ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ. Για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών προϊόντων ΔΙΑΤΡΙΒΗ Για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Σχεδιασμός και σύνθεση επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης συζευγμένων με ανθρακινόνες Δανιηλίδης Άγγελος Ελευθέριος ΧΗΜΙΚΟΣ Πάτρα 2016

2

3 UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENTS OF CHEMISTRY, PHARMACY, MEDICINE INTER-DEPARTMENTAL POSTGRADUATE PROGRAM MEDICINAL CHEMISTRY: Drug discovery and design M.Sc. Thesis Design and synthesis of myelin protein epitopes conjugated with anthraquinones Daniilidis Angelos Eleftherios CHEMIST Patras 2016

4

5 Επιβλέπων: Θεόδωρος Τσέλιος Αναπληρωτής Καθηγητής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Θεόδωρος Τσέλιος Δημήτριος Γάτος Γεράσιμος Τσιβγούλης Αναπληρωτής Καθηγητής Αναπληρωτής Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Supervisor: Theodore Tselios Associate Professor Examiners Committee: Theodore Tselios Dimitrios Gatos Gerasimos Tsivgoulis Associate Professor Associate Professor Assistant Professor v

6 vi

7 Περίληψη Το αντικείμενο μελέτης της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η σύνθεση αναλόγου του ανοσοκυρίαρχου επιτόπου της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης που σχετίζεται με τη Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ). Πιο συγκεκριμένα συντέθηκε πεπτιδικό ανάλογο με βάση τoν επίτοπο της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης (Myelin Basic Protein, MBP) η οποία είναι το βασικό συστατικό του περιβλήματος της μυελίνης και αποτελεί το % των πρωτεϊνών της μυελίνης. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε περιλαμβάνει τη σύνθεση σε στερεή φάση του πεπτιδίου MBP και τη σύζευξη του με τροποποιημένο μόριο ανθρακινόνης το οποίο επίσης συντέθηκε για το σκοπό αυτό. Η διαδικασία της σύζευξης σχεδιάστηκε μέσω μιας γέφυρας (Ahx) 6 και δισουλφιδικού δεσμού με σκοπό να επιτευχθεί, μέσω του συστήματος της θειορεδοξίνης, καταστροφή των εγκεφαλιτογόνων T κυττάρων τα οποία αναγνωρίζουν τον επίτοπο MBP Λέξεις κλειδιά: Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ), Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (MBP), Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας/Αντιγόνα Ανθρώπινων Λεμφοκυττάρων (MHC/HLA), Πεπτιδική Σύνθεση, Θειορεδοξίνη vii

8 viii

9 Summary In this study the synthesis of a peptide analogue based on the myelin proteins involved in Multiple Sclerosis (MS) is reported. This molecule could be the basis for the development of a new approach for the MS treatment. Peptide analogue based on the immunodominant epitope of MBP (Myelin Basic Protein, MBP) was synthesized. MBP is the basic element of the external housing of myelin and it constitutes a proportion of % of all myelin proteins. The strategy that was followed involves the synthesis of the peptide analogue MBP conjugated with a modified anthraquinone that was synthesized for this purpose. The coupling was designed via an (Ahx) 6 bridge and a disulfide bond in order to achieve selective immunosuppression of the encephalitogenic T cells that recognize the MBP immunodominant epitope. Key words: Multiple Sclerosis (MS), Myelin Basic Protein (MBP), Major Histocompatibility Complex/Human Leukocyte Antigen (MHC/HLA), Peptide Synthesis, Theioredoxin ix

10 x

11 Ευχαριστίες Η παρούσα Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στον τομέα Οργανικής Χημείας, Βιοχημείας και Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα μου Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Θεόδωρο Τσέλιο που με επέλεξε να συμμετέχω στην ερευνητική του ομάδα. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω ιδιαίτερα για την καθοδήγηση και την πολύ χρήσιμη βοήθειά του καθ όλη τη διάρκεια της διπλωματικής μου εργασίας αλλά και για τις πολύτιμες συμβουλές του σε θέματα εντός και εκτός εργαστηρίου. Στη συνέχεια θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη τις εξεταστικής επιτροπής μου, Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Δημήτριο Γάτο και Επίκουρο Καθηγητή κ. Γεράσιμο Τσιβγούλη για την άψογη συνεργασία που είχα με τους ίδιους αλλά και τις ερευνητικές τους ομάδες όλο αυτό το διάστημα. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Μεταδιδάκτορα Carmen Simal Fernandez για την άψογη συνεργασία μας, την πολύτιμη βοήθειά της, τη μετάδοση γνώσεων αλλά κυρίως για την ηθική υποστήριξη που μου έδωσε μέσα στο εργαστήριο. Ευχαριστώ επίσης τη Διδάκτορα Ανθή Ταπεινού για τη συμβολή και τη βοήθειά της στο έργο μου. Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλα τα μέλη του εργαστηρίου μου αλλά και των άλλων εργαστηρίων του 2 ου ορόφου για τη βοήθεια, τη στήριξη και τις ωραίες στιγμές που περάσαμε εντός και εκτός Πανεπιστημίου. Ευχαριστώ επίσης τους φίλους μου που μου συμπαραστάθηκαν όλον αυτό τον καιρό. Τέλος θέλω να πω το πιο μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου για όλα όσα μου έχει προσφέρει και συνεχίζει να μου προσφέρει στη ζωή μου όντας πάντα το σημείο αναφοράς μου. Σας ευχαριστώ από καρδιάς. Άγγελος Ελευθέριος Δανιηλίδης xi

12 xii

13 Στους γονείς μου Κωνσταντίνο και Αθηνά xiii

14 xiv

15 Περιεχόμενα Περίληψη... vii Summary... ix Συντομογραφίες... xvii 1 Εισαγωγή Σκλήρυνση κατά Πλάκας Νευρογλοιακά Κύτταρα Νευράξονες Μυελίνη Σύσταση της Μυελίνης & Πιθανά Αυτοαντιγόνα Ανοσία Παθογένεση της ΣΚΠ Υπάρχουσες Θεραπείες Ανθρακινόνη Σχέση δομής-δραστικότητας παραγώγων ανθρακινόνης Πεπτιδική Σύνθεση Εισαγωγή Πεπτιδικός Δεσμός Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης Σύνθεση σε υγρή φάση (Liquid Phase Synthesis) Σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) Μέθοδοι σύνθεσης σε στερεή φάση Boc/Bzl μέθοδος Fmoc/tBu μέθοδος Σύνθεση σε στερεή φάση με την Fmoc/tBu μεθοδολογία Το αδιάλυτο στερεό υπόστρωμα Προστατευτικές ομάδες αμινοξέων στη σύνθεση σε στερεή φάση Ν α -προστατευτικές ομάδες Καρβοξυπροστατευτικές ομάδες Οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Μέθοδος των καρβοδιϊμιδίων Μέθοδος σύζευξης με χρήση φωσφονικών και ουρανικών παραγώγων Παράπλευρες αντιδράσεις στην πεπτιδική σύνθεση Στρατηγικές Πεπτιδικής Σύνθεσης Σταδιακή ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας (step by step) xv

16 Σύνθεση μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών κλασμάτων (Fragment condensation ή fragment coupling) Ανίχνευση αμινών με δοκιμή νινυδρίνης (test Kaiser) Αναλυτικές τεχνικές Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) Φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry MS) Σκοπός Βιβλιογραφική ανασκόπηση Στόχος εργασίας Πειραματικό Μέρος Συσκευές-Όργανα-Υλικά Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων Γενική πορεία σύνθεσης πεπτιδικών αναλόγων σε στερεά φάση Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων σε στερεή φάση επί της CLTR-Cl ρητίνης κατά στάδια (step by step) Αντίστροφη συνθετική ανάλυση του συζεύγματος ανθρακινόνη (Ahx) 6 MBP Σύζευξη του αναλόγου (1) με SPDP [Succinimidyl 3-(2- Pyridyldithio)Propionate] για τη σύνθεση του αναλόγου (2) Σύζευξη του αναλόγου (1b) με SPDP [Succinimidyl 3-(2- Pyridyldithio)Propionate] για τη σύνθεση του αναλόγου (2b) Σύνθεση του αναλόγου (3) Σύνθεση του αναλόγου (4) Αποτελέσματα Συζήτηση Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων Σύνθεση αναλόγων ανθρακινόνης Σύνθεση του αναλόγου (3) Σύνθεση του αναλόγου (4) Βιβλιογραφία xvi

17 Συντομογραφίες Οι συντμήσεις που χρησιμοποιούνται στην παρούσα διπλωματική εργασία έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχημικής Ονοματολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomeclature (JCBN), Nomeclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations, Eur. J. Biochem. 138 (1984) 9 and J. Biol. Chem. 264 (1989) 663. Σύντμηση 2-Clt AA ΑΕΦ AcN Ala APC Arg Asn Asp Boc Bzl CLTR-Cl Cys DCC DCM DCU DIC Ονομασία 2-χλωροτριφαινυλομεθυλο-(2-χλωροτριτυλο-) αμινοξύ αιματοεγκεφαλικός φραγμός ακετονιτρίλιο αλανίνη αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο αργινίνη ασπαραγίνη ασπαραγινικό τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα βενζυλομάδα 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη κυστεΐνη Ν, Ν'-δικυκλο εξυλοκαρβοδιιμίδιο διχλωρομεθάνιο Ν,Ν -δικυκλοεξυλουρία Ν, Ν'-διισοπρόπυλοκαρβοδιιμίδιο xvii

18 DIU DIPEA DIMAC DMAP DMF DMSO Dpm ESI-MS Fmoc Gln Glu Gly His HLA HOAt HOBt HPLC IL Ile IFN-γ iproh KNΣ Leu LPS Lys MAG N, N -διισοπροπυλουρία διισοπροπυλαιθυλαμίνη N, N-διμεθυλακεταμίδιο 4-διμεθυλαμινοπυριδίνη διμεθυλοφορμαμίδιο διμεθυλοσουλφοξείδιο διφαινυλομεθυλομάδα φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα γλουταμίνη γλουταμινικό οξύ γλυκίνη ιστιδίνη ανθρώπινο μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης ιντερλευκίνη ισολευκίνη ιντερφερόνη-γ ισοπροπανόλη κεντρικό νευρικό σύστημα λευκίνη σύνθεση σε υγρή φάση λυσίνη μυελινο-σύνδετη γλυκοπρωτεΐνη xviii

19 MBP Met MHC MOBP MOG MRI MS/ΣΚΠ Mtt NK NMP ΠΝΣ Pbf PetEt Phe PLP Pro Py RP-HPLC Scavenger Ser SPPS TBTU TCR TES TFA TFE βασική πρωτεΐνη της μυελίνη μεθειονίνη μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας μυελινο-σύνδετη βασική πρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών μυελινική γλυκοπρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών μαγνητική τομογραφία Σκλήρυνση Κατά Πλάκας 4-μεθυλ-τριτυλομάδα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα Ν-μεθυλοπυρολιδόνη περιφερικό νευρικό σύστημα 2,2,4,6,7-πενταμεθυλοδιυδροφουρανο-5-σουλφονυλομάδα πετρελαϊκός αιθέρας φαινυλαλανίνη πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης προλίνη πυριδίνη υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης ανάστροφης φάσης δεσμευτής (κατιόντων) σερίνη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η-βενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3- τετραμεθυλουρίας υποδοχέας Τ-κυττάρων τριαιθυλοπυρίτιο τριφθοροξικό οξύ τριφθοροαιθανόλη xix

20 THF Thr TLC TNF T R Tris Trp Trt Tyr Val τετραϋδροφουράνιο θρεονίνη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας παράγοντας νέκρωσης όγκων χρόνος έκλουσης (resolution time) τρις-(υδροξυμεθυλ)άμινο μεθάνιο τρυπτοφάνη τριφαινυλομεθυλο(τριτυλο)-ομάδα τυροσίνη βαλίνη xx

21 1 Εισαγωγή

22

23 Εισαγωγή 1.1 Σκλήρυνση κατά Πλάκας Η Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) αυτοάνωσης αρχής που οφείλεται στην καταστροφή της μυελίνης των νευραξόνων (Σχήμα 1). Η μυελίνη είναι μία μονωτική λιποπρωτεΐνη που περιβάλει τους περισσότερους νευράξονες και βοηθάει στην μετάδοση των νευρικών ώσεων (ερεθισμάτων). Σε περίπτωση που η μυελίνη είναι κατεστραμμένη, το νευρικό ερέθισμα σταματάει ή φτάνει με κάποια καθυστέρηση, ανάλογα με το βαθμό καταστροφής της, με συνέπεια να παρατηρούνται νευρολογικές διαταραχές όπως, η δυσκολία στη βάδιση, προβλήματα στην όραση κ.ά. Κύρια χαρακτηριστικά της ΣΚΠ είναι, η πολλαπλότητα που εμφανίζει στα συμπτώματα της, η διάρκεια και η σοβαρότητα των συμπτωμάτων αυτών και τέλος η πορεία εξέλιξης της νόσου που είναι εξατομικευμένη για κάθε ασθενή. Η ΣΚΠ εμφανίζεται κυρίως σε νεαρούς ενήλικες ετών αλλά ενδέχεται και η εμφάνισή της σε ανήλικους ή ηλικιωμένους ανθρώπους με την αναλογία εμφάνισης ανάμεσα σε άντρες και γυναίκες είναι ένα προς δύο. Τα ακριβή αιτία της νόσου παραμένουν άγνωστα, αναγνωρίζεται όμως η συμμετοχή διάφορων περιβαλλοντικών, γενετικών και ανοσολογικών παραγόντων στην εμφάνιση της ασθένειας (Compston and Coles 2008). Σχήμα 1: Υγιής και κατεστραμμένος νευρώνας. (Προσαρμοσμένο από 3

24 Εισαγωγή Νευρογλοιακά Κύτταρα Νευράξονες Μυελίνη Το νευρικό σύστημα αποτελείται από το κεντρικό και το περιφερικό τμήμα. Το κεντρικό τμήμα του νευρικού συστήματος ονομάζεται Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) και αποτελείται από τον νωτιαίο μυελό και τον εγκέφαλο. Το περιφερικό τμήμα του νευρικού συστήματος ονομάζεται Περιφερικό Νευρικό Σύστημα (ΠΝΣ) και αποτελείται από τα νεύρα (Deber et al 1991). Το νευρικό σύστημα αποτελείται από το νευρικό ιστό που αυτός αποτελείται από τα νευρικά κύτταρα και τα νευρογλοιακά κύτταρα (ή νευρογλοία ή απλά γλοία κύτταρα). Τα νευρικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για τη μετάδοση των νευρικών ερεθισμάτων ενώ τα νευρογλοιακά κύτταρα υποβοηθούν αυτή τη λειτουργία θρέφοντας και προστατεύοντας τα νευρικά κύτταρα καθώς και διευκολύνοντας τις νευρικές ώσεις. Πιο συγκεκριμένα, τα γλοία κύτταρα περιβάλλουν τον νευράξονα των νευρικών κυττάρων με μία επικάλυψη μυελίνης μονώνοντας ηλεκτρικά τα νευρικά κύτταρα και έτσι διευκολύνουν τη μετάδοση των νευρικών ώσεων. Η μυελίνη είναι μια λιπόφιλη ουσία πρωτεϊνικής φύσης που βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη των γλοίων κυττάρων. Τα γλοία κύτταρα περιτυλίγουν πολλαπλές φορές την μεμβράνη τους γύρω από τους νευράξονες, δημιουργώντας τα έλυτρα της μυελίνης. Το περίβλημα μυελίνης που περιβάλλει εξωτερικά τον νευράξονα δεν είναι συνεχές, αλλά διακόπτεται κατά μήκος του άξονα του νευρικού κυττάρου. Στα σημεία που δεν υπάρχει το περίβλημα της μυελίνης ο νευράξονας είναι εκτεθειμένος και τα σημεία αυτά ονομάζονται κόμβοι Ranvier (Σχήμα 2). Τα ενεργά δυναμικά των νευρικών ώσεων δεν μπορούν να διαπεράσουν τη μυελίνη σε αυτά τα σημεία και κάνουν «άλμα» από τον έναν κόμβο Ranvier στον επόμενο κόμβο, αυξάνοντας την ταχύτητα διάδοσής τους (Deber et al 1991). Συμπέρασμα αυτού είναι ότι ο κύριος ρόλος της μυελίνης είναι να αυξάνει την ταχύτητα διάδοσης των ενεργών δυναμικών κατά μήκος των νευραξόνων. 4

25 Εισαγωγή Σχήμα 2: Νευρικό κύτταρο και νευρογλοιακά κύτταρα. (Προσαρμοσμένο από Σύσταση της Μυελίνης & Πιθανά Αυτοαντιγόνα Βασικό βιοχημικό χαρακτηριστικό της μυελίνης που τη διαφοροποιεί από άλλες βιολογικές μεμβράνες είναι η υψηλή αναλογία λιπιδίου προς πρωτεΐνες. Έχει βρεθεί ότι τα λιπίδια αποτελούν ένα ποσοστό 70-85% της συνολικής σύστασης της μυελίνης σε αντίθεση με τις πρωτείνες που αποτελόυν το 15-30% του ποσοστού της μυελίνης (Hemmer et al 2002). Η κύρια πρωτεΐνη της μυελίνης είναι η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης (Proteolipid Protein, PLP) που διαμορφώνει περίπου το 50% των συνολικών πρωτεϊνών και ο ρόλος της είναι η παροχή σταθερότητας. Η δέυτερη σημαντικότερη πρωτεΐνη της μυελίνης είναι η βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (Myelin Basic Protein, MBP) που αποτελέι το 30-40% του συνόλου των πρωτεϊνών της μυελίνης (Hemmer et al 2002). 5

26 Εισαγωγή Σε μικρότερα ποσοστά συναντώνται και άλλες πρωτεΐνες όπως είναι η μυελινική πρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG) που βρίσκεται στην επιφάνεια του περιβλήματος της μυελίνης και αποτελεί μόνο το 0,01-0,05% του συνόλου των μυελινικών πρωτεϊνών. Επίσης σε μικρό ποσοστό βρίσκεται η μυελινο-σύνδετη γλυκοπρωτεΐνη ολιγοδενδριτών (Myelin Associated Glycoprotein, MAG). Η πρωτεΐνη αυτή είναι ο κύριος μεσολαβητής των αξονικών νευρογλοιακών συνάψεων με σημαντικό ρόλο στην έναρξη της μυελινοποίησης. Αποτελεί περίπου το 1 % της μυελίνης (Σχήμα 3). Σε ακόμα μικρότερο ποσοστό, είναι οι θερμοπληκτικές πρωτεΐνες (heat shock), η αβ κρυσταλλίνη (ελάσσονα heat shock πρωτεΐνη), η GFAP πρωτεΐνη (Glial fibrillary acidic protein, GFAP), και η S-100b πρωτεΐνη. Σχήμα 3: Οι πρωτεΐνες του ελύτρου της μυελίνης αποτελούν πιθανά αυτοαντιγόνα και στόχοι της ανοσοαπόκρισης στη ΣΚΠ. (Προσαρμοσμένο από Hemmer et al. 2002) 6

27 Εισαγωγή Ανοσία Στον άνθρωπο συναντούμε δύο γραμμές άμυνας για την αντιμετώπιση των παθογόνων, τη μη ειδική και την ειδική άμυνα. Μη ειδική άμυνα εμφανίζουν σχεδόν όλοι οι ζωικοί και οι φυτικοί οργανισμοί. Η μη ειδική ανοσοαπόκριση αναφέρεται στη βασική αντίσταση των οργανισμών σε κάθε είδους λοίμωξη προερχόμενη από ξένους προς αυτόν οργανισμούς. Τα κύρια στοιχεία της μη ειδικής άμυνας είναι οι φυσικοί φραγμοί, τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (Natural Killer cells, NK cells) και τέλος το συμπλήρωμα. Η μη ειδική ανοσία δεν επαρκεί για την πλήρη αντιμετώπιση των παθογόνων έτσι λοιπόν, οι ζωικοί οργανισμοί έχουν αναπτύξει την ειδική ανοσία. Στην ειδική ανοσία το ανοσοποιητικό σύστημα αναγνωρίζει και καταστρέφει τους ξένους μικροοργανισμούς με μια διεργασία που ονομάζεται ανοσοαπόκριση. Η ουσία που προκαλεί την ανοσοαπόκριση ονομάζεται αντιγόνο. Τα πιο κοινά αντιγόνα είναι οι ξένες προς τον οργανισμό πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Αλλά αντιγόνα μπορεί να αποτελέσουν επίσης τα νουκλεϊκά οξέα και τα λιπίδια. Στα αντιγόνα υπάρχουν ειδικές περιοχές που είναι υπεύθυνες για τη δημιουργία της ανοσοαπόκρισης και καλούνται αντιγονικοί καθοριστές ή επίτοποι. Τα περισσότερα αντιγόνα έχουν περισσότερους από έναν επιτόπους μερικοί εκ των οποίων είναι ικανότεροι να προκαλούν ανοσοαπόκριση και υπερισχύουν. Η ειδική ανοσία διακρίνεται στη χυμική και στην κυτταρική ανοσία. Η χυμική ανοσία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των Β κυττάρων από κάποιο αντιγόνο και τη μετέπειτα διαφοροποίησή τους σε πλασματοκύτταρα, που εκκρίνουν αντισώματα ειδικά για το κάθε αντιγόνο, και σε κύτταρα μνήμης. Τα εκκρινόμενα αντισώματα δεσμεύουν τα αντιγόνα και τα καταστρέφουν. Στην κυτταρική ανοσία συναντάμε τα Τ κύτταρα, των οποίων ο ρόλος είναι να αναγνωρίζουν διάφορες ενδοκυττάριες μολύνσεις. Στη συνέχεια ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε Τ κυτταροτοξικά (Τ-cytotoxoc, Tc) και Τ βοηθητικά (T-helper, Th) κύτταρα. Ο μηχανισμός δράσης τους είναι ο εξής. Αρχικά, στο ενδοπλασματικό δίκτυο του προσβεβλημένου κυττάρου οι ξένες πρωτεΐνες υδρολύονται σε πεπτίδια και αμινοξέα. Έπειτα μόρια μεταφορείς, που ονομάζονται Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας ή Αντιγόνα Ανθρώπινων Λεμφοκυττάρων (Major Histocompatibility Complex, ΜΗC ή Human Leukocyte Antigen, HLA για τον άνθρωπο), δεσμεύουν τα πεπτίδια και μεταφέρονται στην επιφάνεια του προσβεβλημένου αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου (Antigen Presenting Cell, APC), όπου αναγνωρίζονται από τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα 7

28 Εισαγωγή (MHC I) και από τα Τ βοηθητικά κύτταρα (MHC II). Έπειτα το μόριο ΜΗC μεταφέρει το πεπτίδιο στην επιφάνεια του κυττάρου, όπου αναγνωρίζεται από τον υποδοχέα ενός Τ κυττάρου και δημιουργείται τριμοριακό σύμπλοκο (Σχήμα 4) μεταξύ του υποδοχέα του Τ κυττάρου (TCR), του αντιγόνου (πεπτίδιο) και του συστήματος ιστοσυμβατότητας (MHC/HLA) (Anderson et al. 2001; Hemmer et al 2006). Τα κυτταροτοξικά T-κύτταρα καταστρέφουν ολόκληρο το προσβεβλημένο κύτταρο, ενώ τα βοηθητικά Τ κύτταρα αποκρίνονται μόνο στο αντιγόνο εκκρίνοντας κυτταροκίνες, που ενεργοποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα (συμπλήρωμα, μακροφάγα, Β κύτταρα) για να επιτεθεί στο αντιγόνο. Δύο διαφορετικοί τύποι Th κυττάρων είναι πολύ σημαντικοί και προέρχονται από το πρόδρομο Th0 κύτταρο, τα Th1 και Th2. Τα Th1 κύτταρα εκκρίνουν κυρίως IL-2, TNF και IFN-γ προάγοντας την ενεργοποίηση των μακροφάγων και άλλων φαγοκυττάρων (κυτταρική ανοσία). Τα Th2 κύτταρα εκκρίνουν κυρίως IL-4 και IL-10, προάγοντας κυρίως την ενεργοποίηση των Β κυττάρων (χυμική ανοσία). Έχει βρεθεί ότι ορισμένοι ασθενείς με ΣΚΠ εμφανίζουν Τh1 ανοσολογική απόκριση (Anderson et al. 2001). Σχήμα 4: Σχηματισμός τριμοριακού συμπλόκου. ( 8

29 Εισαγωγή Παθογένεση της ΣΚΠ Στη ΣΚΠ η ισορροπία μεταξύ του ανοσοποιητικού συστήματος και του οργανισμού διαταράσσεται, με αποτέλεσμα πεπτιδικά τμήματα της μυελίνης να αναγνωρίζονται ως αντιγόνα και το ανοσοποιητικό σύστημα να της επιτίθεται. Αυτό το φαινόμενο οφείλεται σε μια περίπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ διαφόρων συστατικών του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως των μακροφάγων, των Τ και Β κυττάρων, καθώς και διαφόρων κυτταροκινών. (Wucherpfennig et al., 1997, Steinman, 1995). Το πρώτο στάδιο της ανοσολογικής απόκρισης παρατηρείται στην περιφέρεια, όταν ένα μυελινικό αντιγόνο εκφραστεί στην επιφάνεια ενός αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου και κατόπιν αναγνωριστεί από τα T βοηθητικά κύτταρα. Τα βοηθητικά Τ κύτταρα όταν ενεργοποιηθούν, εκκρίνουν κυτταροκίνες, όπως ιντερφερόνες και ιντερλευκίνες με αποτέλεσμα την ενίσχυση της ανοσολογικής απόκρισης. Οι παραγόμενες κυτταροκίνες, όπως η IFN-γ, προκαλούν, μέσω ενός μηχανισμού υπερέκφρασης ορισμένων μορίων, τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα να διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ) και να εισέρχονται στο ΚΝΣ. Αφού εισέλθουν στο ΚΝΣ τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα συνεχίζουν την έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών, οι οποίες δρουν στα γλοία κύτταρα που περιγράφτηκαν προηγουμένως και τα μετατρέπουν σε αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα που εκφράζουν στην επιφάνειά τους μυελινικά αντιγόνα. Ταυτόχρονα, άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως Β κύτταρα και μακροφάγα, επίσης εισέρχονται στο ΚΝΣ μέσω του ΑΕΦ, με αποτέλεσμα την επιπλέον ενίσχυση της ανοσολογικής απόκρισης έναντι της μυελίνης (Miller et al. 2002). Τα Β κύτταρα παράγουν αντισώματα που επιτίθενται στη μυελίνη, ενώ παράλληλα τα μακροφάγα επιτίθενται στη μυελίνη με φαγοκυττάρωση ή με την έκκριση TNFα και άλλων φλεγμονωδών κυτταροκινών. Με τη σειρά του το συμπλήρωμα επιτίθεται και αυτό στη μυελίνη (Σχήμα 5). Αποτέλεσμα αυτού είναι η κλιμακούμενη απομυελίνωση και η δημιουργία φλεγμονών στους νευρώνες, με τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή της μυελίνης, την κακή μεταφορά των νευρικών ώσεων και τελικώς την εμφάνιση παθοφυσιολογικών συμπτωμάτων. 9

30 Εισαγωγή Σχήμα 5: Αυτοανοσία και απομυελίνωση στη ΣΚΠ. (Προσαρμοσμένο από Σύμφωνα με την ιογενή θεωρία, τα T κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη ΣΚΠ διεγείρονται από μικρόβια, βακτήρια ή ιούς μέσα από το σχηματισμό του τριμοριακού συμπλόκου. Δομικές ομοιότητες μεταξύ επιτόπων πρωτεϊνών των παθογόνων μικροοργανισμών και αυτοαντιγόνων, μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται μοριακή μίμηση. Ένα παράδειγμα αποτελεί η ομολογία του επιτόπου της πρωτεΐνης MBP όπου εμφανίζονται αλληλουχίες τεσσάρων με έξι αμινοξέων όμοιες με τμήματα των πρωτεϊνών που βρίσκονται στον ιό της ιλαράς, της ηπατίτιδας Β, στον ιό της γρίπης, στον αδενοϊό (adenovirus), στον ιό Epstein_Barr, στον ιό του έρπητα 6 (HHV-6) και στον ιό papilloma (HPV) (Wucherpfennig and Strominger 1995; Soldan et al 1997). Αυτό σημαίνει ότι μια ανοσολογική απόκριση από έναν μικρόβιο ή ιό μπορεί να επαρκεί για την εκκίνηση της ασθένειας ή υποτροπής σε ασθενή (Gautam et al., 1992). 10

31 Εισαγωγή Υπάρχουσες Θεραπείες Μέχρι και σήμερα δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για την καταπολέμηση της ΣΚΠ, υπάρχουν όμως θεραπευτικά σχήματα που έχουν ως στόχο την ανάρρωση ασθενών μετά από κάποια υποτροπή, την πρόληψη των υποτροπών και την πρόληψη εμφάνισης αναπηρίας. Δυστυχώς η αναποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών καθώς και οι παρενέργειες σε συνδυασμό με τους περιορισμούς στη χρήση φαρμάκων σε ομάδες και η πιθανή εμφάνιση ανοσογονικότητας σε ορισμένους ασθενείς, αποτελούν εμπόδιο για ιδανική θεραπεία αν λάβουμε υπόψη και τη συμμόρφωση του ασθενούς με τη θεραπεία (Minagar 2013). Οι κυριότερες θεραπευτικές αγωγές που χρησιμοποιούνται σήμερα είναι έξι και είναι αυτές που ακολουθούν. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι ιντερφερόνες. Υπάρχουν δύο τύποι, ο τύπος I όπου υπάγονται οι ιντερφερόνες α και β (IFN-α, IFN-β) και ο τύπος II όπου ανήκει η ιντερφερόνη γ. Η IFN-β είναι αυτή που χρησιμοποιείται στη ΣΚΠ και εμφανίζει μείωση στον αριθμό των υποτροπών και στην επιδείνωση της αναπηρίας. Κάποια από τα φάρμακα που κυκλοφορούν στην αγορά είναι η IFN-β-1a (Avonex και Rebif) και IFN-β-1b (Betaferon), (Kappos et al., 2006). Στη δεύτερη κατηγορία ανήκει το glatiramer acetate (Copaxone). Πρόκειται για οξικό άλας μίγματος συνθετικών πολυπεπτιδίων που περιέχει τα αμινοξέα L-Ala, L-Glu, L-Lys, και L-Tyr (Neuhaus et al., 2007). Παρουσιάζει μείωση στον αριθμό των υποτροπών και καθυστέρηση στην εξέλιξη της ασθένειας. Δρα ως ανταγωνιστής του επιτόπου της MBP για τον υποδοχέα των Τ-κυττάρων (Weber et al., 2007). Μία ακόμα περίπτωση αποτελεί το μονοκλωνικό αντίσωμα Natalizumab (Tysabri). Ο μηχανισμός δράσης του είναι μέσω της δέσμευσης στο μόριο προσκόλλησης α 4 -ιντεγκρίνη που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων και άλλων λεμφοκυττάρων. Αναστέλλει τη μετανάστευσή τους στα σημεία φλεγμονής μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Ενδείκνυται σε ασθενείς που η θεραπεία με ιντερφερόνες είναι ανεπαρκής και οι ασθενείς συνεχίζουν να παρουσιάζουν συχνές υποτροπές ή/και ταχεία εξέλιξη της νόσου (Polman et al., 2006). 11

32 Εισαγωγή Στην τέταρτη κατηγορία φαρμάκων είναι η μιτοξανδρόνη (Νovantrone, Mitoxan). Αποτελεί ανοσοκατασταλτικό που χρησιμοποιείται σε χημειοθεραπείες για την αντιμετώπιση του καρκίνου και τα τελευταία χρόνια έχει εγκριθεί για χορήγηση στη ΣΚΠ. Έχει την ικανότητα να επιβραδύνει την εξέλιξη της νευρολογικής ανικανότητας και να μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης υποτροπών. Η χρήση του φαρμάκου περιορίζεται σε ασθενείς με ταχέως εξελισσόμενη μορφή της νόσου που δεν ανταποκρίνεται σε άλλες θεραπείες, καθώς χαρακτηρίζεται από καρδιοτοξικότητα (Zipoli et al., 2007). Η Φινγκολιμόδη (Gilenya) αποτελεί ανοσορυθμιστικό φάρμακο με φυσική προέλευση από τον μύκητα Isaria Sinclair. Η δράση του έγκειται στην απομόνωση των λεμφοκυττάρων στους λεμφαδένες εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την είσοδο τους στο ΚΝΣ (Pelletier et al., 2012). Στην τελευταία κατηγορία ανήκει ο φουμαρικός διμεθυλεστέρας (Tecfidera): Παρουσιάζει αντιφλεγμονώδη και νευροπροστατευτική δράση. Ο ακριβής μηχανισμός δράσης της θεραπείας δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστός, έχει αποδειχτεί όμως ότι μειώνει τις υποτροπές και καθυστερεί την εξέλιξη της αναπηρίας εμφανίζοντας καλή εικόνα ασφάλειας και ανοχής (Hutcinson et al. 2013). 12

33 Εισαγωγή Ανθρακινόνη Η ανθρακινόνη είναι ένας αρωματικός πολυκυκλικός υδρογονάνθρακας με μοριακό τύπο C 14 H 8 O 2. Υπάρχουν διάφορα ισομερή, με το πιο σημαντικό παράγωγο κινόνης του ανθρακενίου την 9,10-ανθρακινόνη (IUPAC: 9,10-διοξο ανθρακένιο) που αποτελεί μητρική ένωση μιας μεγάλης κατηγορίας βαφών και χρωστικών. Τα τελευταία χρόνια παράγωγα ανθρακινόνης έχουν χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία του καρκίνου με τη μιτοξανδρόνη να είναι μία από αυτές (Holmes et al., 1984). Χρησιμοποιείται κλινικά μόνη της αλλά και σε συνδυασμό με άλλες χημειοθεραπευτικές ουσίες για τη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου κυρίως σε κακοήθη όγκο του πνεύμονα, λευχαιμία, μελάνωμα, καρκίνο του μαστού και στη νόσο του Hodgkin. Τα τελευταία χρόνια η μιτοξανδρόνη χορηγείται στη ΣΚΠ αποτελώντας θεραπεία πρώτης γραμμής αλλά και θεραπεία δεύτερης γραμμής καθυστερώντας την εξέλιξη της νόσου και αυξάνοντας το διάστημα μεταξύ των υποτροπών (Fox 2006). Η δράση της είναι ανοσοκατασταλτική, πιο συγκεκριμένα, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων, των Τ και B κυττάρων και μειώνει την έκκριση κυτταροκινών όπως της IFN-γ και IL-10 (Morrisey et al., 2005). Η ανακάλυψη της αντικαρκινικής δράσης των αναλόγων των ανθρακεν-9, 10-διονών, όπως η αμετανδρόνη και η μιτοξανδρόνη, έχει οδηγήσει σε περεταίρω φαρμακολογικές μελέτες για κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους, ο οποίος εμπλέκεται στη σύνθεση και επιδιόρθωση του DNA σε καρκινικά αλλά και σε υγιή κύτταρα. Ο δακτύλιος της ανθρακινόνης στη δομή της μιτοξανδρόνης, παρεμβάλλεται μεταξύ των ζευγών βάσεων του DNA και οι αζωτούχες πλευρικές αλυσίδες προσδένονται μη δεσμικά στις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA (Krishnamoorthy et al., 1986). Αυτή η δέσμευση της μιτοξανδρόνης στο DNA προκαλεί τη συμπύκνωσή του, εμποδίζοντας την αντιγραφή του, καθώς και την μεταγραφή του RNA (Nishio and Uyeki, 1983). Επιπλέον η μιτοξανδρόνη είναι αναστολέας της τοποϊσομεράσης II, ένζυμο υπεύθυνο για την εκτύλιξη και την επιδιόρθωση του κατεστραμμένου DNA και αυτό οδηγεί σε μονά και διπλά σπασίματα κλώνου (Capranico et al., 1993). Η μιτοξανδρόνη και η αμετανδρόνη έχουν παρόμοια δομή (Σχήμα. 6), ωστόσο η πρώτη εμφανίζει δεκαπλάσια δραστικότητα συγκριτικά με την αμετανδρόνη. 13

34 Εισαγωγή Σχήμα 6: R=H, Αμετανδρόνη R=OH, Μιτοξανδρόνη Σχέση δομής-δραστικότητας παραγώγων ανθρακινόνης Ανάλυση αποτελεσμάτων από διάφορα ανάλογα οδήγησε σε κάποια συμπεράσματα σχετικά με το ρόλο που διαδραματίζουν κάποια δομικά χαρακτηριστικά του μορίου στη δράση του (Murdock et al. 1979, Johnson et al. 1979): 1. Οι υδροξυλομάδες στις θέσεις 1 και 4 του δακτυλίου ενισχύουν τη δράση του ενώ υδροξυλίωση στις θέσεις 1 και 2 έχει μικρή επίδραση. 2. Η παρουσία των δύο πλευρικών αλυσίδων με βασικό χαρακτήρα, δε φαίνεται να είναι ουσιαστική για τη δράση του μορίου. Μερικά παράγωγα με μία αλυσίδα αντί δύο, με ένα υδρογόνο ή μία αμινομάδα στη θλεση της πλευρικής αλυσίδας διατηρούν σημαντική δραστικότητα. 3. Ουσίες με πλευρικές αλυσίδες βασικού χαρακτήρα στις θέσεις 5 και 1 αντί των θέσεων 5 και 8, είναι ανενεργές. 4. Τα άζωτα στις θέσεις 5 και 8 δεν μπορούν να αντικατασταθούν από άτομα οξυγόνου. 5. Το τελικό άτομο αζώτου των πλευρικών αλυσίδων είναι μεγάλης σημασίας και δεν μπορεί να αντικατασταθεί από θείο, οξυγόνο ή μεθυλενομάδα. 6. Η απόσταση μεταξύ των δύο ατόμων αζώτου της πλευρικής αλυσίδας είναι σημαντική καθώς, μειώνοντας ή αυξάνοντας τον αριθμόν των μεθυλενομάδων, επηρεάζεται η δραστικότητα. 14

35 Εισαγωγή 7. Το τελικό άτομο αζώτου πρέπει να είναι πλήρως βασικό. Πυριδυλ-, Ν-αρυλ, Ν-ακυλ- παράγωγα είναι αδρανή. 8. Στερεοχημική παρεμπόδιση του τελικού αζώτου από την αύξηση του μεγέθους της πλευρικής αλυσίδας μειώνει ή εκμηδενίζει τη δράση. 9. Πυρηνόφιλη υποκατάσταση με 3-μεθυλ. 3-καρβοξυλο ή 2,3-διχλωρο ομάδες δίνει αδρανείς ουσίες. 10. Τα 6,7-διϋδρο παράγωγα έχουν συγκρίσιμη δράση με τα αντίστοιχα αρωματικά παράγωγα, αλλά είναι λιγότερο αποτελεσματικά. Φαίνεται ότι αυτές οι ουσίες in vivo μερικώς οξειδώνονται. 11. Παρόλο που φαίνεται ότι η πιο αποτελεσματική επιλογή για αντικαρκινική δράση είναι η NH(CH 2 )NH(CH 2 ) 2 -OH ως πλευρική αλυσίδα, έχει βρεθεί ότι η σύνδεσή της σε άλλα αρωματικά συστήματα δεν έχει οδηγήσει σε δραστικές ουσίες. 15

36 Εισαγωγή 1.2 Πεπτιδική Σύνθεση Εισαγωγή Τα αμινοξέα είναι τα βασικά δομικά μόρια των πρωτεϊνών. Ένα α-αμινοξύ αποτελείται από μία αμινομάδα, μία καρβοξυλομάδα, ένα άτομο υδρογόνου και μία πλετρική ομάδα R δεσμευμένη στο άτομο του α-άνθρακα (Σχήμα 7). Σχήμα 7: Δομή α-αμινοξέος Οι πρωτεΐνες είναι μία από τις πιο σημαντικές κατηγορίες μακρομορίων και η παρουσία τους είναι πολύ σημαντική για την ύπαρξη κάθε μορφής ζωής. Με τον όρο πεπτίδιο χαρακτηρίζεται ένα μόριο όταν αυτό απαρτίζεται από λιγότερα από 50 αμινοξέα ενώ ως πρωτεΐνη χαρακτηρίζεται ένα μόριο με σύσταση περισσοτέρων των 50 αμινοξέων. Τα α-αμινοξέα που συναντώνται στις φυσικές πρωτεΐνες είναι είκοσι και όλα με L-στερεοχημική διάταξη. Οι πρωτεΐνες συμμετέχουν σε μια μεγάλη ποικιλία βιοχημικών λειτουργιών ως ένζυμα, ορμόνες, υποδοχείς κα. Το ενδιαφέρον για τη σύνθεση των πρωτεϊνών σε ερευνητικό επίπεδο έχει οδήγησε στην ανάπτυξη ενός μεγάλου κλάδου που ονομάζεται πεπτιδική χημεία. Τα συνθετικά πεπτίδια βρίσκουν σήμερα εφαρμογή στη ρύθμιση της αναπαραγωγής και της ανάπτυξης, στην αντιμετώπιση ασθενειών όπως του καρκίνου και των αυτοάνοσων νοσημάτων, στη θεραπευτική αντιμετώπιση καρδιαγγειακών παθήσεων, ανωμαλιών του πεπτικού συστήματος αλλά και ως αντιβιοτικά έναντι παθογόνων βακτηρίων. 16

37 Εισαγωγή Πεπτιδικός Δεσμός Ο πεπτιδικός δεσμός προκύπτει από την αντίδραση μεταξύ της α-αμινομάδας και της α-καρβοξυλομάδας δύο αμινοξέων (Σχήμα 8). Η αρίθμηση της (πολυ)πεπτιδικής αλυσίδας ξεκινάει από το τελικό άκρο που φέρει την αμινομάδα του πεπτιδίου ή της πρωτεΐνης. Ο πεπτιδικός δεσμός είναι μια άκαμπτη και επίπεδη περιοχή του μορίου. Το υδρογόνο της αμινομάδας είναι συνήθως trans ως προς το οξυγόνο του καρβονυλίου, καθώς η cis δομή είναι λιγότερη σταθερή λόγω στερεοχημικών παρεμποδίσεων. Σχήμα 8: Πεπτιδικός δεσμός Η αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού δεν πραγματοποιείται αυθόρμητα αλλά απαιτεί υψηλή θερμοκρασία. Για να πραγματοποιηθεί η σύνθεση του πεπτιδίου προβαίνουμε στην ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος, ώστε να έχουμε πυρηνόφιλη προσβολή της από την αμινομάδα του αμινοσυστατικού, με αποτέλεσμα να διεξάγεται επιτυχώς η αντίδραση, διατηρώντας έτσι ήπιες θερμοκρασίες αντίδρασης. 17

38 Εισαγωγή Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης Σύνθεση σε υγρή φάση (Liquid Phase Synthesis) Η σύνθεση του πεπτιδίου γίνεται εξ ολοκλήρου σε διάλυμα. Μετά από κάθε βήμα απαιτείται απομόνωση των ενδιάμεσων προϊόντων, καθαρισμός και ταυτοποίηση, καθιστώντας την τεχνική αυτή χαμηλή σε απόδοση. Η τεχνική αυτή είναι πολύ χρονοβόρα και επίπονη, ειδικά όταν πρόκειται για μεγάλου μήκους πεπτίδια. Επιπλέον ενδέχεται να εμφανιστούν προβλήματα διαλυτότητας των ενδιαμέσων προϊόντων Σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) Σε αυτή τη συνθετική πορεία, η αμινομάδα ή η καρβοξυλομάδα του πρώτου αμινοξέος της πεπτιδικής αλυσίδας συνδέεται ομοιοπολικά με ένα στερεό πολυμερές υπόστρωμα. Η επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας επιτυγχάνεται με επαναλαμβανόμενες διαδικασίες επιλεκτικής απομάκρυνσης της προστατευτικής ομάδας και σύζευξης (Σχήμα 9). Η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού δεν είναι αυθόρμητη αντίδραση σε φυσιολογικές συνθήκες θερμοκρασίας όπως αναφέρθηκε πριν με αποτέλεσμα να απαιτείται η ενεργοποίηση της ελεύθερης καρβοξυλομάδας ώστε να γίνει η σύζευξη με την ελεύθερη αμινομάδα. Όλες οι υπόλοιπες δραστικές ομάδες των αμινοξέων πρέπει να είναι προστατευμένες, ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός ανεπιθύμητων παραπροϊόντων. Οι πλύσεις του πολυμερούς, με τους κατάλληλους διαλύτες, σε κάθε κύκλο σύζευξης είναι απαραίτητες ώστε να απομακρύνονται οι περίσσειες των αντιδραστηρίων και τα πιθανά παραπροϊόντα. Όταν ολοκληρωθεί η πεπτιδική σύνθεση, το πεπτίδιο απομακρύνεται από τη ρητίνη και ακολουθεί απομάκρυνση των πλάγιων προστατευτικών ομάδων. Τέλος καθαρίζεται και ταυτοποιείται. Η σύνθεση σε στερεά φάση περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1963 από τον Robert Bruce Merfield. 18

39 Εισαγωγή Σχήμα 9: Αρχή πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση. Η επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας πραγματοποιείται από το C προς το Ν τελικό άκρο. (Προσαρμοσμένο από Molecular Biomethods Handbook, M. Cudic & G.B. Fields, 2008) 19

40 Εισαγωγή Μέθοδοι σύνθεσης σε στερεή φάση Στη μέθοδο προστασίας της αμινομάδας των αμινοξέων συναντάμε συγκεκριμένο τύπο πλάγιων προστατευτικών ομάδων και συγκεκριμένο τύπο ρητινών. Οι πιο χαρακτηριστικοί τύποι Ν α -προστατευτικών ομάδων είναι δύο. Η Boc/Bzl μέθοδος, που περιλαμβάνει την όξινη απομάκρυνση της Boc Ν α -προστατευτικής ομάδας, και η Fmoc/tBu μέθοδος που περιλαμβάνει τη βασική απομάκρυνση της Ν α - προστατευτικής ομάδας Boc/Bzl μέθοδος Χαρακτηρίζεται και ως μέθοδος Merrifield. Ως προσωρινή Ν α -προστατευτική ομάδα χρησιμοποιείται η tert-βουτυλοξυ-καρβονυλομάδα (Boc) η οποία απομακρύνεται με τη χρήση τριφθοροξικού οξέος (TFA). Σαν πλάγιες προστατευτικές ομάδες σε αυτή τη μέθοδο χρησιμοποιούνται βενζυλ-τύπου ομάδες, όπως η βενζυλ-ομάδα (Bzl), οι οποίες απομακρύνονται ταυτόχρονα με την απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη με υδροφθόριο (HF) ή με τριφθορομεθανοθειώδες οξύ (TFMSA). Αν και αυτή η μέθοδος παρουσιάζει πλεονεκτήματα, τα βασικά της μειονεκτήματα έχουν σχέση με τη χρήση του πολύ ισχυρού, τοξικού και επικίνδυνου HF. Σχήμα 10: Boc/Bzl μεθοδολογία. (Προσαρμοσμένο από Molecular Biomethods Handbook, M. Cudic & G.B. Fields, 2008) 20

41 Εισαγωγή Fmoc/tBu μέθοδος Ως προσωρινή Ν α -προστατευτική ομάδα χρησιμοποιείται η 9-φλουρενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc) η οποία απομακρύνεται με διάλυμα % πιπεριδίνης (βασικές συνθήκες) σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF). Αντίθετα με την Boc/Bzl μέθοδο, η Fmoc/tBu μέθοδος σε συνδυασμό με τη χρήση κατάλληλου τύπου ρητίνης παρέχει τη δυνατότητα σύνθεσης προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω για κυκλοποίηση ή συμπύκνωση πεπτιδικών τμημάτων (fragment condensation). Σχήμα 11: Fmoc/tBu μεθοδολογία. (Προσαρμοσμένο από Molecular Biomethods Handbook, M. Cudic & G.B. Fields, 2008) 21

42 Εισαγωγή Σύνθεση σε στερεή φάση με την Fmoc/tBu μεθοδολογία Το αδιάλυτο στερεό υπόστρωμα Το πολυμερές υπόστρωμα που χρησιμοποιείται κατέχει σημαντικό ρόλο στην επιτυχία της μεθόδου σύζευξης σε στερεή φάση. Τα βασικότερα κριτήρια καταλληλότητας του υποστρώματος είναι πρώτον η μηχανική αντοχή, η καλή διόγκωση του σε διαλύτες που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση και τέλος η εύκολη πρόσβαση στα ενεργά κέντρα του πολυμερούς από τα αντιδραστήρια. Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση χαρακτηρίζονται καλύτερα ως πηκτώματα που διογκώνονται και αποδιογκώνονται σε μεγάλο βαθμό με διάφορους διαλύτες και όχι ως στερεά. Σε ένα καλά διογκωμένο πολυμερές τα αντιδραστήρια διαχέονται απροβλημάτιστα στο εσωτερικό των πόρων του, εξασφαλίζοντας την πρόοδο των αντιδράσεων με μεγάλη ταχύτητα. Το πολυμερές που χρησιμοποιείται ευρύτατα στην πεπτιδική σύνθεση είναι ένα συμπολυμερές πολυστυρολίου και διβινυλοβενζολίου (PS-DVB). Το ποσοστό του διβινυλοβενζολίου (DVB) για την επίτευξη μέγιστης δράσης είναι 1 %. Πολυμερή με μικρότερο ποσοστό DVB δεν έχουν καλή μηχανική σταθερότητα ενώ αυτά με μεγαλύτερο ποσοστό εμφανίζουν αυξημένη σκληρότητα και δε διογκώνονται σε ικανοποιητικό βαθμό με τους διαλύτες που χρησιμοποιούνται στη σύνθεση σε στερεή φάση. Η χαρακτηριστική ομάδα του κάθε υποστρώματος είναι αυτή που το διαφοροποιεί από όλες τις υπόλοιπες ρητίνες. Είναι μια δραστική ομάδα, ομοιοπολικά συνδεδεμένη με το πολυμερές υπόστρωμα που, με τις κατάλληλες αντιδράσεις, μπορεί να συνδεθεί με την πολική καρβοξυλομάδα του προς σύνθεση πεπτιδίου. 22

43 Εισαγωγή Πίνακας 1: Μερικές από τις σημαντικότερες ρητίνες που χρησιμοποιούνται στην Fmoc/tBu πεπτιδική σύνθεση. Ρητίνη Συνθήκες απόσπασης Βιβλιογραφία 90-95% v/v TFA, 1-2h Wang et al., % TFA σε DCM, 5-10 min Mergler et al., 1988 AcOH/TFE/DCM (1:1:8), min 1-5% TFA σε DCM, 1min Barlos et al., 1989a, 1989b, % HFIP σε DCM 3-5 min Bollhagen et al., % v/v TFA, 1h Terracciano et al.,

44 Εισαγωγή Η πιο σημαντική από τις παραπάνω ρητίνες είναι η 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη (CLTR-Cl). Είναι ιδανική για τη σύνθεση ελεύθερων και προστατευμένων πεπτιδίων παρέχοντας υψηλή απόδοση και καθαρότητα στα τελικά προϊόντα που λαμβάνουμε. Η εστεροποίηση πραγματοποιείται με κατευθείαν αντίδραση του Ν α -Fmoc προστατευμένου αμινοξέος πάνω στο πολυμερές παρουσία DIPEA (Σχήμα 12) (Barlos et al., 1989a, 1989b). Το ποσοστό υποκατάστασης του πολυμερούς εξαρτάται από την ποσότητα του αντιδρώντος αμινοξέος και πρέπει να είναι ανάλογο του μεγέθους του συντιθέμενου πεπτιδίου. Για τη σύνθεση μικρών πεπτιδίων (<15 αμινοξέα), επιλέγονται μεγάλες υποκαταστάσεις (>0,5 mmol/g), ενώ στη σύνθεση μεγάλων πεπτιδίων (>15 αμινοξέα) επιλέγονται μικρές υποκαταστάσεις (<0,5 mmol/g), διότι όσο αυξάνεται το μήκος της πεπτιδικής αλυσίδας αυξάνεται και η στερεοχημική παρεμπόδιση των συνθετικών διεργασιών. Σχήμα 12: Αντίδραση εστεροποίησης Ν α -Fmoc αμινοξέων στη 2-χλωροτριτυλoχλωρίδιορητίνη (CLTR-Cl) 24

45 Εισαγωγή Προστατευτικές ομάδες αμινοξέων στη σύνθεση σε στερεή φάση Για τον πλήρη έλεγχο της αντίδρασης δυο αμινοξέων ή πεπτιδικών τμημάτων κατά το σχηματισμό ενός επιθυμητού πεπτιδίου, απαιτείται η χρήση πλάγιων προστατευτικών ομάδων για την αποφυγή δημιουργίας παραπροϊόντων μέσω της συμμετοχής των διαφόρων δραστικών ομάδων στις αντιδράσεις σύνθεσης. Η επιλογή των κατάλληλων προστατευτικών ομάδων και των συνθηκών προστασίας και αποπροστασίας των αμινοξέων ή των πεπτιδίων είναι πολύ σημαντική στην πεπτιδική σύνθεση. Για το λόγο αυτό οι προστατευτικές ομάδες διαχωρίζονται σε αμινοπροστατευτικές (Ν α - προστατευτικές), καρβοξυπροστατευτικές και προστατευτικές των πλευρικών δραστικών ομάδων των αμινοξέων. Οι προϋποθέσεις που πρέπει να καλύπτουν οι προστατευτικές ομάδες των αμινοξέων είναι να εισάγονται εύκολα και να είναι σταθερές στις συνθήκες της πεπτιδικής σύνθεσης. Επιπλέον πρέπει να εμποδίζουν τη ρακεμίωση στο χειρόμορφο κέντρο και να καθιστούν το αμινοξύ διαλυτό σε οργανικούς διαλύτες που χρησιμοποιούνται στις συζεύξεις. Να μην εμποδίζουν (τουλάχιστον σημαντικά) την ποιοτική ανάλυση της συνθετικής προόδου, μέχρι να απομακρυνθούν και ταυτόχρονα να απομακρύνονται εύκολα, γρήγορα και ποσοτικά κάτω από ήπιες συνθήκες στο τέλος ή σε ενδιάμεσα στάδια της σύνθεσης. Τέλος πρέπει να έχουν χαμηλό κόστος. 25

46 Εισαγωγή Ν α -προστατευτικές ομάδες Οι Ν α -προστατευτικές ομάδες πρέπει να μειώνουν τον πυρηνόφιλο χαρακτήρα του αζώτου της αμινομάδας, ώστε να μην αντιδράσει με ενεργοποιημένα καρβοξυπαράγωγα. Οπότε οι Ν α -προστατευτικές ομάδες ελαττώνουν την ηλεκτρονική πυκνότητα του αζώτου μέσω μεσομέρειας (ουρεθανικού τύπου ομάδες) ή μέσω επαγωγικού φαινομένου (ο-νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα) ή μειώνουν τη δραστικότητα της αμινομάδας μέσω στερεοχημικής παρεμπόδισης (τριφαινυλμεθυλομάδα). Οι πιο σημαντικές και ευρύτερα χρησιμοποιούμενες είναι οι ουρεθανικού τύπου ομάδες. Παρέχουν εύκολη εισαγωγή, καλή προστασία της αμινομάδας, εύκολη απομάκρυνση και επαρκή προστασία του χειρόμορφου κέντρου του αμινοξέος από ρακεμίωση (Σχήμα 13). Σχήμα 13: Αμινοπροστατευτικές ομάδες (Α) ουροθενικού τύπου, (Β) ο- νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα, (Γ) Τριτυλ-τύπου 26

47 Τριτυλ Ουροθενικού Εισαγωγή Πίνακας 2: Ν α -προστατευτικές ομάδες και συνθήκες απομάκρυνσής τους. Ν α προστατευτική ομάδα Τύπος Συνθήκες Απομάκρυνσης 9-φλουρενυλ-μεθοξυκαρβονυλ-(Fmoc) Δευτεροταγείς αμίνες ή αλκάλια (π.χ. πιπεριδίνη σε DMF) H CH 2 O C O Tριτoταγής βουτυλοξυκαρβονυλ- (Boc) CH 3 CH 3 C O CH 3 O C Τριφαινυλμεθυλ- / τριτυλ- (Trt) ΤFA, HCl / AcOH H 2 /Pd, ΤFA, AcOH C 9-φλουρενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc) Η Fmoc-ομάδα εισάγεται στο αμινοξύ με επίδραση Fmoc-Cl ή Fmoc-ΟSu σε μίγμα αλκαλικού διαλύματος/διοξάνης (Carpino and Han, 1970, 1972, Paquet, 1982) (Σχήμα 14). Επίσης έχει χρησιμοποιηθεί και η σιλυλ-μέθοδος (Bolin et al., 1989) κατά την οποία αρχικά σχηματίζεται ο σιλυλεστέρας του αμινοξέος, που στη συνέχεια αντιδρά με Fmoc-Cl σε DCM παρουσία DIPEA και τελική υδρόλυση του σιλυλεστέρα προς το Fmoc- αμινοξύ. 27

48 Εισαγωγή R Fmoc-OSu + NH 2 CH C O OH 10% Na 2 CO 3 /διοξάνη SuOH Fmoc NH R CH C O OH Σχήμα 14: Εισαγωγή της Fmoc-ομάδας με χρήση Fmoc-ΟSu. Η απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας γίνεται σε βασικές συνθήκες με β- απόσπαση. Συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα 20-50% πιπεριδίνης (δευτεροταγής αμίνη) σε DMF. + H N + _ H-O- C-NHR O _ H CH 2 O C NHR O H _ N CH 2 Πιπεριδίνη CO 2 + H 2 N-R H CH 2 N Σχήμα 15: Μηχανισμός διάσπασης της Fmoc ομάδας με πιπεριδίνη. Τα πλεονεκτήματα της Fmoc-ομάδας σε σύγκριση με άλλες ομάδες ουρεθανικού τύπου είναι πρώτον, ότι μπορεί να συνδυαστεί με πλάγιες προστατευτικές ομάδες που απομακρύνονται σε όξινες συνθήκες (Ζ-, Boc-, tbu-) οπότε αυτή παραμένει στο μόριο εάν πραγματοποιηθεί απομάκρυνση της πλάγιας προστατευτικής ομάδας και δεύτερον ότι τα χημικά είδη που παράγονται κατά την απομάκρυνσή της δεν προκαλούν παράπλευρες αντιδράσεις. Τριτοταγής βουτυλοξυκαρβουνυλομάδα (Boc) Η εισαγωγή της Boc-ομάδας στο αμινοξύ γίνεται εύκολα κυρίως με τριτοταγή βουτυλοξυκαρβονυλ-ανυδρίτη (Boc 2 O), το οποίο είναι ασφαλές αντιδραστήριο και δίνει καλές αποδόσεις. Η απομάκρυνσή της γίνεται σε ήπια όξινες συνθήκες. Για την απομάκρυνσή της χρησιμοποιούνται συνήθως διάλυμα TFA σε διχλωρομεθάνιο (DCM) ή HCl σε οξικό οξύ (AcOH). 28

49 Εισαγωγή Η Fmoc-ομάδα όπως και η Boc-ομάδα συνδυάζουν την εύκολη εισαγωγή, επαρκή προστασία της αμινομάδας, εύκολη απομάκρυνση και καλή προστασία του χειρόμορφου κέντρου του αμινοξέος από ρακεμίωση. Το πλεονέκτημα της Bocομάδας είναι ότι συνδυάζεται με Bzl-τύπου πλάγιες προστατευτικές ομάδες λόγω της σταθερότητας της σε συνθήκες καταλυτικής υδρογόνωσης. Σημαντικό μειονέκτημα της όμως είναι ότι κατά την απομάκρυνση της με οξέα τα σχηματιζόμενα τριτοταγή βουτυλοκατιόντα καθώς και ο τριτοταγής βουτυλεστέρας μπορεί να προσβάλλουν τα πυρηνόφιλα κέντρα του πεπτιδίου, όπως είναι οι δραστικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων Trp, Tyr, Met. Αντίθετα η Fmoc-ομάδα μπορεί να συνδυαστεί με πλάγιες προστατευτικές ομάδες που απομακρύνονται σε όξινες συνθήκες (Ζ-, Boc- και tbu-) ενώ τα χημικά είδη που παράγονται κατά την απομάκρυνσης της δεν δίνουν παράπλευρες αντιδράσεις. Tριφαινυλμεθυλομάδα (Trt) Η τριφαινυλμεθυλομάδα ή τριτυλομάδα (Trt) είναι η πιο σημαντική τριφαινυλομεθυλο-τύπου προστατευτική ομάδα. Έχει τα πλεονεκτήματα ότι εισάγεται εύκολα, απομακρύνεται εκλεκτικά παρουσία αλλών προστατευτικών ομάδων και τέλος τα Ν α -Trt-αμινοξέα παρασκευάζονται εύκολα με την σιλυλ-μέθοδο. Η Trt ομάδα ασκεί σημαντική στερεοχημική παρεμπόδιση επειδή είναι ογκώδης μειώνοντας σημαντικά τον κίνδυνο ρακεμίωσης των γειτονικών της χειρόμορφων κέντρων. Η απομάκρυνση της τριτυλομάδας γίνεται με χρήση διαλύματος ασθενούς οξέος όπως 1% TFA σε DCM ή 80% υδατικό AcOH παρέχοντας το πλεονέκτημα οτι μπορεί να συνδυαστεί με πλάγιες προστατευτικές ομάδες που απομακρύνονται σε βασικές ή σε ισχυρά όξινες συνθήκες. 29

50 Εισαγωγή Καρβοξυπροστατευτικές ομάδες Οι καρβοξυλομάδες των αμινοξέων μπορεί να είναι λιγότερο δραστικά πυρηνόφιλα από τις αμινομάδες τους αλλά η προστασία τους όταν δε συμμετέχουν στον πεπτιδικό δεσμό είναι απαραίτητη για την αύξησης της διαλυτότητας, για ευκολότερη απομόνωση των προϊόντων και ελαχιστοποίηση της ρακεμίωσης. Η προστασία των καρβοξυλομάδων γίνεται με τη μετατροπή τους σε εστέρες. Πίνακας 3: Καρβοξυπροστατευτικές ομάδες και συνθήκες απομάκρυνσής τους. Καρβοξυ-προστατευτική ομάδα Συνθήκες απομάκρυνσης Τριτυλ-βουτυλ-(tBu) TFA, ισχυρά οξέα CH 3 CH 3 C CH 3 Βενζυλ-(Bzl) CH 2 H 2 /Pd, HBr/AcOH, HF Διφαινυλμεθυλ-(Dpm) H 2 /Pd, TFA 30

51 Εισαγωγή Οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες Η προστασία των πλάγιων δραστικών ομάδων των αμινοξέων είναι απαραίτητη για την αποφυγή παράπλευρων αντιδράσεων κατά τη σύνθεση του πεπτιδίου. Προστασία της ε-αμινομάδας της Λυσίνης (Lys) Η προστασία της ε-αμινομάδας της Lys είναι απαραίτητη, για την αποφυγή παραγωγής διακλαδισμένων πεπτιδίων, μέσω αντίδρασης της με το ενεργοποιημένο καρβοξυπαράγωγο. Οι πλέον χρησιμοποιούμενες ομάδες για την πλευρική προστασία της Lys είναι η Boc- και η Mtt-. H απομάκρυνση της Μtt ομάδας γίνεται σε πολύ ήπια όξινες συνθήκες και μπορεί να συνδυαστεί με tbu-, Βοc-, Pbf-, Pmc- προστατευτικές ομάδες καθώς και να απομακρυνθεί εκλεκτικά σε σχέση με αυτές παρουσία τριαιθυλοσιλανίου (TES) για τη δέσμευση των τριτυλοκατιόντων. Πίνακας 4: Προστατευτικές ομάδες της ε-αμινομάδας της Lys. Προστατευτική ομάδα Lys tert-βουτυλοξυ-καρβονυλομάδα-(boc) Συνθήκες αποπροστασίας 90% v/v TFA, 30min CH 3 CH 3 C O O C CH 3 4-μεθυλ-τριτυλομάδα-(Mtt) 1% v/v TFA σε DCM, 30min AcOH-TFE-DCM (1:2:7), 1h 31

52 Εισαγωγή Προστασία της υδροξυλομάδας των Σερίνη (Ser), Θρεονίνη (Thr) και Τυροσίνη (Tyr) Η προστασία της υδροξυλομάδας είναι απαραίτητη για την αποφυγή αλκυλίωσης κατά την πεπτιδικής σύνθεση. Η προστασία τους επιτυγχάνεται με τη μετατροπή τους σε βενζυλ- ή τριτοταγείς βουτυλ-αιθέρες. Οι πλέον χρησιμοποιούμενες ομάδες είναι η tbu- και η Τrt- ομάδα. Για τη Tyr χρησιμοποιείται και η Clt. Πίνακας 5: Προστατευτικές ομάδες της υδροξυλομάδας των Ser, Thr, Tyr. Προστατευτική ομάδα Ser,Thr,Tyr tert-βουτυλομάδα-(tbu) Συνθήκες αποπροστασίας 90% v/v TFA, 30min τριτυλομάδα-(trt) (R 1 =H) 1-5% v/v TFA σε DCM, 2-5min 2-χλωροτριτυλομάδα-(Clt) (R 1 =Cl) 32

53 Εισαγωγή Προστασία της καρβοξυλομάδας του Ασπαραγινικού (Asp) και του Γλουταμινικού (Glu) Η προστασία της καρβοξυλομάδας είναι σημαντική για την αποφυγή παραγωγής διακλαδισμένων πεπτιδίων συνήθως μέσω εστεροποίησης. Η προστατευτική ομάδα που χρησιμοποιείται είναι η tert-βουτυλομάδα (tbu). Πίνακας 6: Προστατευτική ομάδα της καρβοξυλομάδας των Asp, Glu. Προστατευτική ομάδα Asp, Glu tert-βουτυλομάδα-(tbu) Συνθήκες αποπροστασίας 90% v/v TFA, 30min Προστασία του πλευρικού αμιδίου των Ασπαραγίνη (Asn) και Γλουταμίνη (Gln) Το αμίδιο της Asn και Gln συνήθως προστατεύεται με Trt- ομάδα για την αποφυγή παράπλευρων αντιδράσεων. Πίνακας 7: Προστατευτική ομάδα του αμιδίου της Asn και της Gln Προστατευτική ομάδα Asn, Gln τριτυλομάδα-(trt) Συνθήκες αποπροστασίας 90% v/v TFA, 30-60min 33

54 Εισαγωγή Προστασία του ιμιδαζολίου της Ιστιδίνης (His) Η προστασία του ιμιδαζολίου της His είναι απαραίτητη για την αποφυγή αλκυλίωσης από ενεργοποιημένα καρβοξυπαράγωγα. Επίσης, παρουσιάζει υψηλά ποσοστά ρακεμίωσης λόγω της ηλεκτραρνητικότητας του ιμιδαζολικού δακτυλίου και λόγω του πυρηνόφιλου χαρακτήρα του π-ατόμου του αζώτου. Για την προστασία του ιμιδαζολίο της His χρησιμοποιείται κυρίως η Trt- ομάδα, η οποία εντοπίζεται στο τ-άτομο αζώτου μειώνοντας επίσης τον πυρηνόφιλο χαρακτήρα του π-αζώτου με στερεοχημική παρεμπόδιση. Πίνακας 8: Προστατευτική ομάδα του ιμιδαζολίου της His. Προστατευτική ομάδα His τριτυλομάδα-(trt) Συνθήκες αποπροστασίας 50% v/v TFA σε DCM, 30min 34

55 Εισαγωγή Προστασία της γουανιδινομάδας της Αργινίνης (Arg) Η γουανιδινομάδα (λόγω ισχυρά βασικού και πυρηνόφιλου χαρακτήρα), μπορεί να ακυλιωθεί κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης. Επιπλέον, το Ν δ μπορεί να προσβάλλει την ενεργοποιημένη καρβοξυλομάδα σχηματίζοντας δ λακτάμη. Συνεπώς ιδανική θα ήταν η προστασία και των τριών ατόμων αζώτου της γουανιδινομάδας, συνήθως όμως προστατεύεται το ένα ή τα δύο άτομα. Ως προστατευτικές ομάδες χρησιμοποιούνται η Pbf ή η Pmc. Τα κατιόντα που δημιουργούνται κατά την απομάκρυνσή τους προσβάλουν τις δραστικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων Trp, Tyr και Met οπότε χρησιμοποιούνται στο διάλυμα αποπροστασίας scavengers που δεσμεύουν τα ηλεκτρόφιλα είδη που παράγονται. Πίνακας 9: Προστατευτικές ομάδες της γουανιδινομάδας της Arg. Προστατευτική ομάδα Arg 2,2,4,6,7-πενταμεθυλ- διυδρο-βενζοφουραν-5- σουλφονυλ-ομάδα-(pbf) Συνθήκες αποπροστασίας 95% v/v TFA, 30min (1,2-1,4 φορές ταχύτερη από την Pmc) 2,2,5,7,8-πενταμεθυλχρομαν- 6-σουλφονυλ-ομάδα-(Pmc) 50% v/v TFA σε DCM, 1h TFA-ανισόλη (9:1), 30min TFA-ανισόλη-EDT-EMS (95:3:1:1), 1.5h 35

56 Εισαγωγή Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Για το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού απαιτείται πολλή ενέργεια άρα και υψηλή θερμοκρασία. Όπως αναφέραμε προηγουμένως η υψηλή θερμοκρασία είναι καταστροφική για τα πεπτίδια. Για να επιτύχουμε λοιπόν τη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού σε πιο ήπιες συνθήκες απαιτείται η ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος, ώστε να ευνοείται η πυρηνόφιλη προσβολή της από την αμινομάδα του αμινο-συστατικού. Η ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας επιτυγχάνεται από τα λεγόμενα αντιδραστήρια σύζευξης ή ενεργοποίησης. Οι παράγοντες που λαμβάνονται υπόψη για την επιλογή της μεθόδου σύζευξης κατά τη σύνθεση των πεπτιδίων είναι ο γρήγορος σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού, η υψηλή απόδοση και η απουσία ή ελαχιστοποίηση παράπλευρων αντιδράσεων. Επιπλέον λαμβάνεται υπόψη να είναι απλή και εύκολη η διαδικασία καθαρισμού του προϊόντος και τέλος να επιτυγχάνεται καταστολή της ρακεμίωσης Μέθοδος των καρβοδιϊμιδίων Το Ν,Ν -δικυκλοεξυλο(καρβοδιϊμίδιο) (DCC) αποτελεί το κύριο αντιδραστήριο ενεργοποίησης της καρβοξυλομάδας στην SPPS. Η αντίδραση σύζευξης αρχικά περιλαμβάνει το σχηματισμό του ενεργού ενδιαμέσου της Ο-ακυλισοουρίας, με τη προσθήκη του καρβοξυ-συστατικού στο καρβοδιιμίδιο. Στη συνέχεια γίνεται πυρηνόφιλη προσβολή από το αμινο-συστατικό προς σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού (Σχήμα 16). Μειονέκτημα αποτελεί ο σχηματισμός Ν-ακυλουρίας η οποία μειώνει την απόδοση και δημιουργεί προβλήματα στον τελικό καθαρισμό. Το κύριο μειονεκτήματα από την χρήση του DCC είναι ο σχηματισμός της αδιάλυτης Ν,Ν'- δικυκλοεξυλουρίας (DCU) που διαχωρίζεται δύσκολα από το επιθυμητό προϊόν καθώς και ότι είναι αλλεργιογόνο. Εξαιτίας αυτού του μειονεκτήματος, χρησιμοποιούνται καρβοδιιμίδια, των οποίων η παραγόμενη ουρία είναι ευδιάλυτη στους οργανικούς διαλύτες, όπως το Ν,Ν'-διισοπροπυλοκαρβιδιιμίδιο (DIC), το N'- μεθυλοκαρβοδιιμίδιο, το Ν-τριτοταγές βουτυλο, το Ν'- αιθυλοκαρβοδιιμίδιο και το Ν-αιθυλο, Ν'[3- (διμεθυλο)προπυλο] καρβοδιιμίδιο (EDC). 36

57 Εισαγωγή Σχήμα 16: Αντιδράσεις δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού με χρήση DCC/HOBt. Ο σχηματισμός Ν-ακυλουρίας καθώς και η ρακεμίωση του καρβοξυ-συστατικού αντιμετωπίζεται με τη χρήση πρόσθετων πυρηνόφιλων αντιδραστηρίων όπως είναι το 1- υδροξυβενζοτριαζόλιο (HOBt) για τη δημιουργία ενεργών εστέρων. Το HOBt αντιδρά πολύ γρήγορα με την Ο-ακυλισοουρία και σχηματίζει τον υδροξυβενζοτριαζολυλεστέρα του καρβοξυπαραγώγου, ο οποίος αντιδρά πολύ γρήγορα με το αμινο-συστατικό για τη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού. Επιπλέον το HOBt, ως ασθενές οξύ εμποδίζει την απόσπαση πρωτονίου από το ασύμμετρο άτομο άνθρακα του καρβοξυ-συστατικού μειώνοντας ακόμη περισσότερο την πιθανότητα ρακεμίωσης. Εκτός από το HOBt χρησιμοποιούνται επίσης το Ν-υδροξυ-ηλεκτριμίδιο (HOSu) και το 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο (HOAt) που οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις και χαμηλότερα επίπεδα ρακεμίωσης (Σχήμα 17). HOBt HOSu HOAt Σχήμα 17: Πυρηνόφιλα αντιδραστήρια για τη δημιουργία ενεργών εστέρων 37

58 Εισαγωγή Μέθοδος σύζευξης με χρήση φωσφονικών και ουρανικών παραγώγων Τα τελευταία 30 χρόνια στην πεπτιδική χημεία χρησιμοποιούνται για in situ ενεργοποίηση του καρβοξυ-συστατικού, αντιδραστήρια τα οποία πλεονεκτούν εξαιτίας της σταθερότητας και της ευκολίας χρήσης τους, της χρήσης του σε υγρή και στερεή φάση πεπτιδικής σύνθεσης, και τέλος λόγω της διεξαγωγής της αντίδρασης σε μικρό χρονικό διάστημα. Τα αντιδραστήρια αυτά αντιδρούν μόνο με καρβοξυλικά ανιόντα, γι αυτό είναι απαραίτητη η προσθήκη οργανικής βάσης στο μίγμα της αντίδρασης, όπως η Ν,Ν-διϊσοπροπυλαιθυλαμίνη (DIPEA) και η κολλιδίνη (2,4,6 τριμέθυλο πυριδίνη), μετατρέποντας τα Fmoc-αμινοξέα στους αντίστοιχους OBt εστέρες. Οι βασικές συνθήκες στις οποίες πραγματοποιείται η ενεργοποίηση και σύζευξη οδηγούν σε ταχύτατες συζεύξεις μεγαλύτερες από αυτές που παρατηρούνται σε συζεύξεις με DCC/HOBt. Οι βασικές συνθήκες όμως, αυξάνουν τον κίνδυνο ρακεμίωσης μέσω οζλακτόνης. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται HOBt ή HOAt τα οποία πρωτονιώνουν τη σχηματιζόμενη οζλακτόνη. Πίνακας 10: Φωσφονιακά και Ουρονιακά παράγωγα Ονομασία Χημικός τύπος Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ- τρις(διμεθυλαμινο)- φωσφονίου BOP Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυπυρρολιδινο-φωσφονίου PyBOP Τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η βενζοτριαζολυλ)- 1,1,3,3-τετραμεθυλουρίας TBTU 38

59 Εισαγωγή Παράπλευρες αντιδράσεις στην πεπτιδική σύνθεση Κατά την πεπτιδική σύνθεση, υπάρχει πιθανότητα να συμβούν παράπλευρες αντιδράσεις κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης, της σύζευξης ή της αποπροστασίας των πεπτιδίων (Chan και White, 1999, Kates και Albericio, 2000, Sewald και Jakubke, 2002). Μερικά από τα πιο συνήθη προβλήματα που εμφανίζονται στην πεπτιδική σύνθεση είναι: Ρακεμίωση. Είναι ένα συχνό πρόβλημα της πεπτιδικής σύνθεσης επειδή οδηγεί σε απώλεια της οπτικής καθαρότητας των συντιθεμένων πεπτιδίων που μπορεί να μεταβάλλει τη βιολογική δράση τους, αλλά και επειδή ο διαχωρισμός μίγματος διαστερεομερών είναι δύσκολος και πολλές φορές αδύνατος. Η ρακεμίωση συμβαίνει κυρίως στο στάδιο ενεργοποίησης-σύζευξης των αμινοξέων ή πεπτιδίων. Για παράδειγμα αν το ενεργοποιημένο αμινοξύ είναι η L-Ala και το πεπτίδιο που επιθυμούμε είναι η L-Ala-D-Phe, λόγω ρακεμίωσης της L-Ala λαμβάνονται τα πεπτίδια L-Ala-D-Phe και L-Ala-L-Phe. Ο βαθμός ρακεμίωσης εξαρτάται από τη μέθοδο ενεργοποίησης, τη Ν α -προστατευτική ομάδα, τη θερμοκρασία, το διαλύτη και τέλος τη χρησιμοποιούμενη βάση (τριτοταγής αμίνη). Οι μηχανισμοί ρακεμίωσης στην πεπτιδική σύνθεση είναι πρώτον η απευθείας απόσπαση του α-πρωτονίου από το α-άτομο άνθρακα ενός α- αμινοξέος, αφού το σχηματιζόμενο καρβανιόν μπορεί να πρωτονιωθεί και από τις δύο πλευρές. Και δεύτερον μέσω σχηματισμού οξαζολόνης. Το όξινο πρωτόνιο της οξαζολόνης μπορεί να αποσπασθεί από βάσεις από το χειρόμορφο κέντρο παρέχοντας το σταθερό, λόγω συντονισμού, καρβανιόν. Οξείδωση μεθειονίνης. Η κύρια παράπλευρη αντίδραση της Met όταν χρησιμοποιείται χωρίς προστασία είναι η οξείδωση του θειοαιθέρα της πλευρικής ομάδας της σε σουλφοξείδιο κατά τη διάρκεια της αποπροστασίας ή ακόμα και από το οξυγόνο του ατμοσφαιρικού αέρα. Η μετατροπή του σουλφοξειδίου σε θειοαιθέρα γίνεται με χρήση TFA/NH 4 I (Huang και Rabenstein, 1999). Σχηματισμός νιτριλίου. Όταν χρησιμοποιείται Asn και δεν είναι προστατευμένο το πλευρικό αμίδιο, μπορεί να γίνει αφυδάτωση του αμιδίου προς σχηματισμό κυανοαναλίνης (νιτρίλιο). Η αντίδραση αυτή δεν παρατηρείται στην Bocμεθοδολογία λόγω χρήσης HF που αντιστρέφει το σχηματισμό νιτριλίου. Αντίθετα στην Fmoc-μεθοδολογία λόγω των ήπιων συνθηκών απομάκρυνσης της ρητίνης και στην αποπροστασία του πεπτιδίου δεν έχουμε επανυδάτωση του νιτριλίου. Για την 39

60 Εισαγωγή αποφυγή αυτής της αντίδρασης χρησιμοποιείται πλευρική προστασία στην αλυσίδα της Asn. Αλκυλιώσεις κατά την αποπροστασία. Κατά την απομάκρυνση των πλάγιων προστατευτικών ομάδων στην αποπροστασία των πεπτιδίων, είναι πιθανό τα κατιόντα που δημιουργούνται να προσβάλλουν τις δραστικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων, όπως της Trp, Tyr και Met. Για την παρεμπόδιση αυτών των παράπλευρων αντιδράσεων, προστίθενται στο διάλυμα αποπροστασίας κατάλληλες ενώσεις (scavengers) που δεσμεύουν τα ηλεκτρόφιλα είδη που παράγονται. Χαρακτηριστικά παραδείγματα scavengers αποτελούν η ανισόλη, η θειοανισόλη, η 1,2- αιθανοδιθειόλη (EDTH) και η διθειοθρεϊτόλη. Επιπλέον η προσθήκη νερού στο διάλυμα έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμη. Σχηματισμός δ-λακτάμης. Η δ-γουανιδινομάδα της Arg είναι πολύ καλό πυρηνόφιλο και έτσι κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης του αμινοξέος μπορεί το Ν δ της Arg να προσβάλει την ενεργοποιημένη καρβοξυλομάδα σχηματίζοντας δ- λακτάμη ειδικά όταν έχουμε συμμετρικό ανυδρίτη της Arg. Το HOBt εμποδίζει το σχηματισμό της. Σχηματισμός ασπαρτιμιδίου. Μία συνηθισμένη παράπλευρη αντίδραση στην πεπτιδική σύνθεση όταν χρησιμοποιείται το Asp είναι η κυκλοποίησή του και ο σχηματισμός ασπαρτιμιδίου. Η παράπλευρη αυτή αντίδραση εξαρτάται από την αλληλουχία του πεπτιδίου, αλλά συμβαίνει κυρίως όταν περιέχεται η αλληλουχία Asp-Gly, Asp-Ala, Asp-Ser και Asp-Asp. Δημιουργείται με πυρηνόφιλη προσβολή του αζώτου που είναι συνδεδεμένο στην α-καρβοξυλομάδα του Asp στον καρβονυλικό άνθρακα της πλευρικής ομάδας του Asp οδηγώντας σε ένα πενταμερές ιμίδιο. Το ενδιάμεσο αυτό μπορεί να υποστεί άνοιγμα του δακτυλίου κατά την αποπροστασία με πιπεριδίνη δίνοντας τα αντίστοιχα α- και β-ασπαρτυλαμίδια ή θα παραμείνει μέχρι την απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη για να υδρολυθεί αργότερα προς τα αντίστοιχα α- και β-ασπαρτυλ-πεπτίδια. Ένας τρόπος αντιμετώπισης είναι η χρήση 2-υδροξυ-4-μεθοξυβενζυλομάδα (N-Hmb) ως προσωρινής προστασίας του Asp, καθώς και η προσθήκη ΗΟΒt ή 2,4- δινιτροφαινόλης στο διάλυμα αποπροστασίας της πιπεριδίνης. 40

61 Εισαγωγή Στρατηγικές Πεπτιδικής Σύνθεσης Σταδιακή ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας (step by step) Ένα Ν α -προστατευμένο αμινοξύ ενσωματώνεται με ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του στην πεπτιδική αλυσίδα και απομακρύνεται η Ν α - προστατευτική ομάδα μετά από κάθε βήμα επιμήκυνσης της πεπτιδικής αλυσίδας. Η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας μπορεί να γίνει ξεκινώντας από το C-τελικό άκρο ή από το Ν-τελικό άκρο. Προτιμάται η πρώτη μέθοδος γιατί εξασφαλίζει χαμηλά ποσοστά ρακεμίωσης. Η αποτελεσματικότητα αυτής της μεθόδου οφείλεται στη χρήση περίσσειας Ν α -προστατευμένου αμινοξέος η οποία παρέχει μεγάλες ταχύτητες. Συνδυάζεται κυρίως με την τεχνική της σύνθεσης σε στερεή φάση Σύνθεση μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών κλασμάτων (Fragment condensation ή fragment coupling) Μικρά προστατευμένα τμήματα πεπτιδίων ενώνονται για τον σχηματισμό του τελικού επιθυμητού προϊόντος. Με αυτή τη στρατηγική μπορούν να συντεθούν μεγάλα πεπτίδια σε μικρότερο χρονικό διάστημα. Υπάρχει όμως ο κίνδυνος ρακεμίωσης του ενεργοποιημένου C-τελικού αμινοξέος στο καρβοξυπαράγωγο εκτός αν είναι Gly, Pro, Lys(Boc) ή Glu(tBu). Γενικά, όμως, η αποδοτικότητα αυτής της στρατηγικής εξαρτάται περισσότερο από τη φύση του Ν-τελικού αμινοξέος στο αμινοπαράγωγο παρά από το C- τελικό αμινοξύ του καρβοξυπαραγώγου. Πειράματα έχουν δείξει ότι για το Ν-τελικό άκρο προτιμότερα είναι τα αμινοξέα Gly, Ala, Asp(tBu), Glu(tBu), Lys(Boc) και Ser(tBu). 41

62 Εισαγωγή Ανίχνευση αμινών με δοκιμή νινυδρίνης (test Kaiser) Η δοκιμή Kaiser (Ninhydrin Color Test) χρησιμοποιείται κυρίως για την ανίχνευση πρωτοταγών και δευτεροταγών αμινών. Οι κόκκοι της ρητίνης επεξεργάζονται με διάλυμα νινυδρίνης, φαινόλης και κυανιούχου καλίου. Μετά από θέρμανση η αν υπάρχει ελεύθερη αμίνη φαίνεται από το μπλέ χρώμα (Ruhemann μπλε) του διαλύματος και των κόκκων της ρητίνης (Σχήμα 18). Παρά την ευαισθησία της δοκιμής για τις πρωτοταγής αμίνες, είναι λιγότερο αποτελεσματική στην ανίχνευση δευτεροταγών αμινών. Επιπλέον πρέπει να δίνεται προσοχή στην θερμοκρασία στην οποία γίνεται η δοκιμή καθώς πολλές προστατευτικές ομάδες είναι ασταθείς σε υψηλές θερμοκρασίες. Η δοκιμή γίνεται στους o C. Σχήμα 18: Σχηματισμός έγχρωμου συμπλόκου κατά τη δοκιμή Kaiser 42

63 Εισαγωγή 1.3 Αναλυτικές τεχνικές Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) Όταν ολοκληρωθεί η σύνθεση ενός μορίου (πεπτίδιο, οργανικό μόριο) απαιτείται ο καθαρισμός και ο έλεγχος της καθαρότητας του. Η ανάλυση και ο καθαρισμός των συντιθέμενων μορίων γίνεται με τη χρήση τεχνικών διαχωρισμού, τόσο σε παρασκευαστικό επίπεδο, με σκοπό την απομόνωση ενός ή περισσοτέρων συστατικών από ένα μίγμα, όσο και σε αναλυτικό επίπεδο, με σκοπό τον προσδιορισμό και την ταυτοποίηση μερικών ή όλων των συστατικών του μίγματος. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης HPLC είναι μια τέτοια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανάλυση και τον καθαρισμό των συντιθέμενων μορίων. Η HPLC αποτελείται από μια στήλη διαχωρισμού στην οποία περιέχεται υλικό πλήρωσης (στατική φάση), μια αντλία που κινεί το διαλύτη (κινητή φάση) προς τη στήλη και έναν ανιχνευτή που μετράει τους χρόνους συγκράτησης των μορίων (McMaster, 2007). Ο χρόνος συγκράτησης εξαρτάται από τις φυσικές και χημικές αλληλεπιδράσεις της στατικής φάσης με τα συστατικά των μορίων που αναλύονται και της κινητής φάσης. Όταν το δείγμα εισάγεται στη ροή της κινητής φάσης, η κίνηση του μέσα στη στήλη περιορίζεται εξαιτίας των αναπτυσσόμενων αλληλεπιδράσεων. Το ποσοστό συγκράτησης εξαρτάται από τη φύση του δείγματος καθώς και από τη σύσταση της στατικής και κινητής φάσης. Η κινητή φάση αποτελείται από ένα μίγμα διαλυτών (πολικός/άπολος), οι οποίοι πρέπει να αναμιγνύονται και να μην απορροφούν στο UV σε μήκη κύματος μικρότερα των 190 nm. Παράδειγμα πολικού διαλύτη αποτελεί το Η 2 Ο ενώ άπολοι είναι οι οργανικοί διαλύτες AcN (ακετονιτρίλιο), MeOH (μεθανόλη), THF (τετραϋδροφουράνιο), PrOH (προπανόλη) και i-proh (ισοπροπανόλη). Όταν χρησιμοποιούμε μη πολική στατική φάση η χρωματογραφία καλείται χρωματογραφία ανάστροφης φάσης (Reversedphase chromatography, RPC). Ονομάζεται ανάστροφης φάσης διότι κανονικής φάσης θεωρείται η υγρή χρωματογραφία που χρησιμοποιεί μια υδρόφιλη επιφάνεια από silica ή alumina με μεγαλύτερη συγγένεια δέσμευσης στις πολικές ενώσεις. Η εισαγωγή αλκυλ-ομάδων επάνω στην επιφάνεια της στατικής φάσης έχει ως αποτέλεσμα τα άπολα συστατικά να συγκρατούνται για περισσότερο χρόνο (Molnar και Horvarth, 1976). 43

64 Εισαγωγή Επομένως, η HPLC ανάστροφης φάσης (RP-HPLC ή RPC) αποτελείται από μια μη πολική στατική φάση και μια μεταβαλλόμενης πολικότητας, υδατικής φύσης κινητή φάση. Ως στατική φάση συνήθως χρησιμοποιείται μια silica (σιλάνια) μετά από αντίδρασή της με RMe 2 SiCl, όπου R είναι μια ευθύγραμμη αλκυλομάδα, όπως C 18 H 37 ή C 8 H 17. Για δέσμευση των σιλανομάδων που δεν έχουν αντιδράσει χρησιμοποιείται χλωροτριμεθυλοσιλάνιο. Αποτέλεσμα αυτής της επιλογής είναι να αυξάνεται ο χρόνος συγκράτησης για τα μη πολικά συστατικά, ενώ τα πολικά μόρια να εκλούονται πιο γρήγορα. Όσο μεγαλύτερη είναι η αλκυλομάδα που δεσμεύεται στην επιφάνεια της στατικής φάσης τόσο αυξάνεται η υδροφοβικότητά της. Έτσι για παράδειγμα, μια μη πολική ουσία συγκρατείται σε μια στήλη C-18 σε μεγαλύτερο βαθμό απ ότι σε μια στήλη C-8. Ένα ακόμα πλεονέκτημα της HPLC είναι η ικανότητα μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, που ονομάζεται βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Έτσι, για την ανάλυση και τον καθαρισμό πεπτιδίων χρησιμοποιείται η RP-HPLC μεταβαλλόμενης σύστασης, με τη χρήση Η 2 Ο και AcN ως κινητή φάση. Οι διαλύτες έχουν ph=2 με την προσθήκη 0,08-0,1% TFA (τριφθοροξικό), όπου όλες οι αμινομάδες του πεπτιδίου είναι πρωτονιωμένες. 44

65 Εισαγωγή Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) Η TLC αποτελεί μια χρωματογραφική τεχνική που έχει μεγάλη εφαρμογή στην ανάλυση και ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Η στατική φάση σε αυτή την τεχνική είναι επιστρωμένη επάνω σε μία πλαστική ή από αλουμίνιο πλάκα. Τα μέσα επίστρωσης μπορεί να είναι η Silica gel, αλούμινα, κυτταρίνη και πολυαμίδιο συνήθως αναμεμιγμένα με μικρή ποσότητα γύψου (10-15%) για καλύτερη προσκόλληση επάνω στην πλάκα. Ο διαλύτης, ή το μίγμα διαλυτών, στον οποίο πραγματοποιείται η χρωματογραφία αποτελεί την κινητή φάση, που καλείται διαλύτης ανάπτυξης. Ως διαλύτες ανάπτυξης χρησιμοποιούνται διάφοροι οργανικοί διαλύτες που μπορεί να περιέχουν και νερό. Συνηθισμένα συστήματα διαλυτών που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση είναι τα (BuOH/AcOH/H 2 O) (3:1:1) και AcN/H 2 O (5:1). Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος γίνεται με τη χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας UV σε συνδυασμό με τη χρήση κατάλληλων πλακών που φθορίζουν στο UV, καθώς και με ειδικά αντιδραστήρια ψεκασμού, όταν οι ουσίες που αναλύονται μπορούν να δώσουν έγχρωμα παράγωγα με τα αντιδραστήρια ψεκασμού Φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry MS) Η φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry MS) είναι μια αναλυτική τεχνική, που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της μάζας μιας χημικής ένωσης. Μέσω ιονισμού της χημικής ουσίας, και μετά από θραυσμάτωση των φορτισμένων σωματιδίων της λαμβάνονται σημαντικές πληροφορίες. Τα ιόντα σε ένα φασματόμετρο μάζας διαχωρίζονται σύμφωνα με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z) και ανιχνεύονται ανάλογα με την αφθονία τους. Η αναλογία μάζαςφορτίου των σωματιδίων μπορεί να υπολογιστεί με βάση τη συμπεριφορά των ιόντων, καθώς αυτά διέρχονται από τα ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία που παράγονται από το όργανο της MS. Ένα όργανο MS αποτελείται από μία πηγή ιονισμού, η οποία μετατρέπει τα μόρια ενός δείγματος σε ιόντα, έναν αναλυτή μάζας, ο οποίος ταξινομεί τα ιόντα με βάση το λόγο μάζα/φορτίο (m/z) εφαρμόζοντας ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία, και τέλος έναν ανιχνευτή, ο οποίος καταγράφει είτε το επαγόμενο φορτίο είτε το παραγόμενο ρεύμα όταν ένα ιόν περνάει από μια κατάλληλα επιστρωμένη επιφάνεια ή χτυπάει σε αυτή. Το σήμα που παράγεται στον 45

66 Εισαγωγή ανιχνευτή μετά από επεξεργασία με Η/Υ θα δώσει το φάσμα μάζας με τη μορφή ενός γραφήματος, όπου η τετμημένη είναι ο λόγος μάζα/φορτίο (m/z) και τεταγμένη, η σχετική ένταση (%) ως προς τη βασική κορυφή (Sparkman, 2000). Για την πραγματοποίηση ποιοτικών και ποσοτικών αναλύσεων με ένα φασματόμετρο μάζας, απαιτείται: α) να παράγει ιόντα από το δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί στη πηγή ιονισμού (Ionization Source), β) να διαχωρίζει τα ιόντα αυτά ανάλογα με το m/z στον αναλυτή (Analyzer), γ) να ανιχνεύει τα παραγόμενα ιόντα μετρώντας το λόγο m/z και την αφθονία του στον ανιχνευτή (Detector) και δ) να ελέγχει το όργανο και να επεξεργάζεται τα δεδομένα μέσω υπολογιστή (Computer) (De Hoffman και Stroobant, 2002). Ο ιονισμός από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στη φασματομετρία μάζας για την παραγωγή ιόντων (φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό, electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS). Στον ιονισμό από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό ένα διάλυμα εισάγεται μέσα σε ένα μικρό, φορτισμένο και συνήθως μεταλλικό τριχοειδές (Fenn et al., 1990). Αυτό το διάλυμα περιέχει την προς μελέτη ουσία διαλυμένη σε μια μεγάλη ποσότητα διαλύτη, ο οποίος είναι πιο πτητικός από την ουσία. Ένα φυσικό αέριο-φορέας, όπως άζωτο, συνήθως χρησιμοποιείται για τη μετατροπή του υγρού σε σπρέι και την εξάτμιση του διαλύτη σε σταγονίδια. Καθώς ο διαλύτης εξατμίζεται, τα φορτισμένα μόρια της ουσίας έρχονται πιο κοντά, απωθούνται και δημιουργούν μικρότερα σταγονίδια. Αυτή η διαδικασία καλείται σχάση Coulomb επειδή προκαλείται από απωθητικές δυνάμεις Coulomb μεταξύ των φορτισμένων μορίων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρι να προκύψουν πολλαπλά φορτισμένα σωματίδια της προς ανάλυση ουσίας, τα οποία οδηγούνται προς τον αναλυτή (Analyzer). Στην (ESI-MS) τα παρατηρούμενα ιόντα μπορεί να είναι ψευδομοριακά ιόντα που σχηματίζονται από την προσθήκη ενός πρωτονίου (H + ) και συμβολίζονται ως [M + H] +, από ένα άλλο κατιόν, όπως ιόν νατρίου, [M + Na] +, ή από την απομάκρυνση ενός πρωτονίου, [M H]. Συνήθως παρατηρούνται και πολλαπλά φορτισμένα ιόντα, όπως [M + 2H] 2+. Για μεγάλα μακρομόρια μπορεί να υπάρξουν πολλές βαθμίδες φόρτισης και το φορτίο μπορεί να φτάσει για παράδειγμα μέχρι και [M + 20H]

67 2 Σκοπός

68

69 Σκοπός 2.1 Βιβλιογραφική ανασκόπηση Στόχος εργασίας Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) όπως αναφέρθηκε είναι μία αυτοάνοση ασθένεια του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ). Ο κύριος γενετικός παράγοντας που επηρεάζει τη ΣΚΠ ως προς την παθοφυσιολογία της νόσου αλλά και τη θεραπευτική προσέγγιση που ακολουθείται, είναι το Μείζον Σύμπλεγμα Ιστοσυμβατότητας (MHC/HLA). Στη ΣΚΠ συναντάμε τη λανθασμένη αναγνώριση επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης του ΚΝΣ από το ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενούς ως αντιγόνα. Αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση μιας φλεγμονώδους Th1 ανοσολογικής αντίδρασης που καταλήγει στην καταστροφή της μυελίνης και στην εμφάνιση της νόσου. Αυτό που είναι πολύ σημαντικό για την κατανόηση αλλά και την αντιμετώπιση της νόσου, είναι ο μηχανισμός δράσης που συμβαίνει για την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Αυτή γίνεται μέσω της δημιουργίας του τριμοριακού συμπλόκου μεταξύ του υποδοχέα των T κυττάρων (TCR) Αντιγόνο (πεπτίδιο) HLA (σύστημα ιστοσυμβατότητας) που οδηγεί στην περεταίρω ενεργοποίηση των βοηθητικών T κυττάρων (Anderson et al. 2001; Hemmer et al 2006). Τα πεπτίδια που συγκροτούν το τριμοριακό σύμπλοκο είναι μικρά τμήματα πρωτεϊνών συνήθως 12 έως 20 αμινοξέων των πρωτεϊνών της μυελίνης όπως είναι η MBP και η MOG. Κατά της εκπόνηση αυτής της διπλωματικής εργασίας σχεδιάστηκε και συντέθηκε πεπτιδικό ανάλογο της μυελίνης MBP συζευγμένο με ανοσοκατασταλτική ένωση τύπου ανθρακινόνης για την επιλεκτική καταστολή και καταστροφή των εγκεφαλιτογόνων T κυττάρων που αναγνωρίζουν το πεπτιδικό ανάλογο. Η ανοσοκατασταλτική ένωση μιτοξανδρόνη χορηγείται στη ΣΚΠ καθυστερώντας την εξέλιξη της νόσου και αυξάνοντας το διάστημα μεταξύ των υποτροπών (Fox 2006). Η δράση της είναι ανοσοκατασταλτική αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων, των Τ και B κυττάρων και μειώνει την έκκριση κυτταροκινών όπως της IFN-γ και IL-10 (Morrisey et al 2005). Ο δακτύλιος της ανθρακινόνης στη δομή της μιτοξανδρόνης, παρεμβάλλεται μεταξύ των ζευγών βάσεων του DNA και οι αζωτούχες πλευρικές αλυσίδες προσδένονται μη δεσμικά στις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA αναστέλλοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Krishnamoorthy et al 1986). 49

70 Σκοπός Στα πλαίσια της Μεταπτυχιακής εργασίας σχεδιάστηκε ένα ανάλογο ανθρακινόνης με βάση τη μιτοξανδρόνη με σκοπό τη σύζευξή του με τον κύριο ανοσοκυρίαρχο επίτοπο MBP της μυελίνης. Ως γέφυρα σύνδεσης (linker) επιλέχθηκε ένα εξαπεπτίδιο αποτελούμενο από έξι σε σειρά αμινοεξανοϊκά οξέα και για τη σύζευξη (coupling) επιλέχθηκε ο δισουλφιδικός δεσμός (Σχήμα 19) λόγω της δράσης του συστήματος της θειορεδοξίνης. R = (CH 2 ) 4 SH linker = (Ahx) 6 Σχήμα 19: Σχεδιασμός για τη σύνθεση συζεύγματος ανθρακινόνης-πεπτιδίου 50