ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (ΑΠΟΔΟΣΗΣ) (HPLC) ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (ΑΠΟΔΟΣΗΣ) (HPLC) ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό επεξηγούνται οι βασικές αρχές ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού και παρουσιάζονται οι κυριότερες έννοιες και η ορολογία με τις οποίες περιγράφεται μια χρωματογραφική ανάλυση. Μεταξύ των χρωματογραφικών τεχνικών που περιγράφονται δίνεται έμφαση στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης και στη Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας, που εφαρμόζονται περισσότερο στην κλινική ανάλυση. Η περιγραφή επικεντρώνεται στη συνέχεια στην περισσότερο χρησιμοποιούμενη υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης βασιζόμενη στη χρωματογραφία προσρόφησης, στην εφαρμογή αυτής στον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό και στη μεθοδολογία ανάπτυξης πρωτοκόλλου χρωματογραφικού διαχωρισμού. Προβάλλονται οι κύριες εφαρμογές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης στην κλινική ανάλυση και παρουσιάζεται αναλυτικά το παράδειγμα προσδιορισμού της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Το κεφάλαιο ολοκληρώνεται με πειραματικό παράδειγμα προσδιορισμού φαρμακευτικής ουσίας στον ορό. Προαπαιτούμενες γνώσεις Δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο προαπαιτούμενο κεφάλαιο σε αυτό το βιβλίο. Ως προαπαιτούμενες γνώσεις όμως, μπορούν να θεωρηθούν οι έννοιες της πολικότητας των μορίων, των χαρακτηριστικών ομάδων των οργανικών μορίων και της διαλυτότητας αυτών. 8.1 Εισαγωγή Ο όρος χρωματογραφία (chromatography) περιλαμβάνει πλήθος αναλυτικών τεχνικών που εφαρμόζονται κοινώς στον διαχωρισμό των συστατικών μιγμάτων ουσιών. Οι χρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού εφαρμόζονται ευρύτατα για τη διαπίστωση της παρουσίας ή μη συστατικών σε μίγματα τα οποία περιέχουν ένα περιορισμένο αριθμό άλλων ουσιών/προσμίξεων, γνωστής, ως επί το πλείστον, ταυτότητας. Η επιβεβαίωση της ταυτότητας των συστατικών του μίγματος προαπαιτεί τον χρωματογραφικό διαχωρισμό αυτών με σκοπό την απομόνωσή τους. Ακολουθεί ανάλυση των απομονούμενων συστατικών με χημικές ή φασματοσκοπικές τεχνικές. Πέραν των εφαρμογών της στην κλινική ανάλυση, η χρωματογραφία χρησιμοποιείται ευρύτατα στη φαρμακευτική ανάλυση, την ανάλυση τροφίμων και περιβαλλοντικών δειγμάτων, στη βιοχημική έρευνα, όπως και στην καθημερινή πρακτική ενός συνθετικού χημικού εργαστηρίου και αλλού. Σε συνδυασμό με επακόλουθη συζευγμένη τεχνική ανίχνευσης (tandem chromatography), κυρίως με φασματοσκοπικές τεχνικές όπως UV/Vis, MS ή IR, η χρωματογραφία αποτελεί το αναγκαίο προκαταρκτικό στάδιο όχι μόνο για τον ποιοτικό χαραχτηρισμό, αλλά και τον ποσοτικό προσδιορισμό των διαχωριζόμενων ουσιών μεταβολιτών φαρμάκων κ.α. Τέλος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως μέθοδος απομόνωσης των συστατικών ενός μίγματος στην φυτοχημεία, χημεία φυσικών προϊόντων κ.α. (προπαρασκευαστική χρωματογραφία, preparatory chromatography). Κάθε χρωματογραφική τεχνική περιλαμβάνει μία κινητή φάση (mobile phase), η οποία ρέει μεταφέροντας τις διαχωριζόμενες ουσίες συστατικά ενός μίγματος- μέσω μίας στατικής φάσης (static phase). Η κινητή φάση αποτελείται από ένα διαλύτη ή σύστημα διαλυτών, ενώ η στατική φάση από πορώδες στερεό υλικό ή από υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα. Ο διαχωρισμός των συστατικών στη χρωματογραφία βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό αλληλεπίδρασης του κάθε συστατικού με τις δύο φάσεις, ο οποίος καθορίζεται από την αγχιστεία (φυσικοχημική συγγένεια) του συστατικού με την κάθε φάση). Κάθε μόριο μίας ουσίας κατά 1

2 τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης μετακινείται πάρα πολλές φορές μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης (όπου προσροφάται ή κατανέμεται ή δεσμεύεται λόγω αγχιστείας κ.τ.λ.) και αντίστροφα (Σχήμα 8.1). Σχήμα 8.1 Αρχή διαχωρισμού συστατικών μίγματος με την τεχνική της χρωματογραφίας. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται βάσει της διαφορετικής αγχιστείας των συστατικών με την κινητή και στατική φάση. Αναπαρίσταται η πορεία μορίων δύο διαφορετικών ουσιών διαμέσου μίας στήλης. Το μπλε μόριο κατανέμεται πιο σημαντικά στην κινητή φάση και συνεπώς παρασύρεται από αυτήν ταχύτερα, διότι δεν αλληλεπιδρά ισχυρά με τη στατική φάση. Αντίθετα το κίτρινο μόριο αλληλεπιδρά ισχυρότερα με τη στατική φάση, με αποτέλεσμα να επιβραδύνεται. Κατά συνέπεια το κίτρινο συστατικό θα κινείται βραδύτερα από το μπλε, με αποτέλεσμα τον διαχωρισμό τους. Η διαφορετική αυτή αγχιστεία οφείλεται στις διαφορές των συστατικών του μίγματος σε ορισμένα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους, όπως π.χ. διαφορές στο μέγεθος του μορίου, το φορτίο, την πτητικότητα και τη διαλυτότητα. Η αγχιστεία αυτή περιγράφεται από τον συντελεστή κατανομής Κ (partition coefficient) ο οποίος ορίζεται ως: Κ=Cs/C m (Εξίσωση 8.1) όπου: C: η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στη στατική φάση και C m η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στην κινητή φάση. Ο συντελεστής κατανομής εκφράζεται δηλαδή από το λόγο της συγκέντρωσης της ουσίας στη στατική φάση προς τη συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση. Η κατανομή αυτή καθορίζεται από τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της ουσίας, αλλά και από τη φύση της κινητής, όπως και της στατικής φάσης. Η παράμετρος Κ είναι μία χαρακτηριστική σταθερά για τη δεδομένη χημική ένωση και το ζεύγος στατικής/κινητής φάσης, σε μια δεδομένη θερμοκρασία. Έτσι, μία ουσία που αλληλεπιδρά ισχυρά με τη στατική φάση «επιβραδύνεται» σε σχέση με μία ουσία που κατανέμεται πιο σημαντικά στην κινητή φάση και «παρασύρεται ταχύτερα» από αυτή. Ως αποτέλεσμα, οι δύο ουσίες διαχωρίζονται. Πρέπει να τονισθεί ότι ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός είναι το αποτέλεσµα επαναλαµβανοµένων ισορροπιών των συστατικών µεταξύ των δύο φάσεων κατά τη µετακίνησή τους. Είναι προφανές, ότι προκειμένου να διαχωριστούν δύο ουσίες θα πρέπει να διαφέρουν οι συντελεστές κατανομής αυτών. Σύνοψη: Οι χρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού εφαρμόζονται στο διαχωρισμό συστατικών μιγμάτων που περιέχουν περιορισμένο αριθμό προσμίξεων γνωστής, ως επί το πλείστον, ταυτότητας. Η επιβεβαίωση της ταυτότητας των διαχωριζόμενων ουσιών απαιτεί επακόλουθη ανάλυση των απομονούμενων συστατικών με χημικές ή φασματοσκοπικές τεχνικές. Σύνοψη: Σε ένα χρωματογραφικό διαχωρισμό οι δύο φάσεις επιλέγονται έτσι, ώστε τα συστατικά του δείγματος να κατανέμονται μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης σε διαφορετικό βαθμό και συνεπώς να καθυστερούν περισσότερο ή λιγότερο και να διαχωρίζονται. 2

3 8.2 Διάκριση Χρωματογραφικών τεχνικών Οι χρωματογραφικές τεχνικές μπορούν να ομαδοποιηθούν, με διάφορα κριτήρια. Έτσι, με βάση το μέσο στο οποίο τοποθετείται η στατική φάση, μία βασική διάκριση γίνεται με κριτήριο τη χρωματογραφία στήλης και την επίπεδη χρωματογραφία, ενώ με βάση το είδος της κινητής και στατικής φάσης, διακρίνουμε την υγρή χρωματογραφία και την αέρια χρωματογραφία. Τέλος, ανάλογα με το μηχανισμό αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και την στατική φάση, οι χρωματογραφικές τεχνικές διακρίνονται σε χρωµατογραφία προσρόφησης, κατανοµής, ιονανταλλαγής, µοριακού αποκλεισµού και χηµικής συγγένειας Χρωματογραφία Στήλης Στη χρωματογραφία στήλης (column chromatography) η στατική φάση βρίσκεται ως πληρωτικό υλικό ακινητοποιημένη στο εσωτερικό στήλης κατασκευασµένης από αδρανές υλικό (π.χ. από ύαλο ή ανοξείδωτο χάλυβα). Η κινητή φάση διέρχεται υπό συνεχή ροή διαμέσου της στήλης. Η διέλευση της κινητής φάσης γίνεται είτε λόγω βαρύτητας, είτε υπό υψηλή πίεση, που επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλίας. Από τη στιγμή που θα εισαχθεί το δείγμα στην κορυφή της στήλης, τα επιμέρους συστατικά του δείγματος υφίστανται διαδοχικές κατανομές μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Το κλάσμα κάθε συστατικού, που βρίσκεται κάθε στιγμή στην κινητή φάση, μετακινείται υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. Για το κάθε μόριο κάθε στιγμή επέρχεται νέος καταμερισμός μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων κάθε συστατικού εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους στην στατική φάση, ως προς το χρόνο παραμονής τους στην κινητή φάση και είναι ανάλογη του συντελεστή κατανομής του συστατικού στις δύο φάσεις. Είναι ευνόητο ότι ο διαχωρισμός των επιμέρους συστατικών είναι εφικτός με την προϋπόθεση, ότι αυτά έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής. Κατά την πρόοδο της ανάλυσης, ο διαχωρισμός των συστατικών γίνεται αποτελεσματικότερος. Με την ολοκλήρωση της πορείας τους στη στήλη, τα συστατικά θα έχουν διαχωρισθεί, οπότε θα εξέλθουν σε διαφορετικούς χρόνους από τη στήλη. Ο διαχωρισμός ενός δείγματος στα επιμέρους συστατικά του υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης στη χρωματογραφία στήλης παρουσιάζεται υπό τη μορφή επίδειξης στο Animation 8.1. Animation 8.1 O διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος (εδώ σημειώνονται με κίτρινο και μπλε χρώμα) σε χρωματογραφία στήλης. Σύνοψη: Στη χρωματογραφία στήλης ορισμένη ποσότητα δείγματος ενίεται στην κινητή φάση στην αρχή της στήλης. Το δείγμα μετακινείται στη στήλη υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. Τα επιμέρους συστατικά του δείγματος, με 3

4 την προϋπόθεση, ότι έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής, μετακινούνται με διαφορετική μέση ταχύτητα μέσα στη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες Επίπεδη Χρωματογραφία Στην επίπεδη χρωματογραφία (planar chromatography) η στατική φάση εμφανίζεται ως επίπεδη επιφάνεια π.χ. τμήμα γυαλιού ή φύλλου αλουμινίου επικαλυμένο με προσροφητικό υλικό στην χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC, Thin Layer Chromatography), ή φύλλο κελουλόζης στην χρωματογραφία χάρτου (paper chromatography). Και στα δύο αυτά είδη χρωματογραφίας, η κινητή φάση κινείται διαμέσου της στατικής φάσης, λόγω τριχοειδών φαινομένων και βαρύτητας. Στην TLC, (Animation 8.2) η στατική φάση συνηθέστερα αποτελείται από μία λεπτή στοιβάδα πηκτής διοξείδιου του πυριτίου (silica gel) η οποία επικαλύπτει στερεό επίπεδο υλικό, όπως πλάκα γυαλιού ή φύλλο αλουμινίου. Το διάλυμα του υπό εξέταση δείγματος και οι κατάλληλοι μάρτυρες τοποθετούνται ως κηλίδες στη γραμμή εκκίνησης, κοντά στο κατώτερο άκρο της πλάκας. Η πλάκα στη συνέχεια τοποθετείται μετά σε θάλαμο ανάπτυξης, στον πυθμένα του οποίου βρίσκεται το σύστημα των διαλυτών της κινητής φάσης, ενώ ο υπερκείμενος χώρος είναι κορεσμένος σε ατμούς των διαλυτών. Με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων η πλάκα διαβρέχεται από την κινητή φάση, μέχρι το μέτωπο του διαλύτη να φθάσει λίγα εκατοστά πριν το άνω άκρο της. Επειδή η στατική φάση αποτελείται από πηκτή οξειδίου του πυριτίου διαθέτει επιφανειακές υδροξυλομάδες που της προσδίδουν πολικό χαρακτήρα. Κατά την ανάλυση η στοιβάδα οξειδίου του πυριτίου κορέννυται με νερό. Κατά συνέπεια αλληλεπιδρά ισχυρότερα με πολικές ενώσεις. Έτσι, οι ουσίες που περιέχονται στο υπό εξέταση δείγμα, μετακινούνται στην πλάκα με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με την πολικότητα τους, με τις λιγότερο πολικές ουσίες να κατανέμονται σημαντικότερα στην λιγότερο πολική κινητή φάση και να προπορεύονται. Με τον τρόπο αυτό τα συστατικά ενός μίγματος διαχωρίζονται και σχηματίζουν αυτόνομες κηλίδες επάνω στην πλάκα. Είναι προφανές ότι τα συστατικά του μίγματος θα έχουν διανύσει ίση απόσταση από τη γραμμή εκκίνησης με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Οι κηλίδες γίνονται διακριτές είτε στο υπεριώδες φως (Φωτογραφία 8.1), είτε μετά από ψεκασμό με ειδικά αντιδραστήρια (Φωτογραφία 8.2). Αυτά αντιδρώντας με την προς ανίχνευση ουσία δίνουν χαρακτηριστικές αντιδράσεις, κατά τις οποίες παράγεται έγχρωμο προϊόν. Συχνά απαιτείται και θέρμανση της πλάκας για την επιτάχυνση της αντίδρασης ανίχνευσης. Εναλλακτικά, γίνεται εμβάπτιση της πλάκας σε διάλυμα που περιέχει τα κατάλληλα αντιδραστήρια ανίχνευσης. Η ταυτοποίηση των συστατικών ενός μίγματος βασίζεται λοιπόν στην απόσταση που έχουν διανύσει μάρτυρες, που αναπτύσσονται παράλληλα με το προς διαχωρισμό μίγμα, σε συνδυασμό με τις χαρακτηριστικές αντιδράσεις που δίνουν οι διαχωριζόμενες ουσίες. 4

5 Animation 8.2 Επιμέρους στάδια ανάπτυξης και συνακόλουθης ταυτοποίησης τριών άγνωστων δειγμάτων παράλληλα με δύο μάρτυρες με χρωματογραφία TLC. Φωτογραφία 8.1 Θάλαμος υπεριώδους (στην φωτογραφία αυτή από τον οίκο CAMAG) για την παρατήρηση των κηλίδων των δειγμάτων πάνω σε πλάκα TLC. Υπό το υπεριώδες φως οι ουσίες διακρίνονται ως έγχρωμες κηλίδες κατά την εξέταση της πλάκας. Φωτογραφία 8.2 Σύστημα ψεκασμού χρωστικής σε πλάκα TLC (στη φωτογραφία αυτή από τον οίκο Labfriend. Κατά τον ψεκασμό πραγματοποιείται χαρακτηριστική αντίδραση ανίχνευσης οπότε οι ουσίες διακρίνονται πλέον ως έγχρωμες κηλίδες. Σύνοψη: Στην TLC η στατική φάση συνηθέστερα αποτελείται από μία λεπτή στοιβάδα πηκτής διοξείδιου του πυριτίου (silica gel) η οποία επικαλύπτει στερεό επίπεδο υλικό. Η ανάπτυξη γίνεται κατακόρυφα, όπου με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων, η πλάκα διαβρέχεται από την κινητή φάση, H ταυτοποίηση των συστατικών ενός μίγματος γίνεται με βάση την ίση απόσταση που έχουν διανύσει μάρτυρες που αναπτύσσονται παράλληλα με το προς διαχωρισμό μίγμα, σε συνδυασμό με τις χαρακτηριστικές αντιδράσεις που δίνουν οι διαχωριζόμενες ουσίες Αέρια Χρωματογραφία Στην αέρια χρωματογραφία (Gas Chromatography ή GC) χρησιμοποιείται αέρια κινητή φάση και ως στατική φάση χρησιμοποιείται είτε στήλη με στερεό πληρωτικό υλικό, είτε τριχοειδής στήλη (capillary column). Συχνά υπάρχει λεπτή στοιβάδα υγρού υψηλού σημείου ζέσεως, ακινητοποιημένου στην επιφάνεια του αδρανούς στερεού υποστρώματος. Πάνω από αυτήν ρέει αδρανές αέριο (φέρον αέριο, carrier gas) το οποίο αποτελεί την κινητή φάση. Στην περίπτωση αυτή μιλάμε για χρωματογραφία αερίου-υγρού. Η αέρια χρωματογραφία έχει σχετικά περιορισμένη εφαρμογή, διότι είναι κατάλληλη για την ανάλυση μιγμάτων πτητικών μόνο ουσιών (όπως αρωμάτων). Επίσης εφαρμόζεται στην ανάλυση ουσιών που καθίστανται πτητικές - χωρίς όμως να διασπώνται - με σημαντική άνοδο της θερμοκρασίας (Σχήμα 8.2). Το δείγμα ενίεται στον εισαγωγέα, όπου εξατμίζεται ταχύτατα και εισάγεται σε χρωματογραφική στήλη (στατική φάση) καθώς παρασύρεται από το αδρανές φέρον αέριο (κινητή φάση). Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με κατανομή του αναλύτη μεταξύ της αέριας κινητής και της υγρής ή στερεής στατικής φάσης. O διαχωρισμός πραγματοποιείται σε υψηλές θερμοκρασίες και γι αυτό το λόγο η στήλη είναι εγκλεισμένη σε φούρνο. Συνέπεια των παραπάνω είναι ότι η εφαρμογή της GC περιορίζεται στο διαχωρισμό σχετικά μικρού μοριακού βάρους ουσιών (εφόσον η πτητικότητα μειώνεται στις μεγαλύτερου μοριακού βάρους ενώσεις). 5

6 Σχήμα 8.2 Σχηματική αναπαράσταση της βασικής διάταξης ενός αερίου χρωματογράφου (από την ιστοσελίδα του εμπορικού οίκου Agilent Υγρή Χρωματογραφία Στην υγρή χρωματογραφία (Liquid Chromatography ή LC) η κινητή φάση είναι υγρή, ενώ η στατική φάση μπορεί να είναι στερεή ή υγρή. Η LC βρίσκει ευρύτατη εφαρμογή, σε αντίθεση με την αέρια χρωματογραφία, με μοναδικό περιορισμό τη δυνατότητα διαλυτοποίησης των αναλυόμενων ουσιών στην κινητή φάση. Μη πτητικές και θερμοευαίσθητες ενώσεις διαχωρίζονται αποκλειστικά με υγρή χρωματογραφία. Παρακάτω, θα αναπτυχθεί εκτενώς η θεωρία και μεθοδολογία της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης Άλλες Χρωματογραφικές τεχνικές Aνάλογα με το μηχανισμό αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και την στατική φάση, οι χρωματογραφικές τεχνικές διακρίνονται σε χρωµατογραφία προσρόφησης, κατανοµής, ιονανταλλαγής, µοριακού αποκλεισµού και χηµικής συγγένειας. Στη χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησής τους στη στατική φάση. Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα ανάμεσα στον αναλύτη και τη στατική φάση οφείλονται κυρίως σε αλληλεπιδράσεις διπόλου-διπόλου, van der Waals και σε δεσμούς υδρογόνου (Σχήμα 8.3). 6

7 Σχήμα 8.3 Χρωματογραφία προσρόφησης: O κόκκινος αναλύτης προσροφάται ισχυρότερα στην στατική φάση σε σχέση με τον μπλε, οπότε καθυστερεί να εξέλθει. Η χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό μη ιοντικών πολικών ενώσεων. Στην επιφάνεια του αδρανούς στερεού υποστρώματος υπάρχει ακινητοποιημένη λεπτή στοιβάδα υγρού (υψηλού σημείου ζέσεως). Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μείγματος μεταξύ της υγρής κινητής και της υγρής στατικής φάσης (Σχήμα 8.4). Σχήμα 8.4 Χρωματογραφία κατανομής: O κόκκινος αναλύτης κατανέμεται ισχυρότερα στην στατική φάση σε σχέση με τον μπλε, οπότε καθυστερεί να εξέλθει. Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (size exclusion chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ενώσεων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από Da. Eφαρμόζεται συνεπώς στην ανάλυση και το χαρακτηρισμό των πολυμερών ενώσεων (συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών). Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το μέγεθος (και το σχήμα) των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων: ενώ τα μικρά μόρια καθυστερούν εισερχόμενα στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, τα μεγάλα μόρια δεν εισέρχονται στους πόρους της στατικής φάσης. Έτσι, τα τελευταία εξέρχονται πρώτα από τη στήλη (Σχήμα 8.5). 7

8 Σχήμα 8.5 Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού: ο κόκκινος αναλύτης εισχωρώντας στους πόρους της στατικής φάσης καθυστερεί να εξέλθει σε σχέση με τους υπόλοιπους. Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion exchange chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ιοντικών ενώσεων. Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης (Σχήμα 8.6). Σχήμα 8.6 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής: Ο αρνητικά φορτισμένος κόκκινος αναλύτης αλληλεπιδρά με ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με τις θετικά φορτισμένες ομάδες της στατικής φάσης, οπότε καθυστερεί να εξέλθει. Η χρωματογραφία χημικής συγγένειας (affinity chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό εναντιομερών ενώσεων. Οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι ακινητοποιημένοι στη στατική φάση (Σχήμα 8.7). 8

9 Σχήμα 8.7 Χρωματογραφία χημικής συγγένειας: Ο κόκκινος αναλύτης δεσμεύεται από τη στατική φάση στην οποία υπάρχει ακινητοποιημένος υποκαταστάτης με εκλεκτική συγγένεια για τον κόκκινο αναλύτη. Κατά συνέπεια, καθυστερεί να εξέλθει σε σχέση με τους υπόλοιπους Χρωματογραφία HPLC H χρωματογραφία HPLC (High Pressure Liquid Chromatography ή High Performance Liquid Chromatography Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης ή Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης) αποτελεί σημαντικά εξελιγμένη μορφή της χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή φάση πλέον δεν ρέει υπό την επίδραση της βαρύτητας, αλλά με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και επιτρέπει τη χρήση χρωματογραφικών στηλών με μικρό μέγεθος σωματιδίων υλικού πλήρωσης. Η χρήση μικρoύ μεγέθους σωματιδίων υλικού πλήρωσης αυξάνει το εμβαδόν της επιφάνειας της στατικής φάσης, που είναι διαθέσιμο να αλληλεπιδράσει με τα μόρια που μεταφέρονται μέσω της κινητής φάσης. Κατά συνέπεια, βελτιώνεται ο διαχωρισμός των αναλυόμενων μορίων και μειώνεται σημαντικά το μέγεθος της στήλης που απαιτείται για έναν διαχωρισμό. Στη συνέχεια θα επικεντρωθούμε στην εφαρμογή της HPLC στη χρωματογραφία προσρόφησης, που είναι και η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη. Ανάλογα με τη σχέση της πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης υψηλής πίεσης: HPLC κανονικής φάσης και HPLC αντίστροφης φάσης. Σύνοψη: H χρωματογραφία HPLC αποτελεί παραλλαγή της κλασικής χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή φάση ρέει με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και μειώνει πολύ σημαντικά το μέγεθος της στήλης που απαιτείται για έναν διαχωρισμό. Τα δείγματα που αναλύονται με HPLC βρίσκονται αποκλειστικά σε υγρή μορφή Η HPLC Κανονικής Φάσης Στην HPLC κανονικής φάσης ως πληρωτικό υλικό χρησιμοποιείται κάποιο πολικό υλικό, όπως οξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) ή οξείδιο του αργιλίου (Al 2 O 3 ). Η πολικότητα των υλικών αυτών οφείλεται στις υδροξυλομάδες που περιέχουν. Αντίθετα, η κινητή φάση είναι μειωμένης πολικότητας. Κοινώς χρησιμοποιούνται μη πολικοί διαλύτες, όπως εξάνιο ή χλωροφόρμιο, ενώ δεν περιέχεται στην κινητή φάση νερό. Έτσι, οι πολικές ενώσεις στο διαχωριζόμενο μίγμα αλληλεπιδρούν ισχυρότερα με την πολική στατική φάση, σε σύγκριση με τις άπολες ενώσεις (Σχήμα 8.8). Συνεπώς, οι λιγότερο πολικές ενώσεις διασχίζουν τη στήλη ταχύτερα και εκλούονται από αυτήν νωρίτερα. Η κατακράτηση ενός πολικού μορίου από τη στατική φάση οφείλεται στη προσρόφηση αυτού. Η έκλουση των πολικών μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται με την αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την πορεία της ανάλυσης. Με την αύξηση της πολικότητας της, περισσότερα μόρια διαλύτη αλληλεπιδρούν με τη στατική φάση ανταγωνιζόμενα τις προσροφημένες ουσίες για θέσεις πρόσδεσης. 9

10 Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική (με προγραμματισμένη μεταβολή της πολικότητας της κινητής φάσης) έκλουση των προσροφημένων πολικών μορίων. Η HPLC κανονικής φάσης χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό χημικών ενώσεων που δεν διαλύονται στο νερό ή που υδρολύονται (και συνεπώς δε συνιστάται η παραμονή τους σε υδατικό περιβάλλον). Επίσης, βρίσκει μεγάλη εφαρμογή στον διαχωρισμό ισομερών ουσιών. Στο Σχήμα 8.8 φαίνεται ο χρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC κανονικής φάσης, μίγματος αποτελούμενου από τριών τύπων μόρια, που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Εφόσον η στατική φάση είναι πολική, η κατακράτηση των κίτρινων μορίων θα είναι ισχυρότερη. Αντίθετα, η μπλε ουσία θα κατακρατείται λιγότερο ισχυρά από τη στατική φάση. Μέτριας ισχύος θα είναι η κατακράτηση των μορίων της κόκκινης ουσίας. Η μπλε ουσία επίσης θα συναγωνίζεται εντονότερα με τα μόρια της επίσης άπολης κινητής φάσης για θέσεις πρόσδεσης στη στατική φάση. Έτσι τα μόρια της μπλε ουσίας θα προπορεύονται στο διαχωρισμό. Προκειμένου να επιτευχθεί η έκλουση της κόκκινης και στη συνέχεια και της κίτρινης ουσίας σε εύλογο χρονικό διάστημα, αυξάνεται η πολικότητα της κινητής φάσης, αμέσως μετά την έκλουση της μπλε ουσίας. Ένας απλός κανόνας που ισχύει είναι: Σε οποιοδήποτε διαχωρισμό προπορεύονται τα μόρια ουσιών με πολικότητα αντίστοιχης της κινητής φάσης, ενώ καθυστερούν αυτά με πολικότητα αντίστοιχης της στατικής φάσης. Σχήμα 8.8 Xρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC κανονικής φάσης, μίγματος αποτελούμενου από τριών τύπων μόρια που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες, κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Σύνοψη: Στην HPLC κανονικής φάσης η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο του πυριτίου και είναι πολική, ενώ η κινητή φάση είναι μη πολική. Οι πολικές ενώσεις θα προσροφούνται ισχυρότερα στη στατική φάση και συνεπώς οι άπολες ενώσεις θα εκλούονται πρώτες από τη στήλη. Σύνοψη: Σε οποιοδήποτε διαχωρισμό προπορεύονται τα μόρια ουσιών με πολικότητα αντίστοιχης της κινητής φάσης, ενώ καθυστερούν αυτά με πολικότητα αντίστοιχης της στατικής φάσης. Στη χρωματογραφία ισχύει η αρχή «τα όμοια διαχωρίσουν τα όμοια», που εφαρμόζεται εδώ με την έννοια ότι πολικές στήλες απαιτούνται για το διαχωρισμό πολικών ενώσεων και το αντίστροφο Η HPLC Αντίστροφης Φάσης Το αντίστροφο της HPLC κανονικής φάσης, είναι η HPLC αντίστροφης φάσης (reversed phase HPLC ή RP- HPLC) (Σχήμα 8.9). Εδώ ο διαχωρισμός οφείλεται στην προσρόφηση υδρόφοβων μορίων σε υδρόφοβη στατική φάση, υπό την ροή κινητής φάσης αυξημένης πολικότητας. Η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες, όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο, οκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, 10

11 κυανομάδες κ.α., οι οποίες προσδίδουν στη στατική φάση ιδιαίτερα άπολο χαρακτήρα. Η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή με νερό. Η έκλουση των προσροφημένων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται με τη μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την αύξηση του περιεχόμενου σε αυτή ποσοστού του οργανικού διαλύτη. Η μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ελαττώνει την υδρόφοβη αλληλεπίδραση μεταξύ των προσροφημένων μορίων και της στατικής φάσης: είναι προφανές ότι όσο πιο άπολο είναι ένα διαχωριζόμενο μόριο, τόσο περισσότερο χρόνο θα αλληλεπιδράσει με την άπολη στατική φάση και τόσο υψηλότερη θα είναι η συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, που θα απαιτείται για να επιτευχθεί η αποδέσμευσή του. Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική έκλουση των άπολων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη (Σχήμα 8.9). Είναι προφανές ότι με αντιστροφή της πολικότητας της κινητής και της στατικής φάσης, αντιστρέφεται και η σειρά έκλουσης των τριών συστατικών του μίγματος (Σχήματα 8.8 και 8.9). Σχήμα 8.9 Xρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC αντίστροφης φάσης, μίγματος αποτελούμενου από μόρια τριών τύπων που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες, κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Όπως αναφέρθηκε, στη χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης, η επιφάνεια του προσροφητικού μέσου έχει τροποποιηθεί με την πρόσδεση μακριών αλυσίδων υδρόφοβων μορίων (Σχήμα 8.10). Πολύ κοινώς τέτοια μόρια είναι υδρογονάνθρακες τυπικά αποτελούμενοι από 4 ή 8 ή 18 άτομα άνθρακα - μετατρέποντας την στατική φάση σε άπολη. Οι στήλες με τα παραπάνω προσροφητικά μέσα ονομάζονται C4 ή C8 ή C18, αντίστοιχα. Περισσότερες εφαρμογές στο διαχωρισμό μικρών μορίων με RP-HPLC βρίσκουν οι στήλες C18. Σχήμα 8.10 Σχηματική αναπαράσταση της στατικής φάσης από την οποία αποτελείται μία στήλη RP-HPLC C18. 11

12 Μη πολικά μόρια στο διαχωριζόμενο δείγμα προσροφούνται ισχυρά στις αλυσίδες υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC και γενικότερα η περισσότερο κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού ουσιών για αναλυτικούς σκοπούς. Σύνοψη: Στη χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης, στην επιφάνεια του προσροφητικού υλικού βρίσκονται προσδεμένες μακριές αλυσίδες υδρογονάνθρακα. Η κινητή φάση είναι πολική. Μη πολικά μόρια στο διαχωριζόμενο δείγμα προσροφούνται ισχυρά στις αλυσίδες υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC. Περισσότερες εφαρμογές στο διαχωρισμό μικρών μορίων με RP-HPLC βρίσκουν οι στήλες C Οργανολογία HPLC Μία βασική εργαστηριακή διάταξη υγρής χρωματογραφίας περιλαμβάνει τα παρακάτω επιμέρους μέρη και φαίνεται στη Φωτογραφία 8.3 και στο Σχήμα 8.11: Περιέκτες διαλυτών: Οι διαλύτες που θα αποτελέσουν την κινητή φάση βρίσκονται αποθηκευμένοι σε ειδικές φιάλες. Η κινητή φάση είναι απαραίτητη για τη μεταφορά των δειγμάτων μέσα από το σύστημα της υγρής χρωματογραφίας. Απαερωτής κενού: Ο απαερωτής εξασφαλίζει την απαέρωση της κινητής φάσης, ώστε να είναι εφικτός ο έλεγχος της πίεσης στη χρωματογραφική στήλη. Αντλία (pump): Η αντλία εξασφαλίζει τη συνεχή άντληση και προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου του συνόλου του συστήματος, από τους περιέκτες των διαλυτών μέχρι το δοχείο συλλογής των αποβλήτων του συστήματος, υπό ρυθμιζόμενη υψηλή πίεση και ροή. Σύστημα εισαγωγής δείγματος (injection system/ injector valve): περιλαμβάνει βρόγχο σταθερού όγκου ή αυτόματο σύστημα εισαγωγής, μεταβλητού (προεπιλεγμένου) όγκου έγχυσης. Βρίσκεται πριν τη χρωματογραφική στήλη και επιτρέπει την εισαγωγή του δείγματος στη ροή της κινητής φάσης. Χρωματογραφική στήλη (column): στη στήλη επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός του μίγματος στα συστατικά του. Εφόσον ο διαχωρισμός καθορίζεται και από τη θερμοκρασία, η στήλη εμπεριέχεται σε θερμοστατούμενο κλίβανο (column oven). Ανιχνευτής (detector): Η ανίχνευση των ουσιών που εξέρχονται της στήλης γίνεται συνεχώς, κυρίως με φασματομετρία UV/Vis, όπου το παραγόμενο από τον ανιχνευτή φως προσπίπτει σε κυψελίδα συνεχούς ροής από χαλαζία και μετριέται η απορρόφηση του φωτός. Οι ανιχνευτές που κυρίως χρησιμοποιούνται στην HPLC είναι οι παρακάτω: ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους (UV/Vis Detector), ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων (Diode Array Detector, DAD), αγωγιμομετρικοί ανιχνευτές (Conductivity Detector), ανιχνευτές δείκτη διάθλασης (Refractive Index Detector) φασματογράφοι μάζας MS (Mass Spectroscopy Detector, MS Detector) ανιχνευτής Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Ανιχνευτής ΝΜR) (Nuclear Magnetic Resonance Detector, NMR Detector), ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές (Electrochemical Detector), φθορισμομετρικοί ανιχνευτές (Fluorescence Detector). 12

13 Oι ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους και οι ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων, που είναι και οι πιο συχνά απαντούμενοι, έχουν περιγραφεί στην Ενότητα 7.2. Επίσης, αρκετά συχνά χρησιμοποιούνται και φασματογράφοι μάζας. Καταγραφικό: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης στέλνεται στη συνέχεια σε κάποιον υπολογιστή που παράγει το χρωματογράφημα της ανάλυσης. Δεξαμενή αποβλήτων: Είναι η δεξαμενή όπου συλλέγεται η κινητή φάση μαζί με τα περιεχόμενα συστατικά του δείγματος. Όταν είναι επιθυμητή η συλλογή κλασμάτων της κινητής φάσης, (όπως στην προπαρασκευαστική HPLC), χρησιμοποιείται αυτόματος κλασματοσυλλέκτης (fraction collector). Φωτογραφία 8.3 Τυπική εργαστηριακή διάταξη χρωματογραφίας HPLC (του οίκου Dionex). Σχήμα 8.11 Διάγραμμα εργαστηριακής διάταξης υγρής χρωματογραφίας HPLC. Σύνοψη: Η διέλευση των εκλουόμενων ουσιών ανιχνεύεται με τη βοήθεια ανιχνευτή που βρίσκεται αμέσως μετά τη χρωματογραφική στήλη. Συνηθέστερα πρόκειται για ανιχνευτή UV/Vis, που σε μία κυψελίδα συνεχούς ροής, η ποσότητα του απορροφούμενου φωτός θα εξαρτάται από την ουσία που διέρχεται διαμέσου της ακτίνας της 13

14 προσπίπτουσας ακτινοβολίας κάθε στιγμή. Οι διαλύτες της κινητής φάσης δε θα πρέπει να απορροφούν στο μήκος κύματος, όπου παρακολουθείται η έκλουση της ουσίας που μας ενδιαφέρει. 8.4 Σύνοψη των βασικών σταδίων της Χρωματογραφίας Στήλης Τα βασικά στάδια που περιγράφηκαν για το διαχωρισμό και την ανίχνευση των συστατικών ενός μίγματος κατά την ανάλυση του με χρωματογραφία στήλης συνοψίζονται στα παρακάτω: 1. Kαθορισμένη ποσότητα δείγματος ενίεται στην κινητή φάση στην αρχή της στήλης. 2. Το δείγμα μετακινείται στη στήλη υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. 3. Τα επιμέρους συστατικά του δείγματος κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. 4. Το κλάσμα κάθε συστατικού που βρίσκεται στην κινητή φάση μετακινείται υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. 5. Για το κάθε μόριο την κάθε στιγμή επέρχεται νέος καταμερισμός μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. 6. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων κάθε συστατικού εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους στην κινητή φάση ως προς το χρόνο παραμονή τους στην στατική φάση και είναι ανάλογη του συντελεστή κατανομής του συστατικού στις δύο φάσεις. 7. Tα επιμέρους συστατικά, με την προϋπόθεση ότι έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής, μετακινούνται με διαφορετική μέση ταχύτητα μέσα στη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες. 8. Τα συστατικά εξέρχονται από τη στήλη και ανιχνεύονται από κατάλληλο ανιχνευτή που βρίσκεται στην έξοδο της στήλης Σύγκριση HPLC/TLC Στον Πίνακα 8.1 σημειώνονται τα κυριότερα συγκριτικά πλεονεκτήματα / μειονεκτήματα της TLC σε σχέση με την HPLC, των δύο χρωματογραφικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται περισσότερο στην κλινική ανάλυση. Κριτήριο TLC LC Κόστος εργαστηριακού εξοπλισμού Χαμηλό Υψηλό Κατανάλωση διαλύτη Χαμηλή Υψηλή Ευελιξία σε σχέση με ποικιλία αναλυόμενων ουσιών, συμβατότητα με ph και διαλύτες Μεγάλη Πιο περιορισμένη Δυνατότητα εφαρμογής των δειγμάτων χωρίς προηγούμενη κατεργασία Ναι Όχι Ικανότητα παράλληλης ανάλυσης περισσότερων δειγμάτων Ναι Όχι Δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού Ημιποσοτική Ποσοτική μέθοδος μέθοδος Ευαισθησία Κατά κανόνα χαμηλότερη Κατά κανόνα υψηλότερη Επαναληψιμότητα Χαμηλότερη Υψηλή Ταχύτητα ανάλυσης ανά δείγμα Χαμηλή Υψηλή Διαχωριστική ικανότητα Χαμηλή Υψηλή Πίνακας 8.1 Κυριότερα συγκριτικά πλεονεκτήματα / μειονεκτήματα της TLC σε σχέση με την HPLC. Με έντονο χρώμα είναι σημειωμένα τα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα μειονεκτήματα. Ο πίνακας αναφέρεται στη συζευγμένη με (φασματοσκοπικές κυρίως) μεθόδους ανίχνευσης HPLC. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι είναι σημαντικό να γνωρίζει ο κλινικός επιστήμονας και τις δύο αυτές κύριες χρωματογραφικές τεχνικές ανάλυσης. Η δε χρωματογραφία HPLC είναι η κατεξοχήν χρωματογραφική αναλυτική τεχνική, που χρησιμοποιείται σήμερα στην κλινική (κι όχι μόνο) έρευνα. 14

15 8.5 Βασικές έννοιες που περιγράφουν μία Xρωματογραφική ανάλυση Παρακάτω παρουσιάζονται σύντομα οι σημαντικότερες έννοιες, που περιγράφουν μία χρωματογραφική ανάλυση: Χρωματογράφημα Όπως ήδη αναπτύχθηκε, σε κάθε χρωματογραφικό διαχωρισμό μια διαχωριζόμενη ουσία κατανέμεται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης, κινούμενη ταυτόχρονα προς την έξοδο της στήλης (ή γενικότερα προς το άκρο της στατικής φάσης) υπό την ροή της κινητής φάσης. Ετσι, κατά τον διαχωρισμό δημιουργούνται μετακινούμενες ζώνες μέσα στη στήλη, οι οποίες τελικά ανιχνεύονται κατά τη δίοδο τους από τον ανιχνευτή και καταγράφονται ως διακριτές κορυφές. Η γραφική παράσταση του μετρούμενου από τον ανιχνευτή μεγέθους προς το χρόνο μετά την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη, καλείται χρωματογράφημα (chromatograph). Κάθε μόριο μίας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης μετακινείται «ανταλλασσόμενο» πάρα πολλές φορές μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης (όπου προσροφάται ή κατανέμεται ή δεσμεύεται λόγω αγχιστείας κ.λπ.) και αντίστροφα (Σχήμα 8.1). Μερικά μόρια της ίδιας ουσίας κινούνται με λίγο διαφορετική ταχύτητα, επειδή τυχαία περνούν στην κινητή φάση λίγο περισσότερο χρόνο από τον μέσο χρόνο παραμονής, αλλά και λόγω της πολλαπλότητας των διαδρομών, που μπορεί να ακολουθήσει ένα μόριο μέσα στη στήλη (Σχήμα 8.12). Ως αποτέλεσμα παρατηρείται μια συμμετρική διασπορά της κατανομής των μορίων γύρω από μια μέση τιμή, που αποδίδει τη μέση συμπεριφορά των μορίων της ουσίας. Η κατανομή αυτή προσεγγίζει μία κατανομή κατά Gauss δίνοντας το γνωστό κωδωνοειδές σχήμα των κορυφών σε ένα χρωματογράφημα (Σχήμα 8.13). Το εύρος της ζώνης αυξάνεται καθώς αυτή κινείται προς την έξοδο της στήλης, διότι παρέχεται περισσότερος χρόνος κατά τον οποίο λαμβάνουν χώρα περισσότερες μετακινήσεις μορίων μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Το εύρος της ζώνης λοιπόν είναι ανάλογο προς τον χρόνο παραμονής της ουσίας στη στήλη (Σχήμα 8.14) και αντιστρόφως ανάλογο προς την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης. Σχήμα 8.12 Σχηματική αναπαράσταση της πορείας δύο διαφορετικών μορίων της ίδιας ουσίας διαμέσου της χρωματογραφικής στήλης. Καθώς οι πορείες που ακολουθούν έχουν λίγο διαφορετικά μήκη, το ένα μόριο θα προπορεύεται ελαφρώς του άλλου, με αποτέλεσμα μία συμμετρική διασπορά της κατανομής των μορίων γύρω από μια μέση τιμή. 15

16 Σχήμα 8.13 Χρωματογράφημα (χρωματογράφημα) που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC). Η κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε διαφορετικό συστατικό του μίγματος. Σχήμα 8.14 Χρωματογραφικό προφίλ του ίδιου μίγματος ουσιών α, β, γ μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α) και αντίστροφης φάσης (Β). Η σχέση της πολικότητας των διαχωριζόμενων ουσιών είναι α>β>γ, ενώ κατά τον διαχωρισμό η κινητή φάση είναι χαμηλής πολικότητας για το Α και υψηλής πολικότητας για το Β. Παρατηρούμε ότι το εύρος της κορυφής είναι ανάλογο προς τον χρόνο παραμονής της κάθε ουσίας στη στήλη. Αυτό είναι περισσότερο διακριτό στο συγκεκριμένο χρωματογράφημα για τα συστατικά α και γ. Σύνοψη: Η γραφική παράσταση της απόκρισης του ανιχνευτή συναρτήσει του χρόνου μετά την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη καλείται χρωματογράφημα. Στο χρωματογράφημα η κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε διαφορετική ουσία. Το σύνολο των μορίων κάθε διαχωριζόμενης ουσίας εξέρχονται από τη χρωματογραφική στήλη σε μικρό εύρος χρόνων, δίνοντας διευρυμένες κωδωνοειδείς κορυφές με κατανομή κατά Gauss. Χρόνος κατακράτησης ή χρόνος ανάσχεσης, t R Ο χρόνος κατακράτησης (retention time) t R, είναι ο χρόνος που απαιτείται, ώστε μία συγκεκριμένη ουσία να «ταξιδέψει» διαμέσου της στήλης από την είσοδο αυτής μέχρι τον ανιχνευτή. Η εκκίνηση μέτρησης του χρόνου 16

17 κατακράτησης γίνεται την στιγμή που το δείγμα εισάγεται με ένεση στη στήλη. Το χρονικό διάστημα μετά την ένεση και μέχρι το μέγιστο της κορυφής έκλουσης μίας ουσίας ονομάζεται χρόνος κατακράτησης (Σχήμα 8.15). Ο χρόνος κατακράτησης αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά μιας ουσίας, υπό αυστηρά καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Έτσι, για μία συγκεκριμένη ουσία ο χρόνος κατακράτησης καθορίζεται από: - την πίεση που ασκείται στη στήλη (η οποία με τη σειρά της καθορίζει την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης), - την φύση της στατικής φάσης (υλικό πληρώσεως και μέγεθος σωματιδίων αυτού), - την ακριβή σύσταση της κινητής φάσης (διότι η σύσταση καθορίζει το συντελεστή κατανομής μεταξύ κινητής και στατικής φάσης), - τη θερμοκρασία της στήλης (καθότι ο συντελεστής κατανομής εξαρτάται από τη θερμοκρασία του διαχωρισμού). Σύνοψη: Σε μία χρωματογραφική ανάλυση οι παράμετροι ταχύτητα ροής κινητής φάσης, υλικό πληρώσεως και μέγεθος σωματιδίων στήλης, διαστάσεις στήλης, θερμοκρασία στήλης πρέπει να ορίζονται επακριβώς, προκειμένου μία χρωματογραφική ανάλυση να είναι επαναλήψιμη. Ο χρόνος παραµονής των µορίων του δείγµατος στην κινητή φάση είναι ο ίδιος για όλα τα συστατικά του δείγµατος και ονοµάζεται νεκρός χρόνος, t 0. Ο νεκρός χρόνος είναι ο χρόνος που απαιτείται για ένα µη κατακρατούµενο από τη στατική φάση συστατικό να διέλθει από τη στήλη, δηλαδή με άλλα λόγια είναι ο χρόνος κατακράτησης ενός συστατικού που δεν αλληλεπιδρά καθόλου με τη στατική φάση της στήλης. Προφανώς η ταχύτητα μετανάστευσης της μη κατακρατούμενης ουσίας είναι ίση προς τη μέση ταχύτητα των μορίων της κινητής φάσης. Σε ένα χρωματογράφημα, όπως αυτό του Σχήματος 8.15, ένα µη κατακρατούµενο από τη στατική φάση συστατικό αποτυπώνεται ως μία κορυφή, που εξέρχεται πολύ σύντομα μετά την ένεση του δείγματος. Είναι προφανές ότι ο καθαρός χρόνος παραμονής ενός συστατικού στη στατική φάση για ένα συστατικό που αλληλεπιδρά σε κάποιο βαθμό με αυτήν (ανηγµένος χρόνος κατακράτησης [t R ]) ισούται µε τη διαφορά του χρόνου κατακράτησης και του νεκρού χρόνου, δηλαδή: t R = t R -t 0 (Εξίσωση 8.2). Σύνοψη: Υπό καθορισμένες χρωματογραφικές συνθήκες ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά της ουσίας και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίησή της. 17

18 Σχήμα 8.15 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού φαρμάκου το οποίο περιέχει παρακεταμόλη (ακεταμινοφαίνη), καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη. Σημειώνονται η ταυτότητα της κάθε κορυφής και οι χρόνοι κατακράτησης της κάθε ουσίας-δραστικού συστατικού (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC. Σημειώνεται επίσης, ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης t 0. Συντελεστής κατακράτησης ή παράγοντας κατακράτησης ή παράγοντας χωρητικότητας Ο συντελεστής κατακράτησης k (retention factor ή capacity factor) επίσης, περιγράφει τη μετανάστευση των διαλυμένων ουσιών στη στήλη και αποτελεί ποσοτικό μέτρο της τάσης ενός συγκεκριμένου είδους μορίων να προσροφάται στη στατική φάση. Χρησιμοποιείται πολλές φορές αντί του χρόνου ανάσχεσης, διότι εξαρτάται λιγότερο από τις πειραματικές συνθήκες της ανάλυσης. Ο παράγοντας κατακράτησης ισούται µε τον λόγο του χρόνου που παραµένει η ουσία Α στη στατική φάση προς τον χρόνο που αυτή παραµένει στην κινητή φάση: k = t R = t R t o (Εξίσωση 8.3) t 0 t o Όπου t R ο χρόνος κατακράτησης της προσδιοριζόμενης ουσίας, t R ο ανηγμένος χρόνος κατακράτησης και t 0 είναι ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης. Στο Σχήμα 8.16 φαίνεται ο τρόπος υπολογισμού του παράγοντα κατακράτησης δύο ουσιών. 18

19 Σχήμα 8.16 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη. Σημειώνονται ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας η οποία αντιστοιχεί στις κορυφές 1 και 4 και ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης t 0 (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC). Ενδεικτικά, σημειώνεται επίσης, ο τρόπος υπολογισμού του παράγοντα κατακράτησης των ουσιών που αντιστοιχούν στις κορυφές 1 και 4. Κατά την ανάπτυξη χρωματογραφικών μεθόδων, στοχεύουμε να εξασφαλίσουμε παράγοντες κατακράτησης με τιμές μεταξύ 5 και 20 για καθένα από τα διαχωριζόμενα συστατικά. Τέτοιοι παράγοντες κατακράτησης εγγυώνται καλό διαχωρισμό κι όχι πολύ μεγάλους χρόνους ανάλυσης. Για τιµές k < 5, η έκλουση είναι αρκετά ταχεία και δεν επιτρέπει ακριβή προσδιορισµό του t R. Για τιµές k > 20, η ουσία κατακρατείται πολύ ισχυρά από τη στατική φάση, µε αποτέλεσµα πιθανότατα µη ικανοποιητικό διαχωρισµό και μεγάλους χρόνους ανάλυσης. Στο χρωματογράφημα του Σχήματος 8.16 ο παράγοντας κατακράτησης για την ταχύτερα εκλουόμενη κορυφή (Kορυφή 1) είναι 6,4 (> 5), ενώ για την κορυφή που εκλούεται βραδύτερα (Kορυφή 4) είναι 28,44 (> 20). Στην περίπτωση της κορυφής 4, εφόσον δεν υπάρχει στη στήλη άλλος αναλύτης, εξίσου ισχυρά κατακρατούμενος, ώστε να παρατηρείται αλληλεπικάλυψη κορυφών, ο μεγάλος παράγοντας κατακράτησης δεν εμποδίζει την ανάλυση. Ο μεγάλος όμως χρόνος ανάλυσης που απαιτείται είναι ανεπιθύμητος λόγω της καθυστέρησης της ανάλυσης, αλλά και της μεγαλύτερης κατανάλωσης διαλυτών (και συνεπώς της αύξησης του κόστους) που αυτός συνεπάγεται. Με βάση τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, ο παράγοντας κατακράτησης µπορεί να µεταβληθεί κυρίως µε µεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης, της θερµοκρασίας της στήλης και του συστήματος των διαλυτών. Έτσι, μεταβάλλοντας τις χρωματογραφικές συνθήκες στην περίπτωση της ανάλυσης του Σχήματος 8.16 θα μπορούσαμε να επιτύχουμε εξίσου ικανοποιητικό διαχωρισμό με μικρότερους όμως παράγοντες κατακράτησης, κυρίως για τους ισχυρά κατακρατούμενους αναλύτες, δηλ. με μεγαλύτερη οικονομία χρόνου και διαλυτών. 19

20 Εύρος κορυφής (peak width), W Κατά το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος μέσω μίας στήλης συμβαίνει αραίωση του δείγματος που ενέθηκε. Ως αποτέλεσμα, η ζώνη που περιέχει το καθένα από τα διαχωρισμένα συστατικά διευρύνεται διαρκώς κατά την εξέλιξη του διαχωρισμού. Έτσι η κάθε κορυφή που καταγράφεται από τον ανιχνευτή έχει ένα συγκεκριμένο εύρος, που καλείται εύρος κορυφής (peak width), W. Το εύρος της κορυφής υπολογίζεται γραφικά, όταν οι κορυφές αποδοθούν κατά προσέγγιση ως τρίγωνα. Ο τρόπος υπολογισμού του εύρους της κορυφής για τα συστατικά 3 και 4 του αναλγητικού που αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Σχημάτων 8.13, 8.15 και 8.16, φαίνεται στο Σχήμα Διαχωριστική ικανότητα στήλης (Resolution), Rs Η διαχωριστική ικανότητα (resolution), Rs, αποτελεί ποσοτικό μέτρο της ικανότητας μίας στήλης να διαχωρίσει δύο προσδιοριζόμενες ουσίες (που αναλύονται υπό ένα συγκεκριμένο πρωτόκολλο). Δύο ουσίες θεωρείται ότι διαχωρίζονται πλήρως, όταν το Rs είναι ίσο τουλάχιστον με 1,5. Υπολογίζεται από τη σχέση: R s = t R2 t R1 (Εξίσωση 8.4) 0,5 (W 2 +W 1 ) Όπου t R2 είναι ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας και t R1 ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας που εκλούεται αμέσως πριν στο χρωματογράφημα. W 2 και W 1 είναι το εύρος της αντίστοιχης κορυφής (προπορευόμενης και επακόλουθης) στη βάση της κορυφής. Σχήμα 8.17 Γραφικός υπολογισμός του εύρους των κορυφών σε χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP- HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC, και υπολογισμός της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης για τα συστατικά 3 και 4. 20

21 Στo Σχήμα 8.18 φαίνεται η μεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών (συστατικών) σε χρωματογράφημα μίγματος τους, με μεταβολή της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης κατά την αλλαγή των χρωματογραφικών συνθηκών. Σχήμα 8.18 Mεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών σε χρωματογράφημα μίγματός τους, με μεταβολή της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης από Rs=0,5 (Α) σε Rs=1,0 (Β) και Rs=1,5 (Γ), κατά την αλλαγή των χρωματογραφικών συνθηκών. Σε ένα διαχωρισμό όπου η διαχωριστική ικανότητα μεταξύ δύο αναλυτών είναι ίση με 1,0, υπάρχει 4% αλληλεπικάλυψη των κορυφών. Σε μικρότερες τιμές διαχωριστικής ικανότητας η αλληλεπικάλυψη είναι σημαντική, ενώ πρακτικά δύο κορυφές θεωρείται ότι διαχωρίζονται πλήρως όταν Rs 1,5. Βλέπουμε ότι στο χρωματογραφικό διαχωρισμό του Σχήματος 8.18, η διαχωριστική ικανότητα της στήλης είναι πολύ ικανοποιητική, όταν Rs 1,5. Σύνοψη: Η διαχωριστική ικανότητα Rs μιας στήλης αποτελεί ένα ποσοτικό μέτρο της ικανότητάς της να διαχωρίσει δύο αναλύτες. Πρακτικά ο διαχωρισμός δύο ουσιών θεωρείται πλήρης όταν Rs 1,5. Αριθμός θεωρητικών πλακών και ύψος θεωρητικής πλάκας Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών (plate number), N, και το ύψος της θεωρητικής πλάκας (plate height), H, είναι καθαρά θεωρητικά μεγέθη. Χρησιμοποιούνται προκειμένου να συγκριθεί η αποδοτικότητα χρωματογραφικών στηλών. Το μοντέλο των θεωρητικών πλακών κάνει την υπόθεση ότι μία χρωματογραφική στήλη αποτελείται από έναν μεγάλο αριθμό ξεχωριστών πλακών (μικρών τμημάτων στήλης). Η είναι το μήκος της στήλης που αντιστοιχεί σε μία θεωρητική πλάκα, το οποίο καλείται ύψος της θεωρητικής πλάκας. Ν είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών που υπάρχουν σε μία στήλη, όπως φαίνεται στο Σχήμα Όσο περισσότερο πακτωμένο είναι το πληρωτικό υλικό στη στήλη και όσο μικρότερη είναι η διάμετρος των σωματιδίων του, τόσο μικρότερο είναι το ύψος μίας θεωρητικής πλάκας. Κάθε μόριο μιας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης, μετακινείται όντας σε ισορροπία μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης της κάθε θεωρητικής πλάκας με την οποία αλληλεπιδρά. Είναι προφανές ότι όσο μικρότερη είναι η τιμή του μεγέθους Η, τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών Ν που εμπεριέχονται σε μία στήλη και συνεπώς τόσο αποτελεσματικότερος είναι ο διαχωρισμός. Είναι σημαντικό να έχει κανείς κατά νου ότι οι θεωρητικές πλάκες δεν υπάρχουν στην πραγματικότητα μέσα σε μία στήλη, απλώς βοηθούν στην κατανόηση των διεργασιών σε αυτή. Τα μεγέθη Ν και Η σχετίζονται επίσης με τη διεύρυνση των κορυφών (δηλαδή με το εύρος W) και συνδέονται με τις σχέσεις: H = L N = L 16 W 2 t R 2 (Εξίσωση 8.5) 21

22 N = L Η = 16 t R 2 W2 (Εξίσωση 8.6) όπου L το μήκος της στατικής φάσης και W το εύρος της κορυφής. Με βάση τις παραπάνω εξισώσεις, τα μεγέθη Ν και Η μπορούν να υπολογισθούν για το κάθε συστατικό από το χρωματογράφημα της ανάλυσης. Από τις παραπάνω σχέσεις διαπιστώνεται ότι όσο μεγαλύτερο είναι το ύψος μίας θεωρητικής πλάκας, τόσο πιο διευρυμένες εμφανίζονται οι κορυφές κατά το διαχωρισμό. Εφόσον η αποδοτικότητα μίας στήλης είναι ανάλογη του Ν και αντιστρόφως ανάλογη του Η, αλλά και η διεύρυνση των κορυφών είναι ανάλογη του Η, τότε, είναι επιθυμητή η χρήση στηλών με μικρό Η και μεγάλο Ν. Σχήμα 8.19 Σχηματική απόδοση της έννοιας των χρωματογραφικών θεωρητικών πλακών. Οι χρωματογραφικές στήλες έχουν διαφορετικό αριθμό θεωρητικών πλακών για διαφορετικούς αναλύτες σε ένα μείγμα. Τα μεγέθη Ν και Η είναι αυτά που κατεξοχήν αναφέρονται από τους οίκους χρωματογραφικού εξοπλισμού, ως μέτρα αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας μίας στήλης να διαχωρίζει συγκεκριμένη ομόλογη σειρά αναλυτών. Ως παράδειγμα, μια αναλυτική χρωματογραφική στήλη με Ν = πλάκες/ m προτιμάται σε σχέση με αυτή με N = πλάκες/m. Η πρώτη παράγει επίσης στενότερες κορυφές για το ίδιο συστατικό, υπό τις ακριβώς ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Θα πρέπει όμως να σημειωθεί ότι, εάν μία στήλη διαχωρίζει αποτελεσματικά μία συγκεκριμένη ομόλογη σειρά χημικών ενώσεων (π.χ. τα αμινοξέα), δεν σημαίνει ότι είναι εξίσου καλή στο διαχωρισμό άλλης ομόλογης σειράς χημικών ενώσεων, όπως π.χ. τις αλκοόλες. Σύνοψη: Μέτρο της αποδοτικότητας μίας στήλης αποτελούν τα θεωρητικά μεγέθη N και H. Η αποδοτικότητα μίας στήλης είναι ανάλογη του αριθμού των πλακών που θεωρητικά περιέχει η στήλη (Ν) και αντιστρόφως ανάλογη του θεωρητικού ύψους της κάθε πλάκας (Η). Επίσης, η διεύρυνση των χρωματογραφικών κορυφών είναι ανάλογη του θεωρητικού ύψους της κάθε πλάκας (Η). Οι χρωματογραφικές στήλες έχουν διαφορετικό αριθμό θεωρητικών πλακών για διαφορετικούς αναλύτες σε ένα μίγμα. 8.6 Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός με Χρωματογραφία HPLC Ποιοτικός προσδιορισμός Ο ποιοτικός προσδιορισμός έχει ως σκοπό να διερευνήσει και πιστοποιήσει την ταυτότητα μίας ουσίας που διαχωρίζεται με HPLC από τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος. Υπάρχουν δύο διακριτές περιπτώσεις: 22

23 1. Όταν είναι γνωστή η ταυτότητα του συστατικού του δείγματος που θέλουμε να διακρίνουμε, οπότε η κορυφή του συστατικού που μας ενδιαφέρει πρέπει να ταυτοποιηθεί. Στην περίπτωση αυτή η ταυτοποίηση γίνεται με βάση το χρόνο ανάσχεσης της κορυφής (ή καλύτερα τον συντελεστή κατακράτησης) που λαμβάνεται κατά την ανάλυση δείγματος και προτύπου της καθαρής ουσίας (Σχήμα 8.20). Είναι απαραίτητο, προκειμένου η αντιστοίχιση να είναι έγκυρη, η ανάλυση δείγματος και προτύπου να διεξαχθεί υπό τις ακριβώς ίδιες πειραματικές συνθήκες. Αυτό σημαίνει χρησιμοποιώντας την ίδια στήλη (σε ό, τι αφορά στα τεχνικά χαρακτηριστικά της, συμπεριλαμβανομένου και του πληρωτικού υλικού), ίδια σύσταση και ροή κινητής φάσης, καθώς και ίδια θερμοκρασία ανάλυσης. Επίσης, τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά των δύο κορυφών θα πρέπει να είναι όμοια, προκειμένου η αντιστοίχιση να είναι ασφαλής, και γι αυτό το λόγο το συστατικό ενδιαφέροντος στο πρότυπο και στο δείγμα θα πρέπει να βρίσκεται σε παρόμοια συγκέντρωση. Εάν το χρωματογραφικό σύστημα έχει έναν επιλεκτικό ανιχνευτή, όπως ανιχνευτή συστοιχίας διόδων ή ανιχνευτή φθορισμού, το λαμβανόμενο φάσμα της κορυφής ενδιαφέροντος ή το μετρούμενο σήμα επιβεβαιώνουν την ταυτοποίηση, σε συνδυασμό με τον συντελεστή κατακράτησης. Για μεγαλύτερη ασφάλεια στην αντιστοίχιση, ιδίως όταν το χρωματογραφικό σύστημα δεν συνδυάζεται με κάποιον επιλεκτικό ανιχνευτή, θα πρέπει το δείγμα και το πρότυπο να αναλυθούν σε μία παράλληλη ανάλυση υπό διαφορετικές χρωματογραφικές συνθήκες, σε σχέση με την πρώτη ανάλυση. Και στη δεύτερη ανάλυση ο χρόνος ανάσχεσης προτύπου και κορυφής ενδιαφέροντος θα πρέπει να συμπίπτουν απόλυτα. Τέλος, μια άλλη μεθοδολογία που εφαρμόζεται κοινώς για την ταυτοποίηση κορυφής, όταν είναι γνωστή η ταυτότητα του συστατικού που μας ενδιαφέρει, είναι ο εμβολιασμός του δείγματος με το γνωστό πρότυπο. Σ αυτή τη μεθοδολογία η απουσία εμφάνισης νέας κορυφής, και παράλληλα η ενίσχυση της υπάρχουσας κορυφής του συστατικού με διατήρηση της συμμετρίας της, επιβεβαιώνει την ταυτότητα της κορυφής. 2. Όταν δεν είναι γνωστή η ταυτότητα των συστατικών του δείγματος. Στην περίπτωση αυτή ενδείξεις για την ταυτότητα της κορυφής λαμβάνονται με σύζευξη του διαχωρισμού με HPLC με κάποιον ανιχνευτή που βοηθάει στην ταυτοποίηση, όπως ανιχνευτή NMR ή MS. Θα πρέπει να τονισθεί ότι επιβεβαίωση της ταυτότητας με τουλάχιστον δύο ή συνήθως περισσότερες χημικές τεχνικές είναι απαραίτητη. Σύνοψη: Ο ποιοτικός προσδιορισμός γνωστής ουσίας που διαχωρίζεται με HPLC γίνεται με βάση τον κοινό χρόνο ανάσχεσης και τη κοινή συμμετρία της κορυφής αυτής στο δείγμα και πρότυπο, που αναλύονται υπό τις ίδιες συνθήκες. Η ταυτοποίηση μπορεί να επιβεβαιωθεί με διατήρηση της σύμπτωσης των χρόνων ανάσχεσης και της συμμετρίας των κορυφών, είτε σε παράλληλη ανάλυση δείγματος και προτύπου υπό άλλες χρωματογραφικές συνθήκες, είτε υπό τον εμβολισμού του δείγματος με πρότυπο. Σχήμα 8.20 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση προτύπου καφεϊνης, σύμφωνα με τις χρωματογραφικές συνθήκες του Σχήματος Η ταυτοποίηση της κορυφής της καφεϊνης στο χρωματογράφημα του φαρμάκου του Σχήματος 8.16 γίνεται με βάση το χρόνο ανάσχεσης της κορυφής της καφεϊνης που λαμβάνεται κατά τις δύο αναλύσεις (t R = 6,19 min και 6,24 min για το μείγμα και το πρότυπο αντίστοιχα). 23

24 8.6.2 Ποσοτικός προσδιορισμός Αναφέρθηκε ήδη ότι ο χρόνος ανάσχεσης αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά μίας ουσίας, υπό αυστηρά καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Προκειμένου, λοιπόν, να ταυτοποιηθούν οι αναλύτες στους οποίους οφείλονται οι κορυφές ενός χρωματογραφήματος, είναι απαραίτητο να συγκριθεί το χρωματογράφημα που προκύπτει κατά την ανάλυση ενός δείγματος με αυτό που λαμβάνεται κατά την ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων, τα οποία περιέχουν γνωστούς αναλύτες. Είναι απαραίτητο να αναλυθεί το δείγμα και τα πρότυπα υπό τις ακριβείς ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Είναι επίσης σημαντικό να έχουμε μία γενική γνώση των αναμενόμενων αναλυτών στο δείγμα μας ήδη πριν την ανάλυση, προκειμένου να επιλεγούν τα κατάλληλα πρότυπα. Οι μετρήσεις σε μια οποιαδήποτε χρωματογραφική τεχνική ανάλυσης είναι σχετικές και απαιτούν τη βαθμονόμηση των χρωματογράφων με διαλύματα προτύπων παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα. Οι κυριότερες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση αναφέρθηκαν στο Kεφάλαιο 1. Είναι προφανές ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας, τόσο μεγαλύτερο θα είναι το εμβαδό της προκύπτουσας κορυφής (εφόσον περισσότερα μόρια της ουσίας θα ανιχνεύονται από τον ανιχνευτή). Μάλιστα η σχέση αυτή είναι ανάλογη. Η ποσοτικοποίηση, λοιπόν, σε μια χρωματογραφική ανάλυση γίνεται βάσει του εμβαδού της επιφάνειας της κορυφής, το οποίο είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση της ουσίας, μετά την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς. Τέτοιο παράδειγμα ποσοτικοποίησης περιλαμβάνεται στο πειραματικό μέρος (βλ. Ενότητα 8.9) που ακολουθεί. Στο Σχήμα 8.21 φαίνεται η υπέρθεση δύο χρωματογραφημάτων διαφορετικών συγκεντρώσεων μιας ουσίας. Και στις δύο περιπτώσεις η ουσία αναλύθηκε υπό τις ακριβώς όμοιες χρωματογραφικές συνθήκες. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής, το οποίο υπολογίζεται αυτόματα από το λογισμικό που υποστηρίζει το σύστημα της χρωματογραφίας, φαίνεται στο ένθετο. Εκεί, φαίνεται και η συγκέντρωση της ουσίας που έδωσε την κάθε κορυφή. Από τα δεδομένα του ένθετου είναι φανερό ότι το εμβαδόν αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη. Είναι επίσης λογικό και εμφανές από το γράφημα, ότι ο χρόνος έκλουσης δεν μεταβάλλεται με τη μεταβολή της συγκέντρωσης της ουσίας. Σημειώνεται ότι μονάδα μέτρησης του εμβαδού στην περίπτωση ανιχνευτή UV/Vis είναι η μονάδα mau min. Σχήμα 8.21 Υπέρθεση δύο χρωματογραφημάτων συγκεντρώσεων C A και C B μίας ουσίας. Και στις δύο περιπτώσεις η ουσία αναλύθηκε υπό τις ακριβώς όμοιες χρωματογραφικές συνθήκες. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής σημειώνεται στο ένθετο. Επίσης, ισχύει και η αναλογία του ύψους της κορυφής με την ποσότητα του αναλύτη. Θα πρέπει να γίνει κατανοητό ότι κατά την ποσοτικοποίηση δύο ουσιών που περιέχονται σε ένα μίγμα, είναι απαραίτητο να κατασκευαστεί καμπύλη αναφοράς για καθένα από τα συστατικά του μίγματος, χρησιμοποιώντας για κάθε καμπύλη αναφοράς την αντίστοιχη πρότυπη ουσία. Αυτό θα πρέπει να γίνει, διότι δεν 24

25 υπάρχει αναλογία μεταξύ του εμβαδού της κορυφής της μίας ουσίας και της συγκέντρωσης της δεύτερης ουσίας. Αυτό οφείλεται στο ότι η κάθε ουσία απορροφάει στο συγκεκριμένο μήκος κύματος στο UV/Vis (όπου ελέγχεται η απορρόφηση) έχοντας διαφορετικό συντελεστή μοριακής απόσβεσης. Έτσι, παρατηρώντας απλώς το χρωματογράφημα π.χ. του Σχήματος 8.13 δεν είναι δυνατόν να αποφανθούμε, εάν η ουσία 1 βρίσκεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση σε σχέση με την ουσία 2 και το αντίθετο. Προκειμένου να γίνει σύγκριση της συγκέντρωσης των δύο ουσιών θα πρέπει να κατασκευασθούν δύο καμπύλες αναφοράς, μία για την κάθε ουσία. Σύνοψη: Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης μιας αναλυόμενης ουσίας σε μία χρωματογραφική ανάλυση, γίνεται βάσει του εμβαδού της επιφάνειας της χρωματογραφικής κορυφής της ουσίας. Αυτό είναι ανάλογο της συγκέντρωσης της ουσίας. Ο ποσοτικός προσδιορισμός είναι δυνατός μετά την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς, χρησιμοποιώντας πρότυπα της ουσίας διαφορετικής συγκέντρωσης Οι προδιαγραφές μίας αναλυτικής Χρωματογραφικής στήλης HPLC Οι κύριες παράμετροι που χαρακτηρίζουν μία αναλυτική χρωματογραφική στήλη αναφέρονται παρακάτω. Οι βέλτιστες τιμές των παραμέτρων αυτών είναι διαφορετικές ανάλογα με την τάξη της ουσίας που μας ενδιαφέρει να προσδιορίσουμε. Ο κάθε εμπορικός οίκος προτείνει στήλες με συγκεκριμένες προδιαγραφές, ανάλογα με τις ανάγκες του αναλυτή. 1. Διαστάσεις της στήλης. Καθώς οι στήλες είναι σωληνοειδείς, οι διαστάσεις μιας στήλης δίνονται υπό την μορφή (εσωτερική διάμετρος στήλης x μήκος στήλης). Π.χ. στήλη (4,6 x 250 mm) σημαίνει στήλη εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm και μήκους καλυμένου με πληρωτικό υλικό, 250 mm. 2. Μέγεθος σωματιδίων υλικού και μέγεθος πόρων υλικού. Το πιο κοινό πληρωτικό υλικό είναι το οξείδιο του πυριτίου, συνήθως χημικά τροποποιημένο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Το μέγεθος σωματιδίων του οξειδίου του πυριτίου κυμαίνεται μεταξύ 3 και 50 µm. Το μικρότερο μέγεθος των σωματιδίων του πληρωτικού υλικού γενικά δίνει καλύτερους διαχωρισμούς. Το μέγεθος των πόρων (διάμετρος των πόρων) του πληρωτικού υλικού κυμαίνεται γενικά μεταξύ Å. Για το διαχωρισμό σχετικά μικρών μορίων περισσότερο κοινή είναι η διάμετρος πόρων 100 Å. 3. Είδος στατικής φάσης. Προδιαγραφές της στήλης που αναφέρονται είναι: - το διάστημα των τιμών ph, όπου η στήλη λειτουργεί αποτελεσματικά, χωρίς φθορά του πληρωτικού. υλικού. - η μέγιστη πίεση στην οποία μπορεί να υποβληθεί μια στήλη χωρίς αλλαγή στο ύψος της θεωρητικής πλάκας και τον αριθμό των θεωρητικών πλακών για έναν διαχωρισμό. Στην πειραματική άσκηση που περιγράφεται πιο κάτω η χρωματογραφική στήλη που θα χρησιμοποιηθεί είναι η Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex. Αυτό σημαίνει ότι πρόκειται για στήλη αντίστροφης φάσης C18, εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm, μήκους 150 mm με μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού 3 μm και με διάμετρο πόρων σωματιδίων πληρωτικού υλικού 120 Å. 8.7 Παραδείγματα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Προκειμένου να εντοπιστούν οι βέλτιστες συνθήκες ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού, ο αναλυτής καλείται να επιλέξει καταρχήν την περισσότερο κατάλληλη στατική φάση και κατόπιν την βέλτιστη κινητή φάση και το πρωτόκολλο διαχωρισμού. 25

26 8.7.1 Η επιλογή της Στατικής Φάσης Στην επιλογή της στατικής φάσης (συνεπώς της αναλυτικής στήλης) λαμβάνονται υπ όψη τα παρακάτω χαρακτηριστικά/προδιαγραφές της στήλης σε συνδυασμό με τη μοριακή δομή (δηλ. την ομόλογη σειρά, την πολικότητα, το μέγεθος μορίου κ.α.) της προσδιοριζόμενης ουσίας αλλά και των προσμίξεων που αναμένονται στο αναλυόμενο δείγμα: το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως, τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης, η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης, η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως, η σταθερότητα της στήλης στη μεταβολή του ph, η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους τόσο πιο πολική είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων. Όλοι οι εμπορικοί οίκοι χρωματογραφικών στηλών παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις παραπάνω προδιαγραφές της στήλης, αλλά και αναλυτικές μελέτες της απόδοσης της στήλης σε σχέση με τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του αναλυόμενου μορίου και των αναμενόμενων προσμίξεων. Ένας γενικός κανόνας που πρέπει να ακολουθείται από τον αναλυτή είναι ότι «η στατική φάση πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με την(ις) προσδιοριζόμενη(ες) ένωση(εις)». Στο Σχήμα 8.22 που ακολουθεί φαίνεται το διαφορετικό χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση του ίδιου μίγματος ουσιών, όταν χρησιμοποιούνται στήλες αντίστροφης φάσης C8 ή C18. Για τη συγκεκριμένη ανάλυση η χρήση της στήλης C18 προσφέρει καλύτερο διαχωρισμό των κορυφών 3 και 4. Σχήμα 8.22 Επίδραση του μήκους της αλυσίδας που είναι προσδεμένη στο προσροφητικό υλικό στηλών αντίστροφης φάσης στον διαχωρισμό μίγματος θειαμίνης (1), νικοτιναμίδιου (2), νικοτινικού οξέος (3), οροτικού οξέος (4), αμινοβενζοϊκού οξέος 26

27 (5). Στο ανώτερο χρωματογράφημα χρησιμοποιήθηκε στήλη C8, ενώ στο κατώτερο στήλη C18. Και στις δύο αναλύσεις οι στήλες είχαν τις ίδιες διαστάσεις, ίδιο μέγεθος σωματιδίων προσροφητικού υλικού και ίδιο μέγεθος πόρων. Επίσης, και στις δύo περιπτώσεις η ίδια κινητή φάση και ταχύτητα ροής χρησιμοποιήθηκαν (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου ARC Sciences Η επιλογή της Κινητής Φάσης Όπως αναφέρθηκε, η διαχωριστική ικανότητα Rs εξαρτάται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών Ν της στήλης και τον παράγοντα συγκράτησης k. Μετά την επιλογή της στατικής φάσης (συνεπώς και την επιλογή του αριθμού θεωρητικών πλακών Ν), επιλέγεται η κινητή φάση, έτσι ώστε ο παράγοντας k' να είναι μεταξύ 5 και 20. Η βελτιστοποίηση της παραμέτρου k επιτυγχάνεται κυρίως με αλλαγές στη σύσταση και ταχύτητα ροής της κινητής φάσης και δευτερευόντως με αλλαγές στη θερμοκρασία της ανάλυσης. Σε μία χρωματογραφική ανάλυση εφαρμόζονται κυρίως δύο διαφορετικές τεχνικές έκλουσης: η ισοκρατική έκλουση (isocratic elution) και η βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Στην ισοκρατική έκλουση η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση καθ όλη τη διάρκεια της ανάλυσης, ενώ στη βαθμιδωτή έκλουση η σύσταση της κινητής φάσης έχει προγραμματιστεί να μεταβάλλεται κατά την ανάλυση είτε γραμμικά (linear gradient), είτε σε διακριτά βήματα (step gradient). To Σχήμα 8.23 παρουσιάζει βασικά πρωτόκολλα βαθμιδωτής και ισοκρατικής έκλουσης και τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε κάθε περίπτωση κατά την ανάλυση του ίδιου μίγματος. Είναι φανερό ότι στη συγκεκριμένη ανάλυση η μεταβολή του πρωτοκόλλου έκλουσης από ισοκρατική σε βαθμιδωτή είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του εύρους των κορυφών, αλλά και τη σημαντική μείωση του χρόνου της ανάλυσης. Το τελευταίο έχει ιδιαίτερη σημασία, επειδή οι διαλύτες υψηλής καθαρότητας που απαιτούνται στην υγροχρωματογραφία είναι ιδιαίτερα υψηλού κόστους. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλογή του βέλτιστου πρωτόκολλου διαχωρισμού επιτυγχάνεται μόνο μετά από πολλαπλές διαδοχικές δοκιμές. Στις δοκιμές αυτές, κάθε προηγούμενο πρωτόκολλο δίνει τις κατευθυντήριες αρχές, για την επιλογή του επόμενου πρωτόκολλου. Έχοντας αλλάξει τις χρωματογραφικές συνθήκες, η βελτίωση του χρωματογραφικού διαχωρισμού διαπιστώνεται με υπολογισμό της μεταβολής της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης, σε ό, τι αφορά ένα κρίσιμο ζεύγος αναλυτών. Ως κρίσιμο ζεύγος αναλυτών χαρακτηρίζεται το ζεύγος αυτό για το οποίο καταγράφεται η χαμηλότερη διαχωριστική ικανότητα. Π.χ. για τον διαχωρισμό, που φαίνεται στο Σχήμα 8.23 και για το πρωτόκολλο Α, το κρίσιμο ζεύγος είναι το ζεύγος των αναλυτών 3-4, ενώ για το πρωτόκολλο Β, κρίσιμο ζεύγος είναι το ζεύγος των αναλυτών 8-9. Άλλες παράμετροι που εξετάζονται προκειμένου να διαπιστωθεί η καταλληλότητα ενός πρωτοκόλλου είναι ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης και κυρίως η επαναληψιμότητα της ανάλυσης, σε ό, τι αφορά στο εμβαδό/ύψος των κορυφών, καθώς και το εύρος της γραμμικής περιοχής της καμπύλης αναφοράς. 27

28 Σχήμα 8.23 Χρωματογραφήματα που λήφθηκαν κατά την ισοκρατική (Α) και βαθμιδωτή (Β) έκλουση μίγματος ουσιών 1-9 που αναλύθηκαν σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας. Τα αντίστοιχα πρωτόκολλα έκλουσης φαίνονται στα Α και Β. Η ισοκρατική ανάλυση και βαθμιδωτή ανάλυση έδωσαν συγκρίσιμη διαχωριστική ικανότητα κρίσιμου ζεύγους, αλλά η βαθμιδωτή έκλουση υπερτερεί στη συγκεκριμένη ανάλυση στο ότι απαιτείται πολύ μικρότερος χρόνος ανάλυσης και στο ότι δίνει κορυφές μικρότερου εύρους (Schellinger & Carr, 2006). Στο Σχήμα 8.24 φαίνεται το χρωματογραφικό προφίλ του μίγματος ουσιών α, β, γ των Σχημάτων 8.8 και 8.9, μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α) όπως στο Σχήμα 8.8 και αντίστροφης φάσης (Β), όπως στο Σχήμα 8.9. Η μεταβολή της πολικότητας της κινητής φάσης μειώνει τη διαχωριστική ικανότητα (σε Rs < 1,5), αλλά και το χρόνο της ανάλυσης. Προκειμένου να εντοπιστεί το βέλτιστο πρωτόκολλο διαχωρισμού θα πρέπει ο αναλυτής να πειραματισθεί με την πολικότητα της κινητής φάσης μεταβάλλοντας την διαδοχικά μεταξύ των δύο ακραίων τιμών του Σχήματος Οι βέλτιστες συνθήκες θα είναι αυτές που θα δώσουν Rs 1,5 σε συνδυασμό με τον ελάχιστο χρόνο ανάλυσης. 28

29 Σχήμα 8.24 Χρωματογραφικό προφίλ του ίδιου μίγματος ουσιών α, β, γ μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α και Α ) και αντίστροφης φάσης (Β και Β ). Η σχέση της πολικότητας των διαχωριζόμενων ουσιών είναι α>β>γ, ενώ κατά τον διαχωρισμό η κινητή φάση είναι χαμηλής πολικότητας για το Α και υψηλής πολικότητας για το Β. Μεταβάλλοντας την πολικότητα της κινητής φάσης σε μέση πολικότητα (στα Α και Β ) η διαχωριστική ικανότητα της στήλης μειώνεται. Ταυτόχρονα όμως μειώνεται και ο χρόνος της ανάλυσης Παράδειγμα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Σιμβαστατίνης σε ορό Στο παρακάτω παράδειγμα παρουσιάζεται η πορεία που ακολουθήθηκε προκειμένου να γίνει δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός σιμβαστατίνης (αντιλιπιδικός παράγοντας), που προστέθηκε εξωγενώς σε ορό. Ο προσδιορισμός της περιγράφεται στο πειραματικό μέρος (Ενότητα 8.9) που ακολουθεί. 1. Εφόσον η σιμβαστατίνη είναι ένα μόριο χαμηλής πολικότητας, επιλέχθηκε η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης για τον διαχωρισμό της. Αρχικά «έτρεξαν» πρότυπα διαλύματα σιμβαστατίνης σε διαφορετικές συνθήκες σύστασης κινητής φάσης και ταχύτητας ροής αυτής (Φωτογραφίες ). Τα πρότυπα αναλύθηκαν σε στήλη Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex. Φωτογραφία 8.4 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 70:30 και ταχύτητα ροής αυτής 0,7 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 12,62 min. 29

30 Φωτογραφία 8.5 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 80:20 και ταχύτητα ροής αυτής 0,7 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 8,68 min. Φωτογραφία 8.6 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 80:20 και ταχύτητα ροής αυτής 0,9 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 5,75 min. 30

31 Φωτογραφία 8.7 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 70:30 και ταχύτητα ροής αυτής 0,9 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 10,60 min. 2. Στη συνέχεια έτρεξε ορός ελεύθερος σιμβαστατίνης σε κάθε μία από τις πειραματικές συνθήκες που εφαρμόστηκαν, προκειμένου να διαπιστωθεί ποιες συνθήκες είναι οι καταλληλότερες, δηλαδή υπό ποιες συνθήκες οι ενδογενείς κορυφές του ορού δεν συνεκλούονται με την κορυφή της σιμβαστατίνης. 31

32 Φωτογραφία 8.8 Χρωματογραφικό προφίλ ορού χωρίς την προσθήκη εξωγενούς σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ευθεία δηλώνει τη θέση, όπου θα εκλούονταν η σιμβαστατίνη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 80:20, ταχύτητα ροής 0,9 ml/min), σύμφωνα με τα πρότυπα των προηγούμενων φωτογραφιών. 32

33 Φωτογραφία 8.9 Χρωματογραφικό προφίλ ορού χωρίς την προσθήκη εξωγενούς σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ευθεία δηλώνει τη θέση όπου θα εκλούονταν η σιμβαστατίνη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 70:30, ταχύτητα ροής 0,9 ml/min), σύμφωνα με τα πρότυπα των προηγούμενων φωτογραφιών. Φωτογραφία 8.10 Xρωματογράφημα ορού μετά την εξωγενή προσθήκη σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ένδειξη υποδεικνύει την κορυφή της σιμβαστατίνης. Η ανάλυση έγινε με κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 70:30 και ταχύτητα ροής 0,9 ml/min. 33

34 Στην Φωτογραφία 8.8 φαίνεται ότι υπάρχει μία ενδογενής κορυφή του ορού που εκλούεται στο χρόνο έκλουσης της σιμβαστατίνης. Κατά συνέπεια, δεν θα ήταν δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης υπό τις συνθήκες αυτές. Αντίθετα, όπως φαίνεται στο χρωματογράφημα της Φωτογραφίας 8.9 δεν υπάρχει ενδογενής κορυφή του ορού που να εκλούεται στο χρόνο έκλουσης της σιμβαστατίνης, οπότε γίνεται δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης, υπό τις συνθήκες του χρωματογραφήματος της Φωτογραφίας 8.9. Σύνοψη: Στην ανάπτυξη του βέλτιστου πρωτόκολλου διαχωρισμού ένας πρώτος κανόνας που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη είναι ότι «η στατική φάση πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με την προσδιοριζόμενη ένωση». Η επιλογή του πρωτόκολλου μεταβολής της κινητής φάσης γίνεται με πολλαπλές δοκιμές και με κριτήρια πρωτίστως το διαχωρισμό της κορυφής ενδιαφέροντος από προσμίξεις αλλά και το συνδυασμό μέγιστου εύρους γραμμικής περιοχής της καμπύλης αναφοράς, την επαναληψιμότητα του εμβαδού/ύψους των κορυφών και τον απαιτούμενο χρόνο της ανάλυσης. Σύνοψη: Σε μια χρωματογραφική ανάλυση οι παράμετροι ταχύτητα ροής κινητής φάσης, υλικό πληρώσεως και μέγεθος/διάμετρος πόρων σωματιδίων στήλης, διαστάσεις στήλης και θερμοκρασία στήλης πρέπει να ορίζονται επακριβώς προκειμένου η ανάλυση να είναι επαναλήψιμη. 8.8 Εφαρμογές της HPLC στην Κλινική Ανάλυση Τα πιο κοινά πεδία εφαρμογών της χρωματογραφίας HPLC στη κλινική ανάλυση αποτελούν: Η τοξικολογική ανάλυση. Η HPLC χρησιμοποιείται συχνά στην ιατροδικαστική και στην εγκληματολογική έρευνα και ιδιαίτερα στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων (επιπέδων) ουσίων ή μεταβολιτών τους, ναρκωτικών, δηλητηρίων και φαρμάκων σε τοξικές δόσεις, στα βιολογικά υγρά. Η θεραπευτική παρακολούθηση φαρμάκων (φαρμακοκινητικός έλεγχος). Ο προσδιορισμός των επιπέδων ενός φαρμάκου στον ορό έχει νόημα στην θεραπευτική παρακολούθηση της επίδρασης ή της συγκέντρωσης αυτού, με στόχο την προσαρμογή μιας μεμονωμένης δόσης του φαρμακευτικού προϊόντος. Η ανάλυση κλινικών αναλυτών με διαγνωστικό ενδιαφέρον, για τους οποίους οι φωτομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού παρουσιάζουν μικρή εκλεκτικότητα. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η περίπτωση της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης Προσδιορισμός των επιπέδων της Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης και άλλων Αιμοσφαιρινικών κλασμάτων με HPLC Ο ευρύτερα αποδεκτός δείκτης για την παρακολούθηση της νόσου του σακχαρώδη διαβήτη και την αξιολόγηση της μεσοπρόθεσμης αποτελεσματικότητας της εφαρμοζόμενης θεραπείας, αποτελούν τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης A 1c (HbA 1c ). Η HbA 1c αποτελεί το κυριότερο κλάσμα της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη είναι το ποσοστό της αιμοσφαιρίνης που έχει υποστεί γλυκοζυλίωση. Η παρουσία HbA 1c σε ποσοστό μεγαλύτερο του 6,5% της ολικής αιμοσφαιρίνης αποτελεί ένδειξη διαβήτη. Σύμφωνα με την Αμερικανική Διαβητολογική Εταιρεία (American Diabetes Association, ADA), η προδιαβητική κατάσταση χαρακτηρίζεται από την παρουσία HbA 1c μεταξύ 5,7-6,4%. Δεδομένου ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια (με μέση διάρκεια ζωής περί των ημερών) που περιέχουν την αιμοσφαιρίνη, συνεχώς ανανεώνονται, το ποσοστό γλυκοζυλίωσης της αιμοσφαιρίνης μεταβάλλεται κι αυτό, ανάλογα με τη γλυκόζη του αίματος. Καθώς η γλυκοζυλίωση της αιμοσφαιρίνης είναι μη αναστρέψιμη, η τιμή της HBA 1c ενσωματώνει τις διακυμάνσεις του σακχάρου του αίματος στο διάστημα των τελευταίων 2-3 μηνών και αντανακλά τη μέση τιμή του τελευταίου. Σήμερα, τα επίπεδα της HbA 1c θεωρούνται ως το πιο αξιόπιστο κριτήριο μεταβολικού ελέγχου. Έχει αποδειχθεί η συσχέτιση μεταξύ επιπέδων HbA 1c και μακροχρόνιου κινδύνου πιθανών επιπλοκών του σακχαρώδη διαβήτη, 34

35 όπως και του τακτικού ελέγχου των επιπέδων HbA 1c με την αποτελεσματικότητα του γλυκαιμικού ελέγχου των ασθενών (Delamater, 2006). Επιπλέον, ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιμέρους αιμοσφαιρινικών κλασμάτων έχει κλινικό ενδιαφέρον στη διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθείων, σε περιπτώσεις θαλασσαιμίας ή άλλων αναιμιών (Clarke & Higginsa, 2000). Παλαιότερα, η κλασική ηλεκτρόφορηση εφαρμόζονταν πολύ συχνά στην κλινική ανάλυση HbA 1c. Η τεχνική αυτή έχει πλέον αντικατασταθεί είτε από τη χρωματογραφία HPLC είτε από την τριχοειδική ηλεκτροφόρεση, είτε από ανοσομεθόδους. Τα πλεονεκτήματα της HPLC έναντι της κλασικής ηλεκτροφόρησης συνοψίζονται κυρίως στην μεγαλύτερη ταχύτητα ανάλυσης της πρώτης, τη δυνατότητα ανίχνευσης περισσότερων παθολογικών αιμοσφαιρινικών κλασμάτων και τον μεγαλύτερο αυτοματισμό της. Επίσης, η χρήση φωτομετρικών μεθόδων προσδιορισμού αιμοσφαιρίνης έχει πλέον εκλείψει στην κλινική βιοχημική ανάλυση. Η Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής (IFCC, 2002) ενέκρινε το 2002 δύο εναλλακτικές μέθοδους αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της HbA 1c στα πλαίσια του γλυκαιμικού ελέγχου. Και οι δύο μέθοδοι βασίζονται στην ενζυματική πρωτεόλυση της αιμοσφαιρίνης που οδηγεί στην αποκοπή ενός εξαπεπτιδίου από το άμινο-τελικό άκρο της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης. Τα γλυκοζυλιωμένα εξαπεπτίδια διαχωρίζονται στη συνέχεια από τα μη γλυκοζυλιωμένα εξαπεπτίδια με χρωματογραφία RP-HPLC. Στην πρώτη μεθοδολογία χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής φασματογράφος μάζας με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (HPLC-ESI/MS). Στη δεύτερη μεθοδολογία η RP-HPLC στήλη συνοδεύεται από ανιχνευτή UV και είναι συζευγμένη με σύστημα τριχοειδικής ηλεκτροφόρεσης, επίσης με ανιχνευτή UV (HPLC-CE). Οι υψηλές τεχνικές απαιτήσεις, σε συνδυασμό με το κόστος και τη μεγάλη διάρκεια των αναλύσεων με τις παραπάνω μεθόδους, απέτρεψε την ευρεία υιοθέτησή τους από τα κλινικά εργαστήρια ανά τον κόσμο. Σήμερα, τα κλινικά εργαστήρια παγκοσμίως που μετρούν τα επίπεδα HbA 1c στα πλαίσια γλυκαιμικού ελέγχου ασθενών, χρησιμοποιούν μεθόδους εγκεκριμένες κατά το NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program, Εθνικό Πρόγραμμα Προτυποποίησης Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης) των ΗΠΑ. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται είτε στη χρωματογραφία HPLC, είτε στην τριχοειδική ηλεκτροφόρηση, είτε σε ανοσομεθόδους. Οι εγκεκριμένες μέθοδοι HPLC χρησιμοποιούν κυρίως τη χρωματογραφία κατιοντικής ανταλλαγής. Πολύ συχνά χρησιμοποιούνται οι στήλες κατιοντικής ανταλλαγής PolyCAT A. Σε αυτές, η στατική φάση είναι οξείδιο του πυριτίου, όπου έχουν συζευχθεί αλυσίδες πολυασπαρτικού οξέος. Οι μέθοδοι αυτοί επιτρέπουν το διαχωρισμό της HbA 1c και τον εκλεκτικό ποσοτικό προσδιορισμό αυτής. Παράλληλα, είναι κατάλληλες για τον ποσοτικό προσδιορισμό των διαφόρων άλλων αιμοσφαιρινικών κλασμάτων, για τη διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών. Συνήθως τα σύγχρονα διαγνωστικά εργαστήρια διαθέτουν πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα HPLC, που χρησιμοποιούνται αποκλειστικά ως αναλυτές αιμοσφαιρινοπαθειών. Αυτά διαθέτουν ολοκληρωμένα συστήματα βαθμονόμησης και ποιοτικού ελέγχου, προκατεργασίας δείγματος με αιμόλυση ολικού αίματος και αυτόματο δειγματολήπτη. Τέτοια είναι τα συστήματα του οίκου Bio-Rad (California, USA). Οι αναλυτές αιμοσφαιρίνης της Biorad, Variant II (Turbo) και D-10 Hemoglobin Testing System ως παράδειγμα, διαθέτουν ενσωματωμένα προγράμματα ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού HbA 1c και θαλασσαιμίας (Wajcman, H., 2003). Πριν τη χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιείται από το αυτοποιημένο σύστημα αιμόλυση ολικού αίματος με χρήση αιμολυτικού αντιδραστηρίου. Το πρωτόκολλο HbA 1c χρησιμοποιεί στήλη κατιοντικής ανταλλαγής και η έκλουση επιτυγχάνεται με χρήση βαθμίδας ιοντικής ισχύος. Η ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός στηρίζονται σε διχρωματική ανάλυση στα 415 nm και 690 nm (βλ.ενότητα ). Στον υπολογισμό του εμβαδού της επιφάνειας της κορυφής που αντιστοιχεί στην HbA 1c εξαιρείται η συνδρομή της ασταθούς HbA 1c (labile HbA 1c ) και καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινών. Με το ενσωματωμένο πρόγραμμα θαλασσαιμίας επιτυγχάνεται ο καθορισμός μέσα σε λίγα λεπτά του ποσοστού των HbA 2 και HbF και η προκαταρκτική ανίχνευση άλλων κοινώς απαντούμενων, μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Το πρωτόκολλο χρησιμοποιεί στήλη κατιοντικής ανταλλαγής 3,0 0,46 cm και η έκλουση πραγματοποιείται στους 32 ± 1 C, με ταχύτητα ροής 2 ml/min, με χρήση βαθμίδας ph και ιοντικής ισχύος που επιτυγχάνεται με δύο φωσφορικά ρυθμιστικά διαλύματα (Wajcman, 2003). 35

36 8.9 Πειραματικό μέρος Προσδιορισμός συγκέντρωσης Σιμβαστατίνης σε ορό Αρχή της μεθόδου Η σιμβαστατίνη συνταγογραφείται για την μείωση των επιπέδων της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων στο αίμα. Πρόκειται για μια λακτόνη η οποία στον οργανισμό μετατρέπεται πολύ εκτενώς στο αντίστοιχο υδροξυοξύ, που αποτελεί και τη φαρμακολογικά ενεργή μορφή. Σε μοριακό επίπεδο δρα αναστέλλοντας το ένζυμο της αναγωγάσης του 3-υδροξυ-3-μεθυλογλουταρικού συνενζύμου Α. Ο φαρμακοκινητικός προσδιορισμός των επιπέδων ενός φαρμάκου στον ορό, παίζει σημαντικό ρόλο στην θεραπευτική παρακολούθηση της δράσης του φαρμάκου, με στόχο τον καθορισμό της ιδανικής δοσολογίας του συγκεκριμένου ασθενή. Στην περίπτωση της σιμβαστατίνης, λόγω της εκτενούς μετατροπής της στο υδροξυοξύ, τα επίπεδα του προφαρμάκου δεν ανιχνεύονται στον ορό, ενώ ανιχνεύονται τα επίπεδα της φαρμακολογικά ενεργής μορφής (υδροξυοξύ) (Bews et al., 2014). Για καθαρά διδακτικούς λόγους, στην άσκηση αυτή επιχειρείται ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης σε δείγμα ορού όπου αυτή έχει προστεθεί εξωγενώς. O χρόνος ανάσχεσης t R αποτελεί το κριτήριο ταυτοποίησης των ουσιών που αναλύονται χρωματογραφικά. Για σταθερές παραμέτρους ανάλυσης (υλικό πλήρωσης και διαστάσεις στήλης, ταχύτητα ροής κινητής φάσης, θερμοκρασία και σύσταση του συστήματος έκλουσης) ο χρόνος ανάσχεσης είναι σταθερός και χαρακτηρίζει την εκλουόμενη ουσία. Το εμβαδόν της χρωματογραφικής κορυφής της αναλυόμενης ουσίας ή το μέγιστο ύψος αυτής χρησιμοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της, διότι αυτά είναι ανάλογα της συγκέντρωσης της αναλυόμενης ουσίας. Τα δείγματα που αναλύονται με HPLC πρέπει να βρίσκονται αποκλειστικά σε υγρή μορφή. Συνήθης προκατεργασία αυτών αποτελούν η αραίωση και η διήθηση. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του αναλύτη στα δείγματα γίνεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που κατασκευάζεται ενίοντας πρότυπα διαλύματα της καθαρής ουσίας. Αν είναι δυνατόν, τα πρότυπα παρασκευάζονται στο ίδιο μητρικό υλικό με τα δείγματα. Στο συγκεκριμένο προσδιορισμό, προκειμένου να ληφθούν υπ όψη οι όποιες απώλειες σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και εκχύλιση αυτών με ακετονιτρίλιο, ακριβώς όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου Σκεύη αντιδραστήρια - όργανα 1. Φίλτρα σύριγγας Millipore (0,22 µm) 2. Σύριγγες ινσουλίνης 3. Μικροσύριγγα ακριβείας Hamilton 100 μl 4. Χρωματογραφική Στήλη Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex. 5. Ογκομετρικές φιάλες 6. Γυάλινοι δοκιμαστικοί σωλήνες 7. Ακετονιτρίλιο HPLC grade 8. Υπερκάθαρο νερό (HPLC grade) Πρότυπη ουσία: European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard Σιμβαστατίνης (CAS Number , ΜB = 418,57) από οίκο Sigma. Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (Ultimate 3000, Dionex), που περιλαμβάνει αντλία παλινδρόμησης τεσσάρων διαλυτών Ultimate 3000 Pump (Pump LPG-3400 A), θερμοστατούμενο χώρο Column Compartment (TCC-3100) και ανιχνευτή Συστοιχίας φωτοδιόδων UV-Vis (PDA 3000) από τον οίκο Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA. 36

37 Στήλη αντίστροφης φάσης Acclaim 120 C18 (Dionex), εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm, μήκους 150 mm με μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού 3 μm και με διάμετρο πόρων σωματιδίων πληρωτικού υλικού 120 Å. Σύνοψη: Τα σκεύη θα πρέπει να είναι πολύ καθαρά, γεγονός που εξασφαλίζεται με τον περιοδικό καθαρισμό τους με 2% w/v διχρωμικό κάλιο (όταν διαπιστωθεί ότι υπάρχουν προσμίξεις στα αναλυόμενα πρότυπα). Καθημερινά πλένονται με ακετονιτρίλιο ή υπερκαθαρό νερό, ανάλογα με το προηγούμενο περιεχόμενο τους. Οι διαλύτες της κινητής φάσης θα πρέπει να έχουν απαερωθεί (π.χ με συνεχή διοχέτευση αδρανούς αερίου, ή με διήθηση τους μέσα από ειδικές μεμβράνες, είτε με χρήση υπερήχων) και να είναι ελεύθεροι μικροβιακού φορτίου (π.χ. με τη διοχέτευσή τους μέσω φίλτρου με διάμετρο πόρων 0,22 μm). Συνήθως τα συστήματα HPLC διαθέτουν απαερωτές κενού, αμέσως μετά τους περιέκτες των διαλυτών, που απαερώνουν την κινητή φάση Παράμετροι της ανάλυσης Σύστημα έκλουσης: Ισοκρατική έκλουση με κινητή φάση 70% v/v ακετονιτρίλιο: 30 % v/v νερό Πίεση κινητής φάσης: psi Ταχύτητα ροής κινητής φάσης: 0,9 ml/min Θερμοκρασία έκλουσης: 25 C Χρόνος ανάλυσης: 15 min Ενέσιμη ποσότητα δείγματος: 20 μl (χρησιμοποιείται βρόγχος χωρητικότητας 20 μl στο σύστημα εισαγωγής δείγματος) Καταγραφή απορρόφησης: στα 237 nm επί 15 min Παρασκευή και έγχυση των πρότυπων διαλυμάτων Παρασκευάζουμε έξι πρότυπα διαλύματα σιμβαστατίνης συγκεντρώσεως 0 μμ, 1,25 μμ, 2,5 μμ, 5,0 μμ, 10 μμ και 12,5 μμ. Για τη διάλυση της σιμβαστατίνης χρησιμοποιείται υπερκάθαρο ακετονιτρίλιο (HPLC grade), που έχει υποβληθεί σε απαέρωση. Για την κάθε ανάλυση, εισάγουμε με έγχυση 20 μl κάθε προτύπου στη στήλη, εκτελώντας τουλάχιστον δύο επαναλήψεις ανά πρότυπο. Ξεκινο ύμε από το πρότυπο μικρότερης συγκέντρωσης και αναλύουμε διαδοχικά τα υπόλοιπα πρότυπα, κατά σειρά αυξανόμενης συγκέντρωσης. Μετρούμε την απορρόφηση στα 237 nm επί 15 min. Υπό το επιλεγμένο πρωτόκολλο ανάλυσης η κορυφή της σιμβαστατίνης εκλούεται στα 10,60 min. Σύνοψη: Απαιτείται μεγάλη προσοχή στην καθαριότητα της μικροσύριγγας Hamilton. Η σύριγγα εκπλένεται αρχικά επανειλημμένα με τον διαλύτη, στον οποίο βρίσκεται διαλυμένο το πρότυπο και στη συνέχεια με το πρότυπο διάλυμα ή το δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί. Πρέπει να αποφεύγονται οι φυσαλίδες κατά την εισαγωγή του δείγματος. Επίσης, ο βρόγχος ανάλυσης θα πρέπει να έχει πληρωθεί με όγκο μεγαλύτερο από το τριπλάσσιο της χωρητικότητας του βρόγχου με το πρότυπο ή δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί, προκειμένου ο περιεχόμενος σε αυτόν όγκος να είναι ο προδιαγραφόμενος. Ο όγκος του δείγματος που υπερβαίνει την χωρητικότητα του βρόγχου απορρίπτεται στη δεξαμενή αποβλήτων Προετοιμασία του άγνωστου δείγματος Σε 200 μl πλάσματος προσθέτουμε εξωγενώς σιμβαστατίνη (κατά βούληση σε τελική συγκέντρωση 1,25-10 μm) και στη συνέχεια 400 μl ακετονιτρίλιο. Αναδεύουμε στο vortex, αφήνουμε το διάλυμα σε ηρεμία στους 2 8 C επί 30 min και φυγοκεντρούμε στα x g επί 10 min. Το υπερκείμενο υγρό αναρροφάται με πλαστική σύριγγα και διοχετεύεται μέσω κατάλληλου φίλτρου σύριγγας (0,22 µm, Millipore) σε καθαρό δοκιμαστικό σωλήνα. Ακολουθεί η εισαγωγή 20 μl του «άγνωστου» δείγματος στη στήλη. Γίνονται δύο εγχύσεις (ενέσεις) από το κάθε άγνωστο. Μεταξύ του τελευταίου αναλυόμενου προτύπου και του πρώτου αναλυόμενου αγνώστου πρέπει να παρεμβληθεί ένεση καθαρού ακετονιτριλίου, προκειμένου να διαπιστωθεί ότι στη στήλη δεν παραμένουν υπολείμματα προτύπου. 37

38 Σύνοψη: Προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι όποιες απώλειες σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και η εκχύλιση αυτών να γίνεται με διπλάσιο όγκο ακετονιτριλίου, όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου Επεξεργασία αποτελεσμάτων Όπως αναφέρθηκε, κάνουμε δύο εγχύσεις από το κάθε πρότυπο διαλύματα και το δείγμα. Σημειώνουμε τους χρόνους ανάσχεσης (t R ), για κάθε επανάληψη και κάθε συγκέντρωση πρότυπης ουσίας. Ταυτοποιούμε την σιμβαστατίνη στον ορό συγκρίνοντας τον χρόνο ανάσχεσης της σιμβαστατίνης των προτύπων με τους χρόνους ανάσχεσης των χρωματογραφικών κορυφών στο χρωματογράφημα του ορού. Ολοκληρώνουμε τις αντίστοιχες κορυφές, σημειώνουμε το εμβαδόν τους (ή το μέγιστο ύψος), υπολογίζουμε τον μέσο όρο των εμβαδών (ή του μέγιστου ύψους) των χρωματογραφικών κορυφών των δύο επαναλήψεων για κάθε πρότυπο και δείγμα, και κατασκευάζουμε καμπύλη αναφοράς. Στον Πίνακα 8.2 σημειώνονται οι τιμές εμβαδού των χρωματογραφικών κορυφών της σιμβαστατίνης που λήφθηκαν κατά τη χρωματογραφική ανάλυση των προτύπων της σιμβαστατίνης, σύμφωνα με τις παραπάνω συνθήκες. [Σιμβαστατίνη] μμ Μέσο εμβαδόν κορυφής (mau min) 0 0,002 1,25 1,627 2,5 3, , ,164 12,5 17,846 Πίνακας 8.2 Μέσο εμβαδόν των κορυφών της σιμβαστατίνης κατά τη χρωματογραφική ανάλυση δύο επαναλήψεων των προτύπων. Από τις τιμές του πίνακα κατασκευάστηκε η παρακάτω καμπύλη αναφοράς (Σχήμα 8.25): 38

39 Σχήμα 8.25 Καμπύλη αναφοράς ποσοτικού προσδιορισμού σιμβαστατίνης. Σημειώνεται η εξίσωση της ευθείας (εξίσωση παλινδρόμησης) και o συντελεστής συσχέτισης R 2. Με βάση την καμπύλη αναφοράς, υπολογίζεται η συγκέντρωση σιμβαστατίνης του «άγνωστου» δείγματος ορού. Έτσι, εάν το δείγμα ορού έδωσε κορυφή σε χρόνο που ταυτίζεται με το t R της σιμβαστατίνης μέσου εμβαδού 2 mau min, αντικαθιστώντας όπου y = 2,0 λαμβάνουμε χ = 1,48 μμ. Επειδή όμως το δείγμα αραιώθηκε 1:3 κατά τη διαδικασία της εκχύλισης η συγκέντρωση της σιμβαστατίνης σε αυτό θα είναι 3 x 1,48 = 4,44 μμ. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι λόγω απωλειών σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, η υπολογιζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου είναι ψευδώς χαμηλότερη της πραγματικής. Προκειμένου να ληφθούν υπ όψη οι όποιες απώλειες, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και εκχύλιση αυτών με ακετονιτρίλιο, ακριβώς όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου. Σύνοψη: Στη χρωματογραφία HPLC ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του αναλύτη στα δείγματα γίνεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που κατασκευάζεται ενίοντας πρότυπα διαλύματα της καθαρής ουσίας. Τα πρότυπα παρασκευάζονται αν είναι δυνατόν στο ίδιο μητρικό υλικό με τα δείγματα. Προκειμένου μάλιστα να ληφθούν υπόψη οι όποιες απώλειες του αναλύτη κατά την προκατεργασία των δειγμάτων πριν την υγχροχρωματογραφική ανάλυσή τους, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων στη μήτρα και υποβολή αυτών στην προκατεργασία,να γίνεται ακριβώς, όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου Παράδειγμα προσδιορισμού HbA 1c με HPLC Άλλο εξελιγμένο αυτοματοποιημένο σύστημα γλυκαιμικού ελέγχου είναι το HPLC HA-8140 της εταιρίας Menarini Diagnostics (Florence, Italy) (John et al., 1997). Ο αναλυτής αιμοσφαιρίνης HA 8140 διαθέτει σύστημα αυτόματης τροφοδοσίας δειγμάτων και ανάγνωσης bar code. Το σύστημα παραλαμβάνει αυτόματα 3 μl ολικού αίματος από το φιαλίδιο που περιέχει το προς ανάλυση δείγμα και ακολουθεί η αιμόλυση του δείγματος με προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος τετραπυροφωσφορικού, ph 6,0. Το αιμολυμένο δείγμα διατηρείται για 2 min στους 48 C, προκειμένου να απομακρυνθεί η ασταθής HbA 1c (labile HbA 1c ). Στη συνέχεια το αιμόλυμα εισάγεται 39

40 με ένεση σε στήλη αντίστροφης φάσης κατιοντικής ανταλλαγής, όπου υπάρχει καθηλωμένο συμπολυμερές μεθακρυλικού οξέος και μεθακρυλικού εστέρα (Micronex A 1c -HSII στήλη, Sekisui Chemical Co.,Tokyo, Japan). Η στήλη θερμοστατείται στους 40 C. Η έκλουση πραγματοποιείται με ταχύτητα ροής 2 ml/min κι ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βαθμίδα ιοντικής ισχύος/ ph. Η ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός στηρίζονται σε διχρωματική ανάλυση στα 415 nm και 500 nm (βλ. Ενότητα ). O συνολικός χρόνος ανάλυσης είναι μόνο 4 min. Μειονέκτημα του αναλυτή αιμοσφαιρίνης HA 8140 είναι η παρεμβολή καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινικών κλασμάτων στην HbA 1c κορυφή (Meijs, 2008). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως εκατοστιαίο ποσοστό της ολικής αιμοσφαιρίνης. Στη Φωτογραφία 8.11 παρουσιάζεται το χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση αιμολύματος ασθενούς με το σύστημα HPLC HA-8140 και η ολοκλήρωση των λαμβανόμενων κορυφών. Εκεί φαίνεται ότι το κλάσμα ΗbΑ 1c αντιστοιχεί στις κορυφές P4 και P5. Η παρουσία μικρής κορυφής υπό τη μορφή «ώμου» (shoulder, κορυφή P4) στη βασική κορυφή της ΗbΑ 1c είναι κοινή σε πολλά πρωτόκολλα διαχωρισμού αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Το σχετικό εκατοστιαίο ποσοστό της HbA 1c (% HbA 1c ) δίνεται από το άθροισμα της σχετικής εκατοστιαίας περιεκτικότητας που αντιστοιχεί στις κορυφές 4 και 5. Το ποσοστό %ΗbΑ 1c στη συγκεκριμένη ανάλυση είναι 6,6 % και υποδεικνύει κακή ρύθμιση του διαβήτη. Το συνολικό ποσοστό της ολικής γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (% HbA 1 ) προέρχεται από το άθροισμα της σχετικής εκατοστιαίας περιεκτικότητας που αντιστοιχεί στις κορυφές P1 μέχρι και P5, ενώ στη μη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA 0 ) αντιστοιχεί η κορυφή P6. Το άθροισμα HbA 1 + HbA 0 δίνει την ολική αιμοσφαιρίνη. Φωτογραφία 8.11 Χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση αιμολύματος ασθενούς με το σύστημα HPLC HA Αναγράφεται και η ολοκλήρωση των λαμβανόμενων κορυφών. Ένα πιο σύγχρονο αυτοματοποιημένο σύστημα γλυκαιμικού ελέγχου του ίδιου εμπορικού οίκου (Menarini Diagnostics, Florence, Italy) είναι ο αναλυτής αιμοσφαιρίνης Hb Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός εδώ βασίζεται στη μέθοδο χημικής συγγένειας βορονικού οξέος. Η στήλη που χρησιμοποιείται έχει καθηλωμένα σε στερεό υπόστρωμα παράγωγα του βορονικού οξέος, με τα οποία δίνουν ενώσεις συναρμογής οι ομάδες 1,2-cis-διόλης της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Ομάδες 1,2-cis-διόλης δεν υπάρχουν στη μη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη. Έτσι όταν αιμόλυμα διέρχεται διαμέσου της στήλης, μόνο τα κλάσματα της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης αλληλεπιδρούν με αυτήν, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται. Η έκλουσή τους 40

41 επιτυγχάνεται στη συνέχεια με χρήση κατάλληλου αντιδραστηρίου έκλουσης που συναγωνίζεται τη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη για τις θέσεις πρόσδεσης. Η έκλουση του γλυκοζυλιωμένου κλάσματος ανιχνεύεται με φωτομέτρηση στα 413 nm. Η εφαρμοζόμενη μέθοδος αποτρέπει κάθε παρεμβολή στο αποτέλεσμα των κύριων παθολογικών αιμοσφαιρινών, της ασταθούς HbA 1c και καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινών και συνεπώς πλεονεκτεί σε σχέση με το αναλυτή HA

42 Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο Σύντομη παρουσίαση χρήσης αυτόματου αναλυτή HPLC για τον προσδιορισμό της σιμβαστατίνης, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Aρχή μεθόδου χρωματογραφίας στήλης: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου ΤLC (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Διαχωρισμός μίγματος φαινόλης (C 6 H 5 OH)/τολουολίου (C 6 H 5 CH 3 ) με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Η φαινόλη είναι πιο πολική από το τολουόλιο, λόγω της παρουσίας του υδροξυλίου στο μόριο της και αλληλεπδρά ισχυρότερα με την πολική στατική φάση. Κατά συνέπεια θα καθυστερεί σε σχέση με το μόριο του τολουολίου, το οποίο θα προπορεύεται: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου χρωματογραφίας χάρτου. Στην παρουσίαση αυτή, παρουσιάζεται προσομοίωση του διαχωρισμού μίγματος αποτελούμενου από μία μπλε και μία κίτρινη ουσία. Στην επίδειξη παρέχεται η δυνατότητα της προσομοίωσης του διαχωρισμού μεταβάλλοντας το βαθμό προσρόφησης των διαχωριζόμενων ουσιών στο χαρτί καθώς και τη διαλυτότητα αυτών στην κινητή φάση: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου χρωματογραφικού διαχωρισμού με HPLC αντίστροφης φάσης: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). 42