ΕΓΧΥΜΑΤΑ, ΑΦΕΨΗΜΑΤΑ & ΒΑΜΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΤΟΥ LIGUSTRUM JAPONICUM

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΠΕΡΙΦΑΝΤΣΗ Χηµικός Μηχανικός, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια του ΠΜΣ του τµήµατος Χηµείας µε έµφαση στη Χηµεία και Τεχνολογία Τροφίµων ιπλωµατική εργασία µε τίτλο: ΕΓΧΥΜΑΤΑ, ΑΦΕΨΗΜΑΤΑ & ΒΑΜΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΤΟΥ LIGUSTRUM JAPONICUM ΜΙΑ ΠΡΩΤΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΥΝΑΜΙΚΟΥ ΤΟΥΣ Υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας κ. Μαρίας Ζ. Τσιµίδου Θεσσαλονίκη, 2009

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα µεταπτυχιακή διπλωµατική εργασία πραγµατοποιήθηκε κατά τη διάρκεια του πανεπιστηµιακού έτους στο εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας κ. Μαρίας Ζ. Τσιµίδου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτριά µου κ. Μ. Τσιµίδου για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε καθώς και για τη συνεχή καθοδήγηση και τις πολύτιµες συµβουλές της. Η υπόδειξη του θέµατος µου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ µε τη µελέτη φυσικών προϊόντων ικανοποιώντας έτσι την επιθυµία µου να συµµετάσχω σε έρευνα από την οποία θα αποκόµιζα γνώσεις άµεσα εφαρµόσιµες στην καθηµερινή ζωή και την ευχαριστώ πολύ γι αυτό. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους µου τους καθηγητές για τις γνώσεις που µου µετέδωσαν στα δύο χρόνια των µεταπτυχιακών σπουδών µου και ιδιαίτερα τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Γ. Μπλέκα και τη λέκτορα κ. Ε. Χατζηδηµητρίου που µε τις εύστοχες υποδείξεις τους βοήθησαν στην ολοκλήρωση της συγγραφής της εργασίας µου. Θα ήταν µεγάλη παράλειψη να µην ευχαριστήσω τη διδάκτορα Βίκυ Παπώτη και τον υπό διορισµό λέκτορα Νίκο Νενάδη για την καλή τους διάθεση και για την σηµαντική βοήθεια που µου προσέφεραν κατά τη διεξαγωγή των πειραµάτων. Ακόµη, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οµάδα που ασχολήθηκε µε τη συλλογή και προκατεργασία του φυτικού υλικού που χρησιµοποίησα, καθώς και τη λέκτορα Φανή Μαντζουρίδου και τη διδάκτορα Στέλλα Ορδούδη για τη διατήρηση του όµορφου κλίµατος στο εργαστήριο. Ιδιαίτερα ευχαριστώ και τη συµφοιτήτρια και φίλη µου Ελένη Ναζίρη, η οποία εκτός από την ηθική της συµπαράσταση συνέβαλε και στον εγκλιµατισµό µου στο Τµήµα Χηµείας. Τελειώνοντας, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τους γονείς µου Θωµαή και Γιώργο που στηρίζουν πάντα και µε όποιον τρόπο µπορούν της επιλογές µου και τον σύζυγό µου Παναγιώτη για τη µεγάλη του υποµονή και κατανόηση. Ελευθερία Περιφάντση, Χηµικός Μηχανικός

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η σύνδεση κατανάλωσης τροφίµων-ανθρώπινης υγείας οδήγησε τη βιοµηχανία τροφίµων στην ανάπτυξη νέων προϊόντων που περιέχουν συστατικά µε πλήρως αποδεδειγµένες -αλλά και µη- βιολειτουργικές ιδιότητες. Οι φυσικοί παρεµποδιστές οξείδωσης αποτελούν µία από τις σηµαντικότερες κατηγορίες βιοδραστικών ενώσεων επειδή θεωρείται πως δρουν αποτελεσµατικά στην πρόληψη του κινδύνου εµφάνισης ασθενειών και στην αντιµετώπιση δυσµενών καταστάσεων του οργανισµού που σχετίζονται µε τη δράση ελευθέρων ριζών. Στο πλαίσιο της καθηµερινής πρόσληψης φυσικών αντιοξειδωτικών συστατικών µέσω οικιακών παρασκευασµάτων όπως τα εγχύµατα, αφεψήµατα και βάµµατα, διεξάγονται τα τελευταία χρόνια έρευνες προκειµένου να διαπιστωθεί η αντιοξειδωτική δράση διαφόρων φυτών, η χηµική εξέταση των οποίων αποκαλύπτει την παρουσία σε αυτά φυσικών παρεµποδιστών οξείδωσης, όπως είναι οι φαινολικές ενώσεις. Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο της αναζήτησης πιθανών εναλλακτικών πηγών ελαιοευρωπαΐνης και άλλων βιοδραστικών φαινολικών ενώσεων σε φυτά της οικογένειας Oleaceae πέραν του ελαιόδενδρου. Το φυτό που µελετήθηκε ήταν το Ligustrum japonicum, γνωστό καλλωπιστικό φυτό µε φύλλα διαθέσιµα όλο το χρόνο. Πραγµατοποιήθηκε δειγµατοληψία ώριµων φύλλων και καρπών του φυτού από τέσσερις διαφορετικές περιοχές της Θεσσαλονίκης και σε χρονικές περιόδους που αντιστοιχούν σε διάφορα στάδια ανάπτυξής του προκειµένου να παρουσιαστούν ορισµένα πρώτα στοιχεία εκτίµησης της σύστασής του σε φαινολικά συστατικά και της αντιοξειδωτικής του δράσης σε επιλεγµένα συστήµατα. Τα αποτελέσµατα συζητώνται συγκριτικά µε εκείνα που βρέθηκαν για αντίστοιχα εκχυλίσµατα φύλλων ελιάς (Olea europaea L.). Οι πρώτες εκτιµήσεις του αντιοξειδωτικού περιεχοµένου των εκχυλισµάτων του λιγούστρου και της δράσης του έδειξαν πως το φυτικό υλικό που µελετήθηκε περιέχει φαινολικά συστατικά σε µικρότερα όµως επίπεδα από αυτά που εµφανίζονται στα φύλλα της ελιάς όταν τα αποτελέσµατα εκφράζονται επί ξηρού εκχυλίσµατος. Γενικά, το φυτό δεν φαίνεται να αποτελεί πλούσια σε ελαιοευρωπαΐνη πηγή, στα εκχυλίσµατά του όµως απαντούν άλλες βιοδραστικές ενώσεις (τυροσόλη, υδροξυτυροσόλη, βερµπασκοζίτης κ.ά.).

4 ABSTRACT The impact of food consumption to human health has led the food industry to the development of new products that contain constituents with fully prooved -or notbiofunctional properties. Natural antioxidants are one of the major categories of bioactive compounds since it is considered that they are effective in preventing the risk of disease due to the implication of reactive oxygen and nitrogen species. In concern of the daily intake of natural antioxidant ingredients via household preparations such as infusions, decoctions and tinctures, scientific investigation is in progress in order to determine the antioxidant activity of various plants, the chemical examination of which reveals the presence of natural inhibitors of oxidation, such as the phenolic compounds. This work aims at investigating alternative sources of oleuropein and other bioactive phenolic compounds in plants of Oleaceae family beyond the olive-tree. The plant studied was Ligustrum japonicum, a well known ornamental plant with leaves available throughout the year. Mature leaves and fruits of the plant from four different regions of Thessaloniki were sampled at periods corresponding to different stages of the phenological development. The plant material was examined for its phenolic content and composition as well as its antioxidant activity in selected systems. The results are discussed in comparison with those found for the respective olive leaf extracts. Initial estimates of the antioxidant content of the extracts of Ligustrum and its activity showed that the studied plant material contains phenolic constituents though in levels lower that those evidenced for olive leaf when the results are expressed on a dry extract basis. Generally the plant is not a rich source of oleuropein, but in its extracts answer other bioactive compounds (tyrosol, hydroxytyrosol, verbascoside etc.).

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΑΤΡΟΦΙΚΕΣ ΤΑΣΕΙΣ ΚΑΙ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΑΡΕΜΠΟ ΙΣΤΩΝ ΟΞΕΙ ΩΣΗΣ ΣΤΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ ΤΑΞΕΙΣ, ΣΧΕΣΕΙΣ ΟΜΗΣ- ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ (SAR) ΚΑΙ ΠΗΓΕΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ OLEACEAE ΩΣ ΦΥΣΙΚΗ ΠΗΓΗ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ Γενικά Olea europaea ΤΟ ΓΕΝΟΣ LIGUSTRUM Γενικά Το είδος Ligustrum japonicum ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Φυτικό υλικό Λιπαρές ύλες που χρησιµοποιήθηκαν ως υποστρώµατα στις δοκιµές αντιοξειδωτικής δράσης του φυτικού υλικού Πρότυπες ενώσεις Αντιδραστήρια ιαλύτες ΟΡΓΑΝΑ-ΣΥΣΚΕΥΕΣ-ΣΚΕΥΗ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ...38

6 3.5 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Παρασκευή εγχύµατος Παρασκευή αφεψήµατος Παρασκευή βάµµατος ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Φασµατοφωτοµετρική εκτίµηση του περιεχοµένου των φυτικών εκχυλισµάτων σε ολικές φαινόλες µε τη χρήση του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu Φθορισµοµετρική εκτίµηση του περιεχοµένου των φυτικών εκχυλισµάτων σε ολικές φαινόλες Χρωµατοµετρικός προσδιορισµός του περιεχοµένου των φυτικών εκχυλισµάτων σε ολικά φλαβονοειδή µε τη µέθοδο συµπλοκοποίησης φλαβονοειδών-αlcl ΟΚΙΜΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των φυτικών εκχυλισµάτων µε δοκιµή εκτίµησης της ικανότητας δέσµευσης της σταθερής ρίζας DPPH ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΣΤΑ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΑ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΣΤΟ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΥΝΑΜΙΚΟ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΞΗΡΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΟΥ ΤΡΟΠΟΥ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ ΤΩΝ ΒΙΟΕΝΕΡΓΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ...53

7 4.4 ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...82

8 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ 1.1: ΠΡΟΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΑΜΥΝΑ...4 ΠΙΝΑΚΑΣ 1.2: ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ ΠΛΟΥΣΙΕΣ ΠΗΓΕΣ ΣΕ ΜΗ- ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΑ...7 ΠΙΝΑΚΑΣ 1.3: ΚΥΡΙΕΣ ΤΑΞΕΙΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΠΟΥ ΑΠΑΝΤΟΥΝ ΣΕ ΦΥΤΑ..10 ΠΙΝΑΚΑΣ 1.4: ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΠΟΥ ΑΠΑΝΤΟΥΝ ΣΤΟΥΣ ΚΑΡΠΟΥΣ ΚΑΙ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ ΤΟΥ LIGUSTRUM JAPONICUM...29 ΠΙΝΑΚΑΣ 3.1: ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ...45 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.1: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ 1ΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ.47 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.2: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ 2ΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ.48 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.3: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ 3ΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ.48 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.4: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ 4ΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ.48 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.5: ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΝΕΡΟ ΚΑΡΠΩΝ LIGUSTRUM JAPONICUM...48 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.6: ΜΕΣΕΣ ΤΙΜΕΣ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ LIGUSTRUM JAPONICUM...49 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.7: ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΧΡΟΝΟΥ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΣΤΟ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΥΝΑΜΙΚΟ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ LIGUSTRUM JAPONICUM...49 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.8: ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΧΡΟΝΟΥ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΣΤΟ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΥΝΑΜΙΚΟ ΤΩΝ ΚΑΡΠΩΝ ΤΟΥ LIGUSTRUM JAPONICUM...50 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.9: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΥΝΑΜΙΚΟΥ ΦΥΛΛΩΝ ΛΙΓΟΥΣΤΡΟΥ, ΕΛΙΑΣ, ΣΙ ΕΡΙΤΗ ΚΑΙ ΡΙΓΑΝΗΣ...52 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.10: ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΟΚΙΜΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΚΑΙ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ...55 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.11: ΚΥΡΙΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ ΛΙΓΟΥΣΤΡΟΥ...64 ΠΙΝΑΚΑΣ 7.1: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΚΙΜΗΣ RANCIMAT ΓΙΑ ΙΑΦΟΡΑ ΕΙ Η ΣΙ ΕΡΙΤΗ...83 ΠΙΝΑΚΑΣ 7.2: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΚΙΜΗΣ RANCIMAT ΓΙΑ ΦΥΛΛΑ ΕΛΙΑΣ ΑΠΟ ΥΟ ΠΟΙΚΙΛΙΕΣ... 83

9 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΣΧΗΜΑ 1.1: ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΚΑΙ ΒΛΑΒΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ ΚΑΙ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΙΣ ΕΝΕΡΓΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ...6 ΣΧΗΜΑ 1.2: ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΦΑΙΝΟΞΥ- ΡΙΖΑΣ ΜΕΣΩ ΟΜΩΝ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ...13 ΣΧΗΜΑ 1.3: ΟΞΕΙ ΩΣΗ 1,4- ΙΦΑΙΝΟΛΗΣ ΠΡΟΣ ΚΙΝΟΝΗ ΚΑΙ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗ ΤΗΣ...14 ΣΧΗΜΑ 1.4: ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΟΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΙΑΦΟΡΩΝ ΤΑΞΕΩΝ ΑΠΛΩΝ ΦΑΙΝΟΛΩΝ ΠΟΥ ΒΟΗΘΟΥΝ ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΚΡΙΤΗΡΙΩΝ SAR...15 ΣΧΗΜΑ 1.5: ΑΝΤΙ ΡΑΣΕΙΣ ΠΟΛΥΜΕΡΙΣΜΟΥ ΠΟΥ Ο ΗΓΟΥΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗ Υ ΡΟΞΥ- ΟΜΑ ΩΝ...16 ΣΧΗΜΑ 1.6: ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΟΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΙΑΦΟΡΩΝ ΤΑΞΕΩΝ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙ ΩΝ ΠΟΥ ΒΟΗΘΟΥΝ ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΚΡΙΤΗΡΙΩΝ SAR...17 ΣΧΗΜΑ 1.7 : ΤΥΠΙΚΗ ΜΟΡΦΗ ΙΠΛΟΣΤΙΒΑ ΑΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΜΟΡΙΑ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙ ΙΩΝ...20 ΣΧΗΜΑ 1.8: ΟΜΕΣ ΤΗΣ ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ Υ ΡΟΞΥΤΥΡΟΣΟΛΗΣ...30 ΣΧΗΜΑ 4.1: ΕΠΙΤΑΧΥΝΟΜΕΝΗ ΟΞΕΙ ΩΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΓΧΥΜΑΤΩΝ ΣΧΗΜΑ 4.2:ΕΠΙΤΑΧΥΝΟΜΕΝΗ ΟΞΕΙ ΩΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΦΕΨΗΜΑΤΩΝ ΣΧΗΜΑ 4.3: ΕΠΙΤΑΧΥΝΟΜΕΝΗ ΟΞΕΙ ΩΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΒΑΜΜΑΤΩΝ...59 ΣΧΗΜΑ 4.4: ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΕΓΧΥΜΑΤΩΝ ΛΙΓΟΥΣΤΡΟΥ ΚΑΙ ΕΛΙΑΣ...60 ΣΧΗΜΑ 4.5: ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΦΕΨΗΜΑΤΩΝ ΛΙΓΟΥΣΤΡΟΥ ΚΑΙ ΕΛΙΑΣ...61 ΣΧΗΜΑ 4.6: ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΒΑΜΜΑΤΩΝ ΛΙΓΟΥΣΤΡΟΥ ΚΑΙ ΕΛΙΑΣ...62

10 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ ΕΙΚΟΝΑ 1: LIGUSTRUM VULGARE...23 ΕΙΚΟΝΑ 2: ΦΥΛΛΟ L. JAPONICUM...28 ΕΙΚΟΝΑ 3: ΆΝΘΗ L. JAPONICUM...28 ΕΙΚΟΝΑ 4: ΚΑΡΠΟΙ L. JAPONICUM...28 ΕΙΚΟΝΑ 5: ΧΑΡΤΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ...34 EΙΚΟΝΑ 6: ΣΥΣΚΕΥΗ RANCIMAT...42 ΕΙΚΟΝΑ 7: ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΑ ΦΥΛΛΩΝ ΛΙΓΟΥΣΤΡΟΥ ΚΑΙ ΕΛΙΑΣ...54

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

12 1.1 ΙΑΤΡΟΦΙΚΕΣ ΤΑΣΕΙΣ ΚΑΙ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΑΡΕΜΠΟ ΙΣΤΩΝ ΟΞΕΙ ΩΣΗΣ ΣΤΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Οι απαιτήσεις του καταναλωτή σε ότι αφορά τα τρόφιµα έχουν παρουσιάσει ιστορικά σηµαντική εξέλιξη. Σήµερα τα τρόφιµα έχουν πλέον αναγνωριστεί ως εφοδιασµός του οργανισµού µε κάτι περισσότερο από χηµική ενέργεια καθώς συµβάλλουν στη µείωση του κινδύνου εµφάνισης και εξάπλωσης χρόνιων ασθενειών που σχετίζονται µε το σύγχρονο τρόπο ζωής όπως ο διαβήτης, οι καρδιακές παθήσεις, η αθηροσκλήρωση, η υπέρταση, η οστεοπόρωση, η αρθρίτιδα και ο καρκίνος (Arai, 2005). Η σηµερινή τάση αναθεώρησης της λειτουργίας των τροφίµων και των βασικών τους συστατικών οδήγησε τις διατροφικές απαιτήσεις του καταναλωτή στο τελευταίο στάδιο της εξέλιξής τους, δηλαδή στην αναζήτηση τροφίµων που συµβάλλουν θετικά στην υγεία και ενισχύουν την καλή λειτουργία του οργανισµού πέραν των ήδη γνωστών διατροφικών πλεονεκτηµάτων τους. Σε αυτό το πλαίσιο γεννήθηκε η έννοια των «λειτουργικών τροφίµων» στα τέλη της δεκαετίας του `80 στην Ιαπωνία που γρήγορα εξαπλώθηκε παγκοσµίως (Arai, 2005). Οι στρατηγικές που ακολουθούν οι επιστήµονες του τοµέα των τροφίµων και διατροφής για το σχεδιασµό λειτουργικών τροφίµων είναι είτε η τροποποίηση του ενεργειακού περιεχοµένου των συµβατικών τροφίµων (π.χ. µείωση της περιεκτικότητάς τους σε τριγλυκερίδια και σάκχαρα) είτε η αναζήτηση νέων πηγών φυσικών συστατικών µε φυσιολογικές ή µεταβολικές λειτουργίες που επηρεάζουν θετικά την υγεία (Schneeman, 2000). Καθώς όµως η εµφάνιση των χρόνιων ασθενειών σχετίζεται και µε άλλους παράγοντες πέραν των διατροφικών συνηθειών όπως η ρύπανση του περιβάλλοντος, το στρες και η κληρονοµικότητα, η Schneeman (2000) πρότεινε την αντιµετώπιση των λειτουργικών τροφίµων όχι ως µέσα για τη βελτιστοποίηση της υγείας, την προώθηση της ευεξίας και την πρόληψη των ασθενειών, αλλά ως τρόφιµα που περιέχουν συστατικά τα οποία µέσω των φυσιολογικών τους λειτουργιών στον οργανισµό µειώνουν τον κίνδυνο εµφάνισης της ασθένειας. Η κατανάλωσή τους δηλαδή δεν συνίσταται για θεραπευτικούς σκοπούς (Ορδούδη, 2007). Τα ευεργετικά για την υγεία συστατικά των λειτουργικών τροφίµων είναι γνωστά µε τους όρους λειτουργικά συστατικά (functional ingredients), nutraceuticals 2

13 (από τις λέξεις nutrients και pharmaceuticals) και βιοδραστικές ενώσεις (bioactive compounds) και απαντούν σε φυτικούς ή και σε ζωικούς οργανισµούς σε µικρές συγκεντρώσεις. Τα φυτικής προέλευσης συστατικά ονοµάζονται συχνά και φυτοχηµικά (phytochemicals). Μεταξύ των ευεργετικών ιδιοτήτων συγκαταλέγεται η ικανότητα να δρουν ως αντιοξειδωτικά, να ενεργοποιούν ένζυµα που αποτοξινώνουν το ήπαρ, να εµποδίζουν τη δράση βακτηρίων ή ενζύµων, να παρεµποδίζουν την απορρόφηση της χοληστερόλης, να επιβραδύνουν τη συσσωµάτωση των αιµοπεταλίων, να καταστρέφουν επιβλαβή για το γαστρεντερικό σύστηµα βακτήρια, να ρυθµίζουν δηλαδή το σύνολο των βιοχηµικών και φυσιολογικών διεργασιών που αφορούν την ανάπτυξη και διατήρηση της καλής λειτουργίας του ανθρώπινου οργανισµού και την αποκατάσταση ανωµαλιών που τυχόν προκαλούνται σε αυτόν (Ορδούδη, 2007, Camire, 2000). Οι βιοδραστικές ενώσεις µπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε θρεπτικούς (nutrients) και µη-θρεπτικούς (non-nutrients) παράγοντες. Τα θρεπτικά συστατικά είναι ενώσεις βασικές για τη ζωή, µε την έννοια ότι η απουσία τους ή η ελλιπής κατανάλωσή τους µέσω της διατροφής προκαλεί ασθένειες όπως η αβιταµίνωση. Σε αυτές τις ουσίες περιλαµβάνονται τα βασικά αµινοξέα, αρκετοί υδατάνθρακες, βασικά ω-3 και ω-6 λιπαρά οξέα, βιταµίνες και ιχνοστοιχεία και αριθµούνται περίπου 52 χηµικές ενώσεις. Τα µη- θρεπτικά λειτουργικά στοιχεία συµπληρώνουν τα θρεπτικά και αριθµούν τουλάχιστον ορισµένες χιλιάδες χηµικών ενώσεων. Η πρόληψη και παρεµπόδιση της εξάπλωσης χρόνιων ασθενειών απαιτούν µια αλληλεπίδραση των δύο κατηγοριών ενώσεων. Τέτοιες συνέργειες είναι παραδείγµατα στην παρεµπόδιση των επιπτώσεων που έχουν ανεπιθύµητες οξειδώσεις µεταβολικής και εξωγενούς προέλευσης, οι οποίες µειώνονται µέσω της συνέργειας των θρεπτικών λειτουργικών αντιοξειδωτικών όπως οι βιταµίνες C και Ε, ορισµένα καροτενοειδή, το σελήνιο και πιθανώς το φολικό οξύ µαζί µε τα µηθρεπτικά λειτουργικά αντιοξειδωτικά όπως το λυκοπένιο, η λουτεΐνη και η ζεαξανθίνη. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές έχουν ως αποτέλεσµα τη βελτιστοποίηση της αντιοξειδωτικής άµυνας των ιστών (Camire, 2000, Lachance, 1998). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, στον ανθρώπινο οργανισµό επικρατεί µια ισορροπία µεταξύ των παραγόντων που προκαλούν οξείδωση και των παραγόντων 3

14 που την παρεµποδίζουν (Πίνακας 1.1). Μια αύξηση στην παραγωγή των προοξειδωτικών παραγόντων ή µια ανεπάρκεια του αντιοξειδωτικού αµυντικού συστήµατος µπορεί να διακόψει αυτή την ισορροπία προς όφελος των πρώτων. Η κατάσταση αυτή στην οποία διαταράσσεται η προαναφερόµενη ισορροπία καλείται οξειδωτικό στρες και η σηµασία της πρόσληψης αντιοξειδωτικών µέσω της τροφής αναδεικνύεται σε αυτές τις περιπτώσεις (Camire, 2000, Langseth, 2000). Πίνακας 1.1: Προοξειδωτικοί παράγοντες και αντιοξειδωτική άµυνα Προοξειδωτικοί Αντιοξειδωτική άµυνα παράγοντες Φλεγµονές Κάπνισµα Άσκηση Ρυπαντές ατµόσφαιρας Ακτινοβολία ίαιτα υψηλή σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα Καρκινικά κύτταρα Βιταµίνη Ε Βιταµίνη C Β- καροτένιο Άλλα καροτενοειδή Γλουταθειόνη ισµουτάσες σουπεροξειδίου Καταλάση, υπεροξειδάσες γλουταθειόνης, σελήνιο, ουρικό οξύ, άλλα αντιοξειδωτικά προερχόµενα από τρόφιµα Πηγή: Langseth, 2000 Οι φυσικοί παρεµποδιστές οξείδωσης αποτελούν τη σηµαντικότερη κατηγορία βιοδραστικών ενώσεων επειδή θεωρείται πως δρουν αποτελεσµατικά στην πρόληψη του κινδύνου εµφάνισης ασθενειών και στην αντιµετώπιση δυσµενών καταστάσεων του οργανισµού που σχετίζονται µε τη δράση ελευθέρων ριζών. Οι τελευταίες είναι ασταθή συγκροτήµατα ατόµων που διαθέτουν ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική στιβάδα ενός ατόµου και προσβάλλουν ενώσεις προκειµένου να δηµιουργηθούν νέες σταθερές ενώσεις. Έτσι λαµβάνουν µέρος σε µια 4

15 σειρά αλυσιδωτών αντιδράσεων που προκαλούν βλάβες στον οργανισµό (Ορδούδη, 2007). Κατά τη διάρκεια του µεταβολισµού στο ανθρώπινο σώµα γεννώνται ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που µετατρέπονται σε ενεργά συστατικά ικανά να βλάψουν το DNA, τις πρωτεΐνες, τους υδατάνθρακες και τα λιπίδια. Η σειρά των αντιδράσεων που µπορούν να προκαλέσουν το σχηµατισµό επικίνδυνων ελευθέρων ριζών είναι: - Ο 2 + e O 2 (ρίζα σουπεροξειδίου) - 2O 2 + 2Η + Η 2 Ο 2 + Ο 2 Η 2 Ο 2 + 2GSH 2Η 2 Ο + GSSG ROOH + 2GSH ROH + GSSG +H 2 O - 2O 2 + Η 2 Ο 2 OH + Ο 2 + OH - Αρχικά σχηµατίζεται µια ρίζα σουπεροξειδίου η οποία ανάγεται από την αντίστοιχη δισµουτάση προς υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το τελευταίο µπορεί να αποµακρυνθεί µε την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης. Αυτοί όµως οι αµυντικοί µηχανισµοί του σώµατος δεν αρκούν, καθώς παρουσία ιόντων µετάλλου η ρίζα του σουπεροξειδίου και το υπεροξείδιο του υδρογόνου αντιδρούν προς σχηµατισµό ριζών υδροξυλίου. Οι ρίζες αυτές είναι εξαιρετικά ενεργές και αφαιρούν υδρογόνα από το πλησιέστερο διαθέσιµο µόριο λιπιδίου, πρωτεΐνης ή νουκλεϊνικού οξέος. Το αρχικό αυτό στάδιο εξελίσσεται σε µια αυτοκαταλυόµενη αλυσιδωτή αντίδραση που µπορεί να προκαλέσει βλάβη στο κύτταρο (Μπόσκου, 2004). Η ρίζα σουπεροξειδίου (Ο 2 -), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), η υδροξυλική ρίζα (ΟΗ ), οι υπεροξειδικές (ROO ) και αλκοξυ- (RO ) ρίζες, το µοριακό οξυγόνο στη διεγερµένη κατάσταση (singlet oxygen, O 2 ), η ρίζα ΝΟ και το υπεροξυνιτρώδες ανιόν (ΟΟΝΟ - ) χαρακτηρίζονται ως ενεργές µορφές οξυγόνου (ROS, Reactive Oxygen Species) (Μπόσκου, 2004) και θεωρούνται υπαίτιες για την εµφάνιση πληθώρας ασθενειών και βλαβών του οργανισµού, ορισµένες από τις οποίες παρουσιάζονται στο Σχήµα

16 Αρτηριοσκλήρωση Αρθρίτιδα Φλεγµονή Ισχαιµία ιαβήτης ROS Έµφραγµα Καρκίνος Κρυοπαγήµατα Μολύνσεις Νόσος Πάρκινσον Σχήµα 1.1: Ασθένειες και βλάβες που προκαλούνται στον οργανισµό και σχετίζονται µε τις ενεργές µορφές οξυγόνου (Shahidi, 1997) Τα κύτταρα παράγουν ελεύθερες ρίζες µέσω των φυσιολογικών τους λειτουργιών και εποµένως όλοι εκτίθενται ως ένα βαθµό σε αυτές. Υπάρχουν όµως και οµάδες που διατρέχουν µεγαλύτερο κίνδυνο καθώς εκτίθενται και σε επιπλέον εξωτερικές πηγές ελευθέρων ριζών, συµπεριλαµβανοµένου του καπνίσµατος, των ρυπαντών της ατµόσφαιρας, ορισµένων φαρµάκων και της υπεριώδους ακτινοβολίας (Camire, 2000). οµικά αµυντικά µέσα in vivo, όπως κυτταρικές µεµβράνες και χηλικοί παράγοντες προλαµβάνουν την επαφή µεταξύ των ελευθέρων ριζών και των ευπρόσβλητων µορίων. Οι πρωτεάσες διασπούν πρωτεϊνικά µόρια που έχουν υποστεί βλάβες από τις ελεύθερες ρίζες, επιτρέποντας την αντικατάσταση αυτών από νέες λειτουργικές πρωτεΐνες. Επίσης στον οργανισµό απαντούν ένζυµα, ο ρόλος των οποίων είναι να επιδιορθώνουν βλάβες που προκαλούνται στο DNA. Μια άλλη κατηγορία ενζύµων, τα λεγόµενα αντιοξειδωτικά ένζυµα (δισµουτάση σουπεροξειδίου, καταλάση και υπεροξειδάση γλουταθειόνης) αντιδρούν µε τις ελεύθερες ρίζες και τις απενεργοποιούν. Ορισµένα µικρά µόρια που συντίθενται in vivo, όπως η γλουταθειόνη και το ουρικό οξύ, βοηθούν επίσης στη σταθεροποίηση ελευθέρων ριζών (Camire, 2000). Εκτός από τα ενδογενή αµυντικά συστήµατα που αναφέρονται ανωτέρω, ορισµένα είδη µορίων που δε µπορούν να συντεθούν στον οργανισµό συνεισφέρουν 6

17 στο αµυντικό αντιοξειδωτικό σύστηµα και µπορούν να προσληφθούν µέσω της καθηµερινής διατροφής. Σε αυτά συµπεριλαµβάνονται οι απαραίτητες βιταµίνες Ε και C και µια οµάδα φυτικών χρωστικών, τα καροτενοειδή (ορισµένα από τα οποία είναι πρόδροµες ενώσεις της βιταµίνης Α). Επιπλέον, ορισµένα τρόφιµα περιλαµβάνουν και µη- θρεπτικά αντιοξειδωτικά, τα περισσότερα από τα οποία είναι φαινολικά ή πολυφαινολικά συστατικά, ουσίες χωρίς γνωστές διατροφικές λειτουργίες, οι οποίες όµως χαρακτηρίζονται ως σηµαντικές για την ανθρώπινη υγεία λόγω της αντιοξειδωτικής τους δράσης (Langseth, 2000). Στον Πίνακα 1.2 παρουσιάζονται ορισµένα τρόφιµα που περιέχουν µη- θρεπτικά αντιοξειδωτικά. Περισσότερα παραδείγµατα λειτουργικών τροφίµων που περιέχουν θρεπτικά και µη- θρεπτικά αντιοξειδωτικά µπορεί κανείς να αναζητήσει σε πηγές όπως Omaye and Zhang, 1998, Pennington, 2002, Kris-Etherton et al., 2002, Stone and Papas, 2003, Manach et al., 2004, Boskou, 2006, Webb, 2006 και συγκεντρωτικά στη διδακτορική διατριβή της Ορδούδη, Πίνακας 1.2: Παραδείγµατα τροφίµων που είναι πλούσιες πηγές σε µη- θρεπτικά αντιοξειδωτικά Προϊόν Αντιοξειδωτικά Σόγια Πράσινο τσάι, µαύρο τσάι Καφές Κόκκινο κρασί εντρολίβανο, φασκόµηλο και άλλα βότανα Εσπεριδοειδή και άλλα φρούτα Κρεµµύδια Ελιές Ισοφλαβόνες, φαινολικά οξέα Πολυφαινόλες, κατεχίνες Φαινολικοί εστέρες Φαινολικά οξέα Καρνοσινικό οξύ, ροσµαρινικό οξύ ιφλαβανοειδή, χαλκόνες Κερκετίνη, καιµπφερόλη Πολυφαινόλες Πηγή: Langseth,

18 Παρατηρώντας κανείς τον Πίνακα 1.2 εύκολα διαπιστώνει πως ορισµένα προϊόντα καταναλώνονται ως έχουν (φρούτα, κρεµµύδια, ελιές), ενώ τα πολύτιµα για την υγεία συστατικά από προϊόντα όπως τα βότανα παραλαµβάνονται µέσω εκχυλισµάτων τους. Η παρασκευή ροφηµάτων τσαγιού είναι η πιο διαδεδοµένη στον κόσµο και τα εκχυλίσµατα του φυτού Camellia sinensis, από το οποίο παρασκευάζεται το µαύρο τσάι, έχουν αποτελέσει αντικείµενο πληθώρας επιστηµονικών µελετών (Balentene, 1992). Ο σύγχρονος άνθρωπος µε τη βοήθεια της Τεχνολογίας Τροφίµων και Ποτών έχει πλέον τη δυνατότητα να καταναλώνει συσκευασµένους χυµούς φρούτων και λαχανικών και ροφήµατα εµπλουτισµένα σε λειτουργικά συστατικά. Επιπλέον αφεψήµατα, εγχύµατα και βάµµατα αποτελούν συχνά συστατικά της ανθρώπινης διατροφής. Πρόκειται για απλές, ταχείες και εφαρµόσιµες σε επίπεδο οικιακής παρασκευής τεχνικές παραλαβής βιοδραστικών ενώσεων από φυτικά υλικά. Για την παρασκευή αφεψηµάτων απαιτείται ταυτόχρονος βρασµός του νερού και του φυτικού υλικού, ενώ κατά την παρασκευή εγχυµάτων βραστό νερό αποχύνεται στο φυτικό υλικό και το µίγµα παραµένει σε ηρεµία για ορισµένο χρονικό διάστηµα. Τα βάµµατα διαφοροποιούνται από τις άλλες δύο τεχνικές επειδή το εκχύλισµα που προκύπτει είναι υδατοαιθανολικό. Για την παρασκευή των τελευταίων προστίθεται στο φυτικό υλικό µίγµα αιθανόλης:νερού σε διάφορες αναλογίες, εξαρτώµενες από τα προς εκχύλιση συστατικά (Ody, 1993). Στο πλαίσιο της ανάγκης για καθηµερινή πρόσληψη και µη- θρεπτικών φυσικών αντιοξειδωτικών συστατικών µέσω των οικιακών παρασκευασµάτων που προαναφέρθηκαν διεξάγονται τα τελευταία χρόνια επιστηµονικές έρευνες προκειµένου να διαπιστωθεί η αντιοξειδωτική δράση διαφόρων φυτών, η χηµική εξέταση της σύστασης των οποίων αποκαλύπτει την παρουσία φυσικών παρεµποδιστών οξείδωσης, όπως είναι οι φαινολικές ενώσεις. 8

19 1.2 ΤΑΞΕΙΣ, ΣΧΕΣΕΙΣ ΟΜΗΣ- ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ (SAR) ΚΑΙ ΠΗΓΕΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Η χρήση των φυσικών παρεµποδιστών οξείδωσης ή αλλιώς φυσικών αντιοξειδωτικών είχε ξεκινήσει πριν από το δεύτερο παγκόσµιο πόλεµο, διακόπηκε όµως µε την έλευση φθηνότερων συνθετικών ενώσεων (Pokorny, 2001) όπως ο προπυλ- (PG) και ο δωδεκυλεστέρας του γαλλικού οξέος (DG), η βουτυλιωµένη υδροξυανισόλη (ΒΗΑ), το βουτυλιωµένο υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ), διάφοροι εστέρες του ασκορβικού οξέος µε λιπαρά οξέα κ.ά. Τις τελευταίες δεκαετίες όµως το ενδιαφέρον για τα φυσικώς απαντώµενα αντιοξειδωτικά επανήλθε στο προσκήνιο εξαιτίας των πιθανών αρνητικών επιδράσεων των συνθετικών αντιοξειδωτικών στην υγεία των καταναλωτών (Frankel, 1988) και της σύγχρονης τάσης του αγοραστικού κοινού να στρέφεται προς την κατανάλωση φυσικών προϊόντων. Οι φυσικοί παρεµποδιστές οξείδωσης περιλαµβάνουν χηλικές ενώσεις, αντιοξειδωτικές ενώσεις, βιταµίνες, ένζυµα, καροτενοειδή, καρνοσίνη, φαινολικά και πολυφαινολικά συστατικά (Shahidi, 1997). Οι φαινολικές ενώσεις αποτελούν τη σπουδαιότερη κατηγορία φυσικών παρεµποδιστών οξείδωσης που απαντούν στα τρόφιµα. Εντοπίζονται σε όλα τα τµήµατα των φυτών συζευγµένες µέσω εστερικών, αιθερικών ή ακεταλικών δεσµών κυρίως µε σάκχαρα και οργανικά οξέα, καθώς µε τον τρόπο αυτό καθίστανται περισσότερο υδατοδιαλυτές και συγκρατούνται καλύτερα σε ενδοκυτταρικά σωµατίδια. Σε ελεύθερη µορφή εµφανίζεται µόνο ένα πολύ µικρό ποσοστό τους, πιθανώς λόγω µιας αυξηµένης τοξικότητας που αποδίδεται σε δυνατότητα ιονισµού των φαινολικών υδροξυ- οµάδων και µεταφοράς πρωτονίων (Ορδούδη, 2007). Ως προς τη δοµή τους, οι φαινολικές ενώσεις (ΑΗ) αποτελούνται από έναν τουλάχιστον αρωµατικό δακτύλιο που φέρει έναν ή περισσότερους υδροξυυποκαταστάτες. Οι κύριες τάξεις των ενώσεων αυτών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.3. Οι φαινολικές ενώσεις βιοσυντίθενται µέσω δύο κύριων µεταβολικών οδών, αυτή του σικιµικού και αυτή του οξικού οξέος. Η πρώτη οδός οδηγεί απευθείας στο σχηµατισµό φαινυλοπροπανοειδών όπως υδροξυ- κινναµωµικών οξέων και κουµαρινών, ενώ από τη δεύτερη προκύπτουν απλές φαινόλες και ορισµένες κινόνες. Με το συνδυασµό των δύο βιοσυνθετικών οδών παράγονται τα φλαβονοειδή, τα 9

20 οποία αποτελούν τη µεγαλύτερη τάξη φαινολικών ενώσεων και κατηγοριοποιούνται σε φλαβόνες, φλαβονόλες, φλαβανόνες, φλαβανόλες, ισοφλαβόνες, φλαβανονόλες και ανθοκυανίνες (Harborne, 1989). Ωστόσο υπάρχουν και φαινολικές ενώσεις των οποίων η βιοσύνθεση ακολουθεί συνδυασµό άλλων οδών. Στις ενώσεις αυτές περιλαµβάνονται οι τοκοφερόλες-τοκοτριενόλες, τα φαινολικά διτερπένια (π.χ. καρνοσικό οξύ, καρνοσόλη) και οι γλυκοζίτες σεκοϊριδοειδών (π.χ. ελαιοευρωπαΐνη) που θεωρούνται τερπένια (Νενάδης, 2004). Πίνακας 1.3: Κύριες τάξεις φαινολικών ενώσεων που απαντούν σε φυτά Βασική δοµή Τάξη C 6 Απλές φαινόλες, βενζοκινόνες C 6 C 1 C 6 C 2 C 6 C 3 C 6 C 4 C 6 C 1 C 6 C 6 C 2 C 6 C 6 C 3 C 6 Φαινολικά οξέα Ακετοφαινόνες, φαινυλοξικά οξέα Υδροξυ- κινναµωµικά οξέα, φαινυλοπροπένια, κουµαρίνες, ισοκουµαρίνες, χρωµόνες Ναφθοκινόνες Ξανθόνες Στιλβένια, ανθρακινόνες Φλαβονοειδή, ισοφλαβονοειδή (C 6 C 3 ) 2 Λιγνάνες, νεολιγνάνες (C 6 C 3 C 6 ) 2 ιφλαβονοειδή (C 6 C 3 ) n Λιγνίνες (C 6 ) 6 Κατεχολικές µελανίνες (C 6 C 3 C 6 ) n Συµπυκνωµένες ταννίνες Πηγή: Harborne,

21 Τα δοµικά χαρακτηριστικά κάθε τάξης διαφοροποιούν τον τρόπο µε τον οποίο οι φαινολικές ενώσεις δρουν ως παρεµποδιστές οξείδωσης. Βασικά κριτήρια σχέσεων δοµής-δραστικότητας (structure-activity relationships, SARs) που αφορούν κυρίως στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών από φαινολικές ενώσεις έχουν κατά καιρούς αξιολογηθεί από διάφορους ερευνητές. Προκειµένου να γίνει κατανοητός ο τρόπος µε τον οποίο οι SAR που έχουν αναπτυχθεί ερµηνεύουν την αντιοξειδωτική δράση των διαφόρων τάξεων φαινολικών ενώσεων, περιγράφονται στη συνέχεια οι µηχανισµοί µε τους οποίους οι ΑΗ παρεµποδίζουν την οξείδωση ευοξείδωτων υποστρωµάτων. Οι φαινολικές ενώσεις χαρακτηρίζονται ως πρωτοταγή αντιοξειδωτικά επειδή έχουν την τάση να δεσµεύουν τις ελεύθερες ρίζες που προκαλούν έναρξη και διάδοση αντιδράσεων αυτοξείδωσης παράγοντας νέες σταθερές και σχετικά ανενεργές ρίζες ( R1 και R2) και επειδή µπορούν να ανταγωνίζονται µε το λιπαρό υπόστρωµα για την αντίδραση µε τις υπεροξυ- ρίζες (R3) (Frankel, 1998). R + AH RH + A (R1) RO + AH ROH +A (R2) ROO + AH ROOH + A (R3) ROO + AH ROO _ ΑΗ + ROOH + A (R4) Αποδεκτός είναι και ο µηχανισµός δράσης των ΑΗ που περιγράφεται από την αντίδραση R4 και περιλαµβάνει δύο στάδια. Την αναγωγή της ROO προς το αντίστοιχο ανιόν µε απόδοση µονήρους ηλεκτρονίου και την ακόλουθη µετατροπή του ανιόντος σε υδροϋπεροξείδιο (Tsimidou et al., 2006). Η προστατευτική δράση των ΑΗ συµπληρώνεται µε το σχηµατισµό σταθερών προϊόντων µε τη βοήθεια των φαινοξυ- ριζών (A ) σύµφωνα µε τις αντιδράσεις R5-R8 (Frankel, 1998). RO + A ROA R + A RA (R5) (R6) 11

22 ROO + A ROOA A + A A-A (R7) (R8) Στην περίπτωση όµως ασθενών ΑΗ είναι δυνατόν να λάβουν χώρα και άλλες παράπλευρες αντιδράσεις, όπως η αντίδραση των A µε το οξυγόνο της ατµόσφαιρας (R9) και στη συνέχεια µε το λιπαρό υπόστρωµα (R10) ή απευθείας µε το λιπαρό υπόστρωµα και τα υδροϋπεροξείδια (R11 και R12) ή ακόµη και η ίδια η ΑΗ να οξειδωθεί απευθείας από το οξυγόνο ή να αντιδράσει µε υπάρχοντα υδροϋπεροξείδια εµφανίζοντας τελικά προοξειδωτική δράση (R13 και R14) (Νενάδης, 2004). Α + Ο 2 ΑΟΟ (R9) ΑΟΟ + RH ΑΟΟΗ + R (R10) Α + RH AH + R (R11) Α + ROOH AH + ROO (R12) AH + O 2 Α + HOO (R13) AH + ROOH Α + H 2 O + RO (R14) Οι παραπάνω αντιδράσεις είναι πιο βραδείες από τις αντιδράσεις R2 και R3. Έτσι, όταν η ΑΗ απαντά σε υψηλές συγκεντρώσεις η παρουσία ριζών ROO και RO περιορίζεται σηµαντικά, µε αποτέλεσµα οι παράπλευρες αντιδράσεις στις οποίες αυτές δε συµµετέχουν να ευνοούνται και να σχηµατίζονται τελικά νέες ρίζες R, γεγονός που οδηγεί σε προοξειδωτική δράση των ΑΗ σε τέτοιες περιπτώσεις. Χαρακτηριστικό παράδειγµα ΑΗ που µπορεί να εµφανίσει προοξειδωτική δράση µε αύξηση της συγκέντρωσης είναι η α-τοκοφερόλη (Νενάδης, 2004). Μπορεί εποµένως να γίνει αντιληπτό πως η αντιοξειδωτική ικανότητα των ΑΗ εξαρτάται από δύο παράγοντες. Από την ισχύ του δεσµού Ο-Η των υδροξυυποκαταστατών που καθορίζει την ευκολία απόδοσης ατόµου υδρογόνου προς τις ελεύθερες ρίζες και από τη σταθερότητα της φαινοξυ- ρίζας που προκύπτει. (Νενάδης, 2004, Ορδούδη, 2007). Στο σηµείο αυτό γίνεται πλέον κατανοητή η σηµασία των δοµικών χαρακτηριστικών των διαφόρων τάξεων των φαινολικών 12

23 ενώσεων, αφού αυτά καθορίζουν σε µεγάλο ή µικρότερο βαθµό την αποτελεσµατικότητα των ΑΗ να δρουν ως παρεµποδιστές οξείδωσης. Έτσι, σύµφωνα µε τον πρώτο παράγοντα, η απλή φαινόλη δεν εµφανίζει αντιοξειδωτική δράση παρά µόνο όταν υπάρχει υποκατάσταση σε ο- ή π- θέση µε οµάδες δότες ηλεκτρονίων (π.χ. υδροξυ-, αλκυλο-, µεθοξυ-) που προκαλεί αύξηση της ηλεκτρονιακής πυκνότητας στο φαινολικό υδροξύλιο. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την ελάττωση της ενέργειας του δεσµού Ο-Η και εποµένως διευκολύνεται η απόδοση ατόµου υδρογόνου προς τις υπεροξυ- ρίζες. Η υποκατάσταση σε µ- θέση δεν επιφέρει κάποια βελτίωση στην αντιοξειδωτική ικανότητα καθώς σε µια τέτοια θέση οι υποκαταστάτες έχουν ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα (Νενάδης, 2004). Η σταθερότητα της φαινοξυ- ρίζας Α, οφείλεται σε δοµές συντονισµού (Σχήµα 1.2), ενώ µπορεί να επιτευχθεί και περαιτέρω σταθεροποίησή της µε την υποκατάσταση σε ο- θέση µε υδροξυ- ή µε ογκώδεις αλκυλο- οµάδες, σχηµατίζοντας ενδοµοριακούς δεσµούς υδρογόνου και προκαλώντας φαινόµενα στερεοχηµικής παρεµπόδισης, αντιστοίχως (Νενάδης, 2004). Σχήµα 1.2: Σταθεροποίηση φαινοξυ- ρίζας µέσω δοµών συντονισµού (Choe και Min, 2006) Από τα διφαινολικά παράγωγα µε απόδοση ατόµου υδρογόνου στις ελεύθερες ρίζες προκύπτει ηµικινοειδής ρίζα η οποία µπορεί να οξειδωθεί περαιτέρω αντιδρώντας µε δεύτερη υπεροξυ- ρίζα προς κινόνη ή υδροκινόνη ή να αλληλεπιδράσει µε οµοειδή ρίζα οδηγώντας στην αναγέννηση ενός µορίου της αρχικής διφαινόλης (Σχήµα 1.3), γεγονός που εξηγεί την αντιοξειδωτική τους δράση (Pokorny, 1987). 13

24 O OH OH O OH OH O OH ROO ROOH OH ROO ROOH O Σχήµα 1.3: Οξείδωση 1,4-διφαινόλης προς κινόνη και αναγέννησή της Βασικά κριτήρια SAR έχουν κατά καιρούς αξιολογηθεί από διάφορους ερευνητές (Bors et al., 1990, Shahidi and Wanaundara, 1992, Rice-Evans et al., 1996, Heim, 2002, Tsimidou et al., 2006). Στη συνέχεια παρατίθενται ορισµένα παραδείγµατα SAR δύο σηµαντικών τάξεων φαινολικών ενώσεων, των φαινολικών οξέων και των φλαβονοειδών, ενώ περισσότερες πληροφορίες και παραδείγµατα µπορεί κανείς να αναζητήσει στους προαναφερθείς ερευνητές. Σε ότι αφορά τα φαινολικά οξέα, έχει µελετηθεί συστηµατικά η σηµασία του αριθµού και της θέσης των υδροξυ- και µεθοξυ- οµάδων, της άµεσης υποκατάστασης του δακτυλίου µε καρβοξυλική οµάδα και της απόστασης της τελευταίας από το φαινολικό δακτύλιο. Ενδεικτικά αναφέρονται ακολούθως ορισµένα ευρήµατα τέτοιων µελετών. Για τη διευκόλυνση του αναγνώστη, στο Σχήµα 1.4 παρουσιάζονται τα δοµικά χαρακτηριστικά ορισµένων τάξεων φαινολικών οξέων. Η παρουσία τριών υδροξυ- οµάδων σε ο- θέση θεωρείται το αποτελεσµατικότερο δοµικό χαρακτηριστικό των υδροξυβενζοϊκών οξέων, καθιστώντας το γαλλικό οξύ ως τον ισχυρότερο παρεµποδιστή οξείδωσης της τάξης στην οποία ανήκει (Shahidi and Wanasundara, 1992). Μεθοξυ- οµάδα σε ο- θέση ως προς το φαινολικό ΟΗ ευνοεί τη δραστικότητα των µονοφαινολικών ενώσεων, όχι όµως στον ίδιο βαθµό µε την υδροξυ- οµάδα λόγω της µικρότερης σταθερότητας της προκύπτουσας φαινοξυ- ρίζας, µε αποτέλεσµα το βανιλλικό οξύ να είναι σηµαντικά ασθενέστερος παρεµποδιστής οξείδωσης σε σχέση µε το πρωτοκατεχικό (Nergiz, 14

25 1991, Cuvelier et al., 1992, Brand-Williams et al., 1995). Η παρουσία όµως και δεύτερης µεθοξυ- οµάδας συµβάλλει στερεοχηµικά στη σταθεροποίηση της φαινοξυρίζας (Bors et al., 2002), γεγονός που εξηγεί και τη µικρότερη δραστικότητα του συριγκικού οξέος από το πρωτοκατεχικό οξύ (Ορδούδη, 2007). Σχήµα 1.4: Απαραίτητα δοµικά χαρακτηριστικά διαφόρων τάξεων απλών φαινολών που βοηθούν στην κατανόηση κριτηρίων SAR (Ορδούδη, 2007). Η παρουσία COOH ως άµεσου υποκαταστάτη του φαινολικού δακτυλίου µειώνει τη δραστικότητα των απλών φαινολών λόγω της ισχυρά ηλεκτραρνητικής φύσης του, γεγονός που δεν επαληθεύεται σε όλες τις πειραµατικές συνθήκες (Ορδούδη, 2007). Χαρακτηριστική είναι η παρόµοια αποτελεσµατικότητα του πρωτοκατεχικού οξέος µε την κατεχόλη (Nenadis et al., 2004). Για τη σχετική θέση 15

26 της καρβοξυλικής οµάδας ως προς τις υδροξυ- οµάδες δεν έχει διευκρινιστεί κάποια συγκεκριµένη σχέση δοµής-δραστικότητας, θεωρείται όµως πως τα ο- υδροξυβενζοϊκά οξέα είναι λιγότερο δραστικά από τα π- ισοµερή τους, ενώ τα µ- υδροξυβενζοϊκά αναµένεται να είναι περισσότερο δραστικά από τα αντίστοιχα ο- και π- ισοµερή, καθώς σε αυτή τη θέση δεν επηρεάζεται η ισχύς του δεσµού ΟΗ από τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα της καρβοξυλικής οµάδας (Ορδούδη, 2007). Η µεγαλύτερη απόσταση της καρβοξυλικής οµάδας από το φαινολικό δακτύλιο ελαττώνει την ηλεκτραρνητική ισχύ της, αυξάνοντας έτσι την αποτελεσµατικότητα των υδροξυκινναµωµικών οξέων έναντι των αντίστοιχων υδροξυβενζοϊκών. Στο γεγονός αυτό συµβάλλει και η παρουσία διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα (-CH=CH-COOH) που επιτρέπει τη σταθεροποίηση της φαινοξυ- ρίζας µε περισσότερες δοµές συντονισµού (Clifford, 2001). Ένα ακόµη αξιοσηµείωτο κριτήριο SAR που εισήγαγαν οι Hotta και συνεργάτες (2001) είναι η ικανότητα ορισµένων φαινολικών οξέων να δίνουν αντιδράσεις πολυµερισµού, οι οποίες οδηγούν στην αναγέννηση επιπλέον υδροξυοµάδων (Σχήµα 1.5), ενισχύοντας έτσι την αντιοξειδωτική τους δράση, π.χ. ως προς τη ρίζα DPPH. DPPH HO OH COOH O OH COOH O OH COOH DPPH HO OH COOH O OH COOH O OH COOH HOOC COOH HOOC COOH 4 DPPH HO O HO O HO OH O O Σχήµα 1.5: Αντιδράσεις πολυµερισµού που οδηγούν στην αναγέννηση υδροξυοµάδων (Hotta et al., 2001) 16

27 Τα κριτήρια SAR που έχουν διατυπωθεί στην περίπτωση των φαινολικών οξέων είναι αρκετά απλούστερα από εκείνα των φλαβονοειδών (Tsimidou et al., 2006). Η πολυπλοκότερη δοµή των δεύτερων φαίνεται στο Σχήµα 1.6 και η εξήγηση των SARs που εµφανίζει η σηµαντική αυτή τάξη των φαινολικών ενώσεων στηρίζεται στα δοµικά χαρακτηριστικά κάθε δακτυλίου και στη συνεισφορά του καθενός στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών (Tsimidou et al., 2006). Σχήµα 1.6: Απαραίτητα δοµικά χαρακτηριστικά διαφόρων τάξεων φλαβονοειδών που βοηθούν στην κατανόηση κριτηρίων SAR (Ορδούδη, 2007). 17

28 Ο δακτύλιος Β αποτελεί κύριο στόχο των ελευθέρων ριζών (Bors et al., 1990). Η δοµή κατεχόλης (παρουσία δύο υδροξυ- οµάδων σε ο- θέση) συµβάλλει στην αύξηση της δραστικότητας, ενώ η παρουσία και τρίτης υδροξυ- οµάδας σε ο- θέση δεν οδηγεί στο ίδιο αποτέλεσµα. Μικρότερη δραστικότητα εµφανίζεται και στην περίπτωση της παρουσίας δύο υδροξυ- οµάδων σε µ- θέσεις του ίδιου δακτυλίου. Έτσι, η κερκετίνη έχει µεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση από την καιµπφερόλη, τη µυρικετίνη και τη µορίνη (Rice-Evans et al., 1996, Cao et al., 1997, Silva et al., 2002, Hotta et al., 2002, Nenadis et al., 2004). Σηµειώνεται πως η δοµή κατεχόλης στο δακτύλιο Β είναι καθοριστική σηµασίας και λόγω της ικανότητάς της να συµπλοκοποιεί µέταλλα π.χ. Fe 3+ (Van Acker et al., 1996). Τα δοµικά χαρακτηριστικά του δακτυλίου C διαδραµατίζουν επίσης σηµαντικό ρόλο στην αντιοξειδωτική δράση των φλαβονοειδών (Tsimidou et al., 2006). Η παρουσία υδροξυ- οµάδας στη θέση C-3 του δακτυλίου αυτού συµβάλλει στη συνολική δράση της ένωσης, ενώ η παρουσία του διπλού δεσµού (C-2, C-3) και αυτή της οξο- οµάδας (C-4) σταθεροποιούν τη ρίζα του φλαβονοειδούς. Τα κριτήρια αυτά αναδεικνύουν και πάλι την υπεροχή της κερκετίνης και της ρίζας της, αυτή τη φορά έναντι της λουτεολίνης και της ρίζας της κατεχίνης, αντιστοίχως (Rice-Evans et al., 1996, Hotta et al., 2002, Silva et al., 2002). Σε ότι αφορά το δακτύλιο Α, η υποκατάστασή του µε υδροξυ- οµάδες δε συνεισφέρει σηµαντικά στην αντιοξειδωτική δράση των φλαβονοειδών (Tsimidou et al., 2006). Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό πως η αντιοξειδωτική ικανότητα µιας φαινολικής ένωσης καθορίζεται από τα δοµικά χαρακτηριστικά της. Ωστόσο υπάρχουν και περιπτώσεις στις οποίες τα ευρήµατα διαφορετικών πειραµατικών µελετών που αφορούν SARs αλληλοσυγκρούονται (Tsimidou et al., 2006). Συνεπώς, οι SARs εξαρτώνται και από παράγοντες όπως το υπόστρωµα στο οποίο γίνεται η µελέτη, τις συνθήκες της αντίδρασης (π.χ. θερµοκρασία, συγκέντρωση ΑΗ) και τελικά από την έκφραση και ερµηνεία των αποτελεσµάτων (Νενάδης, 2004). Η διαπίστωση της υψηλής δραστικότητας των φαινολικών ενώσεων προκαλεί το ενδιαφέρον της βιοµηχανίας των τροφίµων, η οποία προκειµένου να βρίσκεται σε συµφωνία µε τις αρχές της ορθής βιοµηχανικής πρακτικής αναζητά συστατικά των οποίων η παρουσία σε µικρές συγκεντρώσεις εγγυάται την προστασία των τροφίµων 18

29 από την οξείδωση. Η απαίτηση αυτή, σε συνδυασµό µε την σύγχρονη τάση κατανάλωσης λειτουργικών τροφίµων, οδήγησε τους ερευνητές στην αναζήτηση φυσικών πηγών φαινολικών ενώσεων. Στις κύριες πηγές φαινολικών αντιοξειδωτικών περιλαµβάνονται φρούτα και λαχανικά, δηµητριακά, τσάγια, αλκοολούχα και άλλα ποτά, βότανα και αρωµατικά φυτά. Λιγότερο γνωστές στο ευρύ κοινό πηγές είναι διάφορα παραδοσιακά και εθνικά προϊόντα, τροπικά φρούτα, ακόµη και παραπροϊόντα και απόβλητα γεωργικών βιοµηχανιών και βιοµηχανιών τροφίµων (Boskou, 2006). Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγµα της αξιοποίησης φύλλων ελιάς που προκύπτουν από το κλάδεµα των ελαιόδεντρων και τη διεργασία της παραγωγής ελαιόλαδου, τα οποία αναδείχθηκαν ως πλούσιες πηγές σε υδροξυτυροσόλη και ελαιοευρωπαΐνη (Guinda et al., 2004). 1.3 ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ Το ενδιαφέρον των µελετητών για τη δράση των φυσικών παρεµποδιστών οξείδωσης οδήγησε στη δηµοσίευση µεγάλου αριθµού πρωτοκόλλων που αφορούν στην εκτίµηση της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας (Frankel & Finley, 2008). Οι τεχνικές που χρησιµοποιούνται συχνότερα περιλαµβάνουν: οκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης ελαίων (π.χ. µέθοδος πυριαντηρίου C, µέθοδος ενεργού οξυγόνου, ΑΟΜ C και διαβίβαση ρεύµατος αέρα, µέθοδος Rancimat θ C και διαβίβαση ρεύµατος αέρα). οκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης µοντέλων λιπαρών υποστρωµάτων (π.χ. γαλακτώµατα ελαίου σε νερό (o/w), γαλακτώµατα νερού σε έλαιο (w/o), µικήλια και λιποσώµατα). Αντιδράσεις των ΑΗ µε ελεύθερες ρίζες (π.χ. ρίζα 1,1-διφαινυλο-2- πικρυλυδραζυλίου DPPH, κατιοντική ρίζα 2,2 -αζινο-δις-(3- αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος ABTS +, ρίζα υδροξυλίου ΟΗ ρίζα σουπεροξειδίου Ο - 2 ) σε οργανικά ή υδατικά διαλύµατα. Προσδιορισµό της παρουσίας ΑΗ στην περίπτωση φυσικών και µη προϊόντων (π.χ. µέθοδος Folin-Ciocalteu και φθορισµοµετρική µέθοδος). 19

30 Στην πρώτη περίπτωση, η εκτίµηση της αποτελεσµατικότητας µιας ΑΗ περιλαµβάνει την προσθήκη της σε λιπαρό υπόστρωµα απαλλαγµένο από προοξειδωτικούς ή αντιοξειδωτικούς παράγοντες και στη συνέχεια παρακολούθηση της πορείας της οξείδωσης µε κάποια δοκιµή σταθερότητας. Ο υπολογισµός των πρωτογενών ή/και δευτερογενών προϊόντων της οξείδωσης επιτρέπει την παρακολούθηση της πορείας της αυτοξείδωσης του υποστρώµατος. Οι δοκιµές σε συστήµατα διασποράς προσοµοιάζουν τα τρόφιµα και τα βιολογικά συστήµατα που εµπεριέχουν πολλά συστατικά σε διασπορά. Ειδικά τα λιποσώµατα θεωρείται ότι προσοµοιάζουν τις κυτταρικές µεµβράνες επειδή όταν είναι σε διασπορά έχουν την τάση να σχηµατίζουν διαδοχικές διπλοστιβάδες (Σχήµα 1.7). Για το λόγο αυτό η µελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης σε λιποσώµατα δίνει επαγωγικά πληροφορίες για την πρόβλεψη της συµπεριφοράς τους in vivo (Frankel, 1998). Σχήµα 1.7 : Τυπική µορφή διπλοστιβάδας λιποσώµατος που αποτελείται από µόρια φωσφολιπιδίων Κατά την αντίδραση των δραστικών ΑΗ µε σταθερές συνθετικές ελεύθερες ρίζες που έχουν τη δυνατότητα να δίνουν µε το νερό ή οργανικούς διαλύτες έγχρωµα διαλύµατα παρατηρείται σταδιακός ή άµεσος αποχρωµατισµός του διαλύµατος, γεγονός που επιτρέπει τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της ρίζας σε διαφορετικές χρονικές στιγµές και συνεπώς την έµµεση εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης των υπό µελέτη ΑΗ. Τέλος, ο προσδιορισµός της παρουσίας ΑΗ σε φυσικά και µη προϊόντα είναι µια έµµεση τεχνική εκτίµησης της αντιοξειδωτικής τους δράσης, ιδιαίτερα χρήσιµη στην περίπτωση της αναζήτησης νέων λειτουργικών αντιοξειδωτικών. 20

31 1.4 Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ OLEACEAE ΩΣ ΦΥΣΙΚΗ ΠΗΓΗ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ Γενικά Η οικογένεια των φυτών Oleaceae χαρακτηρίζεται ως µεσαίου µεγέθους και απαρτίζεται από 25 γένη και περίπου 600 είδη που ευδοκιµούν σε όλο τον κόσµο, από τις βόρειες εύκρατες µέχρι τις νότιες τροπικές περιοχές (Wallander and Albert, 2000). Έχει µελετηθεί διεξοδικά µέχρι σήµερα, εξαιτίας της σηµαντικότητας των συστατικών που περιέχονται στα φυτά που την αποτελούν. Κυρίως χαρακτηρίζεται από την παρουσία ιριδοειδών γλυκοζιτών (iridoid glycosides) και φαινυλαιθανοειδών (phenylethanoid) παραγώγων µε τη µορφή εστέρων και γλυκοζιτών της τυροσόλης και ιδιαίτερα της ντοπαόλης (dopaol). Συχνά συναντώνται επίσης και γλυκοζίτες κουµαρινών και λιγνανών (Jensen et al.,, 2002). Η παρουσία των ιριδοειδών συνδέει την Oleaceae µε τις οικογένειες των Lamiales και Gentianales και δεδοµένου ότι οι περισσότερες από αυτές τις ουσίες είναι τύπου σεκοϊριδοειδών, συνδέεται περισσότερο µε αυτή των Gentianales. Το γεγονός αυτό, µεταξύ άλλων, οδήγησε στο χαρακτηρισµό των Oleaceae ως αδελφή οικογένεια των Gentianales (Jensen et al.,, 2002). Ωστόσο, η παρουσία παραγώγων της τυροσόλης και ντοπαόλης στην Oleaceae, τόσο ως εστέρες των ιριδοειδών όσο και (κυρίως) ως βερµπασκοζίτης (verbascoside), καθώς και η παρουσία των αναλόγων τους (caffeoyl phenylethanoid glycosides = CPGs) θα µπορούσε, αντιθέτως, να δείχνει µια στενότερη σχέση µε την οικογένεια των Lamiales δεδοµένου ότι οι εν λόγω ενώσεις είναι χαρακτηριστικές της δεύτερης και σχεδόν δεν υπάρχουν πουθενά αλλού (Jensen, 1992). Οι ευεργετικές ιδιότητες των σεκοϊριδοειδών και ειδικότερα της ελαιοευρωπαΐνης συνδέονται µε χαµηλή συχνότητα εµφάνισης διαφόρων τύπων καρκίνου και καρδιαγγειακών παθήσεων (Νενάδης, 2004). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν 10 από τα 25 είδη της οικογένειας λόγω των ευρηµάτων χηµειοταξονοµικών µελετών που ανέδειξαν την παρουσία της ελαιοευρωπαΐνης και συγγενικών σεκοϊριδοειδών σε αυτά (Chionanthus, Forestiera, Fraxinus, Jasminum, Ligustrum, Nestegis, Olea, Osmanthus, Phillyrea και Syringa) (Nenadis & Tsimidou, 2009). 21

32 1.4.2 Olea europaea Η Olea europaea (ελαιόδενδρο ή ελιά) είναι ένα από τα σηµαντικότερα είδη της οικογένειας Oleaceae. Οι θεραπευτικές της ιδιότητες ήταν γνωστές από την αρχαιότητα (Κυριτσάκης, 2007). Σήµερα, ο καρπός της ελιάς και το ελαιόλαδο που είναι τα κύρια προϊόντα του ελαιόδενδρου, θεωρούνται βασικές πηγές φαινολικών ενώσεων (Boskou et al., 2005), ενώ τα φύλλα, οι βλαστοί, τα άνθη και τα απόβλητα ελαιουργείων, που αποτελούν δευτερεύοντα προϊόντα του ή παραπροϊόντα του, αποκτούν ολοένα και µεγαλύτερο ενδιαφέρον λόγω του περιεχοµένου τους σε βιοδραστικά συστατικά (Papoti & Tsimidou, 2009). Στα εκχυλίσµατα των φύλλων της ελιάς έχουν αποδοθεί αντιφλεγµονώδεις, αντιµυκητιακές, αντιοξειδωτικές, αποτοξινωτικές και άλλες δράσεις (Khan et al., 2007), οι οποίες βρέθηκε ότι σχετίζονται µε την παρουσία ενός ή/ και περισσότερων βιοενεργών συστατικών στα φύλλα, κυρίως φαινολικών ενώσεων. Συγκεκριµένα, στα φύλλα της ελιάς εµφανίζονται απλές φαινόλες (υδροξυτυροσόλη και γλυκοζίτες της, τυροσόλη και γλυκοζίτες της), βενζοϊκά οξέα (π.χ. γαλλικό, βαννιλικό, συριγκικό, σαλυκιλικό, υδροξυβενζοϊκό), κινναµωµικά οξέα (π.χ. κινναµωµικό, καφεϊκό, κουµαρικό, φερουλικό, χλωρογενικό), άλλα συγγενή συστατικά (ελενολικό οξύ και παράγωγά του, βερµπασκοζίτης), σεκοϊριδοειδή (π.χ. αποµεθυλοελαιοευρωπαΐνη, ελαιοζίτης, ελαιοευρωπαΐνη και άγλυκο συστατικό της) και φλαβονοειδή (π.χ. απιγενίνη και γλυκοζίτες της, εσπεριδίνη, λουτεολίνη και γλυκοζίτες της, κερκετίνη, ρουτίνη) (Papoti & Tsimidou, 2009). Οι ίδιες ερευνήτριες επισηµαίνουν και το πλούσιο περιεχόµενο των φύλλων της ελιάς σε ιχνοστοιχεία, µέταλλα και άλλες βιοενεργές ενώσεις, όπως στερόλες, τοκοφερόλες, καροτενοειδή, βιταµίνες και τερπένια. Επειδή η ευρέως αποδεκτή αντιοξειδωτική δράση της Olea europaea οφείλεται στην παρουσία των ανωτέρω βιοδραστικών συστατικών της, στο πλαίσιο της αναζήτησης νέων πηγών φυσικών παρεµποδιστών οξείδωσης το ενδιαφέρον της ερευνητικής οµάδας των Τσιµίδου και συνεργατών στρέφεται στη µελέτη περισσότερων φυτών που ανήκουν στην ίδια οικογένεια. Σε αρκετές περιπτώσεις τα ευρήµατα σχετικών ερευνών ενισχύουν την παραπάνω υπόθεση. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγµα του φυτού Syringa oblata του οποίου το µεθανολικό εκχύλισµα 22

33 παρουσίασε αντιοξειδωτική δράση συγκρίσιµη µε αυτήν της ελιάς (Nenadis et al., 2007). 1.5 ΤΟ ΓΕΝΟΣ LIGUSTRUM Γενικά Το γένος του φυτού Ligustrum ανήκει στην οικογένεια Oleaceae και περιλαµβάνει περίπου είδη αειθαλών και ηµι-φυλλοβόλων θάµνων και µικρών δέντρων. Ευδοκιµεί στην Ευρώπη, τη Βόρειο Αφρική, την Ασία και την Αυστραλία, ενώ οι περισσότερες ποικιλίες εµφανίζονται στην Κίνα, τα Ιµαλάια, την Ιαπωνία και την Ταϊβάν. Η κοινή ονοµασία του φυτού είναι αγριοµυρτιά και χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά για το είδος L. vulgare, αργότερα για το είδος L. ovalifolium και τελικά επικράτησε για όλα τα είδη του Ligustrum. Η αγγλική ονοµασία του φυτού είναι privet και προέρχεται από τον όρο private (= ιδιωτικός) εξαιτίας της µορφολογίας του, καθώς χρησιµοποιείται συχνά ως φράχτης για να διαχωρίζει καλαίσθητα τις γειτονικές ιδιοκτησίες (Εικόνα 1) ( Εικόνα 1: Ligustrum vulgare 23

34 Πολλά είδη του φυτού χρησιµοποιούνται είτε για την παρασκευή αφεψηµάτων, είτε για ιατρικούς σκοπούς. Το είδος Ku - Ding-Cha είναι ένα γνωστό στην κινεζική παράδοση τσάι, το οποίο παρασκευάζεται από διάφορα είδη που ανήκουν σε διαφορετικές οικογένειες και γένη, συµπεριλαµβανοµένου του Ligustrum (Nenadis and Tsimidou, 2009). Τα άνθη του είναι µικρά, εύοσµα και σχηµατίζουν ταξιανθίες. Έχουν τέσσερα σπειροειδή πέταλα και δύο ψηλούς στήµονες µε κίτρινους ή κόκκινους ανθήρες και ανάµεσά τους παρίσταται ο χαµηλότερος ύπερος του άνθους. Τα πέταλα και οι στήµονες αποβάλλονται µετά τη γονιµοποίηση του άνθους, αφήνοντας τον ύπερο στον κάλυκα. Οι καρποί, οι οποίοι αναπτύσσονται κατά οµάδες, είναι µικροί και η απόχρωσή τους εξαρτάται από το στάδιο της ανάπτυξής τους (γλαυκώδες, µωβ, µαύρο) ( Στη συνέχεια αναφέρονται τα περισσότερα είδη του Ligustrum, οι περιοχές στις οποίες ευδοκιµούν και οι κοινές ονοµασίες των σηµαντικότερων από αυτά. L. amamianum (Κίνα), L. angustum (Κίνα), L. chenaultii (Κίνα (Yunnan)), L. compactum (Ιµαλάια, νοτιοδυτική Κίνα), L. confusum (Ιµαλάια, Khasi Hills), L. delavayanum (Νοτιοδυτική Κίνα, Myanmar), L. expansum (Κίνα), L. gracile (Κίνα), L. henryi (Κεντρική Κίνα), L. ibota (Ιαπωνία), L. indicum (Ιµαλάια, Ινδοκίνα), L. japonicum (Ιαπωνία, Κορέα), L. leucanthum (Κίνα), L. lianum (Κίνα), L. liukiuense (Ταϊβάν), L. longitubum (Κίνα), L. lucidum (Chinese or Glossy Privet) (Κίνα, Ιαπωνία, Κορέα), L. massalongianum (Ιµαλάια), L. microcarpum (Ταϊβάν (συχνά περιλαµβάνεται στο L. sinense)), L. morrisonense (Ταϊβάν), L. obovatilimbum (Κίνα), L. obtusifolium (Ανατολική Ασία), L. ovalifolium (Japanese or Oval-leaved Privet) (Ιαπωνία), L. pedunculare (Κίνα), L. pricei (Ταϊβάν), L. quihoui (Κίνα), L. retusum (Κίνα), L. robustum (Κίνα), L. sempervirens ( υτική Κίνα), L. sinense (κινεζική αγριοµυρτιά) (Κίνα, Ταϊβάν), L. strongylophyllum (Κεντρική Κίνα), L. tenuipes (Κίνα), L. tschonoskii (Ιαπωνία), L. vulgare (Η κοινή ή ευρωπαϊκή αγριοµυρτιά) (Ευρώπη, βορειοδυτική Αφρική, νοτιοδυτική Ασία), L. xingrenense (Κίνα), L. yunguiense (Κίνα) (Parasyringa, 1996). Η βιβλιογραφική ανασκόπηση έδειξε ότι τα είδη του γένους Ligustrum που έχουν έως σήµερα µελετηθεί είναι τα εξής: L. delavayanu, L. japonicum, L. lucidum, 24

35 L. ovalifolium, L. pedunculare, L. purpurascens, L. robustum, L. sinense και L. vulgare (Inoue et al., 1982, Kuwajima et al., 1989, He 1994, Machida et al., 1997, Shi et al., 1998, Tian et al., 1998, Chen et al., 2000, Pieroni et al., 2000, Pieroni et al., 2000b, Romani et al., 2000, He et al., 2001, He et al., 2001b, Ma et al., 2001, Wong et al., 2001, Chen et al., 2002, Lau et al., 2002, He et al., 2003, Ouyang et al., 2003, Šeršeň et al., 2005, Nagy et al., 2006, Šeršeň et al., 2006, Buschhaus et al., 2007, Lin et al., 2007) Αντιοξειδωτική δράση φυτών του γένους Ligustrum Οι ευεργετικές ιδιότητες του πράσινου τσαγιού αποτέλεσαν πρόκληση για πολλούς επιστήµονες, οι οποίοι έστρεψαν το ενδιαφέρον τους στην αναζήτηση αντίστοιχων ιδιοτήτων και σε άλλα είδη τσαγιού. Το γένος Ligustrum, όπως προαναφέρθηκε στην 1.5.1, αποτελεί ένα από τα 12 είδη φυτών που χρησιµοποιούνται για την παρασκευή του κινεζικού τσαγιού Ku-Ding-Cha, γνωστό στην κινεζική παραδοσιακή ιατρική για τις αντιτοξικές, διουρητικές και αντιπυρετικές του ιδιότητες (He et al., 1992). Στο πλαίσιο της κατανόησης των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του συγκεκριµένου παρασκευάσµατος εκπονήθηκαν µελέτες που αφορούν σε κάθε συστατικό από τα οποία αποτελείται. Μελέτες τέτοιου τύπου πραγµατοποιούνται για διάφορα είδη του γένους Ligustrum. Τα ευρήµατα των συστηµατικότερων µελετών των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του συγκεκριµένου φυτού παρουσιάζονται στη συνέχεια. Εγχύµατα των φύλλων του L. delavayanum και L. vulgare έδειξαν αποτελεσµατική αντιοξειδωτική δράση κατά τη δοκιµή δέσµευσης της ρίζας DPPH (Nagy et al., 2006). Αιθανολικά εκχυλίσµατα των φύλλων του L. robustum εµφανίστηκαν ως παρεµποδιστές στην αιµόλυση των ερυθρών αιµοσφαιρίων που προκλήθηκε από την παρουσία του 2,2 - αζω-δισ-2-αµιδινοπροπανοδιχλωριδίου, ΑΑΡΗ (azo-bis-(2-amidinopropane) dihydrochloride). Στο ίδιο συµπέρασµα κατέληξε και µελέτη για τα αιθανολικά εκχυλίσµατα φύλλων του L. lucidum (He et al., 2001b, He et al., 2003). Αιθανολικά εκχυλίσµατα του καρπού του ίδιου είδους εµφάνισαν ασθενή αντιοξειδωτική δράση σε οξειδωτικό στρες που προκλήθηκε σε ποντίκια µέσω υψηλών δόσεων BHT (Lin et al., 2007). Στην ίδια εργασία όµως επισηµαίνεται 25