Άσκηση 4. Οροδιαγνωστική των λοιμώξεων & Μοριακές τεχνικές στη διάγνωση των λοιμώξεων. Α. Βελεγράκη

Transcript

1 Άσκηση 4 Οροδιαγνωστική των λοιμώξεων & Μοριακές τεχνικές στη διάγνωση των λοιμώξεων

2 Ανοσο-ορολογικές δοκιμασίες Ανιχνεύουν αντιγόνα (Ag) στον ορό, ή την ανταπόκριση του ανθρώπινου οργανισμού (αντισώματα-ab) σε λοιμογόνο παράγοντα μετά την επαφή του λοιμογόνου παράγοντα με το ανοσοποιητικό σύστημα. Η διαγνωστική τους σημασία στηρίζεται στον προσδιορισμό αύξησης του τίτλου αντισωμάτων (Ab) που υποδεικνύει την εξέλιξη μιας νόσου ή λοίμωξης. Σε μερικές μόνον περιπτώσεις η παρουσία αντισωμάτων σε ένα δείγμα ασθενούς καταδεικνύει νόσο ή λοίμωξη. Ιδιαίτερης σημασίας για επιδημιολογικές μελέτες και για την επιβεβαίωση της απόκρισης του πληθυσμού σε εμβολιασμούς. Χρήσιμα για την in vitro ανίχνευση μικροβιακών λοιμώξεων και για την αναγνώριση λοιμογόνων παραγόντων (π.χ. Salmonella, Shigella, Streptococcus, κ.λ.π.). Οι ανοσο-ορολογικές αντιδράσεις ανιχνεύουν in vitro είτε ένα ειδικό αντιγόνο ενός μικροοργανισμού, είτε ειδική ανοσιακή απόκριση του ξενιστή.

3 Τι ανιχνεύουν Αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος: ELISA Μη-ειδική αντίδραση (VDRL test) Αντίδραση μέσω του συμπληρώματος (complement fixation test) Πλεονεκτήματα Ταχεία ταυτοποίηση του λοιμογόνου παράγοντα Υψηλή ειδικότητα ως προς την ανίχνευση αντιγόνου Απλή στην εκτέλεση Δεν εκθέτει τον χρήστη σε κίνδυνο Έχει διαγνωστική αξία Χρησιμοποιείται ως επιδημιολογικό εργαλείο Επιβεβαιώνει και ΑΝΑΔΡΟΜΙΚΑ μια νόσο ή λοίμωξη

4 Ποιοτικός Έλεγχος Σήμερα υπάρχει μεγάλη ποικιλία ανοσο-ορολογικών δοκιμασιών. Κάθε εργαστήριο πρέπει να έχει αυστηρά καθορισμένους κανόνες πρότυπης διεξαγωγής αυτών των δοκιμασιών για να διασφαλίζεται η ποιότητα και συνεπώς η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που εκδίδει το εργαστήριο.

5 Ιδιότητες ανοσο-ορολογικών διαγνωστικών δοκιμασιών Η κλινική ειδικότητα μιας μεθόδου αξιολογείται ελέγχοντας αρνητικά δείγματα και δείγματα που περιέχουν ουσίες οι οποίες μπορούν να προκαλέσουν διασταυρούμενες αντιδράσεις και αυτές πρέπει να συμπεριλαμβάνονται στα δείγματα όταν αξιολογείται μια δοκιμασία. Η κλινική ευαισθησία μιας μεθόδου που αξιολογείται για διαγνωστική χρήση πρέπει να συγκρίνεται με αυτήν άλλων μεθόδων. Γενικά, σπάνια μια διαγνωστική δοκιμασία είναι το ίδιο ευαίσθητη στην κλινική πράξη όσο και κατά την αξιολόγησή της υπό συνθήκες ελεγχόμενες στο εργαστήριο. Η ακρίβεια μιας ποσοτικής ή ημιποσοτικής δοκιμασίας πρέπει να αξιολογείται υπό το φως της ακρίβειας που απαιτείται για την κλινική εφαρμογή της (κλινική αξία του αποτελέσματος)! Η ακρίβεια μιας δοκιμασίας επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, ένας όμως που συχνά παραβλέπεται στην εφαρμογή των ανοσο-ορολογικών δοκιμασιών είναι η επιλογή του εύρους των αραιώσεων ενός αντιδραστηρίου. Εάν κρατηθούν σταθερές όλες οι μεταβλητές πλην αυτής ενός αντιδραστηρίου, τότε η δοκιμασία γίνεται λιγότερο ακριβής όσο αυξάνεται το εύρος αυτών των αραιώσεων (πχ Χ2 ή Χ4).

6 Αλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τις ανοσο-ορολογικές δοκιμασίες Αιμόλυση του δείγματος αίματος Τα δείγματα με αιμόλυση είναι ακατάλληλα για ανοσο-οροδιαγνωστικές δοκιμασίες. αιμοληψία μέσω πολύ μικρής διαμέτρου σύριγγας απότομη αναρρόφηση αίματος στη σύριγγα κατά την αιμοληψία έντονη ανακίνηση του αίματος Φυγοκέντρηση του αίματος σε υψηλές στροφές πριν την πήξη κατάψυξη και απόψυξη του αίματος ακάθαρτοι σωλήνες

7 Αντίσωμα Το αντίσωμα ή ανοσοσφαιρίνη είναι πρωτεΐνη μεγάλου μεγέθους, σχήματος Y που παράγεται από το ανοσοποιητικό σύστημα για να αναγνωρίζει και να εξουδετερώνει ξένους προς το οργανισμό οργανισμούς όπως βακτήρια, ιούς, παράσιτα, μύκητες. Κάθε αντίσωμα αναγνωρίζει ένα ειδικό αντιγόνο. Κάθε κλειδαριά δέχεται ΜΟΝΟ ΕΝΑ ΚΛΕΙΔΙ, δηλαδή ένα αντιγόνο. Η παραγωγή αντισωμάτων είναι η κύρια αποστολή του συστήματος χυμικής ανοσίας. Οι ανοσοσφαιρίνες αίναι γλυκοπρωτεΐνες που λειτουργούν ως αντισώματα. Οι όροι αντίσωμα και ανοσοσφαιρίνη συχνά χρησιμοποιούνται εν αλλάξ. Ανευρίσκονται στο αίμα και στις εκκρίσεις, έχουν δομή σφαιρίνης και παράγονται από τα Β κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Τα Β- κύτταρα ενεργοποιούνται μετά την σύνδεση με κάποιο αντιγόνο και διαφοροποιούνται, ενώ σε μερικές περιπτώσεις για την διαδικασία αυτή απαιτείται και η συνεργασία των Τ- βοηθητικών κυττάρων.

8 Παραδείγματα εφαρμογών ανοσοορολογικών δοκιμασιών στη διαγνωστική Αυτοάνοσα νοσήματα Αιμολυτική αναιμία (Coombs test). Η δοκιμασία Coombs χρησιμοποιείται επίσης για τον έλεγχο αίματος προς μετάγγιση και για έλεγχο αντισωμάτων σε γυναίκες μετά τον τοκετό. Ανοσοθεραπεία Σχεδιασμός μονόκλωνων αντισωμάτων για τη θεραπεία νόσων (ρευματοειδής αρθρίτις, μερικοί τύποι καρκίνου) Ανοσοανεπάρκεια Απουσία αντισωμάτων (Χ-συνδεόμενη αγαμμασφαιριναιμία υπογαμμασφαιριναιμία). Ηπατικά νοσήματα Αύξηση διαφόρων τάξεων ανοσοσφαιρινών συχνά υποδηλώνει ηπατική(ες) βλάβη(ες) Πχ οι ολικές IgA είναι αυξημένες στην αλκοολική κίρρωση Οι ολικές IgM είναι αυξημένες στην ιογενή ηπατίτιδα και στην πρωτογενή κίρρωση ήπατος Οι ολικές IgG είναι αυξημένες στην ιογενή ηπατίτιδα και στην αυτοάνοση ηπατίτιδα

9 Φθορισμός (Άμεσος-Έμμεσος για την ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών) Ο φθορισμός είναι οπτικό φαινόμενο όπου γίνεται απορρόφηση φωτονίων και ακολουθεί έγερση άλλου φωτονίου εφόσον προσπέσει φως άλλου μήκους κύματος. Η διαφορά ενέργειας μεταξύ φωτονίων που απορροφούνται γίνεται αντιληπτή ως δόνηση ή θερμότητα. Ο φθορισμός εκπέμπεται στο ορατό φάσμα.

10 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

11 Διάγνωση με μεθόδους Μοριακής Βιολογίας

12 Ορισμός στόχου Άσκησης Μοριακών τεχνικών Πρέπει να ξέρει

13 Στόχος Μοριακής διαγνωστικής Έλεγχος όλων των ασθενών & για όλα τα πιθανά παθογόνα;

14 Ανακεφαλαίωση: Καλλιέργειες, ανίχνευση Αg/Ab & DNA λοιμογόνου παράγοντα & Ab

15 Ανακεφαλαίωση: Συμβατικός χαρακτηρισμός μικροοργανισμών Μορφολογία Βιοχημεία Ορολογικές μέθοδοι Δεν αρκούν για επιδημιολογική διερεύνηση! Συχνά αναγνωρίζουν τον μικροοργανισμό σε επίπεδο γένους

16

17 Νέες μέθοδοι αντικαθιστούν τις πιο παραδοσιακές Αυτές βασίζονται στην ανίχνευση μεταβολών σε επίπεδο: DNA ή RNA Ανιχνεύουν ποικιλομορφία Ανιχνεύουν τις πηγές και τον τρόπο διασποράς Συνδυάζουν αξιοπιστία και ταχύτητα Στην πλειοψηφία τους είναι προσιτές οικονομικά

18 Στοιχεία ελέγχου νοσοκομειακής λοίμωξης Επαγρύπνηση Έγκαιρη εργαστηριακή διάγνωση Γνώση της βιολογικής συμπεριφοράς του παθογόνου Έγκαιρη θεραπεία Πολύ αργά! Πολύ αργά!

19 Παράδειγμα: Ο ιός HPV-Διαγνωστικά προβλήματα Οικογένεια Papoviridae Μικροί DNA ιοί Γονιδίωμα 8Kb ds DNA > από 100 διαφορετικοί γονότυποι Καλλιέργειες στο κλινικό εργαστήριο μη πρακτικές Δεν υπάρχει αξιόπιστη ορολογική διάγνωση

20 Επιλογή εναρκτών* Στόχος ενίσχυσης Γονίδια L2 + L1 Τμήματα γονιδίων L2 + L1 Εναρκτές Προϊόντα ενίσχυσης Μικρό ενισχυθέν τμήμα του γονιδίου L2 Kleter et al. JCM 37,1999; 2508 * Καλούνται και εκκινητές

21 Η σύγκριση αλληλουχιών των προϊόντων ενίσχυσης Χαρακτηρίζει (ταυτοποιεί) και τυποποιεί τον ιό Kleter et al. JCM 37,1999; bp

22 PCR-LiPA (reverse hybridization Line Probe Assay)

23 Εργαστηριακά αποτελέσματα ρουτίνας PCR-LiPA για HPV ιχνηθέτης Kleter et al. JCM 37,1999; 2508

24 PCR-LiPA για... Mycobacterium marinum Mycobacterium ulcerans

25 P. herbarum P. foveata P. exigua P. foveata P. exigua Υλικό βιοψίας) Μικροσυστοιχία που περιλαμβάνει 148 ολιγονουκλεοτιδικούς τόπους - κηλίδες. Κάθε τόπος διευκρινίζει έναν διμορφισμό σημειακής μετάλλαξης αντικατάστασης εντός του αυτού ανθρωπίνου δείγματος. Βελεγράκη & Καμπούρης, Αρχ. Ελλ. Ιατρικής 2003, 20,

26 Πολυπλεκτική PCR πραγματικού χρόνου για τρία είδη παθογόνου μικροοργανισμού σε ολικό αίμα ασθενούς Αρνητικός μάρτυρας β-σφαιρίνη: εσωτερικός μάρτυρας

27 Μετά την ενίσχυσή του από το κλινικό υλικό, το προϊόν της PCR αναλύεται για να προσδιοριστούν οι αλληλουχίες ώστε να καταστεί εφικτή η σύγκριση των αλληλουχιών σε μοριακές βάσεις δεδομένων και να επιτευχθεί η αναγνώριση του παθογόνου μικροοργανισμού

28 (ct c ή t) AY (c t) (t c) AY AY560100

29 Ευθυγράμμιση (αντιστοίχηση) αλληλουχιών μέσω ειδικών λογισμικών Μετά τη σύγκριση των ευθυγραμμισμένων αλληλουχιών με άλλες που υπάρχουν σε μοριακές βάσεις δεδομένων επιτυγχάνεται η αναγνώριση του παθογόνου μικροοργανισμού.

30 FISH (Fluorescence in situ hybridization) Yeast Traffic Light PNA FISH Escherichia coli (πράσινος φθορισμός), Pseudomonas aeruginosa (κόκκινος φθορισμός), Klebsiella pneumoniae (κίτρινος φθορισμός).

31 Τι πρέπει να τηρείται όταν χρησιμοποιείται PCR για διαγνωστικούς σκοπούς Κατάλληλοι τρόποι δειγματοληψίας κλινικού υλικού Επιλογή κατάλληλου δοκιμίου για την εκχύλιση DNA/RΝΑ (π.χ. για ιστό ή βιολογικά υγρά) 1 h κλιβανισμός σε αυτόκαυστο των αναλωσίμων προς χρήση για PCR Έλεγχος των επιμολύνσεων σε όλα τα στάδια (δειγματοληψία, χειρισμός δείγματος, κ.λ.π Πολλαπλοί θετικοί & αρνητικοί μάρτυρες Εσωτερικός μάρτυρας Μειονεκτήματα: - Ο κίνδυνος επιμολύνσεων!!! - Υψηλό κόστος για ποσοτικοποίηση - Διαφοροποίηση αποικισμού / λοίμωξης όχι πάντα εφικτή