«Σχεδιασμός και σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων, επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης»

Transcript

1 Τμήματα Χημείας, Φαρμακευτικής και Ιατρικής ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» ΔΙΑΤΡΙΒΗ Για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ EΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Σχεδιασμός και σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων, επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης» Αγαθή Ντελή Χημικός Επιβλέπων : Θεόδωρος Τσέλιος, Αναπληρωτής Καθηγητής ΠΑΤΡΑ 2015 i

2 Department of Chemistry, Pharmacy and Medicine PSTGRADUATE PRGRAM «Medicinal Chemistry: Drug discovery and design» M. Sc. Thesis «Design and synthesis of peptide analogues of myelin proteins» Agathi teli Chemist Supervisor: Associate Professor Theodore Tselios PATRA 2015 ii

3 iii

4 Επιβλέπων: Θεόδωρος Τσέλιος Αναπληρωτής Καθηγητής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Θεόδωρος Τσέλιος Γάτος Δημήτριος Βλάμης Αλέξιος Αναπληρωτής Καθηγητής Αναπληρωτής Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Supervisor: Theodore Tselios Associate Professor Examiners Committee: Theodore Tselios Gatos Dimitrios Vlamis Alexios Associate Professor Associate Professor Assistant Professor iv

5 v

6 Περίληψη Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μία χρόνια φλεγμονώδης αυτοάνοση νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) που προκαλεί την καταστροφή της μυελίνης γύρω από τους νευράξονες και την δυσλειτουργία στη μετάδοση των νευρικών ερεθισμάτων. Η έναρξη της ανοσολογικής απόκρισης στη ΣΚΠ γίνεται με τη δημιουργία του τριμοριακού συμπλόκου ανάμεσα στο Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (Major istocombatibility Complex, MC ή uman Leukocyte Antigen, LA), το αντιγόνο και τον υποδοχέα του Τ-κυττάρου (T-cell Receptor, TCR). Ο σχεδιασμός και η σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων αλλά και τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων (APLs) των πρωτεϊνών της μυελίνης που θα έχουν ισχυρή πρόσδεση με το MC/LA αλλά όχι με τον TCR θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση των εγκεφαλιτογόνων Τ-κυττάρων. Έχει βρεθεί ότι ανοσοκυρίαρχοι επίτοποι που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων στη ΣΚΠ και έχουν μελετηθεί σε κλινικές δοκιμές είναι οι MBP 13-32, MBP 83-99, MBP , MBP , MG 1-20, MG και PLP Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας συντέθηκαν ανάλογα των επιτόπων MBP 83-99, MBP 13-32, PLP , PLP και VA (επίτοπος της οβαλβουμίνης ο οποίος δεσμεύεται στο MC/LA τάξης ΙΙ). Η σύνθεση των πεπτιδίων έγινε σε στερεή φάση κατά στάδια επί της 2- χλωροτριτυλοχλωριδίου ρητίνης (CLTR-Cl) ακολουθουμένη από την Fmoc/tBu μεθοδολογία και χρησιμοποιώντας τα Ν,Ν -διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο και 1- υδροξυβενζοτριαζόλιο (DIC/Bt) ως αντιδραστήρια σύζευξης. Ο καθαρισμός των τελικών προϊόντων έγινε με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης Ανάστροφης Φάσης (RP-PLC) και η ταυτοποίησή τους με Φασματομετρία Μάζας (ESI-MS). Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός με ημιπαρασκευαστικό RP-PLC πεπτιδικών αναλόγων της μυελίνης με σκοπό την in vivo και in vitro βιολογική τους αποτίμηση σε συνδυασμό με τον αυξητικό παράγοντα FGF2v, έναν παράγοντα που συμμετέχει στην μυελίνωση και την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Λέξεις Κλειδιά: Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ), Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (MBP), Πρωτεολιπιδική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (PLP), Τροποποιημένα Πεπτιδικά Ανάλογα (APLs), Πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση, Κυκλικά πεπτίδια. vi

7 Summary Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disease of the Central ervous System (CS) that leads to the destruction of the myelin that surrounds the neuroaxons and the dysfunction of the nervous signals transmitting. Immune response in MS is induced by the formation of the trimolecular complex between the Major istocombatibility Complex (MC) or uman Leukocyte Antigen (LA), the antigen and the T-cell receptor (TCR). Design and synthesis of peptide analogues and altered peptide ligands (APLs) of the immunodominant epitopes of myelin, with high affinity to the MC and not to the TCR, could inhibit the induction of encephalitogenic T-cells. The epitopes MBP 13-32, MBP 83-99, MBP , MBP , MG 1-20, MG and PLP which have been studied in clinical trials, are considered as the main immunodominant epitopes that stimulate the T-cells. In this study, peptide analogues of MBP 83-99, MBP 13-32, PLP , PLP and VA (ovalbumin epitope which binds to the MC/LA II class) epitopes were synthesized. The synthesis of the peptide analogues was achieved using the 2- chlorotritylchloride resin (CLTR-Cl) combined with Fmoc/tBu methodology, utilizing Ν,Ν -diisopropylcarbodiimide and 1 hydroxybenzotriazole (DIC/Bt) as coupling reagents. The purification of the final products was accomplished with Reversed Phase igh-perfomance Liquid Chromatography (RP-PLC) and their identification was achieved with Electrospray Ionization Mass Spectroscopy (ESI-MS). Moreover, other peptides of myelin sheath were purified with semi-preparative RP-PLC in order to evaluate in vivo and in vitro their activity in combination with the FGF2v (Fibroblast Growth Factor), which has been implicated in diverse biological processes, such as myelination and nervous system development. Keywords: Multiple Sclerosis (MS), Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid Protein of Myelin (PLP), Altered Peptide Ligands (APLs), Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS), Cyclic peptides. vii

8 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας και Πεπτιδικής Χημείας στο Τμήμα Χημείας στο Πανεπιστήμιο Πατρών. Πρώτα από όλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντά μου και Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Θεόδωρο Τσέλιο για την ευκαιρία που μου έδωσε να συνεργαστώ μαζί του, για την εμπιστοσύνη που μου επέδειξε και για την συνεχή καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της παραμονής μου εκεί αλλά κατά της συγγραφή της παρούσας εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τα δύο υπόλοιπα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Δημήτριο Γάτο και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Βλάμη Αλέξιο για την βοήθεια και τη συνεισφορά τους. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τα δύο μέλη του εργαστηρίου που με την παρουσία και την στήριξη τους με βοήθησαν να φέρω εις πέρας την πειραματική αλλά και θεωρητική εκπόνηση της εργασίας μου. Την υποψήφια διδάκτορα Ανθή Ταπεινού για την αδιάκοπη και πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε στο εργαστήριο, τις γνώσεις που μου μεταβίβασε, τις χρήσιμες και απαραίτητες συμβουλές που μου έδωσε, την υποστήριξη και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε από την αρχή των πειραμάτων μέχρι και το τέλος της συγγραφής της διπλωματικής μου εργασίας. Τον Χρήστο Κοντό για την άψογη συνεργασία που αναπτύξαμε, την συμμετοχή και την αμέριστη βοήθεια του στη διεκπεραίωση της εργασίας καθώς και για την συμπαράσταση, την κατανόηση και την στήριξη που μου προσέφερε όλα αυτά τα χρόνια. Θα ήθελα να αναφέρω επίσης την μεταδιδακτορικό Carmen Simal Fernandez, τις προπτυχιακές φοιτήτριες Μαρία Πλακαντωνάκη και Ελένη Μύρτση, καθώς και όλα τα μέλη του εργαστηρίου και του ορόφου και να τους ευχαριστήσω για την ευχάριστη συνεργασία και την βοήθειά τους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όσους έμειναν μέχρι το τέλος στο πλάι μου και συνεχίζουν να με στηρίζουν ακόμα και από μακριά. Χωρίς την οικογένειά μου τίποτα από όλα αυτά δεν θα είχε υλοποιηθεί. Για αυτό θέλω να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου τους γονείς μου Παναγιώτη και Ιωάννα και την αδερφή μου Χρύσα για όλα όσα μου πρόσφεραν και θυσίασαν για viii

9 να μπορέσω να πραγματοποιήσω τους στόχους μου και τα όνειρά μου, μένοντας πάντα παρόντες στο πλάι μου σε χαρούμενες και δύσκολες στιγμές. ix

10 x Στην οικογένειά μου

11 Περιεχόμενα Συντομογραφίες Α. Θεωρητικό Μέρος Α.1. Σκλήρυνση κατά πλάκας A.1.1. Γενικά Α.1.2. Νευρικό σύστημα Α Νευρώνες Α Νευρογλοία A.1.3. Μυελίνη Α.1.4. Ανοσία Α.1.5. Αυτοανοσία- Παθοφυσιολογία της ΣΚΠ Α.1.6. Τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα (APLs) Α.1.7. Διάγνωση-Υπάρχουσες θεραπείες στην ΣΚΠ Α.2. Πεπτιδική σύνθεση Α.2.1. Αμινοξέα-Πρωτεΐνες-Πεπτιδικός δεσμός Α.2.2. Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Α Μέθοδος καρβοδιιμιδίων Α Μέθοδος των ενεργών εστέρων Α Μέθοδος με χρήση φωσφονικών και ουρονικών παραγώγων Α Μέθοδος των ανυδριτών Α Μέθοδος των αζιδίων Α.2.3. Ρακεμίωση Α.2.4. Συνήθεις παράπλευρες αντιδράσεις Α Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης Α Σχηματισμός νιτριλίου Α Σχηματισμός δ-λακτάμης Α Σχηματισμός πυρογλουταμινικού οξέος Α Σχηματισμός ασπαρτιμιδίων Α Οξείδωση της Met Α Αλκυλιώσεις κατά την αποπροστασία των πεπτιδίων Α.2.5. Προστατευτικές ομάδες αμινοξέων Α Προστασία της α-αμινομάδας Α Βενζυλοξυκαρβονυλομάδα (Ζ) xi

12 Α Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc) Α φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc) Α Προστασία της α-καρβοξυλομάδας Α Προστασία των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων Α Ορθογωνικότητα Α Προστασία της σουλφυδρυλομάδας της Κυστεΐνης Α Προστασία του ημιδαζολικού δακτυλίου της Ιστιδίνης Α Προστασία του αμιδίου της πλευρικής ομάδας της Ασπαραγίνης και της Γλουταμίνης Α Προστασία της καρβοξυλομάδας της πλευρικής ομάδας του Ασπαραγινικού και του Γλουταμινικού οξέος Α Προστασία της υδροξυλομάδας της Σερίνης, της Θρεονίνης και της Τυροσίνης Α Προστασία της γουανιδινομάδας της Αργινίνης Α Προστασία της ε-αμινομάδας της Λυσίνης Α Προστασία του ινδολικού δακτυλίου της Τρυπτοφάνης Α Δεσμευτές κατιόντων (scavengers) Α.2.6. Μέθοδοι πεπτιδικής σύνθεσης Α Μέθοδος σταδιακής σύνθεσης πεπτιδικής αλυσίδας (Step by Step).. 68 Α Μέθοδος σύνθεσης μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών κλασμάτων (Fragment Condensation) Α.2.7. Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης Α Σύνθεση σε υγρή φάση (Liquid Phase Synthesis) Α Σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) Α Στερεό υπόστρωμα Α Διαλύτες στην SPPS Α.2.8. Κυκλοποίηση πεπτιδίων Α.2.9. Αναλυτικές τεχνικές Α Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (PLC) Α Φασματομετρία Μάζας (Mass Spectrometry, MS) Α Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) Α Test Kaiser Β. Σκοπός xii

13 Γ. Πειραματικό Μέρος Γ.1. Συσκευές-Όργανα-Υλικά Γ.2. Γενική πορεία σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεή φάση Γ.3. Συνθέσεις πεπτιδίων Γ.3.1. Σύνθεση γραμμικών πεπτιδικών αναλόγων επί της CLTR-Cl ρητίνης σε στερεή φάση με βάση επιτόπους της MBP Γ.3.2. Σύνθεση γραμμικών πεπτιδικών αναλόγων επί της CLTR-Cl ρητίνης σε στερεή φάση με βάση επιτόπους της PLP Γ.3.3. Σύνθεση γραμμικών πεπτιδικών αναλόγων επί της CLTR-Cl ρητίνης σε στερεή φάση με βάση επιτόπους της VA Γ.3.4. Σύνθεση κυκλικού πεπτιδικού αναλόγου επί της CLTR-Cl ρητίνης σε στερεή φάση Δ. Αποτελέσματα-Συζήτηση Δ.1. Συντεθέντα ανάλογα Δ.1.1. Σύνθεση του πεπτιδικού αναλόγου MBP Δ.1.2. Σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων MBP [Tyr 91 ] και (KG) 5 MBP 83-99[Tyr 91 ] Δ.1.3. Σύνθεση του πεπτιδικού αναλόγου MBP Δ.1.4. Σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων PLP και PLP Δ.1.5. Σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων VA και (KG) 5 VA Δ.1.6. Σύνθεση του πεπτιδικού αναλόγου cycloplp [Leu 144,Arg 149 ] Δ.2. Καθαρισμοί πεπτιδίων Βιβλιογραφία xiii

14 14 Α. Θεωρητικό Μέρος Συντομογραφίες Οι συντμήσεις οι οποίες χρησιμοποιούνται στην παρούσα διπλωματική εργασία έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχημικής Ονοματολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) και της Διεθνούς Ένωσης Βιοχημείας (IUD). Οι προτάσεις αυτές ανακοινώθηκαν το 1972 και συμπληρώθηκαν σταδιακά μέχρι το 1989 [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical omenclature (JCB), omenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations, 1984 Eur J Biochem 138: 9; 1989 J Biol Chem 264, και παρουσιάζονται ολοκληρωμένες όσον αφορά την Πεπτιδική Χημεία στην αναφορά: 2003 J Pep Sci 9: 1-8. Σύντμηση 1-Bu CLTR-Cl AC Ac Ala APC APLs Arg Αsn Asp BBB Boc BP Bzl Cys DCC DCM DCU DIC DIPEA DIMAC DKP DMAP DMF ΕΑΕ EDT EMS Ονομασία 1-βουτανόλη 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη Ακετονιτρίλιο Οξικό οξύ Αλανίνη Αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο Τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα Αργινίνη Ασπαραγίνη Ασπαραγινικό οξύ Αιματοεγκεφαλικός φραγμός Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα Εξαφθοροφωσφορικό άλας του 1Η-βενζοτριαζολ-1-υλοξυ-τρις(διμεθυλαμινο)- φωσφονίου Βενζυλ- ομάδα Κυστεΐνη, -δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο Διχλωρομεθάνιο, -δικυκλοεξυλουρία Ν,Ν -διισοπροπυλο-καρβοδιιμίδιο Διισοπροπυλαιθυλαμίνη Ν,Ν -διμεθυλακεταμίδιο Δικετοπιπεραζίνη 4-διμεθυλαμινο-πυριδίνη Ν,Ν -διμεθυλοφορμαμίδιο Πειραματική Αλλεργική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα 1,2-Αιθανοδιθειόλη Μεθανοσουλφονικός αιθυλεστέρας

15 15 Α. Θεωρητικό Μέρος ESI-MS Et 2 Ο Fmoc FGF2v Gln Glu Gly BTU F is LA At Bt PLC IF IL Ile i-pr Lys MΒ MAG MBP Me Met MC MG ΜS MP ps P 2 5 PLP Pro Pr RP-PLC Scavenger Ser SPPS TBTU tbu TES TFA TFE T h Thr TLC t R Trp Φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό Διαιθυλαιθέρας 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα Αυξητικός παράγοντας Γλουταμίνη Γλουταμινικό οξύ Γλυκίνη Eξαφθοροφωσφορικό άλας της 2-(1Η βενζοτριαζολ-1υλ)-1,1,3,3-τετραμεθυλουρίας Υδροφθόριο Ιστιδίνη Αντιγόνο των ανθρώπινων λευκοκυττάρων 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο Υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης Ιντερφερόνη Ιντερλευκίνη Ισολευκίνη Ισοπροπανόλη Λυσίνη Μοριακό βάρος Mυελινο-σύνδετη γλυκοπρωτεΐνη Βασική πρωτεΐνη της μυελίνης Μεθανόλη Μεθειονίνη Μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας Μυελινική γλυκοπρωτείνη των ολιγοδενδριτών Πολλαπλή σκλήρυνση -μεθυλοπυρολλιδίνη 2-νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα Πεντοξείδιο του φωσφόρου Πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης Προλίνη Προπανόλη Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης Δεσμευτής (κατιόντων) Σερίνη Σύνθεση πεπτιδίου σε στερεή φάση Τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η βενζοτριαζολ-1υλ)-1,1,3,3-τετραμεθυλουρίας Τριτοταγής βουτυλομάδα Τριισοπροπυλοπυρίτιο Τριφθοροξικό οξύ Τριφθοροαιθανόλη Βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα Θρεονίνη Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Χρόνος έκλουσης (resolution time) Τρυπτοφάνη

16 16 Α. Θεωρητικό Μέρος Trt Τyr Val Z (ή Cbz) ΚΝΣ ΠΝΣ ΣΚΠ Τριφαινυλομεθυλο (τρίτυλο) ομάδα Τυροσίνη Βαλίνη Βενζυλοξυκαρβονυλομάδα Κεντρικό νευρικό σύστημα Περιφερικό νευρικό σύστημα Σκλήρυνση Κατά Πλάκας

17 17 Α. Θεωρητικό Μέρος Α. Θεωρητικό Μέρος

18 18 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.1. Σκλήρυνση κατά πλάκας A.1.1. Γενικά Η πολλαπλή σκλήρυνση (multiple sclerosis, MS) ή αλλιώς σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια αυτοάνοση φλεγμονώδης απομυελινωτική νόσος και ασθένεια του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ). Κύριος στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος είναι η μυελίνη που περιβάλλει τα νεύρα με αποτέλεσμα την καταστροφή της [1]. Τα συμπτώματα της ΣΚΠ διαφέρουν από ασθενή σε ασθενή καθώς δεν υπάρχουν συγκεκριμένα πρώτα συμπτώματα. Χαρακτηριστικά είναι η μυϊκή ατροφία και η αδυναμία υποστήριξης του σώματος [2]. Επίσης, επηρεάζονται οι φυσικές ικανότητες του ατόμου όπως είναι η όραση, η αφή, η ομιλία, η ισορροπία αλλά και οι νοητικές όπως είναι διαταραχές στη μνήμη και στη σκέψη. Δεν βιώνουν όλοι οι ασθενείς όλα τα συμπτώματα και ο βαθμός εμφάνισής ή επιδείνωσης τους ποικίλλει [3]. Ανάλογα με την πορεία της νόσου διακρίνουμε τις εξής μορφές: Σχήμα Α.1: Μορφές της ΣΚΠ. Προσαρμοσμένη από [3]. Η εμφάνιση της ΣΚΠ αυξάνεται με την αύξηση του γεωγραφικού πλάτους, τόσο ως προς το βόρειο όσο και προς το νότιο ημισφαίριο. Ο παρακάτω χάρτης παρουσιάζει τον πληθυσμό ασθενών με ΣΚΠ ανά τον κόσμο.

19 19 Α. Θεωρητικό Μέρος Σχήμα Α.2: Παγκόσμιος χάρτης ασθενών με ΣΚΠ [3]. Στις ΗΠΑ υπολογίζεται ότι περίπου ασθενείς πάσχουν από ΣΚΠ με περίπου νέα περιστατικά κάθε χρόνο ενώ εκτιμάται ότι υπάρχουν 2,5 εκατομμύρια ασθενείς παγκόσμια. Η ασθένεια είναι πιο συχνή στις γυναίκες από ότι στους άνδρες με αναλογία 2-3 προς 1 και η διάγνωσή της γίνεται συνήθως σε ηλικίες χρονών, με τα πρώτα συμπτώματα να εμφανίζονται σε ηλικία χρονών. Η ΣΚΠ δεν θεωρείται κληρονομική ασθένεια αλλά πιστεύεται ότι μπορεί να υπάρχει προδιάθεση για την ανάπτυξή της. Η γενετική προδιάθεση σε συνδυασμό με περιβαλλοντολογικούς ή ιογενείς παράγοντες είναι η κύρια υπόθεση γιαο που οφείλεται, αν και δεν έχει βρεθεί τι προκαλεί την ασθένεια αυτή. Άνθρωποι που πάσχουν από άλλες αυτοάνοσες ασθένειες, όπως διαβήτη τύπου 1, βρίσκονται σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης της ΣΚΠ [4]. Α.1.2. Νευρικό σύστημα Το νευρικό σύστημα αποτελείται από το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ), που αποτελείται από τον εγκέφαλο και τον νωτιαίο μυελό και το Περιφερικό Νευρικό Σύστημα (ΠΝΣ), που αποτελείται από τα νεύρα [1]. Αποτελείται από έναν τύπο ιστού που ονομάζεται νευρικός και χωρίζεται σε δύο κατηγορίες: τα νευρικά κύτταρα ή νευρώνες και τα νευρογλοιακά κύτταρα ή νευρογλοία. Ο νευρικός ιστός συλλέγει, επεξεργάζεται, χρησιμοποιεί και μεταβιβάζει τις πληροφορίες που δέχεται τόσο από εξωτερικά ερεθίσματα όσο και από τον εγκέφαλο. Το ΠΝΣ διακρίνεται στο Αυτόνομο νευρικό σύστημα (Somatic nervous system, SoS) που περιέχει όλους τους νευρώνες που συνδέονται με τους σκελετικούς μύες και το δέρμα και χειρίζεται εθελοντικά τον έλεγχο κινήσεων του σώματος και στο Σωματικό νευρικό σύστημα (Autonomic nervous system, AS) που

20 20 Α. Θεωρητικό Μέρος λειτουργεί ως ένα ακούσιο σύστημα ελέγχου και είναι υπεύθυνο για τις σπλαχνικές λειτουργίες. Α Νευρώνες Οι νευρώνες αποτελούνται από τα εξής τμήματα: 1. Δενδρίτες: Είναι πολυάριθμες δενδροειδείς επεκτάσεις που βρίσκονται στην αρχή του νευρώνα και βοηθούν στην αύξηση της επιφάνειας του σώματος του κυττάρου. Λαμβάνουν πληροφορίες από άλλους νευρώνες και μεταφέρουν ηλεκτρικά σήματα στο κυτταρικό σώμα. 2. Kυτταρικό σώμα: Περιέχει τον πυρήνα και άλλα σημαντικά συστήματα, όπως μιτοχόνδρια και σύστημα Golgi και είναι το σημείο όπου τα σήματα από τους δενδρίτες ενώνονται και μεταβιβάζονται. Το σώμα και ο πυρήνας δεν έχουν ενεργό ρόλο στην μεταβίβαση των νευρικών σημάτων αλλά χρησιμεύουν στην διατήρηση της λειτουργίας του νευρώνα. 3. Άξονας ή νευράξονας: Είναι μια επιμήκης ίνα που εκτείνεται από το κυτταρικό σώμα μέχρι τα τελικά κομβία και μεταδίδει τα νευρικά σήματα (νευρικές ώσεις). Όσο μεγαλύτερος είναι ο άξονας τόσο πιο γρήγορα μεταδίδονται οι πληροφορίες. Μερικοί νευράξονες καλύπτονται από μία λιποειδής ουσία, τη μυελίνη, η οποία δρα ως μονωτής και βοηθά στην επιτάχυνση μετάδοσης των ώσεων. 4. Τελικά κομβία: Βρίσκονται στο τέλος του νευράξονα και είναι υπεύθυνοι για την μεταφορά του σήματος σε άλλους νευρώνες. Μετά τα τελικά κομβία υπάρχει ένα κενό γνωστό ως σύναψη. Τα νευρικά σήματα μεταδίδονται μέσω των συνάψεων με τη βοήθεια νευροδιαβιβαστών [5]. Α Νευρογλοία Τα νευρογλοία υποβοηθούν τη μετάδοση των νευρικών σημάτων αφενός με το να θρέφουν και να προστατεύουν τα νευρικά κύτταρα και αφετέρου με το να διευκολύνουν τις νευρικές ώσεις. Υπάρχουν τρεις κύριοι τύποι νευρογλοίων στο ΚΝΣ και δύο τύποι στο ΠΝΣ.

21 21 Α. Θεωρητικό Μέρος Σχήμα Α.3: Τύποι νευρογλοιακών κυττάρων. Προσαρμοσμένη από [6]. Κεντρικό Νευρικό Σύστημα: 1. Μακρογλοία: Τα κύτταρα αυτά είναι μεγαλύτερα από τα άλλα νευρογλοία και διαχωρίζονται στα αστροκύτταρα (έχουν σχήμα αστεριού και μακριές αποφυάδες) και στα ολιγοδενδροκύτταρα (μικρότερα σε μέγεθος από τα αστροκύτταρα με μικρότερες αποφυάδες). 2. Μικρογλοία: Έχουν πολύ μικρό μέγεθος, μια ιδιότητα που τους επιτρέπει να πολλαπλασιάζονται γύρω από μία τραυματισμένη περιοχή του ΚΝΣ. 3. Επενδυματικά κύτταρα: Συμμετέχουν στην ανάπτυξη των νευρώνων. Περιφερικό Νευρικό Σύστημα: 1. Δορυφορικά κύτταρα: Έχουν παρόμοιες λειτουργίες με τα μακρογλοία. 2. Κύτταρα Schwann: Τα κύτταρα αυτά είναι υπεύθυνα για την δημιουργία και την επιδιόρθωση του ελύτρου της μυελίνης στο ΠΝΣ [7]. A.1.3. Μυελίνη Όπως αναφέρθηκε, η μυελίνη είναι ένας ηλεκτρικός μονωτής που καλύπτει τους νευράξονες. Αποτελείται από 40% νερό και 60% ξηρή μάζα, η οποία τόσο στο ΚΝΣ όσο και στο ΠΝΣ, χαρακτηρίζεται από υψηλό ποσοστό λιπιδίων (70-85%) και κατ επέκταση από χαμηλό ποσοστό πρωτεϊνών (15-30%). Το μέχρι στιγμής αποδεχόμενο μοντέλο της μεμβράνης της μυελίνης υποδεικνύει ότι υπάρχει μία

22 22 Α. Θεωρητικό Μέρος διπλοστοιβάδα λιπιδίων με ενσωματωμένες σε αυτή πρωτεΐνες και με εξωτερικές πρωτεΐνες που συνδέονται στη μεμβράνη μέσω συνδετών. Το στρώμα μυελίνης που περιβάλλει τον νευράξονα δεν είναι συνεχές αλλά διακόπτεται ανά τακτά διαστήματα. Τα σημεία αυτά, στα οποία δεν υπάρχει μυελίνη, ονομάζονται κόμβοι Ranvier και είναι υπεύθυνα για το «άλμα» των νευρικών ώσεων, καθώς η μυελίνη αποτελεί μονωτικό υλικό και τα ενεργά δυναμικά δεν μπορούν να τη διαπεράσουν. Με τον τρόπο αυτό, αυξάνεται η ταχύτητα διάδοσης των ενεργών δυναμικών κατά μήκος της νευρικής ίνας [8]. Σχήμα Α.4: Έλυτρο μυελίνης. Προσαρμοσμένη από [9]. Οι πρωτεΐνες της μυελίνης θεωρούνται πιθανοί στόχοι του ανοσοποιητικού συστήματος στην ΣΚΠ. Συχνά χρησιμοποιείται ο όρος ανοσοκυρίαρχος επίτοπος για να περιγραφεί ο επίτοπος εκείνος που έχει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ανοσοαπόκρισης και στην αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων που είναι εξειδικευμένα προς αυτόν. Έχει βρεθεί πως συγκεκριμένοι επίτοποι της μυελίνης αναγνωρίζονται από τα ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα σε σημεία όπου υπάρχει εκτενής απομυελίνωση [10]. Οι κυριότερες πρωτεΐνες της μυελίνης είναι [11, 12]: PLP (Proteolipid Myelin Protein), Πρωτεολιπιδική Πρωτεΐνη της Μυελίνης: Είναι μία από τις κύριες πρωτεΐνες της μυελίνης με σημαντικό ρόλο στην δομή και την σταθερότητα της. Παρόλο που στα θηλαστικά αποτελεί πάνω από το 50% της μυελίνης στο ΚΝΣ, δεν έχει κατανοηθεί πλήρως ο ρόλος της στην ΣΚΠ. Είναι μία διαμεμβρανική και πολύ υδρόφοβη πρωτεΐνη, που το 48% της αλληλουχίας της είναι μη πολικά ή αρωματικά αμινοξέα. Η υδροφοβικότητα της ενισχύεται και από 14 κατάλοιπα κυστεΐνης, τα οποία είτε υφίστανται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και ακυλιώνονται με λιπαρά οξέα είτε εμπλέκονται σε ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς. Η ελάχιστη έως μηδενική διαλυτότητα της στο νερό προκάλεσε εμπόδια στις πρώτες προσπάθειες που έγιναν για την απομόνωση και τον καθαρισμό της αλλά

23 23 Α. Θεωρητικό Μέρος και στην ανοσολογική ανάλυσή της [13]. Γενικά είναι ευδιάλυτη στους οργανικούς διαλύτες και το μοριακό βάρος της φτάνει τα 30 kda. Έχει παρατηρηθεί πως οι ασθενείς που πάσχουν από ΣΚΠ έχουν αυξημένο πληθυσμό Τ-κυττάρων, ειδικών για τα πεπτίδια της PLP σε σχέση με τους υγιείς ανθρώπους, επομένως συμπεραίνεται πως η PLP έχει καθοριστικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου. Η PLP των ανθρώπων και των τρωκτικών έχουν αρκετούς κοινούς επιτόπους που αναγνωρίζονται από τα Τ-κύτταρα. Ο επίτοπος έχει μελετηθεί εκτενέστερα και επεξεργάστηκε και στην παρούσα διπλωματική. Η αλληλουχία του στη μυελίνη των ανθρώπων είναι: is 139 -Cys-Leu-Gly-Lys-Trp 144 -Leu-Gly-is 147 -Pro-Asp-Lys-Phe-Val-Gly-Ile 154 Η τρυπτοφάνη και η ιστιδίνη, στις θέσεις 144 και 147 αντίστοιχα, είναι σημεία όπου γίνεται η σύνδεση με τους υποδοχείς των T-κυττάρων [14]. MBP (Myelin Basic Protein), Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης: Η πρωτεΐνη αυτή μαζί την PLP αποτελούν το 60-80% των πρωτεϊνών της μυελίνης. Γενικά το ποσοστό της κυμαίνεται από 5%-18% των συνολικών πρωτεϊνών του ΠΝΣ ενώ στο ΚΝΣ φτάνει το 30%. Είναι μια υδρόφοβη πρωτεΐνη, υπεύθυνη για την δομή του ελύτρου της μυελίνης και βρίσκεται στην επιφάνεια της μυελινικής μεμβράνης. Η MBP έχει μελετηθεί εκτενέστερα, καθώς ήταν το πρώτο μυελινικό αντιγόνο που χρησιμοποιήθηκε σε ζώα για την πρόκληση κυτταρικής ανοσοαπόκρισης για την επαγωγή EAE (Experimental Allergic Encephalomyelitis, Πειραματική Αλλεργική/ Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα) που είναι το ζωικό μοντέλο της ΣΚΠ. Οι πιο γνωστοί επίτοποι της MBP είναι οι επίτοποι και 87-99, καθώς έχει παρατηρηθεί πως σε ασθενείς με ΣΚΠ υπάρχει μεγάλος αριθμός ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων που τους αναγνωρίζουν. Ο ανθρώπινος επίτοπος MBP είναι ο εξής: Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val 87 -is-phe-phe-lys 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 Η λυσίνη στη θέση 91 θεωρείται η κύρια σύνδεση του πεπτιδίου στον υποδοχέα των Τ-κυττάρων (TCR) ενώ η σύνδεση επιτυγχάνεται επίσης και μέσω της is, Phe και Pro στις θέσεις 88, 89 και 96 αντίστοιχα. Οι Val 87, Phe 90, Asn 92, Ile 93 και

24 24 Α. Θεωρητικό Μέρος Thr 98 είναι τα σημεία στα οποία επιτυγχάνεται η σύνδεση του πεπτιδίου με το MC [15, 16]. MAG (Myelin-Associated Glycoprotein), Mυελινο-σύνδετη Γλυκοπρωτεΐνη: Βρίσκεται σε μικρό ποσοστό τόσο στο ΚΝΣ όσο και στο ΠΝΣ. Η MAG έχει μία μόνο διαμεμβρανική περιοχή, η οποία διαχωρίζει το γλυκοζυλιωμένο εξωκυτταρικό κομμάτι της από την ενδοκυτταρική καρβοξυ-τελική περιοχή της. Βρίσκεται στην περιαξονική μεμβράνη του ελύτρου της μυελίνης και έχει σημαντικό ρόλο στην επικοινωνία των αξονικών-νευρογλοιακών συνάψεων. Η απουσία της MAG προκαλεί μείωση της απόδοσης της μυελινοποίησης από τα ολιγοδενδροκύτταρα. MG (Myelin ligodendrocyte Glycoprotein), Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών: Είναι μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, με μοριακό βάρος 26 kda και βρίσκεται στην εξωτερική επιφάνεια του ελύτρου της μυελίνης. Η θέση αυτή μπορεί να έχει ρόλο στην μεταγωγή σημάτων, δηλαδή στην μετάδοση πληροφοριών από τον εξωκυττάριο χώρο στα ολιγοδενδροκύτταρα. Οι πιο γνωστοί επίτοποι της MG είναι οι 1-22 και 35-55, καθώς αποτελούν τους κύριους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους της πρωτεΐνης. Έχει παρατηρηθεί πως αντισώματα για την MG πρωτεΐνη συνδέονται με καταστροφή της μυελίνης τόσο στην ΣΚΠ όσο και στο μοντέλο της ΕΑΕ [17]. Ειδικότερα, ο επίτοπος MG επάγει ανοσοαπόκριση στο ΚΝΣ και φλεγμονώδη απομυελίνωση. Η αλληλουχία του ανθρώπινου επιτόπου MG είναι: Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-is-Leu-Tyr-Arg- Asn-Gly-Lys 55 Ο επίτοπος MG των ποντικιών διαφέρει με τον ανθρώπινο μόνο στο αμινοξύ στη θέση 42, όπου αντί για προλίνη υπάρχει σερίνη. Σημαντικά αμινοξέα για τη σύνδεση του πεπτιδίου με το TCR στο τριμοριακό σύμπλοκο θεωρούνται οι Arg 41, Phe 44 και Arg 46 ενώ για την σύνδεση με το MC οι Tyr 40, Pro 43, Ser 45 και Val 48. MBP: (Myelin associated-ligodendrocytic Basic Protein), Μυελινοσύνδετη Βασική Πρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών: Έχει παρόμοια δομή με την ΜΒΡ αλλά εκφράζεται αποκλειστικά στο ΚΝΣ.

25 25 Α. Θεωρητικό Μέρος Το ΠΝΣ περιέχει επίσης κάποιες πρωτεΐνες: P 0 γλυκοπρωτεΐνη: Έχει μοριακό βάρος 30 kda και αποτελείται από περίπου 220 αμινοξέα. Είναι η κύρια πρωτεΐνη στο ΠΝΣ και έχει υποτεθεί πως παρόλο που έχει πολλές διαφορές με την PLP τόσο στην αμινοξική αλληλουχία όσο και στις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, έχει παρόμοιο ρόλο στην δημιουργία δομής της μυελίνης στο ΠΝΣ. PMP-22 (Peripheral myelin protein-22): Αποτελεί λιγότερο από 5% των συνολικών πρωτεϊνών του ΠΝΣ κ έχει μοριακό βάρος 22 kda. Σε αντίθεση με την P 0, εκφράζεται και σε άλλους ιστούς και όχι μόνο στα νεύρα. Έχει τέσσερις υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές και είναι μία τετραμερής πρωτεΐνη, όπως η PLP. P 2 πρωτεΐνη: Έχει μοριακό βάρος 15 kda και ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών FABP (Fatty Acid Binding Proteins). Άλλες πρωτεΐνες της μυελίνης είναι η 2, 3 -κυκλικό νουκλεότιδο 3 - φωσφοδιεστεράση (CP), η S-100b πρωτεΐνη, η GFAP πρωτεΐνη, η αβ κρυσταλλίνη και οι heat shock πρωτεΐνες, μία ευρεία κατηγορία πρωτεϊνών που αποκρίνονται στο στρες και είναι συστατικά του περιβλήματος της μυελίνης. Α.1.4. Ανοσία Με τον όρο ανοσία καλούμε την βιολογική άμυνα του οργανισμού απέναντι σε μολύνσεις, ασθένειες και άλλους εξωτερικούς ανεπιθύμητους βιολογικούς παράγοντες. Διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: την φυσική (μη ειδική) ανοσία και την επίκτητη (ειδική) ανοσία. Σχήμα Α.5: Διάγραμμα κατηγοριοποίησης της ανοσίας. Προσαρμοσμένη από [18]. Η φυσική ανοσία δεν είναι επαρκής για την προφύλαξη του οργανισμού από τα αντιγόνα. Με τον όρο αντιγόνο (Αg) καλούμε κάθε ξένη προς τον οργανισμό ουσία που ενεργοποιεί το ανοσοποιητικό σύστημα. Οι περιοχές του αντιγόνου που

26 26 Α. Θεωρητικό Μέρος αναγνωρίζονται από τον φορέα του αντιγόνου ονομάζονται αντιγονικοί προσδιοριστές ή επίτοποι και η πρωτεΐνη που συντίθεται σε ένα ζώο ως αντίδραση στην ύπαρξη του αντιγόνου λέγεται αντίσωμα ή ανοσοσφαιρίνη (Ig). Μικρά ξένα μόρια, όπως συνθετικά πεπτίδια, είναι επίσης ικανά να προκαλέσουν την ενεργοποίηση των αντισωμάτων, με την προϋπόθεση να περιέχουν έναν επίτοπο και να είναι δεσμευμένα σε έναν μακρομοριακό φορέα. Το μικρό αυτό ξένο μόριο λέγεται απτένιο [19]. Κύρια στοιχεία της φυσικής ανοσίας είναι οι φυσικοί φραγµοί, τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (atural Killer cells, K cells) και το συµπλήρωµα. Η φυσική ανοσία έχει άμεση δράση, είναι γενική για τα μικρόβια και δεν έχει μνήμη, σε αντίθεση με την επίκτητη ανοσία η οποία χρειάζεται χρόνο (έως και μέρες) για να δράσει, έχει υψηλή ειδικότητα για αντιγόνα και έχει μνήμη. Υπάρχουν δύο τύποι επίκτητης ανοσίας: η χυμική που ενεργοποιείται για εξωκυττάριους μικροοργανισμούς και η κυτταρική που ενεργοποιείται για ενδοκυττάριους μικροοργανισμούς. Η χυμική ανοσία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των Β-λεμφοκυττάρων, τα οποία υφίστανται κυτταρική διαίρεση προς αύξηση τους πληθυσμού τους και διαφοροποιούνται σε Β-λεμφοκύτταρα μνήμης αλλά και σε πλασματοκύτταρα που παράγουν αντισώματα. Τα αντισώματα αυτά εισέρχονται στο αίμα, παρεμποδίζουν τις λοιμώξεις και εξαλείφουν τους εξωκυττάριους μικροοργανισμούς. Η κυτταρική ανοσία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των Τ- λεμφοκυττάρων, τα οποία διαφοροποιούνται σε T-βοηθητικά που φέρουν στην επιφάνειά τους την CD4 + πρωτεΐνη (T-helper, Th) και T-κυτταροτοξικά που φέρουν στην επιφάνειά τους την CD8 + πρωτεΐνη (Τ-cytotoxic, T c ) [20]. Αφού το κύτταρο προσβληθεί, πραγματοποιείται στο ενδοπλασματικό του δίκτυο η υδρόλυση των πρωτεϊνών του αντιγόνου σε πεπτίδια και αμινοξέα από έναν κυτταροφάγο. Η διαδικασία αυτή είναι απαραίτητη καθώς τα Τ κύτταρα δεν μπορούν να αναγνωρίσουν τα αντιγόνα σε ελεύθερη μορφή, αλλά μόνο ως σύμπλοκα του αντιγονικού πεπτιδίου με το κατάλληλο MC μόριο. Τα μόρια αυτά ονομάστηκαν αρχικά αντιγόνα ιστοσυμβατότητας (Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας - Major istocompatibility Complex, ΜΗC) γιατί έδιναν το μέτρο συμβατότητας των ιστών του δότη και του λήπτη σε μία μεταμόσχευση. Σήμερα ονομάζονται αντιγόνα των ανθρώπινων λευκοκυττάρων (uman Leukocyte Antigen, LA) και λειτουργούν ως υποδοχείς των αντιγονικών πεπτιδίων που προκύπτουν μετά την υδρόλυση και παρουσιάζονται στην επιφάνεια των προσβεβληµένων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (Antigen Presenting Cell, APC).

27 27 Α. Θεωρητικό Μέρος Τα MC είναι γλυκοπρωτεΐνες της κυτταρικής μεμβράνης και χωρίζονται σε 2 κατηγορίες: MC τάξης Ι και MC τάξης Ι. Τα MC τάξης Ι εκφράζονται από όλα τα εμπύρηνα κύτταρα του οργανισμού και συνδέονται με την πρωτεΐνη CD8 + των Tc κυττάρων ενώ τα μόρια MC τάξης ΙΙ εκφράζονται κυρίως στα Β-λεμφοκύτταρα, τα Τ-λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα. Συνδέονται με πεπτιδικά αντιγόνα που αποτελούν θραύσματα από μεγαλύτερα αντιγόνα και εισέρχονται στο αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο, όπου επεξεργάζονται στα λυσοσώματα [21]. Εφόσον το πεπτίδιο, που προέρχεται από το αντιγόνο, έχει μεταφερθεί στην επιφάνεια του APC με τη βοήθεια του MC μορίου, ένα Τ-λεμφοκύτταρο και συγκεκριμένα ένα T h κύτταρο, το αναγνωρίζει και προσδένεται μέσω του υποδοχέα του T-κυττάρου (Τ-cell Receptor, TCR) σε αυτό. Έτσι, δημιουργείται τριμοριακό σύμπλοκο μεταξύ του υποδοχέα TCR, του αντιγόνου/πεπτιδίου και της ιστοσυμβατής πρωτεΐνης MC [22]. Σχήμα Α.6: Τριμοριακό σύμπλοκο. Προσαρμοσμένη από [23]. Το Τ h κύτταρο ενεργοποιείται και παράγει δύο νέα είδη Τ h κυττάρων, τα Τ h1 και τα Τ h2. Τα Τ h1 είναι Τ h κύτταρα μνήμης, που εκκρίνουν κυρίως IL-2 (Ιντερλευκίνη- 2) και IF-γ (Ιντερφερόνες-γ) και βοηθούν στην ενεργοποίηση μακροφάγων ή άλλων κυτταροφάγων (κυτταρική ανοσία) ενώ τα Τ h2 παράγουν κυτταροκίνες (κυρίως IL-4 και IL-1), οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν τα B-λεμφοκύτταρα ώστε να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται (χυμική ανοσία). Ορισμένοι ασθενείς με ΣΚΠ εμφανίζουν Τh 1 ανοσολογική κατάσταση [24].

28 28 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.1.5. Αυτοανοσία- Παθοφυσιολογία της ΣΚΠ Αυτοανοσία ονομάζουμε την κατάσταση όπου ένας οργανισμός αναγνωρίζει λανθασμένα ένα δικό του κομμάτι (κύτταρο, ιστό, όργανο) ως αντιγονικό παράγοντα και του επιτίθεται μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος με σκοπό να το καταστρέψει. Στην περίπτωση της ΣΚΠ, το ανοσοποιητικό σύστημα επιτίθεται στη μυελίνη. Εφόσον ένα μυελινικό αντιγόνο μεταφερθεί στην επιφάνεια του APC, τα Τ h κύτταρα θα το αναγνωρίσουν και έτσι θα ξεκινήσει η ανοσολογική απόκριση. Συγκεκριμένα, τα Τ h κύτταρα θα εκκρίνουν κυτταροκίνες όπως ιντερφερόνες και ιντερλευκίνες, ενώ παράλληλα θα αρχίσει και ο πολλαπλασιασμός των Β και των Τ λεμφοκυττάρων για ενίσχυση της άμυνας του οργανισμού. Τα Τ-λεμφοκύτταρα δεσμεύονται στα μόρια συγκόλλησης καθώς επάγεται η υπερέκφραση αυτών των μορίων στα επιθηλιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα να διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (Blood-Brain Barrier, BBB) και να μεταφέρονται στο ΚΝΣ [25, 26]. Ταυτόχρονα, κάποια άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως είναι τα Β κύτταρα και τα μακροφάγα, διαπερνούν και αυτά το ΒΒΒ και εισέρχονται στο ΚΝΣ με αποτέλεσμα την επιπλέον αύξηση της άμυνας του οργανισμού απέναντι στο μυελινικό αντιγόνο [27, 28]. Τα μακροφάγα επιτίθενται στη μυελίνη είτε με φαγοκυττάρωση είτε με έκκριση φλεγμονοδών κυτταροκινών και τα Β-λεμφοκύτταρα παράγουν αντισώματα που επιτίθενται στη μυελίνη και στα ολιγοδενδροκύτταρα. Το συμπλήρωμα επιτίθεται επίσης στη μυελίνη. Όλα αυτά έχουν ως αποτέλεσμα μία αυξανόμενης έντασης επίθεση στη μυελίνη και τη δημιουργία φλεγμονών. Η μυελίνη καταστρέφεται με συνέπεια την απομυελίνωση των νευραξόνων, οπότε πλέον δεν γίνεται καλής ποιότητας μεταφορά του νευρικού μηνύματος και δημιουργούνται τα παθοφυσιολογικά συμπτώματα της ΣΚΠ.

29 29 Α. Θεωρητικό Μέρος Σχήμα Α.7: Ανοσοαπόκριση στην ΣΚΠ [29]. Τα τελευταία χρόνια έχει προταθεί το μοντέλο της ιογενούς θεωρίας, σύμφωνα με το οποίο τα Τ-κύτταρα μπορούν να ενεργοποιηθούν από παθογόνους οργανισμούς όπως ιοί, μύκητες και βακτήρια. Η ενεργοποίηση οφείλεται στις δομικές ομοιότητες που έχουν οι επίτοποι των παθογόνων με τους επιτόπους των πρωτεϊνών και των αυτοαντιγόνων και έτσι μπορεί να γίνει λανθασμένη έναρξη της ανοσολογικής απόκρισης απέναντι στον παθογόνο μικροοργανισμό. Το φαινόμενο αυτό καλείται μοριακή μίμηση και στην περίπτωση της ΣΚΠ, η αμινοξική αλληλουχία των αντιγονικών πεπτιδίων μπορεί να μοιάζει σε τρία-τέσσερα αμινοξέα με αντίστοιχες αλληλουχίες των πρωτεϊνών της μυελίνης. Με άλλα λόγια, η ανοσολογική απόκριση του οργανισμού σε ένα παθογόνο είναι πιθανόν να σηματοδοτήσει την έναρξη της ασθένειας ή την υποτροπή της [30]. Ένα παράδειγμα είναι o επίτοπος της MBP, στον οποίο υπάρχουν αλληλουχίες τεσσάρων έως έξι αμινοξέων που είναι όμοιες με τμήματα πρωτεϊνών που υπάρχουν στον ιό της ηπατίτιδας Β, της ιλαράς, της γρίπης στον αδενοϊό (adenovirus), στον ιό Epstein-Barr, στον ιό του έρπητα 6 (V-6) και στον ιό papilloma (PV) [31].

30 30 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.1.6. Τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα (APLs) Λόγω της ομοιότητας των κλινικών και παθολογικών συμπτωμάτων που υπάρχουν ανάμεσα στην ΣΚΠ και την EAE, έχει προταθεί πως τα ενεργοποιημένα Τ- κύτταρα που επιτίθενται στη μυελίνη παίζουν μεγάλο ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Οι πρωτεΐνες MBP και PLP φαίνεται πως είναι οι κύριοι στόχοι των Τ-κυττάρων στην ΣΚΠ, καθώς σε ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο βρέθηκε πως υπάρχει αυξημένος πληθυσμός των ειδικών Τ-κυττάρων για τις πρωτεΐνες αυτές στο περιφερικό αίμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό αλλά και αυξημένη ανοσοαπόκριση τους σε συγκεκριμένους επιτόπους τους [32]. Μία προσέγγιση για την αντιμετώπιση της ασθένειας είναι ο σχεδιασμός και η σύνθεση τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων (Altered Peptide Ligands, APLs) των ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης. Η προσέγγιση αυτή χαρακτηρίζεται από αλλαγή στην αλληλουχία των αμινοξέων, έτσι ώστε να αλλάξει η αλληλεπίδραση μεταξύ του APL και του υποδοχέα των Τ-κυττάρων ή του μορίου MC. Με αυτόν τον τρόπο, είναι δυνατόν να γίνει μετατροπή της Th 1 ανοσοαπόκρισης (προφλεγμονώδης απόκριση) σε Th 2 (αντιφλεγμονώδης απόκριση). [33]. Α.1.7. Διάγνωση-Υπάρχουσες θεραπείες στην ΣΚΠ Η διάγνωση βασίζεται στην έναρξη της νόσου στη νεαρή ηλικία, στο χαρακτηριστικό ιστορικό των εξάρσεων και υφέσεων και σε διάφορες εργαστηριακές εξετάσεις όπως είναι η μαγνητική τομογραφία, η οποία έχει την μεγαλύτερη ευαισθησία. Στην κλινική πράξη οι ασθενείς κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες, όσον αφορά την βεβαιότητα της διάγνωσης (κριτήρια των Poser) [1]. Βέβαιη πολλαπλή σκλήρυνση Δυνατή (probable) πολλαπλή σκλήρυνση Πιθανή πολλαπλή σκλήρυνση Μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί αποτελεσματική θεραπεία για την αντιμετώπιση της νόσου. Χρησιμοποιούνται θεραπευτικές αγωγές για την επιβράδυνση της εξέλιξης της νόσου, την πρόληψη υποτροπής της ασθένειας, την θεραπεία των συμπτωμάτων και την πρόληψη της αναπηρίας. Μερικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται είναι:

31 31 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.1: Νεότερα φάρμακα στην ΣΚΠ [34]. Δραστική ουσία Εμπορική ονομασία Χρήση Teriflunomide Aubagio Επιβράδυνση εξέλιξης της νόσου Dimethyl Fumarate Tecfidera Επιβράδυνση εξέλιξης της νόσου Dalfampridine Ampyra Αναστολέας αντλίας καλίου Alemtuzumab Lemtrada Μονοκλωνικό αντίσωμα- Αντιμετώπιση υποτροπιάζουσων μορφών της ΣΚΠ

32 32 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.2. Πεπτιδική σύνθεση Α.2.1. Αμινοξέα-Πρωτεΐνες-Πεπτιδικός δεσμός Τα αμινοξέα αποτελούν τα βασικά δομικά στοιχεία των πρωτεϊνών και καθορίζουν τις χαρακτηριστικές ιδιότητές τους. Ένα α-αμινοξύ αποτελείται από μία καρβοξυλομάδα, μία αμινομάδα και μία χαρακτηριστική ομάδα R, που είναι δεσμευμένη στο άτομο του α-άνθρακα. Σχήμα Α.8 : Δομή α-αμινοξέος. Προσαρμοσμένη από [35]. Όλα τα αμινοξέα εκτός από την Pro έχουν την ίδια βασική δομή και διαφέρουν στη φύση της πλευρικής αλυσίδας. Η Pro αντίθετα, είναι το μοναδικό αμινοξύ που έχει μια κυκλική δομή που εμπεριέχει μια δευτεροταγή αμίνη [36]. Τα αμινοξέα είναι είκοσι στο σύνολό τους και μπορούν να ταξινομηθούν ως ουδέτερα, όξινα και βασικά, ανάλογα με τη δομή της πλευρικής αλυσίδας τους. Δεκαπέντε από τα είκοσι αμινοξέα έχουν ουδέτερες πλευρικές αλυσίδες, δύο διαθέτουν μία επιπλέον καρβοξυλική ομάδα (Asp και Glu) ενώ τρία φέρουν στις πλευρικές αλυσίδες βασικές αμινομάδες (Lys, Arg και is) (Σχήμα Α.9) Ο ανθρώπινος οργανισμός μπορεί να βιοσυνθέσει μόνο δέκα από αυτά τα αμινοξέα. Τα υπόλοιπα δέκα ονομάζονται απαραίτητα αμινοξέα, γιατί ο οργανισμός πρέπει να τα αποκτήσει μέσω της διατροφής [37].

33 33 Α. Θεωρητικό Μέρος Σχήμα Α.9: Οι τέσσερις κατηγορίες αμινοξέων. Προσαρμοσμένη από [38]. Τα φυσικά αμινοξέα είναι συνολικά είκοσι και μπορούν να υπάρξουν σε δύο εναντιομερείς μορφές, την L και την D, ενώ στην φύση η βιοσύνθεση των πρωτεϊνών γίνεται με την L στερεοχημική διάταξη. Όλα τα αμινοξέα εκτός της Gly είναι χειρόμορφα εξαιτίας της παρουσίας ενός στερεογονικού κέντρου, που είναι ο α- άνθρακας. Επίσης, όλα έχουν S διαμόρφωση στον α-άνθρακα, εκτός από την Cys, της οποίας η L μορφή αντιστοιχεί στην R διαμόρφωση. Η Thr και η Ile έχουν και δεύτερο στερεογονικό κέντρο στον β-άνθρακα, έχοντας έτσι 4 διαστερεομερή η καθεμία. Συγκεκριμένα, η L-Thr έχει στερεοχημεία 2S,3R και η L-Ile έχει στερεοχημεία 2S,3S. Σχήμα Α.10: Στερεοχημεία της L-Thr και της L-Ile. Προσαρμοσμένη από [39].

34 34 Α. Θεωρητικό Μέρος Ονομάζουμε πεπτίδια τις αλυσίδες που αποτελούνται από 50 ή λιγότερα αμινοξέα ενώ με τον όρο πρωτεΐνες αναφερόμαστε στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες που αποτελούνται από 50 έως 2000 κατάλοιπα αμινοξέων [37]. Οι πρωτεΐνες είναι πολύπλοκα μακρομόρια στους ζώντες οργανισμούς και εξυπηρετούν βασικές λειτουργίες σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες. Λόγω των ιδιοτήτων τους μπορούν να συμμετέχουν σε ένα ευρύ φάσμα λειτουργιών. Η λειτουργία μιας πρωτεΐνης εξαρτάται άμεσα από την τρισδιάστατη δομή της, η οποία καθορίζεται από την αλληλουχία των αμινοξέων που αποτελούν τη πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες περιέχουν μια μεγάλη σειρά λειτουργικών ομάδων όπως είναι οι αλκοόλες, οι θειόλες, οι καρβοξυλικές ομάδες και μπορούν να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους ή και με άλλα βιολογικά μακρομόρια. Ακόμη, μπορούν να λειτουργήσουν ως δομικά στοιχεία του κυτταρικού σκελετού ή ως αρθρωτά τμήματα ανάλογα την ευκαμψία που παρουσιάζουν λόγω της τρισδιάστατης δομής τους [19]. Οι πεπτιδικές αλυσίδες αποτελούνται από αλυσίδες μονομερών που συνδέονται μεταξύ τους με αμιδικό δεσμό, ο οποίος λέγεται και πεπτιδικός δεσμός. Ο πεπτιδικός δεσμός είναι ο ομοιοπολικός δεσμός που δημιουργείται ανάμεσα σε μία α- καρβοξυλομάδα και μία α-αμινομάδα δύο αμινοξέων. Σχήμα Α.11: Πεπτιδικός δεσμός. Προσαρμοσμένη από [40]. Το μονήρες ζεύγος ηλεκτρονίων του αζώτου είναι απεντοπισμένο, λόγω της αλληλοεπικάλυψης με τα τροχιακά της καρβονυλομάδας. Η αλληλοεπικάλυψη αυτή έχει ως αποτέλεσμα να αποκτά ο αμιδικός δεσμός C- εν μέρει χαρακτήρα διπλού δεσμού, οπότε η ελεύθερη περιστροφή του περιορίζεται. Έτσι, ο πεπτιδικός δεσμός είναι επίπεδος και ο καρβονυλικός άνθρακας, το οξυγόνο, το άζωτο και το αμιδικό

35 35 Α. Θεωρητικό Μέρος υδρογόνο βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο. Η ιδιότητα αυτή προσδίδει στα πεπτίδια δύο ισομερή, το cis και το trans, με το trans να είναι το χαμηλότερο ενεργειακά ισομερές. Γενικότερα τα αμίδια είναι δύσκολο να παρασκευαστούν με απευθείας αντίδραση καρβοξυλικών οξέων με αμίνες, διότι οι αμίνες είναι βάσεις που μετατρέπουν τις όξινες καρβοξυλικές ομάδες στα καρβοξυλικά ανιόντα τους, σχηματίζοντας έτσι άλατα και όχι αμίδια. Επειδή το καρβοξυλικό ανιόν φέρει αρνητικό φορτίο, δεν είναι πλέον ηλεκτρονιόφιλο και δεν προσβάλλεται από πυρηνόφιλα παρά μόνο σε υψηλές θερμοκρασίες, συνθήκες που δεν ευνοούν τη σταθερότητα του πεπτιδίου [37]. Για να αποφευχθεί αυτό, πραγματοποιείται ενεργοποίηση της α-καρβοξυλομάδας του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος ώστε να είναι εφικτή η πυρηνόφιλη προσβολή της από την αμινομάδα του αμινο-συστατικού σε ήπιες θερμοκρασίες, όπως θα αναλυθεί και παρακάτω. Στα πεπτίδια απαντάται και ένα δεύτερο είδος ομοιοπολικού δεσμού, ο δισουλφιδικός. Μία δισουλφιδική γέφυρα RS-SR σχηματίζεται ανάμεσα σε δύο μόρια κυστεΐνης. Συγκεκριμένα ο δεσμός αυτός πραγματοποιείται ανάμεσα σε δύο σουλφυδρυλομάδες (-S) από δύο κυστεΐνες, που μπορεί να βρίσκονται στην ίδια ή και σε διαφορετική πεπτιδική αλυσίδα. Η παρουσία του δισουλφιδικού δεσμού έχει ως αποτέλεσμα την αναδίπλωσης της πεπτιδικής αλυσίδας [41]. Οι δισουλφιδικοί δεσμοί σχηματίζονται εύκολα με ήπια οξείδωση και μπορούν επίσης εύκολα να υποστούν διάσπαση υπό ήπιες αναγωγικές συνθήκες. C C 2 C S + S 2 C C C Αναγωγή π.χ. β-μερκαπτοαιθανόλη Ήπια οξείδωση π.χ. Ο 2 C C C 2 C S S 2 C C Σχήμα Α.12: Δισουλφιδικός δεσμός [41].

36 36 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.2.2. Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Στην πεπτιδική χημεία, η διαδικασία σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού μεταξύ δύο α-αμινοξέων καλείται σύζευξη. Όπως αναφέρθηκε και στην προηγούμενη ενότητα, για να δημιουργηθεί ο πεπτιδικός δεσμός είναι απαραίτητο να γίνει πρώτα η ενεργοποίηση της α-καρβοξυλικής ομάδας του ενός αμινοξέος. Αυτό επιτυγχάνεται με την προσθήκη μιας ηλεκτρονιοελκτικής ομάδας στην α-καρβοξυλομάδα, έτσι ώστε στο ενδιάμεσο που προκύπτει, να λάβει χώρα μια πυρηνόφιλη προσβολή από την αμινομάδα του άλλου αμινοξέος και να σχηματιστεί το επιθυμητό αμίδιο (πεπτίδιο) με ταυτόχρονη αποβολή ενός μορίου νερού. R 1 C R 1 C X -X R 1 C R 2 R 2 2 Σχήμα Α.13: Γενική απεικόνιση ενεργοποίησης της α-καρβοξυλομάδας του αμινοξέος. Η αντίδραση αυτή, όμως, απαιτεί υψηλή θερμοκρασία εξαιτίας του ιοντικού χαρακτήρα των αμινοξέων. Επίσης, η ενεργοποίηση της α-καρβοξυλομάδας είναι ενδόθερμη αντίδραση, που είναι καταστροφική για τα πεπτίδια. Για να δημιουργηθεί επομένως ο πεπτιδικός δεσμός σε ήπιες συνθήκες (χαμηλή θερμοκρασία) πρέπει ένα ή και τα δύο συστατικά της αντίδρασης να μετατραπούν σε υψηλής ενέργειας ενδιάμεσα και για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται τα αντιδραστήρια σύζευξης, τα οποία πρέπει να πληρούν τα εξής κριτήρια: 1. Ικανοποιητική ταχύτητα αντίδρασης και υψηλή απόδοση. 2. Αποφυγή σχηματισμού παραπροϊόντων. 3. Ελαχιστοποίηση ρακεμίωσης. 4. Απλός και εύκολος τρόπος καθαρισμού και απομόνωσης του προϊόντος. Υπάρχουν αρκετές μέθοδοι σύνθεσης πεπτιδικού δεσμού και οι πιο βασικές είναι οι παρακάτω:

37 37 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Μέθοδος καρβοδιιμιδίων Τα συνηθέστερα αντιδραστήρια σύζευξης είναι τα καρβοδιιμίδια και είναι ενώσεις που περιέχουν την λειτουργική ομάδα R-=C=-R. Η χρήση τους στην πεπτιδική σύνθεση και στην δημιουργία πεπτιδικού δεσμού προτάθηκε πρώτη φορά το 1955 από τους Sheenan και ess, οι οποίοι υποστήριξαν ότι μία ελεύθερη α- καρβοξυλομάδα και μία ελεύθερη α-αμινομάδα μπορούν να ενωθούν (δηλαδή να συζευχθούν) με υψηλή ταχύτητα και σε υψηλή απόδοση παρουσία του Ν,Ν δικυκλοεξυλο-καρβοδιιμιδίου (DCC) σε θερμοκρασία δωματίου [42]. C Ν,Ν -δικυκλοεξυλο-καρβοδιιμίδιο (DCC) Η μέθοδος των καρβοδιιμιδίων περιλαμβάνει τον σχηματισμό ενός ενδιαμέσου, της Ο-ακυλοσουρίας, η οποία προσβαλλόμενη από την πυρηνόφιλη αμινομάδα ενός αμινοξέος, σχηματίζει πεπτιδικό δεσμό. Ένα μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ο σχηματισμός της Ν-ακυλουρίας από τον μετασχηματισμό της Ο-ακυλοσουρίας με Ο Ν μετάθεση, η οποία δεν απομονώνεται εύκολα καθώς η διαλυτότητά της είναι όμοια με αυτή του επιθυμητού προϊόντος και έτσι παρεμποδίζει τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, δημιουργεί προβλήματα στον καθαρισμό και προκαλεί μείωση της απόδοσης.

38 38 Α. Θεωρητικό Μέρος R C R C R C DCC,'-δικυκλοεξυλο-καρβοδιιμίδιο -ακυλοϊσοουρία Bt -ακυλουρία C R Bt-εστέρας Προηγούμενο αμινοξύ R C + C DCU,'-δικυκλοεξυλουρία Σχήμα Α.14: Δημιουργία πεπτιδικού δεσμού με τη χρήση DCC/Bt [36]. Όπως φαίνεται και από το σχήμα Α.14, στην πεπτιδική σύνθεση τα καρβοδιιμίδια συνοδεύονται από τη χρήση πυρηνόφιλων αντιδραστηρίων, όπως είναι το 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο (Bt) (43) ή το 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο (At) [44]. 1-υδροξυ-βενζοτριαζόλιο 1-υδροξυ-7-αζα-βενζοτριαζόλιο Με την προσθήκη αυτή εμποδίζεται η δημιουργία της Ν-ακυλουρίας, καθώς η Ο-ακυλισοουρία αντιδρά γρήγορα με το Bt, πρωτονιώνεται το βασικό ιμινικό άζωτο της και σχηματίζεται ο υδροξυβενζοτριαζολυλεστέρας του καρβοξυπαραγώγου. Ο εστέρας αυτός είναι είναι ενεργός εστέρας, δηλαδή έχει πιο ηλεκτρονιόφιλη καρβονυλομάδα από ότι ένας κανονικός εστέρας. Ο ενεργός εστέρας αντιδρά με τη σειρά του με την α-αμινομάδα του αμινοξέος και δημιουργείται έτσι ο πεπτιδικός δεσμός. Ένα άλλο πλεονέκτημα της χρήσης του Bt είναι η ιδιότητα του ως ασθενές οξύ, κάτι που εμποδίζει την απόσπαση πρωτονίου από το ασύμμετρο

39 39 Α. Θεωρητικό Μέρος άτομο άνθρακα του καρβοξυσυστατικού, μειώνοντας έτσι ακόμη περισσότερο την πιθανότητα ρακεμίωσης μέσω οξαζολόνης. Το μειονέκτημα της χρήσης του DCC είναι ο σχηματισμός της Ν,Ν -δικυκλοεξυλουρίας (DCU) η οποία δεν διαχωρίζεται εύκολα και είναι αλλεργιογόνος ουσία. Έτσι πλέον χρησιμοποιείται ευρύτατα το Ν,Ν -διισοπροπυλο-καρβοδιιμίδιο ή DIC, το οποίο δίνει ως παραπροϊόν την ουρία, η οποία είναι ευδιάλυτη σε οργανικούς διαλύτες και απομακρύνεται εύκολα, σε αντίθεση με την DCU [36]. C C,'-διισοπροπυλο-καρβοδιιμίδιο Ουρία Α Μέθοδος των ενεργών εστέρων Στη μέθοδο αυτή τα ενεργοποιημένα καρβοξυπαράγωγα είναι εστέρες των Ν α - προστατευμένων αμινοξέων. Οι ενεργοί εστέρες παρασκευάζονται συνήθως με επίδραση DCC σε μείγμα του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος και της κατάλληλης αλκοόλης [45]. Έχουν παρασκευαστεί πολλοί εστέρες με γενικό τύπο -C(=)CR 7, όπου R 7 είναι ένας υποκατεστημένος φαινολικός δακτύλιος που έλκει ηλεκτρόνια και διευκολύνει την πυρηνόφιλη προσβολή του εστέρα από το άμινο συστατικό σε ήπιες συνθήκες. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι ο κίνδυνος ρακεμίωσης του καρβοξυπαραγώγου, στην διάρκεια της παρασκευής και της αμινόλυσής του, κάτι που μειώνεται σημαντικά στις περιπτώσεις των υδροξυ-ηλεκτριμιδικών και υδροξυβενζοτριαζολυλεστέρων [43]. Α Μέθοδος με χρήση φωσφονικών και ουρονικών παραγώγων Τα τελευταία χρόνια για να επιτευχθεί η in situ ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του αμινοξέος χρησιμοποιούνται φωσφονικά και ουρονικά παράγωγα. Τα αντιδραστήρια αυτά μετατρέπουν τα Fmoc αμινοξέα σε Bt-εστέρες και επειδή αντιδρούν μόνο με καρβοξυλικά ανιόντα, είναι απαραίτητη η προσθήκη μιας βάσης στο μείγμα της αντίδρασης, όπως είναι η διισοπροπυλαιθυλαμίνη

40 40 Α. Θεωρητικό Μέρος (DIPEA) ή η κολλιδίνη. Η βάση αποσπά το πρωτόνιο από το καρβοξύλιο του αμινοξέος και έτσι το καρβοξυλικό ανιόν αντιδρά με αυτού του είδους τα παράγωγα. όπως είναι το BP, το BTU, το TBTU και το ATU. Οι βασικές συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιείται η ενεργοποίηση του αμινοξέος και η σύζευξη με το επόμενο, προσδίδουν στις αντιδράσεις αυτές μεγαλύτερη ταχύτητα σε σχέση με τη σύζευξη μέσω καρβοδιιμιδίων, ευνοούν όμως τον σχηματισμό ενός παραπροϊόντος, της αζλακτόνης. Για επιπλέον μείωση της ρακεμίωσης προστίθεται Bt ή At, τα οποία πρωτονιώνουν τη σχηματιζόμενη αζλακτόνη. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται μερικά από τα σημαντικότερα αυτού του είδους αντιδραστήρια σύζευξης:

41 41 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.2: Φωσφονικά και ουρονικά παράγωγα. Χημικός τύπος Ονομασία Me 2 PF 6 P Me 2 Me 2 Εξαφθοροφωσφορικό άλας του 1Η-βενζοτριαζολ-1-υλοξυτρις(διμεθυλαμινο)- φωσφονίου (BΟΡ) [46] PF 6 P Eξαφθοροφωσφορικό άλας του 1Η-βενζοτριαζολ-1-υλοξυ-τρις- (πυρρολιδινο)- φωσφονίου (PyBP) [47] PF 6 C Me 2 Me 2 Eξαφθοροφωσφορικό άλας της 2-(1Η βενζοτριαζολ-1υλ)-1,1,3,3- τετραμεθυλουρίας (ΗBTU) [48] BF 4 C Me 2 Me 2 Τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η βενζοτριαζολ-1υλ)-1,1,3,3- τετραμεθυλουρίας (TBTU) [36]

42 42 Α. Θεωρητικό Μέρος BF 4 C Me 2 Me 2 Me 2 C Me 2 BF 4 R R TBTU Me 2 R Me 2 Me 2 Bt C Me 2 R R + 2 Σχήμα Α.15: Μηχανισμός δράσης του αντιδραστηρίου TBTU στην πεπτιδική σύνθεση. Α Μέθοδος των ανυδριτών Οι ανυδρίτες είναι εξαιρετικά ακυλιωτικά μέσα και έχουν βρει ευρεία εφαρμογή στην πεπτιδική σύνθεση καθώς αντιδρούν με αμίνες προς παρασκευή αμιδίων. Η μέθοδος των ανυδριτών περιλαμβάνει την μετατροπή των Ν α - προστατευμένων αμινοξέων σε ενεργά καρβόξυ-παράγωγα. Συμμετρικοί ανυδρίτες έχουν παρασκευασθεί με αφυδάτωση με προσθήκη DCC στα αντίστοιχα προστατευμένα αμινοξέα. Το μειονέκτημα των συμμετρικών ανυδριτών είναι ότι χρησιμοποιείται μόνο η μία ακυλομάδα για την ακυλίωση, κάτι που δεν συμφέρει από οικονομικής άποψης καθώς εισάγεται η μισή ποσότητα του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα. Έτσι, αναπτύχθηκαν στη θέση τους οι μικτοί ανυδρίτες που μπορούν να παρασκευαστούν με αντίδραση ακυλαλογονιδίων με τα αντίστοιχα άλατα οξέων [49].

43 43 Α. Θεωρητικό Μέρος C 3 C 3 Y + Cl C 3 Y C 3 + Cl R Σχήμα Α.16: Γενική σύνθεση μικτών ανυδριτών [50]. R Α Μέθοδος των αζιδίων Η μέθοδος των αζιδίων εισήχθηκε από τον Curtius και περιλαμβάνει την μετατροπή των Ν α -προστατευμένων αμινοξέων σε υδραζίδια και έπειτα σε αζίδια με χρήση νιτρώδων παραγώγων. Τα αζίδια αντιδρούν με την αμινομάδα του αμινοσυστατικού και έτσι σχηματίζεται ο πεπτιδικός δεσμός [51]. Το πλεονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ότι θεωρείται η καλύτερη μέθοδος δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού, όσον αφορά την πιθανή ρακεμίωση του ενεργοποιημένου καρβόξυ-συστατικού. Η ιδιότητά τους αυτή έχει αποδοθεί στην ηλεκτροστατική έλξη μεταξύ του καρβονυλικού οξυγόνου της αμινοπροστατευτικής ομάδας και του κεντρικού ατόμου αζώτου της αζιδομάδας που παρεμποδίζει τον σχηματισμό αζλακτόνης (οξαζολόνης). Όπως θα αναφερθεί και σε επόμενη ενότητα, ο σχηματισμός αζλακτονών είναι ένας σημαντικός μηχανισμός ρακεμίωσης ενεργοποιημένων χειρόμορφων α-αμινοξέων που είναι Ν-προστατευμένα με ομάδες ουρεθανικού τύπου π.χ. Boc, Fmoc. Σαν μειονεκτήμα της μεθόδου μπορεί να αναφερθεί ο μετασχηματισμός Curtius [49]. R 1 R 1 R 1 R 3 R R R 2 R 2 R R 2 R 4 Σχήμα Α.17: Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού με τη μέθοδο των αζιδίων [49]. Α.2.3. Ρακεμίωση Η ρακεμίωση είναι ένα πολύ συχνό φαινόμενο στην πεπτιδική σύνθεση καθώς όλα τα 20 φυσικά αμινοξέα εκτός από την Gly, έχουν ένα ή περισσότερα στερεογονικά άτομα άνθρακα, επομένως είναι οπτικώς ενεργές ουσίες. Η διατήρηση της στερεοχημικής διάταξης κατά τη διάρκεια της ανοικοδόμησης της πεπτιδικής

44 44 Α. Θεωρητικό Μέρος αλυσίδας είναι πολύ σημαντική, καθώς οι ιδιότητες των πεπτιδίων και των πρωτεϊνών εξαρτώνται από την στερεοχημική δομή τους. Η ρακεμίωση πραγματοποιείται κυρίως στο στάδιο ενεργοποίησης-σύζευξης των αμινοξέων. Για παράδειγμα, αν το προς ενεργοποίηση αμινοξύ είναι η L-Ala και το επιθυμητό πεπτίδιο είναι το L-Ala-D-Phe, τότε λόγω ρακεμίωσης της L-Ala λαμβάνονται τα D,L διπεπτίδια: L-Ala-D-Phe και D-Ala-D-Phe. Ο σχηματισμός των διαστερεομερών αποτελεί εμπόδιο για τον καθαρισμό του πεπτιδίου καθώς ο διαχωρισμός τους είναι δύσκολος. Ο βαθμός ρακεμίωσης εξαρτάται από: 1. Τη μέθοδο ενεργοποίησης. 2. Τη χρησιμοποιούμενη α -προστατευτική ομάδα. 3. Τη θερμοκρασία. 4. Το διαλύτη. 5. Τη χρησιμοποιούμενη βάση (τριτοταγής αμίνη). Οι σπουδαιότεροι μηχανισμοί ρακεμίωσης στην πεπτιδική σύνθεση είναι: Α) Ο σχηματισμός ενδιάμεσης αζλακτόνης. Β) Η απευθείας απόσπαση του α-πρωτονίου του ασύμμετρου ατόμου άνθρακα του αμινοξέος του [41]. Α) Σχηματισμός ενδιάμεσης αζλακτόνης Ο σχηματισμός της αζλακτόνης είναι ο σημαντικότερος μηχανισμός ρακεμίωσης στην πεπτιδική σύνθεση. Περιλαμβάνει το σχηματισμό ενός ενδιάμεσου κυκλικού παραγώγου μέσω απόσπασης του όξινου πρωτονίου της προστατευόμενης αμινομάδας από την βάση και στη συνέχεια, τη δράση ενός άλλου μορίου βάσης επί του κυκλικού ενδιαμέσου. Αποτέλεσμα είναι η διάνοιξη του δακτυλίου και η δημιουργία ρακεμικού μείγματος. Ο σχηματισμός της αζλακτόνης περιορίζεται με χρήση ουρεθανικού τύπου προστατευτικές ομάδες ενώ ευνοείται από Ν α -ακετυλοαμινοξέα [36].

45 45 Α. Θεωρητικό Μέρος R X R - R R L- L- + R R 2 R DL- DL- Σχήμα Α.18: Μηχανισμός ρακεμίωσης μέσω αζλακτόνης. Β) Απευθείας απόσπαση του α-πρωτονίου Στην περίπτωση αυτή, το όξινο υδρογόνο του α-άνθρακα του αμινοξέος αποσπάται από τη βάση, μια τριτοταγή αμίνη, προς παραγωγή καρβανιόντος, το οποίο μπορεί πρωτονιωθεί και από τις δύο πλευρές. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η ρακεμίωση της Cys και της is, όπως θα αναφερθεί και σε επόμενη ενότητα. B A- R C C-X -B A- R C C-X -B A- R C + C-X A- R C C-X Σχήμα Α.19: Μηχανισμός ρακεμίωσης με απευθείας απόσπαση α-πρωτονίου. Α= Ν α -προστατευτική ομάδα / Χ= Ομάδα ενεργοποίησης

46 46 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.2.4. Συνήθεις παράπλευρες αντιδράσεις Κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης μπορούν να συμβούν κάποιες παράπλευρες αντιδράσεις. Μπορούν να διακριθούν σε αυτές που συμβαίνουν λόγω ατελής αντίδρασης (π.χ. ατελείς συζεύξεις ή ατελείς διασπάσεις της Fmoc ομάδας) και σε αυτές που συμβαίνουν λόγω αντιδράσεων των αμινοξέων μεταξύ. Οι τελευταίες διαφέρουν για κάθε πεπτίδιο και για κάθε μέθοδο σύνθεσης που χρησιμοποιείται. Α Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης Η δικετοπιπεραζίνη (DKP) μπορεί να σχηματιστεί στα πρώτα στάδια της πεπτιδικής σύνθεσης. Κατά την προσθήκη του τρίτου αμινοξέος σε ένα διπεπτίδιο, μπορεί να λάβει χώρα μία αντίδραση ενδομοριακής κυκλοποίησης, γνωστή ως σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης. Στην αντίδραση αυτή γίνεται πυρηνόφιλη προσβολή της ελεύθερης αμινομάδας του ενός αμινοξέος του διπεπτιδίου στην εστερομάδα του άλλου αμινοξέος που είναι συνδεδεμένο σε ρητίνη. 2 R 2 R 2 + R 1 R 1 Σχήμα Α.20: Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης. Όπως έχει αναφερθεί, ο πεπτιδικός δεσμός έχει χαρακτήρα διπλού δεσμού και μπορεί να θεωρηθεί ότι έχει trans διαμόρφωση. Για να σχηματιστεί όμως η δικετοπιπεραζίνη, όπως φαίνεται και από το σχήμα Α.20, ο πεπτιδικός δεσμός πρέπει να έχει την cis διαμόρφωσή του. Η αντίδραση αυτή είναι κινητικώς και θερμοδυναμικώς εφικτή καθώς ο πολύ σταθερός δακτύλιος της δικετοπιπεραζίνης είναι η κινητήρια δύναμη για το μετασχηματισμό αυτό. Υπάρχουν αρκετοί παράγοντες που επηρεάζουν τον σχηματισμό της δικετοπιπεραζίνης. Όταν τα δύο πρώτα αμινοξέα έχουν διαφορετική στερεοχημική δομή (D και L αντίστοιχα) ο πεπτιδικός δεσμός ανάμεσά τους είναι cis, άρα η αντίδραση αυτή ευνοείται. Γενικά, η αντίδραση ευνοείται με αμινοξέα που

47 47 Α. Θεωρητικό Μέρος σχηματίζουν πεπτιδικό δεσμό με cis διαμόρφωση, όπως είναι η Gly, η οποία έχει ως πλευρική ομάδα ένα υδρογόνο άρα μπορεί πολύ εύκολα να σχηματίσει cis πεπτιδικό δεσμό και η Pro που λόγω δομής της μπορεί να δώσει στροφή στην πεπτιδική αλυσίδα. Εάν τα δύο πρώτα αμινοξέα είναι Gly-Gly, Gly-Pro, Pro-Gly τότε η κυκλοποίηση μεταξύ τους είναι σίγουρη και καταστροφική για την συνέχιση της σύνθεσης [52]. Ένας τρόπος πρόληψης της αντίδρασης αυτής, είναι η ταυτόχρονη προσθήκη του τρίτου α -προστατευμένου αμινοξέος, του αντιδραστηρίου σύζευξης και της βάσης προκειμένου να γίνει in situ αδρανοποίηση του διπεπτιδίου και μάλιστα σε υψηλές συγκεντρώσεις ώστε να αυξηθεί η ταχύτητα της αντίδρασης της σύζευξης και να μειωθεί ο βαθμός κυκλοποίησης [36]. Α Σχηματισμός νιτριλίου Η κυριότερη ανεπιθύμητη αντίδραση που συμβαίνει κατά την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας όταν χρησιμοποιείται η Asn, είναι η αφυδάτωση του αμιδίου της πλευρικής της αλυσίδας προς σχηματισμό του αντίστοιχου νιτριλίου και συγκεκριμένα της β-κυανοαναλίνης. Η αφυδάτωση μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης της Asn. Η αντίδραση αυτή συνήθως δεν παρατηρείται στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεά φάση με την Boc-μεθοδολογία επειδή στο τελικό της στάδιο προστίθεται F, το οποίο αντιστρέφει το σχηματισμό του νιτριλίου. Αντίθετα, στην Fmoc-μεθοδολογία οι συνθήκες απομάκρυνσης της ρητίνης και της αποπροστασίας του πεπτιδίου είναι πολύ ήπιες και δεν μπορεί να επανυδατωθεί το νιτρίλιο. Για την αποφυγή αυτής της παράπλευρης αντίδρασης, χρησιμοποιείται η Asn με προστατευτική ομάδα στην πλευρική της αλυσίδα [53]. Fmoc- 2 DIC/Bt Fmoc- Bt Σχήμα Α.21: Σχηματισμός νιτριλίου από την Αsn.

48 48 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Σχηματισμός δ-λακτάμης Η δ-γουανιδινομάδα της Arg είναι πολύ καλό πυρηνόφιλο και έτσι κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης του αμινοξέος, μπορεί να συμβεί ενδομοριακή κυκλοποίηση και να σχηματιστεί η δ-λακτάμη [36]. ω R 2 ω ω R 2 ω δ δ Ενεργοποίηση R 2 R 1 R 1 R 1 Σχήμα Α.22: Μηχανισμός σχηματισμού δ-λακτάμης [36]. Α Σχηματισμός πυρογλουταμινικού οξέος Όταν το αμινοξύ του -τελικού άκρου της πεπτιδικής αλυσίδας είναι η Gln, μπορεί να λάβει χώρα μία ενδομοριακή κυκλοποίηση και να σχηματιστεί έτσι το πυρογλουταμινικό οξύ. Η κυκλοποίηση αυτή μπορεί να καταλυθεί από ασθενή οξέα και συμβαίνει πιο συχνά κατά τη διάρκεια της σύζευξης του επόμενου Ν α - προστατευμένου αμινοξέος μετά την Gln ή μετά από αφαίρεση της Boc ομάδας με TFA. Αν το πυρογλουταμινικό οξύ δημιουργηθεί, τότε δεν μπορεί να συνεχισθεί η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας [36]. 2 Boc 1.TFA 2.DIPEA 2 2 Σχήμα Α.23: Μηχανισμός σχηματισμού πυρογλουταμινικού οξέος [36].

49 49 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Σχηματισμός ασπαρτιμιδίων Μία κοινή αντίδραση στην πεπτιδική σύνθεση όταν χρησιμοποιείται το Asp είναι η κυκλοποίησή του προς σχηματισμό ασπαρτιμιδίου. Η αντίδραση αυτή συμβαίνει κυρίως στις αλληλουχίες Asp-Gly, Asp-Ala, Asp-Ser και Asp-Asn. Τα ασπαρταμίδια μπορεί να σχηματιστούν κάτω από όξινες ή βασικές συνθήκες και δημιουργούνται με πυρηνόφιλη προσβολή του ατόμου του αζώτου που είναι συνδεδεμένο με την α-καρβοξυλομάδα του Asp στον καρβονυλικό άνθρακα της πλευρικής ομάδας του Asp. Όταν το ασπαρτιμίδιο υδρολυθεί, έχουμε παραγωγή των αντίστοιχων α- και β- ασπαρτυλ-πεπτιδίων [36]. R α Σχήμα Α.24: Μηχανισμός σχηματισμού ασπαρτιμιδίων από πεπτίδιο που περιέχει την αλληλουχία Asp-Gly και παραγωγή των αντίστοιχων α- και β- ασπαρτυλ-πεπτιδίων [36]. β Εάν στο ασπαρτιμίδιο προσθέσουμε πιπεριδίνη, τότε οδηγούμαστε στον σχηματισμό α- και β-παραγώγων πιπεριδίνης, όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. α-παράγωγο πιπεριδίνης β-παράγωγο πιπεριδίνης Ένας τρόπος αντιμετώπισης είναι η προστασία του Asp με την 2-υδροξυ-4- μεθοξυβενζυλομάδα (mb) και η προσθήκη Bt ή 2,4-δινιτροφαινόλης στο διάλυμα αποπροστασίας της πιπεριδίνης.

50 50 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Οξείδωση της Met Μία πολύ συχνή αντίδραση που συμβαίνει όταν χρησιμοποιείται η Met χωρίς πλευρική προστασία είναι η οξείδωση του θειοαιθέρα της πλευρικής της ομάδας προς σουλφοξείδιο. Η οξείδωση μπορεί να συμβεί πολύ εύκολα, ακόμα και με την έκθεση στον ατμοσφαιρικό αέρα, παρόλα αυτά είναι αντιστρεπτή αντίδραση και μπορεί να αντιμετωπιστεί με χρήση κατάλληλου διαλύματος αποπροστασίας που περιέχει TFA/ 4 I και scavengers [54]. Η αναγωγή του σουλφοξειδίου της Met μπορεί να γίνει με χρήση του Ν-μεθυλο-μερκαπτο-ακεταμιδίου [55]. 2 C C 2 C C C 2 C 2 Οξείδωση C 2 C 2 S S C 3 Σχήμα Α.25: Οξείδωση της Met. C 3 Α Αλκυλιώσεις κατά την αποπροστασία των πεπτιδίων Κατά την αποπροστασία των πεπτιδίων είναι πιθανή η αλκυλίωση των δραστικών πλευρικών ομάδων των αμινοξέων από τα κατιόντα που δημιουργούνται λόγω της απομάκρυνσης των πλάγιων προστατευτικών ομάδων. Αμινοξέα που μπορούν να αλκυλιωθούν εύκολα είναι η Trp, η Met και η Tyr. Για την αποφυγή της αλκυλίωσης χρησιμοποιούνται δεσμευτές κατιόντων (scavengers), όπως θα αναλυθεί και σε επόμενη ενότητα. Α.2.5. Προστατευτικές ομάδες αμινοξέων Κάθε στάδιο σε μια συνθετική αλληλουχία περιλαμβάνει εκείνη ή εκείνες τις θέσεις σε ένα μόριο που είναι απαραίτητες για την επιθυμητή μετατροπή. Συχνά όμως συμβαίνει τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται, να αντιδρούν τόσο με τις επιθυμητές ομάδες και θέσεις των μορίων αλλά και με άλλες σε κάποια άλλη θέση που δεν είναι επιθυμητές. Για το λόγο αυτό, κατά την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής

51 51 Α. Θεωρητικό Μέρος αλυσίδας, κρίνεται αναγκαία η προσωρινή αδρανοποίηση (προστασία) εκείνων των ομάδων που δεν επιθυμείται να αντιδράσουν ώστε να μείνουν ανέπαφες κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και να μπορέσουν να αναγεννηθούν σε επόμενο στάδιο. Για την εκλογή της κατάλληλης προστατευτικής ομάδας θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι ακόλουθοι παράγοντες: Η φύση της υπό προστασίας ομάδας. Οι συνθήκες αντίδρασης κάτω από τις οποίες η προστατευτική ομάδα θα παρουσιάσει τον προστατευτικό της χαρακτήρα. Οι συνθήκες που μπορεί να είναι ανεκτές στο υπόλοιπο μόριο κατά την απομάκρυνση της προστατευτικής ομάδας. Η προστατευτική ομάδα να μπορεί να προστατεύσει την προς προστασία ομάδα κατά τη διάρκεια της σύζευξης. Η προστασία και η αποπροστασία να γίνονται με την υψηλότερη δυνατή απόδοση και εκλεκτικότητα. Να παραμένει χημικά ακέραιος ο πεπτιδικός δεσμός και να μην συμβαίνουν διάφοροι μετασχηματισμοί. Να μην πραγματοποιείται ρακεμίωση [41, 49]. Οι προστατευτικές ομάδες που δεσμεύονται στις αμινομάδες των αμινοξέων ονομάζονται αμινοπροστατευτικές, αυτές που δεσμεύονται στις καρβοξυλομάδες καρβoξυπροστατευτικές και αντίστοιχα αυτές που δεσμεύονται στις πλευρικές δραστικές ομάδες των αμινοξέων ονομάζονται πλάγιες προστατευτικές. Οι προστατευτικές ομάδες μπορεί να είναι προσωρινές, μόνιμες που συνήθως απομακρύνονται στο τελευταίο στάδιο της σύνθεσης και σε ημιμόνιμες που συνήθως είναι στο C-άκρο του πεπτιδίου και απομακρύνονται παρουσία άλλων προστατευτικών ομάδων. Α Προστασία της α-αμινομάδας Η προστασία της α-αμινομάδας των αμινοξέων είναι πολύ σημαντική στην πεπτιδική σύνθεση. Συνήθως οι αμινοπροστατευτικές ομάδες είναι προσωρινές προστατευτικές ομάδες και θα πρέπει να είναι ευδιάλυτες στους περισσότερους κοινούς διαλύτες, να εμποδίζουν ή να ελαχιστοποιούν τον επιμερισμό κατά τη

52 52 Α. Θεωρητικό Μέρος διάρκεια της σύζευξης, να απομακρύνονται γρήγορα και εύκολα χωρίς παράπλευρες αντιδράσεις και να δημιουργούν ελάχιστα έως καθόλου παραπροϊόντα [56]. Οι ομάδες αυτές αποσκοπούν στη μείωση του πυρηνόφιλου χαρακτήρα του ατόμου του αζώτου ώστε αυτό να μην αντιδράσει με τα ενεργοποιημένα καρβόξυπαράγωγα. Η ελάττωση αυτή γίνεται είτε μέσω της μείωσης της ηλεκτρονιακής πυκνότητας τους αζώτου με έλξη ηλεκτρονίων μέσω μεσομέρειας (π.χ. ουρεθανικού τύπου ομάδες όπως είναι οι προστατευτικές ομάδες Ζ, Boc και Fmoc) ή επαγωγικού φαινομένου (π.χ. 2-νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα, ps) είτε μέσω στερεοχημικής παρεμπόδισης (π.χ. τριφαινυλομεθυλο ομάδα, Trt). S R C C 2 α β γ X X: Cl,, Me, Me Σχήμα Α.26: Ν α -προστατευτικές ομάδες: α) Ουρεθανικού τύπου, β) ο-νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα, γ) Τριφαινυλομεθυλο τύπου [36]. Οι προστατευτικές ομάδες ουρεθανικού τύπου είναι αυτές που χρησιμοποιούνται περισσότερο λόγω της εύκολης εισαγωγής τους, η οποία ακολουθεί την παρακάτω γενική αντίδραση [49]: R 2 + R' X B Διαλύτης R' R + B X B B R' X R Στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεά φάση χρησιμοποιούνται κυρίως οι ομάδες Boc και Fmoc ενώ στην πεπτιδική σύνθεση σε διάλυμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι ομάδες Z, ps και Βpoc [2-(4-διφαινυλ)ισοπροπ-οξυ-καρβονυλο].

53 53 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Βενζυλοξυκαρβονυλομάδα (Ζ) Η βενζυλοξυκαρβονυλομαδα (Cbz) ή αλλιώς Ζ ομάδα χρησιμοποιήθηκε πρώτη φορά από τους Bergman και Ζέρβα το 1932 [57]. Ανήκει στην κατηγορία των ομάδων ουρεθανικού τύπου και εισάγεται με επίδραση βενζυλοξυκαρβονυλο-χλωριδίου στην α-αμινομάδα των αμινοξέων σε αλκαλικές συνθήκες. R R Cl + 2 Βάση -Cl Σχήμα Α.27: Εισαγωγή της Z ομάδας σε αμινοξύ. Η απομάκρυνση της Z ομάδας γίνεται με καταλυτική υδρογονόλυση (Η 2 /Pt-C) ή με ισχυρά όξινες συνθήκες, όπως με χρήση F σε Ac [49]. Α Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc) Η Boc προστατευτική ομάδα προτάθηκε το 1957 από τους McKay και Albertson [58]. Εισάγεται εύκολα με τη χρήση του τριτοταγούς βουτυλόξυ-καρβόνυλo ανυδρίτη Boc 2 παρουσία βάσης (π.χ. μονόξινο ανθρακικό νάτριο, ac 3 ). Η ομάδα αυτή είναι σταθερή σε βασικές συνθήκες και συνδυάζεται με Bzl (βενζυλ-) τύπου πλάγιες προστατευτικές ομάδες λόγω της σταθερότητάς της σε συνθήκες καταλυτικής υδρογονόλυσης.

54 54 Α. Θεωρητικό Μέρος R R + R -C R Σχήμα Α.28: Μηχανισμός απομάκρυνσης της Βoc-ομάδας με επίδραση οξέως [36]. Η απομάκρυνση της Boc ομάδας γίνεται σε πιο ήπιες όξινες συνθήκες από αυτές που απαιτούνται για την απομάκρυνση της Z ομάδας και αυτό επειδή οι μεθυλομάδες δίνουν ηλεκτρόνια με Ι+ επαγωγικό φαινόμενο στο τριτοταγές βουτυλοκατιόν και το σταθεροποιούν σε αντίθεση με το πιο ασταθές τριτοταγές βενζυλόξυ κατιόν. Συνήθως χρησιμοποιούνται διαλύματα TFA σε DCM ή Cl σε Ac. Α φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc) [59]. Η Fmoc προστατευτική ομάδα προτάθηκε το 1972 από τους Carpino και an Η εισαγωγή της στην αμινομάδα του αμινοξέος μπορεί να επιτευχθεί με επίδραση Fmoc-Cl σε μίγμα αλκαλικού διαλύματος/διοξάνης, όμως δίνει σαν

55 55 Α. Θεωρητικό Μέρος παραπροϊόν Fmoc-διπεπτίδιο. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιείται το Fmoc-Su (9- φλουορενυλομεθυλ-ηλεκτριμιδικό ανθρακικό) που είναι πιο ήπιο αντιδραστήριο [60]. 2 R + R Σχήμα Α.29: Εισαγωγή της Fmoc ομάδας σε αμινοξύ με χρήση Fmoc-Su. Προσαρμοσμένη από [61]. Η διαφορά της ομάδας αυτής σε σχέση με τις άλλες ουρεθανικές ομάδες είναι ότι είναι σταθερή σε όξινες και απομακρύνεται με βασικές συνθήκες με μηχανισμό β- απόσπασης με χρήση διαλύματος πιπεριδίνης (συνήθως 20-25%) σε DMF. Η αντίδραση είναι τύπου E 1cb, δηλαδή το πρώτο στάδιο είναι η απόσπαση του πρωτονίου και το δεύτερο η απομάκρυνση της αποχωρούσας ομάδας. Μετά την απόσπαση Η, σχηματίζεται ένα πολύ σταθερό αρωματικό ανιόν (Α). Η Fmoc ομάδα μπορεί να συνδυαστεί με πλάγιες προστατευτικές ομάδες που απομακρύνονται σε όξινες συνθήκες, όπως είναι η Boc ομάδα και η τριτοταγής βουτυλομάδα (tbu).

56 56 Α. Θεωρητικό Μέρος R R R C R a Σχήμα Α.30: Μηχανισμός απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας με πιπεριδίνη [36]. Ο μηχανισμός αποπροστασίας ξεκινάει με αποπρωτονίωση της Fmoc ομάδας για να δώσει το σταθερό διβενζοκυκλοπενταδιένιο ανιόν, το οποίο μετατρέπεται σε διβενζοφουλβένιο. Το διβενζοφουλβενιο στη συνέχεια «παγιδεύεται» από την πιπεριδίνη δίνοντας το προϊόν Β, το οποίο απομακρύνεται εύκολα. Α Προστασία της α-καρβοξυλομάδας Η προστασία της θεωρείται αναγκαία για την αποφυγή προσβολής της από πυρηνόφιλα που έχουν ως συνέπεια τον σχηματισμό παραπροϊόντων. Η κύρια μέθοδος προστασίας της καρβοξυλομάδας είναι η εστεροποίηση. Η α- καρβοξυλομάδα στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεά φάση προστατεύεται με την ομοιοπολική δέσμευσή της στη ρητίνη.

57 57 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.3: Κυριότερες προστατευτικές ομάδες καρβοξυλομάδας [41]. Χημικός τύπος Ονομασία- Σύντμηση Αποπροστασία 3 C Μεθυλεστέρας (ΟMe) - -αλκοόλη 2 C Βενζυλεστέρας (ΟBze) - -αλκοόλη, F, υδραζινόλυση 3 C C 3 C τριτυλ-βουτυλεστέρας (ΟtBu) Cl/Ac, Br/Ac, TFA C 3 C 3 3 C Si Τριμεθυλοσιλυλεστέρας (otms) 2,Ac, Cl,TFA C 3 Α Προστασία των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων [36, 56, 62] Η προστασία των δραστικών πλευρικών ομάδων των αμινοξέων είναι απαραίτητη κατά την επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας ώστε να αποφευχθούν παράπλευρες αντιδράσεις. Για το σκοπό αυτό επιλέγονται ομάδες που έχουν την ιδιότητα να παραμένουν σταθερές στις συνθήκες που γίνεται η απομάκρυνση της Ν α - προστατευτικής ομάδας και να απομακρύνονται μόνο υπό ειδικές συνθήκες στο τέλος της σύνθεσης του επιθυμητού πεπτιδίου. Α Ορθογωνικότητα Ο όρος ορθογωνικότητα επινοήθηκε το 1977 από τους G. Barany και R.B. Merrifield και ορίζει ότι: «ι προστατευτικές ομάδες διαχωρίζονται σε κατηγορίες όπου απομακρύνονται με διαφορετικούς χημικούς μηχανισμούς, έτσι ώστε να αφαιρούνται με οποιαδήποτε σειρά παρουσία άλλων κατηγοριών προστατευτικών ομάδων. Τα συστήματα ορθογωνικής προστασίας επιτρέπουν τη χρήση ηπιότερων συνθηκών

58 58 Α. Θεωρητικό Μέρος αντίδρασης και τη σύνθεση μερικώς προστατευμένων πεπτιδίων» [63]. Με άλλα λόγια, η αποπροστασία κάποιας ομάδας μπορεί να γίνει με τυχαία σειρά παρουσία των υπόλοιπων, χωρίς ανεπιθύμητες αντιδράσεις. Υπάρχουν μεθοδολογίες ανάλογα με την προστατευτική ομάδα που επιλέγεται για την προστασία της α-αμινομάδας, που σχηματίζουν ορθογωνικότητα με τις αντίστοιχες πλευρικές προστατευτικές ομάδες. Έτσι, υπάρχει η μεθοδολογία Boc/Bzl, στην οποία η Boc ομάδα είναι η Ν α -προστατευτική με πιο χαρακτηριστική πλευρική προστατευτική ομάδα την βενζυλομάδα (Bzl) και η μεθοδολογία Fmoc/tBu, στην οποία η Fmoc ομάδα είναι η Ν α -προστατευτική με πιο χαρακτηριστική πλευρική προστατευτική ομάδα την τριτοταγή βουτυλομάδα (tbu). Και στις δύο περιπτώσεις οι συνθήκες απομάκρυνσης της α -προστατευτικής δεν επηρεάζουν την πλευρική προστατευτική ομάδα. Αντίθετα π.χ., η tbu ομάδα δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με την ομάδα Boc ως Ν α -προστατευτική καθώς δεν έχουν σχέση ορθογωνικότητας. Στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκε η Fmoc/tBu μεθοδολογία και στη συνέχεια θα αναλυθούν και οι αντίστοιχες πλευρικές προστατευτικές ομάδες που χρησιμοποιήθηκαν. Α Προστασία της σουλφυδρυλομάδας της Κυστεΐνης 2 C C C 2 S Κυστεΐνη (Cys) Η προστασία της πλευρικής αλυσίδας της Cys είναι υποχρεωτική καθώς η σουλφυδρυλομάδα της είναι καλό πυρηνόφιλο και μπορεί να αλκυλιωθεί και να ακυλιωθεί. Επίσης, μπορεί πολύ εύκολα να οξειδωθεί από τον ατμοσφαιρικό αέρα, δίνοντας δισουλφίδια. Οι ομάδες που χρησιμοποιούνται για την προστασία της σουλφυδρυλομάδας είναι:

59 59 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.4: Προστατευτικές ομάδες της σουλφυδρυλομάδας της Cys. Όνομα προστατευτικής ομάδας Δομή προστατευτικής ομάδας Συνθήκες απομάκρυνσης Βιβλιογραφία Τριφαινυλομεθυλο (τρίτυλο) ομάδα (Trt) C 90%TFA v/v, 30-60min iskey et al., 1966 [64] 4-μεθοξυτριτυλομάδα (Mmt) 3 C 0.5% v/v TFA σε DCM-TES (95:5), 30-60min Barlos et al., 1996 [65] 1) I 2 (S-S) Ακεταμιδομεθυλομάδα (Acm) 2) Tl(TFA) 3 (S-S) 3) Ag(TFMS) (S) 4) g (II) (S) unter and Komives, 1995 [66] Κατά την αποπροστασία, είναι πιθανό τα καρβοκατιόντα που θα σχηματιστούν να ξαναπροστεθούν στην θειολομάδα και για αυτό το λόγο προστίθενται scavengers, όπως η 1,2-αιθανοδιθειόλη. Στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκε η Trt ομάδα, η οποία προστατεύει το πυρηνόφιλο S με την ογκώδη ομάδα της και εμποδίζει τα ηλεκτρόφιλα να πλησιάσουν λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης.

60 60 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Προστασία του ημιδαζολικού δακτυλίου της Ιστιδίνης 2 C C C 2 Ιστιδίνη (is) Ο ημιδαζολικός δακτύλιος της is είναι υπεύθυνος για την εύκολη ρακεμίωση της is, ακόμα και όταν η α -ομάδα της είναι προστατευμένη. Αυτό συμβαίνει επειδή το π άτομο αζώτου της is είναι καλό πυρηνόφιλο και καλή βάση. π τ -R R τ R τ Boc X Boc X π Boc π A π -R τ π -R τ B Boc X Boc X Σχήμα Α.31. Μηχανισμοί ρακεμίωσης της is. Στην α περίπτωση το π άτομο αζώτου της is συμπεριφέρεται ως πυρηνόφιλο και στην β περίπτωση ως βάση [36]. Για την προστασία της is χρησιμοποιείται η Trt ομάδα, η οποία δεσμεύεται στο τ-άτομο αζώτου του ημιδαζολικού δακτυλίου και μειώνει τον πυρηνοφιλικό χαρακτήρα του π-ατόμου αζώτου λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης.

61 61 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.5: Προστατευτική ομάδα του ημιδαζολίου της is. Όνομα προστατευτικής ομάδας Δομή προστατευτικής ομάδας Συνθήκες απομάκρυνσης Βιβλιογραφία Τριφαινυλομεθυλο 50% v/v TFA σε Sieber και (τρίτυλο) ομάδα C DCM, Riniker (Trt) 30min 1987 [67] Α Προστασία του αμιδίου της πλευρικής ομάδας της Ασπαραγίνης και της Γλουταμίνης 2 C C 2 C C C 2 C 2 C C 2 2 C Ασπαραγίνη (Asn) 2 Γλουταμίνη (Gln) Οι αμιδικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων Asn και Gln συχνά δεν προστατεύονται στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεά φάση. Παρόλα αυτά μερικές φορές κατά την ενεργοποίηση, προκαλείται αφυδάτωσή τους και σχηματίζονται τα αντίστοιχα νιτρίλια, επομένως προστατεύονται για την αποφυγή αυτών των αντιδράσεων. Η Trt ομάδα εμποδίζει τον σχηματισμό των νιτριλίων μέσω της στερεοχημικής παρεμπόδισης. Πίνακας Α.6: Προστατευτική ομάδα των αμιδίων των Asn και Gln. Όνομα προστατευτικής ομάδας Δομή προστατευτικής ομάδας Συνθήκες απομάκρυνσης Βιβλιογραφία Τριφαινυλομεθυλο (τρίτυλο) ομάδα (Trt) C 90% v/v TFA, 30-60min Sieber και Riniker 1991 [68]

62 62 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Προστασία της καρβοξυλομάδας της πλευρικής ομάδας του Ασπαραγινικού και του Γλουταμινικού οξέος 2 C C 2 C C C 2 C 2 C C 2 C Ασπαραγινικό οξύ (Asp) Γλουταμινικό οξύ (Glu) Οι πλευρικές ομάδες των αμινοξέων Αsp και Glu περιέχουν καρβοξυλικές ομάδες οι οποίες πρέπει να προστατευτούν ώστε να μην ενεργοποιηθούν και σχηματίσουν πεπτιδικό δεσμό. Η προστασία τους γίνεται με εστεροποίηση της tbu ομάδας. Πίνακας Α.7: Προστατευτική ομάδα της καρβοξυλομάδας των Asp και Glu. Όνομα προστατευτικής ομάδας Τριτοταγής βουτυλομάδα (tbu) Δομή προστατευτικής ομάδας C 3 C 3 C C 3 Συνθήκες απομάκρυνσης 90% v/v TFA, 30min Βιβλιογραφία Schwyzer και Dietrich, 1961 [69] Α Προστασία της υδροξυλομάδας της Σερίνης, της Θρεονίνης και της Τυροσίνης 2 C C 2 C C 2 C C C 2 C C 2 C 3 Σερίνη (Ser) Θρεονίνη (Thr) Τυροσίνη (Tyr)

63 63 Α. Θεωρητικό Μέρος Τα αμινοξέα Ser, Thr και Tyr περιέχουν υδροξυλομάδες στις πλευρικές τους αλυσίδες και επειδή είναι πολύ εύκολο να αλκυλιωθούν χρειάζονται προστασία, η οποία επιτυγχάνεται με την μετατροπή της υδροξυλομάδας σε αιθέρα. Η προστασία μπορεί να γίνει με την tbu ή την Trt ομάδα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία τα τρία αυτά αμινοξέα ήταν προστατευμένα με την tbu ομάδα. Πίνακας Α.8: Προστατευτικές ομάδες της υδροξυλομάδας των Ser, Thr και Tyr. Όνομα προστατευτικής ομάδας Τριτοταγής βουτυλομάδα (tbu) Δομή προστατευτικής ομάδας C 3 C 3 C C 3 Συνθήκες απομάκρυνσης 90% v/v TFA, 30min Βιβλιογραφία Beyerman και Bontekoe, 1961 [70] Callahan et al., 1963 [71] Τριφαινυλομεθυλο (τρίτυλο) ομάδα (Trt) C 1-5% v/v TFA σε DCM, 2-5min Sieber και Riniker 1991 [72] Α Προστασία της γουανιδινομάδας της Αργινίνης 2 C C C 2 C 2 C 2 C 2 Αργινίνη (Arg) Η προστασία της δ-γουανιδομάδας της αργινίνης είναι απαραίτητη καθώς είναι ισχυρά βασική με pk a =12,5 και αποτελεί καλό πυρηνόφιλο. Συνεπώς πρέπει να

64 64 Α. Θεωρητικό Μέρος προστατευτεί γιατί όπως αναφέρθηκε, χωρίς προστασία μπορεί να σχηματιστεί μια δ- λακτάμη. Οι ομάδες που χρησιμοποιούνται είναι δύο πολύ ογκώδεις ομάδες, οι Pbf και Pmc. Πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με scavengers καθώς κατά την απομάκρυνσή τους δημιουργούνται κατιόντα που μπορούν να αλκυλιώσουν άλλες δραστικές ομάδες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία η Arg ήταν προστατευμένη με την Pbf ομάδα. Πίνακας Α.9: Προστατευτικές ομάδες της γουανιδινομάδας της Arg. Όνομα προστατευτικής ομάδας (2,2,4,6,7)- πενταμεθυλο- διυδροβενζο- φουραν-5- σουλφονυλομάδα (Pbf) Δομή προστατευτικής ομάδας S Συνθήκες απομάκρυνσης 95% v/v TFA, 30min Βιβλιογραφία Carpino et al., 1993 [73] 50% v/v TFA σε (2,2,5,7,8)- DCM, 1h Ramage και πενταμεθυλο- χρωμαν-6- σουλφονυλομάδα S TFA-Ανισόλη (9:1), 30min Green, 1987 [74] (Pmc) TFA-Ανισόλη-EDT- EMS (95:3:1:1), Ramage et al., 1991 [75] 1.5h

65 65 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Προστασία της ε-αμινομάδας της Λυσίνης 2 C C C 2 C 2 C 2 C 2 2 Λυσίνη (Lys) Η ε-αμινομάδα της Lys είναι πολύ βασική και είναι απαραίτητο να προστατευτεί καθώς η ακυλίωσή της μπορεί να οδηγήσει σε διακλάδωση της πεπτιδικής αλυσίδας. Οι ομάδες που χρησιμοποιούνται για την προστασία της είναι η Boc, η Trt και η Mtt. Η Boc ομάδα, όπως αναφέρθηκε, είναι ομάδα ουρεθανικού τύπου και μειώνει την πυρηνοφιλία του αζώτου έλκοντας ηλεκτρόνια μέσω μεσομέρειας και είναι η ομάδα που χρησιμοποιήθηκε για την προστασία της Lys στην παρούσα διπλωματική εργασία. Η Trt και η Mtt είναι ογκώδεις ομάδες που προκαλούν στερεοχημική παρεμπόδιση. Ειδικότερα, η Mtt ομάδα επιτρέπει την εκλεκτική αποπροστασία του πεπτιδίου, καθώς μπορεί να απομακρυνθεί σε πολύ ήπιες συνθήκες (1% TFA), παρουσία άλλων προστατευτικών ομάδων που απαιτούν πιο όξινες συνθήκες (>90% TFA). Αυτό συμβαίνει επειδή η μεθυλομάδα της προσφέρει ηλεκτρόνια με +Ι επαγωγικό φαινόμενο και σταθεροποιεί το καρβοκατιόν που δημιουργείται κατά την αποπροστασία της, καθιστώντας έτσι το μόριο καλύτερη αποχωρούσα ομάδα.

66 66 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.10: Προστατευτικές ομάδες της ε-αμινομάδας της Lys. Όνομα προστατευτικής ομάδας Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc) Δομή προστατευτικής ομάδας Συνθήκες απομάκρυνσης 90% v/v TFA, 30min Βιβλιογραφία Chang et al., 1980 [76] 1% v/v TFA σε 4-μεθυλτριτυλομάδα (Mtt) 3 C C DCM, 30min Ac-TFE-DCM Aletras et al., 1995 [77] (1:2:7), 1h Α Προστασία του ινδολικού δακτυλίου της Τρυπτοφάνης 2 C C C 2 Τρυπτοφάνη (Trp) ινδολικός δακτύλιος της Trp υφίσταται εύκολα ηλεκτρόφιλη αρωματική υποκατάσταση σε περισσότερες από μία θέσεις και είναι επιρρεπής στην οξείδωσή του από το ατμοσφαιρικό οξυγόνο σε όξινες συνθήκες. Έτσι, χρησιμοποιούνται ομάδες που απενεργοποιούν το δακτύλιο, ελαττώνουν δηλαδή την ηλεκτρονιακή του πυκνότητα και συγκεκριμένα η Boc ομάδα. Κατά την αποπροστασία, απομακρύνεται η βουτυλομάδα και το ινδόλιο παραμένει προστατευμένο με την καρβοξυλομάδα, η οποία εμποδίζει την αλκυλίωση και απομακρύνεται με κατεργασία του πεπτιδίου με ελαφρώς όξινο υδατικό διάλυμα.

67 67 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.11: Προστατευτική ομάδα του ινδολίου της Trp. Όνομα προστατευτικής ομάδας Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc) Δομή προστατευτικής ομάδας Συνθήκες απομάκρυνσης 90% v/v TFA, 1h ακολουθούμενη από 1% aq. TFA, 1-2h Βιβλιογραφία White, 1992 [78] Α Δεσμευτές κατιόντων (scavengers) Κατά τη διάρκεια αποπροστασίας του πεπτιδίου με χρήση οξέων είναι δυνατό να δημιουργηθούν κατιόντα, τα οποία δημιουργούνται λόγω απομάκρυνσης των πλευρικών προστατευτικών ομάδων. Τα καρβοκατιόντα αυτά μπορούν να προκαλέσουν πολλά προβλήματα, καθώς είναι ηλεκτρόφιλα επομένως και καλά αλκυλιωτικά μέσα. Έτσι, είναι πιθανό τα πυρηνόφιλα άτομα που υπάρχουν στο γύρω περιβάλλον, π.χ. στις πλευρικές ομάδες των αμινοξέων, να αλκυλιωθούν και να δημιουργήσουν παραπροϊόντα, όπως φαίνεται και στο παρακάτω σχήμα. 3 S S C 3 C2 C 2 C 2 C 2 C 2 -Cys- -Met- -is- -Tyr- -Trp- Σχήμα Α.32: Πιθανές θέσεις αλκυλίωσης αμινοξέων έπειτα από χρήση οξέος. Οι πρωτονιωμένες θέσεις δεν αλκυλιώνονται [43]. Για να αποφευχθούν οι αντιδράσεις αυτές, χρησιμοποιούνται οι δεσμευτές κατιόντων ή scavengers. Τα μόρια αυτά έχουν παρόμοια σύσταση με τα αμινοξέα και υπόκεινται αλκυλίωση στη θέση τους [43]. Ανάλογα το είδος των αμινοξέων και την προστατευτική ομάδα που χρησιμοποιήθηκε για την πλευρική αλυσίδα, επιλέγεται

68 68 Α. Θεωρητικό Μέρος και ο κατάλληλος δεσμευτής ή μείγμα από αυτούς. Συχνά χρησιμοποιείται η 1,2- αιθανοδιθειόλη, η ανισόλη, η θειοανισόλη, το διμεθυλοσουλφίδιο κ.α. C 3 S C 3 S 2 C 2 C S 3 C S C 3 Σχήμα Α.33: Παραδείγματα δεσμευτών κατιόντων (scavengers). Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις όπου δεσμεύονται τα κατιόντα. Α.2.6. Μέθοδοι πεπτιδικής σύνθεσης Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση για την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας είναι οι παρακάτω: Α Μέθοδος σταδιακής σύνθεσης πεπτιδικής αλυσίδας (Step by Step) Σύμφωνα με τη μέθοδο σύνθεσης κατά στάδια, η σύνθεση ενός διπεπτιδίου περιλαμβάνει την προσθήκη ενός Ν α -προστατευμένου αμινοξέος με ενεργοποιημένη καρβοξυλομάδα στο Ν-τελικό άκρο του δεύτερου αμινοξέος και την επακόλουθη απομάκρυνση της Ν α -προστατευτικής ομάδας μετά τη σύζευξη. Η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας συνεχίζεται με την σταδιακή προσθήκη Ν α προστατευμένων αμινοξέων, τη σύζευξή τους με το τελευταίο αμινοξύ της πεπτιδικής αλυσίδας και την αποπροστασία του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος [36]. Η μέθοδος αυτή δεν επιλέγεται για την σύνθεση μεγάλων πεπτιδίων λόγω της μείωσης της καθαρότητας των συντιθέμενων πεπτιδίων. Στη φύση η βιοσύνθεση των πρωτεϊνών γίνεται με κατεύθυνση από το Ν- τελικό άκρο προς το C-τελικό άκρο. Στο εργαστήριο προτιμάται η αντίθετη πορεία, δηλαδή η προσθήκη αμινοξέων στο C-τελικό άκρο μέχρι να προστεθεί και το Ν- τελικό άκρο, έτσι ώστε να μειωθεί το ποσοστό της πιθανής ρακεμίωσης.

69 69 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Μέθοδος σύνθεσης μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών κλασμάτων (Fragment Condensation) Η σύνθεση πεπτιδίων μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών κλασμάτων περιλαμβάνει την σύνθεση προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων (κλασμάτων) και την ακόλουθη ένωσή τους με πεπτιδικό δεσμό. Η σύνθεση κατά στάδια ενδείκνυται για πεπτίδια περίπου αμινοξέων ενώ η σύνθεση μέσω συμπύκνωσης κλασμάτων σε στερεά φάση, η οποία ονομάζεται SPFC (Solid-Phase Fragment Condensation), προτιμάται για μεγαλύτερα πεπτίδια και για μικρές πρωτεΐνες (με 50 αμινοξέα ή παραπάνω). Ο λόγος που η μέθοδος αυτή προτιμάται για μεγάλες συνθέσεις είναι η μείωση των αριθμών συζεύξεων μεταξύ των κλασμάτων, επομένως συμβάλλει στην αύξηση της απόδοσης και της καθαρότητας του επιθυμητού πεπτιδίου σε σύγκριση με τη μέθοδο σύνθεσης κατά στάδια. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι ο κίνδυνος ρακεμίωσης του ενεργοποιημένου C-τελικού αμινοξέος του καρβοξυπαραγώγου, ο οποίος αντιμετωπίζεται με την επιλογή Pro Gly ή ως C-τελικά άκρα στα κλάσματα που θα χρησιμοποιηθούν για συμπύκνωση μεταξύ τους. Όπως αναφέρθηκε, ο λόγος είναι ότι η Gly δεν έχει στερεογονικό άτομο άνθρακα και η Pro έχει το στερεογονικό άτομο άνθρακα δεσμευμένο σε δακτύλιο, οπότε και παρεμποδίζεται το φαινόμενο της ρακεμίωσης [79]. Α.2.7. Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης φάση. Η πεπτιδική σύνθεση μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε σε υγρή είτε σε στερεή Α Σύνθεση σε υγρή φάση (Liquid Phase Synthesis) Κατά τη πεπτιδική σύνθεση σε υγρή φάση όλες οι διεργασίες γίνονται σε διάλυμα. Το πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι επιτρέπει την απομόνωση και την ταυτοποίηση των ενδιάμεσων προϊόντων, έτσι ώστε να γνωρίζουμε ποια χημικά είδη υπάρχουν στο διάλυμα σε κάθε βήμα και αν έχει λάβει χώρα κάποια

70 70 Α. Θεωρητικό Μέρος ανεπιθύμητη αντίδραση, όπως είναι η ατελής αποπροστασία. Παρόλο που μέσω διάφορων τεχνικών καθαρισμού, όπως η ανακρυστάλλωση, είναι δυνατή η αφαίρεση των παραπροϊόντων από το διάλυμα πριν συνεχιστεί η σύνθεση, η τεχνική αυτή απαιτεί πολύ χρόνο για την ολοκλήρωση της σύνθεσης. Επίσης, ένα άλλο πρόβλημα που προκύπτει συχνά είναι η δυσδιαλυτότητα των ενδιάμεσων προϊόντων καθώς κατά τη διάρκεια της σύνθεσης είναι πιθανό κάποια από τα προστατευμένα συντιθέμενα πεπτίδια να μην διαλύονται στους διαλύτες και έτσι να εμποδίζουν την ολοκλήρωση της σύνθεσης [36]. Για τους λόγους αυτούς η τεχνική αυτή δεν προτιμάται για τη σύνθεση μεγάλων πεπτιδίων. Α Σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) Η πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση προτάθηκε από τον R. B. Merrifield το 1963 [80]. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην δέσμευση του πρώτου αμινοξέος με ομοιοπολικό δεσμό σε ένα στερεό πολυμερές υπόστρωμα (ρητίνη). Έπειτα, γίνεται η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας κατά στάδια με την προσθήκη των επόμενων αμινοξέων μέχρι να συντεθεί η επιθυμητή αλληλουχία και στο τέλος αφαιρούνται το στερεό υπόστρωμα καθώς και οι προστατευτικές ομάδες από το πεπτίδιο. Το συντιθέμενο πεπτίδιο καθαρίζεται και ταυτοποιείται. Με τη δέσμευση της πεπτιδικής αλυσίδας σε ένα αδιάλυτο στερεό, είναι εφικτή η διήθηση, η έκπλυση και η απομάκρυνση των περισσευούμενων αντιδραστηρίων και των διαλυτών προϊόντων. Το μειονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι πως δεν μπορεί να γίνει απομόνωση ταυτοποίηση των ενδιάμεσων προϊόντων, παρά μόνο μετά το τέλος της σύνθεσης. Η διευκόλυνση όμως των χειρισμών και η μείωση του χρόνου σύνθεσης των πεπτιδίων που προσφέρει, την έχουν καταστήσει ως τη βασική μέθοδο πεπτιδικής σύνθεσης.

71 71 Α. Θεωρητικό Μέρος Σχήμα Α.34: Σχηματική αναπαράσταση πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση. Προσαρμοσμένη από [81]. Α Στερεό υπόστρωμα Για να είναι ένα πολυμερές κατάλληλο στερεό υπόστρωμα (ρητίνη) πρέπει να πληρούνται κάποιες προϋποθέσεις [36, 82]: 1. Να έχει μηχανική αντοχή και φυσικοχημική αδράνεια σε όλα τα αντιδρώντα και τους διαλύτες που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια της σύνθεσης και να μην μπορεί να αλληλεπιδράσει με αυτά ή με την πεπτιδική αλυσίδα που είναι εστεροποιημένη στη ρητίνη. 2. Να έχει καλή διόγκωση στους διαλύτες που χρησιμοποιούνται. 3. Να είναι εύκολη η εστεροποίηση του πρώτου Ν α -προστατευμένου αμινοξέος στη ρητίνη. 4. Να είναι εύκολη η απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη. 5. Να είναι αδιάλυτο σε όλους τους διαλύτες που χρησιμοποιούνται. 6. Να έχει σταθερή φυσική δομή η οποία επιτρέπει την άμεση διήθηση. 7. Να έχει μια λειτουργική ομάδα πάνω στην οποία θα δεσμευτεί το πρώτο Ν α - προστατευμένο αμινοξύ με ομοιοπολικό δεσμό. 8. Να έχει τέτοια κοκκομετρική σύσταση (συνήθως mesh), ώστε όταν διογκωθεί η ρητίνη, να επιτρέπει στα αντιδρώντα να εισχωρήσουν μέσα στο πολυμερές.

72 72 Α. Θεωρητικό Μέρος Η διόγκωση της ρητίνης παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη πεπτιδική σύνθεση καθώς όσο πιο πολύ διογκώνεται η ρητίνη τόσο μεγαλύτερη διάχυση των διαλυτών υπάρχει. Έτσι, τα αντιδραστήρια μπορούν να φτάσουν στις λειτουργικές περιοχές της ρητίνης και να γίνει η επιθυμητή αντίδραση. Η διόγκωση εξαρτάται από τον τύπο του διαλύτη που χρησιμοποιείται κάθε φορά. Σχήμα Α.35: Σχηματική αναπαράσταση διόγκωσης και συρρίκνωσης ρητίνης με εφαρμογή κατάλληλου διαλύτη [83]. Η πρώτη ρητίνη που χρησιμοποιήθηκε από τον Merrifield ήταν ένα χλωρομέθυλο παράγωγο ενός συμπολυμερούς στυρολίου-διβινυλοβενζολίου. Cl Σχήμα Α.36: Ρητίνη του Merrifield. Το βασικό πολυμερές που χρησιμοποιείται στην πεπτιδική σύνθεση είναι ένα συμπολυμερές στυρολίου-διβινυλοβενζολίου (PS-DVB). Το ποσοστό του διβινυλοβεζολίου είναι περίπου 1-2%, ποσοστό που προσδίδει τις επιθυμητές ιδιότητες στο πολυμερές. Το στυρόλιο μόνο του είναι διαλυτό ενώ μαζί με το διβινυλοβενζόλιο αποτελούν ένα αδιάλυτο σε οργανικούς διαλύτες πολυμερές.

73 73 Α. Θεωρητικό Μέρος X Στυρόλιο Διβινυλοβενζόλιο Συμπολυμερές PS-DVB Η χαρακτηριστική ομάδα της ρητίνης είναι αυτή που τη διαφοροποιεί από τις υπόλοιπες. Η ομάδα αυτή λειτουργεί ως συνδέτης και συνδέει μία δραστική ομάδα του πολυμερούς με μία δραστική ομάδα του μορίου (C-τελικό άκρο του πρώτου Ν α - προστατευμένου αμινοξέος). Διατηρεί τις ιδιότητες του πολυμερούς (π.χ. ότι είναι αδιάλυτο σε όλους τους οργανικούς διαλύτες) και τις ιδιότητες του εστέρα (του μορίου δηλαδή που έχει δεσμευτεί πάνω σε αυτήν). Το είδος της ρητίνης επιλέγεται ανάλογα με την στρατηγική σύνθεσης που θα ακολουθηθεί και το είδος των Ν α -προστατευμένων αμινοξέων που θα χρησιμοποιηθούν. Οι δύο στρατηγικές που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι η Boc/Bzl και η Fmoc/tBu μεθοδολογία. Μερικές από τις συνήθεις ρητίνες που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα.

74 74 Α. Θεωρητικό Μέρος Πίνακας Α.12: Ρητίνες που χρησιμοποιούνται στην SPPS. Δομή και ονομασία ρητίνης R Συνθήκες αποπροστασίας Μεθοδολογία Fmoc Fmoc R C C + DCC/DMAP TFA 95% v/v TFA, 1-2h Fmoc/tBu Wang [84] R C 3 Fmoc Fmoc R C C + DCC/DMAP TFA C 3 0,5-1% TFA σε DCM, 15 min Fmoc/tBu Sasrin [85] R Fmoc C + Cl Cl C Fmoc DIPEA Cl Ac/TFE/DCM 1:1: min Fmoc/tBu C C R Ac/TFE/DCM CLTR-Cl [86] Το μειονέκτημα της ρητίνης Wang είναι η χρήση της 4-διμεθυλαμινοπυριδίνης (DMAP), η οποία είναι μία ισχυρή βάση και ακόμα και σε μικρό ποσοστό, μπορεί να διώξει την Fmoc-προστατευτική ομάδα, να μείνει ελεύθερο το Ν-άκρο της πεπτιδικής αλυσίδας και να συζευχθεί εκεί και δεύτερο αμινοξύ. Επίσης, αυξάνει την πιθανότητα ρακεμίωσης, ειδικά στα αρωματικά αμινοξέα καθώς σε βασικές συνθήκες είναι εύκολη η απόσπαση πρωτονίου.

75 75 Α. Θεωρητικό Μέρος Η ρητίνη Sasrin έχει τα ίδια μειονεκτήματα με τη ρητίνη Wang και το μόνο πλεονέκτημά της είναι ότι απαιτεί πιο ήπιες συνθήκες απομάκρυνσης του πεπτιδίου από τη ρητίνη (1% TFA) λόγω της μεθόξυ ομάδας στον δακτύλιό της. Α CLTR-Cl ρητίνη Η 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη (CLTR-Cl) προσφέρει εύκολη και γρήγορη εστεροποίηση του πρώτου α -προστατευμένου αμινοξέος. Η εστεροποίηση γίνεται με απευθείας αντίδραση του καρβόξυ-άκρου του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος με το Cl της ρητίνης με χρήση διισοπροπυλ-αιθυλαμίνης (DIPEA) [87, 88]. Η παρουσία του δεύτερου χλωρίου μειώνει την ευαισθησία του εστερικού δεσμού, καθώς όταν δημιουργηθεί το τριτυλ κατιόν κατά την απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη, το Cl στη θέση 2 (ortho-cl) σταθεροποιεί το καρβοκατιόν έλκοντας ηλεκτρόνια με Ι επαγωγικό φαινόμενο. Το ποσοστό υποκατάστασης του πολυμερούς εξαρτάται από την ποσότητα του αντιδρώντος αμινοξέος και είναι αντιστρόφως ανάλογο με το μέγεθος του παρασκευαζόμενου πεπτιδίου. Για μικρά πεπτίδια (<15 αμινοξέα επιλέγεται μεγάλη υποκατάσταση (>0,5mmol/g ρητίνης) και για μεγάλα πεπτίδια (>15 αμινοξέα) επιλέγεται μικρότερη υποκατάσταση (<0,5mmol/g ρητίνης), καθώς όσο μεγαλώνει η πεπτιδική αλυσίδα, αυξάνεται και η στερεοχημική παρεμπόδιση των διεργασιών της σύνθεσης. C Cl Cl DCM C Cl Cl + Fmoc R (DIPEA) DIPEA.Cl + C Fmoc Cl R Σχήμα Α.37: Εστεροποίηση Ν α -προστατευμένου αμινοξέος στην CLTR-CL ρητίνη.

76 76 Α. Θεωρητικό Μέρος Όπως φαίνεται και στο σχήμα Α.37, το DIPEA δεσμεύει το Cl που εκλύεται. Πριν την απομάκρυνση της Fmoc ομάδας, πραγματοποιούνται εκπλύσεις της ρητίνης με διάλυμα Me/DIPEA/DCM, ώστε να απενεργοποιηθούν τα ενεργά κέντρα της ρητίνης που δεν αντέδρασαν κατά την εστεροποίηση και στις θέσεις αυτές να σχηματιστούν μεθυλαιθέρες της ρητίνης. Εάν δεν δεσμευτούν αυτές οι θέσεις θα εκλυθεί Cl, οπότε και υπάρχει κίνδυνος απομάκρυνσης του πεπτιδίου από τη ρητίνη. Μετά την απομάκρυνση της Fmoc ομάδας ακολουθεί η σύζευξη του επόμενου Fmoc-αμινοξέος. Όταν το πεπτίδιο συντεθεί με διαδοχικούς κύκλους σύζευξηςαποπροστασίας, απομακρύνεται από τη ρητίνη. Η απομάκρυνση γίνεται σε ήπιες συνθήκες που αφήνουν ανέπαφες τις άλλες προστατευτικές ομάδες και μειώνει την πιθανότητα σχηματισμού DKP ανάμεσα στο πρώτο και δεύτερο αμινοξύ λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης. Α Διαλύτες στην SPPS Κατά την επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας είναι σημαντικό να υπάρχει καλή επιδιαλύτωση του πεπτιδίου-ρητίνης έτσι ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία συσσωμάτων μέσα στην αλυσίδα ή μεταξύ πολλών αλυσίδων (inter- και intra-chain αντίστοιχα), κάτι το οποίο εμποδίζει την διεκπεραίωση της αντίδρασης. Επομένως, όσο καλύτερη είναι η επιδιαλύτωση του πεπτιδίου πάνω στη ρητίνη, τόσο μεγαλύτερη θα είναι και η απόδοση της σύνθεσης. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται πολικοί απρωτικοί διαλύτες και οι πιο συχνοί από αυτούς είναι το διχλωρομεθάνιο (DCM), το Ν,Ν -διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF), η Ν-μεθυλοπυρολλιδίνη (MP) και το Ν,Ν - διμεθυλοακεταμίδιο (DIMAC) [89], [90]. Διχλωρομεθάνιο (DCM): Διογκώνει πολύ καλά ρητίνες που αποτελούνται από πολυστυρόλιο, δεν αντιδρά με το TFA και χρησιμοποιείται συχνά στην Boc μεθοδολογία καθώς διαλύει αμέσως τα περισσότερα Boc-προστατευμένα αμινοξέα. Δεν χρησιμοποιείται ως διαλύτης στις αντιδράσεις σύζευξης στην Fmoc μεθοδολογία επειδή αντιδρά με την πιπεριδίνη και σχηματίζει αδιάλυτους κρυστάλλους. Ν-μεθυλο-πυρολλιδίνη (MP): Είναι πιο πολικός διαλύτης από το DCM και συμβάλλει στην καλή επιδιαλύτωση και στην αύξηση απόδοσης της σύνθεσης. Διαλύει τα περισσότερα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται, παρόλα αυτά έχει

77 77 Α. Θεωρητικό Μέρος παρατηρηθεί ότι όταν τα Fmoc-προστατευμένα αμινοξέα διαλύονται με MP αποικοδομούνται πιο γρήγορα σε σχέση με όταν διαλύονται με DMF. Ν,Ν -διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF): Το DMF είναι πολύ φθηνότερος διαλύτης από ότι το MP και για αυτό προτιμάται στις αντιδράσεις σύζευξης, παρόλο που διασπάται σε διμεθυλαμίνες. Οι αμίνες αυτές μπορούν να αντιδράσουν με τη Fmoc ομάδα και να την απομακρύνουν από το Ν-άκρο, κάτι που οδηγεί σε πολλές επανασυζεύξεις του αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα και σε προϊόντα με πολλές ακαθαρσίες. Α.2.8. Κυκλοποίηση πεπτιδίων Τα κυκλικά πεπτίδια αποτελούν αντικείμενο συχνής μελέτης στην πεπτιδική χημεία καθώς οι ιδιότητές τους τα καθιστούν σε πολλές περιπτώσεις χρησιμότερα από ότι τα αντίστοιχα γραμμικά πεπτίδια. Ο δεσμός μεταξύ άμινο και καρβόξυ άκρου ενισχύει την αντοχή του μορίου απέναντι στα πρωτεολυτικά ένζυμα και η απουσία φορτίου προσδίδει αυξημένη υδροφοβικότητα και επομένως αυξημένη διαπερατότητα δια μέσου των κυτταρικών μεμβρανών [91]. Ακόμη, η δομή τους επηρεάζει την συγγένειά τους με τον υποδοχέα, καθιστώντας τα πιο εκλεκτικά. Υπάρχουν τέσσερις διαφορετικοί τρόποι κυκλοποίησης: Από άκρη σε άκρη (head to tail) Από άκρη σε πλευρική ομάδα (head to side chain) Από πλευρική σε πλευρική ομάδα (side chain to side chain) Μέσω πλάγιας ομάδας κυστεΐνης (ενδομοριακοί ή διαμοριακοί δισουλφιδικοί δεσμοί) Στην παρούσα διπλωματική εργασία, η κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε από άκρη σε άκρη. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία αμιδικού δεσμού στην περίπτωση αυτή είναι τα TBTU/At παρουσία βάσης όπως είναι η κολλιδίνη. Ο διαλύτης που χρησιμοποιείται είναι το DMF και μάλιστα σε μεγάλη ποσότητα, καθώς πρέπει να έχουμε μεγάλες αραιώσεις ώστε να γίνει ενδομοριακή κυκλοποίηση και όχι διαμοριακή. Η καταβύθιση του κυκλοποιημένου πεπτιδίου γίνεται με νερό και όχι διαιθυλαιθέρα, καθώς ο δεύτερος καταβυθίζει το At και το TBTU.

78 78 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.2.9. Αναλυτικές τεχνικές Α Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (PLC) Ο όρος χρωματογραφία αποδίδεται σε μια μεγάλη ποικιλία μεθόδων, οι οποίες διαχωρίζουν ουσίες με παραπλήσιες χημικές ιδιότητες από σύνθετα μίγματα. Σε όλους τους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς το δείγμα κινείται σε μια κινητή φάση (mobile phase), η οποία μπορεί να είναι ένα αέριο, ένα υγρό ή ένα υπερκρίσιμο ρευστό. Στη συνέχεια, η κινητή φάση εξαναγκάζεται να διέλθει μέσω μιας στατικής φάσης (stationary phase), η οποία είναι καθηλωμένη σε μια στήλη ή σε μια στερεά επιφάνεια (υλικό πλήρωσης). Οι δύο φάσεις επιλέγονται έτσι, ώστε τα συστατικά του δείγματος να κατανέμονται μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης σε διαφορετικό βαθμό. Τα συστατικά τα οποία κατακρατούνται ισχυρότερα από τη στατική φάση κινούνται αργά κατά τη ροή της κινητής φάσης. Αντίθετα, τα συστατικά τα οποία κατακρατούνται ασθενέστερα από τη στατική φάση, κινούνται ταχύτερα. Ως αποτέλεσμα αυτών των διαφορών στην ευκινησία, τα συστατικά του δείγματος διαχωρίζονται καταλαμβάνοντας το καθένα ξεχωριστές ζώνες και στη συνέχεια μπορούν να προσδιορισθούν ποιοτικά ή/και ποσοτικά. Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (igh Performance Liquid Chromatography, PLC) είναι η πιο διαδεδομένη από όλες τις αναλυτικές τεχνικές διαχωρισμού. Οι λόγοι είναι η ευαισθησία της, η εύκολη προσαρμογή της σε ακριβείς ποσοτικούς προσδιορισμούς, η καταλληλότητα της για διαχωρισμούς μη πτητικών ή θερμικά ευαίσθητων συστατικών και κυρίως, η εφαρμοσιμότητά της σε προσδιορισμούς ουσιών, όπως είναι τα αμινοξέα, οι πρωτεΐνες, τα νουκλεϊκά οξέα, οι υδρογονάνθρακες κ.α. Μετά τη σύνθεση των πεπτιδίων, είναι απαραίτητο να γίνει ο διαχωρισμός τους από άλλες ουσίες ή τυχόν παραπροϊόντα, ο καθαρισμός τους και ο έλεγχος καθαρότητάς τους. Με την PLC μπορούμε να επεξεργαστούμε το συντιθέμενο πεπτίδιο και να εκπληρώσουμε τις απαιτήσεις αυτές. Συγκεκριμένα, για τον καθαρισμό των πεπτιδίων, χρησιμοποιούμε την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Ανάστροφης Φάσης (Reverse Phase-igh Performance Liquid Chromatography, RP-PLC). Στην χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, η στατική φάση είναι μη πολική και είναι συχνά ένας υδρογονάνθρακας ενώ η κινητή φάση

79 79 Α. Θεωρητικό Μέρος είναι ένας σχετικά πολικός διαλύτης, όπως είναι το νερό, η μεθανόλη και το ακετονιτρίλιο. Το αποτέλεσμα είναι το πολικότερο συστατικό του δείγματος που αναλύουμε, να εκλούεται (δηλαδή να εμφανίζεται) πρώτο και με αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης ο χρόνος έκλουσης (t R ) αυξάνει. Στην επιφάνεια της στατικής φάσης, η οποία συνήθως είναι πυριτία (silica), προσδένονται οργανοπυριτικές ενώσεις, όπως είναι τα σιλοξάνια, που σχηματίζονται κατά την αντίδραση της υδρολυμένης επιφάνειας με ένα οργανοχλωριομένο σιλάνιο: C 3 C 3 Si + Cl Si R Si Si R C 3 C 3 Σχήμα Α.38: Επίστρωση της στατικής φάσης με σιλοξάνια, όπου R=αλκυλομάδα ή υποκατεστημένη αλκυλομάδα. Η επίστρωση αυτή μετατρέπει την στατική φάση από πολική (silica) σε μη πολική και όσο μεγαλύτερη είναι η ομάδα R στα σιλοξάνια, τόσο μειώνεται η πολικότητα της στατικής φάσης. Συνηθέστερα, η ομάδα R είναι μια αλυσίδα C 8 (nοκτύλιο) ή μια αλυσίδα C 18 (n-δεκαοκτύλιο). Μεγαλύτερες αλυσίδες αλκυλομάδας παράγουν υλικά πλήρωσης με μεγαλύτερη ικανότητα κατακράτησης, για παράδειγμα υλικό με C 18 κατακρατεί μεγαλύτερη ποσότητα ουσίας σε σχέση με ένα υλικό με C 8. Συχνά η απόδοση διαχωρισμού ενισχύεται σημαντικά με τη βαθμιδωτή έκλουση, στην οποία χρησιμοποιούνται δύο ή τρία συστήματα διαλυτών που διαφέρουν σημαντικά ως προς την πολικότητα και ο λόγος τους μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της έκλουσης. Ωστόσο, θα πρέπει να ληφθεί πρόνοια να αποφευχθούν τιμές p μεγαλύτερες από 7,5, διότι στις τιμές αυτές αρχίζει υδρόλυση του σιλοξανίου, που οδηγεί σε αποικοδόμηση ή καταστροφή του υλικού πλήρωσης. Γενικώς, για την ανάλυση και τον καθαρισμό των πεπτιδίων χρησιμοποιούμε την RP-PLC με βαθμιδωτή έκλουση και σύστημα διαλυτών 2 και AC ως κινητή φάση. Επίσης, στην κινητή φάση προσθέτουμε ποσότητα TFA 0,08-0,1% για επίτευξη p περίπου ίσο με 2, όπου όλες οι αμινομάδες του προς ανάλυση πεπτιδίου είναι πρωτονιωμένες [92]. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση και τον καθαρισμό πεπτιδίων είναι συνήθως υπεριώδους ακτινοβολίας, σταθερού ή μεταβαλλόμενου μήκους κύματος. Τα μήκη κύματος που χρησιμοποιούνται ευρέως για τα πεπτίδια είναι η περιοχή των nm, στην οποία ανιχνεύεται η υψηλότερη απορρόφηση

80 80 Α. Θεωρητικό Μέρος του πεπτιδικού δεσμού, τα 254nm στα οποία ανιχνεύονται τα αμινοξέα τα οποία φέρουν αρωματικές ομάδες και τα 265nm όπου έχει χαρακτηριστική απορρόφηση η Fmoc ομάδα. Α Φασματομετρία Μάζας (Mass Spectrometry, MS) Η φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry, MS) είναι μια πολλαπλά χρήσιμη και ευρύτατα χρησιμοποιούμενη τεχνική για την ταυτοποίηση στοιχείων σε δείγματα και τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεών τους. Η ανάλυση με φασματομετρία μάζας περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Ατομοποίηση. 2. Μετατροπή ενός σημαντικού κλασμάτος των ατόμων, που σχηματίζονται κατά το πρώτο στάδιο, σε ρεύμα ιόντων. 3. Διαχωρισμό των ιόντων, που σχηματίζονται κατά το δεύτερο στάδιο, με βάση το λόγο μάζας/φορτίου (m/z), όπου m είναι η μάζα του ιόντος σε ατομικές μονάδες και z το φορτίο του. 4. Απαρίθμηση των ιόντων κάθε κατηγορίας ή μέτρηση του ρεύματος που παράγεται, όταν τα σχηματιζόμενα από το δείγμα ιόντα προσπίπτουν σε κατάλληλο μεταλλάκτη. Το φασματόμετρο μαζών είναι ένα όργανο που διαχωρίζει ταχέως κινούμενα ιόντα με βάση το λόγο m/z. Τα κύρια τμήματά του είναι: Το σημείο εισόδου (στόμιο εισαγωγής) όπου εισάγεται η μικροποσότητα δείγματος. Η πηγή ιόντων όπου οι ενώσεις του δείγματος μετατρέπονται σε αεριώδη ιόντα μετά από βομβαρδισμό με ηλεκτρόνια, φωτόνια, ιόντα ή μόρια. Ο αναλυτής μαζών όπου εισέρχεται ένα ρεύμα θετικών ή αρνητικών ιόντων σε αεριώδη κατάσταση και γίνεται η ταξινόμηση τους. Ο μεταλλάκτης ιόντων, ο οποίος μετατρέπει την ιοντική δέσμη σε ηλεκτρικό σήμα. Ο επεξεργαστής σήματος όπου γίνεται ο χειρισμός των δεδομένων. Η έξοδος δεδομένων από όπου λαμβάνουμε το φάσμα μαζών.

81 81 Α. Θεωρητικό Μέρος Το φάσμα μαζών λαμβάνεται με τη μορφή ενός γραφήματος, όπου η τετµηµένη είναι ο λόγος μάζα/φορτίο (m/z) και τεταγµένη είναι η σχετική ένταση (%) ως προς τη βασική κορυφή [93]. Η φασματομετρία μαζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (electrospray ionization/mass spectrometry, ESI/MS), είναι η τεχνική που χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση των πεπτιδίων. Το διάλυμα του δείγματος αντλείται μέσω μιας ανοξείδωτης τριχοειδούς βελόνας με ταχύτητα μl/min. Η βελόνα βρίσκεται σε δυναμικό αρκετών kv ως προς ένα κυλινδρικό ηλεκτρόδιο που περιβάλλει τη βελόνα. Οι δημιουργούμενες φορτισμένες μικρές σταγόνες διέρχονται μέσω ενός τριχοειδούς, όπου ο διαλύτης εξατμίζεται και φορτίζονται τα μόρια του αναλύτη. Καθώς οι σταγόνες μικραίνουν λόγω εξαέρωσης του διαλύτη, η πυκνότητα φορτίου αυξάνει και πραγματοποιείται εκρόφηση των ιόντων στο περιβάλλον αέριο, π.χ. άζωτο [92]. Α Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας είναι μια μέθοδος επίπεδης χρωματογραφίας, στην οποία η στατική φάση είναι ένα σχετικά λεπτό επίπεδο στρώμα μιας ουσίας, το οποίο αυτοστηρίζεται πάνω σε μια επιφάνεια, συνήθως αλουμινίου. Η κινητή φάση είναι ένας διαλύτης ή ένα σύστημα διαλυτών, η οποία διέρχεται μέσα από τη στατική φάση με τριχοειδή φαινόμενα. Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας παρουσιάζει το πλεονέκτημα του χαμηλού κόστους και της ταχύτητας των διερευνητικών πειραμάτων. Αφού γίνει η ανάπτυξη της πλάκας, δηλαδή η μεταφορά του δείγματος με την κινητή φάση μέσα από τη στατική, εντοπίζουμε τη θέση του αναλύτη πάνω στην πλάκα. Η διεργασία αυτή γίνεται είτε με εμφάνιση των κηλίδων που περιέχουν αρωματική ένωση στο υπεριώδες φως, είτε με ψεκασμό της πλάκας με νινυδρίνη, ένα αντιδραστήριο το οποίο σχηματίζει έγχρωμο παράγωγο με δευτεροταγείς αμίνες, όπως είναι τα αμινοξέα [92].

82 82 Α. Θεωρητικό Μέρος + 2 C R C Νινυδρίνη (ένυδρο 1,2,3-ινδανοτριόνη) C + RC + C έγχρωμο παράγωγο Σχήμα Α.39: Αντίδραση νινυδρίνης με αμινοξύ [94]. Α Test Kaiser Για να ελέγξουμε αν η αποπροστασία του εκάστοτε τελικού Ν α αμινοξέος ολοκληρώθηκε με επιτυχία, εφαρμόζουμε το test Kaiser. Το test Kaiser είναι ένα σύστημα τριών διαλυτών, νινυδρίνης, φαινόλης και κυανιούχου καλίου το οποίο αντιδρά με ελεύθερες αμίνες και δίνει μπλε χρώμα στο διάλυμα. Μετά την προσθήκη του αντδραστηρίου Kaiser στο δείγμα πεπτιδίου-ρητίνης και θέρμανση για 5min στους ο C, παρατηρούμε το χρώμα. Αν το χρώμα είναι μπλε, τότε το αντιδραστήριο αντέδρασε με ελεύθερη αμινομάδα του πεπτιδίου. Αν το χρώμα είναι κίτρινο, τότε δεν έγινε αντίδραση, επομένως δεν υπάρχουν ελεύθερες αμινομάδες στο πεπτίδιο. Όλα τα αμινοξέα δίνουν μπλε χρώμα, εκτός από την Pro που δίνει καφέ-κίτρινο [95]. Σχήμα Α.40: Απεικονίζονται με τη σειρά: 1) Αρνητικό test Kaiser, 2) Θετικό test Kaiser, 3) Αρνητικό test Kaiser προλίνης, 4) Θετικό test Kaiser προλίνης.