ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 Τμήματα Χημείας, Φαρμακευτικής και Ιατρικής ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμος και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» Σύνθεση γραμμικών και κυκλικών πεπτιδικών αναλόγων των πρωτεϊνών της μυελίνης και ανάπτυξη νανοσωματιδίων Ηρώ Τριανταφυλλάκου Χημικός Επιβλέπων: Τσέλιος Θεόδωρος, Αναπληρωτής Καθηγητής Πάτρα 2016

2 ii

3 Department of Chemistry, Pharmacy and Medicine MASTER S THESIS POSTGRADUATE PROGRAM Medicinal Chemistry: Drug discovery and design Synthesis of linear and cyclic peptide analogues of myelin proteins and the development of nanoparticles Iro Triantafyllakou Chemist Supervisor: Tselios Theodore, Associate Professor Patras 2016 iii

4 Επιβλέπων: Θεόδωρος Τσέλιος Αναπληρωτής Καθηγητής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Θεόδωρος Τσέλιος Δημήτριος Γάτος Γεράσιμος Τσιβγούλης Αναπληρωτής Καθηγητής Καθηγητής Αναπληρωτής Καθηγητής Supervisor: Theodore Tselios Associate Professor Examiner Committee: Theodore Tselios Dimitrios Gatos Gerasimos Tsivgoulis Associate Professor Professor Associate Professor iv

5 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Διατμηματικού Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών, Ιατρική Χημεία: «Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων», υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Θ. Τσέλιου. Το πρώτο μέρος εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών ενώ η συνέχεια στο εργαστήριο Ανοσολογίας του Πανεπιστημίου Piemonte Orientale Amedeo Avogadro στην Νοβάρα της Ιταλίας. Κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής εργασίας υπήρξαν αρκετές δυσκολίες αλλά και πολλές ευχάριστες στιγμές και ως εκ τούτου άνθρωποι που τους οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ για την στήριξη και τη βοήθεια που μου προσέφεραν. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλεποντα καθηγητή μου κ. Θεόδωρο Τσέλιο για την πολυετή συνεργασία μας, τις πολύτιμες συμβουλές και την εμπιστοσύνη του σε εμένα. Επιπλέον, ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Δημήτριο Γάτο και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεράσιμο Τσιγβούλη για την τιμή που μου έκαναν συμμετέχοντας στην εξεταστική μου επιτροπή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Professor Umberto Dianzani και την Assistant Professor Annalisa Chioccheti που με φιλοξένησαν στο εργαστήριό τους στα πλαίσια του Erasmus+ καθώς και στην Μεταδιδάκτορα Nausicaa Clemente για την συνεργασιά μας, την καθοδήγηση και την συμβολή της στην περάτωση των πειραμάτων. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τις υποψήφιες διδάκτορες Άννα Παντελιά και Μαίρη Γιαννακάκη για την πολύτιμη βοήθεια και στήριξή τους καθώς και την άψογη συνεργασία μας, την υποψήφια διδάκτωρ Γκόλφω Κόρδοπάτη και την Μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ανδριάνα Κωνσταντινίδη για την βοήθεια τους σε δύσκολες στιγμές. Δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω όλους όσους αναφέρθηκαν αλλά και τα υπόλοιπα μέλη των εργαστηρίων μας για την συνεργασία και για τις όμορφες στιγμές που περάσαμε όλο αυτό το διάστημα. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους μου Ουρανία, Κωνσταντίνα, Αλέξη και Θοδωρή σαν ελάχιστο δείγμα ευγνωμοσύνης, καθώς ο καθένας τους ξεχωριστά αλλά και όλοι μαζί ήταν δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια, σε δύσκολες αλλά και ευχάριστες στιγμές. v

6 vi

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης ασθένεια του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) η οποία χαρακτηρίζεται από καταστροφή της μυελίνης και απουσία νευρολογικών λειτουργιών, με αποτέλεσμα ο ασθενής να οδηγείται σε παράλυση. Πιθανά αυτοαντιγόνα θεωρούνται οι πρωτεΐνες της μυελίνης και ιδιαίτερα οι πρωτεΐνες MOG (Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών) και MBP (Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης) οι οποίες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και εξέλιξη της νόσου. Τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα πρωτεϊνών της μυελίνης έχουν προταθεί για την αναστολή εμφάνισης της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, ΕΑΕπειραματικό μοντέλο της ΣΚΠ). Η αμινοξική ακολουθία της MOG είναι ανοσοκυρίαρχη και έχει την ακόλουθη πρωτοταγή δομή: Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 Ο εν λόγω επίτοπος αναφέρεται στην MOG των ποντικών ενώ ο ίδιος επίτοπος στην ανθρώπινη MOG (hmog) διαφέρει μόνο στην θέση 42 όπου η Ser αντικαθίσταται από Pro. Ο επίτοπος της MBP με την παρακάτω αλληλουχία είναι επίσης ανοσοκυρίαρχος, και εμπλέκεται στην εμφάνιση της ΕΑΕ σε πειραματόζωα. Τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογά του αναστέλλουν ή καθυστερούν την εμφάνιση συμπτωμάτων της ΕΑΕ. Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 Βιοδιασπώμενα συστήματα με βάση τα συμπολυμερή γαλακτικού και γλυκολικού οξέος [Poly(lactic-co-glycolic)acid, PLGA] έχουν προταθεί για την βραδεία αποδέσμευση φαρμάκων. Στην πολυμερική μήτρα μπορούν να εγκλωβιστούν πεπτίδια προστατεύοντάς τα από την άμεση υδρόλυση και αποικόδομηση καθώς είναι το σημαντικότερο πρόβλημα των πρωτεϊνών και πεπτιδίων. Το κυριότερο πλεονέκτημα που παρουσιάζουν είναι η ικανότητα να ελέγχουν και να επιβραδύνουν την αποδέσμευση του φαρμάκου. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε σύνθεση κυκλικών και γραμμικών πεπτιδικών αναλόγων επιτόπων των πρωτεϊνών MBP και MOG της μυελίνης, με αντικατάσταση συγκεκριμένων αμινοξέων. Στη συνέχεια το ανάλογο hmog (Ala 41 ) εγκλωβίστηκε σε νανοσωματίδια που κατασκευάστηκαν από PLGA πολυμερή και μελετήθηκε o ρυθμός αποδέσμευσης του in vitro. Τέλος, τα συντιθέμενα νανοσωματίδια δοκιμάστηκαν in vivo στο πειραματικό μοντέλο της ΕΑΕ σε ποντίκια τύπου C57BL/6 στα οποία η νόσος προκλήθηκε με τον επίτοπο rmog vii

8 Λέξεις κλειδιά: Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ), Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών (MOG), Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (MBP), Πεπτιδική Σύνθεση Στερεής Φάσης, πολύ (γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ (PLGA), νανοσωματίδια, Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (EAE) viii

9 ABSTRACT Multiple Sclerosis (MS) is an immunologically controlled, inflammatory, demyelinating disease, characterized by destruction of the white matter (myelin) of the Central Nervous System (CNS), leading to serious medical conditions and paralysis. The proteins of the myelin sheath are considered to be the main self antigens and especially Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) and Myelin Basic Protein (MBP) that they have an important role in the MS induction. Mutated peptide analogues of myelin proteins have been proposed for EAE inhibition (EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, the animal model of MS). The epitope of rat MOG (rmog) is one of the most immunodominant regions of MOG and has the following sequence: Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 The same epitope in human MOG protein (hmog) differs only in position 42 where the amino acid Ser is replaced by Pro. Moreover, Alter Peptide Ligands (APLs) of MBP epitope inhibit EAE symptoms. The MBP has the following sequence: Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 Biodegradable systems based on lactic and glycolic acid [Poly (lactic-co-glycolic) acid, PLGA] have been proposed for slow release of bioactive molecules and peptides. Peptides are encapsulated into the polymeric matrix for protection from hydrolysis and degradation. Moreover, the low release of peptides from the PLGA nanoparticles will improve their bioavailability and their pharmacokinetic profile. In this study, cyclic and linear peptide analogues based on the immunodominant epitopes of MBP and MOG myelin proteins have been designed and synthesized. Subsequently, the analogue MOG (Ala 41 ) was encapsulated into nanoparticles composed of PLGA polymer. The release of the peptide was examined in vitro and the synthesized nanoparticles were tested in C57BL/6 mice for inhibition of MOG induced EAE. Keywords: Multiple Sclerosis (MS), Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG), Myelin Basic Protein (MBP), Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS), poly(lactic-glycolic)acid (PLGA), nanoparticles, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (ΕΑΕ) ix

10 x

11 Συντμήσεις Οι συντμήσεις οι οποίες χρησιμοποιούνται στην παρούσα διπλωματική έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχημικής Ονοματολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) και της Διεθνούς Ένωσης Βιοχημείας (IUD). Οι προτάσεις αυτές ανακοινώθηκαν το 1972 και συμπληρώθηκαν σταδιακά μέχρι το 1989 [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN), Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations, 1984 Eur J Biochem 138: 9; 1989 J Biol Chem 264], και παρουσιάζονται ολοκληρωμένες όσον αφορά την Πεπτιδική Χημεία στην αναφορά: 2003 J Pep Sci 9: 1-8. Σύντμηση 1-BuOH ΑΑ ACN AcOH Ala Arg Αsn Asp Asx Boc CLTR-Cl Cys DCC DCM DCU DIC DIPEA DIMAC DMF DMSO ΕΑΕ EDT ESI-MS Ονομασία 1-βουτανόλη Αμινοξύ Ακετονιτρίλιο Οξικό οξύ Αλανίνη Αργινίνη Ασπαραγίνη Ασπαραγινικό οξύ Ασπαραγίνη και Ασπαραγινικό οξύ tert-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα Πολυμερές 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο Κυστεΐνη N,N -δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο Διχλωρομεθάνιο N,N -δικυκλοεξυλουρία N,N -διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο Διισοπροπυλαιθυλαμίνη Ν,Ν -διμεθυλακεταμίδιο Ν,Ν -διμεθυλοφορμαμίδιο Διμέθυλοσουλφοξείδιο Πειραματική Αλλεργική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα Αιθανοδιθειόλη Φασμοτομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό xi

12 Et 2 0 Fmoc Gln Glu Glx Gly His HPLC Ile i-proh ΚΝΣ Lys M MBP MeOH Met MOG NMP NPs PLA PLGA Pro PrOH RP-HPLC Scavenger Ser SPPS ΣΚΠ tbu TES TFA TFE (electron spray ionization) Διαιθυλαιθέρας 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα Γλουταμίνη Γλουταμινικό οξύ Γλουταμίνη και Γλουταμινικό οξύ Γλυκίνη Ιστιδίνη Υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης Ισολευκίνη Ισοπροπανόλη Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Λυσίνη Μοριακό βάρος Βασική Πρωτείνη της Μυελίνης Μεθανόλη Μεθειονίνη Επίτοπος της μυελινικής γλυκοπρωτείνης των ολιγοδενδριτών N-μεθυλοπυρολιδόνη nanoparticles Πολύ γαλακτικό οξύ Πολύ (γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ Προλίνη Προπανόλη Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης Δεσμευτής (κατιόντων) Σερίνη Σύνθεση πεπτιδίου σε στερεή φάση Σκλήρυνση Κατά Πλάκας Τριτοταγής βουτυλομάδα Τριισοπροπυλοπυρίτιο Τριφθοροξικό οξύ Τριφθοροαιθανόλη xii

13 THF Thr TLC tm Tol Τr t R Trp Trt Τyr UV Val Τετραϋδροφουράνιο Θρεονίνη Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Νεκρός χρόνος Τολουόλιο Ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Τ regulatory, Tregs) Χρόνος έκλουσης (resolution time) Τρυπτοφάνη Τριφαινυλομεθυλο(τριτυλο)-ομάδα Τυροσίνη Υπεριώδης ακτινοβολία Βαλίνη xiii

14 Περιεχόμενα... σελ. Κεφαλαιο Α Εισαγωγή... 1 A1.1 Νευρικό Σύστημα... 3 A1.2 Μυελίνη Πρωτεΐνες Λειτουργικότητα... 4 A1.3 Σκληρυνση κατά πλακας... 6 A1.4 Αιτιοπαθογένεια και ανοσοαπόκριση στην ΣΚΠ... 8 A1.5 Πειραματικά Μοντέλα της ΣΚΠ και η ΕΑΕ [16] A1.5.1 Μοντέλα της ΕΑΕ A1.5.2 Κλινικά Στάδια Εξέλιξη της ΕΑΕ A1.5.3 ΕΑΕ σε C57Bl/6 ποντίκια A1.6 Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών (MOG) A1.7 Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (MBP) A2.1 Πεπτιδική Σύνθεση A2.2 Πεπτιδικός δεσμός A2.3 Μέθοδοι Σχηματισμού του Πεπτιδικού Δεσμού A2.3.1 Μέθοδος Αζιδίων A2.3.2 Μέθοδος Ανυδριτών A2.3.3 Μέθοδος Καρβοδιιμιδίων A2.3.4 Μέθοδος φωσφορικών ουρανικών παραγώγων [36, 39] A2.4 Παράπλευρες αντιδράσεις στην πεπτιδική σύνθεση A2.5 Έλεγχος δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού με test Kaiser A2.6 Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης A2.6.1 Σύνθεση σε υγρή φάση A2.6.2 Σύνθεση σε στερεή φάση A2.6.3 Αδιάλυτο στερεό υπόστρωμα A2.6.4 Προστασία πλευρικών ομάδων αμινοξέων xiv

15 A2.7 Κυκλικά πεπτίδια A3 Βιοδιασπώμενα συστήματα με βάση τα συμπολυμερή γαλακτικού γλυκολικού οξέος A3.1 Γενικά Α3.2 Συμπολυμερή πολύ (γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA) Α3.3 Χαρακτηριστικά των PLGA συμπολυμερών Α3.4 Συστήματα χορήγησης φαρμάκων με βάση τα PLGA συμπολυμερή Α3.5 Μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων Α3.6 Μέγεθος σχηματιζόμενων νανοσωματιδίων Α3.7 Ιδιότητες επιφάνειας και Ζ-δυναμικό Α3.8 Εγκλωβισμός του φαρμάκου Α3.9 Αποδέσμευση φαρμάκου ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Κεφάλαιο Β Πειραματικό μέρος 49 Β1 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων Β1.1 Γενική πορεία σύνθεσης Β1.2 Έλεγχος συνθετικής πορείας Β1.3 Μέθοδος απομάκρυνσης πεπτιδίου από την CLTR-Cl ρητίνη Β1.4 Μέθοδος ολικής αποπροστασίας του πεπτιδίου Β1.5 Γενική πορεία κυκλοποίησης πεπτιδίων μέσω δημιουργίας αμιδικού δεσμού Β2 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων του επιτόπου MPB Β3 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων του επιτόπου MOG Β4 Κυκλοποίηση πεπτιδικών αναλόγων Β5 Τελική αποπροστασία των πεπτιδικών αναλόγων Β6 Σύνθεση και χαρακτηρισμός των PLGA νανοσωματιδίων Β6.1 Έλεγχος αποδέσμευσης πεπτιδίου in vitro Β6.2 Μέτρηση της ποσότητας πεπτιδίου που περιέχεται στις νανοσφαίρες Β7 Ανοσοποίηση πειραματόζωων και εμβολιασμός xv

16 Κεφάλαιο Γ Αποτελέσματα - Συζήτηση 65 Γ1 Συντεθέντα πεπτιδικά ανάλογα Γ1.1 Σύνθεση αναλόγου cyclo(91-99) [(KG) 5 MBP (Lys 91 )] (1Γ) Γ1.2 Σύνθεση αναλόγου (KG) 4 MBP (2Γ) Γ1.3 Σύνθεση αναλόγου cyclo(41-55) [(KG) 5 MOG (Lys 41 )]_rat (3Γ) Γ1.4 Σύνθεση αναλόγου MOG (Ala 41 ) (4Γ) Γ2.1 Χαρακτηριστικά των PLGA νανοσφαιρών Γ2.2 Μελέτη απελευθέρωσης πεπτιδίου in vitro Γ3.1 Μελέτη επίδρασης των PLGA νανοσωματιδίων σε ποντίκια που τους έχει προκληθεί ΕΑΕ 80 Γ3.2 Θεραπευτική μελέτη επίδρασης των PLGA νανοσωματιδίων σε ποντίκια που τους έχει προκληθεί ΕΑΕ Κεφάλαιο Δ Συζήτηση 87 Βιβλιογραφία 93 xvi

17 xvii

18 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ

19 2

20 A1.1 Νευρικό Σύστημα Το νευρικό σύστημα είναι ένα σύστημα που αποτελείται από ένα δίκτυο εξειδικευμένων κυττάρων, τους νευρώνες, οι οποίοι συντονίζουν τις ενέργειες και τη μετάδοση σημάτων μεταξύ των διαφόρων τμημάτων του σώματος. Το νευρικό σύστημα αποτελείται από δύο μέρη, το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) και το Περιφερειακό Νευρικό Σύστημα (ΠΝΣ). Το ΚΝΣ περιλαμβάνει το Νωτιαίο Μυελό και τον Εγκέφαλο. Ο Νωτιαίος Μυελός προστατεύεται από τα οστά της σπονδυλικής στήλης και από αυτόν περνάνε όλες οι εντολές που στέλνει ο εγκέφαλος στα διάφορα μέρη του σώματος. Στον εγκέφαλο ρυθμίζονται βασικές λειτουργίες όπως η αναπνοή, ο καρδιακός ρυθμός και διέρχονται οι πληροφορίες που κατευθύνονται προς τον Νωτιαίο Μυελό. Επιπλέον ρυθμίζεται η ισορροπία, η κίνηση και η στάση του ανθρώπινου σώματος. Το ΠΝΣ διακρίνεται σε Σωματικό και Αυτόνομο Νευρικό Σύστημα και αποτελείται από αισθητήριους νευρώνες, συστάδες νευρώνων που ονομάζονται γάγγλια και νεύρα που συνδέονται μεταξύ τους [1]. Μέσω του Νωτιαίου Μυελού,το ΠΝΣ μεταφέρει εντολές από τον εγκέφαλο στα διάφορα μέρη του σώματος και πληροφορίες από τα αισθητήρια όργανα στον εγκέφαλο. Οι νευρώνες στέλλουν μηνύματα προς άλλα κύτταρα ως ηλεκτροχημικά κύματα που ταξιδεύουν κατά μήκος λεπτών ινών, τους άξονες, οι οποίοι διεγείρουν χημικές ουσίες, τους νευροδιαβιβαστές, να απελευθερωθούν σε κόμβους, τις συνάψεις. Οι αισθητήριοι νευρώνες ενεργοποιούνται από φυσικά ερεθίσματα που προσπίπτουν πάνω τους και στέλνουν σήματα που ενημερώνουν το ΚΝΣ για την έκθεση του σώματος σε εξωτερικά ερεθίσματα. Οι κινητήριοι νευρώνες που βρίσκονται στο ΚΝΣ και στα απομακρυσμένα γάγγλια, συνδέουν το νευρικό σύστημα με τους μύες ή με άλλα δραστικά όργανα. Οι κεντρικοί νευρώνες κάνουν όλες τις συνδέσεις εισόδου και εξόδου με τους άλλους νευρώνες. Οι αλληλεπιδράσεις όλων αυτών των τύπων νευρώνων σχηματίζουν τα νευρικά κυκλώματα που προάγουν την αντίληψη ενός οργανισμού και καθορίζουν τη συμπεριφορά του. Το νευρικό σύστημα περιέχει εκτός από τους νευρώνες και άλλα εξειδικευμένα κύτταρα τα νευρογλοιακά κύτταρα (νευρογλοία ή γλοία κύτταρα).τα γλοία κύτταρα που βρίσκονται στο ΠΝΣ λέγονται κύτταρα Schwann, ενώ αυτά που βρίσκονται στο ΚΝΣ λέγονται ολιγοδενδροκύτταρα και αστροκύτταρα και τα πρώτα είναι αυτά που παράγουν την μυελίνη ενώ τα δεύτερα θρέφουν τους νευρώνες. Ο σημαντικότερος ρόλος των νευρογλοιακών κυττάρων όμως είναι ότι διευκολύνουν τις νευρικές ώσεις. Αυτό επιτυγχάνεται με το να δημιουργούν γύρω από τον άξονα των νευρικών κυττάρων μία επικάλυψη μυελίνης που τον μονώνει ηλεκτρικά. Η μυελίνη είναι μια λιπόφιλη ουσία πρωτεϊνικής φύσης η 3

21 οποία ενσωματώνεται στην κυτταρική μεμβράνη των νευρογλοιακών κυττάρων. Το στρώμα της μυελίνης που τα περιτυλίγει δεν είναι συνεχές, αλλά διακόπτεται κατά μήκος του νευροάξονα. Στα σημεία που δεν υπάρχει μυελίνη ο νευροάξονας είναι γυμνός και ονομάζονται κόμβοι Ranvier. Τα ενεργά δυναμικά δεν περνούν την μυελίνη και κάνουν άλμα από τον ένα κόμβο στον άλλο, γεγονός που αυξάνει την ταχύτητα διάδοσής τους. Συνεπώς η ύπαρξη της μυελίνης αυξάνει την ταχύτητα διάδοσης των ενεργών δυναμικών κατά μήκος της νευρικής ίνας. Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση του νευρώνα και τα σημαντικότερα τμήματα του. (Α) αισθητήριος νευρώνας, (Β) κινητικός νευρώνας, (C) το έλυτρο της μυελίνης. Προσαρμοσμένο από [49]. A1.2 Μυελίνη Πρωτεΐνες Λειτουργικότητα Η μυελίνη είναι ένα διηλεκτρικό-μονωτικό υλικό, απόφυση των νευρογλοιακών κυττάρων, απαραίτητο για τη σωστή λειτουργία του νευρικού συστήματος. Είναι χαρακτηριστικό των σπονδυλωτών και η παραγωγή της ξεκινά κατά την εμβρυική ανάπτυξη [2]. Περιέχει περίπου 40% νερό ενώ η μάζα της αποτελείται από περίπου 70-80% λιπίδια και 20-30% πρωτεΐνες. 4

22 Οι κυριότερες πρωτεΐνες της μυελίνης είναι: MBP (Myelin Basic Protein), Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης. Είναι βασικό συστατικό του περιβλήματος της μυελίνης, βρίσκεται στην επιφάνεια της μυελινικής μεμβράνης και αποτελεί το 30-40% της μυελίνης. PLP (Proteolipid Protein), Πρωτεολιπιδική Πρωτεΐνη της Μυελίνης. Αποτελεί το 50% της μυελίνης παρέχοντας αυξημένη σταθερότητα. MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein), Μυελινική Πρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών. Βρίσκεται στην επιφάνεια του περιβλήματος της μυελίνης και αποτελεί μόνο το 0,05% των πρωτεϊνών της μυελίνης. MAG (Myelin-Associated Glycoprotein), Μυελινο-σύνδετη Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών. Είναι ο κυρίαρχος μεσολαβητης των αξονικών νευρογλοιακών συνάψεων και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην έναρξη της μυελινοποίησης. MOBP (Myelin-Associated Oligodendrocyte Basic Protein), Μυελινο-σύνδετη Βασική Πρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών. Είναι δομικά παρόμοια με την MBP αλλά εκφράζεται αποκλειστικά στη μυελίνη του ΚΝΣ. Το κύριο λιπίδιο της μυελίνης είναι ένα γλυκολιπίδιο, ο γαλακτοσερεβοσίτης (galactocerebroside, GalC). Η βασική λειτουργία της μυελίνης είναι η μετάδοση ηλεκτρονίων στον μυελυνωμένο νευρικό άξονα με σκοπό την αύξηση της ταχύτητας των νευρικών ώσεων. Στις απομυελυνωμένες περιοχές, τα ερεθίσματα κινούνται συνεχώς σαν κύματα, ενώ στις μυελινομένες διαδίδονται σαν παλμοί. Ετσι η μυελίνωση αποτρέπει το ηλεκτρικό σήμα να φύγει από τον άξονα. Όταν μια περιφερειακή ίνα καταστρέφεται τοπικά, το έλυτρο της μυελίνης παρέχει τη δυνατότητα αναγέννησης, δεν εξασφαλίζει όμως πάντα την τέλεια αναγέννηση των νευρικών ινών. Η βλάβη στο έλυτρο της μυελίνης και των νευρικών ινών συνδέονται συχνά με λειτουργική ανεπάρκεια. Η απομυελίνωση είναι η απώλεια του ελύτρου της μυελίνης και οδηγεί σε νευροεκφυλιστικές αυτοάνοσες ασθένειες όπως η Σκήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) ή Πολλαπλή Σκλήρυνση. Όταν η μυελίνη υποβαθμίζεται, η αγωγιμότητα των σημάτων κατά μήκος του νεύρου μπορεί να διαταραχθεί ή να χαθεί και τελικά το νεύρο απενεργοποιείται. Το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να παίξει ρόλο στην απομυελίνωση που συνδέεται με αυτές τις ασθένειες προκαλώντας απομυελίνωση από υπερέκφραση των κυτταροκινών και του παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) ή 5

23 της ιντερφερόνης γ (INFγ) [3]. Τα αποτελέσματα της απομυελίνωσης καθορίζονται από τις λειτουργίες των νεύρων που επηρεάζονται, αφού εμποδίζεται η μεταφορά των σημάτων από και προς τον εγκέφαλο. Τυπικά συμπτώματα αποτελούν η θολότητα στο κεντρικό οπτικό πεδίο, η διπλή όραση, η απώλεια όρασης/ ακοής, το μούδιασμα στα άκρα, το στήθος ή το πρόσωπο, η απώλεια μνήμης και επιδεξιότητας, η διαταραχή ισορροπίας κ.ά. Προκειμένου για την αποκατάσταση των κατεστραμμένων στρωμάτων μυελίνης προτείνεται συνήθως χειρουργική εμφύτευση ολιγοδενδρογλοιακών πρόδρομων κυττάρων στο ΚΝΣ και πρόκληση της επισκευής της μυελίνης με ορισμένα αντισώματα. Τα τελευταία χρόνια, τέτοιες τεχνικές έδωσαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε ποντίκια μέσω μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων, δεν επιβεβαιώνεται όμως η αποτελεσματικότητα για την αντικατάσταση της απώλειας μυελίνης σε ανθρώπους [4]. Χολινεργικές θεραπείες με αναστολείς της ακέτυλοχολινεστεράσης, μπορεί επίσης να έχουν ευεργετικά αποτελέσματα στην μυελίνωση. Έρευνες υποστηρίζουν ότι η αύξηση της χολινεργικής διέγερσης ενεργεί στις αναπτυξιακές διαδικασίες του εγκεφάλου και ειδικότερα στα ολιγοδενδροκύτταρα και στη δια βίου διαδικασία της μυελίνωσης [5]. A1.3 Σκληρυνση κατά πλακας Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) εµφανίστηκε για πρώτη φορά το 15 ο αιώνα, αλλά αναγνωρίστηκε ως ασθένεια νευρολογικής φύσεως το Από τις αρχές του 20 ου αιώνα άρχισε να θεωρείται ως ο κυριότερος παράγοντας εµφάνισης νευρολογικών διαταραχών και συνεχίζεται η έρευνα ώστε να καθοριστεί η παθοφυσιολογία της. Η ΣΚΠ είναι µια ανοσολογικά ελεγχόμενη ασθένεια του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) η οποία χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη φλεγμονή και καταστροφή της λευκής ουσίας (μυελίνη) του ΚΝΣ [6]. Θεωρείται αυτοάνοση ασθένεια καθώς τα Τ-κύτταρα αναγνωρίζουν τμήματα της μυελίνης προκαλώντας βλάβες στον ιστό και κατ επέκταση στο ΚΝΣ. Η φλεγμονώδης απόκριση οδηγεί σε καταστροφή της μυελίνης και ακολούθως σε δυσκολία μετάδοσης της νευρικής ώσης και τελικά σε παράλυση. 6

24 Σχήμα 2: Υγιής νευρώνας (Α) και νευρώνας προσβλημένος από ΣΚΠ με κατεστραμμένη την μυελίνη (Β). Προσαρμοσμένο από [7]. Πιο συγκεκριμένα, ενεργοποιούνται πληθυσμοί κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στο περιφερικό αίμα ειδικών για αντιγόνα των πρωτεϊνών της μυελίνης, συμπεριλαμβανομένου των αυτοαντιδρώντων, Τ-κυττάρων. Η ανοσολογική απόκριση για την εμφάνιση της νόσου ξεκινάει στην περιφέρεια. Τα Τ-κύτταρα που αντιδρούν με τα κύρια συστατικά του περιβλήματος της μυελίνης είναι παρόντα σε δείγματα περιφερικού αίματος υγειών ατόμων. Φυσιολογικά, κάποια Τ-κύτταρα αναγνωρίζουν «ξένα» μόρια επομένως διατηρούνται και πολλαπλασιάζονται μέσω θετικής επιλογής από τον θύμο αδένα. Αντίθετα αλλά Τ-κύτταρα αναγνωρίζουν «ίδια» αντιγόναπεπτίδια, οπότε καταστρέφονται μέσω της αρνητικής επιλογής κι έτσι κάποια Τ-κύτταρα από την αρνητική επιλογή διαφεύγουν στο θύμο αδένα. Η διαφυγή από την αρνητική επιλογή Τ-κυττάρων που αναγνωρίζουν αντιγόνα της μυελίνης πιθανά να οδηγεί στην εμφάνιση της νόσου.. Στους ασθενείς µε ΣΚΠ οι απομυελινωτικές περιοχές ονομάζονται πλάκες. Η καταστροφή της μπορεί να προκαλέσει μια ποικιλία συμπτωμάτων όπως, αδυναμία στο ένα ή περισσότερα άκρα (εμφανίζεται στο 40% των ασθενών), διαταραχή όρασης ως οπτική νευρίτιδα (εμφανίζεται στο 22% των ασθενών), παραισθησίες (εμφανίζεται 21% των ασθενών), διπλωπία (εμφανίζεται 12% των ασθενών), ενώ λιγότερο συχνά (εμφανίζεται στο 5%) παρατηρείται ίλιγγος, καυσαλγία και αίσθημα ηλεκτρικής εκκένωσης στην σπονδυλική στήλη και τα πόδια, νευραλγία τριδύμου στο πρόσωπο, παροξυσμικά συμπτώματα και δυσαρθρία. Η ασθένεια προσβάλλει κυρίως νεαρούς ενήλικες, χωρίς όμως να αποκλείεται η εμφάνισή της σε ανήλικους ή και ηλικιωμένους ανθρώπους. Οι επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ορισμένα κύρια και σταθερά ευρήματα τα οποία σχετίζονται με τη νόσο [8]. Για πολλά χρόνια θεωρούταν ότι η εμφάνιση της ασθένειας σχετίζεται αποκλειστικά με τη λευκή ουσία του ΚΝΣ. Τα τελευταία χρόνια αποδείχθηκε ότι η αυτοάνοση απόκριση περιλαμβάνει και την γκρι ουσία (φαιά ουσία). Η εξέλιξη αυτή επεξηγεί την εμφάνιση συμπτωμάτων όπως μεταβολές στη γνωστική λειτουργία που συχνά παρατηρείται στους ασθενείς με ΣΚΠ. 7

25 A1.4 Αιτιοπαθογένεια και ανοσοαπόκριση στην ΣΚΠ Στην αιτιοπαθογένεια της ΣΚΠ συμβάλλουν τόσο γενετικοί όσο και περιβαλλοντικοί παράγοντες. Οι γενετικοί παράγοντες μπορούν είτε να προδιαθέτουν για εμφάνιση της νόσου, είτε να επηρεάζουν την κλινική της έκφραση. Την τελευταία 20ετία, δεδομένα από άρτια σχεδιασμένες πληθυσμιακές μελέτες γενετικής επιδημιολογίας (μελέτες οικογενειών, μελέτες διδύμων, υιοθεσίας, σε ετεροθαλή αδέρφια και σε οικογένειες όπου και οι δύο γονείς πάσχουν από την νόσο) αποσαφήνισαν τη συμβολή των γενετικών παραγόντων στην προδιάθεση για ΣΚΠ. Σε μοριακό επίπεδο, οι μελέτες συσχέτισης υποψηφίων γονιδίων της τελευταίας 15ετίας ανέδειξαν την αδιαμφισβήτητη συμμετοχή συγκεκριμένων απλότυπων των γονιδίων του συμπλέγματος HLA στην εμφάνιση της νόσου που όμως η συμβολή τους είναι περιορισμένης έκτασης. Τελικά εδραιώθηκε η άποψη ότι το μέλλον των γονιδιακών μελετών για την ΣΚΠ βρίσκεται στις μελέτες συσχέτισης οι οποίες έχουν μεγαλύτερη ισχύ να αναδείξουν φαινόμενα περιορισμένης έκτασης. Αποτελέσματα προσπάθειας συσχέτισης ολόκληρου του γονιδιώματος, επιβεβαίωσαν τα ευρήματα των μελετών ανάλυσης και ανέδειξαν κάποιες νέες περιοχές του γονιδιώματος με πιθανή συμμετοχή στην προδιάθεση για την νόσο [9]. Εντούτοις δεν μπορούμε να καταλήξουμε μέχρι σήμερα σε συγκεκριμένα συμπεράσματα που αφορούν τις αιτίες εμφάνισης της νόσου. Η καταστροφή της μυελίνης πραγματοποιείται κάτω από ειδικές συνθήκες από το ανοσοποιητικό σύστημα το οποίο «λανθασμένα» αναγνωρίζει πεπτιδικά τμήματα της μυελίνης ως ξένα και ενεργοποιείται με αποτέλεσμα την κινητοποίηση του ανοσολογικού μηχανισμού έναντι αυτοαντιγόνων [10]. Το ανοσοποιητικό σύστημα περιλαμβάνει δύο είδη ανοσολογικής απόκρισης, την μη ειδική (φυσική ανοσία) και την ειδική (επίκτητη ανοσία). Κύρια στοιχεία της φυσικής ανοσολογικής απόκρισης είναι: α) οι φυσικοί φραγμοί, β) τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα ( Natural killers cells, NK cells) και γ) το συμπλήρωμα. Αντιθέτως, στην ειδική ανοσία, κινητοποιούνται άλλοι μηχανισμοί, με εξαιρετική εξειδίκευση και ετερογένεια, έπειτα από την έκθεση του οργανισμού σε ξένες ουσίες. Οι ξένες ουσίες, οι οποίες επάγουν την επίκτητη ανοσία, καλούνται αντιγόνα, ενώ οι ειδικές περιοχές ενός αντιγόνου, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την ανοσοαπόκριση, καλούνται αντιγονικοί καθοριστές ή επίτοποι. Στην επίκτητη ανοσία περιλαμβάνεται η ενεργοποίηση των Β κυττάρων και των Τ κυττάρων και διαφοροποίηση τους σε Τ κυτταροτοξικά κύτταρα τα οποία φέρουν στην επιφάνεια την πρωτεΐνη CD8 + καθώς επίσης και σε Τ βοηθητικά κύτταρα, τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους την CD4 + πρωτεΐνη. Η κύρια λειτουργία των Τ 8

26 κυτταροξικών κυττάρων είναι η αναγνώριση αντιγονικών επιτόπων και ο κυτταρικός θάνατος ολόκληρου του προσβεβλημένου κυττάρου [11, 12]. Η ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων πραγματοποιείται στο ενδοπλασματικό τους δίκτυο το οποίο έχει προσβληθεί. Εκεί πραγματοποιείται υδρόλυση των πρωτεϊνών, των ιών ή βακτηρίων σε πεπτίδια και απλά αμινοξέα. Τα μόρια μεταφορείς, γνωστά ως Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibility Complex, MHC ή Human Leukocyte Antigen, HLA για τον άνθρωπο), δεσμεύουν τα πεπτίδια και τα μεταφέρουν στην επιφάνεια του προσβεβλημένου αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου (Antigen Presenting Cell, APC). APC είναι διάφοροι τύποι κυττάρων, όπως μικρόγλοια, ινοβλάστες, αλλά κυρίως δενδριτικά κύτταρα μυελινικής προέλευσης. Υπάρχουν δύο κατηγορίες μορίων MHC. Τα MHC τάξης I βρίσκονται σε όλα τα σωματικά πυρηνικά κύτταρα και παρουσιάζουν αντιγόνα στα CD8 + Τ κύτταρα (Τc) και τα MHC τάξης II μόνο στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και κυρίως στα Β κύτταρα και στα μακροφάγα και παρουσιάζουν αντιγόνα στα CD4 + T κύτταρα (Th). Στη συνέχεα, το μόριο MHC μεταφέρει το πεπτίδιο στην επιφάνεια του κυττάρου. Ο υποδοχέας ενός Τ κυττάρου το αναγνωρίζει και έτσι δημιουργείται τριμοριακό σύμπλοκο μεταξύ του υποδοχέα του Τ κυττάρου (TCR), του αντιγόνου (πεπτίδιο) και του μορίου μεταφορέα (MHC) [13]. Σχήμα 3: Κλασσικό μοντέλο σχηματισμού τριμοριακού συμλόκου. Αν το πεπτίδιο αναγνωριστεί ως ξένο, τότε ενεργοποιούνται τα Th κύτταρα τα οποία με την έκκριση των κυτταροκινών, θα ενεργοποιήσουν τα Τc κύτταρα καθώς και την πορεία παραγωγής αντισωμάτων (Β κύτταρα), με στόχο την καταστροφή του αντιγόνου και τελικά την καταστολή την 9

27 ανοσολογικής απόκρισης. Στην αντίθετη περίπτωση, που τα Τ-κύτταρα αναγνωρίσουν το πεπτίδιο ως αυτο-αντιγόνο, θα οδηγούνται σε απόπτωση και θάνατο. Στην ΣΚΠ και τα δύο είδη ανοσολογικής απόκρισης εμπλέκονται στην εμφάνιση της νόσου και ειδικότερα τα CD4 + Τ κύτταρα. Οι περισσότεροι ερευνητές υποστηρίζουν ότι η ΣΚΠ προκαλείται από ανεπιθύμητες ενέργειες της συστηματικής ανοσοαπόκρισης ενάντια σε ξένα, «μη αυτοαντιγόνα» προτείνοντας το μηχανισμό της μοριακής μίμησης, κατά την οποία «μη αυτοαντιγόνα» έχουν δομική ομολογία με «αυτοαντιγόνα» και η ομολογία αυτή οδηγεί σε επαγωγή αυτοανοσίας του ΚΝΣ. Αντίθετα άλλες έρευνες προτείνουν την ενεργοποίηση παρευρισκόμενων κυττάρων, σύμφωνα με την οποία η συστημική ανοσοαπόκριση σε άλλα αντιγόνα οδηγεί στην ενεργοποίηση απόκρισης ενάντια στα αυτοαντιγόνα. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν Τ κύτταρα με διπλό υποδοχέα (T cell receptor, TCR), υπέδειξαν ότι τα Τ κύτταρα μπορούν να αναγνωρίσουν τα «μη αυτοαντιγόνα» μέσω του ενός υποδοχέα και ταυτόχρονα τα «αυτοαντιγόνα» μέσω του δεύτερου υποδοχέα. Υπάρχουν επίσης υποδείξεις ότι η συστημική ανοσοαπόκριση μπορεί να επιδεινώσει την σε εξέλιξη Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλοπάθεια (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, ΕΑΕ), το ζωικό μοντέλο της ΣΚΠ [14]. Πέραν της συστημικής ανοσολογικής απόκρισης, στην εμφάνιση της νόσου φαίνεται να συμβάλει και η τοπική ανοσολογική απόκριση στο ΚΝΣ καθώς παρουσιάζονται διαταραχές στον Αίματο-Εγκεφαλικό Φραγμό (Blood Brain Barrier, BBB) και μετανάστευση των Τ κυττάρων σε αυτόν καθώς και αντισωμάτων έναντι της μυελίνης. Επιπλέον τα μικρογλοία παρουσιάζουν μεγάλη ευαισθησία σε αλλαγές του ΚΝΣ και την ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος. Η αλληλεπίδραση των Τ κυττάρων και των μικρογλοίων είναι πιθανότατα μεγάλης σημασίας αν και οι πληροφορίες μας για αυτήν είναι περιορισμένες. Η είσοδος των Τ-λεμφοκυττάρων, τα οποία ενεργοποιούνται με τον σχηματισμού του τριμοριακού συμπλόκου και πολλαπλασιάζονται, διευκολύνεται και από παράγοντες που δρουν στο ΚΝΣ και προκαλούν την υπερέκφραση ενδοθηλιακών μορίων προσκόλλησης, όπως τα ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) και Ε-σελεκτίνη, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η κύλιση, το δέσιμο, η διαπίδυση και τελικά η μετακίνησή τους στο ΚΝΣ. Η υπερέκφραση των μορίων συγκόλλησης επάγεται από τις παραγόμενες κυτταροκίνες, όπως IFN-γ, οι οποίες εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα. Οι κυτταροκίνες που παράγονται στο ΚΝΣ από τα ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα, μετατρέπουν τα μικρόγλοια σε αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ικανά να εκφράζουν στην επιφάνεια τους αντιγόνα της μυελίνης (MBP, MOG, PLP). Ταυτόχρονα, στο ΚΝΣ εισέρχονται Β-κύτταρα, τα οποία παράγουν αντισώματα που επιτίθενται στην μυελίνη και στα ολιγοδενδροκύτταρα, μακροφάγα, τα οποία επιτίθενται στη μυελίνη τόσο με 10

28 φαγοκυττάρωση όσο και με την έκκριση φλεγμονωδών παραγόντων καθώς επίσης και το συμπλήρωμα το οποίο συνεισφέρει στην καταστροφή της μυελίνης. Η διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω προκαλεί την αλλοίωση του ΑΕΦ και την καταστροφή της μυελίνης, σαν αποτέλεσμα της κλιμακούμενης απομυελίνωσης και της δημιουργίας φλεγμονών και ουλών στους νευρώνες, που οδηγεί σε κακή μεταφορά των μηνυμάτων και την εμφάνιση παθοφυσιολογικών συμπτωμάτων. Παρόλα αυτά από την φλεγμονή στο ΚΝΣ έως την μόλυνση και την αυτοάνοση απόκριση εμφανίζεται ενεργοποίηση και παραγωγή διαφορετικών ειδών κυττάρων [14]. Σχήμα 4: Έναρξη της ανοσολογικής απόκρισης στη περιφέρεια, διαπίδυση του ΑΕΦ και ενεργοποίηση κυττάρων στο ΚΝΣ. Προσαρμοσμένο από [15]. A1.5 Πειραματικά Μοντέλα της ΣΚΠ και η ΕΑΕ [16] Τα κύρια πειραματικά μοντέλα της ΣΚΠ χωρίζονται σε ανοσομεσολαβούμενα και μοντέλα πρόκλησης της ασθένειας από ιό. Στα ανοσομεσολαβούμενα μοντέλα μία αυτοάνοση απόκριση προκαλείται μέσω έκχυσης μορίων μυελίνης (ή τμήματων αυτής), σε συνδυασμό με ενισχυτές του ανοσοποιητικού συστήματος (Freund s adjuvant). Πρότυπο αυτής της κατηγορίας είναι η 11

29 Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, ΕΑΕ) και χρησιμοποιείται σε διάφορα πειραματόζωα όπως ποντίκια, αρουραίοι, κουνέλια κ.ά. Τα ιογενή μοντέλα περιλαμβάνουν χρήση ιών σε πειραματόζωα και παρέχουν πληροφορίες τόσο για την παθογένεια της νόσου αλλά και υποθετικούς μηχανισμούς δράσης στους ανθρώπους. Η ΕΑΕ είναι ένα πειραματικό μοντέλο αυτοάνοσων ασθενειών του ΚΝΣ και προσομοιάζει από πολλές απόψεις την ΣΚΠ. Η ασθένεια χαρακτηρίζεται από ένα μείγμα φλεγμονώδους διείσδυσης στο ΚΝΣ συνοδευόμενη από απομευλίνωση. Η κλινική πορεία μπορεί να είναι οξεία και μονοφασική ή πολυφασική με χρόνια, υποτροπιάζουσα και διαλείπουσα και εξαρτάται από το είδος, την ηλικία και το φύλο των πειραματόζωων που χρησιμοποιούνται, αλλά και από την μέθοδο της πρόκλησής της. Αποδείχθηκε ότι οι δύο κύριες πρωτεΐνες της μυελίνης, MBP και PLP, είναι εγκεφαλιτογόνες ουσίες. Μεταγενέστερες μελέτες με την MBP έδειξαν ότι δεν είναι απαραίτητη ολόκληρη η πρωτεΐνη για να προκληθεί η ΕΑΕ. Συγκεκριμένα κομμάτια που παράγονται από την πεψίνη ή την τρυψίνη έχουν εγκεφαλιτογόνα δράση. Τα τελευταία χρόνια και άλλες πρωτεΐνες της μυελίνης έχουν αποδειχθεί να έχουν παρόμοια δράση. Από αυτές ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η MOG καθώς προκαλεί την ΕΑΕ με εκτενή απομυελινωση. A1.5.1 Μοντέλα της ΕΑΕ Τα παραπάνω συμπεράσματα στηρίχθηκαν σε ενεργή (active) ΕΑΕ όπου η νόσος προκαλείται με έκχυση αντιγόνου του ΚΝΣ σε ανοσοενισχυτικό. Σε αυτό το μοντέλο η έκχυση και η δράση αναφέρεται στο ίδιο πειραματόζωο. Κατά την φάση της έκχυσης, δραστικά κύτταρα ενεργοποιούνται και πολλαπλασιάζονται στους λεμφαδένες σαν απόκριση στην ένεση. Στην φάση της δράσης, τα ενεργοποιημένα αυτά κύτταρα μεταναστεύουν στο ΚΝΣ προκαλώντας βλάβες του ανοσοποιητικού και τα πρώτα κλινικά σημάδια. Η ΕΑΕ μπορεί να προκληθεί με ανοσοποίηση ωμού εγκεφάλου ή ομογενοποιημένο νωτιαίο μυελό ή ολόκληρη τη μυελίνη ή αντιγόνα των πρωτεϊνών της μυελίνης (MBP, PLP, MOG). Στην παθητική (passive) ΕΑΕ, τα δραστικά εξειδικευμένα για τα αντιγόνα του ΚΝΣ κύτταρα, παράγονται σε μια ομάδα πειραματόζωων ενώ η νόσος προκαλείται σε μία δεύτερη ομάδα πειραματόζωων με μεταφορά των κυττάρων από την πρώτη στη δεύτερη. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να μελετηθεί απομονωμένα η φάση της επίδρασης από την φάση της επαγωγής. Η παθητική ΕΑΕ αποτελεί ένα αναπαραγωγικό μοντέλο καθώς εξαλείφεται η μεταβλητότητα της φάσης επαγωγής. 12

30 Η ενεργή και η παθητική ΕΑΕ είναι συχνά οξείς μονοφασικές πορείες που προσομοιάζουν την εξέλιξη της νόσου στον άνθρωπο. Οι έρευνες παρόλα αυτά απαιτούσαν την δημιουργία ενός άλλου μοντέλου με υποτροπιάζοντα (relapsing) ή προοδευτικά (progressive) συμπτώματα που να μιμούνται την πορεία της ΣΚΠ. Αναπτύχτηκαν έτσι μέθοδοι πρόκλησης υποτροπιάζουσας ΕΑΕ με αποτελέσματα πιο αξιόπιστα από αυτά της οξείας ασθένειας, που εξαρτώνται όμως από το γένος των πειραματόζωων. Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκε ακόμη ένα μοντέλο που περιλαμβάνει την χρήση διαγονιδιακών ποντικών δύο ειδών. Το πρώτο είδος αφορά TCR διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν έναν υποδοχέα εξειδικευμένο για την MBP σε όλα ή τα περισσότερα λεμφοκύτταρα. Το δέυτερο είδος αφορά ποντίκια σχεδιασμένα να εκφράζουν ιογενή πρωτεΐνη σε ολιγοδενδροκύτταρα. Ένας μεγάλος αριθμός μοντέλων της ΕΑΕ δείχνουν μονοφασική εξέλιξη της νόσου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να μεσολαβήσει στην ανάκαμψη από την ασθένεια. Πολυάριθμοι είναι και οι μηχανισμοί που έχουν προταθεί πάνω σε αυτήν την παρατήρηση αλλά προς το παρόν η προσοχή στέφεται στου πληθυσμούς των λεμφοκυττάρων, ιδιαίτερα των CD4 + CD25 + Τ κυττάρων, και στην ρυθμιστική κυτταροκίνη IL-10 που τα παράγει. Παρόλο που η ΕΑΕ έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα σαν πειραματικό μοντέλο για την ΣΚΠ, παραμένει ελλιπές ως μοντέλο. Ένας σημαντικός περιορισμός είναι ότι πραγματοποιείται τεχνητά και όχι αυθόρμητα και ως εκ τούτου, έχει περιορισμένη χρήση στον προσδιορισμό των πρωτογενών εναυσμάτων και στην παθογένεση της ασθένειας. Ένας επιπλέον περιορισμός είναι ότι η πλειοψηφία των μοντέλων ΕΑΕ δείχνουν πολύ μικρή απομυελίνωση και έχουν μια οξεία, μονοφασική πορεία με αυθόρμητη ανάρρωση. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τη χρόνια, προοδευτική φύση της ΣΚΠ. Αρκετά μοντέλα ΕΑΕ έχουν αναπτυχθεί στα οποία η βλάβη του ΚΝΣ προσεγγίζει περισσότερο εκείνη της ΣΚΠ. Ένα παράδειγμα είναι η πρόκληση σε C57Bl/6 ποντίκια με τον επίτοπο της MOG πρωτεΐνης [16]. A1.5.2 Κλινικά Στάδια Εξέλιξη της ΕΑΕ Τα κλινικά στάδια και η εξέλιξη της ΕΑΕ φαίνεται να επηρεάζονται από το γένος, το στέλεχος και το είδος των πειραματόζωων. Τα κλινικά και ιστοπαθολογικά σημάδια της ΕΑΕ μπορεί να προσδιορισθούν ποσοτικά σύμφωνα με διάφορα συστήματα. Αξιολογείται η κλινική εικόνα σε όλα τα πειραματόζωα χρησιμοποιώντας μια κλινική βαθμολόγηση (EAE score) με κλίμακα από το 0 έως το 5. Η βαθμολόγηση πραγματοποιείται από έναν εξεταστή που δεν γνωρίζει το 13

31 πειραματικό πρωτόκολλο και με τον ίδιο παρατηρητή καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Οι μέσες κλινικές βαθμολογίες κάθε ημερομηνίας υπολογίζεται προσθέτοντας τα αποτελέσματα των μεμονωμένων ποντικών και διαιρώντας το άθροισμα με τον αριθμό των ποντικών σε κάθε ομάδα. Πίνακας 1: Βαθμολόγηση της κλινικής εικόνας της ΕΑΕ. EAE score Κλινική Εικόνα 0 Καμία κλινική εικόνα 1 Αδυναμία ουράς Ημι- ή παραπληγία (ατελής παράλυση ενός ή δύο οπισθίων άκρων) Ημι- ή παραπληγία (πλήρης παράλυση ενός ή δύο οπισθίων άκρων) Παραπληγία με αδυναμία ή παράλυση στα μπροστινά άκρα 5 Ετοιμοθάνατα ή νεκρά ζώα A1.5.3 ΕΑΕ σε C57Bl/6 ποντίκια Μονοφασική ΕΑΕ πρόκληση σε ποντίκια αυτού του γένους επιτυγχάνεται με ανοσοποίηση με τον επίτοπο MOG σε Complete Freund's Adjuvant (CFA) και ακολούθως ενδοπεριτοναϊκή ένεση τοξίνης του κοκίτη, στην μέρα 0 και 2 του πρωτοκόλλου. Το μέγιστο της κλινικής εικόνας παρουσιάζεται στην 14 η μέρα την έκχυσης. Η μορφή αυτή της ΕΑΕ έχει χαρακτηριστεί σαν πολυεστιακή, συγχωνευμένων περιοχών μονοπύρηνης φλεγμονώδους διείσδυσης της περιφερική λευκής ουσίας του νωτιαίου μυελού, με τοπική απομυελίνωση. Η διείσδυση περιλαμβάνει μακροφάγα, Β και Τ λεμφοκύτταρα. Το συγκεκριμένο μοντέλο έχει χρησιμοποιηθεί τελευταία προκειμένου να αποδειχτεί η δράση των CD4 + CD25 + κυττάρων στην νόσο. Πρόσφατο πείραμα έδειξε ότι όταν αυτά τα Τ κύτταρα συλλέχθηκαν από τους λεμφαδένες ποντικών και μεταφέρθηκαν σε αποδέκτες τρείς μέρες πριν την επαγωγή της ΕΑΕ, υπήρξε σημαντική προστασία από την ασθένεια αλλά και από την παθολογική αλλαγή του ΚΝΣ. Επίσης τα Τ κύτταρα που μεταφέρθηκαν δεν διείσδυσαν στο ΚΝΣ, αλλά παρέμειναν τοπικά στην σπλήνα και τους λεμφαδένες των ποντικών [17]. 14

32 A1.6 Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών (MOG) Οι ανοσολογικές απαντήσεις στις πρωτεΐνες της μυελίνης του ΚΝΣ, την PLP και την MBP, πιστεύεται ότι προκαλούν μερικές από τις παθολογικές αλλοιώσεις στη ΣΚΠ και το ζωικό μοντέλο της, την Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, ΕΑΕ) [18]. Ωστόσο, υπάρχει ένα άλλο σημαντικό αυτοαντιγόνο που συνδέεται με την παθογένεια τόσο της ΣΚΠ όσο και της ΕΑΕ, η Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών (MOG), η οποία είναι ένα δευτερεύον συστατικό του ελύτρου μυελίνης (περίπου 0.05% της συνολικής πρωτεΐνης μυελίνης). Η MOG εκφράζεται ειδικότερα στο ΚΝΣ στο εξωτερικότερο φύλλο του ελύτρου της μυελίνης, καθώς και στο κυτταρικό σώμα και στα ολιγοδενδροκύτταρα. Η αναπτυξιακή καθυστέρηση έκφρασης της MOG συσχετίζεται με τα βραδύτερα στάδια της μυελινογένεσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η MOG έχει σημαντικό ρόλο στην ολοκλήρωση, τη συμπύκνωση, και τη συντήρηση της μυελίνης, γεγονός που υποδηλώνει περαιτέρω ότι η MOG έχει συγκολλητική λειτουργία στο ΚΝΣ. Επιπλέον, η MOG μπορεί να έχει ανοσοποιητικά συσχετιζόμενη λειτουργία. Σε ευπαθή ζώα, η ανοσοποίηση με MOG, ή πεπτίδια της MOG, ή παθητική μεταφορά MOG-συγκεκριμένων Τ-κυττάρων και αυτοαντισωμάτων κατά της MOG, εξάγουν μια σοβαρή νευρολογική ασθένεια που μιμείται πολλά από τα κλινικά, παθολογικά, και ανοσολογικά χαρακτηριστικά της ΣΚΠ. Όσον αφορά τη δομή της, η MOG είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με διμερής μορφή η οποία διαθέτει ένα ενιαίο εξωκυτταρικό ευμετάβλητο κομμάτι Ig (Ig-V) [19, 20]. Η αλληλουχία των αμινοξέων της MOG είναι όμοια μεταξύ των ειδών των ζώων (90%), ενδεικτικό της σημαντικής βιολογικής της λειτουργίας. Έχει εντοπιστεί ένας αριθμός εγκεφαλιτογόνων επιτόπων της MOG (MOG 1-22, MOG και MOG ). Ειδικότερα η MOG 35-55, είναι ένας ισχυρά εγκεφαλιτογόνος επίτοπος, ο οποίος σε αντίθεση με τους MBP και PLP, προκαλέι εντυπωσιακή φλεγμονώδη απομυελινωτική και ανοσολογική αντίδραση στο ΚΝΣ όχι μόνο σε διάφορα είδη, αλλά και σε διαφορετικά γένη των ποντικιών. Η επακόλουθη νόσος χαρακτηρίζεται από υποτροπές και υφέσεις, εκτεταμένη νευρική φλεγμονή και απομυελίνωση, αξονική βλάβη, και παραγωγή αντισωμάτων κατά της MOG [21, 22]. Επιπλέον, τα αντισώματα για την MOG συνδέονται άμεσα με βλάβη της μυελίνης στο μοντέλο της ΕΑΕ καθώς και στο ΚΝΣ των ασθενών με ΣΚΠ [23]. Ύστερα από μελέτες μοριακής μοντελοποίησης καθώς και από κρυσταλλικές δομές που έχουν προκύψει, έχει αποδειχθεί ότι όλα σχεδόν τα μόρια MHC τάξης II περιέχουν ένα κεντρικό πεπτίδιο εννέα αμινοξέων. Είναι γνωστό ότι το πεπτίδιο MOG 35-55, που εμφανίζεται στο μόριο Ι- 15

33 Ab του MHC τάξης ΙΙ, προκαλεί χρόνια ΕΑΕ σε ποντίκια C57BL/6. Επίσης, έχει αποδειχθεί ότι το πεπτίδιο MOG είναι ο ελάχιστος επίτοπος ο οποίος μπορεί να προκαλέσει μερική από τη διέγερση του MOG Η αλληλουχία των αμινοξέων του επιτόπου MOG των ποντικιών C57BL/6 είναι: Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 Η ανθρώπινη MOG διαφέρει μόνο στη θέση 42, όπου στη θέση της Ser υπάρχει Pro. Τέλος, τα αμινοξέα Tyr 40, Pro 43, Ser 45 και Val 48 δεσμεύονται στις αντίστοιχες θήκες P1, P4, P6 και P9 του MHC ΙΙ, ενώ τα αμινοξέα Arg 41, Ser 42, Phe 44, Arg 46 και Val 47 είναι διαθέσιμα για την αναγνώριση του TCR στις θήκες P2, P3, P5, P7, P8 αντίστοιχα [24, 25]. A1.7 Βασική Πρωτεΐνη της Μυελίνης (MBP) H MBP πρωτεΐνη αποτελείται από 170 αμινοξέα και είναι η δεύτερη μεγαλύτερη σε ποσοστό πρωτεΐνη που περιέχεται στον νευρικό άξονα. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία απομυελίνωσης και αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη για την ανάπτυξη των θεραπευτικών προσεγγίσεων. Με βάση την κρυσταλλική δομή, πολλά πειράματα έχουν προσπαθήσει να καθορίσουν τα αμινοξέα της μυελίνης που προσδένονται στον MHC II. Έρευνες που αφορούν ασθενείς της ΣΚΠ δείχνουν ότι το ανάλογο της MBP είναι ανοσοκυρίαρχο για τα ανθρώπινα Τ κύτταρα που ενεργοποιούνται από την MBP Το πεπτίδιο αυτό δημιουργεί ένα σύμπλεγμα με το HLA-DR2, έναν απλότυπο που θεωρείται υπεύθυνος για την εμφάνιση της νόσου. Σειρά πειραμάτων ανέδειξαν τρία αμινοξέα «κλειδιά» είναι απαραίτητα για να επιτευχθεί μια ικανοποιητική αλληλεπίδραση πεπτιδίου-hla. Συγκεκριμένα έδειξαν ότι τα αμινοξέα Val 87 και Phe 90 του πεπτιδίου MBP έχουν αναγνωριστεί ως κύρια αμινοξέα πρόσδεσης με τις θήκες Ρ1 και Ρ4 του HLA-DR2 [26]. Για την αναγνώριση του συμπλόκου που δημιουργείται απομονώθηκε ο TCR από ασθενή της ΣΚΠ και μεταφέρθηκε σε διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν τον ίδιο TCR και το ανθρώπινο μόριο HLA. Η δομή έδειξε μια ιδιαίτερα ασυνήθιστη τοπολογία διαγώνιας πρόσδεσης του πεπτιδίου στον HLA που δεν είχε παρατηρηθεί στους ανθρώπινους υποδοχείς Τ κυττάρων ενάντια σε μολυσματικούς παράγοντες. Η διαγώνια αυτή πρόσδεση φαίνεται να είναι υπεύθυνη για το ότι τα Τ κύτταρα που ενεργοποιούνται με αυτόν τον τρόπο καταφέρνουν και αποφεύγουν τη φυσιολογική αρνητική επιλογή στο θύμο αδένα προκαλώντας έτσι ανοσολογική απόκριση και θεωρείται αποτέλεσμα εκλεκτικής ενεργοποίησης τους. Κατά την διάρκεια ανάπτυξης στον θύμο 16

34 αδένα, τα Τ κύτταρα που εμφανίζουν βέλτιστη εφαρμογή στο σύμπλοκο πεπτιδίου-hla (με το πεπτίδιο να έχει το ρόλο του αυτοαντιγόνου), είναι τα πιο πιθανά να διαγραφούν. Αντίθετα τα Τ κύτταρα των οποίων ο TCR εφαρμόζει σε μικροβιακό πεπτίδιο δεσμευμένο με τον HLA δεν διαγράφονται συστηματικά και έχουν ένα ανταγωνιστικό πλεονέκτημα υπερ των άλλων Τ κυττάρων σε μια αντιμικροβιακή απόκριση. Τέλος η δομή αυτή παρέχει μία εξήγηση στο γεγονός ότι τα αυτοαντιδρώντα Τ κύτταρα είναι παρόντα σε κάθε περίπτωση, παρά τους περίπλοκους μηχανισμούς για τον περιορισμό τέτοιων κυττάρων [27]. Η αλληλουχία των αμινοξέων του επιτόπου MBP είναι: Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 17

35 18

36 A2.1 Πεπτιδική Σύνθεση Οι πρωτεΐνες και τα πεπτίδια είναι ουσίες με πρωταρχικό και κυρίαρχο ρόλο στη ζωή. Λαμβάνουν μέρος σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες και βρίσκονται σε όλα τα όργανα του κυττάρου. Πεπτίδια χαρακτηρίζονται οι οργανικές ενώσεις που αποτελούνται από δύο ή περισσότερα α- αμινοξέα τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με αμιδικό δεσμό. Γενικά τα πεπτίδια είναι αζωτούχες ενώσεις και αποτελούν δομικό συστατικό των πρωτεϊνών. Τα α-αμινοξέα που απαντώνται στην φύση είναι 20, όλα με L-στερεοχημική διάταξη. Ο α-άνθρακας του κάθε αμινοξέος φέρει μια αμινο-ομάδα (-ΝΗ 2), μια καρβόξυλο-ομάδα (-COOH) και μια πλευρική ομάδα (-R). Σχήμα 5: Δομή των 20 αμινοξέων και οι κύριες ιδιότητες. Προσαρμοσμένο από [28]. Ο πεπτιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ της α-καρβοξυλο-ομάδας του πρώτου αμινοξέος και της α-άμινο-ομάδας του δεύτερου. Στα κύτταρα η αντίδραση αυτή καταλύεται από ριβοσωμικά ένζυμα και είναι ιδιαίτερα εκλεκτική. Για να επιτύχουμε την εκλεκτική αντίδραση στο εργαστήριο, γίνεται προστασία των δραστικών πλευρικών ομάδων των αμινοξέων καθώς και της καρβόξυλοομάδας του C-τελικού αμινοξέος και της άμινο-ομάδας του Ν-τελικού αμινοξέος, ώστε να μην υπάρχουν διαθέσιμες ομάδες να αντιδράσουν. Επιπλέον απαιτούνται μέθοδοι επιλεκτικής απομάκρυνσης των προστατευτικών ομάδων, ώστε να μην σχηματίζονται παραπροϊόντα. Η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: 19

37 I. Πεπτιδική σύνθεση κατά στάδια (step by step) Στην πεπτιδική σύνθεση κατά στάδια, η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας επιτελείται βήμα προς βήμα προσθέτοντας κάθε φορά ένα προστατευμένο αμινοξύ. Θεωρητικά η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας μπορεί να συμβεί και από τις δύο διευθύνσεις, δηλαδή είτε από το Ν- τελικό άκρο του μορίου προς το C-τελικό, είτε αντίστροφα από το C-τελικό προς το N-τελικό. Στη φύση ακολουθείται η πρώτη διαδικασία ενώ στο εργαστήριο προτιμάται η δεύτερη καθώς αποφεύγεται έτσι κατά το δυνατόν η ρακεμίωση. II. Πεπτιδική σύνθεση μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών τμημάτων (fragment orsegment condensation) Στην συγκεκριμένη μέθοδο κατάλληλα προστατευμένα πεπτίδια δύο ή περισσότερων αμινοξέων (fragment) συνδέονται μέσω πεπτιδικού δεσμού προς μεγαλύτερα τμήματα, συνθέτοντας έτσι τον πεπτιδικό σκελετό. Η μέθοδος αυτή βρίσκει εφαρμογή κυρίως στη σύνθεση μεγάλων πεπτιδικών αλληλουχιών. Το μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι το αυξημένο ποσοστό ρακεμίωσης του ενεργοποιημένου C-τελικού αμινοξέος του καρβοξυ-παραγώγου. Προκειμένου για την μείωση της ρακεμίωσης προτιμάται η επιλογή πεπτιδικών τμημάτων τα οποία περιέχουν σαν C-τελικό αμινοξύ γλυκίνη (χωρίς ασύμμετρο άνθρακα) ή προλίνη (οπτικά σταθερή), επιτρέποντας έτσι την ευρεία χρησιμοποίηση της μεθόδου. A2.2 Πεπτιδικός δεσμός Όπως αναφέρθηκε ο πεπτιδικός δεσμός είναι αποτέλεσμα της αντίδρασης της α-αμινομάδας και της α-καρβοξυλομάδας δύο γειτονικών αμινοξέων. Το τελικό άκρο που φέρει την αμινομάδα του πεπτιδίου ή της πρωτεΐνης είναι η αρχή της πεπτιδικής αλυσίδας, απ όπου και αρχίζει η αρίθμηση. Ο πεπτιδικός δεσμός αποτελεί μία άκαμπτη και επίπεδη περιοχή του μορίου. Το υδρογόνο της αμινομάδας είναι συνήθως trans ως προς το οξυγόνο του καρβονυλίου, ενώ η cis δομή είναι λιγότερο σταθερή λόγω στερεοχημικών παρεμποδίσεων. Οι Pauling και Corey πρώτοι ανακάλυψαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ ότι είναι αδύνατη η ελεύθερη περιστροφή των ατόμων του αμιδικού δεσμού, διότι ο δεσμός δεν είναι αμιγώς απλός δεσμός, αλλά παίρνει μερικώς το χαρακτήρα διπλού δεσμού. Εξαιτίας της διπολικής φύσης των αμινοξέων η αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού δεν ευνοείται θερμοδυναμικά και γι αυτό δεν πραγματοποιείται αυθόρμητα, αλλά απαιτείται υψηλή θερμοκρασία, πράγμα ανεπιθύμητο [29]. Για την σύνθεση ενός πεπτιδίου προβαίνουμε σε ενεργοποίηση της 20

38 καρβοξυλομάδας του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος, ώστε να έχουμε πυρηνόφιλη προσβολή της από την αμινομάδα του αμινο-συστατικού, με αποτέλεσμα να διεξάγεται επιτυχώς η αντίδραση σε ήπια θερμοκρασία. A2.3 Μέθοδοι Σχηματισμού του Πεπτιδικού Δεσμού Κατά τη σύνθεση στα κύτταρα, η απαιτούμενη ενέργεια σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού προέρχεται από την υδρόλυση του ATP κατά το σχηματισμό αμινο-άκυλο-rna. Στην in vitro σύνθεση η ενέργεια προέρχεται από υψηλού ενεργειακού περιεχομένου ουσίες οι οποίες αυξάνουν την ενέργεια της α-καρβοξυλομάδας των αμινοξέων με τα οποία αντιδρούν. Το ενεργοποιημένο ενδιάμεσο δέχεται πυρηνόφιλη προσβολή από την α-αμινομάδα του επόμενου αμινοξέος προς σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού. Η ουσία που χρησιμοποιήθηκε για την ενεργοποίηση έχει υποστεί υδρόλυση. Η ενέργεια αυτή θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την ενέργεια υδρόλυσης του πεπτιδικού δεσμού, ώστε η αντίδραση να κατευθυνθεί προς το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού. Για το λόγο αυτό έχουν προταθεί πολλοί τρόποι ενεργοποίησης της καρβοξυλομάδας και την μετατροπή της υδροξυλομάδας σε καλή αποχωρούσα ομάδα από το τετραεδρικό ενδιάμεσο που προκύπτει κατά την πυρηνόφιλη προσβολή της αμινομάδας. Οι κυριότεροι παράγοντες για την επιλογή της καταλληλότερης μεθόδου σύζευξης κατά τη σύνθεση πεπτιδίων είναι οι ακόλουθοι: (i) ο γρήγορος σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού, (ii) η υψηλή απόδοση, (iii) η απουσία παράπλευρων αντιδράσεων, (iv) η απλή διαδικασία καθαρισμού του προϊόντος και (v) η αποτροπή της ρακεμίωσης. Οι κυριότερες μέθοδοι για την δημιουργία του αμιδικού δεσμού είναι η μέθοδος των αζιδίων, των καρβοδιϊμιδίων και των ανυδριτών. A2.3.1 Μέθοδος Αζιδίων Η μέθοδος πρωτοεφαρμόστηκε το 1902 και σήμερα χρησιμοποιείται περιορισμένα, κυρίως στη σύζευξη πεπτιδικών κλασμάτων, λόγω χαμηλού ποσοστού ρακεμίωσης. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε τρία στάδια. Αρχικά τα Ν α -προστατευμένα αμινοξέα ή πεπτιδικά κλάσματα μετατρέπονται σε υδραζίδια και στη συνέχεια αντιδρούν με νιτρώδη παράγωγα για παραγωγή 21

39 αζιδίων. Τελικά, η αντίδραση του αζιδίου με την αμινομάδα του αμινο-συστατικου οδηγεί σε σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ο σχηματισμός αμιδίου κατά τη διάρκεια παρασκευής του αζιδίου και η μετάθεση Curtius [30]. Το προϊόν της τελευταίας είναι ισοκυανικοι εστέρες οι οποίοι αντιδρώντας με το αμινο-συστατικό δίνουν παράγωγα ουρίας, παρεμποδίζουν την παραλαβή των πεπτιδίων. A2.3.2 Μέθοδος Ανυδριτών Η χρήση ανυδριτών των Ν α - προστατευμένων αμινοξέων βρίσκει εφαρμογή στην πεπτιδική σύνθεση. Οι συμμετρικοί ανυδρίτες χρησιμοποιούνται ως ενεργά καρβοξυπαράγωγα κυρίως στην Βοc/ΒzΙ μεθοδολογία σύνθεσης πεπτιδίων. Συνήθως παρασκευάζονται με επίδραση DCC ή DIC σε διάλυμα του αντίστοιχου αμινοξέος και αποτελούν ισχυρά ακυλιωτικά μέσα. Υπάρχουν όμως μειονεκτήματα όπως α) το υψηλό ποσοστό ρακεμίωση και β) στην πεπτιδική αλυσίδα εισάγεται η μισή ποσότητα του αρχικά χρησιμοποιούμενου Ν α -προστατευμένου αμινοξέος. Οι μικτοί καρβονικοί ανυδρίτες [31, 32] χρησιμοποιούνται κυρίως στην υγρή φάση ως ενεργοποιημένα αντιδραστήρια σύζευξης. A2.3.3 Μέθοδος Καρβοδιιμιδίων Με την ανακάλυψη του Ν,Ν -δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμιδίου (DCC) [33, 30] στα μέσα της δεκαετίας του 50 η μέθοδος των καρβοδιιμιδίων χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για τη σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση. Τα πιο δημοφιλή αντιδραστήρια για το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού αποτελούν το DCC σε συνδυασμό με το πυρηνόφιλο 1-υδροξυ-βενζο-τριαζόλιο (HOBt) [34]. Ο μηχανισμός δράσης περιλαμβάνει το σχηματισμό του ενεργού ενδιαμέσου της Ο-ακυλισοουρίας το οποίο είναι ισχυρό ακυλιωτικό μέσο και μπορεί να υποστεί πυρηνόφιλη προσβολή από την α- αμινομάδα ενός αμινοξέος οδηγώντας στο σχηματισμό του επιθυμητού πεπτιδίου. Επιπλέον, μπορεί να δημιουργήσει ενεργοποιημένα καρβοξυ-παράγωγα, συμμετρικούς ανυδρίτες και ενεργούς εστέρες, αλλά και να υποστεί ενδομοριακό μετασχηματισμό προς Ν-ακυλουρία η οποία μειώνει την απόδοση και δημιουργεί προβλήματα στον τελικό καθαρισμό. Μειονεκτήματα από την χρήση DCC είναι ο σχηματισμός της αδιάλυτης Ν,Ν'-δικυκλοεξυλουρίας (DCU) που διαχωρίζεται δύσκολα από το επιθυμητό προϊόν καθώς και η αλλεργιογόνος δράση του. 22

40 Σχήμα 6: Δημιουργία πεπτιδικού δεσμού με τη χρήση DCC/HOBt. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται καρβοδιιμίδια, των οποίων η παραγόμενη ουρία είναι ευδιάλυτη στους οργανικούς διαλύτες, όπως το Ν,Ν'-διισοπροπυλοκαρβιδιιμίδιο (DIC) [35], το N'- μεθυλοκαρβοδιιμίδιο, το Ν-τριτοταγές βουτυλο, το Ν'-αιθυλοκαρβοδιιμίδιο και το Ν-αιθυλο, Ν'[3-(διμεθυλο) προπυλο] καρβοδιιμίδιο (EDC). Σχήμα 7: Ν,Ν'-διισοπροπυλοκαρβιδιιμίδιο (DIC) Το πρόβλημα της ρακεμίωσης αντιμετωπίζεται επίσης, με τη χρήση πρόσθετων πυρηνόφιλων αντιδραστηρίων για τη δημιουργία ενεργών εστέρων. Ένα από τα πλέον διαδεδομένα αντιδραστήρια της κατηγορίας αυτής είναι το HOBt που οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις και χαμηλότερα επίπεδα ρακεμίωσης. Το HOBt, ως ασθενές οξύ, εμποδίζει την απόσπαση πρωτονίου από το ασύμμετρο άτομο άνθρακα του καρβόξυ- συστατικού μειώνοντας ακόμη περισσότερο την πιθανότητα ρακεμίωσης [36, 37, 38]. 23

41 Σχήμα 8: 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο (HOBt) Τα παραπάνω αντιδραστήρια προσβάλλουν το ενδιάμεσο της ακυλισοουρίας και σχηματίζουν έναν ενεργό εστέρα περιορίζοντας έτσι τον σχηματισμό Ν-ακυλουρίας. Ο σχηματισμός της αδιάλυτης δικυκλοεξυλουρίας (DCU) είναι το κυριότερο μειονέκτημα της χρήσης του DCC. A2.3.4 Μέθοδος φωσφορικών ουρανικών παραγώγων [36, 39]. Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκε μια σειρά αντιδραστηρίων με δυνατότητα in situ δημιουργίας ενεργών εστέρων. Τέτοια αντιδραστήρια είναι το το εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ-τρις(διμεθυλαμινο)- φωσφονίου (BOP) και το εξαφωσφορικό άλας της 2-(1Hβενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3- τετραμεθυλουρίας (HBTU) το οποίο έχει αντικαταστήσει το τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1H- βενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3- τετραμεθυλουρίας (TBTU). Τα αντιδραστήρια αυτά αντιδρούν μόνο με καρβοξυλικά ανιόντα γι αυτό είναι απαραίτητη η προσθήκη μιας οργανικής βάσης στο μίγμα της αντίδρασης. Συνηθισμένες βάσεις που οδηγούν σε ελαχιστοποίηση της ρακεμίωσης είναι η Ν,Ν-διϊσοπροπυλοαιθυλαμίνη (DIPEA) και η 2,3,5- τριμεθυλοπυριδίνη. Οι βασικές συνθήκες στις οποίες πραγματοποιείται η ενεργοποίηση και σύζευξη οδηγούν σε ταχύτατες συζεύξεις αυξάνοντας όμως τον κίνδυνο ρακεμίωσης. Για την αποφυγή της ρακεμίωσης γίνεται συνήθως χρήση HOBt ή HOAt. Εξαιτίας των πλεονεκτημάτων που παρουσιάζουν τα συγκεκριμένα αντιδραστήρια (ευκολία χρήσης, εφαρμογή σε υγρή και στερεά φάση, ολοκλήρωση των αντιδράσεων σε σύντομο χρόνο και σχετικά υψηλές αποδόσεις) η χρήση τους τα τελευταία χρόνια παρουσιάζει αλματώδη αύξηση. A2.4 Παράπλευρες αντιδράσεις στην πεπτιδική σύνθεση Κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης υπάρχει πιθανότητα να λάβουν μέρος κάποιες παράπλευρες αντιδράσεις. Αυτές μπορεί να συμβούν κατά την διάρκεια της ενεργοποίησης, της 24

42 σύζευξης ή της αποπροστασίας. Κάποια από τα συνηθέστερα προβλήματα κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης είναι τα εξής: i. Ρακεμίωση Η ρακεμίωση είναι η παραγωγή ρακεμικού μίγματος, δηλαδή ο σχηματισμός των δύο εναντιομερών (οπτικοί αντίποδες ή και διαστερεομερών), μίας ουσίας. Τα διαστερεομερή μεταξύ τους παρουσιάζουν λειτουργικές διαφορές π.χ. την κατεύθυνση στροφής του πολωμένου στο επίπεδο φωτός άρα είναι εύλογο ότι θα παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές και στη λειτουργικότητά τους. Ο διαχωρισμός των διαστερεομερών από το ρακεμικό μίγμα στα δύο συστατικά του και η παραλαβή του επιθυμητου διαστερεομερούς, είναι εξαιρετικά δύσκολος και πολύπλοκος. Η ανάγκη να κατευθύνουμε την αντίδραση και να παρασκευάσουμε το σωστό εναντιομερές του πεπτιδίου, γίνεται επιτακτική. Στην πεπτιδική σύνθεση η ρακεμίωση ευνοείται όταν χρησιμοποιούνται ισχυρές βάσεις σε αυξημένες ποσότητες και πολικοί διαλύτες. Οι βασικοί μηχανισμοί ρακεμίωσης στην πεπτιδική σύνθεση είναι: Α) Μέσω σχηματισμού οξαζολόνης (αζλακτόνη) Αποτελεί και τον σημαντικότερο μηχανισμό ρακεμίωσης. Το όξινο πρωτόνιο της οξαζολόνης μπορεί να αποσπασθεί από βάσεις από το χειρόμορφο κέντρο παρέχοντας το σταθερό, λόγω συντονισμού, καρβανιόν [40]. Σχήμα 9: Ρακεμίωση μέσω οξαζολόνης [41]. Β) Απευθείας απόσπαση του α-πρωτονίου 25

43 Από το α-άτομο άνθρακα ενός αμινοξέος με επίδραση βάσης αποσπάται το α-πρωτόνιο, αφού το σχηματιζόμενο καρβανιόν μπορεί να πρωτονιωθεί και από τις δύο πλευρές [42]. ii. Οξείδωση της μεθειονίνης Το αμινοξύ μεθειονίνη παρουσιάζει σαν παράπλευρη αντίδραση την οξείδωση του θειοαιθέρα της προς σουλφοξείδιο. Μπορεί να συμβεί είτε κατά τη διάρκεια της αποπροστασίας του πεπτιδίου είτε κατά την παραμονή του πεπτιδίου σε διάλυμα που είναι εκτεθειμένο στον ατμοσφαιρικό αέρα. Η μετατροπή του σουλφοξειδίου σε θειοαιθέρα γίνεται με κατεργασία του πεπτιδίου με NH 4 I/TFA [43]. iii. Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης Κατά την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας, η προσθήκη του τρίτου αμινοξέος (ή ενός πεπτιδίου) σε ένα διπεπτίδιο μπορεί, υπό συνθήκες, να εμφανίσει πρόβλημα. Οι εστέρες των διπεπτιδίων υφίστανται αυθόρμητη κυκλοποίηση και παράγουν 2,5 δικετοπιπεραζίνες. Η οδηγούσα δύναμη (driving force) για το μετασχηματισμό αυτό είναι η δημιουργία του πολύ σταθερού δακτυλίου της δικετοπιπεραζίνης. Η αντίδραση ευνοείται ιδιαίτερα στα πεπτίδια που περιέχουν γλυκίνη και προλίνη. Ο σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης ευνοείται επίσης στην περίπτωση όπου το ένα αμινοξύ είναι L και το άλλο D στερεοχημικής διάταξης. Υψηλές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων αυξάνουν την ταχύτητα της επιθυμητής αντίδρασης σύζευξης και μειώνουν το βαθμό της κυκλοποίησης [44]. Σχήμα 10: Μηχανισμός σχηματισμού δικετοπιπεραζινών iv. Σχηματισμός νιτριλίου Κατά την ενεργοποίηση της Asn και όταν δεν είναι προστατευµένο το πλευρικό αµίδιο µπορεί να σχηµατιστεί νιτρίλιο. Για την αποφυγή του προτείνεται η χρήση προσχηµατισµένων ενεργών εστέρων, όπως Fmoc-Asn-OPfp ή η χρήση πλευρικής προστασίας. 26

44 v. Σχηµατισµός δ-λακτάµης Κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης µπορεί το Ν δ της Arg να προσβάλει την ενεργοποιηµένη καρβοξυλοµάδα σχηµατίζοντας δ-λακτάµη (κυρίως όταν έχουµε συµµετρικό ανυδρίτη της Arg, ενώ το HOBt εµποδίζει το σχηµατισµό της) [45]. vi. Αλκυλιώσεις κατά την αποπροστασία Τα κατιόντα που δηµιουργούνται κατά την αποµάκρυνση των πλάγιων προστατευτικών οµάδων προσβάλλουν τις δραστικές πλευρικές οµάδες των αµινοξέων, όπως της Trp, Tyr και Met. Για την αποφυγή των παράπλευρων αυτών αντιδράσεων, χρησιµοποιούνται στο διάλυµα αποπροστασίας κατάλληλες ενώσεις (scavengers) που δεσµεύουν τα ηλεκτρόφιλα είδη που παράγονται [45]. A2.5 Έλεγχος δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού με test Kaiser Η συνηθέστερη μέθοδος για την ανίχνευση των πρωτοταγών αλειφατικών αμινών είναι η δοκιμή Kaiser. Στη δοκιμή αυτή οι κόκκοι της ρητίνης κατεργάζονται με διάλυμα νινυδρίνης, φαινόλης και κυανιούχου καλίου. Μετά από θέρμανση στους 100 ο C η παρουσία ελεύθερης αμίνης ταυτοποιείται από το μπλε χρώμα (Ruhemanns blue) του διαλύματος και των κόκκων [46]. 27

45 Σχήμα 11: Αντίδραση νινυδρίνης στην δοκιμή Kaiser. A2.6 Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης A2.6.1 Σύνθεση σε υγρή φάση Όλες οι διεργασίες ανοικοδόμησης της αλυσίδας λαμβάνουν χώρα σε διάλυμα. Τα ενδιάμεσα προϊόντα μπορούν να απομονωθούν και να ταυτοποιηθούν, με αποτέλεσμα τη λήψη καθαρού τελικού προϊόντος. Η τεχνική όμως είναι χρονοβόρα και επίπονη, κυρίως για μεγάλου μήκους πεπτίδια. Μπορεί επίσης να υπάρξουν προβλήματα δυσδιαλυτότητας των ενδιαμέσων προϊόντων. A2.6.2 Σύνθεση σε στερεή φάση Η μέθοδος της σύνθεσης σε στερεά φάση αποτελεί σταθμό στην πεπτιδική χημεία. Περιγράφηκε πρώτη φορά από τον Merrifield. Το 1963 ανέπτυξε την αυτοματοποιημένη διαδικασία με σκοπό να απλοποιηθεί η χρονοβόρα και επίπονη σύνθεση της σταδιακής ανοικοδόμησης. Αρχικά, γίνεται ομοιοπολική δέσμευση του C-τελικού αμινοξέος σε μια χαρακτηριστική ομάδα ενός αδιάλυτου, στερεού υποστρώματος (πολυμερές). Στη συνέχεια, πραγματοποιούνται 28

46 επαναλαμβανόμενες διεργασίες απομάκρυνσης της Ν α -προστατευτικής ομάδας και σύζευξης με το επόμενο αμινοξύ. Οι εκπλύσεις σε κάθε κύκλο είναι αρκετές, ώστε να απομακρυνθούν με κατάλληλους διαλύτες οι περίσσειες αντιδραστηρίων και τυχόν παραπροϊόντα και για να προετοιμαστεί η ρητίνη για το επόμενο στάδιο. Στο τέλος της σύνθεσης, το προϊόν αποδεσμεύεται από τη ρητίνη και τις προστατευτικές ομάδες και μπορεί να ταυτοποιηθεί. Η μέθοδος είναι πιο εύκολη και γρήγορη από τη σύνθεση σε υγρή φάση [47]. Σύμφωνα με την χρήση της παροδικής προστασίας της Ν α -αμινομάδας κάθε αμινοξέος καθώς και την παρουσία πλευρικών προστατευτικών ομάδων η σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο κυρίως τεχνικές, την Boc/Bzl και την Fmoc/tBu [48, 49, 50]. Boc/Bzl μέθοδος Μία από τις βασικές αρχές της μεθόδου περιλαμβάνει την σύνδεση του πρώτου αμινοξέος στο στερεό υπόστρωμα μέσω του σχηματισμού βενζυλεστέρα. Προσωρινή προστασία χρησιμοποιείται η τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc). Η απομάκρυνσή της επιτυγχάνεται με χρήση τριφθοροξικού οξέος (TFA) ή με χρήση διαλύματος TFA σε διχλωρομεθάνιο (DCM). Μόνιμες προστατευτικές ομάδες χρησιμοποιούνται οι βενζύλ τύπου ομάδες όπως η βενζυλομάδα (Bzl). Η απομάκρυνση του πεπτιδίου από την ρητίνη καθώς και η απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων επιτυγχάνεται με χρήση υδροφθορίου (HF). Η μέθοδος αυτή ονομάζεται και μέθοδος Merrifield γιατί βασίζεται στην πρώτη σύνθεση σε στερεά φάση. Η τεχνική σύνθεσης έχει βελτιωθεί τόσο στη χρησιμοποίηση ρητινών, όσο και στη χρησιμοποίηση προστατευτικών ομάδων και τεχνικών απομάκρυνσης από την ρητίνη. Η μέθοδος αυτή παρουσιάζει μειονεκτήματα τα οποία έχουν σχέση με τη χρήση του ιδιαίτερα επικίνδυνου HF για την απόσπαση του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα, ενώ η παρασκευή προστατευμένων πεπτιδίων παρουσιάζει δυσκολίες. Η Boc/Bzl μέθοδος σήμερα βρίσκει περιορισμένη χρήση [51, 48, 49]. Fmoc/tBu μέθοδος Σε αντίθεση με την προηγούμενη μέθοδο, η Fmoc/tBu μέθοδος έχει το πλεονέκτημα ότι η απομάκρυνση της Ν α -άμινο-προστατευτικής ομάδας γίνεται σε βασικές συνθήκες. Έτσι χρησιμοποιείται η 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβόνυλο ομάδα(fmoc) [41], η οποία απομακρύνεται με διάλυμα 20-25% πιπεριδίνης σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF). Τόσο οι ρητίνες όσο και οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες που χρησιμοποιούνται είναι ευαίσθητες έναντι των οξέων και μάλιστα σε ηπιότερες συνθήκες σε σχέση με την Boc/Bzl μέθοδο. Η απόσπαση του πεπτιδίου από 29

47 το στερεό υπόστρωμα όπως και η πλήρης απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων επιτυγχάνεται συνήθως με διάλυμα 95% TFA [52]. Σχήμα 12: Τα στάδια της πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση. Για την παρασκευή προστατευμένων πεπτιδίων μπορεί να επιλεχτεί τέτοιο στερεό υπόστρωμα, ώστε η απομάκρυνσή του από το πεπτίδιο να γίνεται σε ασθενείς όξινες συνθήκες χωρίς να επηρεάζονται καθόλου οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι τέτοια ώστε προτιμάται έναντι της Boc/Bzl μεθόδου. A2.6.3 Αδιάλυτο στερεό υπόστρωμα Το πολυμερές υπόστρωμα παίζει σπουδαίο ρόλο στην επιτυχία της μεθόδου σύζευξης σε στερεή φάση. Βασικά κριτήρια που καθορίζουν την καταλληλότητα του υποστρώματος είναι: 30

48 η μηχανική αντοχή, η καλή διόγκωση σε διαλύτες που χρησιμοποιούνται ευρέως στην πεπτιδική σύνθεση η εύκολη πρόσβαση στα ενεργά κέντρα του πολυμερούς από αντιδραστήρια. Ο όρος στερεό δεν αρμόζει απόλυτα στα πολυμερή που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση. Μπορούν να χαρακτηριστούν καλύτερα ως πηκτώματα που διογκώνονται και αποδιογκώνονται σε μεγάλο βαθμό με διάφορους διαλύτες. Σε ένα καλά διογκωμένο πολυμερές τα αντιδραστήρια διαχέονται στο εσωτερικό των πόρων του επιτυγχάνοντας τοπικά υψηλές συγκεντρώσεις που εξασφαλίζουν την πρόοδο των αντιδράσεων και μάλιστα με μεγάλες ταχύτητες. Το πολυμερές που χρησιμοποιείται ευρύτατα στην πεπτιδική σύνθεση είναι ένα συμπολυμερές πολυστυρολίου και διβινυλοβενζολίου (PS-DVB). Η χαρακτηριστική ομάδα κάθε ρητίνης είναι αυτή που τη διαφοροποιεί από όλες τις υπόλοιπες. Έτσι ανάλογα με τη μεθοδολογία που επιλέγεται για σύνθεση των πεπτιδίων, χρησιμοποιείται και ο κατάλληλος τύπος ρητίνης [53]. Μία από τις πιο σημαντικές ρητίνες [54, 55, 56, 57, 58, 59] που χρησιμοποιούνται είναι η 2- χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη (CLTR-Cl), η οποία συνδυάζεται με την Fmoc/tBu μεθοδολογία. Είναι ιδανική για τη σύνθεση τόσο ελεύθερων πεπτιδίων όσο και προστατευμένων με μεγάλη απόδοση και υψηλή καθαρότητα των τελικών προϊόντων. Σχήμα 13: Δομή της 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνης. A2.6.4 Προστασία πλευρικών ομάδων αμινοξέων Όπως αναφέρθηκε παραπάνω τα αμινοξέα στις πλευρικές τους ομάδες μπορεί να περιέχουν δραστικές ομάδες. Για την αποφυγή της συμμετοχής τους στις αντιδράσεις και συνεπώς δημιουργία παραπροϊόντων κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, είναι απαραίτητη προστασίας τους. 31

49 Στην Fmoc/tBu μέθοδο σύνθεσης, οι πλευρικές προστασίες που χρησιμοποιούνται είναι tbu τύπου. Η επιλογή της κατάλληλης προστασίας γίνεται με βάση τόσο από την πλευρική ομάδα του αμινοξέος όσο και από τις συνθήκες αποπροστασίας του. Πίνακας 2: Σημαντικότερες πλευρικές προστατευτικές ομάδες στην μεθοδολογία και οι συνθήκες απομάκρυνσης τους. Δραστική ομάδα Χημικός τύπος Συνθήκες Αποπροστασίας Τριτυλομάδα Trt 90% v/v TFA, 30-60min [60] 50% v/v TFA in CH2Cl2, 30min [61] Τριτυλομάδα Trt 90% v/v TFA, 30-60min [62] Τριτυλομάδα Trt 4-μεθοξυ-τριτυλομαδα Mmt 0,5% v/v TFA in CH 2 Cl 2 /TES(95:5), 30-60min [63] 3% TFA, 5-10min [64] 32

50 Δραστική ομάδα Χημικός τύπος Συνθήκες Αποπροστασίας tert-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα Boc 90% v/v TFA, 30min 1% v/v TFA in CH 2 Cl 2, 30min [65] 4-μεθόξυ-τριτυλομάδα Mtt 2,2,5,7,8- πενταμέθυλχρομαν-6- σουλφονυλ-ομάδα Pmc 50%v/v TFA in CH 2 Cl 2, 1h TFA/Ανισόλη (9:1), 30min [66] TFA/Ανισόλη/EDT/EMS (95:3:1:1), 1,5h [67] 2,2,4,6,7-πενταμεθυλ- διυδρο-βενζοφουραν-5- σουφλονυλ-ομάδα Pbf 90% v/v TFA, 30min [68] tert-βουτυλομάδα tbu 90% v/v TFA, 30min [69] 1-5% v/v TFA in CH 2 Cl 2 2-5min Τριτυλομάδα Trt 33

51 A2.7 Κυκλικά πεπτίδια Πολλές φορές απαντώνται πεπτίδια με κυκλική ή πολυκυκλική μορφή. Η κυκλική δομή τους μπορεί να οφείλεται σε οξείδωση της κυστεΐνης και σχηματισμό δισουλφιδικού δεσμού ή λόγω μετασχηματισμού των αμιδικών δεσμών κ.ά.. Η κυκλοποίηση των γραμμικών πεπτιδίων που συναντούμε στη φύση, συνήθως σε κατώτερους οργανισμούς και φυτά, χρησιμοποιείται συνήθως για τη σύνθεση πιο σταθερών αναλόγων. Η δημιουργία κυκλικών πεπτιδίων έχει αποδειχθεί χρήσιμη για την ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών πεπτιδικών αναλόγων καθώς μειώνει την διαμορφωτική ελευθερία των εύκαμπτων γραμμικών μορίων. Η περιορισμένη δομική ευλυγισία αυξάνει την εκλεκτική τους συγγένεια με διάφορες κοιλότητες στους υποδοχείς, εγκλωβίζοντάς τα στο εσωτερικό τους προστατεύοντάς τα από τη δράση των πρωτεολυτικών ενζύμων [70]. Οι στρατηγικές για τη σύνθεση κυκλικών πεπτιδίων είναι: κυκλοποίηση μεταξύ των δύο τελικών ομάδων του πεπτιδίου (head-to-tail), μεταξύ πλευρικής ομάδας της πεπτιδικής αλυσίδας και του τελικού άκρου (head-to-side chain, side chain-to-tail) και μεταξύ δύο πλευρικών ομάδων της πεπτιδικής αλυσίδας (side chain-to-side chain). Η τελευταία μέθοδος, μεταξύ δύο πλευρικών ομάδων της πεπτιδικής αλυσίδας, περιλαμβάνει και το σχηματισμό των γεφυρών θείου μεταξύ δύο πλευρικών ομάδων θείου της κυστεΐνης [71]. Σε στερεά φάση η κυκλοποίηση προϋποθέτει την πρόσδεση του πρώτου αμινοξέος πάνω στον φορέα δια μέσω της πλευρικής του ομάδας και χαρακτηρίζεται από τα εξής στάδια: 1. Η πλευρική του ομάδα του αρχικά προστατευμένου αμινοξέος προσδένεται στο πολυμερές, 2. Προοδευτική σύνθεση της γραμμικής αλληλουχίας του πεπτιδίου, 3. Εκλεκτική αποπροστασία των αμινοξέων μεταξύ των οποίων θα γίνει η κυκλοποίηση (για την head-to-side chain η αποπροστασία αφορά την αποπροστασία ενός ενδιάμεσου αμινοξέος με πλευρική ομάδα με άμινο- ή καρβόξυ ομάδα και της C- τελικής καρβοξυλομάδας ή της Ν- τελικής αμινομάδας αντίστοιχα), 4. Αποτελεσματική ενεργοποίηση της καρβόξυ ομάδας και συμπύκνωσή της με την ελεύθερη αμινομάδα, με αποτέλεσμα το κλείσιμο του επιθυμητού δακτυλίου, 5. Τελική αποπροστασία και απελευθέρωση του τελικού κυκλικού πεπτιδίου από το πολυμερές. 34

52 A3 Βιοδιασπώμενα συστήματα με βάση τα συμπολυμερή γαλακτικού - A3.1 Γενικά γλυκολικού οξέος Ένα μεγάλο πλήθος πολυμερών έχουν μελετηθεί για φαρμακευτική χρήση. Τα περισσότερο μελετημένα είναι το πολύ(γαλακτικό οξύ), PLA και τα συμπολυμερή του με γλυκολικό οξύ, PLGA. Από αυτά μπορούν να παρασκευαστούν νανο- και μικρό- σφαίρες για την χορήγηση φαρμάκων. Το γλυκολικό και το γαλακτικό οξύ είναι τα κοινά ονόματα των δύο πρώτων α- υδροξυκαρβοξυλικών οξέων. Το γαλακτικό οξύ περιέχει ένα ασύμμετρο άτομο άνθρακα και επομένως έχει δύο οπτικά ισομερή D(-) και L(+). Σχήμα 14: Δομή γλυκολικού (αριστερά) και γαλακτικού (δεξιά) οξέος. Κυκλικά διμερή αυτών μπορούν να συντεθούν με αφυδάτωση των μονομερών και ονομάζονται γαλακτίδιο (lactide, LE) και γλυκολίδιο (glycolide, GE). Τα κυκλικά διμερή είναι λευκά υγροσκοπικά υλικά τα οποία υδρολύονται παρουσία υγρασίας [72, 73, 74] Α3.2 Συμπολυμερή πολύ (γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA) Τα συμπολυμερή γαλακτικού και γλυκολικού οξέος είναι βιοαποικοδομήσιμα και βιοσυμβατά πολυμερή και έχουν εγκριθεί για την χρήση τους στον άνθρωπο σαν εμφυτεύματα, για παρατεταμένη αποδέσμευση φαρμάκων αλλά και σε εμβόλια αντιγόνων σε σωματιδιακή μορφή. Το αντιγόνο μπορεί είτε να εγκλωβιστεί στο εσωτερικό του σωματιδίου είτε να απορροφηθεί από την επιφάνειά του. Εν συνεχεία, η διαδικασία της αποικοδόμησης έχει ως αποτέλεσμα την βραδεία αποδέσμευση του αντιγόνου. Η χρήση των πολυμερικών μικροσωματιδίων με εγκλωβισμένο το αντιγόνο γίνεται ολοένα και εκτενέστερη στη χορήγηση αντιγόνων καθώς προστατεύουν τις αντιγονικές πρωτεΐνες, τα 35

53 πεπτίδια ή το DNA από την άμεση αποικοδόμηση ενώ ταυτόχρονα παρέχουν την ικανότητα ελέγχου της βραδείας αποδέσμευσης για αρκετά μεγάλο διάστημα in vivo. Α3.3 Χαρακτηριστικά των PLGA συμπολυμερών Οι ιδιότητες των PLGA συμπολυμερών εμφανίζουν μεγάλο εύρος ανάλογα με την σύστασή τους, ανάλογα δηλαδή με την αναλογία γαλακτικού-γλυκολικού οξέος στο μόριό τους, την στερεοχημεία του γαλακτικού οξέος και το μοριακό βάρος. Το μεγάλο εύρος στις ιδιότητες τους σε συνδυασμό με την βιοσυμβατότητα και την ικανότητα βιοδιάσπασής τους τα καθιστά χρήσιμα σε ποικιλία βιοϊατρικών εφαρμογών [75, 76]. Διαλυτότητα Τα PLGA συμπολυμερή είναι διαλυτά στους οργανικούς διαλύτες διευκολύνοντας τη διαμόρφωσή τους σε μορφές χορήγησης φαρμάκων. Συγκεκριμένα το πολύ (γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ με ποσοστό μονάδων γλυκολικού οξέος λιγότερο από 50%, είναι διαλυτά στην ακετόνη, τον οξικό μεθυλεστέρα, το τετραϋδροφουράνιο και σε χλωριωμένους υδρογονάνθρακες. Αντίθετα συμπολυμερή πλούσια σε μονάδες γλυκολικού οξέος είναι υλικά δυσδιάλυτα στους κοινούς οργανικούς διαλύτες και ο χειρισμός τους απαιτεί ειδικούς διαλύτες όπως η εξαφθοροισοπροπανόλη (HFIP). Μοριακό Βάρος Τα μόρια ενός πολυμερικού υλικού δεν έχουν όλα την ίδια μάζα. Το πολυμερές αποτελείται από αλυσίδες διαφόρων μεγεθών με αποτέλεσμα η πειραματική μέτρηση του μοριακού βάρους να αντιπροσωπεύει μια μέση τιμή. Οι διάφορες τιμές του μοριακού βάρους λαμβάνονται ανάλογα με την ιδιότητα στην οποία βασίζεται η μέθοδος μέτρησης. Για παράδειγμα, μπορεί να βασίζεται σε μεγέθη που εξαρτώνται από των αριθμό των μορίων του πολυμερούς στο δείγμα, στη μέτρηση της διάθλασης του φωτός σε διάλυμα του πολυμερούς ή με βάση το ιξώδες. Μηχανικές Ιδιότητες Η διαδικασία πολυμερισμού, η στερεοχημεία του παραγόμενου πολυμερούς καθώς και η σύστασή του και το μοριακό του βάρος καθορίζουν τη μηχανική αντοχή των PLGA συμπολυμερών. Η ελαστικότητα και η ενέργεια που απαιτείται για την θραύση των υμενίων πολύ 36

54 (γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος φαίνεται να σχετίζονται με το μοριακό βάρος. Η συσχέτιση αυτή δείχνει να αυξάνει την αντοχή τούς όσο αυξάνεται το μοριακό βάρος των πολυμερών [77]. Βιοδιάσπαση Τα προϊόντα βιοδιάσπασης των PLGA συμπολυμερών όπως αναφέρθηκε, είναι το γαλακτικό και το γλυκολικό οξύ, τα οποία μπορούν να απομακρυνθούν από τον οργανισμό μέσω του κύκλου του Krebs. Η βιοδιάσπαση τους γίνεται σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο της βιοδιάσπασης πραγματοποιείται μη ειδική υδρόλυση των εστερικών δεσμών. Το στάδιο αυτό φαίνεται να αυτοκαταλύεται από τις ελεύθερες καρβοξυλομάδες που δημιουργούνται με την λύση των δεσμών. Το δεύτερο στάδιο χαρακτηρίζεται από την έναρξη απώλειας μάζας από το πολυμερές και από την αύξηση του ρυθμού υδρόλυσης. Η υδρόλυση των εστερικών δεσμών συμβαίνει με τον ίδιο μηχανισμό in vivo και in vitro, κάτι που υποδεικνύει ότι στο στάδιο αυτό δεν αναμειγνύεται η δράση ενζύμων [78, 79] ενώ αντίθετα στο δεύτερο στάδιο η παρουσία κάποιων ενζύμων φαίνεται να επιταχύνει τη διάσπασή τους [80, 81]. Ο ρυθμός βιοδιάσπασης που απαιτείται ποικίλει ανάλογα με την σύσταση και το μοριακό βάρος από 1 μήνα έως 2 χρόνια και αυξάνεται με την αύξηση του μοριακού βάρους ενώ αξίζει να σημειωθεί ότι η αύξηση των μονάδων γλυκολικού οξέος φαίνεται να μειώνει τον ρυθμό βιοδιάσπασής τους [82]. Α3.4 Συστήματα χορήγησης φαρμάκων με βάση τα PLGA συμπολυμερή Τα συμπολυμερή πολυ (γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος είναι από τα πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενα πολυμερικά υλικά σε βιοϊατρικές εφαρμογές. Τα συμπολυμερή αυτά χρησιμοποιούνται για την παρασκευή ιατρικών βοηθημάτων στη χειρουργική (π.χ. βιοαπορροφούμενα ιατρικά ράμματα) και ορθοπεδική (βιοαπορροφούμενες λάμες, βίδες κ.λπ. σε αντικατάσταση των μεταλλικών), καθώς και για τη διαμόρφωση βιοδιασπώμενων συστημάτων χορήγησης βιοδραστικών παραγόντων. Μεγάλη εφαρμογή επίσης, φαίνεται να βρίσκουν στην χορήγηση πεπτιδίων και πρωτεϊνών καθώς η χρήση πρωτεϊνών ή πεπτιδίων ως δραστικών ουσιών περιορίζεται λόγω του μικρού χρόνου ζωής που παρουσιάζουν μετά τη χορήγησή τους στο σώμα. Για την παράταση της θεραπευτικής δράσης τέτοιων βιολογικών δραστικών μορίων όπως τα πεπτίδια και οι πρωτεΐνες έχει προταθεί ο εγκλωβισμός τους σε συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Αυτό επιτρέπει την παρατεταμένη χορήγηση τους για μεγάλο χρονικό διάστημα 37

55 αλλά και την προστασία τους από την διάσπαση μέσω ενζύμων που πιθανόν να υφίστανται στο σώμα. Το πολυ (γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ (PLGA) χρησιμοποιείται ευρύτατα σε εφαρμογές συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης και πολλά πεπτίδια και πρωτεΐνες έχουν επιτυχώς εγκλωβιστεί σε μικροσφαίρες ή εμφυτεύματα από PLGA [83, 84, 85]. Τέτοιο παράδειγμα είναι το υποδόριο σύστημα ελεγχόμενης χορήγησης του πεπτιδίου οξική γκοζερεζίνη, που αποτελεί συνθετικό ανάλογο της ορμόνης που ρυθμίζει την απελευθέρωση της ωχρινοποιητικής ορμόνης, LHRH και χρησιμοποιείται σήμερα για την αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη [86]. Τα τελευταία χρόνια τα πολυμερικά συστήματα θεωρούνται καλοί υποψήφιοι για την χορήγηση αντιγόνων και ιδιαίτερα για την επίτευξη ανοσοποίησης με μία δόση (single-shot). Τα προβλήματα που παρουσιάζονται με την συχνή και επαναλαμβανόμενη χορήγηση, έδωσαν ώθηση για την ανάπτυξη εμβολίων βασισμένα σε τέτοια συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης [87]. Έτσι προτάθηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας η ανάπτυξη PLGA μικροσφαιρών που φέρουν αντιγόνα, ως τρόπος για την βελτιστοποίηση των μεθόδων ανοσοποίησης και τέτοια συστήματα αρχίζουν να παίρνουν έγκριση για τον κύκλο των κλινικών δοκιμών [88, 89]. Σχήμα 15: Πολυμερικά νανοσωματίδια με προσροφημένη (αριστερά) και εγκλωβισμένη (δεξιά) την δραστική ουσία και οι ιδιότητες επιφάνειάς τους. Προσαρμοσμένο από [90]. 38

56 Α3.5 Μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων Ο εγκλωβισμός βιοδραστικών ενώσεων σε νανοσωματίδια πραγματοποιείται με τη δημιουργία σωματιδίων με διάμετρο που κυμαίνεται από 1 έως 1000nm. Ο όρος νανοσωματίδιο είναι η γενική ονομασία των νανοσφαιρών και των νανοκαψακίων. Οι νανοσφαίρες έχουν δομή μιάς στερεής πολυμερικής μήτρας και οι βιοδραστικές ουσίες μπορούν είτε να προσροφηθούν στην επιφάνεια της σφαίρας είτε να εγκλωβιστούν στο εσωτερικό της. Τα νανοκαψάκια είναι κυστιδικά συστήματα, όπου η ουσία είναι περιορισμένη στο εσωτερικό του κυστιδίου σε ένα υγρό πυρήνα, ο οποίος περιβάλλεται από μία πολυμερική μεμβράνη. Η δραστική ουσία μπορεί και πάλι να είναι προσροφημένη στην επιφάνεια του κυστιδίου αν και συνήθως είναι εγκλωβισμένη στο εσωτερικό σε διαλυτή μορφή [91, 92, 93] Οι μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων κατηγοριοποιούνται σε δύο βασικές ομάδες ανάλογα με το αν η παρασκευή τους απαιτεί την επί τόπου πραγματοποίηση της αντίδρασης πολυμερισμού (in situ), ή με χρήση ήδη παρασκευασμένου πολυμερούς. Τα περισσότερα μονομερή που είναι κατάλληλα για πολυμερισμό σε υδατική φάση οδηγούν σε πολυμερή που βιοαποικοδομούνται αργά ή και καθόλου. Επιπλέον τα παραπροϊόντα από τον πολυμερισμό μπορεί να είναι τοξικά και να απαιτούν διαδικασίες καθαρισμού του υλικού. Για τους λόγους αυτούς προτιμάται συνήθως η χρήση των ήδη παρασκευασμένων πολυμερών και η παρασκευή των νανοσωματιδίων μπορεί να επιτευχθεί με μία από τις παρακάτω μεθόδους [94]. Οργανική φάση σε υδατική (oil-in-water, o/w) με εξάτμιση διαλύτη. Χρησιμοποιείται κυρίως για τον εγκλωβισμό λιπόφιλων μορίων. Το πολυμερές και το φάρμακο διαλύονται σε ένα πτητικό οργανικό διαλύτη, μη αναμίξιμο με το νερό. Η οργανική φάση γαλακτοματοποιείται με χρήση ομογενοποιητή ή υπερήχων, εντός μιας υδατικής φάσης. Ο οργανικός διαλύτης αφήνεται να εξατμιστεί σε ήπια ανάδευση παρουσία ή απουσία κενού και τα παραγόμενα νανοσωματίδια συλλέγονται και καθαρίζονται μέσω φυγοκέντρησης. Η χρήση του διχλωρομεθανίου ως οργανική φάση είναι μια καλή επιλογή καθώς έχει χαμηλό σημείο ζέσης (39,8 ο C) και η διαλυτότητά του στο νερό είναι ασήμαντη. Σαν επιφανειοδραστικό ή/και σταθεροποιητής συνήθως χρησιμοποιείται πολυβινυλική αλκοόλη (PVA). Έχει επισημανθεί ότι ο τύπος και η συγκέντρωση του επιφανειοδραστικού επηρεάζει την ποιότητα των νανοσωματιδίων, την ικανότητα εγκλωβισμού, την απελευθέρωση της ουσίας, την φαρμακοκινητική και την κυτταρική πρόσληψη/αλληλεπίδραση. 39

57 Υδατική φάση σε οργανική (water-in-oil,w/o) με διαχωρισμό φάσης. Το πολυμερές διαλύεται σε έναν οργανικό διαλύτη και στη συνέχεια αναμιγνύεται με το φάρμακο που είναι διαλυμένο σε μικρό όγκο υδατικής φάσης και οι δύο φάσεις γαλακτοματοποιούνται. Ένας επαγωγέας φάσης (π.χ. έλαιο σιλικόνης, φυτικό έλαιο) που δεν διαλύει το πολυμερές αλλά είναι αναμίξιμος με τον οργανικό διαλύτη, προστίθεται στο γαλάκτωμα για να δημιουργηθούν τα συσσωματώματα. Ο σχηματισμός των συσσωματωμάτων γύρω από την υδατική φάση και η σύντηξή τους αποτελεί τα πρώιμα PLGA σωματίδια. Το εναιώρημα υφίσταται κατεργασία με ένα οργανικό διαλύτη, όπως το επτάνιο και τα σωματίδια αρχίζουν να σχηματίζονται. Η μέθοδος αυτή παρέχει υψηλή απόδοση εγκλωβισμού υδρόφιλων ουσιών, λόγω της μη διαλυτότητας τους στους οργανικούς διαλύτες. Ωστόσο ο έλεγχος της συσσωμάτωσης είναι ιδιαίτερα δύσκολος ενώ και το κόστος είναι ιδιαίτερα υψηλό λόγω της χρήσης ελαίων σε μεγάλες ποσότητες [95]. Υδατική φάση σε οργανική σε υδατική (water-in-oil-in-water,w 1 /o/w 2 ) με εξάτμιση διαλύτη. Χρησιμοποιείται συνήθως για υδρόφιλες ουσίες όπως οι πρωτεΐνες και τα πεπτίδια. Η ουσία διαλύεται σε μικρή ποσότητα υδατικής φάσης ενώ το πολυμερές σε ένα πτητικό οργανικό διαλύτη. Στη συνέχεια γαλακτοματοποιείται η υδατική φάση με την οργανική. Στο γαλάκτωμα που παράχθηκε, προστίθεται ένας μεγαλύτερος όγκος υδατικής φάσης που περιέχει το επιφανειοδραστικό και γαλακτοματοποιείται εκ νέου, για την παραλαβή του τελικού γαλακτώματος. Οι διαλύτες αφήνονται να εξατμιστούν όπως και στην πρώτη μέθοδο και τα νανοσωματίδια συλλέγονται και καθαρίζονται μέσω φυγοκέντρησης. Στην μέθοδο αυτή, η απόδοση εγκλωβισμού φαρμάκων μικρού μοριακού βάρους είναι σχετικά χαμηλή λόγω της τάσης διαφυγής της ουσίας στην δεύτερη υδατική φάση. Οργανική φάση σε οργανική (oil-in-oil, ο 1 /o 2 ) με εξάτμιση διαλύτη. Το πολυμερές και η ουσία διαλυμένα σε ένα οργανικό διαλύτη, γαλακτοματοποιούνται με μια ελαιώδη φάση (έλαιο σιλικόνης, υγρή παραφίνη). Οι διαλύτες απομακρύνονται όπως στις προηγούμενες μεθόδους και ο καθαρισμός τους γίνεται με φυγοκέντρηση και έκπλυση με εξάνιο για την απομάκρυνση των ελαίων. Βιβλιογραφικές μελέτες δείχνουν ότι τα νανοσωματίδια που προκύπτουν από αυτήν την μέθοδο είναι μεγαλύτερα από αυτά μέσω της o/w μεθόδου [96, 97, 98]. Οργανική φάση σε υδατική (oil-in-water, o/w) με εξαλάτωση. Αυτή η τεχνική περιλαμβάνει τη γαλακτωματοποίηση του πολυμερούς και του φαρμάκου διαλυμένου σε οργανικό διαλύτη, σε ένα κορεσμένο ηλεκτρολυτικό υδατικό διάλυμα [99, 100]. Χρησιμοποιείται ένας οργανικός 40

58 διαλύτης αναμίξιμος με το νερό για την διασπορά των PLGA. Στη συνέχεια αναμιγνύεται με την υδατική και η επίδραση εξαλάτωσης αποτρέπει την ανάμιξη της οργανικής φάσης με την υδατική δημιουργώντας ένα σταθερό γαλάκτωμα. Επάγεται διαδικασία αντίστροφης εξαλάτωσης με την προσθήκη μεγάλης ποσότητας υδατικής φάσης προκαλώντας την διάχυση του αναμίξιμου με το νερό διαλύτη εκτός και σταγονίδια γαλακτώματος εντός της υδατικής φάσης, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό των σωματιδίων. Σαν ηλεκτρολύτες χρησιμοποιούνται συνήθως το οξικό μαγνήσιο, το χλωριούχο ασβέστιο και το χλωριούχο νάτριο. Πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η χρήση μη αλογονωμένων διαλυτών, αλλά πολύ περισσότερο ότι δεν απαιτείται η χρήση συσκευών υψηλής ενέργειας ή πίεσης [101, 102]. Α3.6 Μέγεθος σχηματιζόμενων νανοσωματιδίων Το μέγεθος των νανοσωματιδίων και η κατανομή μεγέθους είναι ίσως το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό τους καθώς καθορίζουν τη βιοκατανομή, την τυχόν τοξικότητα και την ικανότητα στόχευσής τους. Επιπλέον το μέγεθος επηρεάζει και την ποσότητα του φαρμάκου που θα εγκλωβιστεί καθώς και τον ρυθμό αποδέσμευσης του. Πλήθος μελετών δείχνουν την χρήση των νανοσωματίων να υπερτερεί σε σύγκριση με τα μικροσωματίδια και τα λιποσώματα με βασικό πλεονέκτημα να αποτελεί το μικρό τους μέγεθος. Η προσληψή τους από τα κύτταρα είναι υψηλότερη ενώ αποφεύγεται η κατακράτησή τους από τον σπλήνα. Η πρόσληψη των νανοσωματιδίων από τα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου εξαρτάται εκτός από το μέγεθος και από τη φύση του σωματιδίου και το φορτίο που φέρουν. Έτσι νανοσωματίδια κατασκευασμένα από λιπόφιλα πολυμερή προσλαμβάνονται από τα κύτταρα σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι σωματίδια υδρόφιλων πολυμερών [103, 104]. Το μέγεθος των παραγόμενων νανοσωματιδίων εξαρτάται από την ένταση, τον χρόνο και τον τρόπο γαλακτωματοποίησης, την ποσότητα των διαλυτών που χρησιμοποιήθηκαν, την συγκέντρωση του πολυμερούς, το ιξώδες της οργανικής και υδατικής φάσης καθώς και από την θερμοκρασία [105, 106]. Η μέθοδος μέσω γαλακτοματοποίησης παρουσιάζει μεγάλο πλεονέκτημα λόγω ευκολίας παρασκευής των νανοσωματιδίων. Επίσης η χρήση του νερού δεν διαλύει τα πολυμερή και απλοποιεί την διαδικασία καθαρισμού. Μειονεκτήματα της μεθόδου είναι η χρήση σχετικά τοξικών οργανικών διαλυτών καθώς και η χρήση ισχυρών διατμητικών δυνάμεων που μπορεί να φέρει σαν αποτέλεσμα την αλλοίωση ή αποικοδόμηση διαφόρων ουσιών όπως οι πρωτεΐνες [107, 108]. Αντίθετα μέσω της κατακρήμνισης δεν απαιτείται η χρήση ισχυρής ενέργειας και διατμητικών δυνάμεων καθώς τα σωματίδια σχηματίζονται μέσω 41

59 αυθόρμητης διάχυσης ενώ είναι συγκριτικά μικρότερα από αυτά που παράγονται μέσω γαλακτώματος. Η αποδέσμευση του φαρμάκου επίσης επηρεάζεται από το μέγεθος καθώς νανοσωματίδια μικρότερου μεγέθους παρουσιάζουν μεγαλύτερη ειδική επιφάνεια, με αποτέλεσμα την πιο ταχεία αποδέσμευση, μέσω διάχυσης. Από την άλλη πλευρά τα μικρότερα σωματίδια παρουσιάζουν μεγαλύτερη πιθανότητα δημιουργίας συσσωματώματος κατά τη διάρκεια αποθήκευσής τους. Ο πιο γρήγορος και εύκολος τρόπος για τον προσδιορισμό του μεγέθους των νανοσωματιδίων είναι με φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) ή δυναμική σκέδασης φωτός (dynamic scattering light, DLS). Η διάμετρος προσδιορίζεται από την κινητικότητα που εμφανίζουν τα σωματίδια και την ένταση του σκεδαζόμενου φωτός. Η μέθοδος εμφανίζει το πλεονέκτημα της ευκολίας και της ταχύτατης λήψης αποτελεσμάτων ενώ μειονέκτημά της αποτελεί η αξιοπιστία καθώς προσμίξεις, σκόνη ή φυσαλίδες αέρα μπορούν να επηρεάσουν την μέτρηση. Εναλλακτική μέθοδος μέτρησης του μεγέθους αποτελεί η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (Scanning Electron Microscope, SEM) και αποτελεί την αμεσότερη μέθοδο προσδιορισμού. Βασικός περιορισμός είναι ότι το δείγμα πρέπει να είναι πλήρως ξηρό και μπορεί να καταστεί ασταθές όταν βομβαρδίζεται με τη δέσμη ηλεκτρονίων κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα συμπεράσματα. Α3.7 Ιδιότητες επιφάνειας και Ζ-δυναμικό Εκτός από το μέγεθος των νανοσωματιδίων, το φορτίο και η υδροφιλικότητα είναι επίσης σημαντικές ιδιότητες που καθορίζουν την in vivo συμπεριφορά τους. Η εμφάνιση φορτίου επιφάνειας στα περισσότερα εναιωρήματα σωματιδίων σε υδατική φάση οφείλεται στην ύπαρξη φορτισμένων ομάδων ή και στην προσρόφηση ιόντων από το μέσο διασποράς. Σε διαλύματα αλάτων, τα σωματίδια μπορούν να προσροφήσουν μία στοιβάδα ιόντων, η οποία αποτελείται από μη ενυδατωμένα ιόντα συνήθως αρνητικά. Η στοιβάδα αυτή ονομάζεται δυναμικό Nerhst και αποτελεί τη διαφορά δυναμικού της επιφάνειας των σωματιδίων και της ουδέτερης περιοχής του διαλύματος (Nerhst potential). Τα αρνητικά ιόντα στην επιφάνεια των σωματιδίων έλκουν τα θετικά ιόντα του διαλύματος δημιουργώντας το Ζ-δυναμικό που αποτελεί τη διαφορά δυναμικού ανάμεσα στη σταθερά δεσμευμένης στοιβάδας ιόντων στην επιφάνεια των σωματιδίων και την ηλεκτροουδέτερη περιοχή του διαλύματος. Κατά την κίνηση των σωματιδίων το δυναμικό μηδενίζεται στην διάχυτη στοιβάδα, αυτή απομακρύνεται αποκαλύπτεται το δυναμικό 42

60 επιφάνειας, το οποίο αποτελεί το Ζ-δυναμικό (Z-potential). Η μέτρηση του δυναμικού αυτού δίνει πληροφορίες για την έκταση επικάλυψης της επιφάνειας των PLGA-νανοσωματιδίων με PLGA αλλά και για τον πραγματικό εγκλωβισμό του φαρμάκου εντός των νανοσωματιδίων και όχι την προσρόφηση στην επιφάνειά τους [89]. Η εξίσωση που χρησιμοποιείται για την μέτρηση του Ζ- δυναμικού είναι: Όπου ζ: το Ζ-δυναμικό η: το ιξώδες του δείγματος ε: διηλεκτρική σταθερά U: ηλεκτροφοριτική κινητικότητα Σχήμα 16: Απεικόνιση της συγκέντρωσης ιόντων (στην επιφάνεια και το διάλυμα) και της διαφοράς δυναμικού ως συνάρτηση της απόστασης της φορτισμένης επιφάνειας του νανοσωματιδίου στο μέσο διασποράς. Προσαρμοσμένο από [109]. Η μέτρηση του Ζ-δυναμικού αποτελεί βασικό δείκτη της σταθερότητας των κολλοειδών. Μεγάλη τιμή, θετική ή αρνητική, δηλώνει σωματίδια πολύ σταθερά, αντίθετα όταν το δυναμικό είναι μικρό οι ελκτικές δυνάμεις υπερβαίνουν τις απωστικές και μπορεί να δημιουργηθούν συσσωματώματα στο διάλυμα [110, 111]. 43

61 Πίνακας 3: Σταθερότητα νανοσωματιδίων ανάλογα με την τιμή του Ζ-δυναμικού. Τιμή Ζ-δυναμικού(mV) Από 0 έως ±5 Από ±10 έως ±30 Από ±30 έως ±40 Από ±40 έως ±60 Πάνω από ±61 Σταθερότητα Ταχεία κροκίδωση Μικρή αστάθεια Μέτρια σταθερότητα Καλή σταθερότητα Πολλή καλή σταθερότητα Α3.8 Εγκλωβισμός του φαρμάκου Ο εγκλωβισμός του φαρμάκου στο πολυμερές πρέπει να είναι το δυνατόν μεγαλύτερη, ώστε να μην απαιτείται χορήγηση μεγάλης ποσότητας νανοσωματιδίων και να αποφευχθεί ο κίνδυνος συσσώρευσης του πολυμερούς στον οργανισμό, που μπορεί να οδηγήσει σε φαινόμενα τοξικότητας. Το ποσοστό της ουσίας που εγκλωβίζεται τελικά στα νανοσωματίδια προς την αρχική ποσότητα που προστέθηκε, εξαρτάται από την λιποφιλικότητα ή υδροφιλικότητα, τις φυσικοχημικές ιδιότητες και το μοριακό βάρος της ουσίας, από την σύσταση του πολυμερούς και την παρουσία δραστικών ομάδων για την αλληλεπίδρασή τους. Οι πρωτεΐνες και τα πεπτίδια δείχνουν να ενκαψακιώνονται καλύτερα κοντά στο ισοηλεκτρικό τους σημείο [112]. Α3.9 Αποδέσμευση φαρμάκου Όπως αναφέρθηκε, ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου εξαρτάται από τη διαλυτότητα του φαρμάκου στο μέσο διάλυσης, τον ρυθμό διάχυσης του φαρμάκου από τον πυρήνα του νανοσωματιδίου και από την βιοαποικοδομησιμότητα του πολυμερούς. Η αποδέσμευση του φαρμάκου πραγματοποιείται μέσω διάχυσης ενώ η μήτρα του πολυμερούς μπορεί να διαβρώνεται από το μέσο διάλυσης. Παρατηρούμενη ταχεία αποδέσμευση από την αρχή της διεργασίας συνήθως οφείλεται σε ελαφρώς συνδεδεμένο φάρμακο ή προσροφημένο φάρμακο στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Για την in vitro μελέτη της αποδέσμευσης έχουν προταθεί πολλές μέθοδοι όπως οι σάκοι διαπίδυσης και ο διαχωρισμός των νανοσωματιδίων από το φάρμακο με φυγοκέντρηση. Η μέθοδος επιλέγεται με βάση τις ιδιότητες του φαρμάκου [112]. 44

62 45

63 46

64 ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Οι πρωτεΐνες MBP και MOG της μυελίνης διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και εξέλιξη της ΣΚΠ. Τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα πρωτεΐνων της μυελίνης έχουν προταθεί για την αναστολή εμφάνισης της ασθένειας παρεμποδίζοντας το σχηματισμό του τριμοριακού συμπλόκου και την ενεργοποίηση των εγκεφαλιτογόνων Τ-κυττάρων. Η ενεργοποίηση των εγκεφαλιτογόνων Τ κυττάρων πραγματοποιείται μέσω της δημιουργίας τριμοριακού συμπλόκου ανάμεσα στο μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας, τον αντιγονικό επίτοπο της μυελίνης και τον υποδοχέα TCR του Τ κυττάρου. Πεπτιδικά ανάλογα τα οποία θα εμφανίζουν ισχυρή συγγένεια με το μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας χωρίς όμως να ενώνονται με τον TCR των Τ κυττάρων, πιθανώς θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε αναστολή εμφάνισης της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EΑE). Τέτοιοι επίτοποι είναι οι MBP και MOG που η αντικατάσταση συγκεκριμένων αμινοξέων στην αλληλουχία τους μπορεί να οδηγήσει σε ανταγωνιστές. Με βάση αυτούς τους επιτόπους έχουν σχεδιαστεί και συντεθεί γραμμικά και κυκλικά πεπτίδια που φαίνεται πως αναστέλλουν την εμφάνιση της ασθένειας σε πειραματόζωα. Στην ΕΑΕ, το πειραματικό μοντέλο της ΣΚΠ, χρησιμοποιούνται αντιγόνα μυελίνης και απαιτούνται επαναλαμβανόμενες ενέσεις λόγω της ταχείας καταστροφής των αντιγόνων. Τα συμπολυμερή γαλακτικού και γλυκολικού οξέος (Poly(lactic-co-glycolic)acid, PLGA) είναι βιοαποικοδομήσιμα και βιοσυμβατά πολυμερή και έχουν εγκριθεί για την χρήση τους στον άνθρωπο για παρατεταμένη αποδέσμευση φαρμάκων. Το πιθανό αντιγόνο μπορεί να εγκλωβιστεί στο εσωτερικό του σωματιδίου είτε να απορροφηθεί από την επιφάνειά του. Στη συνέχεια, η διαδικασία της αποικοδόμησης έχει ως αποτέλεσμα την βραδεία αποδέσμευση του αντιγόνου. Η χρήση PLGA νανοσωματιδίων με εγκλωβισμένο το αντιγόνο γίνεται ολοένα και εκτενέστερη στη χορήγηση αντιγόνων καθώς προστατεύουν τις αντιγονικές πρωτεΐνες, τα πεπτίδια ή το DNA από άμεση αποικοδόμηση ενώ ταυτόχρονα έχουν την ικανότητα να επιμηκύνουν και να ελέγχουν την αποδέσμευση για αρκετά μεγάλο διάστημα in vivo. Στα πλαίσια της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε αρχικά η σύνθεση γραμμικών και κυκλικών πεπτιδικών αναλόγων με βάση τους επιτόπους MBP και MOG με αλλαγές στις θέσεις των αμινοξέων που συνδέονται με τον υποδοχέα TCR. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε εγκλωβισμός αναλόγου της MOG και έλεγχος της αποτελεσματικότητας των PLGA νανοσωματιδίων in vitro και τέλος υποδόριος εμβολιασμός τους σε ποντίκια που τους έχει προκληθεί ΕΑΕ και έλεγχος της δραστικότητάς του σε PLGA νανοσωματίδια. 47

65 48

66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 49

67 50

68 Β1 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων Β1.1 Γενική πορεία σύνθεσης Η πεπτιδική σύνθεση πραγματοποιήθηκε σε στερεή φάση με τη χρήση της 2-χλωροτρίτυλο χλωρίδιο ρητίνης (CLTR-Cl) σε συνδυασμό με την Fmoc/tBu μεθοδολογία. Για τη σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων χρησιμοποιήθηκε σύριγγα με πορώδη ηθμό G2 όπου εφάρμοζε σε vacuum manifold της εταιρείας Phenomenex. που μπορούσε να συνδεθεί με αντλία κενού. Η CLTR-Cl προερχόταν από την εταιρεία CBL Patras, καθώς και τα προστατευμένα αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν. Τα διάφορα αντιδραστήρια, καθώς και οι οργανικοί διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από τις εταιρείες Merck, Sigma Aldrich, Alfa Aesar και Fluka αναλυτικής καθαρότητας >98%. Πρώτο βήμα της σύνθεσης είναι η εστεροποίηση του πρώτου αμινοξέος στη ρητίνη. Η ρητίνη (1,5mmol/g ρητίνης) διογκώνεται με διχλωρομεθάνιο (DCM) (7mL/g) υπό ελαφρά ανάδευση για 30 min. Στη συνέχεια προσθέτουμε διϊσοπρόπυλοαίθυλο-αμίνη (DIPEA) (4,5mmol/g ρητίνης). Περιμένουμε για 5 min, μέχρι να σταματήσουν να εκλύονται λευκοί ατμοί και προσθέτουμε την κατάλληλη ποσότητα Ν α -Fmoc αμινοξέος (1,5mmol/g ρητίνης) που έχει διαλυθεί στον ελάχιστο όγκο διχλωρομεθανίου (DCM). Το μίγμα τοποθετείται σε μαγνητικό αναδευτήρα όπου και παραμένει για 1,5h σε θερμοκρασία δωματίου. Η ρητίνη διηθείται και πλένεται με μίγμα DCM/ΜeOH/DIPEA (80:15:5) (3x10 ml/g ρητίνης) για 5 min/πλύση. Τέλος, ακολουθούν οι πλύσεις με DMF (3 10mL/g ρητίνης). Ακολουθεί απομάκρυνση της Ν α -Fmoc ομάδας του αμινοξέος με χρήση διαλύματος 20-25% πιπεριδίνη σε DMF(1 10mL/g ρητίνης για 5min, 1 10mL/g ρητίνης για 15min και 1 10mL/g ρητίνης για 10min). Ακολουθούν πλύσεις με DMF (5 10mL/g ρητίνης). Για να ελέγξουμε αν απομακρύνθηκε η Ν α -Fmoc ομάδα του αμινοξέος χρησιμοποιούμε το Kaiser-test και χρωματογραφία TLC. Για την σύζευξη του επόμενου αμινοξέος διαλύεται η απαιτούμενη ποσότητα Fmoc-αμινοξέος στην ελάχιστη ποσότητα DMAC ή DMF [mmol Fmoc-ΑΑ-OH=2,5 (υποκατάσταση ρητίνης) (μάζα ρητίνης]). Στη συνέχεια προστίθεται μίγμα Ν-υδροξυβενζοτριαζολίου (HOBt) [mmol HOBt=3,7 (υποκατάσταση ρητίνης) (μάζα ρητίνης)] και διισοπροπυλοκαρβοδιϊμίδιο (DIC) [mmol DIC=2,35 (υποκατάσταση ρητίνης) (μάζα ρητίνης)] και προστίθεται στη ρητίνη. Μετά το τέλος της σύζευξης (3-4h) η ρητίνη διηθείται και πλένεται με DMF (4 10mL/g ρητίνης). Ο έλεγχος της σύζευξης γίνεται με Kaiser-test και χρωματογραφία TLC. Ακολουθεί αποπροστασία της Fmoc ομάδας όπως περιγράφηκε και η διαδικασία επαναλαμβάνεται ώστε να συντεθεί το επιθυμητό 51

69 πεπτίδιο. Τέλος ακολουθεί απομάκρυνση του προστατευμένου πεπτιδίου από την ρητίνη και τελική αποπροστασία του. Β1.2 Έλεγχος συνθετικής πορείας Για τον έλεγχο της πορείας σύνθεσης χρησιμοποιούνται δύο μέθοδοι, το Kaiser test και η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Συνήθως η πρώτη χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της επιτυχούς σύζευξης του αμινοξέος, ενώ η δεύτερη για την πιστοποίηση της αποπροστασίας της Fmoc ομάδας. Το Kaiser test περιλαμβάνει την χρήση τριών αντιδραστηρίων με την εξής σύσταση: Διάλυμα 1: 500mg νινυδρίνης σε 10mL EtOH. Διάλυμα 2: 40g φαινόλης σε 10mL EtOH. Διάλυμα 3: 2mL διαλύματος KCN 0,001M σε 98mL πυριδίνης Σε δοκιμαστικό σωλήνα μεταφέρονται κόκκοι ρητίνης-πεπτιδίου και προστίθενται δυο σταγόνες από το κάθε διάλυμα και το μείγμα θερμαίνεται για 3-5min σε θερμοθάλαμο στους 100 o C. Εάν πρόκειται για έλεγχο αντίδρασης σύζευξης, το χρώμα του μίγματος και των κόκκων της ρητίνης πρέπει να είναι κίτρινο. Εάν το χρώμα του μίγματος ή/και των κόκκων είναι μπλε-μωβ, η αντίδραση σύζευξης δεν έχει ολοκληρωθεί, οπότε ή παρατείνεται η διάρκεια σύζευξης ή ακολουθεί επανασύζευξη. Εάν πρόκειται για έλεγχο απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας, το χρώμα του διαλύματος και των κόκκων της ρητίνης πρέπει να είναι μπλε-μωβ. Επειδή όμως, το μπλεμωβ χρώμα δεν είναι ενδεικτικό της πλήρους απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας, ακολουθεί έλεγχος με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Για τον έλεγχο με TLC μεταφέρονται σε eppendorf περίπου 1-2 mg πεπτιδίου-ρητίνης και προστίθενται το διάλυμα απομάκρυνσης του πεπτιδίου από τη ρητίνη DCM/TFE (7:3, v/v). Αφού περάσουν 5 min, ελευθερώνεται στο διάλυμα σημαντική ποσότητα πεπτιδίου. Από το διάλυμα αυτό, προστίθεται κηλίδα σε πλάκα χρωματογραφίας και στη συνέχεια αναπτύσσεται σε κατάλληλο σύστημα διαλυτών, ψεκάζεται με διάλυμα νινυδρίνης (0,3g νινυδρίνης, 100mL n- BuOH και 3mL AcOH) και θερμαίνεται σε θερμοθάλαμο στους 100 o C. Β1.3 Μέθοδος απομάκρυνσης πεπτιδίου από την CLTR-Cl ρητίνη Μετά την ολοκλήρωση της επιθυμητής πεπτιδικής αλυσίδας, ακολουθεί η απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτό, ακολουθείται η παρακάτω 52

70 πειραματική διαδικασία. Το πεπτίδιο-ρητίνη μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη και σε αυτό, προστίθεται το διάλυμα DCM/TFE (7:3, v/v) (10mL/g πεπτιδίου-ρητίνης). Το μίγμα αφήνεται υπό ανάδευση για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, η ρητίνη διαχωρίζεται από το διάλυμα με διήθηση και το διάλυμα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση. Στη συνέχεια γίνεται καταβύθιση του πεπτιδίου με προσθήκη ψυχρού Et 2 Ο ή H 2 O στο ελαιώδες υπόλειμμα. Το λαμβανόμενο στερεό υπόστρωμα διηθείται και τοποθετείται σε ξηραντήρα, όπου ξηραίνεται υπό κενό πάνω από P 2 O 5. Β1.4 Μέθοδος ολικής αποπροστασίας του πεπτιδίου Το προστατευμένο πεπτίδιο μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη, προστίθενται σε αυτό διάλυμα TFA/DCM (10mL/g προστατευμένου πεπτιδίου) μαζί με δεσμευτές κατιόντων (scavengers π.χ TES, ανισόλη) και παραμένει υπό ανάδευση για 4h σε θερμοκρασία δωματίου. Η καταβύθιση του πεπτιδίου πραγματοποιείται με την προσθήκη ψυχρού Et 2 Ο. Ακολουθεί διήθηση υπό κενό και τέλος το προϊόν τοποθετείται σε ξηραντήρα, όπου ξηραίνεται υπό κενό πάνω από P 2 O 5. Η σύσταση του διαλύματος TFA/DCM και η χρήση των δεσμευτών κατιόντων (scavengers) καθώς και ο χρόνος παραμονής στο διάλυμα αποπροστασίας, εξαρτάται από τον τύπο των πλάγιων προστατευτικών ομάδων. Β1.5 Γενική πορεία κυκλοποίησης πεπτιδίων μέσω δημιουργίας αμιδικού δεσμού Όταν το επιθυμητό πεπτίδιο είναι κυκλικό, η διαδικασία περιλαμβάνει ένα ακόμη στάδιο και γίνεται χρήση διαφορετικών αντιδραστηρίων. Ειδικότερα, αφού ολοκληρωθεί η απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη και προτού ακολουθηθεί η διαδικασία της ολικής αποπροστασίας παρεμβάλλεται το επιπλέον στάδιο. Το προστατευμένο πεπτίδιο διαλύεται σε 10 ml DMF και ακολουθεί η προσθήκη κολλιδίνης και 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο (ΗΟΑt) (διάλυμα Α). Επόμενο βήμα αποτελεί η διάλυση του τετραφθοροβορικού άλατος της 2-(1 Η-βενζοτριαζολυλ) τετραμεθυλουρίας (ΤΒΤU) σε ~80 ml DMF (διάλυμα Β). Η διαδικασία προχωράει με την προσθήκη του διαλύματος Α, στάγδην και υπό ανάδευση, στο διάλυμα Β σε χρονικό διάστημα 6 h. Η ανάδευση συνεχίζεται για περίπου 24 h και στη συνέχεια το διάλυμα συμπυκνώνεται με αντλία ελαίου (oil pump) και παγίδα αζώτου. Το ελαιώδες υπόλειμμα καταβυθίζεται με H 2 O και ψύχεται για πολύ μικρό χρονικό διάστημα. 53

71 Τέλος το στερεό διαχωρίζεται από το υπερκείμενο με διήθηση με ηθμό G4 και τοποθετείται σε ξηραντήρα, για ξήρανση υπό κενό πάνω από P 2 O 5. Η τελική αποπροστασία των κυκλικών πεπτιδίων γίνεται με τον ίδιο τρόπο που γίνεται και στα γραμμικά. Β2 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων του επιτόπου MPB Η αμινοξική ακολουθία του πεπτιδικών αναλόγων που συντέθηκε είναι η εξής: (Lys-Gly) 5 -Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 (1) (Lys-Gly) 4 -Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Phe 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 (2) Αρχικά έγινε εστεροποίηση 1,5mmol (0,3 g) του Fmoc-Pro-OH σε 1,00g CLTR-Cl με τον τρόπο που περιγράφηκε παραπάνω. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 0,3g Fmoc-Pro-OH και 0,75mL DIPEA. Η υποκατάσταση θεωρήθηκε 0,7mmol Fmoc-Pro-OH/g ρητίνης. Στη συνέχεια έγινε άμεση απομάκρυνση της Fmoc ομάδας με χρήση 25% πιπεριδίνης σε DMF και συνεχίστηκε η επιμήκυνση της αλυσίδας μέχρι την θέση 92 όπου και η ποσότητα χωρίστηκε σε δύο μέρη. Στο ένα μέρος συνεχίστηκε η σύνθεση του αναλόγου (1) με σύζευξη του αμινοξέος Fmoc-Lys(Mtt)-OH ενώ στο άλλο μέρος έγινε σύζευξη του αμινοξέος Fmoc-Phe-OH για το ανάλογο (2). Η σύνθεση των αναλόγων (1) και (2) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη γενική μέθοδο εστοροποίησης και σύζευξης σε στερεά φάση επί της CLTR-Cl σε συνδιασμό με την Fmoc/tBu μεθοδολογία και την μέθοδο καρβοδιϊμιδίων με αντιδραστήρια σύζευξης τα DIC/HOBt. Ο έλεγχος των αντιδράσεων σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας πραγματοποιήθηκε με TLC και Kaiser test όπως έχει περιγραφεί. Μετά την σύζευξη και του τελευταίου αμινοξέος για το ανάλογο (1) και την απομάκρυνση της Fmoc ομάδας ακολούθησε κατεργασία με Boc 2 O(mmol 10) και DIPEA(mmol 10) για την προστασία της Ν α τελικού άκρου της αλυσίδας. Ελήφθησαν: 2,87g Lys(Boc) 2 -Gly-[Lys(Boc)-Gly] 4 -Glu 83 (tbu)-asn-pro-val-val-his(trt)-phe-phe-lys 91 (Mtt)-Asn- Ile-Val-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro 99 -CLTR (1A) 0,79g Η-Lys(Boc)-Gly-[Lys(Boc)-Gly] 3 -Glu 83 (tbu)-asn-pro-val-val-his(trt)-phe-phe-phe 91 -Asn-Ile- Val-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro 99 -CLTR (2A) Ακολούθησε απομάκρυνση των πεπτιδίων από τη ρητίνη. Για τα γραμμικά ανάλογα έγινε κατεργασία με διάλυμα DCM/TFE (7/3 v/v και 10ml/g ρητίνης-πεπτιδίου) για περίπου 2h υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθως διήθηση της ρητίνης, συμπύκνωση του 54

72 διηθήματος υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση του πεπτιδίου με Et 2 O. Για για το (1Α) επειδή επρόκειτο να γίνει ενδιάμεση κυκλοποίηση στην θέση 91, έγινε κατεργασία με διάλυμα DCM/HFIP (6/4 v/v και 10ml/g ρητίνης πεπτιδίου) παρουσία TES, για 1h σε θερμοκρασία δωματίου και υπό ανάδευση για να απομακρυνθεί η Mtt ομάδα της Lys 91. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθούταν ανά 10min με TLC. Έπειτα, ακολούθησε διήθηση της ρητίνης, συμπύκνωση του διηθήματος υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση του πεπτιδίου με Et 2 O. Έτσι ελήφθησαν: 1,268 g Lys(Boc) 2 -Gly-[Lys(Boc)-Gly] 4 -Glu 83 (tbu)-asn-pro-val-val-his(trt)-phe-phe-lys 91 -Asn-Ile- Val-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro 99 -OH (1B) 0,43 g Η-Lys(Boc)-Gly-[Lys(Boc)-Gly] 3 -Glu 83 (tbu)-asn-pro-val-val-his(trt)-phe-phe-phe 91 -Asn-Ile- Val-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro 99 -OH (2B) Στην συνέχεια το προστατευμένο ανάλογο (1Β) χρησιμοποιήθηκε χωρίς περαιτέρω καθαρισμό για την σύνθεση κυκλικού πεπτιδικού αναλόγου της MBP. 55

73 Β3 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων του επιτόπου MOG Η αλληλουχία του επιτόπου MOG στα ποντίκια είναι: Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 Συντέθηκαν το κάτωθι πεπτιδικά ανάλογα: (Lys-Gly) 5- Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Lys 41 -Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly- Lys 55 (3) Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Ala 41 -Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 (4) Αρχικά έγινε εστεροποίηση σε σφαιρική φιάλη των 50 ml 3mmol της Fmoc-Lys(Boc)-ΟΗ σε 2g CLTR-CL για τη σύνθεση των αναλόγων (3) και (4) όπως έχει περιγραφεί παραπάνω. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 1,4g Fmoc-Lys(Boc)-OH και 1,5ml (9mmol) DIPEA. H υποκατάσταση θεωρήθηκε 0,7mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH/g. Ακολούθησε αµέσως αποµάκρυνση της Fmoc οµάδας µε χρήση διαλύµατος 25% πιπεριδίνης σε DMF και έλεγχος των αντιδράσεων με TLC και Kaiser test. Η επιμήκυνση της αλυσίδας συνεχίστηκε όπως έχει περιγραφει. Μετά την σύζευξη και του τελευταίου αμινοξέος για το ανάλογο (3) και την απομάκρυνση της Fmoc ομάδας ακολούθησε κατεργασία με Boc 2 O(mmol 10) και DIPEA(mmol 10) για την προστασία της Ν α τελικού άκρου της αλυσίδας καθώς επρόκειτο να γίνει ενδιάμεση κυκλοποίηση. Έτσι ελήφθησαν: 1,85g Lys(Boc) 2 -Gly-[Lys(Boc)-Gly] 4 -Met 35 -Glu(tBu)-Val-Gly-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Lys 41 (Mtt)-Ser(tBu)- Pro-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Val-His(Trt)-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Lys 55 (Boc)-CLTR (3A) 2,48g Η-Met 35 -Glu(tBu)-Val-Gly-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Ala 41 -Pro-Pro-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Val- His(Trt)-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Lys 55 (Boc)-CLTR (4A) Για τα γραμμικά ανάλογα έγινε απομάκρυνση των πεπτιδίων από την ρητίνη με χρήση διαλύματος DCM/TFE (7/3 v/v και 10ml/g ρητίνης-πεπτιδίου) ενώ για την απομάκρυνση της Mtt ομάδας κατεργάστηκαν σε διάλυμα DCM/HFIP (6/4 v/v και 10ml/g ρητίνης πεπτιδίου) παρουσία TES όπως για το ανάλογο (1Α) και ελήφθησαν: 0,74 g Lys(Boc) 2 -Gly-[Lys(Boc)-Gly] 4 -Met 35 -Glu(tBu)-Val-Gly-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Lys 41 -Ser(tBu)- Pro-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Val-His(Trt)-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Lys 55 (Boc)-OH (3Β) 0,82g Η-Met 35 -Glu(tBu)-Val-Gly-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Ala 41 -Pro-Pro-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Val- His(Trt)-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Lys 55 (Boc)-OH (4Β) 56

74 Το ανάλογο (3Β) χρησιμοποιήθηκε χωρίς περαιτέρω καθαρισμό για την σύνθεση του αντίστοιχου κυκλικού πεπτιδικού αναλόγου. Β4 Κυκλοποίηση πεπτιδικών αναλόγων 100 mg από κάθε προστατευμένο πεπτίδιο χρησιμοποιήθηκαν για την κυκλοποίηση τους με χρήση TBTU (3Χmmol προστατευμένου πεπτιδίου), ΗΟΑt (3Χmmol προστατευμένου πεπτιδίου) και κολλιδίνη (6Χmmol προστατευμένου πεπτιδίου). Αρχικά, το προστατευμένο πεπτίδιο διαλύθηκε σε 20 ml DMF και προστέθηκε η κολλιδίνη και το ΗΟΑt. To παραπάνω διάλυμα προστέθηκε στάγδην και υπό ανάδευση σε χρονικό διάστημα 6h σε διάλυμα της ποσότητας του TBTU σε 80ml DMF. Η κυκλοποίηση του κάθε πεπτιδίου ολοκληρώθηκε υπό ανάδευση overnight. Ακολούθησε συμπύκνωση του διαλύματος υπό ελαττωμένη πίεση με αντλία ελαίου και παγίδα αζώτου και στερεοποίηση του ελαιώδους υπολείμματος με H 2 O.Ελήφθησαν: 90mg cyclo(91-99) Lys(Boc) 2 -Gly-[Lys(Boc)-Gly] 4 -Glu 83 (tbu)-asn-pro-val-val-his(trt)-phe-phe-lys 91 - Asn-Ile-Val-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro 99 (1B ) 95mg cyclo(41-55) Lys(Boc) 2 -Gly-[Lys(Boc)-Gly] 4 -Met 35 -Glu(tBu)-Val-Gly-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Lys 41 - Ser(tBu)-Pro-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Val-Val-His(Trt)-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Lys 55 (Boc) (3Β ) Β5 Τελική αποπροστασία των πεπτιδικών αναλόγων H αποµάκρυνση των προστατευτικών οµάδων (Pbf, tbu,trt) τόσο των γραμμικών, όσο και των κυκλικών προστατευµένων πεπτιδίων έγινε µε κατεργασία σε διάλυµα TFA/DCM και τη χρήση ανισόλης, νερού και TES, ως δεσµευτές κατιόντων (scavengers) για 4h σε θερµοκρασία δωµατίου. Η αναλογία του διαλύματος αποπροστασίας ήταν 94% TFA, 2% DCM, 2% TES, 1% Αnisole και 1% H 2 O (10 ml διαλύματος/g πεπτιδίου). Κατόπιν ακολούθησε συµπύκνωση του διαλύματος υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση των πεπτιδίων µε Et 2 O και ελήφθησαν τα ανάλογα: Η-(Lys-Gly) 5 -Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 (1Γ) 57

75 Η-(Lys-Gly) 4 -Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Phe 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 -ΟΗ (2Γ) (Lys-Gly) 5- Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Lys 41 -Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 (3Γ) Η-Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Ala 41 -Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys 55 -ΟΗ (4Γ) Ο τελικός καθαρισμός έγινε με τη βοήθεια χρωματογραφίας υψηλής επίδοσης ανάστροφης φάσης (RP-HPLC), στο σύστημα της εταιρείας Waters (600 controller) με λειτουργικό σύστημα millennium 2.1 και ανιχνευτή Waters (Diode Array didector, υπεριώδους με συστοιχία διόδων) με τη χρήση ημιπαρασκευαστικής στήλης Lichrosorb RP-18 (250x4mm) με διάμετρο σωματιδίων 7μm και ταχύτητα ροής 3mL/min. Η μεταβολή της σύστασης του διαλύτη έκλουσης ήταν γραμμική και χρησιμοποιήθηκαν συνθήκες 20% ΑCN---->60% ΑCN, σε 45 min. H ταυτοποίηση των προïόντων πραγματοποιήθηκε με ESI-MS. Τέλος τα πεπτίδια λυοφιλοποιήθηκαν υπό τη μορφή λευκού στερεού. Οι ποσότητες έγχυσης στο ημιπαρασκευαστικό RP-HPLC ήταν : i. 30mg ακάθαρτου αναλόγου (1Γ) cyclo(91-99) [(KG) 5 MBP (Lys 91 )] και ελήφθησαν 8,5mg καθαρού προϊόντος ii. iii. iv. 30mg ακάθαρτου αναλόγου (2Γ) (KG) 4 MBP και ελήφθησαν 8mg καθαρού προϊόντος 40mg ακάθαρτου αναλόγου (3Γ) cyclo(41-55) [(KG) 5 MOG (Lys 41 )]_rat και ελήφθησαν 4mg καθαρού προϊόντος 70mg ακάθαρτου αναλόγου (4Γ) MOG (Ala 41 ) και ελήφθησαν 13mg καθαρού προϊόντος Β6 Σύνθεση και χαρακτηρισμός των PLGA νανοσωματιδίων Για την σύνθεση των νανοσωματιδίων PLGA με ενκαψακιωμένα πεπτίδια της MOG πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος διπλού γαλακτώματος w 1 /o/w 2 με εξάτμιση διαλύτη. Το διπλό γαλάκτωμα που παρασκευάζεται αποτελείται από την εσωτερική υδατική φάση w 1, την οργανική φάση και την εξωτερική υδατική φάση w 2. Για την οργανική φάση, 60mg πολυμερούς PLGA (65:35) διαλύονται σε 1mL DCM, ενώ ταυτόχρονα προετοιμάζεται υδατικό διάλυμα 1% w/v PVA με υπερκάθαρο νερό MilliQ, που αποτελεί την εξωτερική υδατική φάση και αφήνονται υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 2h. Τέλος η εσωτερική υδατική φάση 58

76 αποτελείται από 200mg του επιθυμητού πεπτιδίου διαλυμένο σε 50μL PBS. Μετά το πέρας των 2h και αφού το πολυμερές έχει διαλυθεί πλήρως στον οργανικό διαλύτη, γίνεται προσθήκη της εσωτερικής υδατικής φάσης και εφαρμογή υπερήχων για 1min στα 0.21W για την παρασκευή του πρώτου γαλακτώματος. Εν συνεχεία προστίθενται 5mL της εξωτερικής υδατικής φάσης και επαναλαμβάνεται η εφαρμογή υπερήχων για 2min στα 0.21W. Το τελικό γαλάκτωμα αφήνεται υπό ήπια ανάδευση σε απαγωγό μέχρι πλήρως εξατμίσεως των διαλυτών σε γυάλινο τρυβλίο Petri. Μετά την εξάτμιση εμφανίζεται σαν φιλμ. Για τον σχηματισμό και την συλλογή των νανοσωματιδίων το φιλμ διαλύεται σε 7-10mL υπερκάθαρου νερού MilliQ σε διάστημα 2h, συλλέγονται σε γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα και καθαρίζονται με την χρήση φυγοκέντρου στα 13000rpm για 10min στους 20 ο C και διαδοχικές αποχύσεις και πλύσεις με 5-7mL νερού 5 φορές. Τέλος τα νανοσωματίδια παραλαμβάνονται σε πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρησης και προστίθεται 1mL αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού 0.9% w/v NaCl. Ο προσδιορισμός του μέσου μεγέθος των νανοσωματιδίων προσδιορίστηκε με την τεχνική σκεδασμού φωτός καθώς και η μέτρηση του Ζ-δυναμικού και πραγματοποιήθηκαν στο Πανεπιστήμιο της Alessandria στην Ιταλία (Dipartimento di Scienze e Innovazione Technologica) με χρήση της τεχνικής σκεδασμού φωτός, DLS και ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης, SEM. Έτσι παρασκευάστηκαν νανοσωματιδία με ενκαψακιωμένο το πεπτίδιο MOG (Ala 41 ) [113, 114]. Σχήμα 17: Πορεία ανάπτυξης των PLGA νανοσωματιδίων με εγκλωβισμένο το πεπτιδικό ανάλογο (4Γ). 59

77 Β6.1 Έλεγχος αποδέσμευσης πεπτιδίου in vitro Για τον έλεγχο απελευθέρωσης του πεπτιδίου στον φυσιολογικό ορό τα νανοσωματίδια αφήνονται σε θερμό θάλαμο στους 37 ο C υπό συνεχή ανάδευση στα 200rpm για διάστημα 20 ημερών. Για την παραλαβή δείγματος υπερκειμένου που περιέχει το απελευθερωμένο πεπτίδιο, το διάλυμα φυγοκεντρείται και προσεκτικά διαχωρίζεται το υπερκείμενο από τα νανοσωματίδια που αποτελούν το ίζημα. Το δείγμα υπερκειμένου φυλάσσεται στους -20 ο C. Στα νανοσωματίδια προστίθεται 1mL φρέσκου ορού και αφού αναδευτούν έντονα(vortexing) για ομογενοποίηση τοποθετούνται ξανά στον θερμό θάλαμο. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται ανά 2-3 μέρες μέχρι το πέρας των 20 ημερών. Επίσης συλλέγονται δείγματα 50μg νανοσωματιδίων την πρώτη και την τελευταία μέρα του πειράματος. Για τα δείγματα των νανοσωματιδίων ακολουθεί διαδικασία εξαγωγής του εναπομείναντος πεπτιδίου. Για τον σκοπό αυτό τα δείγματα λυοφιλοποιούνται σε speed vacuum στους 30 ο C και 1200rpm και παγώνονται στους -20 ο C. Εν συνεχεία γίνεται προσθήκη 0.25mL DMSO και μετά από 1h προσθήκη 0.75mL HCl 0.01N και αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου υπό ήπια ανάδευση για 1h [115]. Αφού η διαδικασία ολοκληρωθεί όλα τα δείγματα αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για να υγροποιηθούν και στη συνέχεια λυοφιλοποιούνται σε speed vacuum στους 30 ο C και 1200rpm για 4h. Ακολουθεί προσδιορισμός της ποσότητας του πεπτιδίου. Β6.2 Μέτρηση της ποσότητας πεπτιδίου που περιέχεται στις νανοσφαίρες Η μέτρηση της ποσότητας του πεπτιδίου που περιέχεται στις νανοσφαίρες πραγματοποιήθηκε με χρήση της μεθόδου BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific).Η μέθοδος αυτή βασίζεται στο δικιγχονινικό οξύ (BCA) σαν χρωστική ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών. Η μέθοδος απαιτεί την παρασκευή πρότυπης καμπύλης με χρήση αλβουμίνη βόειου ορού και προσθήκη των αντιδραστηρίων Α και Β σε αναλογία 50:1. Το αντιδραστήριο Α περιέχει Na 2 CO 3, NaHCO 3, BCA και τρυγικό οξύ σε 0.1Μ NaOH, ενώ το Β αποτελεί διάλυμα 4% CuSO 4. Έτσι στα δείγματα γίνεται προσθήκη 25μL υπερκάθαρου νερού για διαλυτοποίηση του στερεού και μεταφορά σε πλάκα μικροκαλλιεργιών με επίπεδο πυθμένα. Στη συνέχεια προστίθενται 200μL διαλύματος Α:Β(50:1) και αφήνονται σε θερμοθάλαμο στους 37 ο C για 30min. Ακολουθεί μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 562nm. 60

78 y = 137,89x ,5x R² = 0,9997 Συγκέντρωση (μg/ml) ,5 1 1,5 Απορρόφηση Σχήμα 18: Πρότυπη καμπύλη BCA με χρήση αλβουμίνη βόειου ορού. Αξίζει να σημειωθεί ότι η μέθοδος ανίχνευσης πρωτεϊνών BCA έχει λίγες παρεμβολές από άλλες ενώσεις και έτσι ελέχθησαν όλα τα συστατικά από τα οποία απαρτίζονται οι νανοσφαίρες προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι δεν υπάρχουν παρεμβολές. Ο αριθμός των πεπτιδικών δεσμών και η παρουσία τεσσάρων συγκεκριμένων αμινοξέων (κυστεΐνη, κυστίνη, τυροσίνη και τρυπρτοφάνη) αναφέρονται να είναι υπεύθυνη για τον σχηματισμό χρώματος. Β7 Ανοσοποίηση πειραματόζωων και εμβολιασμός Για την μελέτη χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια C57Bl/6 βάρους 20g και ηλικίας 6 εβδομάδων. Τα ζώα αγοράστηκαν από την Harlan (Horst, The Netherlands) και καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης στεγάζονταν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες από παθογόνους οργανισμούς, σε πλαστικούς κλωβούς, έξι σε κάθε κλωβό, υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας και 12ωρους κύκλους φωτός/σκότους. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στις εγκαταστάσεις ζώων του πανεπιστημίου University of Eastern Piedmont A. Avogadro (Novara) και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Θεσμικής Δεοντολογίας για πειράματα σε ζώα (Institutional Ethical Committee for Animal Experimentation). Για την πρόκληση της ΕΑΕ, τα πειραματόζωα έλαβαν υποδόρια ένεση 0.2mL γαλακτώματος που περιείχε 300μg πεπτιδίου rmog σε πλήρες συμπλήρωμα Freund s (Complete Freund s Adjuvant, CFA) εμπλουτισμένου με 400μg Mycobacterium tuberculosis. Επίσης εγχύθηκε 61

79 ενδοπεριτοναϊκώς Pertussis toxin (from Bordetella pertussis) μετά την ανοσοποίηση καθώς και μετά από 48h. Ακολούθησε θεραπευτικός και προφυλακτικός εμβολιασμός των ποντικών με 350μg PLGA νανοσωματίδια φορτωμένα με το πεπτίδιο [Ala 41 ]MOG και νανοσωματίδια που περιέχουν ενκαψακιωμένη ουσία. Για τον προφυλακτικό εμβολιασμό οι ενέσεις πραγματοποιήθηκαν τις ημέρες 1 και 15 μετά την επαγωγή της ΕΑΕ ενώ για τον θεραπευτικό εμβολιασμό οι ενέσεις χορηγήθηκαν τις ημέρες 8 και 22 μετά την επαγωγή της ΕΑΕ. Η παρακολούθηση της κλινικής εικόνας της ΕΑΕ πραγματοποιήθηκε σε ημερήσια βάση με καταγραφή του βαθμού αναπηρίας των πειραματοζώων. 62

80 63

81 64

82 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ 65

83 66

84 Γ1 Σχεδιασμός συντιθέμενων πεπτιδικών αναλόγων Τα πεπτίδια που σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν με βάση τους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους MOG και MBP παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Πίνακας 4: Πεπτίδια που συντέθηκαν Αλληλουχία Η-(Lys-Gly) 5 -Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 Αριθμός αναλόγου (1Γ) cyclo(91-99) [(KG) 5 MBP 83-99(Lys 91 )] Η-(Lys-Gly) 4 -Glu 83 -Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Phe 91 -Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro 99 -ΟΗ (2Γ) (KG) 4 MBP H-(Lys-Gly) 5- Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Lys 41 -Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg- Asn-Gly-Lys 55 Η-Met 35 -Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Ala 41 -Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly- Lys 55 -ΟΗ (3Γ) cyclo(41-55) [(KG) 5 MOG 35-55(Lys 41 )]_rat (4Γ) MOG (Ala 41 ) Σχεδιασμός πεπτιδικών αναλόγων(1γ) και (2Γ) της MBP: Έχει βρεθεί ότι το αμινοξύ Lys στην θέση 91 του επιτόπου αλληλεπιδρά ισχυρά με τον υποδοχέα των εγκεφαλιτογόνων Τ κυττάρων (TCR) προκαλώντας την εμφάνιση της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (ΕΑΕ) καθώς και έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών [116, 117]. Αντικατάσταση της Lys από διάφορα αμινοξέα όπως για παράδειγμα Arg, Ala, Phe έχουν δείξει ότι αναστέλλουν την εμφάνιση συμπτωμάτων της ΕΑΕ [118]. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι πεπτιδικά ανάλογα ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης συζευγμένα με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη λειτουργούν θεραπευτικά στην ΕΑΕ [119]. Η σύζευξη των αναλόγων με τον πολυσακχαρίτη γίνεται μέσω βάσεων Schiff και μίας γέφυρας (Lys-Gly) n η οποία βρίσκεται στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου [120]. Κατά τον σχεδιασμό και σύνθεση του κυκλικού αναλόγου (1Γ) η κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε ανάμεσα στην πλευρική αμινομάδα της Lys και το C-τελικό άκρο του πεπτιδίου. Κύριος στόχος μέσω της κυκλοποίησης είναι η δημιουργία ενός σταθερότερου στην 67

85 πρωτεόλυση πεπτιδικού αναλόγου με ταυτόχρονη απενεργοποίηση των μη δεσμικών αλληλεπιδράσεων της πλευρικής αμινομάδας της Lys με τον υποδοχέα TCR. Στο Ν-τελικό άκρο του ίδιου αναλόγου υπάρχει η γέφυρα για μελλοντική σύζευξη του με τη μαννάνη. Στο ανάλογο (2Γ) πραγματοποιήθηκε αντικατάσταση της Lys με Phe καθώς έχει βρεθεί ότι σε συνδυασμό με την μαννάνη προκαλεί έκκριση αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών. Επίσης στο Ν- τελικό άκρο προστέθηκε η γέφυρα (Lys-Gly) 4, μειωμένη κατά μία ομάδα (Lys-Gly), για να ελεγχθεί η ικανότητα σύζευξης του αναλόγου με την μαννάνη καθώς και η μείωση της θολερότητας που παρατηρήθηκε κατά την σύζευξη του με χρήση γέφυρας (Lys-Gly) 5 [121]. Σχεδιασμός πεπτιδικών αναλόγων(3γ) και (4Γ) της MOG: Έχει βρεθεί ότι κατά τη διάρκεια του σχηματισμού του τριμοριακού συμπλόκου, η Arg 41 αποτελεί κυρίαρχο αμινοξύ αλληλεπίδρασης του πεπτιδίου με τον υποδοχέα TCR των Τ κυττάρων [122]. Επίσης, η αντικατάσταση της Arg από Ala οδηγεί σε πεπτιδικό ανάλογο το οποίο αναστέλλει την εμφάνιση των συμπτωμάτων της νόσου σε ποντίκια C57BL/6 [113]. Πραγματοποιήθηκε σύνθεση του γραμμικού τροποποιημένου πεπτιδικού αναλόγου (4Γ) προκειμένου για τον εγκλωβισμό του σε PLGA νανοσωματίδια για την προστασία του από την πρωτεολυτική διάσπαση και τον έλεγχο βραδείας αποδέσμευσης αλλά και για την in vivo μελέτη. Τέλος, η αντικατάσταση της Arg με Lys πραγματοποιήθηκε για τη σύνθεση του κυκλικού πεπτιδικού αναλόγου (3Γ) από την πλευρική αμινομάδα της Lys στο C-τελικό άκρο του πεπτιδίου, καθώς όπως προαναφέρθηκε τα κυκλικά πεπτίδια εμφανίζουν ανοχή στα πρωτεολυτικά ένζυμα και είναι πιθανό λόγω δομής και στερεοχημικής παρεμπόδισης να προσδένονται ισχυρά στον HLA και να μην γίνεται η αναγνώρισή τους από τον TCR. Στο Ν-τελικό άκρο προστέθηκε η γέφυρα (Lys- Gly) 5 για μελλοντική σύζευξη με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη. Παρακάτω περιγράφονται σχηματικά οι συνθέσεις των πεπτιδικών αναλόγων, καθώς και τα αναλυτικά RP-HPLC με τα αντίστοιχα ESI-MS των τελικών προϊόντων μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. 68

86 Γ1.1 Σύνθεση αναλόγου cyclo(91-99) [(KG) 5 MBP (Lys 91 )] (1Γ) Σχήμα 19: Συνθετική πορεία του πεπτιδίου (1Γ). Οι αντιδράσεις σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας ελέγχθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και test Kaiser. Ο καθαρισμός του τελικού προϊόντος πραγματοποιήθηκε με ημιπαρασκευαστικο RP-HPLC και η ταυτοποίησή του με ESI-MS. Παρακάτω παρατίθενται τα αναλυτικά RP-HPLC πριν και μετά τον καθαρισμό και τη λυοφιλοποίηση του πεπτιδίου (1Γ), καθώς και το ESI-MS του τελικού προϊόντος μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. 69

87 Σχήμα 20: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (1Γ) πριν από τον καθαρισμό. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 15min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)] t R : 6.831min Σχήμα 21: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (1Γ) μετά τον καθαρισμό και τη λυοφιλοποίηση. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 15min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)] t R : 7.78min. Σχήμα 22: ESI-MS του προϊόντος (1Γ) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. M θεωρ = Παρατηρήσεις: Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του πεπτιδίου (1Γ) παρουσιάστηκαν προβλήματα στις συζεύξεις των αμινοξέων της γέφυρας και ιδιαίτερα στα κατάλοιπα Gly και εξαιτίας αυτής 70

88 της δυσκολίας χρειάστηκαν έως και τέσσερις επανασυζεύξεις έτσι ώστε να ολοκληρωθεί η σύζευξη. Όσον αφορά το χρωματογράφημα του Σχήματος 20, έγινε ταυτοποίηση για το παραπροϊόν με χρόνο έκλουσης 3.8min και αντιστοιχεί σε ανάλογο που δημιουργήθηκε από ατελή σύζευξη, κατά το σχηματισμό της πεπτιδικής αλυσίδας. Γ1.2 Σύνθεση αναλόγου (KG) 4 MBP (2Γ) Σχήμα 23: Συνθετική πορεία του πεπτιδίου (2Γ). Οι αντιδράσεις σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας ελέγχθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και test Kaiser. Σχήμα 24: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (2Γ) πριν από τον καθαρισμό. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 20min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) 71

89 [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)], t R : min Σχήμα 25: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (2Γ) μετά τον καθαρισμό και την λυοφιλοποίηση. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 15min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)] t R : 8.54min Σχήμα 26: ESI-MS του προϊόντος (2Γ) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. M θεωρ = Παρατηρήσεις: Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του πεπτιδίου (2Γ) δεν παρουσιάστηκαν ιδιαίτερα προβλήματα στις συζεύξεις των αμινοξέων. Όσον αφορά το χρωματογράφημα του Σχήματος 24, έγινε ταυτοποίηση για το παραπροϊόν με χρόνο έκλουσης 11.68min και αντιστοιχεί σε ανάλογο που δημιουργήθηκε από ατελή σύζευξη, κατά το σχηματισμό της πεπτιδικής αλυσίδας. 72

90 Γ1.3 Σύνθεση αναλόγου cyclo(41-55) [(KG) 5 MOG (Lys 41 )]_rat (3Γ) Σχήμα 27: Συνθετική πορεία του πεπτιδίου (3Γ). Οι αντιδράσεις σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας ελέγχθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και test Kaiser. Σχήμα 28: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (3Γ) πριν από τον καθαρισμό. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 20min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)], 73

91 t R : 10.7min Σχήμα 29: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (3Γ) μετά τον καθαρισμό και την λυοφιλοποίηση. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 15min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)] t R : 7.26min Σχήμα 30: ESI-MS του προϊόντος (3Γ) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. M θεωρ = 3462,88 Παρατηρήσεις: Κατά την σύνθεση του πεπτιδικού αναλόγου (3Γ) υπήρξαν δυσκολίες στην ανοικοδόμηση της αλυσίδας με αποτέλεσμα να χρειάζονται πολλές επανασυζεύξεις. Οι κορυφές που εμφανίζονται στο σχήμα 28 σαν παραπροϊόντα αποτελούν το πεπτίδιο με οξειδωμένη την μεθειονίνη (t R =10.2min) και το γραμμικό πεπτίδιο (t R =10.5min). Για τον καθαρισμό του συγκεκριμένου αναλόγου παρουσιάστηκαν ιδιαίτερα προβλήματα καθώς ο χρόνος έκλουσης των παραπροϊόντων ήταν πολύ κοντά σε αυτόν του προϊόντος. 74

92 Γ1.4 Σύνθεση αναλόγου MOG (Ala 41 ) (4Γ) Σχήμα 31: Συνθετική πορεία του πεπτιδίου (4Γ). Οι αντιδράσεις σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας ελέγχθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και test Kaiser. Σχήμα 32: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (4Γ) πριν από τον καθαρισμό. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 30min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)] t R : 17.7min 75

93 Σχήμα 33: Αναλυτικό RP-HPLC του πεπτιδίου (4Γ) μετά τον καθαρισμό και την λυοφιλοποίηση. Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18 (100x4,6mm) με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Συνθήκες: 10%(Β) έως 100%(Β) σε 15min, ροή: 1mL/min, (λ=214nm) [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0,08% (v/v)] t R : 7.3min Σχήμα 34: ESI-MS του προϊόντος (4Γ) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. M θεωρ = Παρατηρήσεις: Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του πεπτιδίου (4Γ) παρουσιάστηκαν προβλήματα στις συζεύξεις των αμινοξέων Asn, Arg(Pbf), Tyr(tBu) και χρειάστηκαν αρκετές επανασυζεύξεις προκειμένου να ολοκληρωθεί η σύνθεση. 76

94 Γ2.1 Χαρακτηριστικά των PLGA νανοσφαιρών Τα χαρακτηριστικά των νανοσφαιρών που χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη απελευθέρωσης in vitro φαίνονται στα παρακάτω σχήματα και ελήφθησαν με χρήση δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Η μέτρηση του Ζ-δυναμικού των φορτωμένων με το πεπτίδιο MOG (Ala 41 ) νανοσωματιδίων ελήφθη mv. Σχήμα 35: Καμπύλη προσδιορισμού μέσου μεγέθους νανοσωματιδίων με χρήση DLS ανάλυσης για το πεπτίδιο MOG (Ala 41 ). Σχήμα 36: Μικροφωτογραφία PLGA νανοσωματιδίων από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. 77