Σύγχρονη διαγνωστική προσέγγιση των ιώσεων

Transcript

1 Σύγχρονη διαγνωστική προσέγγιση των ιώσεων Μ. ΓΙΑΝΝΑΚΗ 10 η Ημερίδα Κλινικής Μικροβιολογίας 23/1/2010

2 Αξιολόγηση για την επιλογή της διαγνωστικής τεχνικής Ευαισθησία Ειδικότητα Θετική και Αρνητική Προγνωστική Αξία Επαναληψιμότητα Ταχύτητα - χρόνος εκτέλεσης Δυνατότητα εκτέλεσης μεμονωμένων εξετάσεων Κόστος

3 Ευαισθησία (sensitivity) % Ποσοστόατόμωνμετηνόσοπουβρίσκονται θετικοί με τη συγκεκριμένη δοκιμή Αριθμός θετικών απαντήσεων σε 100 ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο Ευαισθησία= ψευδώςαρνητικά

4 Ειδικότητα (specificity) % Ποσοστό ατόμων χωρίς τη νόσο, που βρίσκονται αρνητικά με την συγκεκριμένη δοκιμή Αριθμός αρνητικών απαντήσεων σε 100 μη πάσχοντες Ειδικότητα = ψευδώςθετικάαποτελέσματα

5 Cutoff = όριο αρνητικού - θετικού αποτελέσματος Κατά την ανάπτυξη μιας τεχνικής Cutoff Ευαισθησία Ειδικότητα Cutoff = Ευαισθησία Ειδικότητα Πρέπει να προσδιορίζεται για κάθε πληθυσμό

6 Προγνωστική αξία (Predictive value) Θετική Η πιθανότητα να έχει τη νόσο ασθενής με θετικό αποτέλεσμα δοκιμής ή η πιθανότητα να είναι αληθινό το θετικό αποτέλεσμα Αρνητική Η πιθανότητα να μη νοσεί άτομο με αρνητικό αποτέλεσμα δοκιμής ή η πιθανότητα να είναι αληθινό το αρνητικό αποτέλεσμα

7 Υπολογισμός των παραμέτρων αξιολόγησης μιας δοκιμής Eυαισθησία (sensitivity) Eιδικότητα (specificity) Θετική Προγνωστική Αξία (Positive Predictive Value) Aρνητική Προγνωστική Αξία (NegativePredictive Value) ΤP TP + FN TΝ TN+FP TP TP+FP ΤΝ ΤΝ + FN X 100% X 100% X 100% X 100% TP = True Positive Αληθώς Θετικό Αποτέλεσμα (Ο εξεταζόμενος πάσχει από το νόσημα) FP = False Positive Ψευδώς Θετικό Αποτέλεσμα Οεξεταζόμενοςδεν πάσχει απότονόσημα) TΝ = True Negative Αληθώς Αρνητικό Αποτέλεσμα (Ο εξεταζόμενοςδεν πάσχει από το νόσημα) FN = False Negative Ψευδώς Αρνητικό Αποτέλεσμα Οεξεταζόμενοςπάσχει απότονόσημα)

8 Κατάργηση έννοιας «χρυσό πρότυπο» Gold standard Χρησιμοποίηση όρων Αληθώς / Ψευδώς, Θετικό / Αρνητικό αποτέλεσμα Οι όροι αυτοί αναφέρονται σε πάσχοντα ή όχι από το νόσημα άτομα σύμφωνα με κλινικά και λοιπά εργαστηριακά κριτήρια

9 Ασθενείς πάσχοντες από λοιμώδη μονοπυρήνωση Κλινικές εκδηλώσεις Γενική αίματος: Βιοχημικός έλεγχος Λευκά αιμοσφαίρια Άτυπα λεμφοκύτταρα Τρανσαμινάσες Υπερηχογράφημα κοιλίας Ευρήματα της υπό εκτίμηση εξέτασης

10 Στην αποδοχή του αποτελέσματος υπεισέρχονται και στατιστικά στοιχεία όπως η συχνότητα του νοσήματος στον πληθυσμό που ανήκει ο εξεταζόμενος ασθενής Παράδειγμα: Σχέση επιπολασμού και προγνωστικής αξίας της μεθόδου Επιπολασμός νόσου 10% Επιπολασμός νόσου 1% Ασθενής Υγιής Σύνολο Θετικό Αρνητικό Σύνολο Ασθενής Υγιής Σύνολο Θετικό Αρνητικό Σύνολο Ευαισθησία 95 Ειδικότητα 95 Θετική Προγνωστική αξία 68 Ευαισθησία 91 Ειδικότητα 95 Θετική Προγνωστική αξία 16 Αρνητική Προγνωστική αξία 99 Αρνητική Προγνωστική αξία 99.5

11 Επαναληψιμότητα Ίδια μέτρηση (intra-assay) Διαφορετικές μετρήσεις (inter-assay) Συντελεστής μεταβλητότητας - CV (Coefficient of Variation) %

12 Εργαστηριακός έλεγχος ιογενών λοιμώξεων Ανίχνευση του ιού: - Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο -Kυτταροκαλλιέργεια -Aντιγόνο - Γονιδίωμα Προσδιορισμός αντισωμάτων Τυποποίηση ιών Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιικά φάρμακα Μέθοδοι γονιδιωμικής και πρωτεωμικής

13 Καλλιέργεια ιών (1) Τα δείγματα ενοφθαλμίζονται στα κυτταρικά υποστρώματα και επωάζονται Οι ιοί πολλαπλασιάζονται Η ανίχνευσή των ιών βασίζεται στην κυτταροπαθογόνο επίδρασή τους (CPE) στα κύτταρα που παρατηρείται μετά από αρκετές ημέρες

14 Καλλιέργεια ιών (2) Ανίχνευση παρουσίας ιού στα κύτταρα αντί CPE Ανοσοφθορισμός (shell vial assay) Αιμοσυγκόλληση Μοριακή μέθοδος Γενετικά τροποποιημένες κυτταρικές σειρές (Vero Slam, MDCK SIAT)

15 Καλλιέργεια ιών (3) Η κυτταροκαλλιέργεια δεν εφαρμόζεται στα διαγνωστικά εργαστήρια, μόνο στα κέντρα αναφοράς για: Ανίχνευση Τυποποίηση Έλεγχο ευαισθησίας στα αντιϊικά φάρμακα Παρασκευή εμβολίων

16 Ανοσολογικές μέθοδοι προσδιορισμού αντισωμάτων Σύνδεση συμπληρώματος Συγκολλητιναντιδράσεις (αναστολή αιμοσυγκολλήσεως) Εξουδετερωτικά αντισώματα Ανοσοφθορισμός Ραδιοανοσολογικές Ανοσοενζυμικές Ανοσοαποτύπωση (WB) Ταχείες δοκιμές - ανοσοχρωματογραφία

17 Συνήθης αντισωματική απάντηση σε λοίμωξη

18 Ανοσολογικές τεχνικές σήμανσης Γενική αρχή αναζήτησης αντισωμάτων Αντιγόνο + ορός (Αντίσωμα;;;)

19 Ανοσολογικές τεχνικές σήμανσης Γενική αρχή αναζήτησης αντισωμάτων Αντιγόνο + ορός (Αντίσωμα;;;) + Αντι-αντίσωμα συνεζευγμένο (conjugate)

20 Ανοσολογικές τεχνικές σήμανσης Γενική αρχή αναζήτησης αντισωμάτων Αντιγόνο + ορός (Αντίσωμα;;;) + Αντι-αντίσωμα συνεζευγμένο (conjugate) F* Mικροσκόπηση (ανοσοφθορισμός)

21 Ανοσολογικές τεχνικές σήμανσης Γενική αρχή αναζήτησης αντισωμάτων Αντιγόνο + ορός (Αντίσωμα;;;) + Αντι-αντίσωμα συνεζευγμένο (conjugate) F* R* Mικροσκόπηση (ανοσοφθορισμός) Αριθμός κρούσεων (ραδιοανοσολογικές τεχνικές)

22 Ανοσολογικές τεχνικές σήμανσης Γενική αρχή αναζήτησης αντισωμάτων Αντιγόνο + ορός (Αντίσωμα;;;) + Αντι-αντίσωμα συνεζευγμένο (conjugate) F* R* Ένζυμο Mικροσκόπηση (ανοσοφθορισμός) Αριθμός κρούσεων (ραδιοανοσολογικές τεχνικές) Υπόστρωμα + χρωμογόνο Παραγωγή χρώματος (Ανοσοενζυμικές τεχνικές)

23 Ανοσοφθορισμός (1) Φθορισμός: η εκπομπή μεγαλύτερου μήκους κύματος φωτός από μία ουσία, όταν ακτινοβολείται από φως μικρότερου κύματος Φθοριοχρώματα: ισοθειοκυανική φθορισκεΐνη FITC (πράσινο) Ισοθειοκυανική τετραμεθυλροδαμίνη TMRITC (κόκκινο) Φυκοερυθρίνη RE (πορτοκαλί )

24 Ανοσοφθορισμός (2) Έμμεσος: ανιχνεύονται αντισώματα IgG, IgM, IgA Αρχή: Αντιγόνο + ορός (αντίσωμα) + Conjugate (αντιαντίσωμα με φθορίζουσα χρωστική) φθορισμός Τεχνική: Αραίωση oρού Τοποθέτηση στην πλάκα Επώαση Πλύσιμο Προσθήκη Conjugate (IgG, IgM, IgA) Επώαση Πλύσιμο Μικροσκόπηση Απαραίτητη η χρήση (+) και (-) μάρτυρα Αυτοματοποιημένο σύστημα

25 Αντισώματα ιλαράς (IFA)

26 Αντισώματα έναντι αναπνευστικών ιών (IFA)

27 Αντισώματα HSV (IFA)

28 Ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA) Aνιχνεύονται: αντισώματα IgG, IgM, IgA Αρχή: Αντιγόνο (στο βύθισμα) + ορός (αντίσωμα;;;) + Conjugate (αντιαντίσωμα με ένζυμο) Παραγωγή Χρώματος (φωτομέτρηση) + υπόστωμα του ενζύμου με χρωμογόνο Mονάδες Απορρόφηση (ένταση χρώματος)

29 Ανοσοενζυμική Capture τεχνική Αντι IgM-αντίσωμα (στο βύθισμα) + Ορός (IgM ειδικό αντίσωμα;;;) + Αντι ΙgM - ένζυμο + Αg + Υπόστρωμα του ενζύμου με χρωμογόνο + Παραγωγή χρώματος (φωτομέτρηση) Πλεονέκτημα: Υψηλότερη ειδικότητα

30 Παραλλαγές ανοσοενζυμικών (Αυτοματοποιημένα συστήματα) Μικροσωματιδιακή Ανοσοενζυμική Τεχνική (Microparticle Enzyme Immunoassay - MEIA) Ανοσοενζυμική με τελική ανίχνευση φθορισμού (Enzyme-Linked Fluorescent Assay - ELFA) Μικροσωματιδιακή με χημειοφωταύγεια

31 Μέθοδοι ανοσοαποτύπωσης (1) (Western blotting, Dot blotting) Διαχωρισμός των αντιγονικών πρωτεϊνών αναλόγως του μοριακού βάρους με ηλεκτροφόρηση Ανοσοενζυμική ανίχνευση των αντισωμάτων ειδικότητα επιβεβαιωτικές δοκιμές κόστος

32 Μέθοδοι ανοσοαποτύπωσης (2) Tαινίες 1-5: πρόσφατη λοίμωξη 6-10: παλαιά λοίμωξη 11: θετικός μάρτυρας 12: αρνητικός μάρτυρας Αντισώματα έναντι VCA gp 125, EBNA p76, EA p54 και VCA p18 του EBV

33 Εξέταση αντισωμάτων με ταχεία τεχνική Ανοσοχρωματογραφία Ετερόφιλα αντισώματα στη λοιμώδη μονοπυρήνωση

34 Heterophile abs Αντισώματα έναντι διαφόρων αντιγόνων EBV

35 Μέθοδοι ανίχνευσης αντιγόνου Ανοσοενζυμική Άμεσος ανοσοφθορισμός Ταχείες τεχνικές

36 Ανοσοενζυμική για ανίχνευση αντιγόνου σε κλινικό δείγμα (Sandwich ELISA) Ειδικό αντίσωμα (στο βύθισμα) + Κλινικό δείγμα (αντιγόνο;;) + Conjugate (αντίσωμα με ένζυμο) + Υπόστρωμα του ενζύμου με χρωμογόνο Παραγωγή χρώματος (φωτομέτρηση) Μειονεκτήματα: Ακατάλληλη για λίγα δείγματα

37 Άμεσος Ανοσοφθορισμός (DFA) Αρχή: Κλινικό δείγμα + αντίσωμα συνδεδεμένο με φθοριόχρωμα (αντιδραστήριο) Φθορισμός (μικροσκόπιο) Τεχνική: Προετοιμασία δείγματος (ρινικό έκπλυμα, πτύελα, φαρυγγικό επίχρισμα, βρογχικό έκκριμα, περιφερικό αίμα, κολπικό, ουρηθρικό, ούρα) - φυγοκέντρηση - έκπλυση - ρευστοποίηση Υψηλή ειδικότητα (δυσκολία στην ανεύρεση του «ειδικού» αντιγονικού τμήματος για την παρασκευή του μονοκλωνικού αντισώματος)

38

39 Αναζήτηση αντιγόνου σε κλινικά δείγματα με IFA RSV Γρίπη Α και Β Αδενοϊοί Παραγρίπη 1,2,3 HSV VZV

40 Αντιγόνα HSV (τύπου 1) από δερματικές βλάβες (DFA)

41 Ταχείες ανοσολογικές τεχνικές (1) Πολύ χρήσιμη ομάδα εξετάσεων Αποτέλεσμα σε λίγα λεπτά Δεν απαιτείται ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός Ανίχνευση αντιγόνων, αντισωμάτων Τα αντιδραστήρια διατηρούνται εκτός ψυγείου Ειδικότητα Η ευαισθησία εξαρτάται από: - συγκέντρωση του αντιγόνου - χρόνο και - τρόπο λήψης του δείγματος

42 Ταχείες ανοσολογικές τεχνικές (2) 80 «παρά την κλίνην» (bedside) τεχνικές Καλύτερα αποτελέσματα όταν εφαρμόζονται από εργαστηριακούς ιατρούς Σε χώρες με οργανωμένα συστήματα περίθαλψης: κλινικοί ιατροί νοσηλευτές τεχνολόγοι Ακολουθούν προγράμματα συνεχούς εκπαίδευσης Συμμετέχουν σε Προγράμματα Ποιοτικού Ελέγχου

43 Ταχείες ανοσολογικές τεχνικές (3) - Ανοσοχρωματογραφία

44 Ταχείες ανοσολογικές τεχνικές (3) - Ανοσοχρωματογραφία

45 Ταχείες ανοσολογικές τεχνικές (3) - Ανοσοχρωματογραφία

46 Ταχείες ανοσολογικές τεχνικές (3) - Ανοσοχρωματογραφία

47 Αντιγόνο noro ιού σε κόπρανα

48 Ταυτόχρονη ανίχνευση δύο αντιγόνων: Rota και αδενο-ιών σε κόπρανα

49 Ταυτόχρονη ανίχνευση ιών γρίπης τύπων Α και Β και πανδημικού στελέχους Η1Ν1

50 Αντισώματα στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΕΝΥ) (1) Διάκριση: τοπικής παραγωγής παθητικής διέλευσης μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού Δείκτες ορολογικού ελέγχου ΕΝΥ Ειδικά αντισώματα ΕΝΥ / Ειδικά αντισώματα ορού Λευκωματίνη ΕΝΥ / Λευκωματίνη ορού Ειδικά αντισώματα ΕΝΥ / Ειδικά αντισώματα ορού IgG ENY / IgG ορού Ειδικά αντισώματα: IgG, IgM, IgA Δείκτης > 1 ένδειξη παραγωγής εντός Κ.Ν.Σ.

51 Αντισώματα στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΕΝΥ) (2) Θετικά για πρόσφατη λοίμωξη αντισώματα στον ορό Κλινική εικόνα λοίμωξης ΚΝΣ PCR ENY για τον συγκεκριμένο ιό

52 Λειτουργική συγγένεια των αντισωμάτων (αvidity) (1) Σύνδεση Ag-Ab επιτυγχάνεται με: δυνάμεις Coulomb Van der Waals δεσμοί υδρογόνου υδρόφοβοι δεσμοί Η ισχύς σύνδεσης (λειτουργική συγγένεια) αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου

53 Λειτουργική συγγένεια (avidity) (2) Ασθενής: Υψηλή: πρόσφατη λοίμωξη παλαιά λοίμωξη επαναλοίμωξη επανενεργοποίηση Μέθοδοι: «εκλούσεως» «προαραιώσεως των ορών» με: ουρία, διαιθυλαμίνη, γονανιδίνη, θειοκυανικό οξύ Avidity Index : τίτλος παρουσία ουσίας τίτλος απουσία ουσίας Χ 100%

54 Avidity index και χρόνος από την πρωτολοίμωξη Ημέρες

55 Μοριακές μέθοδοι -PCR Α ν = f x A 0 x 2 ν

56 Παραλλαγές PCR Real Time - Πραγματικού Χρόνου Multiplex - Πολλαπλή Nested - Διπλή ή εμφωλεάζουσα RT-PCR - Ανάστροφης Τρανσκριπτάσης Υβριδισμός

57 Εφαρμογές μοριακών μεθόδων στην Ιολογία Ανίχνευση ιού Μέτρηση ιικού φορτίου Ανίχνευση αντοχής στα αντιικά Τυποποίηση στελεχών Προσδιορισμός αλληλουχίας (sequencing)

58 Μέθοδοι γονιδιωμικής και πρωτεωμικής genomics - proteomics Διάγνωση Τυποποίηση

59 Ag IgM IgG

60 Έλεγχος ποιότητας ορολογικών δοκιμών Quality Control (1) A. Eσωτερικός Δείγματα ελέγχου που περιλαμβάνονται στη συσκευασία των αντιδραστηρίων ή παραγγέλλονται χωριστά Γνωστής περιεκτικότητας συνήθως: (-), (+) για τις ποιοτικές εύρος τιμών για τις ποσοτικές Ελέγχονται: αντιδραστήριο και διαδικασία

61 Έλεγχος ποιότητας ορολογικών δοκιμών Quality Control (2) Β. Eξωτερικός Τα δείγματα παρέχονται από οίκους του εξωτερικού Εξετάζονται όπως ακριβώς τα δείγματα του εργαστηρίου Αποστολή των αποτελεσμάτων και της κλινικής αξιολόγησης Απάντηση και σχόλια ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ! Συνεχίζουμε ή τροποποιούμε τη μέθοδο Μειονέκτημα: Υψηλό κόστος

62 Γνώση των ορίων της μεθόδου Σωστός σχεδιασμός Έλεγχος ποιότητας Επιθυμητό διαγνωστικό αποτέλεσμα Συνεργασία με τον κλινικό

63 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ