Αφρικανικός βάτραχος. Ψάρι ζέβρα

Transcript

1 Εθνικόν και Καποδιστριακόν Πανεπιστήµιον Αθηνών ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ Επικ. Καθ.ΒασιλικήΟικονοµίδου Νοέµβριος 2014

2 ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ-ΜΟΝΤΕΛΑ Κίνητρο για την µελέτη της ανάπτυξης ενός οργανισµού-µοντέλου είναι: a) H κατανόηση της διαδικασίας ανάπτυξης στο συγκεκριµένο ζώο b) Ηδυνατότηταναχρησιµοποιηθείοοργανισµόςαυτός, ως παράδειγµα για τον τρόπο που αναπτύσσονται οι ζωικοί οργανισµοί c) Απώτερος στόχος είναι να κατανοηθεί πώς αναπτύσσεται το ανθρώπινο σώµα

3 Οι 6 δηµοφιλέστεροι οργανισµοί- µοντέλα Είδος Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Xenopus laevis Κοινή ονοµασία Σκώληκας Μύγα φρούτων Αφρικανικός βάτραχος Φύλο, υποφύλο, οµοταξία Νηµατώδης Αρθρόποδο, µονοσκελές, έντοµο Χορδωτό, σπονδυλωτό, αµφίβιο Brachydanio rerio Gallus domestica Mus musculus Ψάρι ζέβρα Όρνιθα Ποντικός Χορδωτό, σπονδυλωτό, ψάρι Χορδωτό, σπονδυλωτό, πτηνό Χορδωτό, σπονδυλωτό, θηλαστικό

4 Αχινός...αλλοι οργανισµοί µοντέλα

5 ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΟ ΕΝΤΡΟ ΜΕ ΤΙΣ ΘΕΣΕΙΣ ΤΩΝ 6 ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ-ΜΟΝΤΕΛΩΝ

6 Οι 6 δηµοφιλέστεροι οργανισµοί- µοντέλα Πειραµατικά πλεονεκτήµατα(και µειονεκτήµατα) των έξι οργανισµών-µοντέλων. C. elegans Drosophila Ψάρι ζέβρα Xenopus Όρνιθα Ποντικός ιαθεσιµότητα Προσαρµογή Αριθµός εµβρύων υψηλός υψηλός υψηλός υψηλός χαµηλός χαµηλός Κόστος ανάπτυξης στο εργαστήριο χαµηλό µέτριο µέτριο µέτριο χαµηλό υψηλό Πρόσβαση επαρκής επαρκής επαρκής επαρκής επαρκής ανεπαρκής υνατότητα µικροχειρισµών περιορισµένη περιορισµένη αρκετά καλή καλή καλή περιορισµένη Γενετική καλή καλή αρκετά καλή καµία καµία καλή Κατάλογος γονιδίων... γνωστός γνωστός γνωστός γνωστός γνωστός γνωστός...µικρό κύκλο ζωής, εύκολη εκτροφή, διαφανή έµβρυα, µεγάλα ωοκύτταρα και έµβρυα, οµοιότητες µε τον άνθρωπο κλπ.

7 ιαθεσιµότητα των οργανισµών κατά τη διάρκεια του έτους Προσαρµοστικότητα των οργανισµών στις εργαστηριακές συνθήκες (π.χ. ύσκολη η αναπαραγωγή του αχινού σε εργαστηριακές συνθηκές) ιαθεσιµότητα αριθµού εµβρύων 4 οργανισµοί παρέχουν χιλιάδες αυγά της Όρνιθας αγοράζονται από εκκολαπτήρια 12 έµβρυα/διασταυρωση στον ποντικό Το κόστος σχετίζεται µε τη συντήρηση των οργανισµών στο εργαστήριο C. elegance: πιάτα µε άγαρ και βακτήρια D. melanogaster: δωµάτια µε κατάλληλες συνθήκες υγρασίας και θερµοκρασίας Β. rerio: εγκαταστάσειςενυδρείων X. laevis: ενυδρεία G. domestica: εκκολαπτήρια για τα αυγά (µονάδα εκτροφής για τις διασταυρώσεις) Μ. musculus: µονάδεςεκτροφής Πρόσβαση σε έµβρυα σε διάφορα στάδια ανάπτυξης υνατότητα µικροχειρισµών (αφαίρεση κυττάρων ή ιστών, ένεση ουσιών) D. melanogaster: µικρά αυγα µε σκληρό περιβληµα C. elegance: µικρά αυγα µε σκληρό περιβληµα (διαφανή) Μ. musculus: µικράέβρυα Β. rerio: αφαιρεση ή ένεση κυττάρων σε πρώιµα στάδια (διαφανή) X. laevis: µεγάλοµέγεθος G. domestica: µεγάλοµέγεθος Γενετική ύπαρξη κατάλληλης τεχνολογίας για διεξαγωγή γενετικών πειραµάτων στο εργαστήριο

8 ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΑ ΟΡΟΣΗΜΑ

9 ...αλλοι οργανισµοί µοντέλα Αχινός ( ) Μεγάλο βιολογικό κύκλο, δύσκολη εκτροφή, καµµια γενετική Μικρά έµβρυα (<100µm): δύσκολη µικροχειρουργική Προσφέρεται για µελέτες γονιµοποίησης

10 ?

11 Xenopus laevis Eύκολη ανάπτυξη και αναπαραγωγή (χορήγηση χοριακής γοναδοτροπίνης ή in vitro) στο εργαστήριο χωρίς µεγάλο κόστος εξοπλισµού-εγκατάστασης Μεγάλο αριθµό εµβρύων και ανθεκτικότητα των εµβρύων σε απλά θρεπτικά µέσα. (λόγω λεκιθικών κοκκίων και άλλων τροφικών αποθεµάτων) Εύκολοι πειραµατικοί µικροχειρισµοί λόγω µεγέθους (διάµετρος 1,4 mm) Κοντινής εξελικτικής σχέσης µε τον άνθρωπο

12 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ XENOPUS

13 Xenopus Xenopus xeno pus = παράξενοπόδι Αφρικανικό γένος µε 20 είδη Το πιο γνωστό : o Χenopus laevis Oργανισµός µοντέλο: -αναπτυξιακήβιολογία -κυτταρικήβιολογία -νευροβιολογία

14 Xenopus laevis (ονυχοφόροςβάτραχος) Webbed foot of Xenopus laevis Wild-type Xenopus laevis Lab bred Xenopus laevis

15 Xenopus laevis

16 Ανοικει στα Αµφίβια ΑΝΟΥΡΑ (Bufo bufo, Bufo viridis, Xenopus laevis, ) OΥΡΟ ΕΛΗ (Κερκωτά) (Salamandra salamandra, )

17 Λόγοι Επιλογής Αµφιβίων ως πειραµατόζωα: Στοιχεία Εµβρυολογίας Στοιχεία Φυσιολογίας Στοιχεία Οικολογίας *(Η γενετική τους δεν ειναι ιδιαίτερα µελετηµένη) ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Η γενετήσια λειτουργία επιτελείται µέσα στο νερό

18 Γονιµοποίηση Xenopus laevis To αρσενικό εισερχεται στο νερό και προσελκύει το θηλυκό κοάζοντας Ανεβαίνει στην πλάτη του θηλυκού Συγκρατείται µε το ανακλαστικό του εναγκαλισµού (amplexus) Παραµενει 2-3 µέρες µέχρι το θηλυκό να εναποθέσει ωάρια Το αρσενικό εκσπερµατώνει και γονιµοποιεί τα ωάρια µε επίβρεξη

19 Γονιµοποίηση Xenopus laevis

20 Γονιµοποίηση Οι ξενόποδες είναι γεννετικά ώριµοι στους 10 µήνες µ ένα χρόνο. Σ αυτό το διάστηµα ο διαχωρισµός του φύλου είναι εύκολος. Τα αρσενικά κοάζουν συχνά κατά τις βραδινές ώρες, είναι το ½ του µεγέθους των θηλυκών, σχετικά ισχνοί, κι αναπτύσσουν σκούρες βεντούζες ζευγαρώµατος στην κάτωπλευράτωνχεριώνσταµπροστινάάκρατους. Οι θηλυκοί είναι στρουµπουλοί, σχεδόν εντελώς άηχοι, και διαθέτουν µια προέκταση της αµάρας. Κυµαίνονται από 7,5 µε 15 εκατοστάαπ τορύγχοςέωςτηναµάρα. Το ζευγάρωµα µέσω οσφυικού εναγκαλισµού µπορει να λάβει χώρα οποιαδήποτε εποχή, αλλά είναι κοινότερο κατά την άνοιξη. Έως και 4 ζευγαρώµατα / έτος έχουν αναφερθείγιασυµβατάζευγάρια.

21 Ωοθήκη 24 λοβοί/ωοθήκη ιαφανείς σάκοι από συνδετικό ιστό και αιµοφόρα αγγεία 24 λοβοί Κάθε λοβός έχει εκατοντάδες ωοθυλάκια Κάθε ωοθυλάκιο αποτελείται απο ένα ωοκύτταρο σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης και πολλά ωοθυλακικά κύτταρα που το περιβάλλουν

22 Εσω και έξω θήκη Κάθε ωοθυλάκιο περιβάλλεται απο: Η ωογένεση διαρκεί µήνες

23 ιαδικασία Ωογέννεσης (διαρκεί πολλούς µήνες) Ωογόνια Μιτωτικήδιαίρεση ωογόνια stop -αυξάνουν σε µέγεθος -παρασκευάζουνκοκκίατουφλοιού, -καλύπτονται µε βιτελλινική µεµβράνη Πρωτογενή ωοκύτταρα 1 η µειωτικήδιαίρεση stop ΠρόφασηΙ Βιτελλογένεση: Συσσώρευση λεκίθου προςτηµεριάτου φυτικού πόλου

24 Χαρακτηριστικά ωοκυττάρου Πυρήνας (Βλαστικό Κυστίδιο): Μεγάλος ισθενή χρωµοσώµατα Ψηκτροειδή χρωµοσώµατα

25

26 Υλικά ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ -Πηγέςενέργειας:Λέκιθος -Οργανίδια που παράγουν ενέργεια: Μιτοχόνδρια -Μεταβολικά υποστρώµατα -Ριβοσώµατα -Ενζυµα (DNA, RNA πολυµεράσες) -trna, mrνα - οµικές πρωτείνες -Μορφογενετικοί ρυθµιστικοί παράγοντες

27 Πρωτογενή ωοκύτταρα Περιβάλλονται από µονοκυτταρικό στρώµα ωοθυλακικών κυττάρων Ωοθυλακικα κυτταρα Κυτταρόπλασµα Βιτελλινικη µεµβράνη πυρήνας Μεγαλώνουν σταδιακά συσσωρεύοντας λέκιθο προς την πλευρά του φυτικούπόλου, που συντίθεται στο ήπαρ της µητέρας και µεταφέρεται στα ωοκύτταρα µε το αίµα.

28 ...µέχριτηνπροφασηι Βιτελλογένεση Προβιτελλογενεση Πριν και κατά την συσσώρευση λεκίθου

29 Προβιτελλογένεση Σταδιακή αύξηση του µεγέθους των ωογονίων

30 Βιτελλογένεση ΑρχίζεικατάτηνπρόφασηΙτης 1 ης µειωτικήςδιαίρεσης, µετηνσυσσώρευσηλεκίθου που παράγεται στο ήπαρ της µητέρας, και µεταφέρεται στην ωοθήκη µέσω της κυκλοφορίας, διαπερνά τα επιθηλιακά κύτταρα και ενσωµατώνεται στα ωογόνια µε πινοκύττωση. Λέκιθος: Αποτελείται από διάφορα συστατικά µε κύριo την πρωτεϊνη βιτελλογενίνη (470kDa) Βιτελλογενίνη: Στο ώριµο ωοκύτταρο η βιτελλογενίνη διασπάται σε 2 πρωτεϊνες, τη φωσβιτίνη και λιποβιτελλίνη, οι οποίες πακεττάρονται µαζί στα λεκιθικά κυστίδια Λεκιθικό κυστίδιο 75% λεκίθου

31 ΣΤΑ ΙΑ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ ΩΟΚΥΤΤΑΡΟΥ (Ωογένεση) (οι θηλυκοί γεµέτες συσσωρεύουν υλικά για να διατηρήσουν τον µεταβολισµό και την ανάπτυξη, χτίζοντας ένα πολύπλοκο κυτταρόπλασµα) Κατά το προλεκιθικό στάδιο σχηµατίζεται µια ειδική κυτταροπλασµατικη περιοχή πλουσια σε µιτοχόνδια που λέγεται µιτοχονδριακό νέφος. Η περιοχή αυτή ειναι η πρόδροµη του γαµετικού πλάσµατος και η θέση της καθορίζει τον µελλοντικό φυτικό πόλο του ωαρίου Το ηµισφαίριο που έχει το βλαστικό κυστίδιο ειναι το ζωϊκό ηµισφαίριο Στα µέσα της ωογένεσης τα ηµισφαίριο αυτό αποκτά σκούρο χρώµα λόγω συσσώρευσης κοκκίων χρωστικής.

32 Ταυτόχρονα... - Παράγονται κοκκία του φλοιού από τη συσκευή Golgi, τα οποία διασπείρονται, αρχικά, τυχαία µέσα στο κυτταρόπλασµα, ενώ αργότερα µεταναστεύουν στην περιφέρεια του κυττάρου. -Τα µιτοχόνδρια πολλαπλασιάζονται σε αριθµό προκειµένου τα πολλαπλά αντιγραφα να κατανεµηθούν στα βλαστοµερίδια που θα παραχθούν κατά τη διαδικασία της εµβρυογένεσης.

33 ...τέλος βιτελλογένεσης ιαστρωµάτωση/πολικότητα Ωοκυττάρου κατά µήκος του άξονα ζωικού φυτικού πόλου Κοκκία χρωστικής ΖΩΙΚΟΣ ΠΟΛΟΣ µιτοχόνδρια Κοκκία του φλοιού Κοκκία λεκίθου λέκιθος ΦΥΤΙΚΟΣ ΠΟΛΟΣ

34 Αρχές άνοιξης (µεγαλύτερη ηµέρα) Υπόφυση Εκκρισηγοναδοτροπινών ωοθήκες Μέσω κυκλοφορίας αίµατος Παραγωγή προγεστερόνης (6 h µετά) Ωρίµανση Ωοκυττάρων ιέγερση -διάσπαση βλαστικού κυστιδίου -απόσυρση µικρολαχνών -συστολή χρωµοσωµάτων -µετακίνηση χρωµοσωµάτων προς το ζωικό πόλο Θυλακοκύτταρα Περάτωση 1 ης µειωτικής διαίρεσης Απελευθέρωση των ώριµων ωοκυττάρων από την ωοθήκη ευτερογενή ωοκύτταρα (δηµιουργία 1 ου πολικούσωµατίου)

35 ευτερογενές ωοκύτταρο + 1 ο πολικόσωµάτιο 1 st Polar body Περιβάλλονται από την κυτταρική µεµβράνη

36 ΠΟΛΙΚΟ ΣΩΜΑΤΙΟ Πεθαίνει (απόπτωση) ή Παραµένει (µε σηµαντική παρουσία στον κύκλο ζωής του οργανισµού)

37 ευτερογενή ωοκύτταρα +Πολικά σωµάτια Περιβάλλονται από την βιτελλινική µεµβράνη Βγαίνουν από την έσω θήκη και απελευθερώνονται στην σωµατική κοιλότητα

38 Η σωµατική κοιλότητα φέρει κροσσούς που προωθούν τα δευτερογενή ωοκύτταρα προς τους ωαγωγούς

39 ευτερογενή ωοκύτταρα ΩΑΓΩΓΟΣ 2 η µείωση stop µετάφαση ΙΙ Επιθηλικά κύτταρα του ωαγωγού εκκρίνουν το ζελατινώδες περίβληµα, το οποίο περιβάλλει τα ωοκύτταρα µε µια ή 2 στρώσεις. Η ζελατινώδης µάζα απορροφά µεγάλες ποσότητες νερού κατά την επαφή µε το νερό, διογκώνεται, παρέχοντας προστασία από µηχανικές πιέσεις και µεταβολές της Τ. Ωάριο Γονιµοποίηση Γονιµοποιηµένο αυγό ή ζυγώτης Αυξάνει τον όγκο του κατά φορες σε σχέση µε τα αρχέγονα κύτταρα

40 Πώς ενεργοποιεί η προγεστερόνη την ωρίµαση του ωοκυττάρου? Προγεστερόνη Προσδένεται στους υποδοχείς στεροειδών του ωοκυττάρου Ενεργοποιεί τη µετάφραση της πρωτεϊνης c-mos Ενεργοποιεί έναν καταράκτη φωσφορυλιώσεων που φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν την υποµονάδα p34 του MPF (παράγοντας προώθησης της ωρίµανσης) Ο ενεργοποιηµένος MPF επιτρέπει στο βλαστικό κυστίδιο να διασπαστεί και τα χρωµοσώµατα να διαιρεθούν Ο MPF προωθεί την ωρίµανση µέχρι την ΜΕΤΑΦΑΣΗ ΙΙ Μετατρέπει το σύµπλοκο του pre-mpf (pre - M Phase Factor) σε ΜPF (αποτελείται απο 2 υποµονάδες, την κυκλίνη B και την p34cdc2 που ειναι µια κυκλινο-εξαρτώµενη κινάση)

41 Πού οφείλεται η διακοπή της κυτταρικής διαίρεσης στη µετάφαση ΙΙ? Συντονισµένη δράση c-mos + κυκλινο-εξαρτώµενη κινάση 2 που είναι υποµονάδες του κυτταροστατικού παράγοντα CSF

42 Μετά την γονιµοποίηση... Ροήιόντων Ca ++ Ενεργοποιούν την καλµοδουλίνη Ενεργοποιεί 2 ένζυµα που απενεργοποιούν τον CSF - calmodulin-dependent protein kinase II - calpain II ( calcium-dependent protease) Ολοκλήρωση µείωσης ΙΙ

43 ηµιουργία πολικού σωµατίου Πρωτογενές ωοκύτταρο Παράγεται ευτερογενές ωοκύτταρο 1 ο πολικόσωµάτιο (Περάτωση µείωσης Ι) * (Περάτωση µείωσης ΙΙ) *Το 1 ο πολικό σωµάτιο άλλες φορές διαιρείται και άλλες όχι

44 ηµιουργία πολικού σωµατίου 1 η µειωτικήδιαίρεση + 2 η µειωτικήδιαίρεση Αναφαση Ι Μεταφαση ΙΙ

45 Ωογένεση 1 st polar body Primary oocyte arrested in diplotene of prophase I Completion of meiosis I entry into meiosis II Secondary oocyte arrested in metaphase II Completion of meiosis II 1 st polar body 2 nd polar body Activation or Fertilization Mature egg

46 ΣΥΝΟΨΙΖΟΝΤΑΣ...

47 ΙΑΦΟΡΕΣ ΣΤΗΝ ΩΟΓΕΝΕΣΗ XENOPUS - AΝΘΡΩΠΟΥ - X:παράγουνχιλιάδεςαυγά / φορά (4 φορές/ έτος) - A: παράγουν µόνο λίγα ωάρια κατά τη διάρκεια της ζωής τους - X: τα ωογόνια αυτοανανεώνονται και διατηρούνται καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του Οργανισµού - A: τα ωογόνια διαιρούνται σε συγκεκριµένο αριθµό ωογονίων (2 ο -7 ο µήνα κύησης), εκ των οποίων κάποια πεθαίνουν, και κάποια άλλα προχωρούν στην 1 η µειωτικήδιαιρεση (Πρωτογενήωοκύτταρα) καισταµατουνστηνπροφασηι µέχρι την εφηβία (12 έτη). - X: Τα πρωτογενή ωοκύτταρα προχωρούν στη 2 η µειωτική διαίρεση την άνοιξη/έτος - A: Οµάδες πρωτογενών ωοκυττάρων προχωρούν στη 2η µειωτική διαίρεση περιοδικά µετά την εφηβία (κάποια από τα πρωτογενή ωοκύτταρα παραµένουν στην προφαση Ι για 50 χρόνια), και από αυτά ωριµάζουν τελικά µόνο 400 κατάτηδιάρκειατηςζωής.

48 ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Ένα σπέρµα γονιµοποιεί ένα ωάριο Ζυγωτό ή γονιµοποιηµένο αυγό Xenopus laevis 1. Αυξάνεται το ενδοκυτταρικό ασβέστιο και καταστρέφεται ο κυτταροστατικός παράγοντας (CFK) και ολοκληρώνεται η µείωση II µε απελευθέρωση και του 2ου πολικού σωµατίου 2. Συντήκονται οι πυρήνες ωαρίου-σπερµατοζωαρίου 3. Εξωκυττάρωση των φλοιικών κοκκίων στην επιφάνεια του ωαρίου 4. Ανύψωση της βιτελλινικής µεµβράνης 4α. Περιστροφή της λεκίθου (15 ) 4β. Περιστροφή του φλοιού (60 ), του στρώµατος κάτω από την κυτταρική µεµβράνη 5. Εµβρυϊκήανάπτυξη -Αυλάκωση

49 Ένα σπέρµα γονιµοποιεί το ωάριο Ωάριο

50 2. Σύντηξη πυρήνων ωαρίου-σπερµατοζωαρίου

51

52 3. Εξωκυττάρωση των φλοιικών κοκκίων στην επιφάνεια του ωαρίου

53 4. Ανύψωση της βιτελλινικής µεµβράνης

54 4α. Περιστροφή της λεκίθου (15 ) Περιστροφή εξισορρόπησης ή γονιµοποίησης Η ροπή (λόγω βαρύτητας) στρέφει το αυγό ώστε ο φυτικός πόλος που έχει µεγαλύτερη πυκνότητα και βάρος να βρεθεί προς τα κάτω Φυτικός πόλος (ανοιχτόχρωµος) προς τα κάτω και ζωικός (σκουρόχρωµος) προς τα πάνω

55 2α. Περιστροφή της λεκίθου (15 ) Περιστροφή εξισορρόπησης ή γονιµοποίησης Προσφέρει ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ 1.Το σκούρο χρώµα απορροφά την θερµότητα από τις ηλιακές ακτίνες ώστε να ζεσταίνεται το αναπτυσσόµενο έµβρυο 2. Το σκούρο χρώµα εµποδίζει τις υπεριώδεις ακτίνες να εισχωρήσουν σε βάθος και να βλάψουν τα νουκλεικα οξέα

56 2β. Περιστροφή του φλοιού (60 ) ή περιστροφή συµµετροποίησης Η γονιµοποίηση προσφέρει στο ωάριο ένα ακόµα πολικό σωµάτιο, το οποίο αποδιοργανώνει τον κυτταροσκελετό Περιστροφήτουφλοιού (επιφάνειαςαυγού) κατά Η µετατόπιση είναι εξειδικευµένη και εξαρτάται από τη θέση εισόδου του σπερµατοζωαρίου. Στην αντιδιαµετρική θέση της εισόδου εµφανίζεται µια φαιόχρωµη περιοχή, ηφαιάηµισέληνος. Η κίνηση αυτή καθορίζει επακριβώς τις θέσεις συµµετρίας του µελλοντικού οργανισµού Η µελλοντική ραχιαία περιοχή θα είναι απέναντι από το σηµείο εισόδου του σπερµατοζωαρίου προσανατολισµενη συστοιχία µικροσωληνισκων

57 2β. Περιστροφή του φλοιού (60 ) ή περιστροφή συµµετροποίησης

58 4. Συντήκονται οι πυρήνες ωαρίου-σπερµατοζωαρίου

59 3 ΣΤΑ ΙΑ: 5. ΕΜΒΡΥΙΚΗΑΝΑΠΤΥΞΗ 1. Αυλάκωση 2. Γαστριδίωση 3. Νευριδίωση (στους 24 0 Cολοκληρώνονται µέσασε ~ 24 ώρες)

60 1-2 h µετά την σύντηξη των προπυρήνων µετά την γονιµοποίηση 1ηαυλάκωση (cleavage) (90 mins) Ζ/Φ 2ηαυλάκωση (cleavage) (110 mins) Ζ/Φ 90 0 ωςπροςτην 1 η 3η αυλάκωση (cleavage) ισηµερινή (4 µικράζωικά and 4 µεγάλαφυτικά= 8 βλαστοµερήήβλαστοµερίδια) µεσηµβρινή µεσηµβρινή ισηµερινή

61 Αυλακώσεις (Cleavages) 1. Χωρίζει το αριστερό απο το δεξί ηµισφαίριο 2. Χωρίζει την µελλοντική ραχιαία από την κοιλιακή πλευρά 3. Χωρίζει το ζωϊκό από το φυτικό ήµισυ 4. Οι επόµενες αυλακώσεις ποικίλουν ανάλογα µε το άτοµο.

62

63

64

65

66 Βλαστοµερίδια Βλαστίδιο (> 128 κύτταρα) ~ κύτταρα

67 1-2 h µετά την σύντηξη των προπυρήνων µετά την γονιµοποίηση Η πυρηνική άτρακτος προσανατολίζεται έτσι ώστε το ζυγωτό να διαιρεθεί σε δύο πανοµοιότυπα βλαστοµερίδια, σε ένα µεσηµβρινό επίπεδο κάθετο στο επίπεδο που διαχωρίζει τον Ζωικό απο τον Φυτικό πόλου Οι πυρηνικές άτρακτοι των δύο βλαστοµεριδίων είναι κάθετες στο πρώτο επίπεδο διαίρεσης, και τα δύο βλαστοµερίδια διαιρούνται σε τέσσερα µη πανοµοιότυπα βλαστοµερίδια, σε ένα µεσηµβρινό επίπεδο κάθετο προς το πρώτο Τα τέσσερα βλαστοµερίδια διαιρούνται σε οκτώ βλαστοµερίδια (4 µεγάλακαι 4 µικρά) κοκ (µε µεγάλη ταχύτητα) 12 διαιρέσεις 7 ώρες Μεσοβλαστίδιο (4000 κύτταρα)

68 Αυλακώσεις

69 ΜΕΣΟΒΛΑΣΤΙ ΙΟ ~4000 κύτταρα ΒΛΑΣΤΙ ΙΟ (σαν λεια σφαιρα) ~10000 κύτταρα 12 διαιρέσεις-7 ώρες

70 ΑΥΛΑΚΩΣΗ Από το κύτταρο στο Βλαστίδιο (10000 κύτταρα)

71 Βλαστική κοιλότητα ή Βλαστόκοιλο Στο κέντρο του ζωϊκού ηµισφαιρίου του εµβρύου και πάνω από τα λεκιθικά κυστίδια, σχηµατίζεται µια κοιλότητα, ηβλαστικήκοιλότηταήβλαστόκοιλο, η οποία επικαλύπτεται από στιβάδα µικρών κυττάρων

72 ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΒΛΑΣΤΟΚΟΙΛΟΥ

73 Τα Κύτταρα Του Βλαστιδίου µοιάζουν µε επιθηλιακά Σφικτοδεσµοί-Χασµοδεσµοί εξωτερικά ή βλαστόκοιλο (claudins ) (cadherins) εσωτερικά

74 ...µετάτην 12 η ιαίρεση Μετάβαση Μεσοβλαστιδίου ή ΜΒΤ παρατηρούνται : -επιβραδύνεται ο ρυθµός της αυλάκωσης - χάνεται ο συγχρονισµός των κυτταρικών διαιρέσεων - αυξάνεται η ισχύς της διακυτταρικής συνάφειας (λεία σφαίρα) - σηµατοδοτείται η έναρξη της µεταγραφής του ζυγωτικού γονιδώµατος

75 ΓΑΣΤΡΙ ΙΩΣΗ* Χαρακτηρίζεται από έντονη κινητικότητα κυττάρων και κυτταρικών στιβάδων, που εχει ως αποτέλεσµα τον σχηµατισµό των 3 βλαστικών δερµάτων και την εγκαθίδρυση της τυπικής δοµης των 3 στιβάδων του τυπικού τριπλοβλαστικού ζωικού οργανισµού : εξωτερικά το εξώδερµα, εσωτερικά το ενδόδερµα και ενδιάµεσα το µεσόδερµα *H µελέτη αυτή είναι δύσκολη στα αµφίβια επειδή το βλαστίδιο του βατράχου είναι αδιαφανές, άρα δεν είναι δυνατή η παρακολούθηση των κυττάρων στο εσωτερικό του εµβρύου

76 Βλαστίδιο Μικρα 3 ΚυτταρικέςΟµαδες βλαστοπόρος βλαστοµερή Μεγάλα Οριακή ζώνη 3 βλαστικέςστιβάδες: 1. Εξώδερµα (Πάνω από την οριακή ζώνη) 2. Μεσόδερµα (Οριακή ζώνη) 3. Ενδόδερµα (Κάτω από την οριακή ζώνη)

77 ΓΑΣΤΡΙ ΙΩΣΗ ιαδικασία: Αρχίζειµετηνεµφάνισηέγχρωµουβοθρίουστοραχιαίοφυτικότεταρτηµόριο, το ραχιαίο χείλος του βλαστοπόρου 2. Επιµήκυνση του βλαστοπόρου πλευρικά µέχρι να µετατραπεί σε πλήρη κύκλο 3. Ο ιστός εγκολπώνεται γύρω από τον κυκλικό βλαστοπόρο, περισσότερο στη ραχιαία πλευρά Είδη κινήσεων: 1. Επιβολή των κυττάρων του ζωικού ηµισφαιρίου προς το φυτικό, µε αποτέλεσµα την κάλυψη ολόκληρης της επιφάνειας του εµβρύου 2. Εγκόλπωση της οριακής ζώνης, µέχρι ο βλαστοπόρος να γίνει κυκλικός Η κοιλοτητα που σχηµατίζεται λεγεται αρχέντερο, και έχει τη µορφή κυλίνδρου, στη βάση του οποίο ενσωµατώνεται το λεκιθικό πώµα. 3. Το µελλοντικό µεσόδερµα µετατοπίζεται εσωτερικά και καθώς προχωρά η εγκόλπωση, το µεσόδερµα αναδιπλώνεται ως ξεχωριστή στιβάδα ανάµεσα σε ενδόδερµα και εξώδερµα 4. Επιµήκυνση του ραχιαίου αξονικού µεσοδέρµατος µε κατεύθυνση εµπροσθοπίσθια 5. Επέκταση του πλευροκοιλιακού µεσοδέρµατος προς τη ραχιαία µέση γραµµή

78 ΣΤΑ ΙΑΓΑΣΤΡΙ ΙΩΣΗΣ βλαστίδιο Πρώιµο γαστρίδιο Φυαλοειδή κύτταρα Α γαστρίδιο Γ Β βλαστοπόρος 10ώρες µετά όψιµο γαστρίδιο (30000 κύτταρα) Ότανο βλαστοπόρος είναικυκλικός, το τµήµα που ονοµάζεται ραχιαίο χείλος είναι το ραχιαίο ηµικύκλιο, ενώτο κοιλιακό χείλος είναι το κοιλιακό ηµικύκλιο

79 ΓΑΣΤΡΙ ΙΩΣΗ Αποτέλεσµα: Εγκαθίδρυση της τυπικής δοµής των 3 στιβάδων του σώµατος του τριπλοβλαστικού οργανισµού 1. Εξώδερµα (εξωτερικά) 2. Μεσόδερµα (ενδιαµεσα) 3. Ενδόδερµα (εσωτερικά) Εξώδερµα Επιδερµίδα Νευρικό Σύστηµα Φακοί Αυτιά Μεσόδερµα Κεφαλικό µεσόδερµα Σωµίτες Νεφροί Πλευρικά πέταλα Ενδόδερµα Επιθηλιακή επενδυση γαστρεντερικού σωλήνα Πνευµονες Ηπαρ Παγκρεας Πεπρωµένο: Εµπρόσθιος αδένας Αίµα Ουροδόχος κύστη Αιµοφόρα αγγεία Καρδιά Άκρα Μύες Οστά Γονάδες

80 Ηοριακήζώνη (marginal zone), η ζώνη των κυττάρων που εντοπίζονται στον ισηµερινό µεταναστεύει στο εσωτερικό του εµβρύου, µέσω της σχισµής του βλαστοπόρου (blastopore) 10ώρες µετά Οριακή ζώνη Η γαστριδίωση (δηλαδή ο σχηµατισµός των καταβολών του πεπτικού συστήµατος =αρχέντερο, αλλα και των 3 βλαστικών δερµάτων) ολοκληρώνεται. Τα κύτταρα του λεκιθικού πώµατος εισέρχονται στο εσωτερικό του εντέρου και πεπτονται.

81 ΣΤΑ ΙΑΓΑΣΤΡΙ ΙΩΣΗΣ Από το ραχιαίο µεσόδερµα αναπτύσσεται: α) η νωτοχορδή (ράβδος κατά µήκος της ραχιαίας µέσης γραµµής) β) οισωµίτες

82 Από το κύτταρο στο γαστρίδιο

83 Γαστριδίωση

84 Η παρακολούθηση της γαστριδίωσης γίνεται µε Βιοχρωστικές (G. Vogt, 1925) Είναιαδρανείςχρωστικές (Νeutral red, Nile blue), εισέρχονταιεύκολαστακύτταρα, χωρίς να µεταβολίζονται και να επηρεάζουν την ανάπτυξη του εµβρύου ιαδικασία: - ιαλύουµε τις χρωστικές σε υγρό άγαρ και το αφήνουµε να πήξει. -Κοβουµε κοµµατάκια αγαρ και τα τοποθετούµε σε διάφορες θέσεις στην επιφάνεια του βλαστιδίου ή του γονιµοποιηµένου αυγού (Εικόνα). -Μετά από 15 min αποµακρύνουµε το άγαρ από την επιφάνεια του εµβρύου -Όταν αρχίσει η γαστριδίωση µονιµοποιούµε έµβρυα σε διάφορα χρονικά διαστήµατα και κάνουµε ιστολογική µελέτη

85 Xάρτης προορισµού ή πεπρωµένου Αποτελέσµατα-Συµπεράσµατα: -Η παρουσία των βιοχρωστικών στα διάφορα εσωτερικά σηµεία του εµβρύου αποκαλύπτει την πορεία της µετακίνησης των κυττάρων, τα οποία ήταν αρχικά στην επιφάνεια του οργανισµού. -Μπορούµε να γνωρίζουµε ποιά κύτταρα της επιφάνεια θα δώσουν γένεση στα διάφορα εσωτερικά και εξωτερικά όργανα του εβρύου, ώστε να φτιάξουµε τον χάρτη προορισµού ή πεπρωµένου της εµβρυϊκής ανάπτυξης. Επίδοξο/η: Εξώδερµα Νευρική πλάκα Νωτιαία χορδή Μεσόδερµα τετµηµένων πλακών Μεσόδερµα πλευρικών πλακών Κεφαλικό µεσέγχυµα Ενδόδερµα

86 Μετάτο είκτες γενεαλογίας (φθορίζουσες δεξτράνες) Είναι πολυµερή της γλυκόζης, τα οποία διαλύονται στο νερό και είναι µεταβολικά αδρανή. Συνδέονται µε φθορίζουσες ουσίες (flurescine, rhodamine) Dil

87 ΝΕΥΡΙ ΙΩΣΗ Έναρξη σχηµατισµού του νευρικού συστήµατος: Από το εξώδερµα που βρίσκεται στη ραχιαία πλευρά σχηµατίζεται το κεντρικό νευρικό σύστηµα ιαδικασία: 1. Το λεκιθικό πώµα συνεχώς µικραίνει 2. Στοραχιαίοτµήµατουεµβρύουεµφανίζεταιµιαπάχυνσηκαιπλάτυνση, η νευρική πλάκα (µε επιλεκτική µεταβολή του σχήµατος των τοπικών κυττάρων) 3. Πλευρικά και κατά µήκος της νευρικής πλάκας αναπτύσσονται πτυχές, οι νευρικές πτυχές. 4. Η νευρική πλάκα βυθίζεται, και ονοµάζεται νευρική αύλακα, ενώ οι νευρικές πτυχές ανυψώνονται και συγκλίνουν, µε συνέπεια το σχηµατισµό του νευρικού σωλήνα* (µε αναδιπλωση του εξωδέρµατος) 5. Ο νευρικός σωλήνας αφού κλείσει καλύπτεται από το εξώδερµα που εκτείνεται πέραν των πτυχών και σχηµατίζει την επιδερµίδα. 6. Το έµβρυο (80000 κυτταρα) επιµηκύνεται κατά µήκος του κεφαλουριαίου άξονα, και λέγεται νευρίδιο.

88 Κυτταρικές Οµαδες Πλάτυνση του Ραχιαίου τµήµατος {1} Αρχή νευριδίωσης Το λεκιθικό πώµα συνεχώς µικραίνει {2} {3} 1 2 3

89 Σχηµατισµός Νευρικού Σωλήνα κατά τη Νευριδίωση 2 Νευρική πλάκα Νευρικές πτυχές 3 Νευρική αυλακα Σωµίτες 3 Νευρικός σωλήνας 4 4 Νωτοχορδή Νευρικός σωλήνας

90 Πλάτυνση ραχιαίου τµήµατος, η νευρική πλάκα Πλευρικά αναπτύσσονται οι νευρικές πτυχές Νευρικός σωλήνας 2, 3 4 Νευρική αυλακα Εξώδερµα (επιδερµίδα) Νευρικός σωλήνας 4 5 Νωτοχορδή

91 5. Στο τέλος της νευριδίωσης ο νευρικός σωλήνας καλύπτεται από την επιδερµίδα

92 Οι κινήσεις κατά τη νευριδίωση οφείλονται σε επιλεκτική µεταβολή του σχήµατος των τοπικών κυττάρων -τα νευροδερµικά επιµηκύνονται και στενεύουν στην κορυφή, ενώ -τα επιδερµικά πλαταίνουν.

93 Γαστριδίωση και Νευριδίωση

94 Ονοµάζεται: Κατά και Αµέσως µετά τη νευριδίωση... Παρατηρείται επιµήκυνση του σώµατος του εµβρύου µέσω εµβόλιµης παρεµβολής Κυττάρων τόσο στη νωτοχορδή όσο και σε άλλους ιστούς ΑΞΟΝΑΣ ΤΟΥ ΕΜΒΡΥΟΥ Ο νευρικός σωλήνας που δηµιουργείται από την αναδίπλωση του εξωδέρµατος της ραχιαίας πλευρας του εµβρύου και θα εξελιχθεί σε εγκέφαλο και νωτιαίο µυελό (κεντρικό νευρικό σύστηµα). + Η νωτοχορδή που είναι µια κυλινδρική δοµή που αναπτύσεται από το µεσόδερµα, η οποία εκτείνεται από το κεφάλι µέχρι την ουρά και βρίσκεται κάτω από το νευρικό σωλήνα + Οι σωµίτες που είναι διαχωρισµένα τµήµατα του µεσοδέρµατος, τα οποία βρίσκονται εκατέρωθεν της νωτοχορδής και θα εξελιχθούν σε µύες, σπονδυλική στήλη και δέρµα.

95 ΑΞΟΝΑΣ ΤΟΥ ΕΜΒΡΥΟΥ

96 ΑΞΟΝΑΣ ΤΟΥ ΕΜΒΡΥΟΥ

97 Στάδιο καταβολής ουράς Όλα τα κύρια τµήµατα του σώµατος εντοπίζονται στις τελικές τους θέσεις Τοµπροστινόµέροςτουνευρικούσωλήναθαγίνειεγκέφαλος, ενώτοµεσαίοκαιτοπίσωθαγίνεινωταίοςµυελός Πρόσθιο, διάµεσο, οπίσθιο Οι σωµίτες: To ραχιαίο τµηµα θα γίνει επιδερµίδα και το υπόλοιπο µύες (κορµού και άκρων) Μεσόδερµα πλευρικών πετάλων: Καταβολέςτωνάκρων, καρδιά, νεφρά. Κοιλιακό µεσόδερµα: Υπάρχουν νησίδες αίµατος που παρέχουν ερυθροκύτταρα στον πρωιµο γυρινο.

98 Στάδιο καταβολής ουράς Όλα τα κύρια τµήµατα του σώµατος εντοπίζονται στις τελικές τους θέσεις Η καταβολή της ουράς (tailbud) στο οπίσθιο άκρο αποτελείται από την οπίσθια νευρική πλάκα και το µεσόδερµα που βρίσκεται κάτω από αυτή, από τα οποία σχηµατίζονται (1-2 µέρες): -η νωτοχορδή -ο νευρικός σωλήνας -οι σωµίτες της ουράς

99 Στοκεφάλι: oπρόσθιοςνευρικόςσωλήναςδιογκώνεταικαισχηµατίζει 3 κυστίδια: - τον προσθιο εγκέφαλο - τον διάµεσο εγκέφαλο - τον οπίσθιο εγκέφαλο Πλακώδια Επιµήκεις παχύνσεις της επιδερµίδας: -ρινικό πλακώδιο -πλακώδια φακού -ωτικά πλακώδια νευράξονες του οσφρητικού νεύρου φακός µατιού αυτί

100 Στάδιο καταβολής ουράς Όλα τα κύρια τµήµατα του σώµατος εντοπίζονται στις τελικές τους θέσεις

101 Μεσα σε 80 ώρες αναπτύσσεται σε γυρινο µε κύτταρα ΕΝΗΛΙΚΟ Μεταµόρφωση 12 µήνες

102 ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΩΝ ΣΤΑ ΙΩΝ ΤΩΝ Nieuwkoop ΚΑΙ Faber Μέσο αυλάκωσης στάδιο 1, άποψηαπότο ζωικό πόλο στάδιο 4, άποψηαπότο ζωικό πόλο στάδιο 8, πλευρική άποψη στάδιο 10, άποψηαπότο φυτικό πόλο.

103 ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΩΝ ΣΤΑ ΙΩΝ ΤΩΝ Nieuwkoop ΚΑΙ Faber στάδιο 11, άποψηαπότο φυτικό πόλο στάδιο 14, άποψηαπότη ραχιαία πλευρά στάδιο 22, 1 ηµέρας άποψηαπότη ραχιαία πλευρά Τέλος νευριδίωσης

104 ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΩΝ ΣΤΑ ΙΩΝ ΤΩΝ Nieuwkoop ΚΑΙ Faber στάδιο 30, 2 ηµερώνπερίπου στάδιο 40, 3 ηµερώνπερίπου

105 ΣΤΑ ΙΑ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Γονιµοποιηµένο ωοκύτταρο µορίδιο κύτταρα βλαστίδιο κύτταρα γαστρίδιο κύτταρα νευρίδιο κύτταρα

106 Σταδιο 1 ΖΥΓΩΤΟ

107 Σταδιο 2 πισω όψη πρόσθια όψη πλάγια όψη Scale bar=1mm

108 πρόσθια όψη Σταδιο 3 Σταδιο 4

109 Σταδιο 6 Σταδιο 7

110 Σταδιο 8 Σταδιο 9 µεσοβλαστίδιο

111 Γαστρίδιο Σταδιο 10 Σταδιο 11

112 Σταδιο 13 Σταδιο 14

113 Νευρίδιο Σταδιο 15 Σταδιο 16

114 Σταδιο 18 Σταδιο 19

115 Σταδιο 20 Σταδιο 21

116 Σταδιο 22 Σταδιο 23

117 Σταδιο 24 Σταδιο 25

118 Σταδιο 26 Σταδιο 27 Πλάγια όψη Σταδιο 28

119 Σταδιο Σταδιο 32 Σταδιο 33-34

120 Σταδιο Σταδιο Σταδιο 39

121 Σταδιο 41 Σταδιο 47 Σταδιο 43 Σταδιο 45 Σταδιο 49 Σταδιο 50

122 ιάρκεια Εµβρυικής Ανάπτυξης

123 Η εµβρυική ανάπτυξη του Xenopus laevis