμητές χρωματογραφικές ιδιότητες. Οι πρωτοπόροι αυτού του τύπου στατικών φάσεων, χρονολογούνται στα τέλη του 1960 και στις αρχές του 1970, όταν ο Kubin και οι συνεργάτες του παρασκεύασαν ένα φουσκωμένο πολυμερές, το 2-υδροξυ-αιθυλο-μεθυλ-ακρυλικό εστέρα, για να διαχωρίσουν πρωτεΐνες υπό χαμηλή πίεση. Η διαπερατότητα όμως του υλικού αυτού ήταν πολύ μικρή κι έτσι δε μπόρεσε να χρησιμοποιηθεί στην πράξη (1967). Λίγο αργότερα, το 1970, οι Ross και Jefferson κατέγραψαν την προετοιμασία μονολιθικών στηλών για αέρια χρωματογραφία από πολυουρεθάνη, μια ιδέα που επεκτάθηκε και στην υγρή χρωματογραφία από τους Hansen και Sievens. Αν και με αυτό τον τρόπο η διαπερατότητα ήταν εκπληκτική, η πολυουρεθάνη καταστρεφόταν από ορισμένους διαλύτες κι έτσι δε μπορούσε να χρησιμοποιηθεί επιπλέον. Άλλες προσεγγίσεις για την παρασκευή ενός συνεχούς μέσου, εμφανίστηκαν στα τέλη της δεκαετίας του 80 και συμπεριλάμβαναν υλικά, όπως μεμβράνες, φύλλα κυτταρίνης, ξύλινα υποστρώματα, συμπυκνωμένα gel πολυ-(ακρυλαμιδίου) και άλλα. Τα τελευταία, αναπτύχθηκαν από τον Hjerten το 1989 και χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς. Στις αρχές του 1990, οι Svec και Frechet εισήγαγαν μια εντελώς καινούργια τάξη συνεχών μέσων, βασισμένη σε άκαμπτους μονόλιθους από πολυμερή, που παρασκευάζονται με μια πολύ απλή διαδικασία. Οι μοναδικές τους ιδιότητες, επιτρέπουν στα υλικά αυτά να χρησιμοποιηθούν σε πλήθος εφαρμογών και σταδιακά να γίνουν η επικρατούσα τάση στην έρευνα των συνεχών μέσων. Η επιτυχής προετοιμασία μονολιθικών στηλών, καταγράφηκε το 1991 από τους Nakanishi και Soga και ήταν βασισμένη στο διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ). Οι στήλες αυτές στη συνέχεια θα αναφέρονται ως «πυριτικές». Οι πυριτικές στήλες, παρασκευάστηκαν με in situ πολυμερισμό του τετραμεθοξυσιλανίου, παρουσία ενός υδατοδιαλυτού πολυμερούς, του πολυ-(αιθυλενοξειδίου) και οξικού οξέος. Η βελτιστοποίηση των στηλών αυτών πραγματοποιήθηκε από τους Minakuchi και Ishizuka, ενώ αργότερα μια πρωτότυπη μονολιθική στήλη του οίκου Merck, μελετήθηκε από τους Cabrera και Bidlingmeyer. Ανάλογα με τη φύση των κατασκευαστικών τους υλικών, οι 27

28 μονολιθικές στήλες κατατάσσονται σε πυριτικές στήλες και σε στήλες οργανικών υλικών [9]. Μια επιτυχημένη μονολιθική στήλη πρέπει: 1. Να είναι σταθερή και να δίνει επαναλήψιμα αποτελέσματα. 2. Να σταθεροποιείται εύκολα για χρήση. 3. Να μην είναι επιρρεπής στο σχηματισμό φυσαλίδων. 4. Να είναι αποδοτική. 5. Να παρασκευάζεται εύκολα και οικονομικά Κατασκευή μονολιθικών στατικών φάσεων στην HPLC Τα τελευταία χρόνια, έχει επιτευχθεί υψηλότερη απόδοση στήλης και μειωμένος χρόνος ανάλυσης στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης, χρησιμοποιώντας μικρότερα σωματίδια. Η συμβατική οργανολογία της HPLC, έχοντας όρια πίεσης της τάξης των bar, περιορίζει σημαντικά την προσέγγιση αυτή. Για να ξεπεραστεί το πρόβλημα της υψηλής πίεσης που συνδέεται με τη χρήση μικρότερων σωματιδίων, έχουν μελετηθεί και άλλες τεχνικές, όπως η UPLC, η Τριχοειδής Ηλεκτροχρωματογραφία και η Υγρή Χρωματογραφία ανοικτού σωλήνα. Αυτές οι υψηλής απόδοσης τεχνικές όμως, δε χρησιμοποιούνται ευρέως σε αναλύσεις ρουτίνας, λόγω πρακτικών δυσκολιών και υψηλού κόστους. Η κατασκευή όλων των τύπων μονολιθικών στηλών ακολουθεί ένα γενικό μοτίβο: πολυμερισμός μίγματος κατάλληλων μονομερών, με εκκινητές παρουσία πορωγενούς διαλύτη. Με αυτό τον τρόπο προκύπτουν υλικά μεγάλου και μικρού μεγέθους πόρων, που ονομάζονται macropores και mesopores, αντίστοιχα, που επιτρέπουν τη διέλευση των διαλυτών σε υψηλές ταχύτητες ροής. Οι πρώτες μονολιθικές στήλες που δημιουργήθηκαν ήταν βασισμένες στην πολυουρεθάνη και αρκετά χρόνια αργότερα, οι μονολιθικές στήλες κατασκευάστηκαν από άλλα οργανικά πολυμερή. Τα μειονεκτήματα αυτών των στηλών ήρθαν να εξαλείψουν οι πυριτικοί μονόλιθοι. Αυτές οι στήλες χρησιμοποιηθήκαν επιτυχώς στο διαχωρισμό βιομορίων. Στη συνέχεια περιγράφεται η κατασκευή των δύο βασικών τύπων μονολιθικών στηλών που χρησιμοποιούνται στην HPLC. 1. Κατασκευή των πυριτικών μονόλιθων Τα πυριτικά υλικά παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας μια διαδικασία στερεούπηκτής (sol-gel), η οποία συμπεριλαμβάνει την υδρόλυση και την πολυσυμπύκνωση των 28

29 αλκοξυσιλανών, παρουσία υδατοδιαλυτών πολυμερών. Μετά την πάροδο συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος, η στατική φάση στεγνώνει και σχηματίζει μια ράβδο πορώδους δομής, που αποτελείται από μεγάλου και μικρού μεγέθους πόρους, που ονομάζονται μακροπόροι (macropores) και μεσοπόροι (mesopores), αντίστοιχα (Σχήμα 1.7). Οι μεγαλύτερου μεγέθους πόροι, επιτρέπουν υψηλές ταχύτητες ροής, λόγω της χαμηλής αντίστασης ροής, επιτρέποντας στο διαλύτη να μεταφερθεί, υπό χαμηλή πίεση, στην ενεργή περιοχή. Η μεγάλη εσωτερική επιφάνεια που αποτελείται από τους μικρότερου μεγέθους πόρους (300 m 2 /g), διευκολύνει τη γρήγορη κινητική απορρόφηση. Έχει αποδειχθεί πειραματικά ότι είναι δυνατόν να παρασκευαστούν μονολιθικές στήλες από πυριτικά υλικά, με σκελετούς μικρού μεγέθους, (1-3 μm), μεγάλους ενδιάμεσους πόρους, (1,5-5 μm) και ότι μια τέτοια στήλη, μπορεί να προσφέρει πολύ μεγάλη απόδοση. Σχήμα 1.7: Εικόνες από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο της δομής των macropores και mesopores μέσα σε μια μονολιθική στήλη. 2. Παρασκευή των μονόλιθων από οργανικά πολυμερή Η προετοιμασία μιας μονολιθικής στήλης από ένα πολυμερές, είναι σχετικά απλή, συγκρινόμενη με αυτή της παρασκευής μιας στήλης από διοξείδιο του πυριτίου. Ένα μίγμα μονομερών, παρουσία συνήθως πορωγενών διαλυτών, τοποθετείται σε κυλινδρικό καλούπι που είναι κλειστό στο ένα άκρο. Ο πολυμερισμός διεξάγεται σε υδρόλουτρο θερμοκρασίας ο C ή με επίδραση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Στη συνέχεια, περνά από τη στήλη ένας συγκεκριμένος διαλύτης, ο οποίος απομακρύνει όλα τα πορωγενή συστατικά, καθώς και τις διαλυτές ενώσεις που παρέμειναν στη στήλη μετά την ολοκλήρωση του πολυμερισμού. 29

30 Υπάρχουν πολλών ειδών μονολιθικές στήλες που παρασκευάζονται από πολυμερή, οι κυριότερες είναι οι στήλες από πολυστυρένια, πολυακρυλαμίδια και πολυμερή μεθακρυλικού οξέος. Οι στήλες από πολυμερή, εφαρμόστηκαν επιτυχώς στο παρελθόν, στο διαχωρισμό πρωτεϊνών ή σε γρήγορους βιοδιαχωρισμούς, λόγω των σημαντικών θετικών χαρακτηριστικών που έχουν, όπως είναι η εξαιρετική τους βιοσυμβατότητα, το μεγάλο εύρος ph και η ικανότητα τους να καθαρίζονται και από καυστικούς διαλύτες. Δυστυχώς όμως, παρουσιάζουν και πολλά μειονεκτήματα που δεν επιτρέπουν τη συχνή χρήση τους τώρα πια, όπως η μικρή τους απόδοση, σε σχέση με τις πυριτικές στήλες. Επίσης, τα περισσότερα πολυμερή συρρικνώνονται σε κάποιους διαλύτες, με αποτέλεσμα οι στήλες να παρουσιάζουν έλλειψη μηχανικής σταθερότητας. Τέλος, η δομή των πολυμερών, συχνά επηρεάζει τόσο την απόδοση της στήλης, όσο και τη συμμετρία των κορυφών του χρωματογραφήματος [8] Συνθήκες που επηρεάζουν τις πορώδεις ιδιότητες των μονολιθικών στηλών Οι μονολιθικές στήλες παρουσιάζουν μια διπλή κατανομή, όσον αφορά στο μέγεθος των πόρων τους. Οι μεγάλοι πόροι, επιτρέπουν στο υγρό να περάσει μέσα από το μονολιθικό υλικό, υπό χαμηλή πίεση, ακόμη και σε πολύ μεγάλες ταχύτητες ροής και οι μικροί πόροι, συνεισφέρουν σημαντικά στο ολικό μέγεθος της επιφάνειας. Αν και ένας αριθμός παραμέτρων στη διαδικασία παρασκευής των μονολιθικών στηλών, επηρεάζει τις ιδιότητες των πόρων, ορισμένες από αυτές, αποτελούν τις παραμέτρους «κλειδιά», όπως είναι η θερμοκρασία, η συγκέντρωση των πορωδών συστατικών και ο χρόνος πολυμερισμού. Όσον αφορά στη θερμοκρασία, ένας γενικός κανόνας, αναφέρει ότι όσο υψηλότερη είναι αυτή, τόσο μικρότεροι είναι οι πόροι. Η επιλογή και η συγκέντρωση των πορωγενών διαλυτών, είναι ένα άλλο εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ελεγχθούν οι πορώδεις ιδιότητες, χωρίς να μεταβάλλεται η χημική σύσταση του τελικού πολυμερούς. Γενικά, μεγαλύτερο μέγεθος πόρων, μπορεί να επιτευχθεί αν χρησιμοποιηθούν διαλύτες φτωχοί σε πορώδη συστατικά. Τέτοιοι διαλύτες είναι συνήθως αλειφατικές αλκοόλες και πολυμερή με ευθύγραμμη αλυσίδα [8]. 30

31 Σύγκριση των μονολίθων με τις συμβατικές στήλες Αντίθετα από τις συμβατικές στήλες, στις οποίες το υλικό πλήρωσης παράγεται με εφαρμογή προετοιμασμένων σωματιδίων στο κατάλληλο κομμάτι σωλήνα, η πλήρωση των μονολιθικών στηλών γίνεται με ένα και μοναδικό κομμάτι πορώδους υλικού, το οποίο προσκολλάται στα τοιχώματα του σωλήνα. Το εξωτερικό πορώδες των χρωματογραφικών στηλών, είναι συνήθως μεταξύ 0,39 και 0,42 μm, ενώ σπάνια ξεπερνά τα 0,45 μm. Στην περίπτωση όμως των μονολιθικών στηλών, ο τρόπος προετοιμασίας επιτρέπει τον ανεξάρτητο έλεγχο του σκελετικού μεγέθους, (το οποίο ελέγχει την κινητική της μεταφοράς μάζας, άρα και την απόδοση), και του εσωτερικού όγκου, (ο οποίος ελέγχει τη διαπερατότητα). Η υψηλή διαπερατότητα, είναι μια αξιοσημείωτη ιδιότητα των μονολιθικών στηλών, που οφείλεται στη μεγαλύτερη διάμετρο των ανοικτών καναλιών που έχει το υλικό πλήρωσης, για τη ροή της κινητής φάσης ανάμεσα από τη στατική. Ο όγκος των macropores μέσα από τους οποίους ρέει η κινητή φάση στις μονολιθικές στήλες, αντιστοιχεί με αυτόν των απλών συμβατικών στηλών, αφού μόνο το μέγεθός τους ελέγχει τη διαπερατότητα της στήλης και επομένως την πίεση που χρειάζεται να επιτευχθεί για να λειτουργήσει η στήλη σε μια συγκεκριμένη ταχύτητα ροής. Και στους δύο τύπους στηλών, το μέγεθος και ο όγκος των mesopores ελέγχει την επιφανειακή περιοχή και συνεπώς τους όγκους συγκράτησης. Στις συμβατικές στήλες, η μεγαλύτερη απορροφητική επιφάνεια που εντοπίζεται μέσα στα σωματίδια, είναι προσιτή στην επίδραση μιας αργής μοριακής διάχυσης ανάμεσα από την κινητή φάση. Λόγω της κατασκευής του μονολιθικού υλικού, το οποίο περιέχει πόρους που επιτρέπουν εύκολη ροή, το μέγεθος της διάχυσης μειώνεται, καταλήγοντας σε μείωση των προβλημάτων που οφείλονται σε φαινόμενα μεταφοράς μάζας. Επίσης, το ύψος των θεωρητικών πλακών Η, είναι σχεδόν 3,5 φορές μικρότερο στο μονολιθικό υλικό, από ότι σε μια συμβατική στήλη, αναδεικνύοντας ένα μεγάλο πλεονέκτημα των μονολιθικών στηλών, που είναι οι υψηλές ταχύτητες ροής. Επιπλέον, τα μονολιθικά υλικά κατέχουν ξεκάθαρα πλεονεκτήματα, όσον αφορά στην ανάλυση ουδέτερων ενώσεων, εξαιτίας των υψηλότερων πιέσεων που εμφανίζουν οι συμβατικές στήλες. 31

32 Η μονολιθική στήλη με το εμπορικό όνομα Chromolith, του οίκου Merck, η οποία απεικονίζεται στο σχήμα 1.8, είναι συγκρίσιμη στην εκλεκτικότητα με τις συμβατικές στήλες αντίστροφης φάσης, ενώ έχει δειχθεί ότι είναι ισότιμη με τις συμβατικές στήλες των 3,5-5 μm, με το επιπρόσθετο πλεονέκτημα ότι οι ταχύτητες ροής μπορούν να φθάσουν μέχρι και 9 ml/min. Σχήμα 1.8: Μονολιθική στήλη Chromolith Performance RP-18 endcapped. Τέλος, σημειώνεται ότι η μηχανική σταθερότητα των συμβατικών στηλών, ελέγχεται κατά τη διάρκεια της πλήρωσης τους, υπό πίεση δύο φορές υψηλότερη της μέγιστης πίεσης που θα έχουν, όταν χρησιμοποιηθούν, ενώ η μηχανική σταθερότητα των μονολιθικών στηλών, ελέγχεται κατά την πρώτη εφαρμογή τους. Παρά τις εξαιρετικές τους ιδιότητες και τα πολλά πλεονεκτήματα που παρουσιάζουν οι μονολιθικές στήλες συγκρινόμενες με τις απλές χρωματογραφικές στήλες, σε ορισμένες αναφορές φαίνεται να παρουσιάζουν και κάποια μειονεκτήματα. Τα μειονεκτήματα αυτά σχετίζονται με τη μορφή των χρωματογραφημάτων, όταν αναλύονται αλκαλικές ενώσεις ή όταν χρησιμοποιείται κινητή φάση με ph=7. Συγκεκριμένα, παρατηρούνται κορυφές με μειωμένο ύψος και κακή συμμετρία και είναι ακόμη αβέβαιο αν αυτό το γεγονός αποτελεί συνέπεια της διαφορετικής κατασκευαστικής δομής των μονόλιθων, ή αν οφείλεται στην υψηλή «δραστηριότητα» που παρουσιάζουν συνήθως τα πυριτικά υλικά [8, 10] Εφαρμογές των μονολίθων Οι μονολιθικές στήλες, λόγω της μηχανικής τους σταθερότητας και του τρόπου κατασκευής τους, ενδείκνυνται για χρήση σχεδόν σε όλες τις χρωματογραφικές τεχνικές, όπως HPLC, Gas Chromatography (GC), capillary 32

33 electro-chromatography (CEC), αλλά και στο στάδιο της προκατεργασίας δείγματος ως προσροφητικά υλικά, κυρίως στην SPE, ή σε on-line συστήματα σύγχρονων τεχνικών ανάλυσης. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί και πιο εξειδικευμένες εφαρμογές των μονόλιθων, όπως η σύζευξη με την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων (SIA) και η χρήση τους σε τεχνική προκατεργασίας in tube SPME. Οι μονολιθικές στήλες στην HPLC έχουν χρησιμοποιηθεί στον προσδιορισμό διαφόρων ενώσεων, όπως αντιβιοτικά, βιταμίνες, οξέα, αμίνες, ορμόνες κ.α. σε βιολογικά υγρά και φαρμακευτικά σκευάσματα, σε περιβαλλοντικά δείγματα και σε τρόφιμα, καθώς και στον προσδιορισμό διαφόρων πρωτεϊνών, πεπτιδίων και γενικότερα μεγαλομορίων σε κλινικές μελέτες [8]. Η ανάλυση των τροφίμων τα τελευταία χρόνια έχει κερδίσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας, λόγω της αυξανόμενης ανάγκης του ανθρώπου για άριστη ποιότητα στα προϊόντα που καταναλώνει. Από χημικής πλευράς όμως, τα τρόφιμα, όπως και το γάλα, είναι πολύπλοκα υποστρώματα και χρειάζονται ιδιαίτερο χειρισμό, τόσο στην απομάκρυνση των παρεμποδίσεων, όσο και στην εκλεκτική παραλαβή σε υψηλές ανακτήσεις των προσδιοριζόμενων συστατικών. Αυτό, ναι μεν μπορεί να επιτευχθεί με συμβατικά μέσα, όπως χρωματογραφικές στήλες και προσροφητικά υλικά, αλλά το αποτέλεσμα δεν είναι πάντα το επιθυμητό, από πλευράς κόστους, χρόνου, κατανάλωσης διαλυτών, καθαρισμό υποστρώματος κλπ. Σε αυτό το σημείο τα υλικά νέας τεχνολογίας κάνουν επιτακτική τη χρήση τους [9]. Δεν έχουν αναπτυχθεί πολλές μέθοδοι για τον προσδιορισμό διαφόρων ενώσεων στο γάλα, με τη χρήση αναλυτικών μονολιθικών στηλών. Οι χαρακτηριστικότερες πραγματεύονται τον προσδιορισμό μελαμίνης και αντιβιοτικών, όπως πενικιλλινών, κεφαλοσπορινών και σουλφοναμιδίων, τόσο ξεχωριστά, όσο και με συνδυασμό των διαφόρων κατηγοριών αντιμικροβιακών παραγόντων [11-14]. Μεγάλο ενδιαφέρον έχει στο πεδίο της βιοτεχνολογίας, η εκλεκτική παραλαβή και ο αποτελεσματικός καθαρισμός των πρωτεϊνών και γενικότερα των πεπτιδίων από το γάλα. Οι μονόλιθοι έχουν διευκολύνει πολύ τους επιστήμονες στην προσπάθεια αυτή, σε συνδυασμό με την τεχνική της HPLC. Χρησιμοποιούνται, είτε μονολιθικές στήλες του εμπορίου για τον προσδιορισμό των κυριότερων πρωτεινών του γάλακτος, όπως της α-λακταλβουμίνης, της σ-λακτογλοβουλίνης, της λακτοφερίνης και βιοενεργών πεπτιδίων, είτε με παρασκευή πιο εξειδικευμένων μονόλιθων που καλύπτουν τις ανάγκες συγγένειας των πρωτεινών με τα υλικά σε κάθε έρευνα (π.χ. εμπλουτισμός φωσφοπεπτιδίων) [15-23]. 33

34 Τέλος πρέπει να αναφερθεί λίγες περισσότερες λεπτομέρειες, η συνεισφορά των μονόλιθων στην προκατεργασία πολύπλοκων δειγμάτων, όπως είναι τα τρόφιμα και τα βιολογικά δείγματα. Τα συμβατικά προσροφητικά υλικά της εκχύλισης στερεάς φάσης εμφανίζουν σε ορισμένες περιπτώσεις κάποια μειονεκτήματα στη χρήση τους: μαζί με τις προσδιοριζόμενες ενώσεις, συνεκλούονται οι παρεμποδίσεις του υποστρώματος, οπότε η ποσοτική αποτίμηση των κορυφών ενός χρωματογραφήματος παρουσιάζει προβλήματα. Τα μοριακά αποτυπωμένα πολυμερή (MIPs), είναι καινούρια προσροφητικά υλικά με πολύ ικανοποιητικές ιδιότητες, εξαιτίας της υψηλής συγγένειας που εμφανίζουν με τα συστατικά που προσδιορίζονται. Ο συνδυασμός των MIPs με τους μονόλιθους, εμφανίστηκε στη δεκαετία του Είτε με τη μορφή στηλών, είτε με τη μορφή προσροφητικών υλικών, έχουν δώσει πολύ ικανοποιητικά αποτελέσματα σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία. Η τεχνική προκατεργασίας δείγματος PMME (polymer monolith microextraction) που βασίζεται στο συνδυασμό που μόλις αναφέρθηκε, οδήγησε στην εκλεκτική παραλαβή από το γάλα υπολειμμάτων κινολονών, σουλφοναμιδίων, χλωραμφενικόλης και δισφαινόλης-α. Τέλος οι μονόλιθοι, ως προσροφητικά της μικροεκχύλισης στερεάς φάσης, πέτυχαν την εκλεκτική παραλαβή διάφορων συστατικών, όπως αντιβιοτικά (κινολόνες, σουλφοναμίδια, τετρακυκλίνες) και τη μελαμίνη από το σύνθετο υπόστρωμα του γάλακτος [24-36] Στήλες τεχνολογίας συμπαγούς πυρήνα (core-shell columns) Η τεχνολογική πρόοδος των τελευταίων δεκαετιών οδήγησε στην ανάπτυξη χρωματογραφικών υλικών με μέγεθος σωματιδίων μικρότερο των 2 μm. Η χρήση όμως τέτοιων χρωματογραφικών στηλών απαιτεί τη χρήση αντλιών ικανών να δουλεύουν σε πιέσεις άνω των 1000 bar, το κόστος αγοράς των οποίων είναι πολλές φορές απαγορευτικό για αναλυτικά εργαστήρια χαμηλού προϋπολογισμού. Νέες αναλυτικές στήλες, όπως η Kinetex-Phenomenex, χρησιμοποιούν χρωματογραφικά υλικά (2,6 μm) τεχνολογίας συμπαγούς πυρήνα (1,9 μm), ο οποίος περιβάλλεται από πορώδες κέλυφος (0,35 μm) και έχουν προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον (Σχήμα 1.9). Χρησιμοποιώντας τεχνολογία στερεού-πηκτής (sol-gel) σε 34

35 συνδυασμό με την τεχνολογία νανο-δομής, ένας αρκετά ανθεκτικός ομοιογενής και πορώδης μανδύας αναπτύσσεται περιμετρικά ενός συμπαγούς πυρήνα silica [37]. Σχήμα 1.9: Σχηματική αναπαράσταση της δομής ενός σωματιδίου συμπαγούς πυρήνα που περιβάλλεται από πορώδες κέλυφος. Τα σωματίδια συμπαγούς πυρήνα, συγκριτικά με τα παραδοσιακά πορώδη σωματίδια, εμφανίζουν: Μικρότερη κατανομή του μεγέθους σωματιδίων. Πιο αποτελεσματική πάκτωση του πληρωτικού υλικού στο εσωτερικό της στήλης. Γρήγορη έκλουση των συστατικών από τη στήλη - περιορισμό της διάχυσης. Αυτή η τεχνολογία επιτρέπει το σχηματισμό σχεδόν σφαιρικών σωματιδίων με λεία εξωτερική επιφάνεια και ομοιόμορφο πάχος κελύφους, γύρω από συμπαγή σωματίδια, με περιορισμένη διασπορά μεγέθους κόκκου, η οποία περιορίζει τις επικρατούσες ταχύτητες κοντινών αποστάσεων μεταξύ των κόκκων και περιορίζει δραματικά τους δύο κύριους παράγοντες διασποράς των κορυφών τη στροβιλώδη διάχυση και την αντίσταση μεταφοράς μάζας μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης (παράγοντες Α και C της εξίσωσης van Deemter). Συγκριτικά με τα κλασικά πορώδη χρωματογραφικά υλικά, οι ενώσεις δαπανούν λιγότερο χρόνο για να διαχυθούν εντός και εκτός των πόρων της στατικής φάσης και κινούνται πιο γρήγορα διαμέσου της χρωματογραφικής στήλης. Η περιορισμένη διάχυση επιτρέπει τη γρήγορη μεταφορά μάζας και έτσι περιορίζεται η διάχυση της ζώνης του δείγματος. Τελικά, επιτυγχάνεται χρωματογραφικός 35

36 διαχωρισμός υπερυψηλής απόδοσης, κάτω από συνηθισμένες χρωματογραφικές συνθήκες. Οι μικρές τιμές του παράγοντα C επιτρέπουν την εφαρμογή υψηλών ροών με επακόλουθη μείωση του χρόνου ανάλυσης, χωρίς σημαντική μείωση της χρωματογραφικής απόδοσης [38]. Η καινοτόμος διαδικασία παραγωγής αυτών των σωματιδίων παράγει μια πολύ στενή κατανομή μεγέθους σωματιδίων. Έτσι οι αποστάσεις μεταξύ των σωματιδίων έχουν ελαχιστοποιηθεί, και το εσωτερικό της στήλης περιορίζει τα φαινόμενα διάχυσης συγκριτικά με τα παραδοσιακά πορώδη σωματίδια (Σχήμα 1.10). Σωματίδια Core-Shell Παραδοσιακά πορώδη σωματίδια Σχήμα 1.10: Σχηματική απεικόνιση της κατανομής των σωματιδίων στο εσωτερικό της στήλης. Ο παράγοντας Α της εξίσωσης van Deemter μειώνεται, εξαιτίας της ομοιογένειας του συνόλου του υλικού πλήρωσης που παρατηρείται στις στήλες τεχνολογίας συμπαγούς πυρήνα. Στο Σχήμα 1.11 αυτό γίνεται εύκολα αντιληπτό, αν παρατηρήσει κανείς την περιορισμένη διαδρομή του δείγματος μέσα στη στήλη. Στήλη Core-Shell Συμβατική Στήλη Σχήμα 1.11: Περιορισμός της διασποράς των κορυφών. Τέλος η ελαχιστοποίηση της διαδρομής του δείγματος οδηγεί στο σχηματισμό καθαρότερων κορυφών (Σχήμα 1.12). Αυτό οφείλεται στη μείωση του παράγοντα C 36

37 στην εξίσωση van Deemter που εκφράζει την αντίσταση στη μεταφορά μάζας, με επακόλουθη την εφαρμογή υψηλών ροών που συνεπάγεται μείωση του χρόνου ανάλυσης, χωρίς σημαντική μείωση της χρωματογραφικής απόδοσης [38]. Στήλη Core-Shell Συμβατική Στήλη Σχήμα 1.12: Γρήγορη μεταφορά μάζας που περιορίζει τη διάχυση στη ζώνη του δείγματος. Οι στήλες τεχνολογίας συμπαγούς πυρήνα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές για την ασφάλεια των τροφίμων, όπως στην ανίχνευση φυτοφαρμάκων, αντιβιοτικών, αφλατοξινών ή αζωχρωμάτων. Το ίδιο ισχύει και για τις περιβαλλοντικές αναλύσεις, όπως η ανίχνευση εκρηκτικών, τα φυτοφάρμακα και καρβαμιδικά χλωριούχα ζιζανιοκτόνα. Τέλος, προσφέρουν άριστα και σύντομα αποτελέσματα στην εγκληματολογία, καθώς μπορούν να εφαρμοστούν στην ανίχνευση των οπιούχων και άλλων παράνομων ναρκωτικών [39]. Συμπερασματικά, τα πλεονεκτήματα που παρουσιάζουν σε σχέση με τα υλικά πλήρωσης των συμβατικών στηλών, είναι: Αυξημένη ταχύτητα ροής. Αυξημένη διαχωριστική ικανότητα. Εξαιρετική ανθεκτικότητα, σε σύγκριση με στήλες με υλικά πλήρωσης μικρότερα των 2 μm. Αυξημένη ευαισθησία μεθόδων, λόγω της καλύτερης μορφής των κορυφών. Ελαχιστοποίηση φαινομένων διάχυσης και μεταφοράς μάζας. 37

38 Έτσι ενδείκνυνται για χρήση σε εργαστήρια που επιθυμούν να αυξήσουν την παραγωγικότητα και να μειώσουν το κόστος, χωρίς να επενδύσουν σε ένα σύστημα UHPLC [40]. 2. ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Κάθε αναλυτική διεργασία αποτελείται από διάφορα διακριτά στάδια, κάθε ένα από τα οποία είναι κρίσιμο, για να λαμβάνονται ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Το πιο πολύπλοκο και χρονοβόρο είναι η προκατεργασία του δείγματος και αποτελεί τα δύο τρίτα του συνολικού χρόνου ανάλυσης. Κρίνεται παρ όλα αυτά απαραίτητο για την απομάκρυνση και παραλαβή ή για την προσυγκέντρωση των συστατικών του αναλυόμενου δείγματος. Οι στόχοι της προκατεργασίας του δείγματος είναι: Τροποποίηση του υποστρώματος. Καθαρισμός του δείγματος. Εμπλουτισμός / προσυγκέντρωση. Απομόνωση των συστατικών που μας ενδιαφέρουν. Μια τεχνική προκατεργασίας δείγματος πρέπει να πληροί ορισμένες προϋποθέσεις, όπως να είναι απλή, ταχεία, οικονομική, εκλεκτική για τις προσδιοριζόμενες ενώσεις, αποτελεσματική και να μπορεί να αυτοματοποιηθεί. Για την ανάπτυξη της καταλληλότερης μεθόδου προκατεργασίας πρέπει να λαμβάνονται υπόψη ορισμένες παράμετροι: Οι φυσικοχημικές ιδιότητες του δείγματος. Η χημική σύνθεση του δείγματος. Υπόστρωμα / παρεμποδίσεις. Η σταθερότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης. Η ανάκτηση, η οποία πρέπει να είναι ποσοτική. Η διαδικασία να είναι απλή και Η επαναληψιμότητα / η ακρίβεια [5, 41]. 38

39 2.1 Κλασικές τεχνικές προκατεργασίας δείγματος Η μεταφορά ενός συστατικού από μια φάση σε μία άλλη λέγεται εκχύλιση και είναι μια διαδικασία, η οποία χρησιμοποιείται σε μεγάλο βαθμό για την παραλαβή ενός συστατικού από ένα υπόστρωμα. Στις εκχυλίσεις κλασικού τύπου ανήκουν η εκχύλιση υγρού-υγρού και η εκχύλιση Soxhlet. Η αρχή στην οποία στηρίζονται και οι δύο είναι η επαφή του προσδιοριζόμενου συστατικού με κάποιο διαλύτη, στον οποίο διαλύεται εκλεκτικά Εκχύλιση Υγρού-Υγρού Η εκχύλιση υγρού-υγρού δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να επιλύσει σημαντικό αριθμό προβλημάτων που υπεισέρχονται στη χημική ανάλυση, όπως είναι η απομάκρυνση παρεμποδίσεων, ο μεγαλύτερος χρόνος που απαιτείται για τη συγκεκριμένη χημική ανάλυση και άλλα. Eίναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στην προκατεργασία δειγμάτων και περιλαμβάνει την ανάμιξη ενός υδατικού διαλύματος με ένα μη μιγνυόμενο με το νερό οργανικό διαλύτη, οπότε η προσδιοριζόμενη ουσία μεταφέρεται εκλεκτικά στην οργανική στοιβάδα, από την οποία μπορεί να παραληφθεί μετά την απομάκρυνση του διαλύτη. Στις περισσότερες περιπτώσεις η ανάμιξη των δύο φάσεων γίνεται σε ένα διαχωριστικό χωνί, όπου και αναταράσσοντα, προκειμένου να έλθουν σε στενή επαφή και να αποκατασταθεί ισορροπία ανάμεσα στις δύο φάσεις [42] Εκχύλιση Soxhlet H εκχύλιση από στερεά μίγματα γίνεται συνήθως με την εκχυλιστική συσκευή Soxhlet. Το προς εκχύλιση στερεό τοποθετείται στον ειδικό πορώδη χάρτινο ή γυάλινο υποδοχέα της συσκευής. Οι ατμοί του ζέοντος διαλύτη διέρχονται από τον πλευρικό υάλινο σωλήνα του επιθέματος, συμπυκνώνονται στον ψυκτήρα και επαναρρέουν στο χάρτινο υποδοχέα του στερεού μίγματος. Μόλις ο χώρος του επιθέματος πληρωθεί με το διαλύτη γίνεται αυτόματος σιφωνισμός, ο διαλύτης (εκχύλισμα) επαναρρέει στη φιάλη και ο κύκλος επαναλαμβάνεται. Με τον τρόπο 39

40 αυτό γίνεται εμπλουτισμός του διαλύματος στη φιάλη με τα διαλυτά συστατικά του στερεού μίγματος. Η τεχνική αυτή με παρατεταμένη λειτουργία είναι κατάλληλη για την παραλαβή ακόμη και ελάχιστα διαλυτών ουσιών [43]. 2.2 Σύγχρονες τεχνικές προκατεργασίας δείγματος Με την κατασκευή αναλυτικών οργάνων που προσφέρουν μεγάλη ευαισθησία, η προκατεργασία των δειγμάτων έχει γίνει ιδιαίτερα απαιτητική με αποτέλεσμα τεχνικές προκατεργασίας, όπως η εκχύλιση υγρού-υγρού σε πολλές περιπτώσεις να είναι ανεπαρκείς. Ακολουθεί μια σύντομη παρουσίαση των σύγχρονων τεχνικών προκατεργασίας δείγματος Εκχύλιση Στερεάς Φάσης- Υγρού (Solid Phase Extraction) Η εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (SPE) παρουσιάζει σε αρκετές περιπτώσεις σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις κλασικές και ίσως παρωχημένες τεχνικές προκατεργασίας δείγματος. Η εκχύλιση στερεάς φάσης γίνεται απαραίτητη, λαμβάνοντας υπόψη τον αυξημένο αριθμό των δειγμάτων που πρέπει να αναλυθούν, τις απαιτήσεις για ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό των προσδιοριζόμενων ενώσεων και τέλος τον αριθμό των ενώσεων του δείγματος. Τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στην κατασκευή αναλυτικών οργάνων, ώστε αυτά να έχουν μεγαλύτερη ευαισθησία και να μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση πολυάριθμων δειγμάτων. Η εκχύλιση στερεάς φάσης περιλαμβάνει την κατανομή των εκχυλιζόμενων συστατικών ανάμεσα σε δύο φάσεις: μια στερεή, το προσροφητικό υλικό και μια υγρή φάση, το υγρό υπόστρωμα, το οποίο περιλαμβάνει και τις πιθανές παρεμποδίσεις. Τα προσδιοριζόμενα συστατικά θα πρέπει να έχουν μεγαλύτερη συγγένεια προς τη στερεή φάση, απ ότι προς το υπόστρωμα του δείγματος, ώστε να λάβει χώρα συγκράτηση. Τα συστατικά αυτά στη συνέχεια απομακρύνονται με έκλουση με τη βοήθεια διαλύτη, ο οποίος έχει μεγαλύτερη συγγένεια προς τα συστατικά. Οι διάφοροι μηχανισμοί συγκράτησης και έκλουσης είναι αποτέλεσμα διαμοριακών αλληλεπιδράσεων που λαμβάνουν χώρα ανάμεσα σε τρία συστατικά: τα προσδιοριζόμενα συστατικά, τις ενεργές ομάδες στην επιφάνεια του προσροφητικού και του διαλύτη έκλουσης. Οι στόχοι της SPE εκτός από την απομάκρυνση των παρεμποδίσεων και την προσυγκέντρωση του δείγματος περιλαμβάνουν ακόμη: 40

41 Την κλασματική κατανομή του δείγματος σε διάφορες ομάδες ενώσεων, όπως και στην κλασική χρωματογραφία στήλης. Τη δέσμευση συστατικών που είναι ασταθείς σε υγρό περιβάλλον ή εμφανίζουν σχετικά υψηλή πτητικότητα. Την παραγωγοποίηση με αντίδραση ανάμεσα στις δραστικές ομάδες των συστατικών και αυτών στο προσροφητικό υλικό. Με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται: καθαρισμός του δείγματος, απομάκρυνση των παρεμποδίσεων, αύξηση της συγκέντρωσης του προσδιοριζόμενου συστατικού. Όλα τα είδη δειγμάτων μπορούν να υποστούν κατεργασία με την τεχνική της SPE, όπως στερεά, υγρά, ημιστερεά, κρεμώδη κλπ. Στο Σχήμα 2.1 απεικονίζεται μία διάταξη Εκχύλισης Στερεάς Φάσης [44]. Σχήμα 2.1: Διάταξη Εκχύλισης Στερεάς Φάσης. Η SPE εφαρμόζεται σύμφωνα με τα ακόλουθα στάδια. Βελτιστοποίηση της SPE μπορεί να εκτελεστεί σε κάθε ένα από τα στάδια αυτά για καλύτερη αποτελεσματικότητα. 1. Ενεργοποίηση του προσροφητικού. Αυτή περιλαμβάνει την επιδιαλύτωση των δραστικών ομάδων του προσροφητικού και την προετοιμασία του να αλληλεπιδράσει με το δείγμα. 2. Φόρτωση δείγματος. Στο στάδιο αυτό, το δείγμα, το οποίο μπορεί να περιέχει και το εσωτερικό πρότυπο, ωθείται μέσα από το προσροφητικό της μικροστήλης. Τα επιθυμητά συστατικά δεσμεύονται στο προσροφητικό. Για να αυξηθεί η δέσμευση το δείγμα αραιώνεται με νερό, ώστε να αυξηθεί η πολικότητα του περιβάλλοντος των συστατικών. 41

42 3. Έκπλυση. Στο στάδιο αυτό απομακρύνονται τα ανεπιθύματα συστατικά του υποστρώματος. Ο διαλύτης που επιλέγεται για την έκπλυση πρέπει να είναι ασθενής (νερό η ρυθμιστικό διάλυμα), ώστε τα επιθυμητά συστατικά να μην εκροφηθούν από το προσροφητικό. 4. Ξήρανση του προσροφητικού, εάν πρέπει να απομακρυνθεί το νερό σε περίπτωση που ο διαλύτης έκλουσης είναι μη αναμίξιμος. Η ξήρανση μπορεί να επιτευχθεί με την εφαρμογή κενού, διαβίβαση ρεύματος αζώτου ή με φυγοκέντρηση. Τα επιθυμητά συστατικά βρίσκονται στη φάση αυτή δεσμευμένα στη μικροστήλη και σε καθαρή κατάσταση. 5. Έκλουση για την ποσοτική παραλαβή των επιθυμητών συστατικών, με χρήση του κατάλληλου διαλύτη. Για την έκλουση μιας προσροφημένης ένωσης από μία μικροστήλη ή δισκίο SPE αντίστροφης φάσης, χρησιμοποιείται ένας μη πολικός διαλύτης τα μόρια του οποίου, ανταγωνίζονται τα μόρια της προσροφημένης ένωσης και λόγω της μεγάλης περίσσειάς τους, τη "διώχνουν" από το υπόστρωμα. 6. Εξάτμιση του διαλύτη, σε ήπιο ρεύμα αζώτου και πιθανή επαναδιάλυση του στερεού υπολείμματος στην κινητή φάση, με πιθανή προσθήκη του εσωτερικού προτύπου. 42

43 Παρά το γεγονός ότι η βαρύτητα μπορεί να διευκολύνει τη ροή των περισσότερων οργανικών διαλυτών μέσα από τις μικροστήλες, τα δείγματα και οι διαλύτες με μεγάλο ιξώδες πρέπει να αντληθούν με εφαρμογή κενού που εφαρμόζεται στο σημείο εξόδου της μικροστήλης, ή με θετική πίεση που εφαρμόζεται στο σημείο εισόδου της, με αέριο από σύριγγα ή φυγοκέντρηση. Οι τυπικές ταχύτητες ροής που εφαρμόζονται είναι 0,2-1,5 ml/s. Τα στάδια εφαρμογής της φαίνονται στο Σχήμα 2.2. Υπάρχουν δύο προσεγγίσεις στη εφαρμογή της SPE: συγκράτηση των προσδιοριζόμενων συστατικών στο προσροφητικό υλικό της μικροστήλης ή συγκράτηση των παρεμποδίσεων. Σχήμα 2.2: Στάδια εφαρμογής εκχύλισης στερεάς φάσης υγρού. Οι μικροστήλες στην SPE είναι διαθέσιμες σε μεγάλη ποικιλία μεγέθους με υλικά πλήρωσης από 20 mg έως και 10 g και με όγκους δοχείου μέχρι 30 ml. Στο Σχήμα 2.3 φαίνονται διάφοροι τύποι μικροστηλών που χρησιμοποιούνται στην SPE [45]. Oι μικροστήλες μιας χρήσης αποτελούνται από πολυπροπυλένιο σε μορφή σύριγγας, χωρίς έμβολα ή βελόνα. Η μικροστήλη περιέχει το υλικό πλήρωσης με διάμετρο σωματιδίων 40 μm, τo οποίo είναι ακινητοποιημένο ανάμεσα σε δύο φρίτες από πολυπροπυλένιο με διάμετρο πόρων 20 μm. Το πληρωτικό υλικό που συναντάται συχνότερα στην εκχύλιση στερεάς φάσης είναι η πυριτία SiO 2 (silica), στην επιφάνεια της οποίας έχουν προσδεθεί με ομοιοπολικούς δεσμούς αλκυλο- ή αρυλο- ομάδες. Η πρόσδεση πραγματοποιείται μέσω των αρχικά ελεύθερων ομάδων σιλανόλης (Si OH) που είναι υδρόφιλες (πολικές) και βρίσκονται στην επιφάνεια του πυριτικού πληρωτικού υλικού. Οι ομάδες αυτές αντιδρούν με κατάλληλα "σιλανοποιητικά" 43

44 αντιδραστήρια και μετατρέπονται χημικά σε υδρόφοβες αλκυλο- ή αρυλο-ομάδες (Σχήμα 2.3). Σχήμα 2.3: Διάφοροι τύποι μικροστηλών που χρησιμοποιούνται στην SPE. Στο σημείο αυτό αξίζει να αναφερθεί, ότι η SPE χαρακτηρίζεται από τα ακόλουθα πλεονεκτήματα: Ταχύτητα. Επαναληψιμότητα. Εκλεκτικότητα. Χαμηλή κατανάλωση διαλυτών. Δυνατότητα εφαρμογής σε ποικίλα είδη δειγμάτων. Ασφάλεια Απλότητα. Συνδυαστική τεχνική. Δυνατότητα εφαρμογής on-line & off-line στη χρωματογραφική τεχνική. Υψηλές ανακτήσεις συστατικών. 44

45 2.2.2 Εκχύλιση Διασποράς Στερεάς Φάσης Υποστρώματος (Matrix Solid Phase Dispersion) Η τεχνική της διασποράς στερεάς φάσης υποστρώματος είναι μια τεχνική που έκανε την εμφάνισή της μόλις το 1989 και εφαρμόζεται κυρίως για την κατεργασία στερεών, ημιστερεών και υγρών δειγμάτων με υψηλό ιξώδες, σε πολύπλοκα υποστρώματα, όπως τα τρόφιμα και τα βιολογικά δείγματα. Η καινοτομία της τεχνικής έγκειται στο ότι το δείγμα έρχεται σε άμεση επαφή με το στερεό προσροφητικό και επομένως η παραλαβή των συστατικών γίνεται αποτελεσματικά αποφεύγοντας τις δυσκολίες μιας κλασικής προσέγγισης μέσω SPE [46]. Είναι μία απλή τεχνική και τα βασικά στάδια εφαρμογής της έχουν ως εξής (Σχήμα 2.4): το δείγμα αναμιγνύεται με το προσροφητικό υλικό και το μίγμα ομογενοποιείται, οπότε τα προσδιοριζόμενα συστατικά προσροφώνται σε αυτό. Το ομογενοποιημένο μίγμα πακτώνεται σε μία μικροστήλη μεταξύ δύο φριτών και τα επιθυμητά συστατικά εκλούονται με χρήση κατάλληλου διαλύτη. Το προϊόν της έκλουσης, είτε αναλύεται απευθείας, ή εφόσον κρίνεται απαραίτητο υπόκειται σε επιπλέον στάδιο καθαρισμού [47]. Εναλλακτικά για την ενίσχυση τόσο της ομογενοποίησης του μίγματος, όσο και της εκχύλισης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η ενέργεια υπερήχων. Οι υπέρηχοι υποβοηθούν στην αποτελεσματική επαφή ανάμεσα στο στερεό προσροφητικό και το εκχύλισμα, γεγονός που οδηγεί σε υψηλότερες ανακτήσεις των εξεταζόμενων ενώσεων [48]. Η ενέργεια υπερήχων δημιουργεί πολυάριθμες μικρές φυσαλίδες υγρού και προκαλεί τη μηχανική διάσπαση των σωματιδίων του στερεού υλικού. Η πιο εύκολα διαθέσιμη διάταξη διάδοσης ενέργειας υπερήχων είναι το λουτρό υπερήχων, αν και αναφέρονται στη βιβλιογραφία και άλλα μέσα με χαρακτηριστικότερο τον κυλινδρικό σωλήνα υπερήχων [49]. Η MSPD πλεονεκτεί της συμβατικής SPE στην εκλεκτικότητα, την ευκολία του χειρισμού και στο γεγονός ότι μπορεί να ελαχιστοποιήσει τα στάδια πλύσης και εκχύλισης, μειώνοντας δραστικά το χρόνο εκτέλεσης της και την κατανάλωση οργανικών διαλυτών [47, 50-54]. 45

46 Σχήμα 2.4: Στάδια ανάπτυξης εκχύλισης διασποράς υποστρώματος. Αρκετοί παράγοντες είναι αυτοί που πρέπει να λαμβάνονται υπ όψιν πριν την εφαρμογή της MSPD: 1) H επίδραση του μέσου όρου του μεγέθους των σωματιδίων του προσροφητικού: Πολύ μικρό μέγεθος σωματιδίων (3-10 μm) μπορεί να οδηγήσει σε επαναλαμβανόμενα στάδια παραλαβής των συστατικών ή στην εφαρμογή κενού. Ιδανικά προτείνεται μίγμα πυριτικών με μεγέθη σωματιδίων ( μm), γιατί λειτουργούν ικανοποιητικά ως προσροφητικά και το κόστος τους είναι χαμηλό. 2) Τα υλικά είναι non-end-capped, έναντι των end-capped συμβατικών τεχνικών εκχύλισης και το περιεχόμενό τους σε άνθρακα είναι από 8 έως 18%. 3) Η φύση του προσροφητικού: Ανάλογα με την πολικότητα του υλικού που έχει επιλεγεί, μπορούν να παρατηρηθούν πολύ διαφορετικά αποτελέσματα. Για παράδειγμα, εφαρμογές που απαιτούν μια λιπόφιλη φάση, μπορούν να χρησιμοποιήσουν C 18 και εναλλακτικά C 8 ως προσροφητικό. 4) Η χρήση μη παραγωγοποιημένου διοξειδίου του πυριτίου ή άλλων στερεών ακατέργαστων υλικών: Η χρήση π.χ. άμμου, δε μπορεί να έχει τα ίδια αποτελέσματα με το οκταδεκυλοσιλάνιο (ODS). Όλα τα υλικά έχουν μια καθορισμένη χημική συμπεριφορά και εμπεριέχουν πολλές διαφορετικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένης μιας ποικιλίας μετάλλων, και έτσι μπορούν εν δυνάμει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με άλλα υλικά, για να ενισχύσουν τις προσροφητικές τους ικανότητες, με σκοπό την απομόνωση των συστατικών από τα υποστρώματα που μελετώνται. 46

47 Η εκχύλιση διασποράς υποστρώματος διαφέρει από την κλασική SPE στις αρχές λειτουργίας της, ως προς τα ακόλουθα σημεία: 1) Προσφέρει την πλήρη διασπορά του δείγματος σε σωματίδια πολύ μικρού μεγέθους με αυξημένη επιφάνεια επαφής, για την αποτελεσματικότερη εκχύλιση του δείγματος. 2) Στην SPE το δείγμα συνήθως προσροφάται στην κορυφή του υλικού πάκτωσης της μικροστήλης, ενώ στην MSPD σε όλη τη μάζα του προσροφητικού. 3) Οι φυσικές και χημικές αλληλεπιδράσεις των συστατικών του συστήματος είναι εντονότερες στην MSPD από αυτές της κλασικής SPE [47]. Η MSPD, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, έχει πολλές εφαρμογές σε τρόφιμα που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο. Έχει χρησιμοποιηθεί για προκατεργασία δειγμάτων ξηρών καρπών, δημητριακών, ιστών κρεατοπαραγωγών ζώων, λευκού και κόκκινου κρέατος, γαλακτοκομικών, ψαριών, αυγών, φρούτων και λαχανικών κ.α., καταφέρνοντας να απομονώσει εκλεκτικά πολλές κατηγορίες ενώσεων, καλύπτοντας επιτυχώς διαφορετικές ανάγκες προσδιορισμών. Ενδεικτικά αναφέρονται: αντιβιοτικά, αφλατοξίνες, υπολείμματα φυτοφαρμάκων, καροτενοειδή, φλαβονοειδή, φαινολικά και βιταμίνες. Τα αποτελέσματά της είναι σε πολλές περιπτώσεις ισοδύναμα ή και καλύτερα από αυτά επίσημων μεθόδων που περιλαμβάνουν την κλασική SPE, καταναλώνοντας ακόμα και 95% λιγότερο διαλύτη και δαπανώντας περίπου 90% λιγότερο χρόνο. Η συνεχής βελτίωση των προσροφητικών υλικών και η αυτοματοποίηση της διαδικασίας, καθιστά πλέον την εκχύλιση διασποράς υποστρώματος ανταγωνιστική με τις συμβατικές μεθόδους προκατεργασίας δείγματος, σχεδόν σε όλα τα επίπεδα, και θεωρείται μία αξιόπιστη εναλλακτική λύση κατά την ανάπτυξη νέων αναλυτικών πρωτοκόλλων [47, 50-54] Μικρο-εκχύλιση Στερεάς Φάσης (Solid Phase Micro Extraction) H μικρο-εκχύλιση στερεάς φάσης στηρίζεται στην εκλεκτική προσρόφηση των προσδιοριζόμενων συστατικών σε μία ίνα μικρής διαμέτρου και λίγων εκατοστών, η οποία είναι φτιαγμένη από τηγμένο πυρίτιο επιστρωμένο με πολυμερές υλικό. Η οπτική ίνα βρίσκεται προσαρμοσμένη σε μια μικροσύριγγα, η οποία εισάγεται στο δείγμα και τα προσδιοριζόμενα συστατικά προσροφώνται σε αυτήν. Η 47

48 προσρόφηση δε γίνεται ποσοτικά, αλλά αποκαθίσταται μια ισορροπία κατανομής των συστατικών ανάμεσα στις δύο φάσεις, αυτή του δείγματος και αυτή της ίνας. Ακολουθεί η απομάκρυνση της ίνας από το δείγμα και η επαναφορά της στο εσωτερικό της μικροσύριγγας. Όταν ακολουθεί διαχωρισμός των προσδιοριζόμενων συστατικών με HPLC, απαιτείται σύνδεση με βαλβίδα δύο θέσεων, στην οποία, όταν εισαχθεί η ίνα, γίνεται παραλαβή των συστατικών με τη βοήθεια της κινητής φάσης [41] Εκχύλιση υπερκρίσιμου ρευστού Η τάση ατμών μιας ένωσης στην κρίσιμη θερμοκρασία ονομάζεται κρίσιμη πίεση. Σε θερμοκρασίες και πιέσεις πάνω από την κρίσιμη θερμοκρασία, η ουσία λέγεται υπερκρίσιμο ρευστό. Τα υπερκρίσιμα ρευστά (π.χ. CO 2, N 2 O, NH 3, n- βουτάνιο) χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση των προσδιοριζόμενων συστατικών από υποστρώματα Το δείγμα τοποθετείται σε περιέκτη ροής και το υπερκρίσιμο ρευστό περνά μέσα από το δείγμα. Μετά από αποσυμπίεση, η εκχυλισμένη ένωση συλλέγεται σε διαλύτη ή εγκλωβίζεται σε προσροφητικό και ακολουθεί εκρόφηση με έκπλυση με διαλύτη [41] Εκχύλιση υποβοηθούμενη από μικροκύματα Το δείγμα τοποθετείται μαζί με ένα διαλύτη σ' ένα ανοικτό ή κλειστό περιέκτη και θερμαίνεται με τη βοήθεια μικροκυμάτων, προκαλώντας έτσι εκχύλιση της προσδιοριζόμενης ένωσης στο διαλύτη [41]. 2.3 ΣΥΓΧΡΟΝΑ ΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Υλικό QuEChERS-Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe To προσροφητικό υλικό QuEChERS είναι μια γρήγορη, απλή και αποτελεσματική εναλλακτική λύση στις συμβατικές τεχνικές προκατεργασίας δείγματος, ιδιαίτερα με σκοπό την πολυ-υπολειμματική ανάλυση. Τα QuEChERS 48

49 (Σχήμα 2.5), προτάθηκαν το 2003 από επιστήμονες του Περιφερειακού Κέντρου Ερευνών Υπουργείου Γεωργίας των ΗΠΑ (Wyndmoor, PA). Σχήμα 2.5: Προσροφητικά υλικά QuEChERS που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο. Οι ερευνητές εκεί έψαχναν για έναν απλό, αποτελεσματικό, και ανέξοδο τρόπο να παραλάβουν εκλεκτικά υπολείμματα φυτοφαρμάκων από διάφορα δείγματα ρουτίνας, ξεπερνώντας τις δυσκολίες της κλασικής κατεργασίας που χρησιμοποιούσαν. Σε αντίθεση με τα γνωστά, η αποτελεσματικότητα των υλικών QuEChERS, έγκειται σε ένα στάδιο καθαρισμού του υποστρώματος με ανατάραξη, απλά και γρήγορα. Τα σύνθετα υποστρώματα μέσω συμβατικής προκατεργασίας για την απομάκρυνση των παρεμποδίσεων και την εκλεκτική παραλαβή των εξεταζόμενων συστατικών σε υψηλές ανακτήσεις, οδηγούσαν σε μία πολύπλοκη, χρονοβόρα και υψηλού κόστους κατεργασία. Για να μειωθεί το κόστος και να επιταχυνθεί η προκατεργασία του δείγματος, ανέπτυξαν μια νέα τεχνική εκχύλισης διασποράς (dspe), η οποία απομακρύνει αποτελεσματικά τα σάκχαρα, λιπίδια, οργανικά οξέα, στερόλες, πρωτεΐνες και χρωστικές ουσίες, αλλά είναι πολύ απλούστερη και λιγότερο δαπανηρή από τις συμβατικές μεθόδους. Χρησιμοποιώντας τα υλικά QuEChERS, τα δείγματα είναι έτοιμα σε 3 απλά βήματα. Αρχικά το δείγμα ομογενοποιείται με το προσροφητικό υλικό. Στη συνέχεια, με την κατάλληλη προσθήκη οργανικών διαλυτών και αλάτων, εκχυλίζονται τα συστατικά και τελικά με φυγοκέντρηση απομακρύνονται οι παρεμποδίσεις και το καθαρό υπερκείμενο συλλέγεται και είναι έτοιμο για απ ευθείας εισαγωγή στον χρωματογράφο. Με τη χρήση της τεχνικής εκχύλισης με διασπορά του 49