ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. Κ.Καλλέργη Μικροβιολογικό Τμήμα Νοσοκομείου Παίδων Π. & Α. Κυριακού

Transcript

1 ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Κ.Καλλέργη Μικροβιολογικό Τμήμα Νοσοκομείου Παίδων Π. & Α. Κυριακού

2 Ιογενή αίτια αναπνευστικών λοιμώξεων Οικογένεια Orthomyxoviridae Influenzavirus Influenzavirus A Influenzavirus B Influenzavirus C Paramyxoviridae Paramyxovirinae Pneumovirinae PIV1, PIV2, PIV3, PIV4 RSV hmpv Adenoviridae Mastadenovirus 47 ορότυποι Picornaviridae Rhinovirus Enterovirus HPeV >100 ορότυποι 62 ορότυποι 2 ορότυποι Coronaviridae Coronavirus 5 είδη Parvoviridae Bocavirus HBoV Μη αναπνευστικοί HSV, CMV,EBV, VZV,HHV6 Hantavirus, measles, HIV

3 Ιογενείς λοιμώξεις αναπνευστικού Κλινικά σύνδρομα Ρινίτις Φαρυγγίτις Λαρυγγίτις Τραχειοβρογχίτις Βρογχιολίτις Πνευμονία Αναγκαιότητα αιτιολογικής διάγνωσης Αποφυγή επιπλοκών Έλεγχος διασποράς Θεραπεία Επιδημιολογική επιτήρηση Εμβόλια

4 Ιογενείς λοιμώξεις αναπνευστικού Πρωτολοιμώξεις στα μικρά παιδιά Επαναλοιμώξεις με μικρότερη κλινική βαρύτητα Περιορίζονται στο αναπνευστικό σύστημα Ποικιλία κλινικών εκδηλώσεων σε ανοσοεπαρκείς Βαρειές λοιμώξεις : Ακραίες ηλικίες Άτομα με υποκείμενη νόσο Ανοσοκαταστολή Μετάδοση : Εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων Άμεση επαφή (δέρμα, επιφάνειες)

5 Ιοί αναπνευστικού Εποχιακή κατανομή

6

7 ιαγνωστική προσέγγιση ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού στο Κλινικό Εργαστήριο Ανίχνευση του αντιγόνου του ιού στο κλινικό δείγμα Ανοσοενζυμικές, Ανοσοφθορισμός Ανίχνευση ιικού γονιδιώματος με μοριακές μεθόδους PCR, RT-PCR, Multiplex PCR, Real time PCR Ανίχνευση των ειδικών αντισωμάτων στον ορό Τεχνικές: ELISA, IFA, HI, CF

8 είγμα Άμεσες τεχνικές Υλικό εκλογής Ρινικό και ρινοφαρυγγικό έκπλυμα (νεογνά & βρέφη) Αποδεκτά κατά περίπτωση Φαρυγγικά και ρινικά επιχρίσματα Τραχειακά και βρογχοκυψελιδικά εκπλύματα Εξιδρώματα επιπεφυκότα Υγρό μετά παρακέντηση τυμπανικού υμένα Ιστοτεμάχιο βιοψίας

9 είγμα Άμεσες τεχνικές Χρόνος συλλογής 3πρώτες ημέρες νόσου Παράταση απέκκρισης ιού Παιδιά Ανοσοκατασταλμένοι Επεξεργασία Ανίχνευση αντιγόνου Απομάκρυνση βλένης Μοριακές τεχνικές Προφύλαξη RNA από νουκλεάσες Υλικό μεταφοράς VTM (Buffer αλάτων) Υλικό συμβατό με τη μέθοδο εξέτασης Φύλαξη 4C παραμονή έως 96h -70 C παραμονή >96h

10 είγμα - Ανίχνευση αντισωμάτων ιάγνωση της πρόσφατης λοίμωξης 1 δείγμα ορού για ανίχνευση ειδικής IgΜ ή IgA 1 εβδομάδα από την έναρξη της νόσου 2 δείγματα ορού για ανίχνευση ορομετατροπής 1 ο (οξείας φάσης) στην έναρξη της νόσου 2 ο (ανάρρωσης) 2-4 εβδομάδες μετά το 1 ο

11 Ανίχνευση αντιγόνου - Ανοσοενζυμική ΕΙΑ μεμβράνης Ανοσοχρωματογραφία (IC) ιαθέσιμη για IA, IB, RSV.Πρόσφατα για Adeno, hmpv Ευαισθησία κυμαινόμενη Είδος δείγματος Χρόνος συλλογής Ηλικία ασθενούς Ειδικότητα και PPV χαμηλή εκτός επιδημικής περιόδου Αναγκαία η επιβεβαίωση με DFA ήμοριακήτεχνική Υψηλό κόστος αντιδραστηρίων ύσκολος ο έλεγχος της ποιότητας του δείγματος

12 Ανίχνευση αντιγόνου - Ανοσοφθορισμός Άμεση (DFA) ή έμμεση (IFA) τεχνική Αντιδραστήρια για IA, IB, RSV, PIV1, PIV2, PIV3,Adeno Πρόσφατα αντιδραστήρια για τον hmpv Μεμονωμένα μονοκλωνικά αbs ήσεpool Ευαισθησία ικανοποιητική για ΙΑ, ΙΒ, άριστη για RSV Ειδικότητα άριστη για όλους τους ελεγχόμενους ιούς Χαμηλό κόστος ανά δείγμα Έλεγχος ποιότητας δείγματος( κύτταρα τουλάχιστον)

13 Ανίχνευση αντιγόνου - Ανοσοφθορισμός Ταυτόχρονη ανίχνευση και ταυτοποίηση συνδυασμού ιών Με χρήση δύο διαφορετικών φθοριοχρωμάτων Συνδυασμοί που ανιχνεύονται IA/IB PIV1,2,3/Adeno PIV1,2/PIV3 RSV/IA RSV/PIV3 RSV/IA,B, PIVI,2,3,Adeno Πληθυσμός που ελέγχεται Κλινική εικόνα νόσου Επιδημιολογία ιών στην κοινότητα

14 Μοριακές μέθοδοι Το νέο χρυσό πρότυπο στη διάγνωση Ευαισθησία ανίχνευσης 10 ιικά σωματίδια Συμπληρώνουν την ανίχνευση αντιγόνου Αντικαθιστούν τις συμβατικές καλλιέργειες Πλεονεκτήματα εν επηρεάζονται από το είδος και το χρόνο συλλογής του δείγματος

15 Μοριακές μέθοδοι-εφαρμογές Βελτίωση ευαισθησίας συμβατικών τεχνικών Adeno, PIV Ανίχνευση ιών που δεν συμπεριλαμβάνονται στο Fmab pool PIV4, Entero, Rhino, Corona 229E και Corona OC43 Ανίχνευση νέων αναπνευστικών ιών Νέοι Rhino ορότυποι Νέοι Corona NL63 και HCU1 hbov Ανίχνευση μικτών λοιμώξεων 5-10% των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού

16 Ανίχνευση αντισωμάτων Μέθοδοι Ανοσοενζυμική (ELISA) Έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFA) Σύνδεση συμπληρώματος (CF) Αναστολή αιμοσυγκόλλησης (HI) Μειονεκτήματα Αναδρομική διάγνωση της λοίμωξης ιασταυρούμενες αντιδράσεις μεταξύ συγγενών ιών Ιδιαιτερότητες στην ανοσολογική απάντηση νεογνών και ανοσοκατασταλμένων

17 Influenzavirus - Επιδημίες Αντιγονική εκτροπή-drift Ετήσια επιδημικά κύματα Αυτόματες σημειακές αλλαγές στην αλληλουχία των αμινοξέων του γονιδίου της ΗΑ (κυρίως) Αντιγονική μεταβολή-shift Πανδημίες Αντικατάσταση του γονιδίου της ΗΑ ή και της ΝΑ με γονίδιο από στέλεχος γρίπης ζώου ή πτηνού με γενετικό ανασυνδυασμό Γρίπη Α και Β Μόνο στη γρίπη Α

18 Influenzavirus Kλινική εικόνα Ευρύ φάσμα κλινικών εκδηλώσεων Ηπιότερη νόσο ο ορότυπος Β Διαφορές ανά ηλικία και ανοσιακή κατάσταση Επιπλοκές Αφορούν το αναπνευστικό Ακραίες ηλικίες Υποκείμενο νόσημα Μέση ωτίτις Παραρινοκολπίτις Croup Πνευμονία(ιογενής, βακτηριακή) Παρόξυνση άσθματος Μυοσίτις Σύνδρομο Reye

19 Influenzavirus Ανίχνευση αντιγόνου Ανοσοφθορισμός DFA, IFA Ηπιοαξιόπιστη Ανοσοενζυμική EIA, IC Η πιό προσιτή Ευαισθησία % Ειδικότητα % Ευαισθησία * Ειδικότητα % Ιδανικές συνθήκες Ευαισθησία και ειδικότητα >90% * για ΙΒ και Α(Η1Ν1)ν

20

21

22 Influenzavirus - ιάγνωση Μοριακές τεχνικές Αιτιολογική διάγνωση Αντί της καλλιέργειας Χαρακτηρισμός στελεχών Τυποποίηση σε ΙΑ, ΙΒ Ανίχνευση μεταλλαγών ευαισθησία και ταχύτητα Ανίχνευση αντισωμάτων Πρόσφατη λοίμωξη ΕLΙSΑ ΙgM, IgA, IgG Καλή ευαισθησία Κυμαινόμενη ειδικότητα CF ιαχωρίζει Α, Β τύπο Έλεγχος ανοσίας HI Τίτλος 1:40

23 Influenza - Αξιολόγηση μεθόδων Ανίχνευση αντιγόνου (FA) Ταχεία και έγκαιρη διάγνωση Χρήσιμη και απαραίτητη 1. Στην αρχή της επιδημικής περιόδου 2. Σε νόσο εκτός επιδημίας Η ΕΙΑ εναλλακτικά σε μικρά εργαστήρια Ανίχνευση αντισωμάτων Επί αποτυχίας ή αδυναμίας εφαρμογής των άμεσων τεχνικών Μεταλοιμώδεις επιπλοκές γρίπης ( Αναδρομική διάγνωση) Ελεγχος ανοσίας Μοριακές τεχνικές Aποτυχία ανίχνευσης αντιγόνου Τυποποίηση στελεχών

24 Αναπνευστικός συγκυτιακός ιός RSV Συχνότερο αίτιο βρογχιολίτιδας και πνευμονίας νεογνών/βρεφών Προσβολή όλων των παιδιών μεταξύ 2 επιδημικών περιόδων Επιδημίες σε Νεογνικά και Παιδιατρικά Τμήματα Πρωτολοίμωξη: Εμπύρετη ρινίτιδα,φαρυγγίτιδα 20-40% προσβολή κατώτερου αναπνευστικού Ενήλικες Ήπια προσβολή ανώτερου αναπνευστικού Υπερήλικες - Ανοσοκαταστολή Προσβολή ανώτερου κατώτερου αναπνευστικού

25 RSV Ανίχνευση αντιγόνου Ανοσοφθορισμός DFA, IFA Ανοσοενζυμική EIA, IC Η μέθοδος εκλογής Η μέθοδος ρουτίνας Ευαισθησία % Ειδικότητα % Ευαισθησία %* Ειδικότητα % ΗανίχνευσηΑg πιο ευαίσθητη από τη καλλιέργεια *Αναφορά η καλλιέργεια

26

27 RSV - Ανοσοχρωματογραφία

28 RSV - ιάγνωση Μοριακές τεχνικές Ανίχνευση αντισωμάτων Ανίχνευση ιού Σε κλινικά δείγματα με χαμηλό ιικό φορτίο ιάκριση στελεχών Οροομάδες Α και Β ιάγνωση πρόσφατης λοίμωξης Μετά την 5 η -8 η ημέρα νόσου ΕLΙSΑ Ευαισθησία >90% >12 μηνών IFA Ευαισθησία >70% >6μηνών CF Λιγότερο ευαίσθητη

29 RSV αξιολόγηση μεθόδων Ανίχνευση αντιγόνου Μέθοδος αναφοράς για τα παιδιά Αποτέλεσμα κλινικά χρήσιμο Ανακοινώνεται άμεσα Μοριακές τεχνικές Αδιάγνωστες σοβαρές λοιμώξεις κυρίως ενηλίκων εν χρησιμοποιούνται στη διάγνωση ρουτίνας στα παιδιά Ανίχνευση αντισωμάτων Βοηθούν σε ενήλικες αν αποτύχουν ή δεν γίνουν οι άμεσες τεχνικές Περιορισμένη διαγνωστική αξία σε παιδιά <6 μηνών

30 Ιός παραγρίπης Parainfluenzavirus PIV Το 1/3 των αναπνευστικών λοιμώξεων στα παιδιά Παιδιά: PIV1 Croup 6-36μηνών PIV2 Croup ήπιο PIV3 Βρογχιολίτιδα, πνευμονία <6μην PIV4 Ηπια λοίμωξη σε μεγάλα παιδιά Ενήλικες: 10% των αναπνευστικών λοιμώξεων Υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα στους μεταμοσχευμένους (PIV3)

31 PIVs Ανίχνευση αντιγόνου Ανοσοφθορισμός Ανοσοενζυμική ΕΙΑ Mabs για κάθε ορότυπο Mabs σε Pool εν κυκλοφορούν αντιδραστήρια σε kit Ευαισθησία 70-83% Mαbs ή πολυκλωνικά Ειδικότητα Υψηλή Χαμηλή ευαισθησία

32 PIVs - ιάγνωση Μοριακές μέθοδοι Ανίχνευση αντισωμάτων Σπάνιεςεφαρμογέςστη ρουτίνα Πρόσφατη λοίμωξη IgM, IgA, IgG Ορομετατροπή RT-PCR, Multiplex PCR Υψηλό κόστος Έλλειψη συγκριτικών μελετών Μέθοδοι:ELISA, HI, CF Προβλήματα ειδικότητας Πιο αξιόπιστες οι ΕLΙSΑ

33 PIVs Αξιολόγηση μεθόδων Ανίχνευση αντιγόνου Θετικό αποτέλεσμα αξιόπιστο Ανακοίνωση στην κλινική χωρίς ταυτοποίηση τύπου Με ανοσοφθορισμό Μοριακές τεχνικές Αναγκαία η ανίχνευση του ιού PIV3 σε ανοσοκαταστολή εν έχει καθοριστεί η διαγνωστική αξία της Real time PCR Ανίχνευση αντισωμάτων εν συνιστάται Αναδρομική διάγνωση ιασταυρούμενες αντιδράσεις Aναξιόπιστη σε παιδιά <6 μηνών

34 Αδενοϊοί (Adenoviruses) Προκαλούν το 1-5% των αναπνευστικών λοιμώξεων Προσβάλλουν συχνότερα τα παιδιά( ~10 ετών) Αυξημένη επίπτωση και επιδημίες σε συγχρωτισμό Λοιμώξεις με συμμετοχή του οφθαλμού Παρατεταμένη απέκκριση Παιδιά, ανοσοκατασταλμένοι

35 Αδενοϊοί Κλινικά σύνδρομα Νόσος Ορότυπος Ηλικία Φαρυγγοαμυγδαλίτις 1, 2, 3, 5, 7 Βρέφη -παιδιά Βρογχιολίτις Πνευμονία 3, 4, 7, 21 Βρέφη - παιδιά Ανοσοκατασταλμένοι Κοκκυτικό σύνδρομο 5 Παιδιά Οξύ αναπνευστικό σύνδρομο(ard) Φαρυγγοεπιπεφυκιτικό ς πυρετός 4, 7 Νεοσύλλεκτοι 3, 4, 7 Παιδιά Γενικευμένη λοίμωξη 1, 2, 5, 11, 34, 35 Ανοσοκατασταλμένοι

36 Αδενοϊοί - ιάγνωση Ανίχνευση αντιγόνου Μοριακές μέθοδοι Ανοσοφθορισμός (IFA) Εκκινητές εξόνης Ευαισθησία 40-60% Ανινχνεύονται όλοι οι Adeno Ειδικότητα >99% Αποικισμός ή νόσος? Aνοσοχρωματογραφία Εκκινητές τύπου Ευαισθησία 84% Ανίχνευση συγκεκριμένου τύπου (Κέντρα αναφοράς)

37 Αδενοϊοί-Ανίχνευση αντισωμάτων Τεκμηρίωση πρόσφατης λοίμωξης ELISA εν είναι προτυποποιημένη CF Σε ευρεία χρήση. Ικανοποιητική επαναληψιμότητα Μικρή ευαισθησία στα παιδιά HI Ανιχνεύει αντισώματα ειδικά του τύπου (Εργαστήρια Αναφοράς)

38 Αδενοϊοί Αξιολόγηση μεθόδων Ανίχνευση αντιγόνου Συνήθεις αναπνευστικές λοιμώξεις κοινότητας Σε ανοσοκαταστολή Μοριακές μέθοδοι Ανίχνευση αντισωμάτων Γνωστά σύνδρομα (CF, ELISA) ιάγνωση οροτύπου (ΗΙ) Αξιολόγηση Κλινική εικόνα-επιδημιολογία Αποτυχία ανίχνευσης αντιγόνου Ταυτοποίηση τύπου (σύνδρομα) Ψευδώς (+) σε αποικισμό

39 Ανθρώπινος μεταπνευμονοϊός (hmpv) Παιδιά Ενήλικες Λοίμωξη με συμπτώματα RSV Συχνότητα 10-15% Ανώτερο αναπνευστικό Κατώτερο( υποκείμενη νόσος) Μικτές λοιμώξεις (5-30%) Επιδημίες στα Νοσοκομεία Υγιείς Κοινό κρυολόγημα Χρόνια πάσχοντες Παρόξυνση ΧΑΠ, άσθματος Βρογχίτιδα, πνευμονία Ανοσοκατασταλμένοι Σοβαρές επιμένουσες λοιμώξεις

40 hmpv - ιάγνωση Ανίχνευση αντιγόνου Ανοσοενζυμική (ΕΙΑ) Ευαισθησία 89% Ειδικότητα 100% Μοριακές τεχνικές RT-PCR,Multiplex PCR Αξιόπιστη, ευαίσθητη, ειδική Η μέθοδος εκλογής Ανοσοφθορισμός (DFA) Ευαισθησία 74% Ειδικότητα 94% Αντισώματα εν έχουν διαγνωστική αξία

41 Ρινοϊοί - Rhinoviruses Νόσοι Κοινό κρυολόγημα Παραρινικολπίτις Λοιμώξεις κατώτερου αναπνευστικού Επιπλοκές Βακτηριακή παραρινοκολπίτις Μέση ωτίτις Παρόξυνση βρογχίτιδας άσθματος ιάγνωση Μοριακές τεχνικές Ανίχνευση ιού Ταυτοποίηση στελέχους Ανίχνευση Ag και Αbs εν γίνονται Μεγάλος αριθμός οροτύπων

42 Αλγόριθμος διαγνωστικής προσέγγισης ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού ΙΟΣ Ανίχνευση Αg DFA, IFA Influenza A παιδιά B A ενήλικες RSV A παιδιά C ενήλικες Ανίχνευαη Ag EIA, IC A Β Β A A Β C παιδιά ενήλικες παιδιά ενήλικες Μοριακές τεχνικές B A παιδιά ενήλικες B C παιδιά Α ενήλικες PIVs A C B Α μεταμόσχευση Adeno A Β C Α Β B C Ανίχνευση aντισωμάτω ν B C παιδιά Β ενήλικες C ενήλικες hmpv Α B B A C Rhino - - A -

43 ιαγνωστική προσέγγιση Influenza-RSV Ανοσοεπαρκείς (παιδιά και ενήλικες) EIA(Αg) EIA(-) σε περίοδο επιδημίας ή EIA(+) εκτός επιδημίας Επιβεβαίωση με DFA,IFA DFA,IFA (+) ή(-) Μοριακές τεχνικές κατά περίπτωση

44 ιάγνωση Ειδικές περιπτώσεις Ανοσοκαταστολή Χημειοθεραπεία Μεταμόσχευση Χρόνια πνευμονοπάθεια HIV Μικτή λοίμωξη Έλεγχος επίσης και για CMV, HSV enterovirus, rhinovirus Παιδιά με βαρειά νόσο Αποκλεισμός της μικτής λοίμωξης Έλεγχος για hmpv, Adeno Υποψία για Αdeno εν αρκεί η ανίχνευση Ag

45 Ευχαριστώ