ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ Συµβολή στη µελέτη της επιζωοτιολογίας, τη διάγνωση και τηφαρµακευτική αντιµετώπιση της λεϊσµανίωσης του σκύλου. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΛΑΜΠΡΙΝΗ Β. ΑΘΑΝΑΣΙΟΥ Κτηνίατρος ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2004

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ. Β. ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝIΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ Β. 1. Η λεϊσµανίωση του σκύλου Β.2. Η θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου 2. ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ 2.Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝIΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Α.1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.Α.1.1.Περιοχή της έρευνας 2.Α.1.2. Καταγραφή µετεωρολογικών στοιχείων 2.Α.1.3. Περιγραφή του δείγµατος 2.Α.1.4. Ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της L. infantum 2.Α οκιµασία ΙFAT 2.Α οκιµασία ELISA 2.Α.1.5. Στατιστική επεξεργασία 2.Β.ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝIΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Β.1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.Β.1.1. Σκύλοι 2.Β.1.2. Πειραµατισµοί 2.Β Μελέτη της φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης µετά από εφάπαξ χορήγηση 2.Β Μελέτη της κλινικής φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης, της ασφάλειας και της αποτελεσµατικότητάς της για τη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου ύστερα από επαναλαµβανόµενες χορηγήσεις 2.Β.1.3. Κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις 2.Β Κλινική εξέταση 2.Β Εξέταση ολικού αίµατος 2.Β Αιµοληψίες και επεξεργασία του αίµατος 2.Β Αιµατολογική εξέταση 2.Β Βιοχηµικές εξετάσεις στον ορό του αίµατος 2.Β Ορολογικές εξετάσεις 2.Β Ορολογική εξέταση ( οκιµασία ΙFAT) για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της L. infantum 2.Β Ορολογική εξέταση για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της Ε. canis 2.Β Ορολογική εξέταση για την ανίχνευση του αντιγόνου των θηλυκών ενήλικων σκωλήκων της D. immitis 2.Β Εξέταση επιχρίσµατος από τη στοιβάδα των λευκών αιµοσφαιριώναιµοπεταλίων (buffy coat) 2.Β Μικροσκοπική εξέταση σταγόνας ολικού αίµατος και τροποποιηµένη µέθοδος Knott 2.Β Εξέταση ούρου 2.Β Παρασιτολογική εξέταση κοπράνων 2.Β Μικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος οπού λεµφογαγγλίου 2.Β Μικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος µυελού των οστών 1

3 2.Β PCR σε δείγµα οπού λεµφογαγγλίου και µυελού των οστών 2.Β Μέθοδος προσδιορισµού της συγκέντρωσης της αµινοσιδίνης στον ορό του αίµατος 2.Β Μεθοδολογία επεξεργασίας αποτελεσµάτων 2.Β Φαρµακοκινητική και στατιστική ανάλυση των φαρµακοκινητικών παραµέτρων 2.Β Στατιστική επεξεργασία αποτελεσµάτων κλινικών και εργαστηριακών εξετάσεων και διερεύνηση συσχετισµών 2.Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.Γ.Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Γ.Α.1. Περιοχή της έρευνας Κλιµατολογικές συνθήκες 2.Γ.Α.2. Περιγραφή του δείγµατος 2.Γ.Α.3. Ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση αντισωµάτων-l. infantum 2.Γ.Β. ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Γ.Β.1. Στοιχεία των σκύλων 2.Γ.Β.2. Πειραµατισµοί 2.Γ.Β.2.1. Φαρµακοκινητική της αµινοσιδίνης µετά εφάπαξ χορήγηση 2.Γ.Β.2.2. Φαρµακοκινητική της αµινοσιδίνης µετά επαναλαµβανόµενες χορηγήσεις 2.Γ.Β.3. Κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις 2.Γ.Β.3.1. Κλινική εξέταση 2.Γ.Β.3.2. Αιµατολογική εξέταση 2.Γ.Β.3.3. Βιοχηµικές εξετάσεις στον ορό του αίµατος 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού των συγκεντρώσεων των ολικών πρωτεϊνών 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού των συγκεντρώσεων των λευκωµατινών 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού των συγκεντρώσεων των σφαιρινών 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού των λόγων λευκωµατινών σφαιρινών 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού των συγκεντρώσεων του αζώτου ουρίας 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού των συγκεντρώσεων της κρεατινίνης 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού της δραστηριότητας της κρεατινικής κινάσης 2.Γ.Β Αποτελέσµατα του προσδιορισµού της συγκέντρωσης του φωσφόρου 2.Γ.Β.3.4. Ορολογικές εξετάσεις 2.Γ.Β Ορολογική εξέταση ( οκιµασία ΙFAT) για την ανίχνευση αντισωµάτων-l. infantum 2.Γ.Β Ορολογική εξέταση για την ανίχνευση αντισωµάτων-ε. canis 2.Γ.Β Ορολογική εξέταση για την ανίχνευση αντιγόνου-d. immitis 2.Γ.Β.3.5. Εξέταση επιχρίσµατος λευκών αιµοσφαιριών-αιµοπεταλίων (buffy coat) 2.Γ.Β.3.6. Εξέταση σταγόνας ολικού αίµατος και τροποποιηµένη µέθοδος Knott 2.Γ.Β.3.7. Εξέταση ούρου 2.Γ.Β.3.8. Παρασιτολογική εξέταση κοπράνων 2.Γ.Β.3.9. Εξέταση επιχρίσµατος οπού λεµφογαγγλίου 2.Γ.Β Εξέταση επιχρίσµατος µυελού των οστών 2.Γ.Β PCR σε δείγµα οπού λεµφογαγγλίου και µυελού των οστών 2.Γ.Β Συγκέντρωση αµινοσιδίνης στον ορό του αίµατος 2

4 2.Γ.Β ιερεύνηση συσχετίσεων 2.Γ.Β Συσχέτιση ολικών πρωτεϊνών/τίτλου αντισωµάτων 2.Γ.Β Συσχέτιση ολικών πρωτεϊνών/αριθµού πρωτοζώων στο µυελό των οστών 2.Γ.Β Συσχέτιση ολικών πρωτεϊνών/αριθµού πρωτοζώων στον οπό του λεµφογαγγλίου 2.Γ.Β Συσχέτιση σφαιρινών/τίτλου αντισωµάτων 2.Γ.Β Συσχέτιση ολικών πρωτεϊνών/τίτλου αντισωµάτων 2.Γ.Β Συσχέτιση ολικών πρωτεϊνών/αριθµού πρωτοζώων στο µυελό των οστών 2.Γ.Β Συσχέτιση ολικών πρωτεϊνών/αριθµού πρωτοζώων στον οπό του λεµφογαγγλίου 2.Γ.Β Συσχέτιση σφαιρινών/τίτλου αντισωµάτων 2.Γ.Β Συσχέτιση σφαιρινών/αριθµού πρωτοζώων στο µυελό των οστών 2.Γ.Β Συσχέτιση σφαιρινών/αριθµού πρωτοζώων στον οπό του λεµφογαγγλίου 2.Γ.Β Συσχέτιση έντασης λεµφαδενοπάθειας/τίτλου αντισωµάτων 2.Γ.Β Συσχέτιση έντασης λεµφαδενοπάθειας/αριθµού πρωτοζώων στο µυελό των οστών 2.Γ.Β Συσχέτιση έντασης λεµφαδενοπάθειας/αριθµού πρωτοζώων στον οπό του λεµφογαγγλίου 2.Γ.Β Συσχέτιση έντασης συµπτωµάτων/τίτλου αντισωµάτων 2.Γ.Β Συσχέτιση έντασης συµπτωµάτων/αριθµού πρωτοζώων στο µυελό των οστών 2.Γ.Β Συσχέτιση έντασης συµπτωµάτων/αριθµού πρωτοζώων στον οπό του λεµφογαγγλίου 2.Γ.Β Συσχέτιση του τίτλου των αντισωµάτων/αριθµού πρωτοζώων στο µυελό των οστών 2.Γ.Β Συσχέτιση αριθµού πρωτοζώων στον οπό του λεµφογαγγλίου/αριθµού πρωτοζώων στον µυελό των οστών 2.. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 2..Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ 2..Β. ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 3

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα πρωτόζωα του γένους Leishmania προκαλούν τις λεϊσµανιώσεις, µια οµάδα νοσηµάτων των σαρκοφάγων και του ανθρώπου µε µεγάλη ποικιλοµορφία στην κλινική εικόνα και σχεδόν παγκόσµια εξάπλωση. Στις µεσογειακές χώρες, η συχνότητα της λεϊσµανίωσης του σκύλου κυµαίνεται από 0,2 έως 67% ενώ στον άνθρωπο τα περισσότερα κρούσµατα αναφέρονται στην Ισπανία, Ν. Γαλλία και Ν. Ιταλία (8-300 κρούσµατα/χώρα ετησίως, Χαραλαµπίδης, 2003). Τις τελευταίες δεκαετίες, παρατηρείται αύξηση της συχνότητας των λεϊσµανιώσεων καθώς και εξάπλωση σε περιοχές στις οποίες µέχρι πρότινος δεν είχαν διαγνωσθεί (Αlvar, 2001). Τα παραπάνω επιδηµιολογικά στοιχεία αποδίδονται στη βελτίωση των διαγνωστικών µεθόδων και στην ευρύτερη χρήση τους στην ιατρική αλλά και στην κτηνιατρική (Kontos, 1999), στη βελτίωση των µεταφορικών µέσων και την ευχερέστερη διακίνηση ανθρώπων, ζώων και προϊόντων, στην καταστροφή του περιβάλλοντος και τις µεταβολές στο κλίµα και τη βλάστηση, την απαγόρευση της χρήσης εντοµοκτόνων για την καταπολέµηση των κουνουπιών, στην ανοσοπενία και τη χρήση ανοκατασταλτικών φαρµάκων και ειδικότερα για τον άνθρωπο στο σύνδροµο της επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (Alvar 1994, WHO, 1996, Gradoni, 2000). Ορισµένοι από τους παραπάνω παράγοντες σχετίζονται µε τις σκνίπες µεταδότες του πρωτοζώου και τις βιολογικές τους συνήθειες (Χαραλαµπίδης, 2003). Έτσι, η µελέτη της επιζωοτιολογίας του πρωτοζώου συµπεριλαµβάνει και τις συνθήκες οι οποίες επιδρούν έµµεσα στο βιολογικό κύκλο του πρωτοζώου µέσω της επίδρασής τους στη σκνίπα. Βασικό λοιπόν κίνητρο της επιζωοτιολογικής µελέτης, ήταν η ύπαρξη περιορισµένων στοιχείων της υπάρχουσας κατάστασης καθώς και των κλιµατολογικών παραγόντων που ενδεχόµενα επηρεάζουν τη συχνότητα της λεϊσµανίωσης του σκύλου. Τα µέχρι σήµερα δηµοσιευµένα επιζωοτιολογικά στοιχεία για τη λεϊσµανίωση του σκύλου στην Ελλάδα 4

6 αφορούν συγκεκριµένες µόνο περιοχές και λόγω διαφορετικών µεθόδων και χρόνου διεξαγωγής τους δεν είναι συγκρίσιµα. Εκτός όµως από την επιζωοτιολογική µελέτη, πρόκληση αποτελεί και η φαρµακευτική αντιµετώπιση του νοσήµατος όπως φαίνεται και από την πληθώρα σχετικών δηµοσιεύσεων και τη µη ύπαρξη καθολικά αποδεκτής θεραπευτικής αγωγής. Το γεγονός αυτό, καθώς και η ύπαρξη ενθαρρυντικών δεδοµένων από τη φαρµακοδυναµική της αµινοσιδίνης κατά της Leishmania spp. ήταν κίνητρο για τη µελέτη της αποτελεσµατικότητας και της ασφάλειας της χρησιµοποίησης της αµινοσιδίνης στη λεϊσµανίωση του σκύλου. Η προσέγγιση της αποτελεσµατικότητας µέσω και της φαρµακοκινητικής σε σχέση µε την κλασική µελέτη της αποτελεσµατικότητας επιλέχθηκε για την παρούσα µελέτη: α) για τον ακριβέστερο καθορισµό της δόσης (Lees και Shojaee Aliabadi, 2002, Toutain και συν., 2002), β) λόγω της µη ύπαρξης αγωγής αναφοράς και της προσπάθειας για την αποφυγή χρησιµοποίησης αρνητικών µαρτύρων, καθώς και γ) λόγω της ποικιλοµορφίας των κλινικών εκδηλώσεων του νοσήµατος, ιδιαίτερα ύστερα από φυσική µόλυνση και της ποικιλίας των διαγνωστικών µεθόδων που καθιστά µη συγκρίσιµα τα αποτελέσµατα των διαφορετικών θεραπευτικών αγωγών. Η παρούσα διατριβή αποτελείται από δύο µέρη. Το πρώτο µέρος περιλαµβάνει τη βιβλιογραφική ανασκόπηση σε ότι αφορά την επιζωοτιολογία, τη διάγνωση και τη φαρµακευτική αντιµετώπιση της λεϊσµανίωσης του σκύλου. Στο δεύτερο µέρος παρουσιάζεται ο σχεδιασµός, τα αποτελέσµατα, η συζήτηση των αποτελεσµάτων σε σχέση µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα και στο τέλος παρατίθενται αναλυτικότερα σε µορφή πινάκων τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης. Η εκπόνηση και ολοκλήρωση της µελέτης έγινε µε την καθοδήγηση και τη βοήθεια των µελών της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, καθηγητών κ.κ. Σ. Χαραλαµπίδη, Τ., Ράλλη και Β. Κοντό, στους οποίους εκφράζω θερµές ευχαριστίες. 5

7 Επίσης, εκφράζω θερµές ευχαριστίες στον καθηγητή κ. Κουνενή, ιευθυντή του Εργαστηρίου Φαρµακολογίας του τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. όπου πραγµατοποιήθηκε µέρος της φαρµακοκινητικής µελέτης που περιλαµβάνεται στην παρούσα διατριβή, καθώς και το λέκτορα του ιδίου εργαστηρίου κ. Γ. Μπατζία για την καθοριστική συµβολή του στη διεξαγωγή της φαρµακοκινητικής µελέτης. Ευχαριστίες εκφράζω επίσης στον καθηγητή κ. Βακάλη, που επέτρεψε τη διεξαγωγή τµήµατος της διατριβής (ορολογικές δοκιµασίες, PCR) στο Εργαστήριο Παρασιτολογίας, Εντοµολογίας και Τροπικών Νοσηµάτων της Εθνικής Σχολής ηµόσιας Υγείας, καθώς και τη φαρµακοποιό κα Ε. Βασάλου και το βιολόγο ρ Γ. Σπανάκο επιστηµονικούς συνεργάτες του ίδιου εργαστηρίου, για την πολύτιµη βοήθειά τους στην εφαρµογή των ορολογικών δοκιµασιών και της PCR αντίστοιχα. Θα αποτελούσε παράλειψή µου αν δεν εξέφραζα τις ευχαριστίες µου στο ιευθυντή της Κλινικής Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς του τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. κ. Κουτίνα όπου πραγµατοποιήθηκε το κλινικό µέρος της διατριβής καθώς και στο λέκτορα της ίδιας κλινικής κ. Μ. Σαριδοµιχελάκη για τη βοήθειά του στην διεξαγωγή της κλινικής µελέτης και τις εύστοχες παρατηρήσεις του κατά τη συγγραφή της παρούσας διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους µετεκπαιδευόµενους κτηνιάτρους και υποψήφιους διδάκτορες κ.κ. Χ. Κουτίνα, Θ. Πετανίδη, Ο. Φαρµάκη και Γ. ελή που µε βοήθησαν στο κλινικό µέρος και στη ανάλυση των δειγµάτων της φαρµακοκινητικής µελέτης καθώς και τους ζωοκόµους κκ Σ. Ζησόπουλο και Ν. Ζησόπουλο για την περιποίηση και φροντίδα των ζώων. Τέλος ευχαριστώ την εταιρεία CEVA SANTE ANIMALE για την παραχώρηση του φαρµάκου που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή. 6

8 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome - Σύνδροµο Επίκτητης Ανοσοανεπάρκειας ALB: ALP: ALT: ANOVA: ATP: AUC: Albumines - Λευκωµατίνες Alkaline phosphate Αλκαλική φωσφατάση Alaninoaminotransferase - Αλανινοαµινοτρανσφεράση Analysis of Variance - Ανάλυση ιακύµανσης Adenino-5 -triphosphate - Αδενοσινο-5 -τριφωσφορικό οξύ Area under the curve Περιοχή κάτω από την καµπύλη συγκέντρωσης χρόνου ΒUN: Ca: CHOL: CK: Cr: CL: Cmax: DDT: DNA: ED 50 : EDTA: Blood Urea Nitrogen - Άζωτο Ουρίας Calcium - Ασβέστιο Cholosterole - Χολοστερόλη Creatinine kinase - Κρεατινική κινάση Creatinine - Κρεατινίνη Clearance Ολική σωµατική κάθαρση Μaximum Concentration - Μέγιστη συγκέντρωση Dichlorodiphenyltrichloroethane - ιχλωροδιφαινυλτριχλωροαιθάνιο Deoxyribonucleic acid εσοξυριβονουκλεϊνικό οξύ Median effective dose - Μέση αποτελεσµατική δόση Ethylenediaminetetraacetate Αιθυλενοδιαµινοτετραοξεικό κάλιο F: Bioavailabily - Βιοδιαθεσιµότητα GLB: Globulins - Σφαιρίνες h: Hour - Ώρα Ηb Haemoglobulin - Αιµοσφαιρίνη 7

9 HIV: Human Immunodeficiency Virus - Iός της Ανοσοανεπάρκειας του Ανθρώπου. IFAT: IL: Ιg: im: Immunofluorescent Antibody Test Έµµεσος Ανοσοφθορισµός Interleukin - Ιντερλευκίνη Immunoglobulin - Ανοσοσφαιρίνη Intramuscular - Ενδοµυϊκή Κ: Potassium - Κάλιο Ka: Kel: INF: MANOVA: MAT: Absorption rate constant - Σταθερά ταχύτητας απορρόφησης Elimination rate constant - Σταθερά ταχύτητας αποµάκρυνσης Interferon - Ιντερφερόνη Multiple Analysis of Variance Πολλαπλή Ανάλυση ιακύµανσης Mean Absorption Time - Μέσος χρόνος απορρόφησης. MBC: Maximum bactericidal concentration - Μέγιστη βακτηριοκτόνος συγκέντρωση MCHC Mean corpuscular haemoglobin concentration - Μέση εκατοστιαία περιεκτικότητα αιµοσφαιρίνης ανά ερυθρό αιµοσφαίριο MIC.: Min: MRT: Na: Minimum Inhibitory Concentration - Ελάχιστη συγκέντρωση αναστολής Minute λεπτό της ώρας. Mean residence time - Μέσος χρόνος µετακίνησης ή παραµονής Sodium - Νάτριο P: Phosphorus - Φωσφόρος PAE: PCR: PCV: PLT: Post Antibiotic Effect - Μετά το αντιµικροβιακό δράση Polymerase Chain Reaction - Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης Package Cell Volume - Aιµατοκρίτης Platelets - Αιµοπετάλια 8

10 RNA: RAPD-PCR: Ribonucleic acid Ριβονουκλεϊκό οξύ Random Amplified Polymorphic DNA- PCR - Τυχαία ενίσχυση τµηµάτων πολυµορφικού DNA -PCR σ.β.: sc: ΤBIL: TGL: ΤS: Th: t 1/2β : tmax: Vss: Σωµατικό Βάρος subcutaneously - Υποδόρια Total Bilirubin Ολική Χολερυθρίνη Triglycerids - Τριγλυκερίδια Total proteins Ολικές πρωτεΐνες Τhelper βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα Elimination half life Χρόνος ηµίσειας ζωής της αποβολής Χρόνος επίτευξης της µέγιστης συγκέντρωσης Volume of Distribution at Steady State Όγκος κατανοµής στη σταθερή κατάσταση WBC: WHΟ/ ΠΟΥ White Blood Cells Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων World Health Organisation - Παγκόσµια Οργάνωση Υγείας 9

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ Οι λεϊσµανιώσεις είναι οµάδα νοσηµάτων του ανθρώπου και των ζώων µε παγκόσµια εξάπλωση αφού έχουν διαπιστωθεί σε όλες τις Ηπείρους, µε εξαίρεση την Αυστραλία, την Ανταρκτική και τα νησιά του Ειρηνικού (Locksley και Scott, 1991, Reale και συν., 1999, Dereure και συν., 1999). Αν και έχουν περιγραφεί σε πολλά ήδη ζώων, όπως σε διάφορα άγρια είδη της οικογένειας Canidae (Hervas και συν., 1996), το άλογο (Sales και συν., 1998), τη γάτα (Michael και συν., 1982, Craig και συν., 1986, Barnes και συν., 1993, Morsy και Abou el Seoud, 1994, Laruelle-Magalon και Toga, 1996, Οzon και συν., 1998), το πρόβατο (Van der Lugt και συν., 1992) και τα τρωκτικά (Kontos και συν., 1989) από επιδηµιολογική και κλινική άποψη ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι λεϊσµανιώσεις του σκύλου και του ανθρώπου. Οι λεϊσµανιώσεις του ανθρώπου είναι, µετά την ελονοσία και την ασθένεια του ύπνου, τα συχνότερα νοσήµατα που µεταδίδονται µε αρθρόποδα µε κρούσµατα σε 88 ενδηµικές χώρες, όπου εκτιµάται ότι άνθρωποι κινδυνεύουν να µολυνθούν κάθε χρόνο (WHO, 1996, WHO, 2000). Εξάλλου, σε ορισµένες περιοχές, και ιδιαίτερα στις χώρες της υτικής Μεσογείου, αποτελεί τη συχνότερη ευκαιριακή παρασίτωση σε ανθρώπους οροθετικούς για τον ιό της ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου (HIV), µε ποσοστό που ξεπερνά το 50% (Alvar 1994, Alvar 1999). Η λεϊσµανίωση του ανθρώπου ήταν γνωστή νοσολογική οντότητα στη χώρα µας πολύ πριν από την πρώτη περιγραφή του παρασίτου το 1903 (Donovan, 1903, Leishman, 1903). Το πρώτο παρασιτολογικά επιβεβαιωµένο περιστατικό σε άνθρωπο αναφέρθηκε στην Κρήτη το 1907 (Stoney-Archer, 1907), ενώ τον επόµενο χρόνο επιβεβαιώθηκε και η µόλυνση του σκύλου από το πρωτόζωο (Cardamatis, 1911). Η διαπίστωση της λεϊσµανίωσης τόσο στον 10

12 άνθρωπο όσο και στο σκύλο δηµιούργησε προβληµατισµό σχετικά µε τον τρόπο µετάδοσης του πρωτoζώου. Οι αρχικές παρατηρήσεις που αφορούσαν την επιδηµιολογία της λεϊσµανίωσης οδήγησαν στην υπόθεση ότι υπάρχει άγνωστος µεταδότης που ευθύνεται για τη µόλυνση µεταξύ των ανθρώπων, των σκύλων ή και µεταξύ του σκύλου και του ανθρώπου (Aravantinos, 1916, Aραβαντινός, 1942). Αν και αρχικά ενοχοποιήθηκε πλήθος εντόµων και αρθροπόδων, τελικά οι Sergent και συν, (1921) διαπίστωσαν ότι τo πρωτόζωο µεταδίδεται µε τις σκνίπες. Οι ψεκασµοί µε DDT, για την καταπολέµηση των κουνουπιών για την αντιµετώπιση της ελονοσίας, που πραγµατοποιήθηκαν στη χώρα µας συστηµατικά µετά το εύτερο Παγκόσµιο Πόλεµο, µείωσαν σηµαντικά και τον αριθµό των κρουσµάτων της σπλαχνικής και της δερµατικής λεϊσµανίωσης του ανθρώπου, λόγω της ταυτόχρονης καταπολέµησης των σκνιπών. Συγκεκριµένα, τη δεκαετία του 1950 καταγράφονταν κατά µέσο όρο 32 περιστατικά σπλαγχνικής λεϊσµανίωσης ετησίως, που όµως αυξήθηκαν σε 60 ανά έτος από το 1962 έως το 1978 (WHO, 1993). Σε ότι αφορά τη λεϊσµανίωση του σκύλου, στην Κτηνιατρική Σχολή του Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, από την ίδρυσή της (1951) και µέχρι το 1976 είχαν καταγραφεί µόνο 13 περιστατικά, ενώ µέχρι τη δεκαετία του 1960 σποραδικές αναφορές του νοσήµατος υπάρχουν από τους ασχολούµενους µε τα ζώα συντροφιάς κτηνιάτρους των Αθηνών και τους ερευνητές του Ινστιτούτου Παστέρ (Tzamouranis και συν., 1984). Σε επιζωοτιολογικές µελέτες της λεϊσµανίωσης του σκύλου στην Ελλάδα και ανάλογα κάθε φορά µε τη γεωγραφική περιοχή και την εποχή του έτους, το υλικό, τη µέθοδο της δειγµατοληψίας και τη µέθοδο εξέτασης, το ποσοστό των σκύλων µε αντισώµατα κατά της Leishmania spp. κυµαινόταν από 1,6% ως 24% (Κοντός, 1986, Κontos και Spais, 1989, Παπαδοπούλου και συν., 1995, Sideris και συν., 1996, Χαραλαµπίδης και ιάκου, 1999, ιάκου, 2000). Επισηµαίνεται ότι τα παραπάνω ποσοστά οροθετικότητας δεν είναι σε καµία περίπτωση ταυτόσηµα αλλά µόνο ενδεικτικά της συχνότητας του νοσήµατος στο σκύλο. Κατά την τελευταία 15ετία, και αντίθετα µε ότι συµβαίνει στο σκύλο (Frydas και συν., 2001), 11

13 τα κρούσµατα της σπλαχνικής λεϊσµανίωσης του ανθρώπου είναι σποραδικά και κυµαίνονται από 18 έως 106 ετησίως (Χαραλαµπίδης, 2003), ενώ στο 3,9% κλινικά υγιών αιµοδοτών ανιχνεύθηκαν αντισώµατα- Leishmania spp. (Χαραλαµπίδης και Φρύδας, 1993). Μέχρι σήµερα έχουν διαπιστωθεί στη χώρα µας 12 διαφορετικά είδη σκνιπών (Phlebotomus perfiliewi, P. neglectus, P. tobbi, P. balcanicus, P. simici, P. papatasi, P. sergenti, P. similιs, P. alexandri, P. mascittii, Sergentomyia dentata, S. minuta) που έχουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ τους αναφορικά µε τη γεωγραφική εξάπλωση και τις βιολογικές συνήθειες (Leger και συν., 1988, Chaniotis και συν., 1994, Χαραλαµπίδης, 1997, Naucke, 1998, Χαραλαµπίδης, 2003). Από τα είδη αυτά µεταδότες του παρασίτου στην Ελλάδα αποδείχθηκαν ο P. tobbi από τον οποίο αποµονώθηκε Leishmania infantum στη Λέσβο (Adler and Theodor 1932, Lane και συν., 1984) και ο P. neglectus από τον οποίο αποµονώθηκε L. infantum στην Αθήνα, τη Ζάκυνθο, την Κέρκυρα και τις Σέρρες (Leger, 1988, Chaniotis και συν., 1994, Chaniotis και Τselentis, 1996, Χαραλαµπίδης, 1997, Naucke, 1998, Chaniotis και συν., 2000, Χαραλαµπίδης, 2003). Ανάλογα µε το είδος Leishmania spp. και τις επικρατούσες περιβαλλοντικές συνθήκες, η διάρκεια του βιολογικού κύκλου του παρασίτου στο µεταδότη (ασπόνδυλο ξενιστή) κυµαίνεται από 4-20 ηµέρες. Η χρονική περίοδος που απαιτείται για την ολοκλήρωση της εξέλιξης του πρωτοζώου επηρεάζεται κυρίως από τη θερµοκρασία. Συγκεκριµένα, ο βιολογικός κύκλος του παρασίτου αναστέλλεται σε θερµοκρασίες χαµηλότερες από τους 10ºC και επιβραδύνονται όλες οι φυσιολογικές λειτουργίες του µεταδότη. Αντίθετα, ο αριθµός των µολυσµένων σκνιπών και η αναπαραγωγική δραστηριότητά τους εντείνονται µε την άνοδο της θερµοκρασίας. Έχει διαπιστωθεί ότι σε θερµοκρασία µεγαλύτερη από 15ºC, επιπλέον επιταχύνεται η µετακίνηση του παρασίτου προς το πρόσθιο έντερο, ενώ µετά τους 20ºC ευνοείται η προσκόλλησή του στο ρύγχος του εντόµου (Rioux και συν., 1985). Η υγρασία του περιβάλλοντος φαίνεται ότι επηρεάζει τη 12

14 µακροβιότητα του εντόµου και όχι το βιολογικό κύκλο του πρωτοζώου (Chaniotis και συν., 1994). Συµπερασµατικά, φαίνεται ότι: α) η λεϊσµανίωση του σκύλου απαντάται µε ποικίλη συχνότητα και σε όλες τις γεωγραφικές περιοχές της χώρας µας και πρέπει να θεωρείται ενζωοτικό νόσηµα, ενώ στον άνθρωπο απαντώνται µόνο σποραδικά κρούσµατα, β) τα δηµοσιευµένα επιζωοτιολογικά στοιχεία για τη λεϊσµανίωση του σκύλου στην Ελλάδα αφορούν συγκεκριµένες µόνο περιοχές και λόγω των διαφορετικών µεθόδων εξέτασης και του χρόνου διεξαγωγής τους δεν είναι συγκρίσιµα µεταξύ τους, γ) η γεωγραφική κατανοµή του νοσήµατος στο σκύλο εξαρτάται από αυτή των σκνιπών µεταδοτών και δ) οι κλιµατολογικές συνθήκες επηρεάζουν το µεταδότη και πιθανώς σχετίζονται έµµεσα µε τη συχνότητα του νοσήµατος στις διάφορες περιοχές. Σκοπός του πρώτου µέρους της διατριβής αυτής είναι η µελέτη της επιζωοτιολογίας της λεϊσµανίωσης του σκύλου σε 7 διαφορετικές περιοχές της χώρας µας. Ειδικότερα στο τµήµα αυτό της διατριβής: α) διερευνάται η παρουσία αντισωµάτων- Leishmania spp. σε κλινικά υγιείς σκύλους από 7 διαφορετικές περιοχές της χώρας µας µε τη δοκιµασία του έµµεσου ανοσοφθορισµού, β) συγκρίνονται τα αποτελέσµατα µεταξύ των σκύλων των περιοχών αυτών και γ) συγκρίνονται οι κλιµατολογικές συνθήκες (θερµοκρασία, βροχόπτωση, υγρασία) και τα αποτελέσµατα της εξέτασης των σκύλων κάθε περιοχής. 13

15 Β. ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ Β. 1. Η λεϊσµανίωση του σκύλου Στην Ελλάδα, αλλά και στις υπόλοιπες µεσογειακές χώρες, η γενικευµένη λεϊσµανίωση του σκύλου, όπως άλλωστε και η σπλαχνική λεϊσµανίωση του ανθρώπου, οφείλεται στο πρωτόζωο L. infantum (Garifallou και συν., 1984, Frank, 1991). Η ταυτοποίηση των στελεχών που κατά καιρούς αποµονώθηκαν κατατάσσει την πλειονότητά τους στο ζυµότυπο Ι (zymodem MON Ι, Frank, 1991). Φαίνεται µάλιστα ότι στο ζυµότυπο αυτό υπάρχει γενετικός πολυµορφισµός ( ιάκου, 2000), η σηµασία του οποίου δεν είναι πλήρως διευκρινισµένη, ιδιαίτερα σε ότι αφορά τη µολυσµατική ικανότητα των διαφόρων στελεχών του πρωτοζώου (Garifallou και συν., 1984, Alvar, 1999). H περίοδος επώασης της λεϊσµανίωσης του σκύλου κυµαίνεται από λίγους µήνες µέχρι και αρκετά χρόνια (Rioux, 1979, Kοντός, 1986, Ferrer, 1992, Slappendel, 1998, Slappendel και Ferrer, 1998). Τον ενοφθαλµισµό από τη σκνίπα των µετακυκλικών προµαστιγωτών µορφών του παρασίτου στο δέρµα ακολουθεί µια αλληλουχία βιολογικών γεγονότων, που σχετίζονται µε τους µηχανισµούς διαφυγής της από το ανοσοποιητικό σύστηµα του σπονδυλωτού ξενιστή. Οι µηχανισµοί αυτοί µπορούν να οµαδοποιηθούν σε 4 κατηγορίες: α) στην είσοδο και την αρχική επιβίωση του παρασίτου στο χόριο του δέρµατος του ξενιστή (Koutinas και συν., 1993, Ferrer, 1998), β) στην αλληλεπίδραση πρωτοζώου - µακροφάγων στο δέρµα, γ) στη διασπορά του παρασίτου µε τα µολυσµένα µακροφάγα, και δ) στην ενεργοποίηση των Τ-λεµφοκυττάρων (Borgan και συν., 1990, Βογιατζάκη, 1999). Ιδιαίτερη σηµασία για την εξέλιξη της µόλυνσης φαίνεται ότι έχει ο τύπος της ανοσολογικής απάντησης του ξενιστή και κυρίως η ενεργοποίηση των CD+4 T-βοηθητικών (Τh) λεµφοκυττάρων. H ενεργοποίησή τους προς την κατεύθυνση της κυτταρικής ανοσίας 14

16 (Τh-1), µε παραγωγή κυτταροκινών (IL-2, IL-12, INF-γ) που καθιστούν ικανά τα µακροφάγα να καταστρέψουν το πρωτόζωο, οδηγεί στην αυτοΐαση ή την υποκλινική µορφή του νοσήµατος. Αντίθετα, η διέγερση των Th-2 λεµφοκυττάρων οδηγεί σε επικράτηση της χυµικής ανοσίας και παραγωγή αντισωµάτων και κυτταροκινών (IL-4, IL-5, IL-10) που, µειώνοντας την λειτουργική ικανότητα των µακροφάγων, ευνοούν την εξάπλωση του πρωτοζώου και την εµφάνιση συµπτωµάτων (Pinelli και συν., 1994, Pinelli και συν., 1999a, Pinelli και συν., 1999b, Pinelli και συν., 2000, Ferrer, 2002). Φαίνεται ότι στο σκύλο παρατηρούνται και οι δύο παραπάνω τύποι ανοσολογικής αντίδρασης, γεγονός που ερµηνεύει, σε ένα βαθµό, την ποικιλοµορφία και τη βαρύτητα της κλινικής εικόνας που το νόσηµα προκαλεί (Χαραλαµπίδης, 1994, Pinelli, 1994, Pinelli και συν., 1999, Pinelli και συν., 2000, Ferrer, 2002, Χαραλαµπίδης, 2003). Η επικράτηση της κυτταρικής ή της χυµικής ανοσίας µετά τη µόλυνση µε το παράσιτο εξαρτάται από ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα πειραµατικών ερευνών ο αριθµός των πρωτόζωων που ενοφθαλµίζονται, αλλά και ορισµένες ουσίες που περιέχονται στο σίελο των σκνιπών µπορούν να εκτρέψουν την ανοσολογική αντίδραση του ξενιστή προς τη µία ή την άλλη κατεύθυνση (Pinelli και συν., 1994). Ακόµη, φαίνεται ότι η συνύπαρξη άλλων µολύνσεων από πρωτόζωα (Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Babesia spp.), αιµοπαράσιτα (Dirofilaria immitis), ρικκέτσιες (Rickettsia spp.) και ερλίχιες (Ehrlichia canis, Anaplasma platys), καθώς και αυτοάνοσων νοσηµάτων, που διαπιστώνονται σε ορισµένους σκύλους µε λεϊσµανίωση, µπορεί να συντελεί στην εµφάνιση ή στην επιδείνωση των συµπτωµάτων (Κοντός, 1986, Huss και Ettinger, 1992, Ginel και συν., 1993, Mozos και συν. 1999, Κοντός και συν., 1999, Tarantino και συν., 2001, Ferrer, 2002). H κλινική εικόνα της λεϊσµανίωσης του σκύλου είναι επαρκώς µελετηµένη και χαρακτηρίζεται από πληθώρα κλινικών εκδηλώσεων, που προέρχονται από διάφορα όργανα και συστήµατα και δύσκολα διαφοροποιούνται από τις αντίστοιχες άλλων συστηµατικών νοσηµάτων του σκύλου (Κοντός, 1986, Kontos και Koutinas, 1993, Ferrer, 1997, Koutinas 15

17 και συν., 1999). Τα συχνότερα συµπτώµατα είναι η προοδευτική απώλεια βάρους, η περιφερική λεµφαδενοπάθεια, οι δερµατικές αλλοιώσεις (αποφολιδωτική δερµατίτιδα µε ή χωρίς διάχυτη υποτρίχωση, έλκη), η ωχρότητα των βλεννογόνων, η επίσταξη και η ατροφία των κροταφιτών µυών (Κοντός, 1986, Κοntos και Koutinas, 1993, Ciaramella και συν., 1997, Slappendel και Ferrer, 1998, Koutinas και συν., 1999, Vamvakidis και συν., 2000), ενώ η κυριότερη αιτία θανάτου είναι η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, που οφείλεται στη διάµεση νεφρίτιδα και κυρίως στην από ανοσοσύµπλοκα σπειραµατονεφρίτιδα (Koutinas και συν., 1995). Η παρουσία ή όχι συµπτωµατολογίας από τους νεφρούς και νεφρικών αλλοιώσεων αποτελεί άλλωστε καθοριστικό στοιχείο για την πρόγνωση στις περιπτώσεις ανάληψης θεραπευτικής προσπάθειας (Slappendel και Ferrer, 1998). Εξάλλου, η σπειραµατικής προέλευσης πρωτεϊνουρία αποτελεί το συνηθέστερο εύρηµα κατά την εξέταση του ούρου. Άλλα µη ειδικά εργαστηριακά ευρήµατα συµβατά µε τη λεϊσµανίωση του σκύλου είναι η αναιµία, η αύξηση της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών στον ορό του αίµατος λόγω υπερσφαιριναιµίας (κυρίως των β και γ σφαιρινών), ενώ σε περίπτωση νεφρικής ανεπάρκειας διαπιστώνονται επιπλέον αζωθαιµία και χαµηλό ειδικό βάρος στo ούρo (Groulade και Pearson, 1987, Slappendel, 1998, Ferrer, 1992, Ciaramella και συν., 1997, Koutinas και συν., 1999). Η διάγνωση της λεϊσµανίωσης του σκύλου βασίζεται στην άµεση ανίχνευση του πρωτοζώου σε βιολογικά υλικά καθώς και στη µελέτη της ανοσολογικής απάντησης του ξενιστή. Η ανεύρεση των αµαστιγωτών µορφών της Leishmania είναι δυνατόν να γίνει σε επιχρίσµατα από οπό λεµφογαγγλίων, µυελό των οστών, σπλήνα, σε αποτυπώµατα από τις δερµατικές αλλοιώσεις και κατά την ιστολογική εξέταση βιοψιών από όργανα και ιστούς, µε ή χωρίς τη χρήση ανοσοϊστοχηµικών µεθόδων (Σαριδοµιχελάκης και Κουτίνας, 2002). Η καλλιέργεια του πρωτοζώου, αν και χρονοβόρα και τεχνικά δύσκολη, παραµένει ακόµα και σήµερα σηµαντική διαγνωστική µέθοδος (Chang και Hendricks, 1985, Reed, 16

18 1996). Αντίθετα ο ενοφθαλµισµός σε πειραµατόζωα (κρικητοί) σπάνια βρίσκει εφαρµογή στην κλινική πράξη (Chang και Hendricks, 1985). Τα τελευταία χρόνια, η πρόοδος της µοριακής βιολογίας, που είχε ως αποτέλεσµα την ανάπτυξη και την απλοποίηση των τεχνικών της, οδήγησε στην εφαρµογή διαγνωστικών µεθόδων που στηρίζονται στα γονοτυπικά χαρακτηριστικά του πρωτοζώου και συγκεκριµένα στην ανίχνευση του γενετικού υλικού τους (Wilson, 1995, Singh, 1997). Η συχνότερη εφαρµογή της στην καθηµερινή πράξη είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) µε την οποία επιτυγχάνεται in vitro ο πολλαπλασιασµός του DNA του πρωτοζώου. Ακολουθεί η ανίχνευση των προϊόντων πολλαπλασιασµού του DNA στόχου, µε διάφορες µεθόδους όπως η ηλεκτροφόρηση, η χρώση και εξέταση µε λυχνία υπεριώδους ακτινοβολίας, χρήση ειδικών ανιχνευτών (µετά τη µεταφορά του ηλεκτροφορηθέντος προϊόντος σε µεµβράνες, Southern blot) και η ELISA (Mathis και Deplazes, 1995, Ferrer, 1997, Solano-Gallego και συν., 2001). H PCR, θεωρητικά τουλάχιστον, χαρακτηρίζεται από µεγάλη ευαισθησία (µπορεί να ανιχνεύσει µέχρι και µία αµαστιγωτή µορφή του παρασίτου) και ειδικότητα, που είναι αποτέλεσµα του εκλεκτικού πολλαπλασιασµού επιλεγµένων τµηµάτων του γενετικού υλικού της Leishmania. Όµως η µεγάλη ευαισθησία της PCR αποτελεί ταυτόχρονα και µειονέκτηµά της, αφού ακόµα και ελάχιστη ποσότητα DNA στο περιβάλλον που προέρχεται από την επεξεργασία άλλων δειγµάτων, µπορεί να επιµολύνει το δείγµα οδηγώντας σε ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Σηµαντικό πρόβληµα της PCR είναι επίσης και οι αναστολές της αντίδρασης από διάφορα συστατικά που υπάρχουν στο υπο εξέταση δείγµα (Gasser, 1999). Τέλος, η τεχνική της τυχαίας ενίσχυσης τµηµάτων του πολυµορφικού DNA (RAPD-PCR) χρησιµοποιείται για την ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών της Leishmania spp. ( ιάκου, 2000). Η έµµεση διάγνωση της λεϊσµανίωσης βασίζεται στη διαπίστωση της ανοσολογικής αντίδρασης του ξενιστή µέσω του προσδιορισµού των ειδικών κατά του πρωτόζωου αντισωµάτων, που ανιχνεύονται στην πλειονότητα των συµπτωµατικών σκύλων. Από τις 17

19 ορολογικές δοκιµασίες συνήθως χρησιµοποιούνται ο έµµεσος ανοσοφθορισµός (IFAT) και η ΕLISA (Κοντός, 1986, Κοπτόπουλος, 1987, Halliwell και Gorman, 1989, Χαραλαµπίδης, 1994). Σύµφωνα µε τo WHO (1993), οι ορολογικές δοκιµασίες είναι κατάλληλες για την εκτίµηση του επιπολασµού και της επίπτωσης της λεϊσµανίωσης σε µια περιοχή. Ειδικότερα, η IFAT θεωρείται η ορολογική δοκιµασία επιλογής για τις διάφορες επιδηµιολογικές έρευνες λόγω της µεγάλης ευαισθησίας και ειδικότητάς της, που ανάλογα µε τον ερευνητή κυµαίνονται από 80% µέχρι και 100% (Slappendel, 1988, Manciati και Meciani, 1988). Όµως, η IFAT είναι χρονοβόρα και κοπιαστική, ιδιαίτερα όταν χρειάζεται να εξεταστεί µεγάλος αριθµός δειγµάτων και για το λόγο αυτό στην πράξη προτιµάται συνήθως η ELISA. Σε πρόσφατες επιζωοτιολογικές µελέτες αλλά και σε µελέτες αποτελεσµατικότητας όπου χρησιµοποιήθηκαν και οι δύο αυτές ορολογικές δοκιµασίες διαπιστώθηκε συµφωνία των αποτελεσµάτων τους (Rachamim και συν., 1991, Manciati και συν., 1995, Sideris και συν., 1999, Koutinas και συν., 2001) Β.2. Η θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου Η θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου στηρίχθηκε αρχικά στα δεδοµένα της θεραπευτικής αντιµετώπισης της σπλαγχνικής λεϊσµανίωσης του ανθρώπου και τα πρώτα φάρµακα που χρησιµοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό ήταν οι πεντασθενείς ενώσεις του αντιµονίου. Οι πεντασθενείς ενώσεις του αντιµονίου είναι περισσότερο αποτελεσµατικές και λιγότερο τοξικές από τις τρισθενείς, αν και για να δράσουν πρέπει να µετατραπούν στον οργανισµό στις τελευταίες (Goodwin και Page, 1943). Είναι δυνατόν να χορηγηθούν υποδόρια, ενδοµυϊκά και ενδοφλέβια (Caronia, 1916). Ο µηχανισµός δράσης τους παραµένει σε µεγάλο βαθµό αδιευκρίνιστος. Φαίνεται ότι το αντιµόνιο αναστέλλει τη δράση δύο 18

20 ενζύµων σηµαντικών για το µεταβολισµό του πρωτοζώου, και συγκεκριµένα της φωσφοφρουκτοκινάσης και της πυρουβικής δεϋδρογενάσης, διαταράσσοντας έτσι το σχηµατισµό ATP και GDP. Ο ενδοκυτταρικός στόχος τους είναι το γλυκοσωµάτιο του παρασίτου όπου παρεµβάλλονται στους µηχανισµούς της γλυκόλυσης και της οξείδωσης των λιπαρών οξέων, τουλάχιστον στις αµαστιγωτές µορφές του παρασίτου (Euzeby, 1982, Berman, 1988, WHO, 1990). Η φαρµοκοκινητική των πεντασθενών ενώσεων του αντιµονίου στο σκύλο µελετήθηκε σχετικά πρόσφατα (Tassi και συν., 1994, Valladares και συν., 1996). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα των ερευνών αυτών φαίνεται ότι η συγκέντρωση της αντιµονιακής µεγλουµίνης στο πλάσµα µειώνεται γρήγορα και είναι µικρότερη από τη ED 50 µέσα σε 240 λεπτά της ώρας µετά από την ενδοφλέβια χορήγησή της. Επιπλέον, δεν διαπιστώθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές στη φαρµακοκινητική της ουσίας µετά την εφάπαξ χορήγησή της σε υγιή ζώα και επαναλαµβανόµενες χορηγήσεις σε σκύλους µε λεϊσµανίωση, αν και η µέγιστη συγκέντρωσή της στο αίµα (Cmax) ήταν µεγαλύτερη στην περίπτωση των επαναλαµβανόµενων χορηγήσεων (Valladeres και συν., 1998). Η βιοδιαθεσιµότητα της αντιµονιακής µεγλουβίνης είναι περίπου ίδια µετά την ενδοµυϊκή ή την υποδόρια χορήγηση (91,7% και 92,2% αντίστοιχα). Περισσότερο από 80% του αντιµονίου αποβάλλεται από τους νεφρούς τις 9 πρώτες ώρες µετά τη χορήγησή του, µε αποτέλεσµα τη χαµηλή τοξικότητά του. Όταν όµως χορηγείται σε τακτά χρονικά διαστήµατα και για µεγάλο χρονικό διάστηµα µπορεί να παρατηρηθεί αθροιστική τοξίκωση λόγω συσσώρευσής της στον οργανισµό. Στις κυριότερες ανεπιθύµητες ενέργειας που µπορεί να παρατηρηθούν ύστερα από τη χορήγηση αντιµονιούχων στον άνθρωπο περιλαµβάνονται µυαλγία, αρθραλγία, ανορεξία και αύξηση της δραστηριότητας της αλανινο-αµινοτρανσφεράσης, της γαλακτικής δεϋδρογενάσης, της ασπαρτικής αµινοτρανσφεράσης και της αλκαλικής φωσφατάσης στον ορό του αίµατος (WHO, 1990). Έχουν επίσης αναφερθεί κεφαλαλγία, ναυτία, έµετος, πυρετός, νευρικότητα, αϋπνία, κνησµός, νεφροτοξικότητα και ηλεκτροκαρδιογραφικές µεταβολές (Veiga και συν., 19

21 1983, Chulay και συν., 1985). Στο σκύλο, οι ανεπιθύµητες ενέργειες αφορούν συχνότερα το σηµείο της ένεσης και ανάλογα µε την οδό χορήγησης µπορεί να είναι πόνος, εξοίδηση, δηµιουργία αποστήµατος (ενδοµυϊκή χορήγηση) ή φλεβίτιδας (ενδοφλέβια χορήγηση). Λόγω του έντονου πόνου στην περιοχή της έγχυσης συχνά παρατηρείται χωλότητα. Επίσης έχει αναφερθεί ιριδοκυκλίτιδα, πανοφθαλµία και σπανιότερα νεφροτοξίκωση (Slappendel και Teske, 1997). Οι τελευταίες ανεπιθύµητες ενέργειες δεν θα µπορούσαν να αποδοθούν αποκλειστικά και µόνο στη δράση του αντιµονίου, καθώς στην παθογένεια τους φαίνεται ότι υπεισέρχονται και ανοσολογικοί µηχανισµοί. Η δοσολογία, η οδός και η διάρκεια χορήγησης των ενώσεων του αντιµονίου ποικίλλουν ανάλογα µε τον ερευνητή, δεδοµένου ότι δεν υπάρχει κάποιο κοινά αποδεκτό θεραπευτικό πρωτόκολλο. Το γεγονός αυτό αφορά όχι µόνο τη χώρα µας αλλά και τις υπόλοιπες χώρες όπου ενδηµεί η λεϊσµανίωση του σκύλου και σε ένα βαθµό αντανακλά την προσπάθεια δηµιουργίας ενός καθολικά αποδεκτού θεραπευτικού πρωτόκολλου (Euzeby, 1988, Rierra, 1999). Πάντως, η χορήγηση των πεντασθενών ενώσεων του αντιµόνιου σε πολύ χαµηλές και µη αποτελεσµατικές δόσεις, λόγω του φόβου αθροιστικής τοξίκωσης, συντελεί στην ανάπτυξη ανθεκτικών σε αυτές στελεχών της L. infantum (WHO, 1990, Gramiccia και συν., 1992). Η χρησιµοποίηση των πεντασθενών ενώσεων του αντιµονίου εγκαψωµένων σε λιποσώµατα βασίσθηκε στην ιδιότητα των τελευταίων να συγκεντρώνονται εκλεκτικά στα µονοκύτταρα/µακροφάγα, όπου εντοπίζονται οι αµαστιγωτές µορφές του πρωτοζώου. Αναφέρεται ότι η in vitro αποτελεσµατικότητα της εγκαψωµένης µορφής του φαρµάκου είναι περίπου 700 φορές µεγαλύτερη από την απλή µορφή (Alving και συν., 1986) λόγω της φαγοκυττάρωσης των λιποσωµάτων από τα µολυσµένα µακροφάγα, της ενσωµάτωσής τους στο παρασιτοφόρο κενοτόπιο και συνεπώς της άµεσης επαφής του πρωτόζωου µε το αντιµόνιο. Η αποτελεσµατικότητα αυτή αποδόθηκε στο µεγάλο όγκο κατανοµής που εξασφαλίζει θεραπευτικές συγκεντρώσεις στους ιστούς όπου εντοπίζεται το πρωτόζωο και στην υψηλή µέση συγκέντρωση αντιµονίου στο αίµα (Valladares και συν., 2001). In vivo 20

22 όµως, τα λιποσώµατα, αν και επιτρέπουν τη χρησιµοποίηση συνολικά µικρότερης δόσης αντιµονιούχων, δεν αυξάνουν ουσιαστικά την αποτελεσµατικότητα της θεραπείας (Chapman και συν., 1984). Επίσης αναφέρεται ότι, µετά την αγωγή µε πεντασθενείς ενώσεις του αντιµονίου εγκαψωµένων σε λιποσώµατα δεν διαπίστωσαν υποτροπές για ένα χρόνο µετά τη λήξη της (Valladares και συν., 2001). Η αλλοπουρινόλη χρησιµοποιήθηκε αρχικά στην ιατρική του ανθρώπου για τη θεραπεία της ουρικής αρθρίτιδας. Εµπλέκεται στο µεταβολισµό των πουρινών αναστέλλοντας την ξανθινο-οξειδάση, µε συνέπεια την αναστολή της σύνθεσης του ουρικού οξέος και τη µείωση της συγκέντρωσής του στο πλάσµα του αίµατος και το ούρο. Τόσο η αλλοπουρινόλη όσο και το ριβονουκλεοσίδιο της µεταβολίζονται σε µονοφωσφορικό ριβονουκλεοσίδιο της αλλοπουρινόλης παρουσία του ενζύµου νουκλεοσιδοφωσφοτρανσφεράση του πρωτόζωου και στη συνέχεια φωσφορυλιώνονται µε τελικό προϊόν το τριφωσφορικό ριβονουκλεοσίδιο της αµινοπουρινόλης. Η ένωση αυτή, ως δοµικό ανάλογο της τριφωσφορικής αδενοσίνης (ΑΤP), ενσωµατώνεται στο RNA και οδηγεί σε αναστολή της σύνθεσης των πρωτεϊνών της Leishmania (Berens και συν., 1980). Η αναστολή του πολλαπλασιασµού του πρωτόζωου πραγµατοποιείται µέσω του µονοφωσφορικού ριβονουκλεοσιδίου της αλλοπουρινόλης, το οποίο δρα ανταγωνιστικά και αναστέλλει τη δράση ενζύµων, εµποδίζοντας µε τον τρόπο αυτό τη σύνθεση του ATP (Looker και συν., 1984). Η αλλοπουρινόλη έχει χορηγηθεί σε διάφορα δοσολογικά σχήµατα και για χρονικό διάστηµα µέχρι και 20 µηνών, µόνη της ή σε συνδυασµό µε τις πεντασθενείς ενώσεις του αντιµονίου, µε ποικίλα αποτελέσµατα. (Moritz και συν., 1998, Steuber και συν., 1998, Cavaliero και συν., 1999, Denerolle and Bourdoiseau, 1999). Συνήθως παρατηρείται κλινική βελτίωση αλλά το παράσιτο εξακολουθεί να ανευρίσκεται στο αίµα και το µυελό των οστών (Cavaliero και συν., 1999, Κoutinas και συν., 2001). Η χορήγηση της αλλοπουρινόλης σε συνδυασµό µε τις πεντασθενείς ενώσεις του αντιµονίου φαίνεται ότι δίνει καλύτερο 21

23 θεραπευτικό αποτέλεσµα σε σχέση µε τη χορήγηση καθενός από τα φάρµακα αυτά χωριστά (Denerolle και Bourdoiseau, 1999). Σε ότι αφορά τις ανεπιθύµητες ενέργειες, έχει αναφερθεί έµετος, διάρροια και σχηµατισµός ουρόλιθων ξανθίνης (Moritz, 1998). Τέλος, άλλοι ερευνητές (Ginel και συν., 1998) διαπίστωσαν ότι η περιοδική χορήγησή της, για χρονικό διάστηµα 10 έως 44 µηνών, µετά τη λήξη της αρχικής θεραπείας µε πεντασθενείς ενώσεις του αντιµονίου και την κλινική ίαση των σκύλων, ήταν αποτελεσµατική για τη αποφυγή των υποτροπών. Στις περιπτώσεις αυτές δεν εµφανίστηκαν ανεπιθύµητες ενέργειες. Η αµφοτερικίνη Β έχει χρησιµοποιηθεί ως αντιµυκητιακό στην ιατρική του ανθρώπου και των µικρών ζώων. Ο τρόπος δράσης της κατά του παρασίτου είναι παρόµοιος µε αυτόν κατά των µυκήτων και στηρίζεται στη σύνδεσή της µε την εργοστερόλη της κυτταρικής µεµβράνης τη σύνθεση της οποίας µεταβάλει, µε τελικό αποτέλεσµα την αύξηση της διαπερατότητάς της και τελικά το θάνατο του πρωτόζωου (Taboada και Grookers, 2001). Αποτελέσµατα in vitro και in vivo µελετών σε πειραµατόζωα και ανθρώπους δείχνουν ότι επιπλέον η αµφοτερικίνη Β ενεργοποιεί τα µακροφάγα, αυξάνοντας τη φαγοκυτταρική τους ικανότητα (Lin και συν., 1977, Lamothe, 1997). Επίσης αναφέρεται ότι η αµφοτερικίνη B είναι ιδιαίτερα αποτελεσµατική στη θεραπεία της σπλαγχνικής λεϊσµανίωσης του ανθρώπου, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις υποτροπών µετά τη χορήγηση των αντιµονιούχων και σε ασθενείς µε AIDS (Olliaro και Bryceson, 1993, Walker και συν., 1998). Ωστόσο, η χρησιµοποίηση της αµφοτερικίνης Β στη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου είναι σχετικά περιορισµένη λόγω της νεφροτοξικότητας και του υψηλού κόστους της. Άλλες ανεπιθύµητες ενέργειες, µετά την ενδοφλέβια χορήγησή της είναι η φλεβίτιδα και περιφλεβίτιδα σε περίπτωση περιαγγειακής διαφυγής. Επίσης έχει αναφερθεί και ιριδοκυκλίτιδα λόγω της ανοσολογικής διέγερσης από την απότοµη και µαζική ελευθέρωση παρασιτικών αντιγόνων (Lamothe, 1996). Η χορήγηση σκευασµάτων αµφοτερικίνης Β εγκαψωµένης σε λιποσώµατα ή σε συµπλέγµατα µε λιπίδια φαίνεται ότι συντελεί στη µείωση της νεφροτοξικότητας. Τα σκευάσµατα αυτά χρησιµοποιήθηκαν για τη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου µε 22

24 ικανοποιητικά αποτέλεσµατα αναφορικά µε την κλινική ίαση, χωρίς όµως να επιτυγχάνεται πάντοτε παρασιτολογική ίαση και να αποφεύγονται οι υποτροπές (Oliva και συν., 1995, Moreno και συν., 1999, Lamothe, 2001). Άλλα φάρµακα που έχουν χρησιµοποιηθεί στη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου είναι η πενταµιδίνη, η οποία χορηγήθηκε σε µικρό αριθµό σκύλων µε µάλλον φτωχά αποτελέσµατα (Rhalem και συν., 1999, Baneth και Shaw, 2002), η κετοκοναζόλη µε τρόπο δράσης αλλά και ανεπιθύµητες ενέργειες παρόµοιες µε αυτές της αµφοτερικίνης Β (d Ambrosio και συν., 1987) και η µιλτεφοσίνη. Η τελευταία είναι αντινεοπλασµατικό φάρµακο µε αντιλεϊσµανιακή δράση που έχει µελετηθεί in vitro και in vivo σε ποντικούς (Le Fichoux και συν., 1998, Schmidt-Ott και συν., 1999). Στην Ινδία χρησιµοποιήθηκε επιτυχώς για τη θεραπεία της σπλαγχνικής λεϊσµανίωσης του ανθρώπου (Jha TK και συν., 1999) ενώ ελέγχθηκε η αποτελεσµατικότητά της και στη λεϊσµανίωση του σκύλου (Virbac 2001, προσωπική επικοινωνία). Β.3. Η αµινοσιδίνη Η αµινοσιδίνη (παροµοµυκίνη, µονοµυκίνη) είναι αντιµικροβιακή ουσία, δραστική κυρίως κατά των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, που ανήκει στην οµάδα των αµινογλυκοσιδών. Ο τρόπος δράσης της είναι παρόµοιος µε των άλλων αµινογλυκοσιδικών αντιβιοτικών και συνίσταται στη σύνδεσή της µε την υποοµάδα 30S ή 50S του ριβοσώµατος του βακτηριακού κυττάρου σε αερόβιες συνθήκες, προκαλώντας εσφαλµένη ενσωµάτωση αµινοξέων στα πεπτίδια και τελικά αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης (Ballarini, 1993). Σε ότι αφορά την αντιλεϊσµανιακή της δράση, φαίνεται ότι η αµινοσιδίνη επιδρά τόσο στη µακροµοριακή σύνθεση όσο και στις ιδιότητες της µεµβράνης του πρωτόζωου. Συγκεκριµένα, αρχικά αναστέλλει τη σύνθεση του RNA και στη συνέχεια την 23

25 πρωτεϊνοσύνθεση του πρωτόζωου. Επιπλέον, προκαλεί µεταβολές στα λιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης προκαλώντας έτσι διαταραχή στη διαπερατότητά της (Maarouf και συν., 1997). H φαρµακοκινητική της αµινοσιδίνης δεν διαφέρει από αυτή των άλλων αµινογλυκοσιδών (Βrown και Riviere, 1991) και είναι παρόµοια στο σκύλο, στο µόσχο και στο άλογο (Ballarini, 1993, Βelloli και συν., 1996). Επιπλέον, η αµινοσιδίνη παρουσιάζει ικανοποιητική κατανοµή στους ιστούς του σκύλου, ενώ δεν υπάρχουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές στις τιµές των φαρµακοκινητικών παραµέτρων µετά την ενδοµυϊκή ή την υποδόρια χορήγησή της. Η µέγιστη συγκέντρωση στο πλάσµα είναι 30 µg/ml και ανιχνεύεται µία ώρα µετά τη χορήγησή της στη δόση των 15 mg/kg σ.β. (Βelloli και συν., 1996). Η αµινοσιδίνη, όπως και οι υπόλοιπες αµινογλυκοσίδες, δεν χρησιµοποιούνται συχνά στην κλινική πράξη, λόγω των συχνών τους ανεπιθύµητων παρενεργειών (νεφροτοξικότητα, ωτοτοξικότητα), που οφείλονται στη συσσώρευση συµπλεγµάτων αµινογλυκοσίδης και φωσφολιπιδίων στα κύτταρα στόχους (επιθηλιακά κύτταρα εγγύς σπειροειδούς σωληναρίου στο νεφρό, τριχωτά κύτταρα του οργάνου του Corti και του κοχλιακού πόρου στο έσω ούς). Η αντιλεϊσµανιακή δράση της αµινοσιδίνης κατά των προµαστιγωτών και αµαστιγωτών µορφών της L. major διαπιστώθηκε αρχικά σε in vitro δοκιµασίες (Mattock και Peters, 1975, El-On και Greenblatt, 1983). Σε µελέτη για την ευαισθησία διαφορετικών ειδών του γένους Leishmania στην αµινοσιδίνη, η L. major και η L. tropica, καθώς τα περισσότερα στελέχη της L. donovani ήταν ευαίσθητα, ενώ ορισµένα στελέχη της τελευταίας ήταν περισσότερο ευαίσθητα στο συνδυασµό της µε τα αντιµονιούχα (Neal και συν., 1995). Επίσης, σε in vitro συγκριτική µελέτη της δράσης διαφόρων χηµειοθεραπευτικών ουσιών κατά της προµαστιγωτής µορφής στελεχών του γένους Leishmania παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης που ήταν µεγαλύτερη του 70% στο στέλεχος της L. major, 35-70% στα στελέχη των L. infantum και L. mexicana και µικρότερη του 35% στο στέλεχος της L. tropica, σε συγκέντρωση αµινοσιδίνης 81 µμ (Τζώρα-Σκούφου, 1992). 24

26 Ιn vivo η αµινοσιδίνη χρησιµοποιήθηκε αρχικά για την τοπική θεραπεία των δερµατικών αλλοιώσεων πειραµατικά µολυσµένων ποντικών µε L. major (Kellina και συν., 1966, El-On και συν., 1984). Για το σκοπό αυτό, µάλιστα, αναφέρεται ότι ο συνδυασµός της µε τη γενταµικίνη έχει καλύτερα αποτελέσµατα (Grogl και συν., 1999). Αργότερα δοκιµάστηκε η αποτελεσµατικότητά της στη θεραπεία της σπλαχνικής λεϊσµανίωσης του ανθρώπου, σε χώρες της Αφρικής αλλά και της Ευρώπης (Chunge και συν., 1990, Scott και συν., 1992). Σε συγκριτική µελέτη που έγινε στην Ινδία, όπου η ανθεκτικότητα των στελεχών της L. donovani στις πεντασθενείς ενώσεις του αντιµόνιου είναι εκτεταµένη, διαπιστώθηκε ότι η αµινοσιδίνη, στη δόση των 16 ή 20 mg/kg σ.β., ενδοµυϊκά, µία φορά την ηµέρα και για 21 συνεχείς ηµέρες, αποτελεί το φάρµακο επιλογής για τη θεραπεία της σπλαχνικής λεϊσµανίωσης, ενώ σε ότι αφορά την ασφάλειά της δεν παρατηρήθηκε σηµαντικού βαθµού ωτοτοξικότητα ή νεφροτοξικότητα (Jha, 1998). Τα αποτελέσµατα των κλινικών µελετών όσον αφορά την αποτελεσµατικότητα της αµινοσιδίνης στη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου ποικίλλουν, γεγονός που οφείλεται στην ποικιλία των δοσολογικών σχηµάτων και των οδών χορήγησής της, στην ταυτόχρονη ή µη χρησιµοποίηση πεντασθενών ενώσεων του αντιµόνιου, στα διαφορετικά κριτήρια αξιολόγησης της αποτελεσµατικότητας (κλινική ή παρασιτική ίαση ή απλή µείωση του τίτλου των αντισωµάτων) και στη χρονική περίοδο παρακολούθησης των ζώων µετά το τέλος της θεραπείας. Επιπλέον, όταν πρόκειται για φυσικά περιστατικά λεϊσµανίωσης, το αποτελέσµατα επηρεάζονται και από το στάδιο του νοσήµατος, και ενδεχοµένως από την ηλικία και τη φυλή των σκύλων (Solano-Gallego και συν., 2001). Οι διαφορές των µέχρι σήµερα δηµοσιευµένων µελετών, σε ότι αφορά τουλάχιστον τα δοσολογικά σχήµατα που χρησιµοποιήθηκαν, φαίνονται στον Πίνακα 1. 25

27 Πίνακας 1. οσολογικά σχήµατα της αµινοσιδίνης που έχουν χρησιµοποιηθεί για τη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου (L. infantum) ΑΡΙΘΜΟΣ ΟΣOΛΟΓΙΑ Ο ΟΣ ΙΑΡΚΕΙΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΣΚΥΛΩΝ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΑΓΩΓΗΣ ΠΗΓΗ 4 21 mg/kg σ.β./24 h im ή sc 14 ηµέρες Persechino, mg/kg σ.β./24 h im ή sc 21 ηµέρες Persechino, ,5 mg/kg σ.β./12 h im ή sc 14 ηµέρες Persechino, ,5 mg/kg σ.β./12 h im ή sc 21 ηµέρες Persechino, ,5 mg/kg σ.β./24 h im ή sc 21 ηµέρες Persechino, ,25 mg/kg σ.β./12 h im ή sc 21 ηµέρες Persechino, mg/kg σ.β./12 h sc 4 εβδοµάδες Poli και συν., mg/kg σ.β./24 h im 15 ηµέρες Vexenat και συν., mg/kg σ.β./24 h im 20 ηµέρες Vexenat και συν., mg/kg σ.β./24h im 30 ηµέρες Vexenat και συν., ,25 mg/kg σ.β./12 h sc 21 ηµέρες Oliva και συν., ,25 mg/kg σ.β./12 h sc 21 ηµέρες Liege, 1999 im: ενδοµυϊκή χορήγηση sc: υποδόρια χορήγηση Σε όλες τις παραπάνω µελέτες, ανεξάρτητα από το δοσολογικό σχήµα, παρατηρήθηκε κλινική βελτίωση και µείωση του τίτλου των αντισωµάτων. Όσον αφορά τον έλεγχο της παρασιτικής ίασης, χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικές και κατά συνέπεια µη συγκρίσιµες µέθοδοι. Ανεξάρτητα όµως από αυτό, πλήρης παρασιτολογική ίαση και µάλιστα για 4 χρόνια µετά τη λήξη της αγωγής αναφέρεται µόνο µετά τη χορήγηση της αµινοσιδίνης στη δόση των 26

28 40 mg/kg σ.β. για διάστηµα ενός µήνα (Vexenat και συν., 1998), ενώ στις περισσότερες περιπτώσεις διαπιστώθηκε απλά η µείωση του αριθµού των παρασίτων. Σε ότι αφορά την τοξικότητα (νεφροτοξικότητα-ωτοτοξικότητα) αυτή είναι περιορισµένη και κυρίως διαπιστώνεται σε σκύλους µε προϋπάρχουσες νεφρικές αλλοιώσεις ή όταν χρησιµοποιείται στη δόση των 80 mg/kg σ.β. (Vexenat και συν., 1998, Poli και συν., 1997, Oliva και συν., 1998, Liege, 1999). Στις κλινικές µελέτες, ο καθορισµός τόσο της δόσης όσο και της συχνότητας χορήγησης (κάθε 12 ή 24 ώρες) ήταν εµπειρικός. Λόγω του µικρού χρόνου ηµίσειας ζωής τους (2 ώρες), τα αµινογλυκοσιδικά αντιβιοτικά χορηγούνταν κατά το παρελθόν δύο ή τρεις φορές ηµερησίως, µε στόχο να επιτυγχάνονται θεραπευτικές συγκεντρώσεις στο πλάσµα του αίµατος για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα (Brown και Riviere, 1991). Ωστόσο, νεότερες φαρµακοκινητικές-φαρµακοδυναµικές µελέτες των ουσιών αυτών ανέτρεψαν τις παραπάνω απόψεις, αφού διαπιστώθηκε (Hustinx και Hoepelman, 1993) ότι η βακτηριοκτόνος δράση τους εξαρτάται από τη µέγιστη συγκέντρωσή τους στο πλάσµα του αίµατος και ότι χαρακτηρίζονται από µετά το αντιµικροβιακό δράση (PAE). Συνεπώς, η αποτελεσµατικότητα των αµινογλυκοσιδών εξαρτάται από τη δόση και όχι από το χρόνο κατά τον οποίο η συγκέντρωσή τους στο πλάσµα του αίµατος είναι µεγαλύτερη από την ελάχιστη συγκέντρωση των αµινογλυκοσιδών που αναστέλλει την ανάπτυξη µικροοργανισµών (MIC), ενώ η PAE επηρεάζεται άµεσα (Isaksson και συν., 1988) από τη µέγιστη βακτηριοκτόνο συγκέντρωση (MBC). Επιπλέον, διάφορες κλινικές µελέτες αποδεικνύουν ότι µε την κάθε 24 ώρες χορήγηση µειώνεται σηµαντικά η πιθανότητα εµφάνισης τοξίκωσης σε σχέση µε τη χορήγηση της ίδιας συνολικής ηµερήσιας δόσης σε επιµέρους δόσεις κάθε 8 ή 12 ώρες (Frame και συν., 1977, Maglio και συν., 2002). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι το θεραπευτικό σχήµα της εφάπαξ χορήγησης ηµερησίως στη µέγιστη µη τοξική δόση είναι το ίδιο ή και αποτελεσµατικότερο και ταυτόχρονα ασφαλέστερο, τουλάχιστον σε ότι αφορά τις βακτηριακές λοιµώξεις. Μάλιστα, όταν τα δοσολογικά αυτά σχήµατα χρησιµοποιήθηκαν σε ζώα που δεν παρουσίαζαν ανοσοανεπάρκεια, παρατηρήθηκε ότι τα βακτήρια ήταν 27

29 περισσότερο ευαίσθητα στη φαγοκυττάρωση και την ενδοκυτταρική καταστροφή και εποµένως ότι το ανοσοποιητικό τους σύστηµα ήταν ικανό να συνεισφέρει στη µείωση του βακτηριακού φορτίου, ακόµα και την περίοδο που οι συγκεντρώσεις του φαρµάκου ήταν χαµηλές (Maglio και συν., 2002). Ενθαρρυντικά ήταν επίσης και τα αποτελέσµατα των Hustinx και Hoepelman (1993), αν και απαιτούνται περισσότερες µελέτες για να επιβεβαιωθεί ότι το σχήµα της εφάπαξ χορήγησης ηµερησίως είναι εξίσου αποτελεσµατικό και σε ζώα µε ανοσοκαταστολή (Rozdinski και συν., 1993, Mac Gowan και συν., 1994). Συνοψίζοντας φαίνεται ότι: Η αµινοσιδίνη είναι αποτελεσµατική in vitro κατά της Leishmania spp. Η χορήγηση της αµινοσιδίνης έχει πολύ καλά θεραπευτικά αποτελέσµατα στον άνθρωπο µε σπλαγχνική λεϊσµανίωση. Η χορήγηση της αµινοσιδίνης µία φορά ηµερησίως είναι περισσότερο αποτελεσµατική και ασφαλής σε σχέση µε τη χορήγηση της ίδιας δόσης διαιρούµενης κάθε 12 ή κάθε 8 ώρες. Ειδικότερα, σε ότι αφορά την αντιµικροβιακή δράση, ο έλεγχος της αποτελεσµατικότητας διερευνάται σε ζώα φυσικά ή πειραµατικά µολυσµένα και όχι σε υγιή, όπως συµβαίνει µε τα φάρµακα που τροποποιούν τις φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισµού (Lees και Shojaee Aliabadi, 2002). Στις κλασικές µελέτες αποτελεσµατικότητας και προκειµένου για τον καθορισµό του βέλτιστου δοσολογικού σχήµατος χρησιµοποιείται ένας περιορισµένος αριθµός σχηµάτων και συγκριτικά αξιολογείται το καλύτερο. Είναι φανερό ότι όσο αυξάνεται ο αριθµός των δοσολογικών σχηµάτων που συγκρίνονται µεταξύ τους, βελτιώνεται και η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων, αλλά κάτι τέτοιο δεν είναι συνήθως οικονοµικά εφικτό και ηθικά αποδεκτό (Lees και Shojaee Aliabadi, 2002, Toutain και συν., 2002). Με τη φαρµακοκινητική µελέτη περιγράφονται και προβλέπονται οι µεταβολές των συγκεντρώσεων του φαρµάκου ή/και των µεταβολιτών του στον οργανισµό, ενώ µε τη 28

30 φαρµακοδυναµική µελετάται η επίδρασή του στην οµοιοστασία του οργανισµού, οι βιοχηµικές µεταβολές που προκαλεί, ο τρόπος δράσης του και ο συσχετισµός µεταξύ των συγκεντρώσεών του στους ιστούς και του θεραπευτικού αποτελέσµατος. Προκειµένου για τα αντιµικροβιακά φάρµακα, η συσχέτιση των αποτελεσµάτων των φαρµακοκινητικών και φαρµακοδυναµικών µελετών σκοπό έχει την περιγραφή, την πρόβλεψη και την όσο το δυνατόν κατανόηση του θεραπευτικού αποτελέσµατός τους σε σχέση µε το δοσολογικό σχήµα (Τoutain, 2003). Επιπλέον επιτυγχάνεται καλύτερη προσαρµογή του δοσολογικού σχήµατος, επειδή η φαρµακοκινητική/φαρµακοδυναµική προσέγγιση του θέµατος, περιλαµβάνει τις δύο µεγάλες πηγές µεταβλητότητας, στο ίδιο άτοµο και µεταξύ των ατόµων (Schentag και συν., 1985). Ειδικότερα, στην περίπτωση της λεϊσµανίωσης του σκύλου η µελέτη της κλινικής φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης παρουσιάζει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον λόγω: α) της ύπαρξης ενθαρρυντικών δεδοµένων από τις φαρµακοδυναµικές ιδιότητες της ουσίας αυτής κατά της Leishmania spp., β) της µεγάλης ποικιλοµορφίας των κλινικών εκδηλώσεων του νοσήµατος που ενδεχοµένως επηρεάζουν τη φαρµακοκινητική της αµινοσιδίνης, γ) της έλλειψης γενικά αποδεκτής και αποτελεσµατικής αγωγής αναφοράς και δ) του περιορισµένου αριθµού φαρµακοκινητικών µελετών της αµινοσιδίνης στο σκύλο. Στο δεύτερο µέρος της διατριβή αυτής µελετάται η φαρµακοκινητική της αµινοσιδίνης σε υγιείς και σε φυσικώς µολυσµένους σκύλους µε λεϊσµανίωση, καθώς επίσης και η αποτελεσµατικότητα και η ασφάλεια του φαρµάκου. Αναλυτικότερα σκοπός του δεύτερου τµήµατος της διατριβής αυτής ήταν: α) η συγκριτική µελέτη της φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης σε υγιείς και σε φυσικώς µολυσµένους σκύλους µε λεϊσµανίωση, β) η µελέτη της βιοδιαθεσιµότητας της αµινοσιδίνης µετά την υποδόρια χορήγησή της και γ) η διερεύνηση της κλινικής φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης και συγκεκριµένα ο έλεγχος της αποτελεσµατικότητας και της ασφάλειάς της, µε κριτήρια την κλινική βελτίωση ή ίαση, την επιδείνωση ή όχι της νεφρικής λειτουργίας, το 29

31 αποτέλεσµα των ορολογικών δοκιµασιών και την εµφάνιση ή όχι του πρωτόζωου, µετά από τη χορήγησή της στη δόση των 15 mg/kg σ.β., µία φορά ηµερησίως και για 21 συνεχείς ηµέρες σε σκύλους φυσικώς µολυσµένους από Leishmania σκύλους. 30

32 2. ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ 2.Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΣΜΑΝΪΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Α.1 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.Α.1.1.Περιοχή της έρευνας Η επιζωοτιολογική διερεύνηση της λεϊσµανίωσης του σκύλου αφορούσε στους νοµούς: Αττικής, Έβρου, Ευβοίας, Ευρυτανίας, Ιωαννίνων, Σερρών και Φλώρινας. Η γεωγραφική θέση και η διαµόρφωση του εδάφους κάθε νοµού φαίνεται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 2. Γεωγραφική θέση και διαµόρφωση του εδάφους των νοµών της έρευνας. ΘΕΣΗ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ Ε ΑΦΟΥΣ ΝΟΜΟΣ ΠΑΡΑΛΛΗΛΟΙ ΜΕΣΗΜΒΡΙΝΟΙ ΟΡΕΙΝΟ ΗΜΙΟΡΕΙΝΟ ΠΕ ΙΝΟ Αττικής 37 ο 47 Β - 38 ο 05 Β 23 ο 36 Β - 23 ο 50 Β 7,2% 61,6% 31,2% Έβρου 40 ο 28 Β - 41 ο 45 Β 25 ο 37 Α - 26 ο 38 Α 10% 29,3% 60,7% Ευβοίας 39 ο 03 Β - 38 ο 51 Β 22 ο 57 Α - 24 ο 42 Α 37% 33,4% 29,6% Ευρυτανίας 38 ο 40 Β - 39 ο 17 Β 21 ο 21 Α - 21 ο 56 Α κυρίως κυρίως ελάχιστο Ιωαννίνων 39 ο 15 Β - 40 ο 24 Β 20 ο 13 Α - 29 ο 19 Α 88,4% 5% 6,6% Σερρών 40 ο 45 Β - 41 ο 25 Β 22 ο 52 Α - 24 ο 00 Α 34,3% 6,2% 59,5% Φλώρινας 40 ο 56 Β - 40 ο 32 Β 20 ο 57 Α - 21 ο 50 Α 60,8% 13,2% 26% Η Ελλάδα έχει µεσογειακό κλίµα, το οποίο διαφοροποιείται αρκετά ανάµεσα στη Βόρεια και τη Νότια Ελλάδα. Τα χαρακτηριστικά του κλίµατος των περιοχών από όπου ελήφθησαν τα δείγµατα στην παρούσα µελέτη είναι συνοπτικά τα εξής: 31

33 1) Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του αττικού κλίµατος είναι η έλλειψη θερινών βροχών. Η Αττική δέχεται γενικά τις λιγότερες βροχοπτώσεις από όλες τις περιοχές της Ελλάδας. Κατά τη χειµερινή περίοδο εµφανίζει τα χαρακτηριστικά του κλίµατος των υποτροπικών ζωνών των υψηλών πιέσεων. Αυτό σηµαίνει ότι χαρακτηρίζεται από µικρά ετήσια ύψη βροχής, βροχερή περίοδο, κυρίως το χειµώνα, και ξηρά περίοδο, κυρίως το καλοκαίρι, από καλοκαίρια θερµά ή και καυστικά, από χειµώνες ήπιους, που συχνά τους διακόπτουν περίοδοι πολύ καλού ή κακού καιρού, από µεγάλη ηλιοφάνεια, ιδίως κατά τη θερµή περίοδο του έτους (Απρίλιος- Σεπτέµβριος) και, τέλος, από εποχές άνοιξης και φθινοπώρου πολύ µικρής διάρκειας. Το κλίµα της Αττικής επηρεάζεται και από παράγοντες που είναι γνωστοί ως παράγοντες αστικού κλίµατος. Τέτοιοι παράγοντες είναι η έκταση της πόλης, η κατανοµή του οικοδοµικού όγκου στο χώρο της, η φύση των δοµικών υλικών, το πλάτος, το µήκος και ο προσανατολισµός των δρόµων και των πεζοδροµίων, η έκταση και η διασπορά των χώρων πρασίνου, η πυκνότητα του πληθυσµού, η φύση, ο αριθµός, το µέγεθος και η διασπορά των πηγών ενεργείας και ατµοσφαιρικής ρύπανσης. 2) Το κλίµα του νοµού Έβρου είναι ηπειρωτικό µε µεγάλες θερµικές αντιθέσεις, εκτός από την παραλιακή ζώνη που δέχεται την ευεργετική επίδραση της θάλασσας. Επειδή δεν υπάρχουν φυσικά εµπόδια στο Βορρά, ο νοµός είναι εκτεθειµένος στους βόρειους χειµερινούς ανέµους, που κατεβαίνουν από τη Βαλκανική και την Ουκρανία και φθάνουν, µέσω της κοιλάδας του Έβρου, µέχρι το Αιγαίο. Οι χιονοπτώσεις είναι πολύ συχνές και έντονες, κυρίως στα βόρεια του νοµού. 3) Η Εύβοια έχει εύκρατο κλίµα µε δροσερά καλοκαίρια και ήπιους χειµώνες, επειδή περιβρέχεται από θάλασσα. 4) Το κλίµα του νοµού Ευρυτανίας είναι ηπειρωτικό µε χαµηλές θερµοκρασίες το χειµώνα, αλλά δροσερά καλοκαίρια. Αυτό οφείλεται γενικά στο µεγάλο υψόµετρό του, αλλά και στο γεγονός ότι οι πολλές οροσειρές του εµποδίζουν να φθάσει έως εκεί κάθε θαλάσσια επίδραση. Το Καρπενήσι καλύπτεται µε χιόνια δύο και πλέον µήνες το χρόνο. Εξάλλου, λόγω 32

34 της παρουσίας µεγάλων δασών κωνοφόρων, βαλανιδιάς, οξιάς και καστανιάς, το ύψος βροχής είναι µεγάλο. 5) Το κλίµα του νοµού Ιωαννίνων διαµορφώνεται σταδιακά από θαλάσσιο µεσογειακό σε ηπειρωτικό. Το χειµώνα και το φθινόπωρο επικρατούν βόρειοι και νοτιοδυτικοί άνεµοι, ενώ το καλοκαίρι δυτικοί και βορειοδυτικοί. 6) Το κλίµα του νοµού Σερρών είναι ηπειρωτικό, µε κρύους χειµώνες και θερµά καλοκαίρια, επειδή το ανάγλυφο κοντά στις ακτές του δεν είναι ιδιαίτερα οµαλό, µε αποτέλεσµα οι ανατολικές απολήξεις του Κερδύλιου Όρους και οι νοτιοδυτικές απολήξεις του Παγγαίου να παρεµποδίζουν σε µεγάλο βαθµό την ευεργετική επίδραση της θάλασσας. Ταυτόχρονα παρατηρούνται αξιόλογες βροχοπτώσεις, αλλά και υψηλή υγρασία κατά το χειµώνα. 7) Το κλίµα του νοµού Φλώρινας είναι έντονα ηπειρωτικό, µε ψυχρούς χειµώνες και θερµά καλοκαίρια, επειδή ολόκληρη η έκτασή του είναι αποµακρυσµένη και αποµονωµένη από τη θάλασσα. Οι διακυµάνσεις της θερµοκρασίας µεταξύ χειµώνα και θέρους είναι σηµαντικές, ενώ κατά τη διάρκεια του χειµώνα οι χιονοπτώσεις είναι πολύ συνηθισµένες και η θερµοκρασία τόσο στην πόλη της Φλώρινας όσο και στις υπόλοιπες περιοχές πέφτει συχνά κάτω από τους 0 ο C. Γενικά, ο νοµός Φλώρινας είναι ίσως η περιοχή µε το πιο έντονα ηπειρωτικό κλίµα σε ολόκληρο τον ελληνικό χώρο. 2.Α.1.2. Καταγραφή µετεωρολογικών στοιχείων Για τη διερεύνηση της επίδρασης των κλιµατολογικών χαρακτηριστικών στην µόλυνση από L. infantum (ποσοστό οροθετικών) έγινε επεξεργασία στοιχείων που ελήφθησαν από την Εθνική Μετεωρολογική Υπηρεσία για το έτος που συλλέχθηκαν οι οροί (1999). Τα στοιχεία αφορούσαν στη θερµοκρασία, την υγρασία και το ύψος των βροχοπτώσεων. 33

35 2.Α.1.3. Περιγραφή του δείγµατος Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα ορού αίµατος από 2620 σκύλους που προέρχονταν από 7 γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας. Οι σκύλοι που συµπεριελήφθησαν στη µελέτη είχαν ιδιοκτήτη, ήταν κλινικώς υγιείς την ηµέρα της δειγµατοληψίας και δεν είχαν ιστορικό λεϊσµανίωσης. Το µέγεθος του δείγµατος καθορίστηκε έτσι ώστε να περιλαµβάνει τουλάχιστον το 2% των εκτιµούµενων σκύλων κάθε περιοχής. Ο συνολικός πληθυσµός κάθε περιοχής προήλθε από στοιχεία των Κτηνιατρικών και Υγειονοµικών υπηρεσιών. Έτσι από το Νοµό Αττικής συλλέχθηκαν δείγµατα (38,39% του συνολικού αριθµού των δειγµάτων), από το Νοµό Έβρου 416 (15,87% των δειγµάτων), 140 από το Νοµό Ευβοίας (5,34% των δειγµάτων), 200 από το Νοµό Ευρυτανίας (7,63% των δειγµάτων), 233 από το Νοµό Ιωαννίνων (8,89% των δειγµάτων), 479 από το Νοµό Σερρών (18,28% των δειγµάτων) και 146 από το Νοµό Φλώρινας (5,57% του συνολικού αριθµού των δειγµάτων). Εκτός από την κλινική εξέταση και την αιµοληψία καταγράφονταν για κάθε σκύλο, το γένος, η ηλικία, ο τύπος του τριχώµατος, η φυλή και η χρησιµότητα του ζώου. Σύµφωνα µε την ηλικία (όπως αυτή αναφερόταν από τον ιδιοκτήτη) οι σκύλοι χωρίστηκαν σε 4 οµάδες: 1) οµάδα Α (µέχρι και την ηλικία του ενός έτους), 2) οµάδα Β (µεγαλύτερα από ενός έτους έως και 3 ετών), 3) οµάδα Γ (µεγαλύτερα από 3 ετών έως και 9 ετών) και 4) οµάδα (µεγαλύτερα των 9 ετών). Τέλος ανάλογα µε τη χρησιµότητά τους, οι σκύλοι χωρίστηκαν σε κυνηγετικούς, σε φύλακες και σε συντροφιάς. Ο διαχωρισµός αυτός στηρίχθηκε στη φυλή του ζώου και στη δήλωση του ιδιοκτήτη. 34

36 2.Α.1.4 Ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της L. infantum 2.Α οκιµασία ΙFAT Η παρουσία αντισωµάτων κατά της L. infantum προσδιορίσθηκε µε τη δοκιµασία IFAT. Χρησιµοποιήθηκαν έτοιµες πλάκες ανοσοφθορισµού των 10 βοθρίων µε µονιµοποιηµένο αντιγόνο (Fluoleish, Bvt, Biovetotest Diagnostic Veterinaire, France). Κάθε δείγµα ορού αραιωνόταν 1/100 σε απιονισµένο νερό µε PBS (Βiochrom, Dulbecco, Germany). Σε κάθε βοθρίο τοποθετούνταν 10 µl αραιωµένου ορού και οι πλάκες επωάζονταν στους 37ºC και σε αυξηµένη σχετική υγρασία για 30 λεπτά της ώρας. Στην συνέχεια γινόταν δύο εκπλύσεις µε εµβάπτιση και ανατάραξη για 5 λεπτά της ώρας σε απιονισµένο νερό µε PBS και ακολούθως µόνο σε απιονισµένο νερό και αφήνονταν να στεγνώσουν σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθούσε η τοποθέτηση 20 µl συζεύγµατος (Antidog IgG, Sigma), αραιωµένου 1:32 σε PBS και στη συνέχεια η ίδια διαδικασία επώασης, εκπλύσεων και στεγνώµατος. Τέλος, ύστερα από προσθήκη γλυκερίνης και κάλυψη των πλακών µε κατάλληλες καλυπτρίδες, γινόταν η εξέταση σε σκοτεινό θάλαµο µε µικροσκόπιο υπεριώδους ακτινοβολίας (Χ400). Θετικό θεωρούνταν το αποτέλεσµα όταν υπήρχε σαφής φθορισµός στην αρχική αυτή αραίωση (1/100). Στα θετικά δείγµατα γίνονταν περαιτέρω αραιώσεις (1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 κλπ) για τον ακριβή προσδιορισµό του τίτλου των αντισωµάτων. 2.Α οκιµασία ELISA Η παρουσία αντισωµάτων κατά της L. infantum ανιχνεύθηκε και µε τη δοκιµασία ΕLISA. Χρησιµοποιήθηκαν έτοιµες πλάκες (παραχωρήθηκαν από το Κέντρο Ευκαιριακών Λοιµώξεων) µε µονιµοποιηµένο αντιγόνο (παραχωρήθηκε από το Ινστιτούτο Παστέρ Αθηνών). Κάθε δείγµα ορού αραιωνόταν 1/200 σε απιονισµένο νερό µε PBS (Βiochrom, 35

37 Dulbecco, Germany). Σε κάθε βοθρίο τοποθετούνταν 100 µl αραιωµένου ορού και οι πλάκες επωάζονταν στους 37ºC για 90 λεπτά της ώρας. Στη συνέχεια γινόταν τρείς εκπλύσεις και ακολουθούσε η τοποθέτηση σε κάθε βοθρίο 100 µl συζεύγµατος (Antidog IgG, Sigma, συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση), αραιωµένου 1:1000 σε PBS. Μετά από επώαση 90 λεπτών της ώρας στους 37ºC και έκπλυση, τοποθετούνταν σε κάθε βοθρίο 100 µl διαλύµατος p-nitrophenyl phosphate (Sigma) σε 0,05 M carbonate/bicarbonate και 1 mm ρυθµιστικoύ διαλύµατος MgCl 2. Οι πλάκες επωάζονταν στους 37ºC για 10 λεπτά της ώρας και η αντίδραση σταµατούσε µε την προσθήκη σε κάθε βοθρίο 50 µl 3M NaOH. Η ανάγνωση της απορρόφησης γινόταν στα 405 nm. Ο καθορισµός των θετικών (cut off) έγινε ύστερα από ειδική επεξεργασία (cluster analysis) που έγινε από το Κέντρο που παραχώρησε το αντιγόνο (Greiner και συν., 1994). 2.Α.1.5. Στατιστική επεξεργασία Για τη σύγκριση των ποσοστών των οροθετικών σκύλων στις 7 διαφορετικές περιοχές καθώς και για τη σύγκριση µεταξύ διαφορετικών οµάδων ανάλογα µε το φύλο, την ηλικία, το µήκος του τριχώµατος και τη χρησιµότητα των ζώων, χρησιµοποιήθηκε ο Pearson χ 2 έλεγχος (Κτενάς 1992). Για τη διερεύνηση των διαφορών µεταξύ των µετεωρολογικών συνθηκών και συγκεκριµένα της θερµοκρασίας, της υγρασίας και του ύψους των βροχοπτώσεων χρησιµοποιήθηκε η απλή (ΑΝΟVA) ανάλυση διακύµανσης και στη συνέχεια η πολλαπλή (MANOVA) ανάλυση διακύµανσης (Κτενάς 1992). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε σε προσωπικό υπολογιστή µε χρήση του προγράµµατος SPSS for Windows (έκδοση 11.5). 36

38 2.Β.ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΣΜΑΝΪΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Β.1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.Β.1.1. Σκύλοι Χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 6 υγιείς και 16 φυσικώς µολυσµένοι από λεϊσµανίωση σκύλοι. Όλοι οι υγιείς σκύλοι προέρχονταν από εκτροφή πειραµατοζώων (Beagles) της Ιταλίας (Stefano Morini di Soprini Giovanna & Co). Αντίθετα, οι σκύλοι µε λεϊσµανίωση προσκοµίσθηκαν από τους ιδιοκτήτες τους στην Κλινική Παθολογίας Ζώων Συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής, του Α.Π.Θ. και προέρχονταν από νοµούς της Μακεδονίας. Τα ζώα παρέµειναν καθόλη τη διάρκεια της µελέτης στο Νοσηλευτήριο της παραπάνω Κλινικής και διατρέφονταν αποκλειστικά µε ξηρή τροφή για σκύλους (Hill s maintenance diet, Hill s), στην ποσότητα που συνιστάται από την παρασκευάστρια εταιρεία, ανάλογα µε την ηλικία και το σωµατικό βάρος των ζώων. Για να µειωθεί το ενδεχόµενο µόλυνσής τους από κροτωνογενή νοσήµατα και να αποφευχθούν τα νύγµατα των σκνιπών, γινόταν σε µηνιαία διαστήµατα ψεκασµοί µε διάλυµα φιπρονίλης (Frontline spray, Merial) και τοποθετούνταν περιλαίµιο δελταµεθρίνης (Scalibor, Intervet) στην έναρξη της µελέτης. Τα κριτήρια ένταξης των σκύλων µε λεϊσµανίωση στη µελέτη ήταν η συµβατή µε το νόσηµα κλινική εικόνα, η παρουσία αντισωµάτων κατά της L. infantum στον ορό του αίµατος (δοκιµασία IFAT), η ανεύρεση αµαστιγωτών µορφών του πρωτοζώου στη µικροσκοπική εξέταση του οπού των λεµφογαγγλίων ή/και του επιχρίσµατος από το µυελό των οστών, η απουσία αζωθαιµίας και πρωτεϊνουρίας, η µη χορήγηση θεραπευτικής αγωγής για τη λεϊσµανίωση στο παρελθόν και η µη διαπίστωση άλλων παθολογικών καταστάσεων ή νοσηµάτων. Για το σκοπό αυτό, εκτός από τη λήψη του ιστορικού και τη γενική κλινική εξέταση, έγιναν οι παρακάτω εργαστηριακές εξετάσεις (Χρόνος 0): α) αιµατολογική εξέταση, 37

39 β) βιοχηµικές εξετάσεις στον ορό του αίµατος, γ) δοκιµασία IFAT για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της L. infantum και Εhrlichia canis και ELISA για την ανίχνευση του αντιγόνου των θηλυκών ενήλικων νηµατωδών ελµίνθων Dirofilaria immitis, δ) εξέταση επιχρίσµατος από τη στοιβάδα των λευκών αιµοσφαρίων - αιµοπεταλίων (buffy coat) για την ανίχνευση τυχόν αιµοπαράσιτων (Εhrlichia spp., Babesia canis, Hepatozoon canis), ε) µικροσκοπική εξέταση σταγόνας νωπού αίµατος και εξέταση µε τη µέθοδο Knott για την ανεύρεση µικροφιλαριών, στ) εξέταση και καλλιέργεια ούρων, ζ) παρασιτολογική εξέταση κοπράνων, η) µικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος οπού λεµφογαγγλίου ύστερα από παρακέντηση µε λεπτή βελόνα, θ) µικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος µυελού των οστών και ι) PCR σε δείγµα οπού λεµφογαγγλίου ύστερα από παρακέντηση µε λεπτή βελόνα και µυελού των οστών. Προϋπόθεση για την ένταξη των 6 κλινικά υγιών σκύλων στη µελέτη ήταν το αρνητικό αποτέλεσµα όλων των παραπάνω εξετάσεων. 2.Β.1.2. Πειραµατισµοί 2.Β Μελέτη της φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης µετά από εφάπαξ χορήγηση Σκοπός της µελέτης αυτής ήταν να διερευνηθεί η φαρµακοκινητική της αµινοσιδίνης σε υγιείς σκύλους και σε µολυσµένους σκύλους µε λεϊσµανίωση. Στην πρώτη φάση του πειραµατισµού χρησιµοποιήθηκαν οι 6 κλινικά υγιείς σκύλοι (οµάδα Μ) και 4 σκύλοι µε λεϊσµανίωση (οµάδα Λ1) στους οποίους χορηγήθηκε αµινοσιδίνη (Cabrocol 17,5% inj sol, CEVA SANTE ANIMALE), ενδοφλέβια, στη δόση των 15 mg/kg σ.β. Στον ορό του αίµατος των σκύλων αυτών, που λήφθηκε 2 λεπτά της ώρας, 5 λεπτά, 10 λεπτά, 20 λεπτά, 45 λεπτά, 1 ώρα, 1,5 ώρα, 2 ώρες, 2,5 ώρες, 3 ώρες, 4 ώρες, 6 ώρες, 8 38

40 ώρες, 10 ώρες, 12 ώρες, 16 ώρες, 20 ώρες και 24 ώρες µετά τη χορήγηση του φαρµάκου, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της αµινοσιδίνης. Στη δεύτερη φάση του πειραµατισµού χρησιµοποιήθηκαν και πάλι οι 6 σκύλοι της οµάδας Μ καθώς και οι υπόλοιποι 12 σκύλοι µε λεϊσµανίωση (οµάδα Λ2), στους οποίους χορηγήθηκε η αµινοσιδίνη, στην ίδια δόση, υποδόρια. Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του φαρµάκου γινόταν σε δείγµατα ορού αίµατος των σκύλων αυτών που λήφθηκαν στις ίδιες χρονικές στιγµές, όπως στην πρώτη φάση του πειραµατισµού, µε µόνη εξαίρεση τα 2 λεπτά της ώρας. Επισηµαίνεται ότι, προκειµένου για τα ζώα της οµάδας Μ, παρεµβλήθηκε χρονικό διάστηµα 15 ηµερών µεταξύ των δύο φάσεων του πειραµατισµού. 2.Β Μελέτη της κλινικής φαρµακοκινητικής της αµινοσιδίνης, της ασφάλειας και της αποτελεσµατικότητάς της για τη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου ύστερα από επαναλαµβανόµενες χορηγήσεις Σκοπός της µελέτης αυτής ήταν η διερεύνηση της κλινικής φαρµακοκινητικής και της ασφάλειας της αµινοσιδίνης τόσο σε κλινικά υγιείς όσο και σε σκύλους µολυσµένους µε λεϊσµανίωση και η εκτίµηση της αποτελεσµατικότητάς της για τη θεραπεία της τελευταίας. Στον πειραµατισµό αυτό χρησιµοποιήθηκαν οι 6 σκύλοι της οµάδας Μ και οι 12 της οµάδας Λ2, στους οποίους χορηγήθηκε η αµινοσιδίνη, στη δόση των 15 mg/kg σ.β., κάθε 24 ώρες, υποδόρια, για 21 συνεχείς ηµέρες,. Επισηµαίνεται ότι και για τις δύο οµάδες των σκύλων η πρώτη ηµέρα του πειραµατισµού αυτού ήταν η ίδια µε εκείνη της φαρµακοκινητικής µελέτης µετά από εφάπαξ υποδόρια χορήγηση (βλ 1.2.1). Οι αιµοληψίες για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της αµινοσιδίνης στον ορό του αίµατος, την 1 η, 7 η, 15 η και 21 η ηµέρα της µελέτης γινόταν 5 λεπτά της ώρας, 10 λεπτά, 20 λεπτά, 45 λεπτά, 1 ώρα, 1,5 ώρα, 2 ώρες, 2,5 ώρες, 3 ώρες, 4 ώρες, 6 ώρες, 8 ώρες, 10 39

41 ώρες, 12 ώρες, 16 ώρες, 20 ώρες και 24 ώρες µετά τη χορήγηση, ενώ τις υπόλοιπες ηµέρες µετά από 1 ώρα, 12 ώρες και 24 ώρες. Για την εκτίµηση της ασφάλειας της αµινοσιδίνης και της αποτελεσµατικότητάς της στη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου γινόταν καθηµερινή κλινική και βιοχηµική εξέταση στον ορό του αίµατος όλων των ζώων κατά τη διάρκεια του πειραµατισµού, ενώ µία ηµέρα µετά τη διακοπή της χορήγησης του φαρµάκου (χρόνος 1) επαναλήφθηκαν όλες οι εργαστηριακές εξετάσεις όπως στο χρόνο 0. Επιπλέον, οι σκύλοι της οµάδας Λ2 επενεξετάσθηκαν κλινικά και εργαστηριακά µετά από χρονική περίοδο 90 ηµερών (χρόνος 2). Η ασφάλεια της αµινοσιδίνης τόσο στους υγιείς όσο και στους σκύλους της οµάδας Λ2, εκτιµήθηκε κλινικά (απουσία συµπτωµάτων τοξίκωσης) και εργαστηριακά µε βάση τα αποτελέσµατα της αιµατολογικής, της βιοχηµικής εξέτασης στον ορό του αίµατος και της ανάλυσης του ούρου. Η αποτελεσµατικότητα της αµινοσιδίνης για τη θεραπεία της λεϊσµανίωσης του σκύλου εκτιµήθηκε στα ζώα της οµάδας Λ2 µε βάση τα κλινικά κριτήρια (εξάλειψη ή µείωση του αθροίσµατος της έντασης των διάφορων συµπτωµάτων και αλλοιώσεων σε ποσοστό µεγαλύτερο ή ίσο από 75%), τη βελτίωση ή αποκατάσταση των αιµατολογικών και των βιοχηµικών διαταραχών, τη µείωση του παρασιτικού φορτίου στα λεµφογάγγλια και το µυελό των οστών και το τυχόν αρνητικό αποτέλεσµα της PCR. 2.Β.1.3. Κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις 2.Β Κλινική εξέταση Τα διάφορα συµπτώµατα της λεϊσµανίωσης βαθµολογούνταν στους σκύλους της οµάδας Λ2 µε βάση την κλίµακα 0 (απουσία), +1 (µικρή), +2 (µέτρια) και +3 (µεγάλη 40

42 ένταση). Η εκτίµηση της έντασης των συµπτωµάτων καταγραφόταν σε ειδικό φυλλάδιο (Πίνακας 3, Παραρτήµα) χωριστά από δύο ερευνητές και υπολογιζόταν ο µέσος όρος. 2.Β Εξέταση ολικού αίµατος 2.Β Αιµοληψίες και επεξεργασία του αίµατος Από κάθε σκύλο παίρνονταν 9 ml αίµατος από τη σφαγίτιδα φλέβα, µε βελόνα 21G (Terumo, Belgium) και ειδική σύριγγα-φιαλίδιο (S-Monovette, Starstedt, Germany). Σε περίπτωση όµως που χρειάζονταν πολλαπλές αιµοληψίες στο ίδιο 24ωρο η αιµοληψία γινόταν από την κεφαλική φλέβα µέσω καθετήρα (Abbocath, 18-22G). ύο ml αίµατος µεταγγίζονταν αµέσως σε φιαλίδιο µε αιθυλενοδιαµινοτετραοξεικό κάλιο ως αντιπηκτικό (Pottasium-EDTA, Starstedt, Germany), εφόσον χρειαζόταν να γίνει αιµατολογική εξέταση ενώ το υπόλοιπο φυγοκεντρούνταν (1600g X 15 min) µετά την πάροδο 20 λεπτών, διαχωριζόταν ο ορός και τοποθετούνταν σε διαφορετικά φιαλίδια ανάλογα µε τον αριθµό των κάθε φορά απαιτούµενων εξετάσεων. 2.Β Αιµατολογική εξέταση Η εξέταση αυτή γινόταν σε αυτόµατο αιµατολογικό αναλυτή (QBC Vet Autoread, IDEXX), όπου προσδιοριζόταν ο αιµατοκρίτης (PCV, %), η συγκέντρωση της αιµοσφαιρίνης (Hb, g/dl), η µέση εκατοστιαία περιεκτικότητα της αιµοσφαιρίνης ανά ερυθρό αιµοσφαίριο (MCHC, g/dl), ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων (WBC, µl -1 ) και των αιµοπεταλίων (PLT, µl -1 ). Ο λευκοκυτταρικός τύπος, η µορφολογία των κυττάρων του αίµατος και η τυχόν παρουσία αιµοπαρασίτων ελεγχόταν µε µικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος αίµατος ύστερα από χρώση κατά Giemsa (Giemsa, Merck, Germany). 41

43 2.Β Βιοχηµικές εξετάσεις στον ορό του αίµατος Στον ορό του αίµατος προσδιοριζόταν η συγκέντρωση/δραστηριότητα των βιοχηµικών παραµέτρων: ολικές πρωτεΐνες, λευκωµατίνες, σφαιρίνες, λόγος λευκωµατινών/σφαιρινών, άζωτο ουρίας, κρεατινίνη, χολοστερόλη, τριγλυκερίδια, ολική χολερυθρίνη, αλκαλική φωσφατάση, αλανινοαµινοτρανσφεράση, κρεατινική κινάση, ασβέστιο, φωσφόρος, κάλιο και νάτριο, µε βάση τη µεθοδολογία που ακολουθείται στο Εργαστήριο Προπαιδευτικής και Γενικής Παθολογίας, του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. (Ράλλης και συν., 1990). 2.Β Ορολογικές εξετάσεις 2.Β Ορολογική εξέταση ( οκιµασία ΙFAT) για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της L. infantum Περιγράφεται στην παράγραφο 2.Α Β Ορολογική εξέταση για την ανίχνευση αντισωµάτων κατά της Ε. canis Η παρουσία των ειδικών αντισωµάτων κατά της E. canis προσδιορίσθηκε µε τη δοκιµασία IFAT, η διαδικασία της οποίας διέφερε σε ορισµένα µόνο σηµεία από αυτή που ήδη περιγράφηκε (βλ 2.Α.1.4.1). Συγκεκριµένα, η ειδική αντικειµενοφόρος πλάκα είχε 15 βοθρία, σε καθένα από τα οποία τοποθετούνταν 10 µl εναιωρήµατος αντιγόνου E. canis (Synbiotics), το οποίο µονιµοποιούνταν ύστερα από παραµονή σε θερµοκρασία περιβάλλοντος για 12 τουλάχιστον ώρες. Τα δείγµατα του ορού χρησιµοποιούνταν σε δύο αραιώσεις (1/50 και 1/100). Θετικό θεωρούνταν το αποτέλεσµα όταν υπήρχε σαφής 42

44 φθορισµός στην αραίωση 1/100 αν και για µεγαλύτερη ασφάλεια δεν χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη σκύλοι µε φθορισµό στην αραίωση 1/50. 2.Β Ορολογική εξέταση για την ανίχνευση του αντιγόνου των θηλυκών ενήλικων σκωλήκων της D. immitis Όλα τα ζώα εξετάστηκαν στην αρχή της µελέτης για την παρουσία του αντιγόνου των θηλυκών ενήλικων σκωλήκων της D. immitis µε τη βοήθεια εµπορικής ανοσοενζυµικής µεθόδου (Snap Canine Heartworm PF, IDDEX) και το αποτέλεσµα αξιολογήθηκε σύµφωνα µε τις οδηγίες της παρασκευάστριας εταιρείας. 2.Β Εξέταση επιχρίσµατος από τη στοιβάδα των λευκών αιµοσφαιριώναιµοπεταλίων (buffy coat) Τα επιχρίσµατα γίνονταν από τη στοιβάδα των λευκών αιµοσφαιρίων-αιµοπεταλίων της στήλης του αιµατοκρίτη σε σωληνάριο Windrobe, ύστερα από την απόρριψη του υπερκείµενου πλάσµατος. Το υλικό µεταφερόταν και επιστρώνονταν σε αντικειµενοφόρο πλάκα και εξεταζόταν στο µικροσκόπιο µε καταδυτικό φακό (Χ1000) για την τυχόν διαπίστωση µοριδίων της E. canis στο κυτταρόπλασµα των µονοκυττάρων και των λεµφοκυττάρων ή και εξωκυτταρικά. Επιπλέον, ελέγχονταν η παρουσία µοριδίων κοκκιοκυτταροτρόπων ειδών του γένους Ehrlichia και του Anaplasma platys στα αιµοπετάλια, µεροζωϊδίων της B. canis στα ερυθρά αιµοσφαίρια και γαµετοκυττάρων του H. canis στο κυτταρόπλασµα των ουδετερόφιλων. Η αναζήτηση αυτή αφορούσε σε 1000 οπτικά πεδία. 43

45 2.Β Μικροσκοπική εξέταση σταγόνας ολικού αίµατος και τροποποιηµένη µέθοδος Knott Η παρουσία µικροφιλαριών ελέγχθηκε τόσο µε τη µικροσκοπική εξέταση σταγόνας νωπού αίµατος (X 100) όσο και µε την τροποποιηµένη µέθοδο Knott. Η τελευταία γινόταν µε την προσθήκη 9 ml διαλύµατος φορµόλης σε 1 ml αίµατος σε απεσταγµένο νερό για την πρόκληση αιµόλυσης και στη συνέχεια µε φυγοκέντρηση και χρώση µε κυανό του µεθυλενίου (Knott, 1939, Xαραλαµπίδης και ιάκου, 2001, Mylonakis και συν., 2003). 2.Β Εξέταση ούρου Στο ούρο που λαµβάνονταν µε άσηπτη κυστοκέντηση προσδιοριζόταν το ειδικό βάρος µε ιατρικό διαθλασίµετρο (Clinical refractometer, Chuco Co), ενώ µε ειδική χρωµατοµετρική ταινία (Combur-10, Boehringer Mannheim) ελέγχονταν το ph, η παρουσία γλυκόζης και κετονικών σωµάτων. Η εκτίµηση της πρωτεϊνουρίας γινόταν µε την ηµιποσοτική µέθοδο κατά Heller (Finco, 1995, Hurley και Vaden, 1995) και τον υπολογισµό του λόγου πρωτεϊνών/κρεατινίνης (Grauer και συν., 1985, Lulich και Οsborne, 1990, Osborne και Stevens, 1999). Για την εκτίµηση του ιζήµατος 5 ml ούρου υποβάλλονταν σε φυγοκέντρηση (500 g X 5 λεπτά της ώρας) και ύστερα από την απόρριψη του υπερκείµενου υγρού ακολουθούσε η µικροσκοπική εξέταση για τυχόν κυλινδρουρία (>2 κύλινδροι/οπτικό πεδίο, Χ100), πυουρία (>6 λευκά αιµοσφαίρια/οπτικό πεδίο, Χ400), αιµατουρία (>6 ερυθρά αιµοσφαίρια/οπτικό πεδίο, Χ400) και βακτηριουρία (Χ400) (Di Bartola, 2000). Επιπλέον για τον αποκλεισµό τυχόν ασυµπτωµατικής ουρολοίµωξης ποσότητα ούρου (5 ml) προσκοµιζόταν σε µικροβιολογικό εργαστήριο για καλλιέργεια. 44

46 2.Β Παρασιτολογική εξέταση κοπράνων Σε δείγµατα κοπράνων που παίρνονταν από το απευθυσµένο γινόταν παρασιτολογική εξέταση κοπράνων µε την εφαρµογή απλής µεθόδου εξέτασης και της µεθόδου Teleman (Teleman, 1908, Χαραλαµπίδης και ιάκου, 2001). 2.Β Μικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος οπού λεµφογαγγλίου Η παρακέντηση γινόταν, ανεξάρτητα από την παρουσία ή όχι περιφερικής λεµφαδενοπάθειας, στα ιγνυακά ή στα προωµοπλατιαία λεµφογάγγλια και µόνο σε περίπτωση έντονης παχυσαρκίας στα υπογνάθια (1/20 σκύλους). Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνταν βελόνα 21G και 2,5 cm και δεν γινόταν αναρρόφηση µε σύριγγα (Tyler και συν. 1999). H ηµιποσοτική εκτίµηση του αριθµού των πρωτoζώων γινόταν µετά από µονιµοποίηση και χρώση κατά Giemsa, µε βάση την παρακάτω κλίµακα (Chulay και Brycesson 1983, Ciaramella και συν. 1997): +6: > 100 πρωτόζωα / οπτικό πεδίο (X 1000) +5: πρωτόζωα / οπτικό πεδίο (X 1000) +4: 1 9 πρωτόζωα / οπτικό πεδίο (X 1000) +3: 1 9 πρωτόζωα / 2 10 οπτικό πεδίο (X 1000) +2: 1 9 πρωτόζωα / οπτικό πεδίο (X 1000) +1: 1 9 πρωτόζωα / οπτικό πεδίο (X 1000) 45

47 2.Β Μικροσκοπική εξέταση επιχρίσµατος µυελού των οστών Για τον σκοπό αυτό γινόταν µυελοκέντηση στη ραχιαία λαγόνια άκανθα µε βελόνα 16-18G τύπου Rosenthal (Acufirm, Germany), µε το ζώο σε όρθια θέση, ύστερα από βαθιά τοπική αναισθησία µε 3-5 ml διαλύµατος ξυλοκαϊνης 2% (Xylocaine, Astra, ). Η αναρρόφηση 0,5-1ml µυελού γινόταν ύστερα από άσκηση αρνητικής πίεσης µε σύριγγα 10ml που περιείχε 0,25ml διαλύµατος ΕDTA 1%. Στο επίχρισµα του µυελού των οστών, ύστερα από χρώση κατά Giemsa εκτιµούνταν ο αριθµός των πρωτοζώων µε την ίδια µέθοδο που αναφέρθηκε και για τον οπό των λεµφογαγγλίων. 2.Β PCR σε δείγµα οπού λεµφογαγγλίου και µυελού των οστών είγµα οπού λεµφογαγγλίου που συλλέγονταν σε σύριγγα µε µικρή ποσότητα ενεσίµου ύδατος και µυελού των οστών σε φιαλίδιο µε EDTA, χρησιµοποιούνταν για την ανίχνευση του DNA της L. infantum µε την PCR. Τα δείγµατα φυλασσόταν στην κατάψυξη (- 20 C) µέχρι να εξεταστούν. H PCR γινόταν στο Εργαστήριο Παρασιτολογίας και Τροπικών Νοσηµάτων, της Εθνικής Σχολής ηµόσιας Υγείας σύµφωνα µε τη µεθοδολογία που ακολουθείται από το εργαστήριο αυτό (Spanakos και συν. 2002). Συνοπτικά για την αποµόνωση του DNA της L. infantum γινόταν αρχικά πέψη του επεξεργασµένου δείγµατος µε 500 µg πρωτεϊνάσης Κ σε ρυθµιστικό διάλυµα PCR (50mM KCl, 20mM Tris-Cl ph 8,3, 2,5 mm MgCl 2, 0,5% Tween 20). Μετά την επώαση στους 56 o C γινόταν επανενεργοποίηση της πρωτεϊνάσης Κ µε θέρµανση στους 95 o C για 10 min, το διάλυµα φυγοκεντρούνταν για 1 min στις g και το υπερκείµενο υγρό εκχυλίζονταν µε phenol-chloroform isoamylalcochol 25:24:1 (Gibco- BRL) και µε χλωροφόρµιο. Για την PCR χρησιµοποιήθηκαν οι εκκινητές Lei70L 5 - CGCAACCTCGGTTCGGTGTG-3 και Lei70R 5 -CGCGGTGCTGGACACAGGGTA-3 46

48 (MWG, Bioteck, Germany) σε τελικό όγκο 100µl που περιείχε 1Χ ρυθµιστικό διάλυµα PCR, 1,5 mm MgCl 2, 0,2 µm από κάθε δεοξυνουκλεοτίδιο 3 U Taq-DNA polymerase (Gibco-BRL) και 100 pm από κάθε εκκινητή. Στη συνέχεια τα δείγµατα, µαζί µε θετικό και αρνητικό µάρτυρα, τοποθετούνταν σε ηλεκτρονικό θερµοκυκλοποιητή (PTC-100 MJ Research), στον οποίο ο καθένας από τους συνολικά 40 κύκλους, περιλάµβανε τη θέρµανση στους 94 o C για 1 min, στους 65 o C για 1 min, στους 72 o C για 1,5 min και ένα τελικό στάδιο επιµήκυνσης στους 72 o C για 10 min. Το προϊόν της PCR διαχωριζόταν σε γέλη αγαρόζης 2% που περιείχε 0,5 µg/ml ethidium bromide (Sigma) και η απεικόνιση του τµήµατος αντιγραφής γινόταν µε υπεριώδη ακτινοβολία. Κάθε δείγµα θεωρούνταν θετικό όταν το µοριακό µέγεθος του προϊόντος της PCR ήταν ίδιο µε εκείνο του θετικού µάρτυρα. Για να αποφευχθούν επιµολύνσεις, η αποµόνωση του DNA, η PCR και η ηλεκτροφόρηση γίνονταν σε διαφορετικούς χώρους και επιπλέον η πρώτη γινόταν σε θάλαµο νηµατοειδούς ροής. 2.Β Μέθοδος προσδιορισµού της συγκέντρωσης της αµινοσιδίνης στον ορό του αίµατος Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκε η υγροχρωµατογραφική µέθοδος των Lu και συν. (1997) µε ορισµένες τροποποιήσεις. Η στήλη χρωµατογραφίας ήταν Spherisorb-ODS-2 και η κινούµενη φάση ήταν φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα (20 mm δισόξινου φωσφορικού νατρίου) στο οποίο είχαν προστεθεί 2,5 mm ΤΒΑ-HSO 4, 10 mm οκτανοσουλφονικό νάτριο και ακετονιτρίλιο σε αναλογία 53,5:46,5 v/v. Η ταχύτητα ροής της κινούµενης φάσης ήταν 1ml/min και ο προσδιορισµός της αµινοσιδίνης γινόταν σε µήκος κύµατος ανιχνευτή τα 350nm. H αξιολόγηση της µεθόδου, που έγινε πριν αναλυθούν τα δείγµατα της µελέτης, έδειξε ότι το όριο ανίχνευσης ήταν 60 ng αµινοσιδίνης/ml, ενώ το όριο προσδιορισµού της ήταν 90 47

49 ng/ml. Οι αναλύσεις έγιναν στο Εργαστήριο Φαρµακολογίας, του Τµήµατος Κτηνιατρικής, του Α.Π.Θ. 2.Β Μεθοδολογία επεξεργασίας αποτελεσµάτων 2.Β Φαρµακοκινητική και στατιστική ανάλυση των φαρµακοκινητικών παραµέτρων Η φαρµακοκινητική ανάλυση έγινε µε τη µη παραµετρική ή τη µη διαµερισµατική µέθοδο καθώς και µε την κλασική διαµερισµατική µέθοδο. Χρησιµοποιήθηκε το πρόγραµµα WinNonlin, version (Pharsight corp., CA, USA). Οι φαρµακοκινητικές παράµετροι που προσδιορίσθηκαν είναι: AUC (µg x h /ml), AUCM (µg x h 2 / ml), MRT (h), MAT (h), Kel (1/h ή h-1), Ka (1/h ή h-1), t 1/2β (h), Vss (L), CL (ml/min), Cmax (µg/ml), Tmax (h), και F (%). Η σύγκριση των τιµών των παραπάνω φαρµακοκινητικών παράµετρων µεταξύ των οµάδων Μ και Λ1 ή Λ2 έγινε µε τη µη παραµετρική µέθοδο Mann & Whitney ή το Student s t-test. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε µε το πρόγραµµα SPSS for Windows (έκδοση 11.5). 2.Β Στατιστική επεξεργασία αποτελεσµάτων κλινικών και εργαστηριακών εξετάσεων και διερεύνηση συσχετίσεων Το πειραµατικό σχέδιο θεωρήθηκε ως µικτός σχεδιασµός ή σχεδιασµός χωριστού σχεδίου (Mixed Design ή Split Plot Design). Λεπτοµερής περιγραφή της αντίστοιχης στατιστικής µεθοδολογίας δίνεται από τους Brown και Melamed (1990) και τον Girden (1992). 48

50 Τα αποτελέσµατα του πειραµατισµού υποβλήθηκαν σε ανάλυση διακύµανσης, ANOVA (Iversen και συν., 1987, Kirkwood, 1996), µε τη βοήθεια γενικών γραµµικών προτύπων (Mendenhall και Sincich, 1996). Για τις πολλαπλές συγκρίσεις µέσων όρων εφαρµόστηκε ο έλεγχος Bonferroni (Toothaket και Larry, 1993, Klockars και Sax, 1986). Στις περιπτώσεις που τα δεδοµένα δεν ακολουθούσαν την κανονική κατανοµή αντί του ελέγχου αυτού εφαρµόστηκε ο µη παραµετρικός έλεγχος Friedman και Wilcoxon αντί της ANOVA και ο έλεγχος Mc Nemar αντί του Bonferroni. To γραµµικό πρότυπο ανάλυσης περιλαµβάνει δύο κύριες επιδράσεις και µια αλληλεπίδραση. Ειδικότερα, περιλαµβάνει την κύρια επίδραση του παράγοντα «οµάδα» µε δύο επίπεδα (οµάδα Λ και οµάδα Μ), την κύρια επίδραση του παράγοντα «χρόνος» µε 22 επίπεδα (πριν τη χορήγηση για 21 ηµέρες και την 22 ηµέρα από την πρώτη χορήγηση). Στην περίπτωση αυτή τα δύο επίπεδα του παράγοντα «οµάδα» θεωρήθηκαν ως ολόκληρα σχέδια (whole plots), ενώ τα επίπεδα του παράγοντα «χρόνος» ως χωριστά σχέδια (split plots). Συνοπτικά το πειραµατικό σχέδιο εκφράζεται ως εξής: Σχέδιο = «οµάδα» + σφάλµα 1 + «χρόνος» + «οµάδα» «χρόνος» + σφάλµα 2. Ισοδύναµη διατύπωση του πειραµατικού σχεδιασµού στηρίζεται στην έννοια των επαναλαµβανόµενων µετρήσεων (repeated measures, Gomez και Gomez, 1984 και Girden, 1992), όπου ο παράγοντας µε τις επαναλαµβανόµενες µετρήσεις είναι ο «χρόνος». Στην περίπτωση αυτή, το πειραµατικό σχέδιο εκφράζεται συνοπτικά ως εξής: Σχέδιο µεταξύ των υποκειµένων (Between subjects design) = «Οµάδα» + σφάλµα 1 Σχέδιο ανάµεσα στα υποκείµενα (Within subjects design) = «Χρόνος» + «Οµάδα» «Χρόνος» + σφάλµα 2. Το παραπάνω πρότυπο προσαρµόστηκε και στην περίπτωση όπου το ενδιαφέρον εστιάστηκε στη µελέτη τριών χρονικών περιόδων (χρόνους 0, 1 και 2) Για να διερευνηθεί η διαχρονική τάση των βιοχηµικών παραµέτρων προσαρµόστηκαν τα δεδοµένα σε γραµµικά πρότυπα της µορφής: 49

51 Y = b o +b i t + σφάλµα, όπου y = βιοχηµική παράµετρος, b o : σταθερός όρος, b 1 : σταθερά του χρόνου, t= χρόνος σε ηµέρες µετά την πρώτη χορήγηση. Η µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε ήταν η απλή γραµµική παλινδρόµηση (Μπόρα-Σέντα, Μωυσιάδης 1990). Οι συσχετίσεις µεταξύ των διαφόρων παραµέτρων έγιναν µε το συντελεστή συσχέτισης Spearman (Daniel, 1995, Pagano και Gauvraeu, 2000). Όλες οι παραπάνω στατιστικές αναλύσεις έγιναν σε προσωπικό υπολογιστή µε χρήση του προγράµµατος SPSS for Windows (έκδοση 11.5). Η στάθµη σηµαντικότητας των ελέγχων ορίστηκε εξαρχής στο α=0,05, αλλά σε ορισµένες περιπτώσεις, λόγω του µικρού µεγέθους του δείγµατος, θεωρήθηκε και το α=0,1. 50

52 2.Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.Γ.Α. ΕΠΙΖΩΟΤΙΟΛΟΓΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 2.Γ.Α.1. Περιοχή της έρευνας Κλιµατολογικές συνθήκες Τα στοιχεία της Εθνικής Μετεωρολογικής Υπηρεσίας για το 1999 αφορούσαν τη θερµοκρασία, την υγρασία και το ύψος των βροχοπτώσεων. Για την Εύβοια δεν υπήρχαν στοιχεία στην Εθνική Μετεωρολογική Υπηρεσία, θεωρείται όµως ότι δεν υπάρχουν διαφορές µεταξύ του κλίµατος της Εύβοιας και της Αττικής (Ε.Μ.Υ., προσωπική επικοινωνία). Ειδικότερα, στις καταγραφές για τη θερµοκρασία συµπεριελήφθησαν η ελάχιστη, η µέγιστη και η µέση θερµοκρασία κάθε ηµέρας του έτους. Η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση της ελάχιστης θερµοκρασίας για κάθε περιοχή της µελέτης παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Η υψηλότερη ελάχιστη θερµοκρασία καταγράφηκε στην Αττική (14,26 C ± 6,03) ενώ η χαµηλότερη στα Ιωάννινα (6,54 C ± 6,26). Από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων προέκυψε ότι υπάρχει στατιστικώς σηµαντική διαφορά µεταξύ των µέσων όρων των ελάχιστων τιµών της θερµοκρασίας των περιοχών της µελέτης ( P=0,0001). Όσον αφορά τη µέγιστη θερµοκρασία, η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση για κάθε περιοχή της µελέτης παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Η υψηλότερη µέγιστη θερµοκρασία καταγράφηκε στην Αττική (22,21 C ± 8,4) µε µικρή διαφορά από την Ευρυτανία (21,89 C ± 7,32) και η χαµηλότερη στα Ιωάννινα (16,53 C ± 8,8). Οι διαφορές όµως των µεσών όρων της µέγιστης θερµοκρασιών µεταξύ των περιοχών δεν είναι στατιστικώς σηµαντικές (P=0,087). Ωστόσο η µέση θερµοκρασία διαφέρει οριακά µεταξύ των περιοχών (P=0,056). Η υψηλότερη µέση θερµοκρασία (18,3 C ± 6,86) καταγράφηκε 51

53 στην Αττική, µετά στην Ευρυτανία και µετά στον Έβρο. Στις Σέρρες και στη Φλώρινα ήταν σχεδόν ίση µε τον Έβρο και η χαµηλότερη στα Ιωάννινα (11,78 C ± 7,99). H µεγαλύτερη υγρασία (Πίνακας 5) παρατηρήθηκε στο Νοµό Έβρου (71,12% ± 12,46) και κατά φθίνουσα σειρά στις Σέρρες, στα Ιωάννινα, στην Ευρυτανία, τη Φλώρινα και η µικρότερη στη Φλώρινα (59,79% ± 21,04) και στην Αττική (59,29% ± 10,27). Οι διαφορές στην υγρασία µεταξύ των 6 περιοχών ήταν στατιστικώς σηµαντικές (P= 0,022). Τέλος, το µεγαλύτερο ύψος βροχοπτώσεων (Πίνακας 6) καταγράφηκε στη Φλώρινα (78,07 εκατοστά ± 70,55) και κατά φθίνουσα σειρά στις Σέρρες, στα Ιωάννινα, στον Έβρο, στην Ευρυτανία και στην Αττική (36,53 εκατοστά ± 54,96). Οι διαφορές αυτές είναι στατιστικώς σηµαντικές (P= 0,039). 2.Γ.Α.2. Περιγραφή του δείγµατος Από το σύνολο των 2620 σκύλων που εξετάστηκαν για την παρουσία αντισωµάτων κατά της L. infantum, ήταν οι αρσενικοί (48,81%) και οι θηλυκοί (51,18%). Σύµφωνα µε την ηλικία, η οµάδα Α (< 1 έτους) περιελάµβανε 221 σκύλους (8,43%), η οµάδα Β (1-3 ετών) σκύλους (38,51%), η οµάδα Γ (3-9 ετών) σκύλους (41,03%) και η οµάδα (> 9 ετών) 315 σκύλους (12,02%). Aπό το σύνολο των σκύλων που εξετάστηκαν (41,90%) ήταν µακρύτριχοι και (58,09%) βραχύτριχοι. εν έγινε συσχετισµός των αποτελεσµάτων ανάλογα µε τη φυλή, επειδή οι περισσότεροι σκύλοι δεν ανήκαν σε συγκεκριµένη φυλή. Τέλος, σε σχέση µε τη χρησιµότητα των σκύλων που εξετάστηκαν ήταν κυνηγετικοί (62,59%), 815 φύλακες (31,10%) και 165 σκύλοι συντροφιάς (6,29 %). 52

54 2.Γ.Α.3. Ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση αντισωµάτων-l. infantum Από το σύνολο των σκύλων που εξετάστηκαν για την παρουσία αντισωµάτων κατά της L. infantum βρέθηκαν θετικά µε τη δοκιµασία IFAT τα 511 (19,50%) ζώα. Από αυτά τα 509 ήταν θετικά και µε τη δοκιµασία ELISA (19,42%). εν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές (P>0,05) µεταξύ των αποτελεσµάτων των δύο δοκιµασιών. Σε σχέση µε την περιοχή διαβίωσης των ζώων, τα υψηλότερα ποσοστά οροθετικών σκύλων βρέθηκαν στην Αττική (30,11%) και κατά φθίνουσα σειρά στους Νοµούς: Ιωαννίνων (21,03%), Σερρών (20,45%), Ευρυτανίας (17%), Έβρου (4,32%), Εύβοιας (4,28%) και Φλώρινας (2,05%). Από τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων προέκυψε ότι τα ποσοστά µεταξύ των περιοχών διέφεραν στατιστικώς σηµαντικά (P=0,000). Το ποσοστό οροθετικών σκύλων ήταν υψηλότερο στα θηλυκά (20,35%) από τα αρσενικά (18,6%). Ωστόσο η διαφορά αυτή µεταξύ σκύλων διαφορετικού γένους δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική (P>0,05) όπως και µεταξύ σκύλων µε διαφορετικό τύπο τριχώµατος και διαφορετική χρησιµότητα. Αντίθετα στατιστικώς σηµαντικές διαφορές παρουσιάζονται µεταξύ των ηλικιακών οµάδων (P=0, 0129). Μεγαλύτερα ποσοστά οροθετικών σκύλων βρέθηκαν σε σκύλους ηλικίας 1-3 ετών (23,38%) και 3-9 ετών (23,34%). Αναλυτικότερα τα αποτελέσµατα των ορολογικών εξετάσεων και της στατιστικής επεξεργασίας παρουσιάζονται στον Πίνακα 7 όπου ποσοστά µε τον ίδιο εκθέτη δεν είναι στατιστικώς σηµαντικά ενώ στατιστικώς σηµαντικές είναι οι διαφορές ποσοστών µε διαφορετικό εκθέτη. 53

55 Πίνακας 7. Αριθµός και ποσοστά θετικών και αρνητικών σκύλων στην παρουσία αντισωµάτων -Leishmania spp. κατά περιοχή διαβίωσης, γένος, ηλικία, τύπο τριχώµατος και χρησιµότητα. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΘΕΤΙΚΑ / ΑΡΝΗΤΙΚΑ (%) ΝΟΜΟΣ Αττική Έβρος Εύβοια Ευρυτανία Ιωάννινα Σέρρες Φλώρινα 303 / / / / / / / ,11 a 4,32 b 4,28 b 17,00 c 21,03 c 20,45 c 2,05 b ΓΕΝΟΣ Αρσενικό Θηλυκό 238 / / ,60 a 20,35 a ΗΛΙΚΙΑ (ΕΤΗ) <1 >1-3 >3-9 >9 5 / / / / 296 2,26 a 23,38 b 23,34 b 6,03 a ΤΡΙΧΩΜΑ Μακρύτριχα Βραχύτριχα 227 / / ,67 a 18,65 a ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ Κυνήγι Φύλακας Συντροφιά 307 / / / ,71 a 20,98 a 21,81 a 54

56 55