i=péîéå=enn=^ö~ê=pä~åíë================================ === ïáíü=^ëé~êíáå=^åáç=~åç=pççáìã=móêìî~íé=

Transcript

1 i=péîéå=enn=^ö~ê=pä~åíë================================ === ïáíü=^ëé~êíáå=^åáç=~åç=pççáìã=móêìî~íé= Rev. 07 Οκτώβριος 2006 ΙΑ ΙΚΑΣΙΕΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ I II ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το Seven H11 Agar είναι ένα υλικό για την αποµόνωση και την καλλιέργεια µυκοβακτηριδίων. Στη σύνθεση συµπεριλαµβάνεται ασπαρτικό οξύ και πυροσταφυλικό νάτριο για την ενίσχυση της ανάπτυξης και της παραγωγής νιασίνης. ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ A. ιαδικασία παρασκευής ενοφθαλµισµάτων 1. Ενοφθαλµίστε σωληνάρια κεκλιµένης καλλιέργειας Lowenstein-Jensen Medium µε καλλιέργειες παρακαταθήκης των σχετικών µυκοβακτηριδιακών στελεχών µε χρήση αποστειρωµένων µπατονετών ενοφθαλµισµού. 2. Επωάστε τα σωληνάρια µε ξεσφιγµένα καπάκια σε αερόβια ατµόσφαιρα συµπληρωµένη µε διοξείδιο του άνθρακα στους 35 ± 2 C, έως ότου επιτευχθεί έντονη ανάπτυξη (συνήθως εντός 2 έως 3 εβδοµάδων). 3. Συλλέξτε το υλικό της ανάπτυξης µε αποστειρωµένη ακονισµένη µπατονέτα, αφαιρώντας απαλά τα κύτταρα από την επιφάνεια του υλικού καλλιέργειας µε προσοχή, έτσι ώστε να µη συµπεριλάβετε υλικό καλλιέργειας µε τη συγκοµιδή των κυττάρων. α. Για το Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177: (1) Μεταφέρετε το υλικό της ανάπτυξης σε 5,0 ml ζωµού Middlebrook 7H9 µε γλυκερόλη σε αποστειρωµένο γυάλινο σωληνάριο µε βιδωτό καπάκι, το οποίο περιέχει αποστειρωµένα γυάλινα σφαιρίδια. (2) Υποβάλετε σε περιδίνηση καλά (επί αρκετά λεπτά) έως ότου το εναιώρηµα δεν περιέχει πλέον µεγάλα συσσωµατώµατα. (3) Συγκρίνετε το εναιώρηµα αυτό µε ένα πρότυπο νεφελόµετρου McFarland αρ. 1. Το εναιώρηµα θα πρέπει να είναι πιο θολερό από το πρότυπο. (4) Τοποθετήστε το σωληνάριο σε βάση επί 2 έως 3 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου, έτσι ώστε να επιτραπεί η καθίζηση των µεγάλων σωµατιδίων στον πυθµένα. (5) Μεταφέρετε το υπερκείµενο σε αποστειρωµένο δοχείο. (6) Ρυθµίστε τη θολερότητα του εναιωρήµατος στο πρότυπο McFarland αρ. 1 προσθέτοντας αργά στείρο ζωµό Middlebrook 7H9 µε γλυκερόλη. Ανακινήστε καλά. (7) Αραιώστε έως τα 10 5 CFU/mL πριν από τη χρήση. Αναµείξτε καλά και ενοφθαλµίστε µε γραµµωτή επίστρωση το υλικό εξέτασης µε χρήση βαθµονοµηµένου κρίκου 0,01 ml. β. Για όλα τα άλλα µυκοβακτηριδιακά στελέχη: (1) Μεταφέρετε το υλικό της ανάπτυξης σε αποστειρωµένο σωληνάριο φυγοκέντρου 50 ml µε βιδωτό καπάκι, το οποίο περιέχει 8 έως 12 αποστειρωµένα γυάλινα σφαιρίδια (διαµέτρου 2 mm) και 5 ml αραιωτικού µυκοβακτηριδίων που παρασκευάζεται ως εξής: Αναµείξτε τα ακόλουθα συστατικά σε ένα δοχείο του 1 L και ρυθµίστε το ph, µε χρήση υδροξειδίου του νατρίου 1 N, σε 6,7 έως 7,0. Βόεια αλβουµίνη (χωρίς λιπαρά οξέα) 1,0 g Polysorbate 80 0,1 ml Κεκαθαρµένο νερό 500 ml Αποστειρώστε µε διήθηση σε µεµβράνη (φίλτρο 0,2 µ) ιανείµετε ασηπτικά σε ποσότητες των 5,5 ml σε αποστειρωµένα σωληνάρια µε βιδωτά καπάκια. (2) Γαλακτωµατοποιήστε το υλικό µυκοβακτηριδιακής ανάπτυξης στο πλευρικό τοίχωµα ενός σωληναρίου φυγοκέντρου µε βιδωτό καπάκι, µε χρήση µπατονέτας. Αναµείξτε το υλικό της ανάπτυξης µε το αραιωτικό. (3) Πωµατίστε το σωληνάριο και υποβάλετε σε περιδίνηση επί 10 λεπτά περίπου, έως ότου εναιωρηθεί καλά το υλικό της ανάπτυξης και απαλλαγεί από µεγάλα συσσωµατώµατα. (4) Προσθέστε 15 ml στείρου αραιωτικού µυκοβακτηριδίων και αναµείξτε σχολαστικά. (5) Συγκρίνετε το εναιώρηµα αυτό µε ένα πρότυπο νεφελόµετρου McFarland αρ. 1. Το εναιώρηµα θα πρέπει να είναι πιο θολερό από το πρότυπο. 1

2 (6) Τοποθετήστε το σωληνάριο σε βάση επί 2 έως 3 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου, έτσι ώστε να επιτραπεί η καθίζηση των µεγάλων σωµατιδίων στον πυθµένα. (7) Αναρροφήστε το υπερκείµενο και µεταφέρετέ το σε ένα αποστειρωµένο δοχείο. Το εναιώρηµα πρέπει να είναι πιο θολερό από ένα πρότυπο McFarland αρ. 1 και απαλλαγµένο από µεγάλα σωµατίδια. Εάν υπάρχουν ακόµα µεγάλα σωµατίδια, αναµείξτε το εναιώρηµα και αφήστε το να σταθεί επί 1 ώρα επιπλέον. Μεταφέρετε το υπερκείµενο σε αποστειρωµένο δοχείο. (8) Ρυθµίστε τη θολερότητα του εναιωρήµατος στο πρότυπο McFarland αρ. 1 προσθέτοντας αργά στείρο αραιωτικό µυκοβακτηριδίων. Ανακινήστε καλά. (9) ιανείµετε κλάσµατα του εναιωρήµατος σε φιαλίδια καταψύκτη, τα οποία φέρουν σήµανση µε την ταυτοποίηση του µικροοργανισµού που περιέχουν και την ηµεροµηνία παρασκευής. (10) Καταψύξτε τα εναιωρήµατα τοποθετώντας τα φιαλίδια σε καταψύκτη χαµηλής θερµοκρασίας στους -60 C. Τα φιαλίδια είναι δυνατό να φυλαχθούν επί 6 µήνες το πολύ. (11) Για τη χρήση, αφαιρέστε το κατεψυγµένο φιαλίδιο από τον καταψύκτη και αποψύξτε ταχέως το περιεχόµενο, τοποθετώντας το σωληνάριο σε υδατόλουτρο 30 έως 35 C. Αραιώστε έως τα 10 5 CFU/mL πριν από τη χρήση. Αναµείξτε καλά και ενοφθαλµίστε µε γραµµωτή επίστρωση το υλικό εξέτασης µε χρήση βαθµονοµηµένου κρίκου 0,01 ml. B. ιαδικασία για υλικό καλλιέργειας εξέτασης 1. Ενοφθαλµίστε αντιπροσωπευτικά δείγµατα µε τις καλλιέργειες που παρατίθενται παρακάτω. α. Βεβαιωθείτε ότι οι επιφάνειες του άγαρ είναι απαλλαγµένες από υγρασία πριν από τον ενοφθαλµισµό. β. Με χρήση αποστειρωµένων, αναλώσιµων βαθµονοµηµένων κρίκων 0,01 ml, ενοφθαλµίστε τα δοχεία της εξέτασης µε µυκοβακτηριδιακές καλλιέργειες που παρασκευάζονται όπως περιγράφεται παραπάνω. γ. Επωάστε όλα τα δοχεία µε ξεσφιγµένα καπάκια στους 35 ± 2 C, σε αερόβια ατµόσφαιρα, συµπληρωµένη µε διοξείδιο του άνθρακα. 2. Εξετάστε τα σωληνάρια µετά από 7, 14 και, εάν είναι απαραίτητο, 21 ηµέρες για το µέγεθος της ανάπτυξης και τον προσδιορισµό των αντιδράσεων. Για τη σωστή εκτέλεση της εξέτασης νιασίνης, µια καλλιέργεια πρέπει να έχει τουλάχιστον 50 έως 100 αποικίες. 3. Εκτέλεση της εξέτασης νιασίνης α. Στην κεκλιµένη καλλιέργεια, προσθέστε 1,0 ml ζωµού Middlebrook 7H9 µε Polysorbate 80. β. Παρακεντήστε την επιφάνεια της κεκλιµένης καλλιέργειας αρκετές φορές, έτσι ώστε το υγρό να έλθει σε επαφή µε το υλικό καλλιέργειας. Η νιασίνη, εάν υπάρχει, εκχυλίζεται από το υλικό καλλιέργειας και όχι από τη βακτηριδιακή ανάπτυξη. γ. Γείρετε τα σωληνάρια, έτσι ώστε ο ζωµός να καλύψει την κεκλιµένη καλλιέργεια. Αφήστε τα σωληνάρια να εκχυλιστούν επί 30 λεπτά. δ. Αφαιρέστε 0,6 ml του εκχυλίσµατος και τοποθετήστε τα σε ένα αποστειρωµένο σωληνάριο 12 mm x 75 mm. Προσθέστε 0,6 ml ζωµού Middlebrook 7H9 µε Polysorbate 80 σε ένα άλλο σωληνάριο 12 mm x 75 mm ως αρνητικό µάρτυρα. Προσθέστε 0,6 ml ζωµού σε ένα άλλο σωληνάριο 12 mm x 75 mm µαζί µε ένα δίσκο Taxo TB Niacin Test Control ως θετικό µάρτυρα. ε. Σε κάθε σωληνάριο από τα παραπάνω, προσθέστε µια ταινία Taxo TB Niacin Test Strip. Σφραγίστε ερµητικά το σωληνάριο αµέσως µετά την προσθήκη της ταινίας, επειδή το οξυγόνο επηρεάζει τα αποτελέσµατα. στ. Μετά από 12 έως 15 λεπτά (αλλά πριν από 30 λεπτά), εξετάστε το ζωµό σε κάθε σωληνάριο. Η εµφάνιση κίτρινου χρώµατος υποδηλώνει θετική εξέταση νιασίνης. Η απουσία εµφάνισης χρώµατος βαθµολογείται ως αρνητική εξέταση. 4. Αναµενόµενα αποτελέσµατα *Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC *Mycobacterium intracellulare Οµάδα ΙIΙ ATCC Θετικό = κίτρινο χρώµα *Συνιστώµενο στέλεχος µικροοργανισµού για ποιοτικό έλεγχο χρήστη. Αρνητικό = καµία χρωµατική µεταβολή 2

3 III ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 1. Εξετάστε τα σωληνάρια όπως περιγράφεται στην ενότητα Αλλοίωση του προϊόντος. 2. Εξετάστε οπτικά αντιπροσωπευτικά σωληνάρια για να βεβαιωθείτε ότι τυχόν υπάρχοντα φυσικά ελαττώµατα δεν παρεµβαίνουν στη χρήση. 3. Επωάστε τα µη ενοφθαλµισµένα αντιπροσωπευτικά σωληνάρια στους 20 έως 25 C και στους 30 έως 35 C και εξετάστε µετά από 7 ηµέρες για τυχόν µικροβιακή µόλυνση. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ IV ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ Το Seven H11 Agar with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate (Seven H11 Agar µε ασπαρτικό οξύ και πυροσταφυλικό νάτριο) χρησιµοποιείται στην αποµόνωση και την ταυτοποίηση µη χρωµογόνων µυκοβακτηριδίων, ειδικά του Mycobacterium tuberculosis. V ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Οι Middlebrook και Cohn βελτίωσαν τη σύνθεση του άγαρ ελαϊκού οξέος-αλβουµίνης και επέτυχαν ταχύτερη και πιο εκτεταµένη ανάπτυξη του είδους Mycobacterium στο υλικό καλλιέργειάς τους, το οποίο ονοµάστηκε 7H10. 1,2 Οι Cohn et al. τροποποίησαν τη σύνθεση του άγαρ 7H10 µε την προσθήκη ενός γραµµαρίου παγκρεατικού αφοµοιώµατος καζεΐνης ανά λίτρο, προκειµένου να ενισχυθεί η ανάπτυξη των στελεχών του Mycobacterium tuberculosis που παρατηρήθηκε ότι αναπτύσσονται ελάχιστα (ή και καθόλου) στο 7H10 και σε άλλα συµβατικά υλικά αποµόνωσης. 3 Η σύνθεση αυτή ονοµάζεται Seven H11 Agar. Το ασπαρτικό οξύ προστίθεται για τη βελτίωση του ρυθµού παραγωγής νιασίνης 4 και το πυροσταφυλικό νάτριο προστίθεται για τη βελτίωση της ανάπτυξης. VI ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το Seven H11 Agar περιέχει µια ποικιλία ανόργανων αλάτων που παρέχουν ουσίες που είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη των µυκοβακτηριδίων. Το κιτρικό νάτριο, όταν µετατρέπεται σε κιτρικό οξύ, χρησιµεύει για τη συγκράτηση ορισµένων ανόργανων κατιόντων στο διάλυµα. Η γλυκερόλη είναι µια πλούσια πηγή άνθρακα και ενέργειας. Το παγκρεατικό αφοµοίωµα της καζεΐνης είναι µια πλούσια πηγή αζώτου για την ανάπτυξη των βακίλλων της φυµατίωσης και παρέχει διάφορους επιπλέον παράγοντες ανάπτυξης. Το ελαϊκό οξύ, καθώς και άλλα λιπαρά οξέα µακράς αλυσίδας, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν από βακίλλους της φυµατίωσης και διαδραµατίζουν ένα σηµαντικό ρόλο στο µεταβολισµό των µυκοβακτηριδίων. Η πρωτογενής επίδραση της αλβουµίνης είναι η προστασία των βακίλλων της φυµατίωσης από τοξικούς παράγοντες και, εποµένως, ενισχύει την ανάκτησή τους σε πρωτογενή αποµόνωση. Μερική αναστολή των βακτηριδίων επιτυγχάνεται µε την παρουσία της χρωστικής πράσινου του µαλαχίτη. Το πυροσταφυλικό νάτριο είναι ένα διεγερτικό της ανάπτυξης. Το ασπαρτικό οξύ συµπεριλαµβάνεται στη σύνθεση για την ενίσχυση της αντίδρασης παραγωγής νιασίνης. Όλα τα µυκοβακτηρίδια παράγουν νικοτινικό οξύ (νιασίνη). Εξαιτίας µιας αποκλεισµένης µεταβολικής οδού για τη µετατροπή της ελεύθερης νιασίνης σε µονονουκλεοτίδιο νικοτινικού οξέος, το M. tuberculosis συσσωρεύει τη νιασίνη και την απεκκρίνει στο υλικό καλλιέργειας, µια λειτουργία που το διαφοροποιεί από τα περισσότερα άλλα µυκοβακτηριδιακά είδη. 4 VII ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Seven H11 Agar with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate Σύνθεση* κατά προσέγγιση ανά λίτρο κεκαθαρµένου νερού Παγκρεατικό αφοµοίωµα της καζεΐνης... 1,0 g Θειικό µαγνήσιο... 0,05 g Κιτρικό σιδηρο(ιιι) αµµώνιο 0,04 g Κιτρικό νάτριο... 0,4 g Θειικό αµµώνιο... 0,5 g Γλουταµινικό µονονάτριο... 0,5 g Φωσφορικό δινάτριο... 1,5 g Φωσφορικό µονοκάλιο... 1,5 g Ασπαρτικό οξύ... 1,0 g Πυροσταφυλικό νάτριο... 5,0 g Άγαρ... 13,5 g Χλωριούχο νάτριο.. 0,85 g εξτρόζη... 2,0 g Βόεια αλβουµίνη V... 5,0 g Καταλάση... 3,0 mg Πυριδοξίνη... 1,0 mg 3

4 Θειικός ψευδάργυρος... 1,0 mg Θειικός χαλκός... 1,0 mg Βιοτίνη... 0,5 mg Χλωριούχο ασβέστιο... 0,5 mg Πράσινο του µαλαχίτη 0,25 mg Ελαϊκό οξύ.. 0,06 ml Γλυκερόλη... 5,0 ml *Ρυθµισµένο ή/και συµπληρωµένο όπως απαιτείται, έτσι ώστε να πληρούνται τα κριτήρια απόδοσης. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. Τα σωληνάρια µε σφιγµένα καπάκια θα πρέπει να ανοίγονται προσεκτικά για την αποφυγή τυχόν τραυµατισµού λόγω θραύσης του γυαλιού. Σε κλινικά δείγµατα ενδέχεται να υπάρχουν παθογόνοι µικροοργανισµοί, συµπεριλαµβανοµένων των ιών της ηπατίτιδας και του ιού της ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου. Κατά το χειρισµό όλων των ειδών που είναι µολυσµένα µε αίµα και άλλα σωµατικά υγρά, θα πρέπει να ακολουθούνται οι Τυπικές προφυλάξεις 5-8 και οι κατευθυντήριες οδηγίες των ιδρυµάτων. Μετά τη χρήση, τα παρασκευασµένα σωληνάρια, τα δοχεία δείγµατος και άλλα µολυσµένα υλικά πρέπει να αποστειρώνονται σε αυτόκαυστο πριν από την απόρριψη. Για χειρισµούς κλινικών δειγµάτων που δεν παράγουν αερόλυµα, όπως παρασκευή επιχρισµάτων οξεάντοχων µικροοργανισµών, απαιτούνται πρακτικές και διαδικασίες, εξοπλισµός και εγκαταστάσεις περιορισµού βιοασφάλειας επιπέδου 2. Όλες οι δραστηριότητες που δηµιουργούν αερολύµατα πρέπει να διεξάγονται σε θάλαµο βιολογικής ασφάλειας τάξης I ή II. Για εργαστηριακές δραστηριότητες πολλαπλασιασµού και χειρισµού καλλιεργειών του M. tuberculosis και του M. bovis απαιτούνται πρακτικές, εξοπλισµός και εγκαταστάσεις περιορισµού βιοασφάλειας επιπέδου 3. Οι µελέτες µε πειραµατόζωα απαιτούν επίσης ειδικές διαδικασίες. 7 Οι εργαστηριακές διαδικασίες που ενέχουν µυκοβακτηρίδια απαιτούν ειδικό εξοπλισµό και τεχνικές για την ελαχιστοποίηση των βιολογικών κινδύνων. 4,9-11 είτε την ενότητα Παρασκευή βρωµιούχου κυανογόνου 10% (βήµα 2 της ενότητας ιαδικασία της εξέτασης, Παρασκευή των αντιδραστηρίων εξέτασης νιασίνης ) για επιπλέον προφυλάξεις. Οδηγίες φύλαξης Κατά την παραλαβή, φυλάσσετε τα σωληνάρια στο σκότος στους 2 8 C. Αποφεύγετε την κατάψυξη και την υπερβολική θέρµανση. Μην ανοίγετε έως ότου να είστε έτοιµοι για χρήση. Ελαχιστοποιήστε την έκθεση στο φως. Υλικά καλλιέργειας σε σωληνάρια, τα οποία φυλάσσονται σύµφωνα µε την επισήµανση έως ακριβώς πριν από τη χρήση, είναι δυνατό να ενοφθαλµιστούν έως την ηµεροµηνία λήξης και να επωάζονται για τους συνιστώµενους χρόνους επώασης. Αφήστε το υλικό καλλιέργειας να θερµανθεί σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τον ενοφθαλµισµό. Αλλοίωση των προϊόντων Μη χρησιµοποιείτε τα σωληνάρια εάν παρουσιάζουν ενδείξεις µικροβιακής µόλυνσης, αποχρωµατισµό, ξηρότητα ή άλλα σηµεία αλλοίωσης. VIII ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Για τη συλλογή δειγµάτων έχει επινοηθεί µια ποικιλία στειλεών και δοχείων. Τα δείγµατα θα πρέπει να λαµβάνονται πριν από τη χορήγηση αντιµικροβιακής θεραπείας. Πρέπει να λαµβάνονται µέτρα για την άµεση χορήγηση στο εργαστήριο. Συµβουλευτείτε τα κατάλληλα κείµενα για περισσότερες πληροφορίες. 11,12 IX ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Παρεχόµενο υλικό Seven H11 Agar Slants with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Βοηθητικά υλικά καλλιέργειας, αντιδραστήρια, µικροοργανισµοί ποιοτικού ελέγχου και εργαστηριακός εξοπλισµός, όπως απαιτείται. ιαδικασία της εξέτασης Εφαρµόζετε άσηπτες τεχνικές. Οι διαδικασίες εξέτασης είναι εκείνες που συνιστώνται από τα Centers for Disease Control and Prevention (CDC) για πρωτογενή αποµόνωση από δείγµατα που περιέχουν µυκοβακτηρίδια. Το 4

5 διάλυµα N-ακετυλ-L-κυστεΐνης-υδροξειδίου του νατρίου (NALC-NaOH) συνιστάται ως ήπιος, αλλά αποτελεσµατικός παράγοντας πέψης και απολύµανσης. Τα αντιδραστήρια αυτά παρέχονται στο BBL MycoPrep Mycobacterial Specimen Digestion/Decontamination Kit. Για λεπτοµερείς οδηγίες απολύµανσης και καλλιέργειας, συµβουλευτείτε τις κατάλληλες αναφορές. 4,9-11 Μετά τον ενοφθαλµισµό, διατηρείτε τα σωληνάρια προστατευµένα από το φως και τοποθετήστε τα σε κατάλληλο σύστηµα που παρέχει αερόβια ατµόσφαιρα εµπλουτισµένη µε διοξείδιο του άνθρακα. Επωάζετε στους 35 ± 2 C. Τα υλικά κεκλιµένης καλλιέργειας θα πρέπει να ενοφθαλµίζονται σε οριζόντιο επίπεδο, έως ότου απορροφηθεί το ενοφθάλµισµα. Τα σωληνάρια θα πρέπει να έχουν ξεσφιγµένα τα βιδωτά καπάκια τους για τις πρώτες 3 εβδοµάδες, έτσι ώστε να επιτρέπεται η κυκλοφορία του διοξειδίου του άνθρακα για την έναρξη της ανάπτυξης. Ακολούθως, για την πρόληψη της αφυδάτωσης, σφίξτε τα καπάκια και ξεσφίγγετέ τα για λίγο µία φορά την εβδοµάδα. Τοποθετήστε τα σωληνάρια σε όρθια θέση εάν δεν υπάρχει επαρκής διαθέσιµος χώρος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Καλλιέργειες από δερµατικές βλάβες για τις οποίες υπάρχει υποψία ότι είναι M. marinum ή M. ulcerans θα πρέπει να επωάζονται στους 25 έως 33 C για πρωτογενή αποµόνωση. Καλλιέργειες για τις οποίες υπάρχει υποψία ότι περιέχουν M. avium ή M. xenopi εµφανίζουν βέλτιστη ανάπτυξη στους 40 έως 42 C. 4 Επωάστε µια καλλιέργεια εις διπλούν στους 35 έως 37 C. Παρασκευή αντιδραστηρίων εξέτασης νιασίνης** 4 1. Παρασκευή ανιλίνης 4%: Σε 96 ml αιθυλικής αλκοόλης 95%, προσθέστε 4,0 ml άχρωµης ανιλίνης. Φυλάσσετε σε καφέ φιάλη στους 2 έως 8 C. Εάν το διάλυµα γίνει κίτρινο, απορρίψτε το και παρασκευάστε φρέσκο διάλυµα. 2. Παρασκευή βρωµιούχου κυανογόνου 10% ΠΡΟΣΟΧΗ: Οι ατµοί του βρωµιούχου κυανογόνου είναι ιδιαίτερα ερεθιστικοί και πολύ δηλητηριώδεις. Οι χειρισµοί για την παρασκευή του διαλύµατος πρέπει να γίνονται σε απαγωγό χηµικών αναθυµιάσεων και για την εξέταση καλλιεργειών σε θάλαµο βιολογικής ασφάλειας. 4 ΤΟ ΒΡΩΜΙΟΥΧΟ ΚΥΑΝΟΓΟΝΟ ΣΧΗΜΑΤΙΖΕΙ ΗΛΗΤΗΡΙΩ ΕΣ ΑΕΡΙΟ ΚΥΑΝΙΟ ΕΑΝ ΕΛΘΕΙ ΣΕ ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΟΞΥ. 12 ΑΠΟΡΡΙΠΤΕΤΕ ΤΙΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΝΙΑΣΙΝΗΣ ΣΕ ΜΙΚΡΟΒΙΟΚΤΟΝΟ ΙΑΛΥΜΑ ΠΟΥ ΕΧΕΙ ΜΕΤΑΤΡΑΠΕΙ ΣΕ ΑΛΚΑΛΙΚΟ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ Υ ΡΟΞΕΙ ΙΟΥ ΤΟΥ ΝΑΤΡΙΟΥ. ιαλύστε 5 g βρωµιούχου κυανογόνου σε 50,0 ml κεκαθαρµένου νερού. Φυλάσσετε σε ερµητικά σφραγισµένη καφέ φιάλη στους 2 έως 8 C. Εάν σχηµατιστεί ίζηµα κατά την ψύξη, θερµάνετε σε θερµοκρασία δωµατίου για να το διαλύσετε. Παρασκευάζετε σε µικρές ποσότητες επειδή το αντιδραστήριο είναι πτητικό και το διάλυµα χάνει την ισχύ του. Τα ασθενή διαλύµατα ενδέχεται να δώσουν ψευδώς αρνητικές µετρήσεις. **Συνιστάται για χρήση το BBL Taxo TB Niacin Test Strip αντί της παρασκευής των αντιδραστηρίων εξέτασης στο εργαστήριο (ταινίες εξέτασης, αρ. κατ , Taxo TB Niacin Test Control, αρ. κατ ). Ακολουθήστε τις οδηγίες του προϊόντος. Ποιοτικός έλεγχος χρήστη είτε την ενότητα ιαδικασίες ποιοτικού ελέγχου. Πρέπει να τηρούνται οι απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου σύµφωνα µε τους ισχύοντες τοπικούς, πολιτειακούς ή/και οµοσπονδιακούς κανονισµούς ή τις απαιτήσεις πιστοποίησης και τις πρότυπες διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου του εργαστηρίου σας. Συνιστάται ο χρήστης να ανατρέχει στις σχετικές κατευθυντήριες οδηγίες του CLSI και τους κανονισµούς του CLIA για τις κατάλληλες πρακτικές ποιοτικού ελέγχου. X ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4 Εξετάζετε όλα τα µη χρωµογόνα µυκοβακτηρίδια για την παραγωγή νιασίνης (βλέπε ενότητα II, B., 3. παραπάνω). Μόνο τα τραχεία µη χρωµογόνα στελέχη πρέπει να εξετάζονται για τη νιασίνη. Μια καλλιέργεια πρέπει να έχει τουλάχιστον αποικίες µε ανάπτυξη ηλικίας 3 έως 4 εβδοµάδων. Το M. tuberculosis και το πιο σπάνιο M. simiae είναι συνήθως θετικά στη νιασίνη. Τα περισσότερα άλλα µυκοβακτηρίδια είναι αρνητικά στη νιασίνη. 5

6 XI ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Μερικά στελέχη του M. simiae, τα BCG και άλλα µυκοβακτηρίδια συσσωρεύουν επίσης νιασίνη. Για την επιβεβαίωση της ταυτότητας του M. tuberculosis, συνιστάται η εκτέλεση εξετάσεων αναγωγής των νιτρικών και εξετάσεων καταλάσης στους 68 C. 4,11 XII ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Πριν από τη διάθεσή τους, όλες οι παρτίδες των Seven H11 Agar Slants with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate εξετάζονται ως προς τα χαρακτηριστικά απόδοσής τους. Με χρήση βαθµονοµηµένου κρίκου του 0,01 ml, αντιπροσωπευτικά δείγµατα της παρτίδας ενοφθαλµίζονται µε γραµµωτή επίστρωση µε καλλιέργειες που έχουν αραιωθεί για να περιέχουν 10 5 µονάδες σχηµατισµού αποικιών (CFU) ανά ml Mycobacterium intracellulare οµάδας III (ATCC 13950) και M. tuberculosis (ATCC 25177). Μετά τον ενοφθαλµισµό, τα σωληνάρια επωάζονται µε ξεσφιγµένα καπάκια στους 35 ± 2 C σε ατµόσφαιρα συµπληρωµένη µε 5 έως 10% διοξείδιο του άνθρακα. Τα σωληνάρια παρατηρούνται για ανάπτυξη µετά από 7, 14 και 21 ηµέρες επώασης. Μετά την επίτευξη επαρκούς ανάπτυξης (τουλάχιστον 50 έως 100 αποικίες), οι καλλιέργειες εξετάζονται για την παραγωγή νιασίνης µε χρήση των Taxo TB Niacin Test Strips. Το M. tuberculosis είναι θετικό για την παραγωγή νιασίνης, όπως υποδεικνύεται από το κίτρινο χρώµα που εµφανίζεται στον εκχυλισµένο ζωµό. Το M. intracellulare είναι αρνητικό (δηλ. ο ζωµός παραµένει άχρωµος). XIII ΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ Αρ. κατ. Περιγραφή BBL Seven H11 Agar Slants with Aspartic Acid and Sodium Pyruvate, συσκευασία των 10 σωληναρίων, µεγέθους A XIV ΑΝΑΦΟΡΕΣ = = = NK= OK= PK= QK= RK== SK== TK== UK== VK== jáççäéäêççâi=dki=~åç=jkik=`çüåk=nvruk=_~åíéêáçäçöó=çñ=íìäéêåìäçëáëw=ä~äçê~íçêó=ãéíüççëk=^ãk=gk=mìääáå=eé~äíük== QUWUQQJURPK= jáççäéäêççâi=dki=jkik=`çüåi=tkbk=aóéi=tk_k=oìëëéääi=gêki=~åç=ak=iéîók=nvsmk=jáåêçäáçäçöáå=éêçåéçìêéë=çñ=î~äìé=áå= íìäéêåìäçëáëk=^åí~=qìäéêåk=på~åçk=puwssjunk= `çüåi=jkiki=okck=t~ööçåéêi=~åç=gkhk=jå`ä~íåüók=nvsuk=qüé=tenn=ãéçáìã=ñçê=íüé=åìäíáî~íáçå=çñ=ãóåçä~åíéêá~k=^ãk= oéîk=oéëék=aáëk=vuwovrjovsk= héåíi=mkqki=~åç=dkmk=hìäáå~k=nvurk=mìääáå=üé~äíü=ãóåçä~åíéêáçäçöów=~=öìáçé=ñçê=íüé=äéîéä=fff=ä~äçê~íçêók=rpaeepk= `ÉåíÉêë=Ñçê=aáëÉ~ëÉ=`çåíêçäI=^íä~åí~K= k~íáçå~ä=`çããáííéé=ñçê=`äáåáå~ä=i~äçê~íçêó=pí~åç~êçëk=ommnk==^ééêçîéç=dìáçéäáåé=jovj^ok=mêçíéåíáçå=çñ= ä~äçê~íçêó=ïçêâéêë=ñêçã=çååìé~íáçå~ääó=~åèìáêéç=áåñéåíáçåëi=oåç=éçk=k``ipi=t~óåéi=m~k= d~êåéêi=gkpk=nvvsk=eçëéáí~ä=fåñéåíáçå=`çåíêçä=mê~åíáåéë=^çîáëçêó=`çããáííééi=rkpk=aéé~êíãéåí=çñ=eé~äíü=~åç=eìã~å= péêîáåéëi=`éåíéêë=ñçê=aáëé~ëé=`çåíêçä=~åç=mêéîéåíáçåk=dìáçéäáåé=ñçê=áëçä~íáçå=éêéå~ìíáçåë=áå=üçëéáí~äëk==fåñéåík= `çåíêçä=eçëéáí~ä=béáçéãáçäk=ntwrpjumk= rkpk=aéé~êíãéåí=çñ=eé~äíü=~åç=eìã~å=péêîáåéëk=nvvvk=_áçë~ñéíó=áå=ãáåêçäáçäçöáå~ä=~åç=äáçãéçáå~ä=ä~äçê~íçêáéëi= eep=mìääáå~íáçå=e`a`fi=qíü=éçk=rkpk=dçîéêåãéåí=mêáåíáåö=lññáåéi=t~ëüáåöíçåi=ak`k= aáêéåíáîé=ommmlrqlb`=çñ=íüé=bìêçéé~å=m~êäá~ãéåí=~åç=çñ=íüé=`çìååáä=çñ=nu=pééíéãäéê=ommm=çå=íüé=éêçíéåíáçå=çñ= ïçêâéêë=ñêçã=êáëâë=êéä~íéç=íç=éñéçëìêé=íç=äáçäçöáå~ä=~öéåíë=~í=ïçêâ=eëéîéåíü=áåçáîáçì~ä=çáêéåíáîé=ïáíüáå=íüé= ãé~åáåö=çñ=^êíáåäé=nsenf=çñ=aáêéåíáîé=uvlpvnlbb`fk==lññáåá~ä=gçìêå~ä=iosoi=ntlnmlommmi=ék=mmonjmmqrk= `ÉêåçÅÜI=mKiKI=oKhK=bååëI=jK^K=p~ìÄçääÉI=~åÇ=oKgK=t~ää~ÅÉI=gêK=NVVQK=`ìãáíÉÅÜ=NS^I=i~Äçê~íçêó=Çá~Öåçëáë=çÑ=íÜÉ= ãóåçä~åíéêáçëéëk=`ççêçáå~íáåö=éçki=^kpk=téáëëñéäçk=^ãéêáå~å=pçåáéíó=ñçê=jáåêçäáçäçöói=t~ëüáåöíçåi=ak`k= NMK== cçêäéëi=_k^ki=akck=p~üãi=~åç=^kpk=téáëëñéäçk=ommok=_~áäéó=c=påçíídë=çá~öåçëíáå=ãáåêçäáçäçöói=nníü=éçk=jçëäói=fååki= pík=içìáëk= NNK== jéíåüçåâi=_kdki=ckpk=kçäíéi=~åç=okgk=t~ää~åéi=gêk=nvvvk=jóåçä~åíéêáìãi=ék=pvvjqptk=få=mkok=jìêê~ói=bkgk=_~êçåi=jk^k= mñ~ääéêi=ck`k=qéåçîéêi=~åç=okekvçäâéå=eéçkfi=j~åì~ä=çñ=åäáåáå~ä=ãáåêçäáçäçöói=tíü=éçk=^ãéêáå~å=pçåáéíó=ñçê= jáåêçäáçäçöói=t~ëüáåöíçåi=ak`k= NOK= iìíòi=_k=nvvok=fçéåíáñáå~íáçå=íéëíë=ñçê=ãóåçä~åíéêá~k=m~êí=si=ká~åáå=~ååìãìä~íáçåi=ék=pknoknnjpknoknqk=få=ekak= fëéåäéêö=eéçkfi=`äáåáå~ä=ãáåêçäáçäçöó=éêçåéçìêéë=ü~åçäççâi=îçäknk=^ãéêáå~å=pçåáéíó=ñçê=jáåêçäáçäçöói=t~ëüáåöíçåi= ak`k= _ÉÅíçåI=aáÅâáåëçå=~åÇ=`çãé~åó=================================== == _bkbu=iáãáíéç= T=içîÉíçå=`áêÅäÉ= = = = _~ó=h=n~lçi=pü~ååçå=fåçìëíêá~ä=bëí~íé= pé~êâëi=j~êóä~åç=onnro=rp^= = = pü~ååçåi=`çìåíó=`ä~êéi=fêéä~åç= UMMJSPUJUSSP= = = = qéäw=prpjsnjqtjovjom= = = = = = = c~ñw=prpjsnjqtjorjqs= ^q``=áë=~=íê~çéã~êâ=çñ=íüé=^ãéêáå~å=qóéé=`ìäíìêé=`çääéåíáçåk== _ai=_a=içöçi= ii=jóåçmêéé=~åç=q~ñç=~êé=íê~çéã~êâë=çñ=_éåíçåi=aáåâáåëçå=~åç=`çãé~åók=«omms=_a= 6