Δείκτες οξειδωτικού στρες σε παιδιά προέφη[kκτ^ς ηλικία^με συστηματική ενασχόληση σε αερόβιο άθλιβίί^

Transcript

1 ΓΙΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΕΧΟΑΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΓΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ. ' ' :AiAA(t>u6iTiKir- QYacttt frtl Ή» 1 Δείκτες οξειδωτικού στρες σε παιδιά προέφη[kκτ^ς ηλικία^με συστηματική ενασχόληση σε αερόβιο άθλιβίί^ :. ^ _., V * 1 Λ (->' γ--;,. \ ζ ir^' Γ, * ~ \ Λ.*" --W, ' V*",? " Λτ γκθϋγκουρα ςοφγα Λ " *. "*** *.& * -ΑΓ»5 4*-* Π *** «* - ~ ρ.v**r- W*. ν/γ;. ' 'r* *: Λάρισα 2005., u.; **.. -* ' ''.-ίξοοπ Viu,, - >. ΓΤ- -ΐτ1; Γ>/Ιί_ -I * 'i * 1 -vr-i~ * *JT

2 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ & ΠΛΗΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Ειδική Συλλογή «Γκρίζα Βιβλιογραφία» Αριθ. Εισ.: 4424/1 Ημερ. Εισ.: 29/03/2006 Δωρεά: Π.Θ. Ταξιθετικός Κωδικός: ΠΤ - ΒΒ 2005 ΓΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

3 Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον καθηγητή μου κ. Κουρέτα Δημήτριο για την ανάθεση της διπλωματικής μου εργασίας, την πολύτιμη βοήθειά του και την καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκειά της. Ακόμα θέλω να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κωσταρόπουλο Ιάσονα για τις γνώσεις που μου μετέδωσε, την υπομονή και την αμέριστη συμπαράστασή του κατά τη διάρκεια της διπλωματικής εργασίας όπως επίσης και για τις συμβουλές του για την περαιτέρω επαγγελματική μου πορεία. Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω τον κ. Νικολα'ίδη Μιχάλη και τον κ. Στάγκο Δημήτριο για την ευχάριστη συνεργασία και τη βοήθειά τους στο εργαστήριο. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τη φίλη και συνάδελφο κ. Μαργαρίτη Μαρία για τη συνεργασία μας και το ευχάριστο φιλικό περιβάλλον, όπως επίσης και όλα τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου.

4 1 Περιεχόμενα Συντομογραφίες... σελ. 3 Εικόνες και διαγράμματα...σελ. 4 Περίληψη...σελ. 7 Εισαγωγή...σελ. 8 1) Γενικά... σελ ) Εξέλιξη και οξυγόνο...σελ ) Ελεύθερες ρίζες - ορισμοί...σελ ) Παραγωγή ελευθέρων ριζών... σελ ) Βιολογική δράση...σελ ) Αρνητικές συνέπειες...σελ ) Θετικές συνέπειες... σελ ) Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί...σελ ) Γενικά...σελ ) Δισμουτάση του υπεροξειδίου (SOD)... σελ ) Καταλάση (CAT)...σελ ) Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX)... σελ ) Ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (GR)... σελ ) Συνεργειακή δράση της GPX και της CAT για τη διάσπαση του Η2Ο2 in vivo...σελ ) Άλλοι αντιοξειδωτικοί παράγοντες... σελ. 17 2) Φυσική άσκηση και οξειδωτικό στρες σελ ) Οξειδωτικό στρες - ένα πολυπαραγοντικό φαινόμενο... σελ ) Ιστορική αναδρομή... σελ ) Το παράδοξο της άσκησης... σελ ) Πως η άσκηση αυξάνει το οξειδωτικό στρες;... σελ ) Η άσκηση αυξάνει το ρυθμό της αναπνοής σελ ) Η δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης...σελ ) Ενεργοποίηση της φλεγμονώδους αντίδρασης σελ ) Συσσώρευση γαλακτικού οξέος... σελ ) Υπεροξείδωση λιπιδίων...σελ ) Φωσφοφρουκτοκινάση... σελ ) Αμφιλεγόμενα θέματα... σελ ) Αντιοξειδωτική απόκριση και άσκηση - ένα γενικό πλάνο... σελ ) Οξειδωτικό στρες και ηλικία σελ ) CoQ 10...ΖΙΖΖ^ΖΖΙΖΖΖΖΖΖΖΖσέλ ) Πρωτεΐνες θερμικού σοκ σελ ) GPX σελ ) GSH σελ ) SOD... σελ ) TBARS... σελ ) Καταλάση σελ ) Σκοπός της εργασίας... σελ. 31 Υλικά και μέθοδοι... σελ. 32 1) Υλικά σελ. 32 2) Ορός αίματος...,... σελ. 32 3) Αιμόλυμα... σελ. 32 4) Ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του ορού σελ. 32 5) TBARS... σελ. 33 6) Προσδιορισμός της δραστικότητας της καταλάσης ορού... σελ. 34

5 2 7) Ποσοτικός προσδιορισμός της GSH σε αιμόλυμα... σελ. 34 8) Προσδιορισμός της GSSG...σελ. 35 9) Στατιστική ανάλυση... σελ. 36 Αποτελέσματα... σελ. 37 1) Συγκριτικά αποτελέσματα των παραμέτρων μεταξύ της ομάδας ελέγχου και των αθλούμενων παιδιών...σελ. 38 2) Συσχετίσεις των παραμέτρων στην ομάδα των άθλούμενων παιδιών... σελ. 41 3) Συσχετίσεις των παραμέτρων στην ομάδα ελέγχου... σελ. 44 Συζήτηση... σελ. 47 Συμπεράσματα... σελ. 54 Επίλογος... σελ. 54 Βιβλιογραφία... σελ. 55

6 3 Συντομογραφίες ΑΑ - ασκορβικό οξύ ADP - δυφωσφορική αδενοσίνη ΑΗ - α-τοκοφερόλη ΑΜΡ - μονοφωσφορική αδενοσίνη ΑΡ-1 - activator protein-1 ATP - τριφωσφορική αδενοσίνη CAT- καταλάση CoQlO - συνένζυμο Q10 DHA - δεϋδροασκορβικό οξύ DPPH - 1,1 -diphenyl-2-picryl hydrazyl DTNB - 5,5 -dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) EDTA- αιθυλενοδιάμινο τετραοξικό οξύ EGF - επιδερμικός αυξητικός παράγοντας FAD - φλάβινο-αδένινο δινουκλεοτίδιο GH- αυξητική ορμόνη GPX - υπεροξειδάση της γλουταθειόνης GRX - ρεδουκτάση της γλουταθειόνης GSH - ανηγμένη μορφή γλουταθειόνης GSSG - οξειδωμένη μορφή γλουταθειόνης Hsp72 - πρωτεΐνη θερμικού σοκ 72 IGFBP-I - προσδενόμενη πρωτεΐνη στον ινσουλινομιμητικό αυξητικό παράγοντα IGF-I - ινσουλινομιμητικός αυξητικός παράγοντας-ι IL-lra - ιντερλευκίνη-lra IL-1 β - ιντερλευκίνη-1 β IL-6 - ιντερλευκίνη-6 L' - λιπιδιακή ρίζα LOO' - λιπουπεροξειδική ρίζα ΜΑΡΚ - mitogen activated protein kinases MDA - μαλονδυαλδεϋδη NADPH- φωσφορικό νικοτινάμιδο αδένινο δινουκλεοτίδιο NF-kB - nuclear factor-κβ NGF - nerve-derived growth factor PDGF- platelet-derived growth factor PMN - πολυμορφοουδετερόφιλα PTK- protein tyrosine kinases PUFAs - πολυακόρεστα λιπαρά οξέα Q - ουβικινόνη QH - ημικινόνη QH2 - ουβικινόλη RNS - ενεργές ενώσεις αζώτου ROO - λιπουπεροξειδική ρίζα ROOH- λιπουπεροξείδιο ROS - ενεργές ενώσεις οξυγόνου SOD - δισμουτάση του υπεροξειδίου TBARS - ενώσεις που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ TCA - τριχλωροξικό οξύ TNF-α - tumor necrosis factor-a XO - οξειδάση ξανθίνης

7 4 Εικόνες και διαγράμματα Εικόνα 1: Η οικογένεια των ROS περιλαμβάνει μόρια που είναι ρίζες και άλλα που δεν είναι αλλά παρουσιάζουν μεγάλη δραστικότητα (Από: Gabi Nindl, Cellscience Reviews, Vol 1, No 2, 2004)... σελ. 9 Εικόνα 2: Τα ROS (κίτρινο πλαίσιο) σχηματίζονται συνεχώς στον ανθρώπινο οργανισμό, είτε ως παραπροϊόντα του κυτταρικού μεταβολισμού, είτε ως σηματοδοτικά μόρια (μπλε πλαίσιο). Οι επιπτώσεις των ROS στον οργανισμό διαχωρίζονται σε θετικές και αρνητικές (πράσινο πλαίσιο). Ωστόσο πάντα υπάρχει μια λεπτή ισορροπία μεταξύ της παραγωγής ROS και της δράσης των αντιοξειδωτικών μορίων (κόκκινο πλαίσιο). (Από: Gabi Nindl, Cellscience Reviews, Vol 1, No 2, 2004)...σελ. 11 Εικόνα 3: Η ενζυμική αντιοξειδωτική απόκριση του κυττάρου στην αύξηση των επιπέδων των ROS. (Από: James A. Thomas, ΒΒ 404 Supplement/1999)... σελ. 12 Εικόνα 4: Η δομή της Cu-Zn SOD ( ml)... σελ. 13 Εικόνα 5: Η δομή της καταλάσης ( ml)... σελ. 15 Εικόνα 6: α) Το τριπεπτίδιο της γλουταθειόνης : γ-γλουταμινικό-κυστεϊνη-γλυκίνη β) Η οξειδωμένη μορφή της γλουταθειόνης (Από: James A. Thomas ΒΒ 404 Supplement/1999)...σελ 15 Εικόνα 7: Η δομή της ρεδουκτάσης της γλουταθειόνης. Στην εικόνα αποικονίζεται ενωμένη με ένα μόριο FAD. (Από: ΡΑΙ X-RAY CRYSTALLOGRAPHY LAB)... σελ. 16 Εικόνα 8: Δομή ασκορβικού οξέος ( ml)... σελ. 17 Εικόνα 9: Η βιταμίνη Ε ενσωματώνεται με την λιπόφιλη ουρά της στη λιπιδιακή διπλοστοιβάδα και την προστατεύει από οξειδωτική βλάβη. (Από: Garrett D. Guy, JAAPA Archive, 1997)...σελ. 18 Εικόνα 10: Η ουβικινόνη (Q) ανάγεται προς ουβικινόλη (QH2) μέσω μιας ενδιάμεσης ημικινόνης (QH) (Από: Stryer L., 1997)... σελ. 21 Εικόνα 11: Παραγωγή ελευθέρων ριζών από το σύστημα της οξειδάσης της ξανθίνης (Από: Crossnan and Moldave, Methods in enzymology, Vol XII, 1967)... σελ. 22 Εικόνα 12: Παραγωγή H2O2 από τα Τ λεμφοκύτταρα κατά τη φλεγμονώδη αντίδραση. (Από: Gabi Nindl, Cell Science Reviews, 2004)...σελ. 22

8 Εικόνα 13: Στάδια υπεροξείδωσης λιπιδίων. (Από: James A. Thomas ΒΒ 404 Supplement/1999)... σελ. 24 Εικόνα 14: Χημική δομή του DPPH (Από: Halliwell and Gutteridge, 1998)... σελ. 32 Εικόνα 15: Αντίδραση του ΤΒΑ με την MDA προς σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος. (Από: Halliwell and Gutteridge, 1998)...σελ. 33 Εικόνα 16: Αντίδραση παραγωγής έγχρωμου προϊόντος από το DTNB. (Από: σελ. 35 Εικόνα 17: Συσχέτιση της άσκησης με την υγεία και την ανάπτυξη στα παιδιά. (Από: Cooper et al., 2004, Pulmonology, 16:3)...σελ. 50 Εικόνα 18: Οι παράγοντες φλεγμονής ενεργοποιούνται από τα ROS και στη συνέχεια τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εκκρίνουν επιπρόσθετα ROS, συνεχίζοντας έτσι τον κύκλο της φλεγμονής Εικόνα 19 : Οι κύριοι μοριακοί στόχοι των ROS (Από: Poll et al., Current Medical Chemistry, 2004, 11, )...σελ. 53 Διάγραμμα 1: Ραβδόγραμμα της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του ορού της ομάδας των προπονημένων ατόμων και της ομάδας ελέγχου. Ο αστερίσκος δείχνει σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων παιδιών (Ρ<0.05)... σελ. 38 Διάγραιιιια 2: Ραβδόγραμμα TBARS στον ορό της ομάδας των κολυμβητών και της ομάδας ελέγχου στο οποίο δεν διαφαίνεται σημαντική (Ρ>0,05) διαφορά... σελ. 38 Διάγρααμα 3: Ραβδόγραμμα για τη δραστικότητα της καταλάσης στο οποίο δεν διαφαίνεται σημαντική (Ρ>0,05) διαφορά...σελ. 39 Διάγραιιμα 4: Ραβδόγραμμα της GSH για τις δύο ομάδες παιδιών. Ο αστερίσκος δείχνει σημαντική (Ρ>0,0001) διαφορά...σελ. 39 Διάγραιιαα 5: Ραβδόγραμμα της GSSG όπου δεν διαφαίνεται σημαντική (Ρ>0,05) διαφορά...σελ. 40 Διάγραααα 6: Ραβδόγραμμα του λόγου GSH/GSSG για την ομάδα των κολυμβητών και την ομάδα ελέγχου. Ο αστερίσκος δείχνει σημαντική (Ρ<0,01) διαφορά...σελ. 40 Διάγραααα 7: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της δραστικότητας της καταλάσης (Ρ=0,061, r=-0,463, 95% C.I: -0,778, 0,038)... σελ. 41

9 6 Διάγραααα 8: Θετική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και της συγκέντωσης και της συγκέντρωσης GSSG (Ρ=0,002, r=0,693, 95% C.I: 0,305, 0,884)......σελ. 41 Διάγραααα 9: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και του λόγου GSH/GSSG (Ρ=0,01, r=-0,604, 95% C.I: -0,845, -0,159)...σελ. 42 Διάγραμιια 10: Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης GSH και GSSG (Ρ=0,025, r=0,541, 95% C.I: 0,066, 0,816)...σελ. 42 Διάγρααιια 11: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της GSSG και του λόγου GSH/GSSG (ΡΟ,ΟΟΟΙ, r=-0,925, 95% C.I: -0,974, -0,794)...σελ. 43 Διάγραααα 12: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης GSSG και του λόγου GSH/GSSG (ΡΟ,ΟΟΟΙ, r=-0,9441, 95% C.I: -0,985, -0,8010)... σελ. 43 Διάγραααα 13: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης TBARS, αν και η στατιστική σημαντικότητα δεν είναι ικανοποιητική (Ρ-0,0999, r=-0,4974, 95% C.I: -0,8392, 0,1263)...σελ. 44 Διάγραααα 14: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης GSH (Ρ=0,0208, r=-0,6550, 95% C.I: -0,8970, -0,1107)... σελ. 45 Διάγραμμα 15: Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης TBARS και της GSSH, με μικρή στατιστική σημαντικότητα (Ρ=0,0867, r=0,5149, 95% C.I: -0,1031, 0,8461)... σελ. 45 Διάγραααα 16: Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης TBARS και της GSH (Ρ=0,0229, r=0,6474, 95% C.I: 0,09764, 0,8944)...σελ. 46

10 7 Περίληψη Το οξειδωτικό στρες και η παραγωγή ελευθέρων ριζών έχει απασχολήσει αρκετά την επιστημονική κοινότητα γιατί όπως φαίνεται είναι μια βασική αιτία για πολλά σύγχρονα νοσήματα όπως το μεταβολικό σύνδρομο, ο διαβήτης τύπου 2, η παχυσαρκία, ο καρκίνος και οι διάφορες μορφές καρδιαγγειακών ασθενειών. Στον αντίποδα η φυσική άσκηση παρουσιάζεται ως αποτελεσματική προληπτική μέθοδος. Ωστόσο το παράδοξο είναι πως η άσκηση αποτελεί ταυτόχρονα μια κύρια πηγή ελευθέρων ριζών και ένα προσαρμοστικό μηχανισμό στο έντονο οξειδωτικό στρες. Αν και έχουν γίνει εκτεταμένες έρευνες για τον καθορισμό της σχέσης μεταξύ άσκησης και οξειδωτικού στρες στους ενήλικες, υπάρχει μεγάλη έλλειψη στοιχείων για τα παιδιά. Στη συγκεκριμένη μελέτη έγινε προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες σε κατάσταση ηρεμίας σε παιδιά που ασχολούνται με τη κολύμβηση σε αντιπαράθεση με μια ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα των πειραματικών διαδικασιών έδειξαν μη στατιστικά σημαντικές (Ρ>0,05) διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων στα επίπεδα της MDA (προπονημένοι 5,09 ± 0,44, απροπόνητοι 6,53 ± 0,58), της GSSG (προπονημένοι 0,055 ± 0,008, απροπόνητοι 0,046 ± 0,058) και στη δραστικότητα της καταλάσης (προπονημένοι 14,36 ± 1,60, απροπόνητοι 22,64 ± 3,93). Στατιστικά σημαντικές διαφοροποιήσεις παρατηρήθηκαν στον προσδιορισμό της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (προπονημένοι 18,80 ± 1,78, απροπόνητοι 25,99 ± 1,24), στα επίπεδα της GSH (προπονημένοι 0,42 ± 0,02, απροπόνητοι 0,66 ± 0,03) και κατά επέκταση και στο λόγο GSH/GSSG (προπονημένοι 10,26 ± 1,49, απροπόνητοι 18,10 ± 2,76). Σύμφωνα με τα συγκεκριμένα αποτελέσματα η άσκηση δεν επάγει την ενεργοποίηση αντιοξειδωτικών μηχανισμών στα παιδιά όπως συμβαίνει στους ενήλικες και τα επίπεδα ROS ρυθμίζονται με άλλους μηχανισμούς. Η αιτιολογία ίσως να έγκειται στο γεγονός πως στα παιδιά δεν έχουν αναπτυχθεί πλήρως οι αντίστοιχοι προσαρμοστικοί μηχανισμοί ή ακόμα τα ROS να θεωρούνται ως σημαντικά σηματοδοτικά μόρια που ρυθμίζουν διαδικασίες ανάπτυξης και διαφοροποιήσεις που κυρίως συμβαίνουν κατά την παιδική ηλικία.

11 8 Εισαγωγή 1) Γενικά 1.1) Εξέλιξη και οξυγόνο Το οξυγόνο εμφανίσθηκε σε σημαντικά ποσοστά στην ατμόσφαιρα της γης πριν από δισεκατομμύρια χρόνια και γεωλογικά στοιχεία αποδεικνύουν πως το γεγονός αυτό συνέβη λόγω της εξέλιξης της φωτοσύνθεσης από κυανοβακτήρια. Σήμερα εκτός από ορισμένους αναερόβιους και αερο-ανεκτικούς οργανισμούς όλα τα ζώα, τα φυτά και τα βακτήρια απαιτούν οξυγόνο για την επαρκή παραγωγή ενέργειας στην αναπνευστική αλυσίδα των μιτοχονδρίων για τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ή κάποιας άλλης αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Αυτή η ανάγκη για οξυγόνο καλύπτει το γεγονός ότι στην πραγματικότητα το οξυγόνο μέσω των παραγώγων του είναι επικίνδυνο για τη ζωή. Οι αερόβιοι οργανισμοί επιζούν λόγω του ότι διαθέτουν αντιοξειδωτικές άμυνες που τους προστατεύουν από τη δράση του (Halliwell and Gutteridge 1998). Οι οργανισμοί που ανέχονται την παρουσία οξυγόνου εξελίχθηκαν με τέτοιο τρόπο ούτως ώστε να διαθέτουν τη δυνατότητα να το χρησιμοποιούν μεταβολικά (π.χ σε ενζυμικά συστήματα οξειδασών, οξυγενασών και υδροξυλασών) αλλά και για την παραγωγή ενέργειας κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση (Halliwell and Gutteridge 1998). Πολλοί εξελικτικοί βιολόγοι πιστεύουν πως ο μηχανισμός της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης στα μιτοχόνδρια εξελίχθηκε πολύ αργότερα από την ανάπτυξη προσαρμοστικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Λόγω όμως του γεγονότος ότι παράγονταν μεγάλη ποσότητα ΑΤΡ κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση, η οξειδωτική φωσφορυλίωση επικράτησε κατά τη διαδικασία της φυσικής επιλογής σε τόσο μεγάλο βαθμό, ώστε σήμερα πλέον να γίνεται λόγος για πλήρη εξάρτηση των περισσότερων οργανισμών από την αερόβια αναπνοή (Bulkley, 1990). 1.2) Ελεύθερες ρίζες-ορισμοί Το μοριακό οξυγόνο δεν είναι τοξικό λόγω της ηλεκτρονικής δομής του η οποία το καθιστά ανενεργό. Το ατομικό όμως οξυγόνο μπορεί να αποβεί καταστροφικό επειδή είναι ελεύθερη ρίζα που περιέχει δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Ποια όμως είναι ακριβώς η φύση των ελεύθερων ριζών; Τα μόρια αποτελούνται από ένα ή περισσότερους ατομικούς πυρήνες, οι οποίοι περιβάλλονται από ηλεκτρόνια. Όταν κάθε ηλεκτρόνιο της εξωτερικής στοιβάδας βρίσκεται συζευγμένο με κάποιο άλλο ηλεκτρόνιο αντίθετης στροφορμής, τότε το μόριο διατηρείται σχετικά σταθερό σε ένα επίπεδο χαμηλής ενέργειας, και κατά συνέπεια είναι λιγότερο δραστικό. Όταν ένα ή περισσότερα ηλεκτρόνια, της εξωτερικής στοιβάδας μένει μονήρες, το μόριο γίνεται ασταθές και έτσι τείνει να αντιδράσει περισσότερο με άλλα μόρια (Bulkley, 1990). Οι ελεύθερες ρίζες είναι μόρια με ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική στοιβάδα. Λόγω του ότι ο ορισμός της ελεύθερης ρίζας είναι αρκετά ευρύς, υπάρχουν αρκετές ελεύθερες ρίζες στη χημεία και στη βιολογία. Η πιο απλή είναι το ατομικό υδρογόνο που έχει μόνο ένα ηλεκτρόνιο ασύζευκτο. Οι ρίζες κατά γενικό κανόνα παράγονται κατόπιν της απώλειας ενός ηλεκτρονίου από μια μη-ρίζα για παράδειγμα X -» ε' + Χ,+

12 9 ή από την απόκτηση ενός μονήρους ηλεκτρονίου από μια μη-ρίζα για παράδειγμα Υ + e~ -» Υ* Οι ρίζες σχηματίζονται επίσης με τη διάσπαση ενός ομοιοπολικού δεσμού εάν ένα ηλεκτρόνιο από το συνεισφερόμενο ζεύγος παραμένει με κάθε άτομο. Η διαδικασία είναι γνωστή ως ομολυτική διάσπαση. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το εξής: Η * Ο -5- Η -> Η* + ΟΗ* Η ετερολυτική διάσπαση αφορά στην απόκτηση και των δύο ηλεκτρονίων από το ένα άτομο όταν διασπασθεί ο ομοιοπολικός δεσμός, δηλαδή: H-fO-H->H+ + OH'* (Halliwell and Guteridge, 1998). Οι ελεύθερες ρίζες λόγω της μεγάλης αστάθειάς τους, αντιδρούν γρήγορα με γειτονικά μόρια, αφαιρώντας, δίνοντας ή συνεισφέροντας αμοιβαία κάποια ηλεκτρόνια της εξωτερικής τους τροχιάς. Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να ξεκινήσουν αλυσιδωτή αντίδραση με αποτέλεσμα την τροποποίηση πολλών μορίων, καθώς τα ηλεκτρόνια μπορούν να μεταπηδούν από ένα μόριο-στόχο στο επόμενο. Η μεγάλη δραστικότητα των ελεύθερων ριζών οξυγόνου οφείλεται στην ιδιότητά τους να δημιουργούν αλυσιδωτές αντιδράσεις (Bulkley, 1990). Εκτός από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (Ο2* και ΟΗ*), υπάρχουν και κάποια παράγωγα οξυγόνου που δεν περιέχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια αλλά είναι ιδιαίτερα δραστικά, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2), το ατομικό οξυγόνο και το υποχλωριώδες οξύ (HOC1) και προσδιορίζονται από το γενικότερο όρο δραστικές ενώσεις οξυγόνου ή ROS (reactive oxygen species)(sik0va 1) (Nindl, 2004). Reactive Oxygen Species (ROS) ROS contain non-radicals...and radicals H λ m Molecules: I Ο O»* Hydrogen H Peroxide (H:0:) Ions: jojci: «Hypochlorite Ion(OCl-) :*o*:h * Hydroxyl Radical (OH ) * ~ 0: o: «Super oxide Anion (0; ) *0*0* H * * Hydroperaxyi Radical (HO:) Εικόνα 1: Η οικογένεια των ROS περιλαμβάνει μόρια που είναι ρίζες και άλλα που δεν είναι αλλά παρουσιάζουν μεγάλη δραστικότητα (Από: Gabi Nindl, Cellscience Reviews, Vol 1,Νο2, 2004).

13 10 1.3) Παραγωγή ελευθέρων ριζών Η ανεπιθύμητη παραγωγή ελευθέρων ριζών μέσα στο κύτταρο προέρχεται κυρίως από: Τη διαρροή ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα των μιτοχονδρίων Τη λειτουργία του συστήματος του κυτοχρώματος Ρ450 Τις αντιδράσεις αυτοοξείδωσης ενώσεων όπως οι κατεχο λα μίνες, το ασκορβικό οξύ, και οι ανηγμένες φλαβίνες, οι οποίες αφού αντιδράσουν με το οξυγόνο, οδηγούν σε άμεση παραγωγή (V~. Στην πραγματικότητα οι συγκεκριμένες αντιδράσεις αυτοοξείδωσης συνήθως καταλύονται από ιόντα μετάλλων (Halliwell and Cross, 1994). 1.4) Βιολογική δράση Όλοι οι οργανισμοί εκτίθενται σε ρίζες ΟΗ* λόγω του ότι παράγεται in vivo κατά την ομολυτική σύντηξη των δεσμών Ο-Η στα μόρια νερού υπό τη συνεχή επίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας. Οι ρίζες υδροξυλίου είναι τόσο δραστικές με όλα τα βιολογικά μόρια που είναι αδύνατο να δημιουργηθεί ένας εξειδικευμένος μηχανισμός απομάκρυνσής τους (Halliwell and Cross, 1994) ) Αρνητικές συνέπειες Η μακροπρόθεσμη έκθεση του οργανισμού στα ROS έχει ως αποτέλεσμα την τροποποίηση βιολογικών μορίων όπως το DNA, τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες (Rovira and Finkel, 2005). Για αυτό το λόγο έχει προταθεί (Druge, 2002) ότι η γήρανση των κυττάρων οφείλεται στη σταδιακή συσσώρευση κατεστραμμένου πυρηνικού και μιτοχονδριακού DNA. Μάλιστα, το μιτοχονδριακό DNA είναι πιο ευαίσθητο σε οξειδωτικές βλάβες γιατί διαθέτει λιγότερους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς συγκριτικά με το πυρηνικό. Όσο αφορά την καταστροφή των πρωτεϊνών, έχει βρεθεί πως αυξάνεται με την ηλικία (Standman, 2001). Τέλος, η επίθεση των ελεύθερων ριζών μειώνει τη ρευστότητα των κυτταρικών μεμβρανών, μέσω της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, και διαταράσσει τη λειτουργία των πρωτεϊνών που βρίσκονται προσδεδεμένες στη μεμβράνη (Beckman and Ames, 1998) ) Θετικές συνέπειες Στον αντίποδα βέβαια βρίσκεται και η θετική επίδραση των ελευθέρων ριζών. Το κλασσικό παράδειγμα της αναγκαίας παραγωγής ROS αφορά στην ενεργοποίηση των φαγοκυττάρων. Υπάρχουν ακόμα ενδείξεις πως το 02*~ παράγεται από αρκετούς κυτταρικούς τύπους, εκτός των φαγοκυττάρων, όπως τα λεμφοκύτταρα, οι ινοβλάστες και τα αγγειακά επιθηλιακά κύτταρα. Ο ρόλος του σε αυτή την περίπτωση έγκειται στην ενεργοποίηση ενδοκυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών και στη ρύθμιση σημαντικών βιολογικών λειτουργιών. Επίσης η παραγωγή 02*~, HOC1 και Η2Ο2 από τα φαγοκύτταρα είναι γνωστό ότι συμβάλλει στην αντιμετώπιση αρκετών βακτηρίων και στελεχών μυκήτων. Η θετική δράση του Η2Ο2 εντοπίζεται στο ότι χρησιμοποιείται από το ένζυμο θυροειδική περοξειδάση για το σχηματισμό τω θυροειδικών ορμονών (Halliwell and Cross, 1994). Στην εικόνα 2 φαίνεται συνοπτικά ο μεταβολισμός των ROS.

14 11 Εικόνα 2: Τα ROS (κίτρινο πλαίσιο) σχηματίζονται συνεχώς στον ανθρώπινο οργανισμό, είτε ως παραπροϊόντα του κυτταρικού μεταβολισμού, είτε ως σηματοδοτικά μόρια (μπλε πλαίσιο). Οι επιπτώσεις των ROS στον οργανισμό διαχωρίζονται σε θετικές και αρνητικές (πράσινο πλαίσιο). Ωστόσο πάντα υπάρχει μια λεπτή ισορροπία μεταξύ της παραγωγής ROS και της δράσης των αντιοξειδωτικών μορίων (κόκκινο πλαίσιο). (Από: Gabi Nindl, Cellscience Reviews, Vol 1, No 2, 2004). 1.5) Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί 1.5.1) Γενικά Επειδή τα συστατικά ενός ζωντανού κυττάρων είναι πολύ ευπαθή σε επιθέσεις ελεύθερων ριζών, η φυσική επιλογή οδήγησε κατά την εξέλιξη στη δημιουργία ενός αριθμού ενδοκυτταρικών μηχανισμών που εξισορροπούν ή ελέγχουν τη δραστικότητα των ROS (Bulkley, 1990). Η παραγωγή ROS και η απόκριση της αντιοξειδωτικής άμυνας εμφανίζεται σε μια ισορροπία in vivo. Στην πραγματικότητα η ισορροπία είναι ελαφρώς μετατοπισμένη προς όφελος των ROS, αφού όπως προαναφέρθηκε τα ROS είναι υπεύθυνα για την ενεργοποίηση ενδοκυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών, οπότε υπάρχει μια συνεχής ήπια οξειδωτική βλάβη στον ανθρώπινο οργανισμό. Το οξειδωτικό στρες λαμβάνει χώρα όταν η παραγωγή ROS ξεπερνά κατά πολύ αυτή την ισορροπία Για αυτό το λόγο υπάρχει η ανάγκη της δράσης αντιοξειδωτικών μηχανισμών (Bulkley, 1990).

15 12 Μια βασική προσαρμογή των οργανισμών στην επίθεση του οξειδωτικού στρες είναι η ίδια η αναπνευστική αλυσίδα. Τα ηλεκτρόνια περνάν κατά μήκος της αλυσίδας, η οποία επιπλέον βρίσκεται περιορισμένη σε συγκεκριμένη κυτταρική περιοχή, οπότε ελαχιστοποιείται ο κίνδυνος διαρροής (V-. Επίσης το ένζυμο κυτοχρωμική οξειδάση καταλύει την τελική αναγωγή τεσσάρων ηλεκτρονίων του Ο2 σε Η2Ο2 χωρίς την απελευθέρωση ROS. Γενικότερα οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν: Ένζυμα όπως η δισμουτάση του υπεροξειδίου, η καταλάση και η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, που απομακρύνουν ελεύθερες ρίζες ή άλλα ενεργά μόρια. Πρωτεΐνες που ελαχιστοποιούν τη διαθεσιμότητα προοξειδωτικών παραγόντων όπως τα ιόντα σιδήρου, τα ιόντα χαλκού και η αίμη. Παραδείγματα αυτής της κατηγορίας αποτελούν οι τρανσφερίνες, οι μεταλλοθειονίνες, η σερουλοπλασμίνη και οι πρωτεΐνες που προσδένουν την αίμη απτογλοβίνη και αιμοπεξίνες. Πρωτεΐνες που προστατεύουν τα βιομόρια από την οξειδωτική καταστροφή όπως για παράδειγμα οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ. Μικρού μοριακού βάρους διαλυτοί παράγοντες που απομακρύνουν τα ROS και RNS όπως η γλουταθειόνη, η α-τοκοφερόλη, το ασκορβικό οξύ και το ουρικό οξύ (Bulkley, 1990). Ο γενικότερος όρος που μπορεί να αποδοθεί για τον προσδιορισμό των αντιοξειδωτικών είναι «κάθε ουσία που όταν βρίσκεται σε χαμηλή συγκέντρωση συγκριτικά με το οξειδωμένο υπόστρωμα, καθυστερεί ή αναστέλλει σημαντικά την οξείδωση του συγκεκριμένου υποστρώματος» (Halliwell and Gutteridge, 1998). Η αντιοξειδωτική άμυνα εμφανίζει διαφορές μεταξύ των διαφορετικών ιστών και κυτταρικών τύπων. Τα εξωκυτταρικά υγρά διαθέτουν διαφορετικούς προστατευτικούς μηχανισμούς σε σχέση με το ενδοκυτταρικό περιβάλλον. Μια συνοπτική εικόνα αυτής της απόκρισης του κυττάρου φαίνεται στην εικόνα 3.

16 ) Δισμουτάση του υπεροξειδίου (SQD) Η SOD αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού και καταλύει την παρακάτω αντίδραση: Ο2 + Ο2 + 2Η+ ^ Η2Ο2 + Ο2 Υπάρχουν τρεις τύποι SOD: η κυτταροπλασματική Cu-Zn SOD, η μιτοχονδριακή Mn-SOD και η εξωκυτταρική SOD (Mylonas and Kouretas, 1999). 1. Cu-Zn SOD Oi Cu-Zn SOD που έχουν απομονωθεί από ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν μοριακό βάρος περίπου ίσο με και αποτελούνται από δύο υπομονάδες από τις οποίες η μία φέρει ένα άτομο Ζη και η άλλη ένα άτομο Cu (εικόνα 4). Εικόνα 4: Η δομή της Cu-Zn SOD ( Πιο αναλυτικά το ιόν χαλκού φαίνεται πως συμμετέχει στην αντίδραση της δισμουτάσης και υφίσταται διαδοχικά οξέιδωση και αναγωγή, δηλαδή Ένζυμο-Cu^ + 02~* ->Ένζυμο-Cu" + 02 Ένζυμο-Cu"1' + 02' * + 2Η+ -> Ένζυμο-Cu24, + Η202 Το ιόν Ζη2+ δεν συμμετέχει στον καταλυτικό κύκλο αλλά συμβάλλει στη σταθερότητα του ενζύμου. Επιπλέον, κατόπιν πειραμάτων, παρατηρήθηκε πως ενώ το ιόν Cu2+ είναι αναντικατάστατο στο ολοένζυμο, το ιόν Ζη2+ μπορεί να αντικατασταθεί από άλλα μέταλλα όπως το κοβάλτιο, ο υδράργυρος και το κάδμιο (Halliwell and Gutteridge, 1998).

17 14 2. Mn-SOD H Mn-SOD απαντάται σε βακτήρια, φυτά και ζώα, σχεδόν αποκλειστικά στα μιτοχόνδρια. Έχει μοριακό βάρος περίπου ίσο με και περιέχει στο ενεργό της κέντρο ένα ιόν μαγγανίου. Η αντίδραση που καταλύει είναι συνοπτικά η Μη(ΙΙΙ) + 02 * <-> [Μη(ΙΙΙ)- 02~ *] -4 Μη Μπ " * [Μπ *] +2Η+ -> Μπ(ΙΙΙ) + Η202 Σε αντίθεση με την Cu-Zn SOD η δραστικότητά της μειώνεται σε αλκαλικό ph. Η Mn-SOD των ανώτερων οργανισμών αποτελείται από 4 υπομονάδες και περιέχει 0,5-1,0 ιόν μαγγανίου ανά υπομονάδα. Το ένζυμο χάνει τη δραστικότητά του με απομάκρυνση του ιόντος (Halliwell and Gutteridge, 1998). 3. Εξωκυτταρική SOD Ο τρίτος τύπος SOD έχει σχετικά υψηλό μοριακό βάρος σε σύγκριση με τους άλλους δύο (περίπου ) και είναι μια τετραμερής γλυκοπρωτέΐνη στην οποία κάθε υπομονάδα περιέχει ένα άτομο χαλκού και ένα άτομο ψευδαργύρου. Υπάρχουν αρκετές μορφές εξωκυτταρικής SOD (A, Β και C). Έχει παρατηρηθεί πως το μεγαλύτερο ποσοστό της είναι προσδεδεμένο στην επιφάνεια του κυττάρου μαζί με υδρογονάνθρακες, ιδιαίτερα στους πνεύμονες και στα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων (Halliwell and Gutteridge, 1998) ) Καταλάση (CAT) Το παραγώμενο H202 που προέρχεται είτε από τις αντιδράσεις της SOD, είτε από διάφορες οξειδάσες όπως η οξειδάση της ξανθίνης, του ουρικού και των D- αμινοξέων διασπάται από το ένζυμο καταλάση σύμφωνα με την αντίδραση: 2Η202 2Η kl Πιο αναλυτικά : ΚαταλάσηΈε(ΙΙΙ) + Η202 -» σύμπλοκο I + Η20 k2 Σύμπλοκο I + Η202» καταλάση-εε(ιιι) + Η όπου ki = 1,7 -IO mv και k2 = 2,6 ΙΟ7 M'V Στα ζώα η καταλάση βρίσκεται σε όλα τα κύρια όργανα με ιδιαίτερα αυξημένη συγκέντρωση στο συκώτι και στα ερυθροκύτταρα. Εφόσον το Η202 διαχέεται εύκολα, τα ερυθροκύτταρα προστατεύουν τον οργανισμό από την καθολική έκθεσή του στο Η202. Η καταλάση των θηλαστικών αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες, κάθε μία από τις οποίες περιέχει μια ομάδα αίμης (εικόνα 5) (Halliwell and Gutteridge, 1998).

18 15 Catalase Εικόνα 5: Η δομή της καταλάσης ( ) Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) Εκτός από την καταλάση, υπάρχει και μια ακόμα οδός απομάκρυνσης του FECK η οποία περιγράφεται από την αντίδραση: FECK + 2GSH -> GSSG + 2Η20. Το ένζυμο υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) καταλύει την αντίδραση οξείδωσης της ανηγμένης μορφής της γλουταθειόνης (GSH) σε GSSG. Η γλουταθειόνη είναι ένα τριπεπτίδιο χαμηλού μοριακού βάρους το οποίο απαντάται στο κυτταρόπλασμα αλλά και στα μιτοχόνδρια των ζώων, φυτών και πολλών αερόβιων βακτηρίων (εικόνα 6 α και β). nh3 5Η I 00C-CH ch2 C00G CH2 0 1 II 6h2 CH C N H CH2 o=c rvn 1 NH c=o ch2 coo0 CH CH2--S S-CH2-CH I 0=C NH ch2 I < Glutathione NH c=o ch-nh31 <!ή2 CH2 COO ch2 coo -COO θνη3 Glutathione disulfide (GSSG) Εικόνα 6: a) To τριπεπτίδιο της γλουταθειόνης : γ-γλουταμινικό-κυστεϊνη-γλυκίνη β) Η οξειδωμένη μορφή της γλουταθειόνης (Από: James A. Thomas ΒΒ 404 Supplement/1999)

19 16 H GPX εκτός από τη διάσπαση του Η2Ο2 καταλύει την αναγωγή των υποροξειδίων των λιπαρών οξέων σύμφωνα με την αντίδραση: LOOH + 2GSH -> GSSG + Η20 + LOH Η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες κάθε μία από τις οποίες περιλαμβάνει ένα άτομο σεληνίου (Se) στο ενεργό της κέντρο (Halliwell and Gutteridge, 1998) ) Ρεδουκτάση γλουταθειόνης (GR) Εφόσον ο λόγος της ανηγμένης προς την οξειδωμένη μορφή της γλουταθειόνης στα φυσιολογικά κύτταρα είναι υψηλός, υπάρχει και ο ανάλογος μηχανισμός αναγωγής της GSSG σε GSH. Η συγκεκριμένη αντίδραση καταλύεται από το ένζυμο ρεδουκτάση της γλουταθειόνης GSSG + NADPH + Η+ -> 2GSH + NADP+. To NADPH προκύπτει από το μονοπάτι των φωσφορικών πεντοζών. Όσο η ρεδουκτάση της γλουταθειόνης μειώνει το λόγο NADPH/NADP+, τόσο επιταχύνεται η παραγωγή NADPH. Η ρεδουκτάση της γλουταθειόνης αποτελείται από δύο υπομονάδες, με ένα μόριο FAD σε κάθε ενεργό κέντρο. Προφανώς το NADPH ανάγει το FAD, το οποίο στη συνέχεια προωθεί τα ηλεκτρόνιά του στη δισουλφιδική γέφυρα μεταξύ δύο καταλοίπων κυστεΐνης στο ενεργό κέντρο. Με αυτό τον τρόπο σχηματίζονται δύο ομάδες -SH που αντιδρούν με τη GSSG και την ανάγουν σε GSH, οπότε και πραγματοποιείται η ανακύκλωση του ενζύμου (εικόνα 7) (Halliwell and Gutteridge, 1998). Εικόνα 7: Η δομή της ρεδουκτάσης της γλουταθειόνης. Στην εικόνα αποικονίζεται ενωμένη με ένα μόριο FAD. (Από: ΡΑΙ X-RAY CRYSTALLOGRAPHY LAB)

20 ) Συνεργειακή δράση της GPX και της CAT για την διάσπαση του Η2Ο2 in vivo Εφόσον τόσο η CAT όσο και η GPX έχουν κοινό στόχο τη διάσπαση του Η2θ2, τίθεται το ερώτημα για το ποιο ένζυμο είναι πιο σημαντικό σε in vivo συνθήκες. Έχει διαπιστωθεί ότι σε χαμηλές συγκεντρώσεις IΙ202 την διάσπασή του αναλαμβάνει η GPX. Όταν τα επίπεδα του Η2Ο2 αυξάνονται στους ιστούς τότε η αποικοδόμησή του καταλύεται κυρίως από την CAT (Halliwell and Gutteridge, 1998) ) Αλλοι αντιοξειδωτικοί παράγοντες Εκτός από τους ενζυμικούς μηχανισμούς αντιμετώπισης των ROS, υπάρχει και μια μεγάλη ομάδα μη ενζυμικών αντιοξειδωτικών ενώσεων. Ορισμένα μέταλλα όπως ο χαλκός και ο σίδηρος θεωρούνται ρίζες αφού διαθέτουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια και μπορούν να αντιδράσουν με το Η2Ο2 προς σχηματισμό 02 *. Τα μέταλλα αυτά προσδένονται σε πρωτεΐνες και συγκεκριμένα ο σίδηρος με την τρανσφερίνη, τη λακτοφερίνη και τη φερριτίνη και ο χαλκός με τη σερουλοπλασμίνη. Η μελατονίνη είναι μια ορμόνη που φαίνεται πως επάγει την έκφραση αντιοξειδωτικών παραγόντων. Το συνένζυμο Q στην μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα προστατεύει τα λίπη από υπεροξείδωση που μπορεί να προκληθεί από την ουβισεμικινόνη (Halliwell and Gutteridge, 1998). Εκτός όμως από τα ενδογενή αντιοξειδωτικά μόρια, υπάρχουν ενώσεις που προμηθεύεται ο οργανισμός από τη διατροφή και είτε εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες, είτε τις μετατρέπουν σε λιγότερο επιβλαβή παράγωγα. Το ασκορβικό οξύ (ΑΑ) (εικόνα 8) είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό και ένας αναγωγικός παράγοντας που αντιδρά με τις ελεύθερες ρίζες προς σχηματισμό δεϋδροασκορβικού οξέος (DHA): ΑΑ + 2Η+ + 2Ό2 *-> 2Η202 + DHA Εικόνα 8: Δομή ασκορβικού οξέος ( ml)

21 18 Επιπλέον μετατρέπει το τρισθενή σίδηρο σε δισθενή (Fe3+ + ΑΑ» Fe2+ + DHA) και έτσι επάγει τις αντιδράσεις Fenton. Το ΑΑ αναγενάται από την ανηγμένη μορφή της γλουταθειόνης με καταλυτικό ένζυμο τη δεϋδροασκορβική ρεδουκτάση: DHA + 2GSH -» GSSG + ΑΑ (Mylonas and Kouretas, 1999). Η βιταμίνη Ε (α-τοκοφερόλη ή ΑΗ), λόγω της λιπόφιλης φύσης της, έχει την ιδιότητα να ενσωματώνεται στη λιπιδιακή διπλοστοιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης (εικόνα 9) και να αναχαιτίζει την αλυσιδωτή αντίδραση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (ROOFI): ROO* + ΑΗ» ROOH + Α* ROCT + A* -> ROOA FI παραγώμενη ρίζα Α* είναι πολύ ασθενής σε σχέση με την ROO*. Εικόνα 9: Η βιταμίνη Ε ενσωματώνεται με την λιπόφιλη ουρά της στη λιπιδιακή διπλοστοιβάδα και την προστατεύει από οξειδωτική βλάβη. (Από: Garrett D. Guy, JAAPA Archive, 1997) Τα τελευταία χρόνια τα καροτενοειδή, οι φυτικές φαινόλες και διάφορα φυτικά εκχυλίσματα χρησιμοποιούνται κατά κόρον σε συμπληρώματα διατροφής γιατί έχει αποδειχθεί πως ο η αντιοξειδωτική τους δράση συμβάλλει στην πρόληψη ασθενειών (Mylonas and Kouretas, 1999).

22 19 2) Φυσική άσκηση και οξειδωτικό στρες 2.1) Οξειδωτικό στρες-ένα πολυπαραγοντικό φαινόμενο Υπάρχει μια κοινή πεποίθηση πως υπάρχουν αρκετοί παράγοντες που επάγουν το οξειδωτικό στρες. Σε μια πρώτη φάση μπορούν να διαχωριστούν στους εξωγενείς και τους ενδογενείς: Ενδογενείς παράγοντες Φυσική άσκηση/καθιστική ζωή Ψυχολογικό στρες Φλεγμονή (παροδική μόλυνση/χρόνια πάθηση) Καρκίνος Ισχαιμία/επανοξυγόνωση Κυτταρικός θάνατος Εξωγενείς παράγοντες Διατροφή * Δίαιτα πλούσια σε πρωτεΐνες ή λίπη Προοξειδωτικά (ξενοβιωτικά) Αντιοξειδωτικά (χαμηλή περιεκτικότητα διατροφής) Αφεψήματα (αλκοόλ, καφεΐνη) Ρύποι Φάρμακα Κάπνισμα Ρύπανση αέρα (SO2, ΝΟ2, Ο3, υδρογονάνθρακες) Επαγγελματικές νόσοι (μεταβατικά μέταλλα, άσβεστος, paraquat) Αντικαρκινικά Ψοραλένιο Ακτινοβολία * Ιονίζουσα Υπεριώδης Μικροκύμματα Απορροφήσιμες ενώσεις από το δέρμα Εντομοκτόνα Ψωραλένιο * Φάρμακα (lindane, παράγωγα ψωραλενίου) Οι συγκεκριμένοι παράγοντες δρουν συχνά πολύ γρήγορα και πολλές φορές η δράση τους είναι αθροιστική ή τουλάχιστον συνεργατική. Στη συγκεκριμένη εργασία έγινε μελέτη σχετικά με τον πρώτο παράγοντα, τη φυσική άσκηση (Moller et al., 1996).

23 20 2.2) Ιστορική αναδρομή Το 1978 σηματοδότησε μια σημαντική χρονιά γιατί εξετάσθηκε η σχέση της φυσικής άσκησης με την οξειδωτική βλάβη στους ιστούς του ανθρώπου (Dillard et al, 1978). Η μέτριας έντασης άσκηση αύξανε τα επίπεδα εκπνεόμενου πεντανίου, ενός προϊόντος της λιπιδιακής υπεροξείδωσης. Οι ελεύθερες ρίζες, αν και διαθέτουν μικρό χρόνο ζωής, ανιχνεύθηκαν τελικά με φασματοτφωτομετρία ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού (electron paramagnetic resonance spectroscopy). Με βάση τη συγκεκριμένη τεχνική το 1982 (Davies et al, 1982) αποδείχθηκε σε πειράματα με αρουραίους πως η άσκηση αυξάνει 2-3 φορές τα επίπεδα των ελευθέρων ριζών στους σκελετικούς μύες και στο συκώτι. Η ένταση της άσκησης μείωνε την ικανότητα ελέγχου της ροής των ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα και προκαλούνταν καταστροφή των μιτοχονδριακών μεμβρανών. Τα επόμενα χρόνια έγιναν αρκετές αναφορές σχετικά με το αν η συστολή των σκελετικών μυών σε συνδυασμό με την αυξημένη κατανάλωση οξυγόνου κατά την άσκηση αυξάνει τελικά τα επίπεδα ROS (Diaz et al, 1993). To H2O2 στον ασκούμενο μυ, λόγω μεγάλης ικανότητας διάχυσης, διέσχιζε την κυτταρική μεμβράνη και δημιουργούσε πολλές παράγωγες ελεύθερες ρίζες που ήταν ακόμα πιο καταστροφικές για τον opyaviopo(reid et al, 1992). Αργότερα άλλες μελέτες έδειξαν πως πολλά βιομόρια ήταν ιδιαίτερα ευπαθή στο οξειδωτικό στρες (Okamura et al, 1997). Πολλά χρόνια αργότερα βρέθηκαν κάποιοι από τους βασικούς μηχανισμούς παραγωγής ROS κατά την άσκηση (Chandan et al., 2000). 2.3) Το παράδοξο της άσκησης Έχει τεκμηριωθεί πως η τακτική φυσική άσκηση εξασφαλίζει την υγεία και τη μακροβιότητα σε πολλά πειραματικά μοντέλα. Συγκεκριμένα κατόπιν πειραμάτωνσε ποντικούς φάνηκε πως αυξάνει το μέσο όρο ζωής κατά 10%. Ορισμένοι τρόποι άσκησης βελτιώνουν την υγεία των σκελετικών μυών, των αγγείων και διατηρούν τη μυϊκή μάζα σε σταθερά επίπεδα. Στον αντίποδα βέβαια η έντονη άσκηση σε απροπόνητα άτομα αυξάνει το οξειδωτικό στρες και παράλληλα ενεργοποιεί τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς, λειτουργώντας έτσι προστατευτικά (Leeuwenburgh et al., 2001). Επιπλέον ενώ η άσκηση μειώνει τον κίνδυνο των καρδιαγγειακών νοσημάτων, η παραγωγή ROS αποτελεί μια από βασική αιτία τους. Το παράδοξο αυτό γεγονός έχει απασχολήσει την επιστημονική κοινότητα τις τελευταίες δύο δεκαετίες (Elosua et al., 2003). 2.4) Πως η άσκηση αυξάνει το οξειδωτικό στρες; Η άσκηση σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες με δύο τρόπους. Πρώτον, αυξάνει τον οξειδωτικό μεταβολισμό και δεύτερον ενεργοποιούνται οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί σε μια προσπάθεια προσαρμογής στο οξειδωτικό στρες. Υπάρχουν αρκετές εναλλακτικές εξηγήσεις για τον τρόπο με τον οποίο η άσκηση αυξάνει τα επίπεδα ROS (Moller et al., 1996) ) Η άσκηση αυξάνει το ρυθμύ της αναπνοής Η αερόβια αναπνοή συνίσταται στην αναγωγή του μοριακού οξυγόνου σε νερό. Η όλη διαδικασία, που λαμβάνει χώρα στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων, περιλαμβάνει μια ροή ηλεκτρονίων από τους μεταβολίτες του κύκλου του Krebs στο μοριακό οξυγόνο. Μικρά ποσοστά (2-5%) CV και Η2θ2 διαφεύγουν από την αναπνευστική αλυσίδα και μάλιστα προτάθηκε πως το σημείο διαρροής ήταν η ουβικινόνη (Leeuwenburgh et al., 2001). Τελικά έγινε κοινώς αποδεκτό πως δεν

24 21 υπάρχει συγκεκριμένη θέση και πως τα μιτοχόνδρια είναι ταυτόχρονα η πηγή και ο κύριος στόχος των ROS (Navarro et al., 1999). Θεωρείται πως ένα ηλεκτρόνιο που προέρχεται από την αναγωγή της ουβικινόνης, επάγει το σχηματισμό μιας δραστικής ενδιάμεσης ένωσης, της ουβισεμικινόνης. Αντί λοιπόν η ουβισεμικινόνη να δεχθεί ένα ηλεκτρόνιο και ένα πρωτόνιο για να σχηματίσει την ουβικινόλη, προσφέρει ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στο οξυγόνο, οπότε παράγεται (V (Moller et al., 1996) (εικόνα 10). Η καταλυτική συμβολή της άσκησης είναι εμφανής αν αναλογισθεί κανείς πως κατά τη μέγιστη άσκηση η συνολική πρόσληψη οξυγόνου αυξάνεται 20 φορές, ενώ τα επίπεδα οξυγόνου σε μια μυϊκή ίνα αυξάνονται ακόμα και 100 φορές (Li Li Ji, 1999). Εικόνα 10: Η ουβικινόνη (Q) ανάγεται προς ουβικινόλη (QH2) μέσω μιας ενδιάμεσης ημικινόνης (QH ) (Από: StryerL., 1997) ) Η δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίντκ. Η εξάντληση των αποθεμάτων ΑΤΡ οδηγεί σε αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα ADP. Το γεγονός αυτό πυροδοτεί τον καταβολισμό του ADP από το σύστημα της οξειδάσης της ξανθίνης (ΧΟ) η οποία καταλύει μια αντίδραση που έχει χαρακτηρισθεί ως μια από τις κυριότερες πηγές ελευθέρων ριζών. Η υψηλής έντασης άσκηση και τα ισχαιμικά επεισόδια φαίνεται πως δημιουργούν όλες τις ευνοϊκές προϋποθέσεις για την ενεργοποίηση του μονοπατιού της ΧΟ (Moller et al., 1996). Η πρόσληψη οξυγόνου χαρακτηρίζεται ανεπαρκής κυρίως κατά την ισομετρική άσκηση. Υπό αυτές τις συνθήκες το ΑΜΡ (το οποίο έχει προκόψει από τη διάσπαση του ΑΤΡ σε ADP, και του τελευταίου σε ΑΜΡ), διασπάται και παράγεται ένα μόριο υποξανθίνης, η οποία στη συνέχεια μετατρέπεται σε ξανθίνη και ουρικό οξύ από τη ΧΟ (εικόνα 11). Η τελευταία αντίδραση είναι συζευγμένη με την παραγωγή 02*~. Έχει βρεθεί πως η υποξανθίνη συσσωρεύεται μετά από έντονη μυϊκή σύσπαση και το ουρικό οξύ βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα τόσο στον ασκούμενο μυ όσο και στο πλάσμα. Υπάρχουν αρκετές βιβλιογραφικές αναφορές που πιστοποιούν την αύξηση της δραστικότητας της ΧΟ μετά την άσκηση (Rasanen et al., 1996, Hellsten et al., 1996, Radak et al., 1995), ωστόσο δεν έχει διευκρινισθεί η βαρύτητα του ρόλου της ΧΟ. Κάτω από αερόβιες συνθήκες το ΑΤΡ αναπληρώνεται μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και η υποξανθίνη και η ξανθίνη μετατρέπονται σε ουρικό οξύ από τη δεϋδρογενάση της ξανθίνης και όχι από την ΧΟ οπότε δεν παράγονται ROS. Για αυτό το λόγω πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά το είδος της άσκησης που κάθε φορά μελετάται (Li Li Ji, 1999).

25 22 5'-nucleosidase adenosine deaminase AMP-----^^ >* Adenosine Inosine H20 p. h2o nh. Uric Acid OH xanthine xanthine nucleosidase oxidase.... oxidase Xanthine -* Hypoxanthine 73 H+, 02- HP- 2 0H h*.o,-hao! o h2o D-Ribose rvvoh xx's An^n7 ho^n^n HO N > 'N' N Εικόνα 11: Παραγωγή ελευθέρων ριζών από το σύστημα της οξειδάσης της ξανθίνης (Από: Crossnan and Moldave, Methods in enzymology, Vol XII, 1967) 2.4.3) Ενεργοποίησης φλεγμονώδους αντίδρασης. Τα πολυμορφοουδετερόφιλα (ΡΜΝ) είναι μια κατηγορία κυττάρων που κατέχουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα των ιστών σε μολύνσεις από ιούς ή βακτήρια. Η ενεργοποίηση των ΡΜΝ τυπικά αρχίζει με την ήπια καταστροφή των ιστών κατά τη συστολή, είτε από το οξειδωτικό στρες, είτε από κάποιο τραυματισμό. Σε αυτήν την περίπτωση τα ΡΜΝ μεταναστεύουν στην πληγείσα περιοχή, γιατί προσελκύονται από χημειοτακτικούς παράγοντες που απελευθερώνουν τα κατεστραμμένα κύτταρα, και εκκρίνουν λυσοζύμη και Οι*-. Η λυσοζύμη προωθεί τη διάσπαση κατεστραμμένων πρωτεϊνών και κυτταρικών υπολειμμάτων (Li Li Ji 1999), ενώ το CL*, που παράγεται από τη μυελοπεροξειδάση και τη NADPH οξειδάση σύμφωνα με την αντίδραση NADPH + 2CL > 2 CL*- + NADP+ + Η+, προλαμβάνει την επέκταση της βακτηριακής μόλυνσης (Leewennburgh et al., 2001) (εικόνα 12). Τ Lymphocytes aiul Η,Ο, Εικόνα 12: Παραγωγή Η202από τα Τ λεμφοκύτταρα κατά τη φλεγμονώδη αντίδραση. (Από: Gabi Nindl, Cell Science Reviews, 2004).

26 23 Αν και η φλεγμονώδης αντίδραση θεωρείται σημαντική για την απομάκρυνση μορίων που έχουν υποστεί βλάβη, τα ROS και άλλα οξειδωτικά μόρια που απελευθερώνονται προκαλούν μια δεύτερη καταστροφή των μυών. Ωστόσο η δράση των ουδετερόφιλων σε σχέση με την παραγωγή ROS, δεν είναι πλήρως διασαφηνισμένη: η μετακίνηση των ουδετερόφιλων απαιτεί ένα ικανό χρονικό διάστημα, οπότε η συγκεκριμένη απόκριση ίσως να μην αποτελεί την κυριότερη πηγή ROS κατά την έντονη-μικρής χρονικής διάρκειας άσκηση. Ίσως να αποτελεί ένα δευτερεύοντα μηχανισμό που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ROS κατά την περίοδο ανάκαμψης κυρίως μετά από αγωνίσματα μακράς χρονικής διάρκειας όπως ο μαραθώνιος, ή αμέσως μετά την έκκεντρη άσκηση (Moller et al., 1996) ) Συσσώρευση γαλακτικού οξέος Κατά τον αναερόβιο μεταβολισμό, η τοπική πτώση του ph, λόγω συσσώρευσης γαλακτικού οξέος, προάγει την απελευθέρωση οξυγόνου από την αιμογλοβίνη και αυξάνει τη μερική πίεση του οξυγόνου στους ιστούς και μειώνεται στις αρτηρίες, (φαινόμενο Bohr) (Li Li Ji, 1999, Banerjee et al., 2003). Κάτω λοιπόν από συνθήκες έντονης άσκησης η αιμογλοβίνη παράγει ROS. Η πτώση του ph έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση σιδήρου από τις πρωτεΐνες που περιέχουν αίμη. Αμφότερες η μυογλοβίνη και η αιμογλοβίνη έχουν την ιδιότητα να επάγουν την παραγωγή ROS μέσω των ατόμων σιδήρου που διαθέτουν (Banerjee et al., 2003). Fe > Fe ~ H+ -> H R + Fe3+ + H202 -> R*+ + Fe4+= 02 + H ) Υπεροξείδωση λιπιδίων Η πιο ευπαθής ίσως ομάδα βιομορίων στην επίθεση των ROS είναι τα λιπίδια και κυρίως αυτά των κυτταρικών μεμβρανών. Έχει παρατηρηθεί κατά κοινή ομολογία μια ραγδαία αύξηση των υπεροξειδωμένων λιπιδίων αμέσως μετά την επαναλαμβανόμενη ισομετρική άσκηση (Urso et al., 2003). Η λιπιδική υπεροξείδωση είναι ιδιαίτερα καταστροφική για τα κύτταρα καθώς πυροδοτεί την έναρξη μιας αλυσιδωτής αντίδρασης υπεροξείδωσης. Η οξείδωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA) έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μιας λιπιδιακής ρίζας (L*) που στη συνέχεια αντιδρά με οξυγόνο και σχηματίζει lipid peroxy radical (LOO ). Τα τελευταία μόρια μπορούν στην συνέχεια να οξειδώσουν άλλα PUFAs και να οδηγήσουν τελικά στην παραγωγή και άλλων ειδών ριζών. FI σειρά των αντιδράσεων φαίνεται παρακάτω: LH + R -» L* + RH L* > LOO* LOO* + LΗ -> LOOH + L* LOOH > LOO*, LO*, αλδεϋδες (π.χ μαλονδυαλδεϋδη) Κατά γενικό κανόνα, όσο πιο μεγάλος είναι ο αριθμός των ακόρεστων δεσμών που διαθέτει ένα λιπίδιο, τόσο πιο εύκολα αντιδρά με τα ROS. Το 02* είναι ίσως το κυριότερο μόριο-κλειδί στην υπεροξείδωση των λιπιδίων' Παρουσιάζεται τόσο στην έναρξη των αντιδράσεων όσο και στον τερματισμό τους. Αν λάβουμε υπόψη ότι το 02*~ παράγεται συνεχώς σε όλα τα

27 24 κύτταρα, είναι πιθανόν πολύ μικρές ποσότητες αυτής της ρίζας να χρησιμοποιούνται για τον τερματισμό της οξείδωσης των λιπιδίων σύμφωνα με την αντίδραση LOO* + 02*~ + Η+ -> LOOH + C>2*~ (Mylonas and Kouretas, 1999). ΣΤΑΔΙΑ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Έναρξη LIPID + RfOH LIPID* Διάδοση LIPID *+ 0 2 LIPID-00* LIPID-00 *+ LIPID LIPID-OOH + LIPID' Tsouanouoc LIPID *+ LIPID * LIPID-LIPID LIPID-00* + LIPID* > LIPID-00-LIPID Απομάκρυνση LIPID* + VIT E LIPID +VITE unsaturated fatty acid mal on di aldehyde Εικόνα 13: Στάδια υπεροξείδωσης λιπιδίων. (Από: James A. Thomas BB 404 Supplement/1999) 2.4.6) Φωσφοφρουκτοκινάση Ένα σημαντικό ένζυμο του μεταβολισμού που φαίνεται να επηρεάζεται από το οξειδωτικό στρες είναι η φωσφοφρουκτοκινάση. Η οξεία άσκηση φαίνεται πως επηρεάζει αρνητικά τη δραστικότητα της φωσφοφρουκτοκινάσης, η οποία καθορίζει το ρυθμό της γλυκόλυσης. Σε πειράματα που έγιναν σε ομάδες νεαρής και μεγαλύτερης ηλικίας διαπιστώθηκε πως η αναστολή του ενζύμου δεν εξαρτάται από την ηλικία αλλά από τον τύπο της ασκούμενης μυϊκής ίνας. Για το γαστροκνήμιο μυ παρατηρήθηκε μεγαλύτερη αναστολή κατά σειρά στις μυϊκές ίνες τύπου lib, Ila και λιγότερο στις τύπου I. Η κατιούσα ρύθμιση της φωσφοφρουκτοκινάσης παρουσίαζε αρνητική συσχέτιση με τις δραστικότητες των ενζύμων SOD, GPX, γεγονός που

28 25 σημαίνει πως μπορεί να αποτελεί μια δευτερεύουσα συνέπεια του οξειδωτικού στρες. Η αιτιολογία είναι ότι η φωσφοφρουκτοκινάση των θηλαστικών είναι πλούσια σε σουλφυδρυλομάδες, οπότε και ευπαθής στο οξειδωτικό στρες (Sen and Packer, 2000). 2.5) Αμφιλεγόμενα θέματα Αν και σήμερα είναι πλέον τεκμηριωμένο πως η άσκηση αυξάνει το οξειδωτικό στρες, υπήρξαν πολλές φορές που τα αποτελέσματα ερευνών οδηγούσαν σε αμφιλεγόμενες απόψεις. Οι κύριοι λόγοι ήταν οι διαφορές μεταξύ των ομάδων που επιλέγονταν προς μελέτη ως προς την ηλικία, τη φυσική κατάσταση, τη γενετική προδιάθεση, τις διατροφικές συνήθειες όπως επίσης και τα διαφορετικά πρωτόκολλα άσκησης. Αξίζει να σημειωθεί πως μόνο η έντονη άσκηση μακράς διάρκειας φαίνεται πως ξεπερνά την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού και οδηγεί σε οξειδωτικές βλάβες (Palazzetti et al., 2003). Ο προσδιορισμός της φυσικής κατάστασης της μελετούμενης ομάδας είναι μια βασική παράμετρος για την εξαγωγή ορθών αποτελεσμάτων. Η απόδοση του ατόμου κατά την άσκηση και η μέγιστη πρόσληψη οξυγόνου θεωρούνται πλέον ανεπαρκή κριτήρια για τον προσδιορισμό του επιπέδου προσαρμογής του οργανισμού στο οξειδωτικό στρες. Αντιθέτως οι βιοχημικές παράμετροι είναι πιο αντιπροσωπευτικές αν και έχει παρατηρηθεί πως πολλά προϊόντα οξειδωτικών αντιδράσεων δεν παράγονται αμέσως μετά την άσκηση, αλλά φθάνουν σε μέγιστα επίπεδα μετά από κάποιες ώρες ή ακόμα και μέρες μετά το τέλος της άσκησης. Για αυτό το λόγο η απουσία δεικτών οξειδωτικού στρες μετά την άσκηση δεν θεωρείται πλέον πως συνδέεται με τη μη έκθεση του οργανισμού σε ROS.

29 26 2.6) Αντιοξειδωτικιί απόκριση και άσκτισπ-ένα γενικό πλάνο Η συχνή άσκηση εξασφαλίζει την ανάπτυξη ορισμένων γνωστών φυσιολογικών προσαρμοστικών μηχανισμών. Η ουδός στην οποία η άσκηση οδηγεί σε αύξηση του οξειδωτικού στρες φαίνεται να εξαρτάται από τη φυσική κατάσταση του ατόμου. Η άσκηση επάγει αρκετές αλλαγές σε κυτταρικό επίπεδο για την αποτελεσματική αντιμετώπιση των παραγόμενων ROS. Υπάρχουν αρκετές θεωρίες για το πώς ο ανθρώπινος οργανισμός προσαρμόζεται στο οξειδωτικό στρες κατά την άσκηση οι οποίες θα αναφερθούν συνοπτικά. 1) Πρώτον ο ενδιάμεσος μεταβολισμός προσαρμόζεται στις αυξημένες ενεργειακές ανάγκες. Σε πειράματα με ποντίκια παρατηρήθηκε μια γενική άνοδος της οξειδωτικής ικανότητας που ακολουθούσε την αύξηση της συγκέντρωσης των ενζύμων της αναπνευστικής αλυσίδας. Με αυτό τον τρόπο αυξάνεται ο αριθμός των μιτοχονδρίων στους μυς αλλά η ποσότητα των ενζύμων σε κάθε μιτοχόνδριο παραμένει αμετάβλητη. Κατά γενική ομολογία η προσαρμογή του μεταβολισμού στην άσκηση είναι μια αργή διαδικασία. Ο χρόνος ημιζωής του κυτοχρώματος c και της κυτοχρωμικής οξειδάσης είναι σχετικά μικρός και η λεπτομερής λειτουργία του συστήματος δεν είναι πλήρως διασαφηνισμένη. Οπότε είναι απίθανο η άμεση προσαρμογή του οργανισμού να οφείλεται στον παράγοντα μιτοχόνδρια. Η θετική επίδραση της άσκησης ίσως να έγκειται στο γεγονός ότι κάθε μιτοχόνδριο έχει χαμηλότερο οξειδωτικό φορτίο, οπότε και χαμηλότερη παραγωγή ROS (Moller et al., 1996). 2) Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα δείχνουν μια προσαρμοστική συμπεριφορά απέναντι στην άσκηση αν και τα αποτελέσματα σχετικών πειραμάτων είναι διφορούμενα. Επιπλέον είναι άγνωστος ο τρόπος με τον οποίο ενεργοποιούνται τα ένζυμα σε σύντομα χρονικά διάστημα. Έχουν επικρατήσει απόψεις για την αλλοστερική ή ομοιοπολική τροποποίησή τους κυρίως στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, αλλά δεν υπάρχουν πολλές ενδείξεις για την απόκριση σε κύτταρα ιστών θηλαστικών (Banerjee et al., 2003). Η βιβλιογραφία σχετικά με τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών ενζύμων και τους μύες παρουσιάζει πολλές αντιφάσεις, ίσως γιατί κάθε μυϊκή ομάδα ανταποκρίνεται διαφορετικά στην άσκηση. Σε άλλους ιστούς, όπως το συκώτι, η SOD και η καταλάση παραμένουν αμετάβλητες, ενώ η GPX εμφανίζεται αυξημένη, μειωμένη ή και αμετάβλητη. Επίσης η προσαρμογή του λεμφικού ιστού φαίνεται να επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες και κυρίως από την περιεκτικότητα της τροφής σε λιπαρά οξέα. Τελικά, το μοναδικό σημείο που υπάρχει ταύτιση απόψεων είναι ότι κάθε ιστός ή όργανο του σώματος προσαρμόζει την αντιοξειδωτική του συμπεριφορά κατά την άσκηση σύμφωνα με τον ήδη υπάρχοντα μεταβολισμό. 3) Σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα υπάρχουν ενδείξεις πως η συχνή άσκηση μειώνει το χαλαρά συνδεδεμένο σίδηρο των ιστών οπότε παρέχει προστασία από τα ROS σταματώντας την αντίδραση Fenton. 4) Υπάρχει επίσης μεγάλη πιθανότητα η άσκηση να επηρεάζει και το ανοσοποιητικό σύστημα. Αν και τα προπονημένα άτομα φαίνεται να έχουν τα ίδια επίπεδα ουδετερόφιλων με τα απροπόνητα, η άσκηση προκαλεί μείωση της δραστικότητάς τους μόνο στα προπονημένα. Συγκεκριμένα, τα ουδετερόφιλα των ασκούμενων ατόμων παράγουν μικρότερες ποσότητες ROS για την εξουδετέρωση των βακτηρίων. Το γεγονός αυτό συνεπάγεται μεγαλύτερη ευπάθεια των προπονημένων ατόμων σε τοπικές φλεγμονές και λοιμώξεις. Σε αυτή την περίπτωση μειωμένη απόκριση των ουδετερόφιλων μπορεί τελικά να είναι ένας τρόπος για τη μείωση της καταστροφής του ιστού κατά την άσκηση (Moeller et al., 1996).

30 Οξειδωτικό στρες και ηλικία Είναι εμφανές πως υπάρχουν πολλές αναφορές για την άμεση σύνδεση του οξειδωτικού στρες με την άσκηση. Ωστόσο το ενδιαφέρον των ερευνών επικεντρώνεται κυρίως στα ενήλικα άτομα ενώ έχει αγνοηθεί τελείως η επίδραση της άσκησης στα αντιοξειδωτικά συστήματα των παιδιών. Αν και υπάρχει έλλειψη αναφορών στο συγκεκριμένο πεδίο, μπορούν να εξαχθούν χρήσιμα συμπεράσματα από μελέτες που αφορούν κυρίως στη διαφοροποίηση της αντιοξειδωτικής άμυνας μεταξύ νεαρών ατόμων και πιο ηλικιωμένων ) CoOlO Τα τελευταία χρόνια υπήρξε μια μικρή κινητοποίηση σχετικά με την μελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας των παιδιών ως προς το σύστημα του συνενζύμου Q10 (CoQlO) (Niklowitz et al., 2003). Παρατηρήθηκαν ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα του CoQlO στα παιδιά και μια αρνητική συσχέτιση της συγκέντρωσής του στο πλάσμα με την ηλικία ενώ οι ηλικίες είχαν τα υψηλότερα επίπεδα CoQlO σε επίπεδο ιστού. Κατά αρχάς το CoQlO είναι ο κύριος μεταφορέας ηλεκτρονίων στη μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα. Επιπλέον στην ανηγμένη του μορφή λειτουργεί ως αντιοξειδωτικό στην πρόληψη της υπεροξείδωσης των λιπιδίων των κυτταρικών μεμβρανών και των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας. Ταυτόχρονα προστατεύει τις πρωτεΐνες της μιτοχονδριακής μεμβράνης και το DNA ενώ σε αντίθεση με άλλα λιπόφιλα μόρια προέρχεται τόσο από τη διατροφή όσο και από ενδογενή σύνθεση (Niklowitz et al., 2003). Πρακτικά όλα τα μόρια Q10 στο πλάσμα βρίσκονται συζευγμένα με λιποπρωτε'ΐνες (Miles et al., 2004) για αυτό η αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα του CoQlO είναι άμεσα συνδεδεμένη με την πρόληψη καρδιαγγειακών νοσημάτων. Το 2004 παρατηρήθηκε πως υπάρχει μια διακύμανση της συγκέντρωσης του συνενζύμου Q10 στο πλάσμα μεταξύ των διαφόρων ηλικιών (Miles et al., 2004). Αν και μετά την ηλικία των 30 ετών τα επίπεδα του συνενζύμου Q10 παραμένουν σταθερά, δεν παρατηρείται το ίδιο φαινόμενο και στην παιδική ηλικία. Διαπιστώθηκε λοιπόν πως τα επίπεδα CoQlO αυξάνονται κατά τη διάρκεια των πρώτων μηνών ζωής των παιδιών έως ότου προσαρμοστούν στα συνολικά επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος. Έπειτα ξεκινάει μια σταδιακή πτώση μέχρι την παιδική ηλικία οπότε η συνολική ποσότητα του CoQ σταθεροποιείται. Ωστόσο η ποσότητα CoQ που βρίσκεται προσδεδεμένη σε λιπίδια είναι ελαφρώς πιο αυξημένη στα παιδιά, γεγονός που προσδίδει στα παιδιά καλύτερη ολική αντιοξειδωτική ικανότητα σε σχέση με τους ενήλικες ) Πρωτεΐνες θερμικού σοκ Η επίθεση των ROS στα αμινοξέα έχει ως αποτέλεσμα τη δομική και λειτουργική τροποποίηση των πρωτεϊνών. Για αυτό το λόγο το οξειδωτικό στρες ενεργοποιεί αρκετούς μηχανισμούς πρωτεολυτικής αποικοδόμησης ή επιδιόρθωσης. Είναι γνωστό πως η ήπιας έντασης άσκηση ενισχύει την αντιοξειδωτική απόκριση του οργανισμού. Επάγεται λοιπόν η έκφραση πεπτιδασών με απώτερο σκοπό την απομάκρυνση οξειδωτικά τροποποιημένων πρωτεϊνών. Για παράδειγμα η DT-διαφοράση, που αυξάνεται κατά την άσκηση, εξουδετερώνει τις κινόνες και τις σεμικινόνες και μειώνει τα επίπεδα οξειδωτικής βλάβης στο κύτταρο. Επιπλέον παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα χυμοθρυψίνης και θρυψίνης και πολλαπλάσια δραστικότητα στα συμπλέγματα των πρωτεοσωμάτων. Το παράδοξο της άσκησης

31 28 ισχύει και σε αυτή την περίπτωση όπού υπάρχει ταυτόχρονα αύξηση της πρωτεοσύνθεσης και της πρωτεόλυσης (Radak et al., 1999). Ο προστατευτικός ρόλος της άσκησης στην αντιοξειδωτική ικανότητα του οργανισμού είναι εμφανής μέσω της επαγωγής πρωτεϊνών θερμικού σοκ, όπως η Hsp72, σε νεαρά ασκούμενα άτομα. Η Hsp έχει κυτταροπροστατευτικό ρόλο αποτρέποντας τη μη σωστή διαμόρφωση των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδίων, επιδιορθώνοντας τις κατεστραμμένες πρωτεΐνες ή αποικοδομώντας μόρια που έχουν υποστεί βλάβη (Simar et al., 2004). Κατόπιν πειραματικών προσδιορισμών της δραστικότητας της Hsp72 σε άτομα ηλικίας ετών διαπιστώθηκε πως ήταν αρκετά αυξημένη. Αν και τα αποτελέσματα ήταν αρκετά ενδιαφέροντα, η μελέτη δεν επεκτάθηκε σε παιδικές ηλικίες. Άλλωστε τα συμπεράσματα συμφωνούν απόλυτα με το ότι η διαδικασία της γήρανσης και της παθογένεσης οφείλεται σε ένα βαθμό στην ικανότητα του οργανισμού να απομακρύνει μη λειτουργικά μόρια (Radak et al., 1999) GPX Οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (GPX) ανήκουν στην οικογένεια των σεληνοπρωτεϊνών. Υπάρχουν 4 ισομορφές οι οπόιες βρίσκονται σε διαφορετικές περιοχές του κυττάρου και κατανέμονται διαφορετικά στους ιστούς: η κυτταροπλασματική GPX, η φωσφολιπιδιακή υδροπεροξειδάση GPX, η GPX του πλάσματος και η γαστρεντερική GPX (Rush et al., 2003). Το ερέθισμα που δέχεται το συκώτι για τη σύνθεση GPX είναι η υπερπαραγωγή λιπιδικών υπεροξειδίων. Για αυτό το λόγο, κυρίως κατά την έντονη άσκηση, η μέτρηση των επιπέδων της GPX είναι ένας ευαίσθητος δείκτης οξειδωτικού στρες (Palazzetti et al., 2003, Aguilo et al., 2005) GSH H GSH βρίσκεται υπό φυσιολογικές συνθήκες σε μεγάλη συγκέντρωση στο κύτταρο η οποία φθάνει την τάξη των mm και παίζει βασικό ρόλο στην προστασία των ασκούμενων ιστών από το οξειδωτικό στρες. Πρώτον, ανάγει το υπεροξείδιο του υδρογόνου και άλλα οργανικά υπεροξείδια με τη βοήθεια της GPX. Δεύτερον, απομακρύνει το singlet οξυγόνο και το ΟΗ*. Τρίτον, ανάγει τις ρίζες τοκοφερόλης είτε άμεσα, είτε έμμεσα αποτρέποντας έτσι τη λιπιδική υπεροξείδωση. Είναι αξιοσημέιωτο ότι η de novo σύνθεση της GSH στους σκελετικούς μυς και το μυοκάρδιο γίνεται πολύ σπάνια καθώς το συκώτι έχει την αποκλειστικότητα σχεδόν της παραγωγής της. Για αυτό το λόγο οι σκελετικοί μυς είναι σχετικά λιγότερο προστατευμένοι από το οξειδωτικό στρες (Banerjee et al., 2003, Li Li Ji 1999). Τα επίπεδα της GSH και GSSG φαίνεται να μη παραμένουν σταθερά κατά τη διάρκεια της ζωής του ανθρώπου. Σύμφωνα με ένα άρθρο των Mine et al., τα επίπεδα GSH είναι χαμηλά στις βρεφικές ηλικίες (0,2-1 ετών) και στις μεγαλύτερες (41-69 ετών) και υπάρχει μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας και της συγκέντρωσης GSH (Mine et al., 2002) (εικόνα 15 α, β, γ, δ). Οι Al-Turk et al. πρότειναν πως στις ομάδες ατόμων ενδιάμεσης ηλικίας (25-45 ετών) τα επίπεδα ήταν υψηλότερα σε σχέση με τις ομάδες 5-12 ετών και ετών. Επίσης η μείωση των επιπέδων GSH στις μεγαλύτερες ηλικίες πιστοποιεί την εξέλιξη της γήρανσης και την εξασθένιση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Για αυτόν ακριβώς το λόγο τα επίπεδα της GSSG παρουσιάζουν θετική συσχέτιση με την ηλικία και αντιθέτως ο λόγος GSH/GSSG είναι υψηλότερος στις ενδιάμεσες ηλικίες. Η αιτιολογία ωστόσο για την εικόνα που

32 29 εμφανίζουν τα βρέφη είναι διαφορετική από αυτή των πιο προχωρημένων ηλικιών Αποδίδεται κυρίως στο στρες των νεογνών (newborn stress) (Mine et al., 2002). Είναι ευνόητο πως τα νεογέννητα δεν έχουν πλήρως ανεπτυγμένο ανοσοποιητικό σύστημα σε σχέση ακόμα και με τα παιδιά πρώτης παιδικής ηλικίας. Στους πρώτους μήνες ζωής αυξάνεται ραγδαία η παραγωγή κυτοκινών που συνδέονται με την ακόλουθη παραγωγή ROI (reactive oxygen intermediates), τα οποία με τη σειρά τους εξουδετερώνονται από το σύστημα της γλουταθειόνης (Hiroaki et al., 2001). Επιπλέον κατόπιν μετρήσεων δεικτών λιπιδικής υπεροξείδωσης όπως το εκπνεόμενο πεντάνιο, πιστοποιήθηκαν για άλλη μια φορά υψηλότερα επίπεδα ROS και ερμηνεύθηκαν τα αποτελέσματα ως μια φυσιολογική απόκριση του παιδικού οργανισμού: τα ROS λειτουργούν ως διαβιβαστές σήματος σε διαδικασίες ανάπτυξης και αύξησης (Phillips et al., 2003). Η συγκεκριμένη διαφοροποίηση του ρόλου των ROS στα παιδιά και τους ενήλικες θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σε μελέτες που αφορούν ανάλογους προσδιορισμούς. 2,7.5) SOD Όπως έχει ήδη αναφερθεί η SOD αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού στο οξειδωτικό στρες (Nuray Oztasan et al., 2004) και η δραστικότητά της έχει μελετηθεί εκτεταμένα. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία έχουν εκφρασθεί αρκετές απόψεις σχετικά με την αυξομείωση της δραστικότητάς της ανάλογα με τη φυσική κατάσταση του ατόμου και την ηλικία. Κατά γενικό κανόνα υπάρχει μια ποικιλία αποτελεσμάτων ανάλογα με το μελετούμενο ιστό. Τα ερυθροκύτταρα είναι ιδιαίτερα ευπαθή στην οξειδωτική βλάβη γιατί διαθέτουν υψηλό περιεχόμενο πολυακόρεστων λιπαρών οξέων στη μεμβράνη τους και φυσικά υψηλά επίπεδα οξυγόνου και αιμογλοβίνης (Aguilo et al., 2005). Για αυτό το λόγο ενεργοποιείται το ένζυμο της SOD. Ένα ακόμα παράδειγμα είναι το μυοκάρδιο το οποίο διαθέτει ένα έντονο οξειδωτικό μεταβολισμό σε σχέση με τους σκελετικούς μύες που έχουν γλυκολυτικό μεταβολισμό. Αφού λοιπόν εκ φύσεως ο μεταβολισμός των δύο μυϊκών ομάδων είναι διαφορετικός, υπάρχει διαφορετική προσαρμοστική ικανότητα στην άσκηση' η καρδιά λόγω της συνεχούς λειτουργίας της διαθέτει καλύτερη προσαρμοστική ικανότητα. Όσο αφορά τις αποκρίσεις μεταξύ διαφορετικών ηλικιών, φαίνεται πως η καρδιά των ηλικιωμένων ατόμων αυξάνει κατακόρυφα τη δραστικότητα της SOD ίσως λόγω του ότι εκτίθεται συνεχώς σε μεγαλύτερα ποσά Ο2* σε σχέση με τα νεαρά άτομα (Navarro Arevalo et al., 1999). Άλλωστε οι μύες που στηρίζονται κυρίως στον οξειδωτικό μεταβολισμό, έχουν την ιδιότητα να επάγουν σε μεγαλύτερο βαθμό την SOD (Powers et al., 1994). Αν και στα νεαρά άτομα υπάρχει η δυνατότητα να αυξάνεται η δραστικότητα της SOD σε συνθήκες έντονης άσκησης στους σκελετικούς μυς, δεν παρατηρείται απόκριση παρόμοιας έντασης στα πιο μεγάλα άτομα. Το παράδοξο είναι ότι σε συνθήκες ηρεμίας τα μεγαλύτερα άτομα έχουν υψηλότερα επίπεδα SOD. Κατά γενικό κανόνα όμως όταν άσκηση φθάνει σε εξαντλητικά επίπεδα, μόνο τα νεαρά άτομα έχουν τη δυνατότητα απόκρισης στο οξειδωτικό στρες (Navarro Arevalo et al., 1999). Αντιθέτως σε ένα άρθρο των Gunduz et al.(l995) παρουσιάζονται αποτελέσματα που δείχνουν πως μετά από έντονη άσκηση η δραστικότητα της SOD ήταν σημαντικά αυξημένη στο γαστροκνήμιο μυ, το μυοκάρδιο και τους πνεύμονες των ηλικιωμένων και όχι των νεαρών ατόμων (Gunduz et al., 1995). Διαφοροποίηση παρουσιάζεται και σε άλλες μελέτες όπου η δραστικότητα της SOD είναι μειωμένη στο σπλήνα (30-50%) και αυξημένη στο συκώτι (50%) και το θύμο αδένα (100%) όσο αυξάνεται η

33 30 ηλικία των ατόμων (Boltzan et al., 1995). Ωστόσο δεν πρέπει να παραληφθεί πως η απόκριση του οργανισμού εξαρτάται από το είδος της άσκησης και το πρωτόκολλο που εφαρμόζεται. Για παράδειγμα η οξεία άσκηση συνδέεται με πολλαπλάσια επίπεδα SOD κυρίως στους μαραθωνοδρόμους (Nuray Oztasan et al., 2004) TBARS Οι ενώσεις που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξυ (TBARS) είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης οξειδωτικού στρες, όπου μετράται η συγκέντρωση ενός κυρίως προϊόντος λιπιδικής υπεροξείδωσης, της μαλονδυαλδεΰδης (MDA). Η υπεροξείδωση των λιπών φαίνεται να μη παρουσιάζει διαφοροποιήσεις μεταξύ των διαφορετικών ηλικιών ασκούμενων ατόμων. Τα επίπεδα TBARS στους σκελετικούς μυς τόσο των νέων όσο και των πιο μεγάλων ατόμων είναι περίπου ίδια. Αν και τα επίπεδα TBARS στην καρδιά είναι χαμηλότερα συγκριτικά με τους σκελετικούς μυς, στα ηλικιωμένα άτομα προκαλούνται καρδιαγγειακά νοσήματα λόγω συσσώρευσης οξειδωμένων λιπιδίων (Navarro Arevalo et al., 1999). Αντιθέτως σε μελέτες όπου χρησιμοποιήθηκε ένας άλλος δείκτης υπεροξείδωσης λιπιδίων, το εκπνεόμενο πεντάνιο, διαπιστώθηκε πως η υπεροξείδωση των λιπιδίων εμφανίζεται σε μεγαλύτερο ποσοστό στις μεγαλύτερες ηλικίες, στα πλαίσια της αύξησης του οξειδωτικού στρες κατά τη διαδικασία της γήρανσης (Phillips et al., 2000). Όσο αφορά την έρευνα σε άτομα που ασχολούνται με τον αθλητισμό, έχει βρεθεί πως η MDA στον ορό είναι πολύ υψηλότερη σε αθλητές μαραθωνίου και ταχυδυναμικών αγωνισμάτων, ακόμα και κατά 40% αμέσως μετά την άσκηση, σε σχέση με τα μη ασκούμενα άτομα. Ίσως να οφείλεται στο γεγονός πως η έκκεντρη άσκηση συνοδεύεται από μυϊκή φλεγμονή (Urso et al., 2003). Στην περίπτωση των επιπέδων MDA των ερυθροκυττάρων είναι εμφανής ο προσαρμοστικός ρόλος της άσκησης: τα μη προπονημένα άτομα έχουν υψηλότερα επίπεδα σε σχέση με τα προπονημένα (Nuray Oztasan et al., 2004). Ολοκληρωμένες μελέτες που παρουσιάζουν τις διαφορές στα επίπεδα TBARS σε παιδιά και ενήλικες δεν έχουν πραγματοποιηθεί ακόμα ) Καταλάση Τα επίπεδα της καταλάσης παρουσιάζουν διακυμάνσεις κυρίως μεταξύ των διαφορετικών οργάνων. Σύμφωνα με ένα άρθρο των Boltzan et al, η δράση της καταλάσης παραμένει σταθερή ανεξαρτήτου ηλικίας στο συκώτι, ενώ μειώνεται με την πάροδο του χρόνου στο σπλήνα (Boltzan et al., 1995). Αν και η καταλάση δεν ανήκει στην ομάδα ενζύμων των οποίων η δραστικότητα τροποποιείται σημαντικά με την άσκηση, φαίνεται ότι αυξάνεται στους σκελετικούς μυς (Ji 1999) και στον ορό κολυμβητών (Mine et al., 2001). Ωστόσο έχουν διατυπωθεί και κάποιες άλλες απόψεις (Powers et al., 1994), σύμφωνα με τις οποίες η άσκηση δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της καταλάσης. Η συγκεκριμένη υπόθεση βασίζεται σε δύο αιτιολογίες. Πρώτον, η δραστικότητα της καταλάσης ρυθμίζεται από διαφορετικά κυτταρικά σήματα σε σχέση με τα άλλα ενζυμικά συστήματα. Δεύτερον, μπορεί η καταλάση να μοιράζεται τα ίδια ερεθίσματα με τα άλλα αντιοξειδωτικά ένζυμα, αλλά ενεργοποιείται από μεγαλύτερης έντασης ερέθισμα. Αν και δεν υπάρχουν αναφορές για τη δραστικότητα της καταλάσης σε παιδιά, υποστηρίζεται πως μειώνεται καθώς αυξάνεται η ηλικία και συμβάλει στην εκδήλωση νευροεκφυλιστικών ασθενειών σε προχωρημένες ηλικίες (Alper et al., 1996).

34 31 2.8) Σκοπός της εργασίας Υπάρχουν πολλές αναφορές για το οξειδωτικό στρες σε αθλητές και όσο αφορά την επαγωγή αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Ωστόσο οι ενδείξεις για την απόκριση του παιδικού οργανισμού στο οξειδωτικό στρες κατά την άσκηση είναι ανεπαρκείς. Για αυτό το λόγο η εργασία έχει ως στόχο τη μελέτη δεικτών οξειδωτικού στρες σε υγιή παιδιά προεφηβικής ηλικίας που ασχολούνται με ένα άθλημα αντοχής, όπως η κολύμβηση, που συνοδεύεται από υψηλό αερόβιο μεταβολισμό. Το συγκεκριμένο αντικείμενο προσδιορίσθηκε, με τον καθορισμό της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του ορού, με τη με τη μέτρηση των επιπέδων MDA, GSH, GSSG, όπως επίσης και του λόγου τους GSH/GSSG και με τη μέτρηση της δραστικότητας της καταλάσης του ορού.

35 32 Υλικά και μέθοδοι 1) Υλικά Οι φωτομετρικοί προσδιορισμοί έγιναν σε φωτόμετρο Hitachi U Από την εταιρεία SIGMA προμηθεύτηκαν τα εξής υλικά: ΤΒΑ, DTNB, DPPH, NADPH, ρεδουκτάση της γλουταθειόνης, οξειδωμένη μορφή της γλουταθειόνης. Τα NaH2P04, NaHP04 και Tris (hydroxymethyl) aminomethane προέρχονται από την εταιρεία MERCK. To TCA αγοράσθηκε από την εταιρεία Pancreac και το Na2S04 από την Fluca. Στη συγκεκριμένη μελέτη συμμετείχαν 17 παιδιά που ασχολούνται συστηματικά με την κολύμβηση και 12 παιδιά που δεν ασκούνται σε κάποιο άθλημα. Τα γενικά γνωρίσματα της κάθε ομάδας παιδιών φαίνονται στον πίνακα 1. 2) Ορός αίματος Η συλλογή φλεβικού αίματος έγινε και στις δύο ομάδες κατά την ηρεμία και χωρίς να έχει προηγηθεί άσκηση. Μετά την αιμοληψία το αίμα παρέμεινε σε θερμοκρασία δωματίου για 5-10 λεπτά μέχρι να πήξει. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3500rpm (1370g) στους 5 C για lomin και στη συνέχεια ο υπερκείμενος ορός μοιράσθηκε σε σωλήνες eppendorf (περίπου 200μΤ/σωλήνα). Οι σωλήνες eppendorf καταψύχθηκαν στους -20 C έως ότου χρησιμοποιηθούν στις πειραματικές διαδικασίες. 3) Αιμόλυμα Μετά τη συλλογή φλεβικού αίματος σε Vacutainer τα οποία περιείχαν EDTA ως αντιπηκτικό, ακολούθησε καλή ανάμιξη. Σε κάθε Vacutainer που περιείχε 1ml αίματος προστέθηκε 1ml 5% TCA και ακολούθησε ισχυρή ανάδευση σε vortex (2500 rpm). Έπειτα οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν στις 6000rpm (4020 g) στους 5 C για 20min. Στη συνέχεια το υπερκείμενο μοιράσθηκε σε σωλήνες eppendorf (περίπου 200μΕ/σωλήνα) και καταψύχθηκε στους -20 C μέχρι να ξεκινήσουν οι πειραματικοί προσδιορισμοί. Μετά την απόψυξή τους σε κάθε σωλήνα eppendorf προστέθηκαν 60μΕ 5% TCA και ακολούθησε ισχυρή ανάδευση. Έπειτα έγινε φυγοκέντρηση σε κεφαλή eppendorf στις 16000rpm (28620g) στους 5 C για 5min. Το υπερκείμενο συγκεντρώθηκε σε νέα eppendorf και χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον προσδιορισμό της GSH και GSSG. 4) Ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του ορού. Η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα προσδιορίσθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των A.Janaszewska και G.Bartosz (2002). νο2 DPPH (diphenyl-p-picrylhydi-azyl) Εικόνα 14: Χημική δομή του DPPH (Από: Halliwell and Gutteridge, 1998).

36 33 Η συγκεκριμένη μέθοδος είναι φασματοφωτομετρική και η αντιοξειδωτική ικανότητα του ορού προσδιορίζεται με την ικανότητά του να απομακρύνει ένα ηλεκτρόνιο από μια σταθερή ελεύθερη ρίζα, το DPPH (1,1 -diphenyl-2- picrylhydrazyl), η οποία διαθέτει συγκεκριμένο ESR (electron spin resonance) (Halliwell et al., 1998) Σύμφωνα με το πρωτόκολλο προστέθηκαν 20pL ορού σε 480pL 10mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου, ph 7,4 και 500μΕ διαλύματος 0,lmM DPPH σε μεθανόλη. Μετά από 30min επώασης σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, μετρήθηκε η απορρόφηση των δειγμάτων στα 520nm. Τα δείγματα ελέγχου περιείχαν 500μΤ lomm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου, ph 7,4 και 500μι 0,lmM DPPH σε μεθανόλη. Για τον έλεγχο της εγκυρότητας των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκαν θετικοί μάρτυρες, οι οποίοι περιείχαν 5pL διαλύματος lomm ασκορβικού οξέος σε τελική συγκέντρωση 50μΜ. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων εκφράσθηκαν ως η % μείωση της απορρόφησης του αρνητικού μάρτυρα, δηλαδή:, Α πορρόφησηδε; Μ -Απορρόφηση δεί ού % μείωση = % Απορρόφηση δε!γμαελέγχου 5) TBARS (thiobarbitouric acid reactive substances) Στη συγκεκριμένη μέθοδο μετράται κυρίως η μαλονδυαλδεΰδη (MDA) ως δείκτης υπεροξείδωσης λιπών και κατά επέκταση ως δείκτη οξειδωτικού στρες. Η MDA αντιδρά με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (ΤΒΑ) και παράγεται έγχρωμο προϊόν σύμφωνα με την αντίδραση (Halliwell et al., 1998): HS XX + <r H2 - Y acho OH TEA OH CHO δύ*γόη H0yNvSH N^^CH^CH^CnJIi +2H2 OH product OH Εικόνα 15: Αντίδραση του ΤΒΑ με την MDA προς σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος. (Από: Halliwell and Gutteridge, 1998). Ο προσδιορισμός της MDA έγινε με τη μέθοδο των Keles M.S et al (2001). Συγκεκριμένα μέσα σε σωλήνες Falcon προστέθηκαν κατά σειρά 0,1ml ορού και 0,5ml 35% TCA. Κατόπιν ισχυρής ανάδευσης σε vortex προστέθηκαν 0,5ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris/HCl (50mM, ph 7,4) και ακολούθησε ανάδευση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10min. Έπειτα προστέθηκε 1.0ml διαλύματος

37 34 0,75% θειοβαρβιτουρικού οξέος σε 2Μ Na2SC>4. Το διάλυμα θερμάνθηκε για 45min στους 100 C για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση που θα δώσει το έγχρωμο προϊόν. Στη συνέχεια οι σωλήνες Falcon τοποθετήθηκαν σε πάγο για να επανέλθουν σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε προσθήκη 1ml 70% TCA, ισχυρή ανάδευση σε vortex και φυγοκέντρηση στις 5000rpm (2790g) για lomin στους 25 C. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μια επιπλέον φυγοκέντρηση στις loooorpm για lomin στους 25 C γιατί παρατηρήθηκε πως το ίζημα επαναδιαλύονταν γρήγορα και παρεμπόδιζε τη φωτομέτρηση. Τέλος έγινε προσδιορισμός της απορρόφησης του υπερκείμενου στα 530nm εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Στο διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ως τυφλό προστέθηκαν 1 ΟΟμΤ dl FO αντί για ορό. Οι συνολικές ενώσεις που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ προσδιορίσθηκαν με βάση το συντελεστή μοριακής απόσβεσης για την MDA 1, cm'1 Μ'1. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Στην περίπτωσή μας η συνολική ποσότητα των TBARS προσδιορίσθηκε ως : Ποσότητα TBARS = Απορρόφηση δείγμα 1, nmoles/ml ορού 6) Προσδιορισμός της δραστικότητας me καταλάσης ορού Με τη συγκεκριμένη μέθοδο μετρήθηκε η δραστικότητα της καταλάσης στον ορό με τη μέθοδο των Aebi et al. ( 1984). Η καταλάση ως γνωστό καταλύει την αντίδραση: 2Η2Ο2 > 2Η2Ο + Ο2 Σε 20 pl ορού προστέθηκαν 2,975 ml 67mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου, ρτι 7,4 και το διάλυμα επωάσθηκε για 10 min στους 37 C έτσι ώστε το ένζυμο να αποκτήσει τη μέγιστη δραστικότητα. Έπειτα προστέθηκαν 5μΣ 30% Η2Ο2 (τελική συγκέντρωση 15mM) και κατόπιν γρήγορης ανάδευσης έγινε φωτομέτρηση για 3sec στα 240nm σε κυψελίδα χαλαζία οπότε υπολογίστηκε ο ρυθμός διάσπασης του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Στο διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ως τυφλό ο ορός αντικαταστάθηκε από ρυθμιστικό διάλυμα. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η δραστικότητα της καταλάσης υπολογίσθηκε ως εξής: Δραστικότητα = AO.D 3 ΙΟ6 62,4 20 pmoles/min/ml 7) Ποσοτικός προσδιορισμός της GSH σε αιμόλυμα Στο συγκεκριμένο προσδιορισμό εφαρμόσθηκε η μέθοδος των Reddy Υ.Ν. et al. (2004). Η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης απομακρύνει το Η2Ο2 προς σχηματισμό Η2Ο με την οξείδωση της ανηγμένης GSH : Η2Ο2 + 2 GSH > GSSG +2Η2Ο Στη συνέχεια η οξειδωμένη GSSG επανέρχεται στην ανηγμένη μορφή της χρησιμοποιώντας την αναγωγική ισχύ του NADPH και το ένζυμο ρεδουκτάση της γλουταθειόνης: GSSG + NADPH +Η+ -» 2GSH + NADP+ (Halliwell et al., 1998) Η ελεύθερη ομάδα -SH μπορεί να αντιδράσει με το DTNB όπως φαίνεται στην εικόνα 18.

38 35 Rt - S' + Rj - S - S- R2 ^ ^ R2 - S' + Rj - S - S- R, COOH COOH TNB COOH Εικόνα 16: Αντίδραση παραγωγής έγχρωμου προϊόντος από το DTNB. (Από: Σε 20 pl από το υπερκείμενο που προέκυψε κατόπιν φυγοκέντρησης του αιμολύματος προστέθηκαν 660 pl 67 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών νατρίου και καλίου, ph 7,95 και 330 pl διαλύματος DTNB (39,6 mg DTNB σε 100ml 1% κιτρικού νατρίου). Κατόπιν ανάδευσης τα διαλύματα επωάσθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και απουσία φωτός για 15 min. Η μέτρηση της απορρόφησης έγινε στα 412 nm. Στο τυφλό προστέθηκαν 20 pl CIH2O αντί για υπερκέιμενο. Η μέτρηση της απορρόφησης έγινε εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων βασίζεται στο άρθρο των Khyrian et al (2003) σύμφωνα με το οποίο η σύνδεση GSH - DTNB δίνει έγχρωμο προϊόν με συντελεστή απορρόφησης 13,6 mm'1 cm'1 (στοιχείομετρική αντίδραση). Στην περίπτωσή μας ισχύει: Ποσότητα GSH = ΡΡ Ή δείγμα 131,3 pmoles/ml ολικού αίματος 13,6 8) Προσδιορισμός της GSSG Με τη συγκεκριμένη μέθοδο των Tietze F., et al. (2004), προσδιορίζεται η οξειδωμένη γλουταθειόνη. Το κίτρινο χρώμα που παρατηρείται τελικά οφείλεται στη ακόλουθη αντίδραση, αφού δηλαδή η GSSG αναχθεί σε GSH οπότε ο αρχή της μεθόδου είναι πλέον η ίδια με την προηγούμενη μέθοδο προσδιορισμού της GSH. Σε 260 μτ υπερκείμενου από αιμόλυμα κατόπιν φυγοκέντρησης προστέθηκαν pl 1Μ NaOH μέχρι το ph να ανέβει στο 7-7,5. Έπειτα σε κάθε eppendorf προστέθηκαν 4 pl 2-vynilpyridine monomer και έγινε επώαση των δειγμάτων σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Με αυτό τον τρόπο το 2- vynilpyridine λειτούργησε ως μάσκα που δεσμεύει την GSH έτσι ώστε στην συνέχεια να γίνει ο προσδιορισμός μόνο της GSSG. Μετά την επώαση 5 pl από κάθε eppendorf

39 36 τοποθετήθηκαν σε νέα σωληνάκια και προστέθηκαν 100 pl 3mM διαλύματος NADPH. To NADPH διαλύθηκε σε 143mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 6,3 mm Na2EDTA, ph 7,5. Επιπλέον προστέθηκαν 100 pl 10mM διαλύματος DTNB (0,04 gr DTNB σε 10ml 143mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 6,3mM NaiEDTA, ph 7,5), 600 pl ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (143mM, 6,3mM Na2EDTA, ph 7,5 ), 189pL d^o και στο τέλος Ιμΐ ρεδουκτάση της γλουταθειόνης. Έγινε γρήγορη ανάδευση και φωτομέτρηση στα 412nm για 3min, εις διπλούν για το κάθε δείγμα οπότε υπολογίσθηκε ο ρυθμός παραγωγής έγχρωμου προϊόντος ανά λεπτό. Ο προσδιορισμός της GSSG έγινε σύμφωνα με τη βοήθεια εξίσωσης που διεξήχθη από την πρότυπη καμπύλη και έπειτα η τιμή της συγκέντρωσης πολλαπλασιάστηκε επί 400 για να υπολογισθούν τα nmoles της GSSG σύμφωνα με το βαθμό αραίωσης. Στην συγκεκριμένη μέθοδο είναι απαραίτητη η εξίσωση που προκύπτει από την πρότυπη καμπύλη. Η πρότυπη καμπύλη προκύπτει μετρώντας την απορρόφηση διαλυμάτων με γνωστές συγκεντρώσεις GSSG σύμφωνα με τον ακόλουθο πίνακα: (hl) τυφλό 0,12 nmoles 0,25 nmoles 0,75 nmoles 1,5 nmoles GSSG (αραιωμένο διάλυμα) NADPH DTNB Ρυθμιστικό διάλυμα dh GR * ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (143mM, 6,3mM Na2EDTA, ph 7,5) To διάλυμα GSSG που χρησιμοποιήθηκε στην πρότυπη καμπύλη προκύπτει με τον εξής τρόπο: αρχικά παρασκευάσθηκε ένα πυκνό διάλυμα GSSG (0,0061 gr GSSG/10 ml ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (143mM, 6,3mM Na2EDTA, ph 7,5), το οποίο στη συνέχεια αραιώθηκε 1:100 σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (143mM, 6,3mM Na2EDTA, ph 7,5) ώστε το τελικό διάλυμα να έχει συγκέντρωση 10 nmoles/ml. 9) Στατιστική ανάλυστι Ο έλεγχος για την ύπαρξη διαφορών ανάμεσα στις δύο ομάδες έγινε με τη βοήθεια ενός μη-παραμετρικού τεστ, του Mann-Whitney U-test με στάθμη σημαντικότητας Ρ=0,05. Ο συσχέτιση μεταξύ των μεθόδων για την ίδια ομάδα έγινε με τον υπολογισμό του συντελεστή συσχέτισης Spearman r που είναι μια μη παραμετρική δοκιμασία.

40 37 Αποτελέσματα Συγκριτικά μεταξύ των δύο ομάδων παρατηρήθηκε υψηλότερη ολική αντιοξειδωτική ικανότητα στα απροπόνητα άτομα (M.O±s.e: 25,992 ± 1,237) σε σχέση με τα προπονημένα (M.O±s.e: 18,807 ± 1,778) με στατιστική σημαντικότητα (Ρ<0,05). Επιπλέον διαπιστώθηκε με μεγάλη στατιστική σημαντικότητα (Ρ<0,0001) πως τα επίπεδα GSH είναι υψηλότερα στην ομάδα ελέγχου (M.O±s.e: 0,6633 ± 0,035) σε σχέση με τα προπονημένα άτομα (M.O+s.e: 0,4247 ± 0,024). Κατά συνέπεια παρατηρήθηκε πως ο λόγος GSH/GSSH είναι υψηλότερος (Ρ<0,01) στα απροπόνητα άτομα (M.O±s.e: 18,067 ± 2,760) σε σχέση με τα προπονημένα (M.O+s.e: 10,264 ± 1,490). Για κάθε ομάδα μεμονωμένα παρατηρήθηκε στα προπονημένα άτομα αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της δραστικότητας της καταλάσης με μικρή όμως στατιστική σημαντικότητα (Ρ=0,061, r=-0,463), μεταξύ του λόγου GSH/GSSG και της δραστικότητας της καταλάσης (Ρ<0,01, r=-0,604), και μεταξύ του λόγου GSH/GSSG και της συγκέντρωσης της GSSG (ΡΟ,ΟΟΟΙ, r=-0,925). Αντιθέτως θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και της συγκέντρωσης GSSG (ΡΟ,ΟΙ, r=0,693) και μεταξύ της οξειδωμένης και ανηγμένης μορφής της γλουταθειόνης (Ρ<0,05, r=0,541). Στην ομάδα ελέγχου παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης TBARS και GSH (Ρ<0,05, r=0,6474), και μεταξύ της συγκέντρωσης TBARS και GSSH με μικρή όμως στατιστική σημαντικότητα (Ρ=0,0867, r=0,5149). Αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της συγκέντρωσης της GSSG και του λόγου GSH/GSSG (ΡΟ,ΟΟΟΙ, r=-0,9441), μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης TBARS με μη ικανοποιητική στατιστική σημαντικότητα ωστόσο (Ρ=0,0999, r=-0,4974) και μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης GSH (ΡΟ,05, r=-0,6550).

41 38 Διαγράμματα 1) Συγκριτικά αποτελέσματα των παραμέτρων μεταξύ της ομάδας ελέγγου και των «Ολούμενων παιδιών 1) Ολική αντιοξειδωτική ικανότητα 30 π χ 25 ο. Ο 20 b 15-3 w ^ Απροπόνητοι Προπονημένοι Διάγραμμα 1: Ραβδόγραμμα της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του ορού της ομάδας των προπονημένων ατόμων και της ομάδας ελέγχου. Ο αστερίσκος δείχνει σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων παιδιών (Ρ<0.05) 2) Η ποσότητα των ενώσεων που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ παρουσίασε μια τάση διαφοροποίησης μεταξύ των δύο ομάδων όπως φαίνεται στο διάγραμμα 2 (Ρ<0,07). TBARS Προπονημένοι Απροπόνητοι Διάγραμμα 2: Ραβδόγραμμα TBARS στον ορό της ομάδας των κολυμβητών.

42 39 3) Η δραστικότητα της καταλάσης επίσης δεν εμφάνισε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (PO.08). Δραστικότητα καταλάσης 30 - ε C 20 - ίο a. 0 Προπονημένοι Απροπόνητοι Διάγραμμα 3: Ραβδόγραμμα για τη δραστικότητα της καταλάσης. 4) Αντίθετα πολύ σημαντική (Ρ<0,0001) παρουσίασαν οι δύο ομάδες στον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της GSH, όπως φαίνεται στο διάγραμμα 4. GSH Προπονημένοι Απροπόνητοι Διάγραμμα 4: Ραβδόγραμμα της GSH για τις δύο ομάδες: ομάδα κολυμβητών και ομάδα ελέγχου.

43 40 5) Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (Ρ>0,05) στον προσδιορισμό της GSSG, όπως φαίνεται στο διάγραμμα 5. GSSG Ο 08 1 w 0,06 ο g Ο 0,04 α 0,02 = 0 Απροπόνητοι Προπονημένοι Διάγραμμα 5: Ραβδόγραμμα της GSSG για την ομάδα των κολυμβητών και την ομάδα ελέγχου. 6) Ο προσδιορισμός του λόγου GSH/GSSG είναι επίσης μια άλλη παράμετρος με μεγάλη στατιστική σημαντικότητα (Ρ<0,01). Σύμφωνα με τους υπολογισμούς, ο λόγος είχε υψηλότερη τιμή για την ομάδα ελέγχου όπως φαίνεται και στο διάγραμμα 6. GSH/GSSG 25 π * 20 Τ 15 - ^ Απροπόνητοι Προπονημένοι Διάγραμμα 6: Ραβδόγραμμα του λόγου GSH/GSSG για την ομάδα των κολυμβητών και την ομάδα ελέγχου.

44 41 2) Συσγετίσεις των παραμέτρων στην ομάδα των άθλούμενων παιδιών Διάγραμμα 7: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της δραστικότητας της καταλάσης (Ρ=0,061, r=-0,463, 95% C.I: -0,778, 0,038). Διάγραμμα 8: Θετική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και της συγκέντωσης και της συγκέντρωσης GSSG (Ρ=0,002, r=0,693, 95% C.I: 0,305, 0,884).

45 42 Διάγραμμα 9: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και του λόγου GSH/GSSG (Ρ=0,01, r=-0,604, 95% C.I: -0,845, -0,159). Διάγραμμα 10: Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης GSH και GSSG (Ρ=0,025, r=0,541, 95% C.I: 0,066, 0,816).

46 43 Διάγραμμα 11: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της GSSG και του λόγου GSH/GSSG (ΡΟ,ΟΟΟΙ, r=-0,925, 95% C.I: -0,974, -0,794). GSSG - RATIO GSSG (pmol/min/ml)

47 44 4.3) Συσγετίσεις των παραμέτρων στην ομάδα ελέγγου Διάγραμμα 12: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης GSSG και του λόγου GSH/GSSG (ΡΟ,ΟΟΟΙ, r=-0,9441, 95% C.I: -0,985, -0,8010). Διάγραμμα 13: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης TBARS, αν και η στατιστική σημαντικότητα δεν είναι ικανοποιητική (Ρ=0,0999, r=-0,4974, 95% C.I: - 0,8392, 0,1263).

48 45 Διάγραμμα 14: Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης GSH (Ρ=0,0208, r=-0,6550, 95% C.I: - 0,8970, -0,1107). Διάγραμμα 15: Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης TBARS και της GSSH, με μικρή στατιστική σημαντικότητα (Ρ=0,0867, r=0,5149, 95% C.I: - 0,1031,0,8461).

49 46 Διάγραμμα 16: Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης TBARS και της GSH (Ρ=0,0229, r=0,6474, 95% C.I: 0,09764, 0,8944). ν' Ε Ρ Ε ΐ 3. ^ Ο I ο if) * TBARS-GSH TBARS (nmol/ml ορού)

50 47 Συζήτηση Έχει τεκμηριωθεί πως η μέτριας έντασης άσκηση αυξάνει το μέσο όρο ζωής, προστατεύει τον οργανισμό από τις νευρομυϊκές και καρδιαγγειακές παθήσεις και σε βιοχημικό επίπεδο τροποποιεί την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού. Σύμφωνα με αποτελέσματα ερευνών τα τελευταία είκοσι χρόνια, ο ρόλος της άσκησης έχει και προσαρμοστικό χαρακτήρα. Οι έντονες ανάγκες του οργανισμού για οξυγόνο δημιουργούν δραστικές ενώσεις οξυγόνου που αν δεν απομακρυνθούν επιφέρουν σημαντικές βλάβες σε βιολογικά μακρομόρια. Η παρέμβαση της άσκησης έγκειται στην αύξηση των επιπέδων των αντιοξειδωτικών ενζύμων, τη μείωση των δεικτών οξειδωτικού στρες και την αύξηση της μιτοχονδριακής δραστηριότητας (Navarro et al 2003). Τα άτομα στα οποία έχει μελετηθεί εκτεταμένα η σχέση οξειδωτικού στρες και άσκησης ανήκουν κυρίως στην ομάδα των ενηλίκων ενώ έχει αγνοηθεί η επίδραση της άσκησης στα παιδιά. Υπάρχουν λίγες ενδείξεις που διαφοροποιούν την απόκριση του οργανισμού στην άσκηση μεταξύ παιδιών και ανηλίκων, αλλά αναφέρονται κυρίως σε μεταβολικό και φυσιολογικό επίπεδο. Πρώτον, στα παιδιά παρατηρείται μεγαλύτερη κατανάλωση οξυγόνου. Δεύτερον, οι μεταβολές του ph και ο ρυθμός μετατροπής του ανόργανου φωσφόρου σε φωσφοκρεατίνη είναι μικρότερος. Τρίτον, η ροή του οξυγόνου στους ασκούμενους μύες είναι υψηλότερη και κατά συνέπεια τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες που εκτίθενται τα παιδιά είναι μεγαλύτερα (Cooper et al., 2004). Οι πληροφορίες αυτές δίνουν το γενικότερο πλαίσιο των αποτελεσμάτων της συγκεκριμένης μελέτης όπου η ομάδα των παιδιών που ασχολούνται με την κολύμβηση παρουσίασε διαφορετική αντιοξειδωτική απόκριση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Πιο αναλυτικά, βρέθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας μεταξύ της ομάδας των κολυμβητών και της ομάδας ελέγχου. Η ένδειξη αυτή ίσως πιστοποιεί πως η ομάδα των προπονημένων παιδιών έχει εκτεθεί σε υψηλά επίπεδα ROS, οπότε σε κατάσταση ηρεμίας τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών μορίων παραμένουν σε χαμηλά επίπεδα σε σχέση με τα απροπόνητα άτομα. Το γεγονός αυτό έρχεται σε αντίθεση με την άποψη πως η άσκηση αυξάνει την αντιοξειδωτική απόκριση του οργανισμού. Ωστόσο δεν πρέπει να παραβλεφθεί πως η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα προσδιορίζεται και από άλλες παραμέτρους όπως οι διατροφικές συνήθειες, ο βαθμός ανάπτυξης του ανοσοποιητικού συστήματος και ο ρόλος των ROS ως σηματοδοτικά μόρια σε διαδικασίες ανάπτυξης κατά την παιδική ηλικία. Άλλωστε η φυσική κατάσταση των παιδιών στην προεφηβική ηλικία δεν μπορεί να προσδιορισθεί αποκλειστικά από την συστηματική ενασχόλησή τους με κάποιο άθλημα, γιατί η άσκηση είναι μέρος του τρόπου ζωής τους. Όσο αφορά το δείκτη υπεροξείδωσης λιπιδίων TBARS, τα αποτελέσματα φαίνεται να συμφωνούν με προηγούμενες δημοσιεύσεις (Gonenc et al., 2000, Metin et al., 2000). Παρατηρήθηκε μια τάση μείωσης των επιπέδων MDA στα προπονημένα άτομα. Και σε αυτή την περίπτωση σημαντική παράμετρος είναι η περιεκτικότητα της διατροφής των παιδιών σε αντιοξειδωτικά, κυρίως βιταμίνη Ε, που προλαμβάνουν την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Αρκετό ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης η παρατήρηση των μειωμένων επιπέδων GSH στα παιδιά που ασχολούνται με την κολύμβηση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Φαίνεται πως ο ρυθμός οξείδωσης των μορίων GSH είναι αρκετά αυξημένος κατά την άσκηση. Σύμφωνα όμως με αυτή την υπόθεση η συγκέντρωση της GSSG θα έπρεπε να είναι πιο μεγάλη στα προπονημένα άτομα. Ωστόσο δεν παρατηρήθηκε καμιά σημαντική διαφοροποίηση των δύο ομάδων ως προς τη

51 48 συγκέντρωση της GSSG.. Κατά επέκταση ο λόγος GSH/GSSG βρέθηκε πολύ υψηλότερος στα απροπόνητα άτομα. Το συμπέρασμα που μπορεί να εξαχθεί σε αυτή την περίπτωση είναι ότι ο παιδικός οργανισμός κατά την άσκηση δεν επάγει την έκφραση GSH, αλλά περιορίζεται σε ένα γρήγορο ρυθμό ανακύκλωσης του τριπεπτιδίου. Παρόλο που η συγκέντρωση των αμινοξέων γ-γλουταμινικό, κυστεΐνη και γλυκίνη του τριπεπτιδίου καθορίζει εν μέρει το ρυθμό σύνθεσής του, δεν μπορεί να δικαιολογήσει τα πολύ χαμηλά επίπεδα στα προπονημένα άτομα. Η δραστικότητα της καταλάσης τείνει να είναι σχετικά αυξημένη στα άτομα της ομάδας ελέγχου. Και σε αυτή την περίπτωση ο παιδικός οργανισμός δεν ακολουθεί το μοτίβο απόκρισης ενός ενήλικου και τα συστήματα που επηρεάζονται από τα ROS αποκρίνονται με διαφορετικό τρόπο. Για παράδειγμα στους ενήλικες αθλητές αντοχής, όπως είναι οι κολυμβητές, η άσκηση αυξάνει την καταλάση (Alessio and Goldfarb (1988), Aguilo et al (2005)). Σε επίπεδο ομάδας παρατηρήθηκε πως τόσο τα προπονημένα άτομα όσο και τα απροπόνητα παρουσιάζουν μια ομαλή και αναμενόμενη συνεργασία των αντιοξειδωτικών τους συστημάτων. Έτσι για την ομάδα των κολυμβητών παρατηρήθηκε: Μια τάση αρνητικής συσχέτισης μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του ορού και της δραστικότητας της καταλάσης. Η τάση αυτή μπορεί να εξηγηθεί με το σκεπτικό πως όταν η πρώτη γραμμή αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού είναι επαρκής και τα επίπεδα ROS δεν είναι πολύ αυξημένα, τότε δεν υπάρχει άμεση ανάγκη για την ενεργοποίηση των άλλων συστημάτων. Θετική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και της συγκέντρωσης GSSG, η οποία αποτελεί μια λογική ένδειξη γιατί και οι δύο αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί έχουν ως στόχο τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η GSSG, ως προϊόν της GPX, έχει βρεθεί ότι διασπά το Η202. Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας της καταλάσης και του λόγου GSH/GSSG για τον προαναφερόμενο λόγο. Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης GSH και GSSG γιατί ακριβώς το τριπεπτίδιο ανακυκλώνεται από την οξειδωμένη μορφή στην ανηγμένη του μορφή με τη βοήθεια του ενζύμου GR. Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης GSSG και του λόγου GSH/GSSG, αφού αύξηση των επιπέδων της GSSG συνεπάγεται μείωση του παραπάνω λόγου. Στην ομάδα ελέγχου παρατηρήθηκε: Η προφανής αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων GSSG και του λόγου GSH/GSSG. Τάση αρνητικής συσχέτισης μεταξύ ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και επιπέδων TBARS, η οποία μπορεί να ερμηνευθεί ως μείωση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων όταν υπάρχει ικανοποιητική αντιοξειδωτική απόκριση. Έτσι εμποδίζονται τα ROS από το να επιτεθούν σε λιπαρά οξέα των μεμβρανών. Αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης GSH. Όπως και στην περίπτωση της συσχέτισης μεταξύ της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της δραστικότητας της καταλάσης

52 49 στην ομάδα των προπονημένων, έτσι και σε αυτήν η πρωτογενής απόκριση του οργανισμού στα επίπεδα ROS καθορίζει και το βαθμό ενεργοποίησης των μετέπειτα συστημάτων. Μικρή τάση θετικής συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων MDA και GSSG. Το δεδομένο αυτό απεικονίζει μια ταυτόχρονη αύξηση δύο δεικτών που πιστοποιούν πως ο οργανισμός έχει εκτεθεί σε μεγάλα επίπεδα οξειδωτικού στρες. Άλλωστε η GPX δεν αποικοδομεί μόνο Η2Ο2, αλλά και υπεροξείδια λιπών. Θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης MDA και GSH. Η συγκεκριμένη παρατήρηση μπορεί να σημαίνει πως όταν ο οργανισμός εκτίθεται σε αυξημένα επίπεδα ROS, προκαλείται υπεροξείδωση των λιπιδίων και στη συνέχεια ενεργοποιείται το σύστημα της γλουταθειόνης για την αποτελεσματική απομάκρυνσή τους. Είναι αξιοσημείωτο ότι στην ομάδα ελέγχου, κατά αντιστοιχία με την ομάδα των κολυμβητών δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις που να περιλαμβάνουν τη δραστικότητα της καταλάσης. Στη συγκεκριμένη μελέτη παρατηρήθηκε πως στα παιδιά που ασχολούνται συστηματικά με την άσκηση, δεν ενεργοποιούνται οι μελετηθέντες αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί. Η εξήγηση των συγκεκριμένων δεδομένων μπορεί να στηριχθεί προς το παρόν σε λίγες μελέτες που είναι συναφείς με το θέμα του οξειδωτικού στρες. Έτσι λοιπόν είναι γνωστό πως στους ενήλικες η παραγωγή ROS ενεργοποιεί αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς (Cooper et al., 2004). Για πιο λόγο όμως υπάρχει αυτή η διαφοροποίηση στα παιδιά; Έχει βρεθεί πως τόσο τα ROS όσο και κάποιοι φλεγμονώδεις παράγοντες επηρεάζουν τη δράση αυξητικών παραγόντων όπως η αυξητική ορμόνη (GH) και ο ινσουλινομιμητικός παράγοντας I (IGF-I). Μπορεί για αυτό το λόγο η ισορροπία των οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών παραγόντων να αποτελεί ένα μέτρο που καθορίζει την ισορροπία αναβολικών και καταβολικών διαδικασιών κατά την ανάπτυξη στην παιδική ηλικία, (εικόνα 17). Κατά συνέπεια, αφού η δράση και ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων στα παιδιά διαφέρει συγκριτικά με τους ενήλικες, η σημασία των ROS αποκτά διαφορετικό περιεχόμενο και λαμβάνει άλλες διαστάσεις (Cooper et al., 2004).

53 50 Άσκηση Διαμεσολαβητές ανάπτυξης t Συστηματικοί αναβολικοί παράγοντες GH Τοπικοί αναβολικοί παράγοντες IGF-I Ινσουλίνη Ενεργοποίηση μηχανισμών φλεγμονής Ανοσολογική απόκριση Λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα κυτοκίνες φλεγμονής I Οζειδωτικό στρες ROS Ουδετερόφιλα Ασθένειες (άσθμα, κυστική ίνωση)_ Περιβάλλον και άλλοι παράγοντες (παχυσαρκία, καθιστική ζωή, κρίσιμες περίοδοι ανάπτυξης) Επιπτώσεις στην υγεία 1. Πρόληψη μεταβολικού συνδρόμου στην παιδική ηλικία 2. Πρόληψη ασθενειών όπως ο διαβήτης και τα καρδιαγγειακά νοσήματα Επιπτώσεις στην ανάπτυξη 1. Διάπλαση σώματος και μυϊκή μάζα 2. Οστική μάζα Εικόνα 17: Συσχέτιση της άσκησης με την υγεία και την ανάπτυξη στα παιδιά. (Από: Cooper et al., 2004, Pulmonology, 16:3)

54 51 Υπάρχουν ολοένα και αυξανόμενες ενδείξεις πως η μέτριας έντασης αερόβια άσκηση αναστέλει τον άξονα GH/IGF-I, ο οποίος συνδέεται με την αύξηση της μυϊκής μάζας κατά την άσκηση τόσο στους ενήλικες όσο και στα παιδιά. Το παράδοξο είναι πως ενώ στα παιδιά μειώνονται τα επίπεδα του IGF-I, αυξάνεται η μυϊκή μάζα (Cooper et al., 2004). Αυτό το γεγονός οδήγησε στην ιδέα πως η άσκηση ενεργοποιεί την έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών από τα μονοκύτταρα στον ασκούμενο μυ (εικόνα 18), οι οποίες με τη σειρά τους απελευθερώνουν άλλες κυτοκίνες, όπως η IL-6, η IL-Ιβ και ο TNF-α, που αναστέλουν την αναβολική δράση του IGF-I (Smith et al., 2000). Οι κυτοκίνες είναι μια ομάδα πολυπεπτιδίων χαμηλού μοριακού βάρους που ελέγχουν την επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων σε καταστάσεις φλεγμονής (Scheet et al., 2002). Παράλληλα οι αναστολείς των κυτοκινών και οι αντιφλεγμονώδεις κυτοκίνες μειώνουν την έκταση της φλεγμονώδους απόκρισης που εκδηλώνεται από τους ασκούμενους μύες κατά την άσκηση (Ostrowski et al., 1999). 02 OH Η202 HCIO Οξειδωτικό στρες ROS Μεταγραφικοί παράγοντες Κυτοκίνες IL-6, TNF-a Φλεγμονή Ενεργοποίηση μακροφάγων Εικόνα 18: Οι παράγοντες φλεγμονής ενεργοποιούνται από τα ROS και στη συνέχεια τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εκκρίνουν επιπρόσθετα ROS, συνεχίζοντας έτσι τον κύκλο της φλεγμονής. Σύμφωνα με δημοσιευμένες έρευνες (Nemet et al., 2003, Scheet et al., 1999, Scheet et al., 2002) έχουν γίνει προσπάθειες σύνδεσης των φλεγμονωδών παραγόντων που παράγονται κατά την άσκηση και του άξονα GH/IGF-I. Έτσι σε μια μελέτη (Nemet et al., 2003) σε κοπέλες εφηβικής ηλικίας που ασχολούνταν με την υδατοσφαίριση, παρατηρήθηκε πως η άσκηση αυξάνει τα επίπεδα των κυτοκινών και τροποποιεί τους πληθυσμούς των λευκοκυττάρων (Mackinnon, 2000). Για παράδειγμα μια κύρια κυτοκίνη που συναντάται σε μυϊκές φλεγμονές, η IL-6, εμφανίζεται ιδιαίτερα αυξημένη στις παιδικές ηλικίες αν και χαρακτηρίζεται ως καταβολικός παράγοντας. Ταυτόχρονα όμως επάγει την αγγειογένεση ενεργοποιώντας σηματοδοτικά μονοπάτια αυξητικών παραγόντων

55 52 (Scheet et al., 1999). Άλλωστε η αγγειογένεση και η αύξηση της οστικής και μυϊκής μάζας αποτελούν τα πρώτα αποτελέσματα της άσκησης. Η IL-6 αυξάνεται κυρίως ως απόκριση σε μια στρεσογόνο κατάσταση όπως η άσκηση και οδηγεί σε αύξηση των λευκοκκυττάρων τα οποία είναι υπεύθυνα για την έκκρισή της. Επιπλέον ταυτόχρονα με την IL-6 αυξάνεται και η ανασταλτική της κυτοκίνη IL-lra για να επικρατήσει τελικά η ισορροπία (Nemet et al., 2003). Εκτός όμως από την IL-lra, αυξάνεται και η πρωτεΐνη IGFBP-I (insulin growth factor binding protein I) η οποία αναστέλει την αναβολική δράση του IGF-I και ενεργοποιείται από προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (Nemet et al., 2003). Τα παιδιά που ασχολούνται συστηματικά με κάποιο άθλημα φαίνεται πως αντιμετωπίζουν μια συνεχή καταβολική κατάσταση και η βιοχημική εικόνα του οργανισμού τους προσομοιάζει αυτή που συνήθως παρατηρείται σε περιπτώσεις τραυματισμού ή εγκαύματος. Ωστόσο, τα παιδιά που έχουν καλύτερη φυσική κατάσταση φαίνεται πως ξεπερνάν πιο γρήγορα τη συγκεκριμένη κατάσταση και γρήγορα επανέρχεται η δράση του IGF-I (Scheet et al., 2002). Τα παιδιά εμφανίζουν αρκετές διαφοροποιήσεις στο ανοσοποιητικό τους σύστημα σε σχέση με τους ενήλικες. Αυτό είναι λογικό γιατί ο οργανισμός έχει μικρή εμπειρία ως προς την έκθεσή του σε αντιγόνα, οπότε η άμυνα του οργανισμού είναι ακόμα ανώριμη. Η φλεγμονώδης λοιπόν απόκριση του οργανισμού κατά την άσκηση οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα παραγωγής ROS από τα μακροφάγα, τα μονοκύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα γιατί δεν υπάρχει πλήρης έλεγχος αυτών των κυττάρων του ανοσοποιητικού (Lilic et al., 1997). Ίσως τελικά η καταστολή του άξονα GH/IGF-1 να αποτελεί μια από τις πλέον σημαντικές διαδικασίες κατά την παιδική και προεφηβική ηλικία. Έχει βρεθεί πως η διαδικασία της καρκινογένεσης επάγεται από τον αναβολικό παράγοντα IGF-1 (Westerlind, 2003). Η ανασταλτική δράση των κυτοκινών προς αυτή την κατεύθυνση έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή του πολλαπλασιασμού των λιποκυττάρων, τη μείωση της λιπογένεσης και την αύξηση της λιπόλυσης και τη μείωση πρόσληψης γλυκόζης (Wabitsch et al., 1995, Wollman and Ranke 1995, Das, 2001). Η αναστολή αυτών των αναβολικών διαδικασιών έχει ιδιαίτερη σημασία κατά την εφηβεία γιατί οι ηλικίες σηματοδοτεί την χρονική περίοδο που αυξάνεται ο αριθμός των λιποκυττάρων του οργανισμού με σημαντικά μακροπρόθεσμα αποτελέσματα για την υγεία του ατόμου (The international association for the study of obesity, 2004). Άλλωστε ο λιπώδης ιστός χαρακτηρίζεται ως ένα ενδοκρινές όργανο που ρυθμίζει τη λειτουργία του μεταβολισμού και του καρδιαγγειακού συστήματος (Gielen et al., 2004). Αν και τα ROS έχουν την ιδιότητα να προκαλούν βλάβες σε βιολογικά μόρια, ολοένα και περισσότερα δεδομένα δείχνουν ότι η παραγωγή τους είναι ελεγχόμενη στα πλαίσια δράσης τους ως διαβιβαστές σε σηματοδοτικά μονοπάτια (Finkel, 2003) που αφορούν στην ανάπτυξη, τη γήρανση, το προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και στη ρύθμιση αυξητικών παραγόντων (Allen και Tresini, 2000). Κατά συνέπεια η μελέτη των ROS στη παιδική ηλικία, που είναι η κατεξοχήν περίοδος ανάπτυξης του οργανισμού, έχει ιδιαίτερη σημασία. Υπό τον έλεγχο ορμονών, νευροδιαβιβαστών, αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών, τα ROS λειτουργούν ως δεύτεροι διαβιβαστές και τελικά οδηγούν στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων. Χαρακτηριστικά αναφέρονται οι μεταγραφικοί παράγοντες NF-κΒ (nuclear factor-κβ) και ο ΑΡ-1 (activator protein-1) οι οποίοι ενεργοποιούνται σε υψηλές συγκεντρώσεις Η2Ο2. Το αποτέλεσμα της ενεργοποίησής τους είναι κυρίως η παραγωγή κυκλινών όπως η D1 και κατά συνέπεια η επιτάχυνση του κυτταρικού κύκλου, η έκφραση

56 53 αντιαποπτωτικών και αποπτωτικών γονιδίων και προφλεγμονωδών παραγόντων (Kundu et al., 2004). Επίσης αρκετοί αυξητικοί παράγοντες όπως ο PDGF, ο EGF, ο NGF και κυτοκίνες όπως οι IL-6 και ο TNF-α αυξάνουν τα επίπεδα ROS. Ακόμα και οι πιο γνωστές οικογένειες κινασών όπως οι ΡΤΚ, οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης και οι ΜΑΡΚ φαίνεται να αποκρίνονται στα επίπεδα των ROS. Στην εικόνα 19 φαίνεται το δίκτυο αντιδράσεων που εμπλέκονται τα ROS (Poll et al., 2004). Ίσως η αυξημένη αναβολική δράση στον παιδικό οργανισμό να επιτρέπει την αυξημένη συγκέντρωση ROS. EOF, POOF, NGF, E;T-1 TOPJlt.TNFa. IL-Ιβ Ang II 6^ Mitochondrial Smooth cndapimniic reticulum xanthine NADPfH) monoamine elect non transport chain electron transport chain oxidase OXidase(s) oxidase 1 NFIB. AP-1, Sp4, c-myb. ps3, c-myc, EGR-I, MIF4.GR, CRBB a Expression of redos-scnsitivc genes Εικόνα 19 : Οι κύριοι μοριακοί στόχοι των ROS (Από: Poll et al., Current Medical Chemistry, 2004, 11, ).

57 54 Συμπεράσματα Η αερόβια άσκηση, όπως για παράδειγμα η κολύμβηση, δεν προκαλεί αύξηση των συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών μηχανισμών στα παιδιά. Άρα η απόκρισή τους φαίνεται να είναι τελείως διαφορετική από τους ενήλικες. Το μειωμένο αναγωγικό δυναμικό των ερυθροκυττάρων στα προπονημένα άτομα (GSH/GSSG) θα μπορούσε να σημαίνει ότι η GSH αποτελεί σημαντικότερο μηχανισμό για την αντιμετώπιση των ROS σε σχέση με τα απροπόνητα άτομα. Θα μπορούσε όμως να υποδηλώνει ότι ταυτόχρονα έχουν και μειωμένο ρυθμό αναγέννησης της GSH. Η μειωμένη αντιοξειδωτική άμυνα των αθλούμενων παιδιών, όπως αυτή διαφαίνεται από τη χαμηλή ολική αντιοξειδωτική ικανότητα και από τα χαμηλά επίπεδα GSH, αποτελεί ένα σημαντικό στοιχείο που θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη από τους προπονητές, τους διατροφολόγους και τους βιοχημικούς ούτως ώστε να. σχηματίζεται μια πλήρης εικόνα για την αντιοξειδωτική απόκριση των παιδιών. Η γνώση της παραμέτρου αυτής ίσως να αποτελεί σημαντικό παράγοντα για τον καταρτισμό προγραμμάτων προπόνησης. Επιπλέον το γεγονός αυτό δίνει το έναυσμα για τη μελέτη της χορήγησης διατροφικών συμπληρωμάτων σε παιδιά που ασχολούνται συστηματικά με κάποιο άθλημα. Επίλογος Αν και η επίδραση του οξειδωτικού στρες και της άσκησης στους ενήλικες έχει μελετηθεί εκτεταμένα σε διάφορες πληθυσμιακές ομάδες, υπάρχει μεγάλη έλλειψη στοιχείων για την παιδική ηλικία. Ίσως ο λόγος να έγκειται στο γεγονός πως η παιδική ηλικία είναι εκ φύσεως συνδεδεμένη με την άσκηση και την ευρωστία. Ωστόσο τις τελευταίες δύο δεκαετίες οι κοινωνικοοικονομικές αλλαγές φαίνεται πως έχουν επηρεάσει τον τρόπο ζωής των παιδιών. Ολοένα και περισσότερα παιδιά υιοθετούν την καθιστική ζωή και το μη υγιεινό τρόπο διατροφής των ενηλίκων με άμεσο αποτέλεσμα την κατακόρυφη αύξηση της παχυσαρκίας. Παιδίατροι, διατροφολόγοι, φυσιοθεραπευτές και καρδιολόγοι προτείνουν πλέον την επιτακτική ενσωμάτωση της υγιεινής διατροφής και της άσκησης στη συνείδηση και τον τρόπο ζωής των παιδιών. Μέχρι στιγμής η επίδραση της άσκησης στα παιδιά έχει μελετηθεί κυρίως υπό το πρίσμα του ανοσοποιητικού, του ενδοκρινικού και του νευρικού συστήματος και σε συνάρτηση με ορισμένες παθολογικές καταστάσεις. Η πιθανή σύνδεση του οξειδωτικού στρες και της άσκησης κατά την παιδική ηλικία έχει αγνοηθεί τελείως. Στη συγκεκριμένη μελέτη βρέθηκε πως τα παιδιά που ασχολούνται συστηματικά με την άσκηση παρουσιάζουν ένα παράδοξο φαινόμενο ως προς την αντιμετώπιση των ROS. Αν και η αναμενόμενη απόκριση θα ήταν η ένταση της αντιοξειδωτικής απόκρισης, όπως στους ενήλικες, παρατηρήθηκε μια ακριβώς αντίθετη εικόνα. Η πιθανή εξήγηση ίσως να έγκειται στο γεγονός πως τα παραγόμενα ROS λειτουργούν διαφορετικά σε συστήματα ανάπτυξης, ανοσολογικής απόκρισης και σε σηματοδοτικά μονοπάτια αυξητικών παραγόντων. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να στοχεύσουν μελλοντικές έρευνες που αντικείμενο ενασχόλησής τους είναι η επίδραση του οξειδωτικού στρες σε υγιή παιδιά που αθλούνται.

58 55 Βιβλιογραφία 1) Aebi et al. (1984). Catalase in vitro. Methods Enzymol., 105: ) Aguilo Antoni, Tauler Pedro, Fuentespina Emilia, Tur Josep A., Cordova Alfredo, Pons Antoni. (2005). Antioxidant response to oxidative stress induced by exhaustive exercise. Physiology and behavior, 85:1-7. 3) Alessio H.M., Goldfarb A.H. (1988). Lipid peroxidation and scavenger enzymes during exercise: adaptive response to training. J. Appl. Physiol., 64(4): ) Alessio H.M., Hagerman A.E., Fulkeson B.K., Ambrose J. (2000). Generation of reactive oxygen species after exhaustive aerobic and isometric exercise. Medicine and science in sport and exercise, 32(9): ) Allen R.G., Tresini Maria. (2000). Oxidative stress and gene regulation. Free radical biology and medicine, 28(3): ) Ashok Badith T., Rashid Ali. (1999). The aging paradox: free radical theory of aging. Experimental gerontology, 34: ) Banerjee A.K., Mandal A., Chanda D., Chakraborti S. (2003). Oxidant, antioxidant and physical exercise. Mol Cell Biochem., 253: ) Beckman K.B., Ames B.N., (1998). The free radical theory of aging matures. Physiol Rev., 78(2): ) Bolzan Alejandro D., Brown Oscar A., Goya Rodolfo G., Bianchi Martha S. (1995). Flormonal modulation of antioxidant enzyme activities in young and old rats. Experimental gerontology, 30(2): ) Bulkley Gregory, (2002). Free radicals and reactive oxygen species. The evolution of a scientific concept. COSMOS JOURNALS 11) Chandan Sen K, Packer Lester. (2000). Thiol homeostasis and supplements in physical exercise. Am J Clin Nutr., 72:653S ) Cooper C.E., Vollaard N.B.J., Choueiri T., Wilson M.T. (2002). Exercise, free radicals and oxidative stress. Biochem. Society Transactions, 30: ) Cooper Dan Michael, Nemet Dan, Galassetti Pietro. (2004). Exercise, stress and inflammation in the growing child: from the bench to the playground. Pulmonology, 16(3): ) Crossnan and Moldave, (1967). Methods in enzymology, Vol XII 15) Das U.N., MD, FAMS. (2001). Is obesity an inflammatory condition? Nutrition, 17: ) Davies K.J., Quintanilha A.T., Brooks G.A., Packer L. (1982). Free radicals and tissue damage produced by exercise. Biochem. Biophys. Res. Commun., 107: ) Diaz P.T., She Z.W., Davis W.B., Clanton T.N. (1993). Hydroxylation of silicylate by the in vitro diaphragm: evidence for hydroxyl radical production during fatigue. J Appl Physiol., 75 : ) Dillard C.J., Litov R.E., Savin W.M., Dumelin E.E., Tappel A.L. (1978). Effects of exercise, vitamin E, and ozone on pulmonary function and lipid peroxidation. J Appl Physiol., 45: ) Druge W. (2002). Free radicals in the physiologiacal control of cell function. Physiol Rev., 82(1): ) Elosua R., Molina L., Fito M., Arquer A., Sanchez-Quesada J.L., Covas M.I., Ordonez-Llanos J., Marrugat J. (2003). Response of oxidative stress

59 56 biomarkers to a 16-week aerobic physical activity program, and to acute phase physical activity, in healthy young men and women. Athrosclerosis, 167: ) Finkel Toren (2003). Oxidant signals and oxidative stress. Current opinion in cell biology, 15: ) Gabi Nindl (2004). Hydrogen peroxide-from oxidative stressor to redox regulator. Cell science reviews, 1(2). 23) Gielen Stefan MD., Hambrecht Rainer. (2004). The childhood obesity epidemic. Circulation, 109: ) Gunduz F., Senturk U.K, Kuru O., Aktekin B., Aktekin M.R.(2004). The effect of one year s swimming exercise on oxidant stress and antioxidant capacity in aged rats. Physiol. Res., 53: ) Habif Sara, Mutaf Isil, Turgan Nevbahar, Onur Ece, Duman Can, Ozmen Dilek, Bayindir Oya. (2001). Age and gender dependent alterations in the activities of glutathione related enzymes in healthy subjects. Clinical biochemistry, 34: ) Halliwell Barry and Carroll E Cross (1994). Oxygen-derived Species: Their Relation to Human Disease and Environmental Stress. Environ Health Perspect, 102(Suppl 10):5-12 (1994) 27) Halliwell Barry and Carroll E. Cross (1994). Oxygen-derived Species: Their Relation to Human Disease and Environmental Stress. Environmental Health Perspectives, 102, Supplement 10 28) Halliwell Barry and Gutteridge John M.C. (1998). Free radicals in biology and chemistry, Oxford Science Publications 29) Hiroaki Ono, Akiko Sakamoto, Nobuo Sakura. (2001). Plasma total glutathione concentrations in healthy pediatric and adult subjects. Clinica chimica acta, 312: ) Jammes Yves, Guillaume Steinberg Jean, Bregeon Fabienne, Delliaux Stephane. (2004). The oxidative stress in response to routine incremental cycling exercise in healthy sedentary subjects. Respiratory physiology & neurobiology, 144: ) Janaszewska A., Bartosz G.(2002). Assay of total antioxidant capacity: comparison of four methods as applied to human blood plasma. Scand J Clin Invest., 62 : ) Johnson Peter. (2002). Antioxidant enzyme expression in health and disease: effects of exercise and hypertension. Comparative biochemistry and physiology Part C, 133: ) Keles M.S., Taysi S., Sen N., Aksoy H., Akcay F. (2001). Effects of corticosteroid therapy on serum and CSF malondialdehyde and antioxidant proteins in multiple sclerosis. Can. J. Neurol. Sci., 28: ) Kiran T.R., Subramanyam M.V.V., Devi S.A. (2004). Swim exercise training and adaptations in the antioxidant defense system of myocardium of old rats: relationship to swim intensity and duration. Comparative biochemistry and physiology part B, 137: ) Kundu Kumar Joydeb, Surh Young-Joon. (2004). Molecular basis of chemoprevention by resveratrol: NF-κΒ and AP-1 as potential targets. Mutation research, 555: ) Laaksonen DE, Atalay M, Niskanen L, Uusitupa M, Hanninen O, Sen CK. (1999). Blood glutathione homeostasis as a determinant of resting and exercise-induced oxidative stress in young men. Redox Rep., 4(1-2):53-59.

60 57 37) Lee Joohyung, Goldfarb Allan H. Rescino Mark H., Hedge Sudhir, Patric Steve, Apperson Kathy. (2002). Eccentric exercise effect on blood oxidativestress markers and delayed onset of muscle soroness. Medicine and science in sport and exercise, 34(3): ) Leewenburgh C., Heinecke J.W.(2001). Oxidative stress and antioxidants in exercise. Current medical chemistry, 8: ) Li Li Ji (1999) Antioxidants and oxidative stress in exercise. P.S.E.B.M., 222: ) Lilic D., Cant AJ., Abinum M., Calvet JE, Spickett GP. (1997). Cytokine production differs in children and adults. Pediatric research, 42: ) Mackinnon L.T. (2000). Chronic exercise training effects on immune function. Medicine and science in sport and exercise, 32(7): S369-S37. 42) Metin G, Gumustas MK, Uslu E, Belce A, Kayseriliogu A. (2003). Effect of regular training on plasma thiols, malondiadehyde and carnitine concentrations in young soccer players. Clinical journal of physiology, 46(1): ) Miles Michael V., Horn Paul S., Tang Peter H., Morrison John A., Miles Lili, DeCrauw Ton, Pesce Amadeo J., (2004). Age-related changes in plasma coenzyme Q10 concentrations and redox state in apparently healthy children and adults. Clinica chimica acta, 347: ) Mine Erden-Inal, Emine Sunal, Gungor Kanbak. (2002). Age-related changes in the glutathione redox system. Cell biochem Funct., 20: ) Mine Inal, Fahrettin Akyuz, Akin Turgut, Wade Mills Getsfrid. (2001). Effect of aerobic and anaerobic metabolism on free radical generation swimmers. Medicine and science in sport and exercise, 33(4): ) M0ller Peter, Wallin Hakan, Knudsen Lisbeth. (1996). Oxidative stress associated with exercise, psychological stress and life-style factors. Chemicobiological interactions, 102: ) Mylonas Chrisistomos and Kouretas Demetrios (1999). Lipid peroxidation and tissue damage. In vivo, 13: ) Navarro Ana, Gomez Carmen, Jose M.Lopez-Cepero, Alberto Boveris. (2004). Beneficial effects of moderate exercise on mice aging: survival, behavior, oxidative stress and mitochondrial electron transfer. American journal of regulatory, intergrative and comparative physiology, 13: ) Navarro-Arevalo Ana, Canavate Consuelo, Maria Jesus Sanchez-del-Pino. (1999). Myocardial and skeletal muscle aging and changes in oxidative stress in relationship to rigorous exercise training. Mechanisms of aging and development, 108: ) Nemet Dan, Rose-Gottron Christie M., Mills Paul J., Cooper Dan M. (2003). Effect of water polo practice on cytokines, growth mediators and leukocytes in girls. Medicine and science in sport and exercise, 35(2): ) Okamura K., Doi T., Hamada K.(1997). Effect of repeated exercise on urinary 8-hydroxy-deoguanosine excretion in humans. Free radical reviews, 26: ) Oztazan N., Taysi S., Gumustekin K., Altinkaynak K., Aktas O., Timur H., Siktar E., Keles S., Akar S., Akcay F., Dane S., Gul M. (2004). Endurance training attenuates exercise-induced oxidative stress in erythrocytes in rats. Eur J Appl Physiol., 91:

61 58 53) Palazzetti S., Richard M.J., Favier A., Margaritis I. (2003). Overloaded training increases exercise-induced oxidative stress and damage. Can. J. Appl. Physiol., 28(4): ) Patwell David M., McArdle Anne, Morgan Jennifer, Patridge Terence, Jackson Malcom. (2004). Release of reactive oxygen and nitrogen species from contracting skeletal muscle cells. Free radical biology and medicine, 37(7): ) Phillips Michael, Cataneo N. Renee, Greenberg Joel, Gunawardena Ratnasiri, Naidu Aijit, Rahbari-Oskoui Farid. (2000). Effects of age on the breath methylated alkane contour, a display of apparent new markers of oxidative stress. J Lab Clin Med., 136: ) Phillips Michael, Cataneo Renee N., Greenberg Joel, Gunawardena Ratnasiri, Rahbari-Oskoui Farid. (2003). Increased oxidative stress in younger as well as in older humans. Clinica chimica acta, 328: ) Poll G., Leonarducci G., Biasi F., Chiarpotto E. (2004). Oxidative stress and cell signaling. Current medical chemistry, 11: ) Powers Scott K., Criswell David, Lawler John, Li Li Ji, Martin Daniel, Herb Robert A., Dudley Gary. (1994). Influence of exercise and fiber type antioxidant enzyme activity in rat skeletal muscle. American journal of regulatory, intergrative and comparative physiology, 35: ) Reddy Y.N., Murthy S.V., Krishna D.R., Prabhakar M.C. (2004). Role of free radicals and antioxidants in tuberculosis patients. Indian J Tuberc, 51: ) Reid M.B., Shoji T., Moody M.R., Entman M.L. (19.92). Reactive oxygen in skeletal muscle II. Extracellular release of free radicals. J Appl Physiol., 73 : ) Rovira lisa I., Finkel Toren (2002). Survining an aerobic enviroment: aging under oxidative stress. Geriatric times, 3(4). 62) Rush James W.E., Sandiford Shelley D. (2003). Plasma glutathione peroxidase in healthy young adults: influence of gender and physical activity. Clinical biochemistry, 36: ) Scheet Timothy P., Mills Paul J., Ziegler Mike G., Stoppani James, Cooper Dan M. Effect of exercise on cytokines and growth mediators in prepubetral children. Pediatric research, 46(4): ) Scheet Timothy P., Nemet Dan, Stoppani James, Maresh Carl M. Newcomb and Robert, Cooper Dan M. (2002). The effect of endurance-type exercise training on growth mediators and inflammatory cytokines in pre-pubertal and early pubertal males. Pediatric research, 52(4): ) Schultze Paul Christian, Gielen Stephan, Schuler Gerhard, Hambrecht Rainer. (2002). Chronic heart failure and skeletal muscle catabolism: effects of exercise training. International journal of cardiology, 85: ) Simar David, Malatesta Davide, Koechlin Christelle, Cristol Jean Paul, Vendrell Jean Pierre, Caillaud Corinne. (2004). Effect of age on Hsp72 expression in leukocytes of healthy active people. Experimental gerontology, 39: ) Smith LL. (2000). Cytokine hypothesis of overtraining: a physiological adaptation to excessive stress? Medicine and science in sport and exercise, 32: ) Standman E.R. (2001). Protein oxidation in aging and age-related diseases. Ann N Y Acad Sci., 928:22-38.

62 59 69) The international association for the study of obesity. (2004). Obesity reviews, 5(Sl): ) Tietze F. (1969). Enzymic method for quantitive determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Analyt. Biochem., 27: ) Urso Maria L., Clarkson Priscilla M. (2003). Oxidative stress, exercise and antioxidant supplementation. Toxicology, 189: ) Wabitsch Martin, Hauner Hans, Heinze Eberhard, Teller Walter M. (1995). The role of growth hormone/insulin-like growth factors in adipocyte differentiation. Metabolism, 44(10):S ) Watson T.A., Callister R., Taylor R.D., Sibbritt D.W., Wicks-Macdonald L.K., Carg M.L. (2005). Antioxidant restriction and oxidative stress in shortduration exhaustive exercise. Medicine and science in sport and exercise, 37(1): ) Weinstock C., Konig D., Harnischmacher R., Keul J., Berg A., Northhoff H.(1997). Effect of exhaustive exercise stress on the cytokine response. Medicine and science in sport and exercise, 29: ) Westerlind Kim C.(2003). Physical activity and cancer preventionmechanisms. Medicine and science in sport and exercise, 35(11): ) Wollman H.A., Ranke M.B. (1995). Metabolic effects on growth hormone in children. Metabolism, 44(10)S4: