ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό επιχειρείται μια εισαγωγή στις περισσότερο χρησιμοποιούμενες μεθόδους ηλεκτροφόρησης στη κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική. Οι τεχνικές ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για το διαχωρισμό μακρομορίων, όπως οι πρωτεΐνες, οι λιποπρωτεΐνες, τα ένζυμα και τα ισοένζυμά τους κ.α. και στη συνέχεια για τον υπολογισμό των επιμέρους κλασμάτων με σκοπό την άμεση ή έμμεση διάγνωση νοσολογικών καταστάσεων. Περιγράφονται αναλυτικά αρκετές βασικές τεχνικές ηλεκτροφόρησης, αλλά γίνεται αναφορά και σε πιο εξειδικευμένες και σύγχρονες τεχνικές, όπως η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση. Τέλος, επισημαίνεται η χρησιμότητα των τεχνικών αυτών στην κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική. Προαπαιτούμενες γνώσεις Το πέμπτο κεφάλαιο του βιβλίου βασίζεται σε βασικές γνώσεις βιοχημείας και κλινικής χημείας. Θα χρειαστούν βασικές γνώσεις όσον αφορά τα βιολογικά μακρομόρια. 5.1 Η ηλεκτροφόρηση ως βασική μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μία τεχνική διαχωρισμού και εν συνεχεία προσδιορισμού μίγματος ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους, όπως π.χ. πρωτεϊνών, λιποπρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA), ενζύμων και ισοενζύμων ή μορίων με μικρότερο μοριακό βάρος, όπως πεπτίδια ή ακόμη και μίγματος ουσιών με μικρό μοριακό βάρος, όπως π.χ. αμινοξέα, βάσεις κ.α. Εφαρμόζεται ακόμη και σε περιπτώσεις κυττάρων. Με λίγα λόγια μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιαδήποτε δείγμα περιέχει χημικές ενώσεις που φέρουν φορτίο. Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται (Καρκαλούσος, 2012): Α) για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό μορίων ποικίλου μοριακού βάρους ενός μίγματος, Β) για τον προσδιορισμό μοριακού βάρους, Γ) για τον προσδιορισμό της καθαρότητας ενός δείγματος, Δ) για την απομόνωση, τον καθαρισμό και χαρακτηρισμό ουσιών, π.χ. πρωτεϊνών, κ.α. Η ηλεκτροφόρηση βρίσκει εφαρμογές στην βιοχημεία και κλινική χημεία, στην μοριακή βιολογία, στην φαρμακολογία και τοξικολογία, στην εγκληματολογία και άλλες επιστήμες. Η ηλεκτροφόρηση είναι απλή, φθηνή και εύκολα εφαρμόσιμη τεχνική, θεμελιώδες εργαλείο στην μοριακή βιολογία και στην εργαστηριακή διαγνωστική ιατρική. 5.2 Οι βασικές αρχές της Ηλεκτροφόρησης Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μια μέθοδο διαχωρισμού (Σχήμα 5.1), κατά την οποία φορτισμένα μόρια (π.χ. πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα) μετακινούνται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου στο εσωτερικό πηκτών ή διαλυμάτων. Διαφορετικά μόρια κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες και τα συστατικά ενός μίγματος διαχωρίζονται εάν βρεθούν μέσα σε κατάλληλο ηλεκτρικό πεδίο. 1

2 Ηλεκτροφόρηση αμινοξέων επί χάρτου Άνοδος Κάθοδος Animation 5.1 H διαδικασία της ηλεκτροφόρησης. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των φορτισμένων μορίων εξαρτάται κυρίως από (Λιανίδου, 2015ˑ Νταλαμάγκα, 2015): Το καθαρό φορτίο: αρνητικά φορτισμένα μόρια (ανιόντα) μετακινούνται προς την άνοδο (+), ενώ θετικά φορτισμένα μόρια (κατιόντα) μετακινούνται προς την κάθοδο (-). Τα μόρια που φέρουν υψηλό σθένος μετακινούνται γρηγορότερα προς το ηλεκτρόδιο με το αντίθετο φορτίο από μόρια με μικρότερο σθένος. Το μέγεθος: η αντίσταση (λόγω της τριβής) που υφίστανται τα μόρια που κινούνται μέσα σε ένα διάλυμα ή μία πηκτή, έχει ως συνέπεια τα μικρά μόρια να κινούνται γρηγορότερα από τα μεγάλα. Το σχήμα: η τριβή επηρεάζεται από το σχήμα του μορίου, με αποτέλεσμα η κινητικότητα να είναι διαφορετική ανάμεσα σε σφαιρικές και ινώδεις πρωτεΐνες ή ανάμεσα σε γραμμικό και κυκλικό DNA. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου: όσο αυξάνεται η τάση του πεδίου, τόσο αυξάνεται και η κινητικότητα. Όμως, υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί στη χρήση υψηλής τάσης, έτσι ώστε να μην αναπτυχθούν θερμικά φαινόμενα Παράγοντες που επηρεάζουν την τεχνική της Ηλεκτροφόρησης Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την τεχνική της ηλεκτροφόρησης (Πίνακας 5.1) είναι: το ph, η ιοντική ισχύς, η ιοντική σύσταση, η ένταση, η θερμοκρασία, ο χρόνος και το υπόστρωμα. Παράγοντες ph Ιοντική ισχύς Ιοντική σύσταση Ένταση Θερμοκρασία Χρόνος Υπόστρωμα Επίδραση Τροποποίηση φορτίου πρωτεϊνών και αποτελεσματικής κίνησης. Σπάνια επηρεάζει τη δομή και οδηγεί σε μετουσίωση. Τροποποίηση ισχύος και έντασης. Με την αύξηση της ιοντικής ισχύος μειώνεται η κινητικότητα και αυξάνεται η έκλυση θερμότητας. Κινητικότητα μορίων Κατά κανόνα η κινητικότητα είναι ανάλογη της έντασης. Προκαλεί εκτροπή των κλασμάτων. Η υψηλή θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει μετουσίωση των πρωτεϊνών, ενώ η χαμηλή θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει διήθηση, αλλά δεν μεταβάλει τον διαχωρισμό. Ο διαχωρισμός αυξάνει με το χρόνο, αλλά παρατηρείται διήθηση των κλασμάτων. Το μέγεθος των πόρων επηρεάζει την ταχύτητα της κινητικότητας των συστατικών Πίνακας 5.1 Παράγοντες που επηρεάζουν την ηλεκτροφόρηση. 2

3 Animation 5.2 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών με βάση το μοριακό βάρος Τα Υποστρώματα της Ηλεκτροφόρησης Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση είναι αδρανή υλικά και μπορούν να είναι επίπεδα, κυλινδρικά ή σε μορφή σφαιριδίων (πηκτή με πόρους). Στην περίπτωση των επίπεδων πηκτών επιτυγχάνεται η εισαγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων δείγματος, ενώ οι κυλινδρικές πηκτές εμφανίζουν μεγαλύτερη ευαισθησία. Ως υπόστρωμα μπορεί να χρησιμοποιηθούν τα παρακάτω: πηκτή αγαρόζης, πηκτή αμύλου, πηκτή πολυακρυλαμιδίου, οξική κυτταρίνη, διηθητικό χαρτί ή χαρτί Whatman. Πηκτή αγαρόζης Είναι διαυγής και επιτρέπει την μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των ζωνών. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και DNA (Πίνακας 5.4). Το άγαρ είναι πολυσακχαρίτης (σύσταση: όξινη καρραγενάση και ουδέτερη αγαρόζη [D-γαλακτόζη και 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζη]). Πηκτές αγαρόζης σε μορφή σφαιριδίων, συγκέντρωσης 2-10%, ονομάζονται Sepharose (Pharmacia, LKB, π.χ. Sepharose 4B είναι πηκτή 4% σε αγαρόζη) και διατίθενται σε διάφορες ενεργοποιημένες μορφές. Πηκτή αμύλου Χρησιμοποιείται για την ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. 3

4 Το άμυλο είναι πολυσακχαρίτης και βρίσκεται σε μορφή μίγματος διαλυτής αμυλόζης (20%) και αδιάλυτης αμυλοπηκτίνης (80%). Μερική υδρόλυση της αμυλοπηκτίνης οδηγεί σε μίγμα ολιγοσακχαριτών, τις δεξτρίνες. Οι δεξτρίνες με επιχλωροϋδρίνη (C 3H 5OCl) παρέχουν το υλικό Sephadex (εμπορική ονομασία), το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως ως υλικό πλήρωσης χρωματογραφικών στηλών και ως υλικό ακινητοποίησης (ηλεκτροφόρηση), μετά την ενεργοποίηση του με BrCN. Πηκτή πολυακρυλαμιδίου Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων (Πίνακας 5.4). Συνθετικά πολυμερή, όπως τα συμπολυμερή διαφόρων υδρόφιλων ακρυλικών μονομερών (ακρυλικού οξέος, ακρυλαμιδίου, μεθακρυλικού οξέος) χρησιμοποιούνται ως υλικά ακινητοποίησης, π.χ. παράγωγα του πολυακρυλαμιδίου διατίθενται με διάφορες εμπορικές ονομασίες όπως: 1. Bio-Gel CM (ακρυλαμίδιο/ακρυλικό οξύ), 2. Bio-Gel P (ακρυλαμίδιο/ν,ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο), 3. Enzaryl AA (ακρυλαμίδιο/p-νιτροακρυλαμίδιο/ν,ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο), 4. Enzaryl AH (ακρυλαμίδιο/n-ακρυλοϋλο-ν -t-βουτυλοξυκαρβονυλο-υδραζίνη). Το πήκτωμα του πολυακρυλαμιδίου είναι ουδέτερο, τρισδιάστατο πλέγμα υδρογονανθράκων συνδεδεμένων με μεθυλενομάδες. Προκύπτει από το πολυμερισμό δύο συστατικών: α) των μονομερών ακρυλαμιδίου (MBA) και β) του Ν,Ν1-μεθυλενο-bis-ακρυλαμιδίου (ή απλώς bis), το οποίο παίζει συνεκτικό ρόλο στο πήκτωμα. Η αντίδραση πολυμερισμού γίνεται με την προσθήκη υπερθειϊκού αμμωνίου (ammoniumpersulfate, APS) και του Ν,Ν,Ν1Ν1,-τετραμεθυλεθυλενοδιαμίνης (TEMED) (Σχήμα 5.1). Το μέγεθος των πόρων του πλέγματος που σχηματίζεται κυμαίνεται με βάση τα παρακάτω: Την ολική συγκέντρωση ακρυλαμίδης (%Τ) και ΜΒΑ (%C, crosslinker) και τη σχετική συγκέντρωση της ΜΒΑ ως προς την ακρυλαμίδη. Τα πηκτώματα με μικρή συγκέντρωση πολυακρυλαμίδης έχουν μεγαλύτερους πόρους και το αντίστροφο. Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιβραδύνουν τη μετανάστευση των πρωτεϊνών περίπου ανάλογα με το λόγο φορτίου προς μάζα. Χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες ηλεκτροφορήσεις (Σχήμα 5.2) εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη και μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε σε συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς αυτή. Οξική κυτταρίνη Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών. Η κυτταρίνη είναι πολυσακχαρίτης και αποτελείται από πλήθος μορίων γλυκόζης συνδεδεμένα με (1,4)-β-γλυκοζιτικούς δεσμούς. Κάθε μόριο γλυκόζης έχει τρία ελεύθερα υδροξύλια. Κατά τη μερική ή ολική νίτρωση (HNO 3/H 2SO 4) ή ακετυλίωση (οξικός ανυδρίτης/h 2SO 4) της κυτταρίνης, λαμβάνονται τα παράγωγα της (τρι-)νιτρικής ή (τρι-)οξικής κυτταρίνης, τα οποία σε μορφή μεμβρανών χρησιμοποιούνται ευρέως για την ακινητοποίηση βιομορίων (ηλεκτροφόρηση) ή ως φράγματα διάχυσης. Διηθητικό χαρτί ή χαρτί Whatman Εμφανίζει φαινόμενα προσρόφησης ουσιών και για το λόγο αυτό δεν χρησιμοποιείται. 4

5 Σχήμα 5.1 Η χημική δομή του πυκτώματος ακριλαμίδης. Σχήμα 5.2 Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου. 5

6 5.2.3 Χρώση κλασμάτων Η χρώση των διαχωρισθέντων κλασμάτων (ζωνών) αποτελεί σημαντικό στάδιο των ηλεκτροφορητικών τεχνικών (Πίνακας 5.2). Η χρώση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ένα στάδιο ή διαδοχικά σε πολλά στάδια, με τη χρήση δύο ή και περισσοτέρων χρωστικών. Οι χρωστικές μπορεί να είναι εξειδικευμένες, όπως π.χ. η νυνιδρίνη για τις αζωτούχες ομάδες των νουκλεϊκών οξέων, πρωτεϊνών, κ.α. Από την άλλη μεριά οι χρωστικές μπορεί να είναι εξειδικευμένες για πρωτεΐνες, γλυκοπρωτεϊνες, λιπίδια κ.α. Για τη χρώση των πρωτεϊνών ορού χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Amidoblack (απορρόφηση στα 640 nm), PonceauS (520 nm), Coomassie Brilliant Blue (595 nm), Bromophenol Blue (600 nm), Nigrosin (540 nm) κ.α. Για το διαχωρισμό ισοενζύμων: ενζυμικές αντιδράσεις με NADH ή NADPH, με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή φορμαζάνης (570 nm). Με τη χρήση της Coomassie Brilliant Blue μπορεί να ανιχνευθεί 1 μg πρωτεΐνης σε συγκεκριμένο κλάσμα. Η χρώση όμως με νιτρικό άργυρο γίνεται 100 φορές πιο ευαίσθητη και μπορεί να ανιχνευτεί 1 ng πρωτεΐνης σε συγκεκριμένο κλάσμα. Για την χρώση και ανίχνευση των λιποπρωτεϊνών χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Oil Red O (520 nm), Sudan Black (600 nm), Sudan Red 7B (540 nm), κ.α. (Μακέδου, 2015). Ειδικά για ραδιοενεργά ιχνηθετημένα δείγματα η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια της αυτοραδιογραφίας. Βιομόρια Πρωτεΐνες Χρωστικές Περισσότερο χρησιμοποιούμενενες Λιγότερο χρησιμοποιούμε- Coomassi ebrilliant BlueR Amidoblack 250 PonceauS Νιτρικός άργυρος Bromophenol blue Nigrosin DNA Βρωμιούχο αιθίδιο Bromophenol blue Νιτρικός άργυρος Λιποπρωτεϊνες OilRed Ο SudanBlack Β PeriodicAcid Πίνακας 5.2 Παραδείγματα χρησιμοποιούμενων χρωστικών, ανά κατηγορία βιομορίων Καθήλωση και ανίχνευση των συστατικών μείγματος Για την καθήλωση και την ανίχνευση των συστατικών μείγματος χρησιμοποιούνται είτε άμεσες, είτε έμμεσες μέθοδοι. Έμμεση καθήλωση: στη περίπτωση αυτή χρησιμοποιούνται διάφορες χημικές αντιδράσεις, περισσότερο ή λιγότερο εξειδικευμένες για την ανίχνευση συστατικών, όπως η χρώση πρωτεϊνών και των συστατικών τους, ενζυμικές αντιδράσεις, κ.α. Άμεση καθήλωση: στη περίπτωση αυτή προσδιορίζονται οι φυσικές ιδιότητες των συστατικών και συγκεκριμένα: Α) Προσδιορισμός απορρόφησης στα 280 nm (τρυπτοφάνη, τυροσίνη, φαινυλαλανίνη), στα 220 nm, στα 210 nm, κ.λπ. Τα νουκλεϊκά οξέα απορροφούν πιο έντονα στα 260 nm. Σε περίπτωση που το πρωτεϊνικό δείγμα περιέχει και νουκλεϊκά οξέα, για το προσδιορισμό της πρωτεΐνης χρησιμοποιείται ο παρακάτω τύπος: Πρωτεΐνη (mg/ml) = 1,55 A 280 0,76 A 260 (Εξίσωση 5.3) Η μέθοδος αυτή είναι ιδιαίτερα απαραίτητη για πρωτεΐνες στα όρια του 0,5 έως 1,5 mg/ml. Β) Άμεσος προσδιορισμός με φθορισμό. Η μέθοδος είναι χιλιάδες φορές πιο ευαίσθητη από την φασματοφωτομετρία και την χρωματομετρία. Γ) Προσδιορισμός του δείκτη διάθλασης του εκάστοτε συστατικού. 6

7 5.2.5 Πυκνομετρία (densitometry) Η πυκνομετρία αποτελεί μία από τις μεθόδους για την ποσοτική εκτίμηση των συστατικών της ηλεκτροφορητικής τεχνικής (Σχήμα 5.3). Συνήθως τα χρωματισμένα και στεγνά των ηλεκτροφορημάτων των πρωτεϊνών αναλύονται με πυκνομετρική ανάλυση της μεμβράνης ή της πηκτής. Με τη μέθοδο αυτή η ποσότητα κάθε κλάσματος μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της απορρόφησης. Συνεπώς, η συγκέντρωση του κάθε κλάσματος πρέπει να είναι ευθέως ανάλογη της απορρόφησης. Σχήμα 5.3 Διαγραμματική απεικόνιση λειτουργίας πυκνόμετρου Εργαστηριακά όργανα και σκεύη Ηλεκτροφόρησης Για τις περισσότερες τεχνικές ηλεκτροφόρησης απαιτούνται τα παρακάτω όργανα και σκεύη (Kaplan et al., 2003ˑ Δημητριάδης, 2015): τροφοδοτικό, λουτρό ηλεκτροφόρησης, ηλεκτρόδια, υπόστρωμα, διηθητικό χαρτί (Watmann), διαλύτες, απορρυπαντικά μετουσίωσης πρωτεϊνών (SDS, Urea. LithiumDodecylSulfate, BRij 35, CHAPSO, κ.α. χτενάκια (Applicator - για την εναπόθεση του δείγματος, συνήθως 1-10 μl, παράλληλα με το δείγμα φορτώνεται μάρτυρας και πρότυπο), λουτρό χρωματισμού και αποχρωματισμού σταθεροποίησης, επιφανειακά ηλεκτρόδια, υπολογιστής, ph-μετρο, ρυθμιστές θερμοκρασίας, δείκτες ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, 7

8 δείκτες για πρότυπα και μάρτυρες Το βιολογικό δείγμα Στις τεχνικές ηλεκτροφόρησης μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλά και διαφορετικά δείγματα ποικίλης προέλευσης, π.χ. ορός, εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ούρα. Επίσης πλάσμα, πλευριτικό υγρό, αλλά και βιοψίες από ιστούς, σπανίως και ομάδες κυττάρων. Ανάλογα με την τεχνική ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιείται και την συγκέντρωση πρωτεϊνών του δείγματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί φυσικό ή προκαταβολικά επεξεργασμένο βιολογικό δείγμα Διαχωριστική ικανότητα - τεχνικές ηλεκτροφόρησης Η διαχωριστική ικανότητα είναι η δυνατότητα της μεθόδου να διαχωρίσει το μίγμα ουσιών σε όσο το δυνατόν περισσότερα κλάσματα. Τα είδη των τεχνικών ηλεκτροφόρησης διακρίνονται με βάση την διαχωριστική τους ικανότητα, η οποία είναι συνάρτηση των παρακάτω παραγόντων: υποστρώματος, ph του διαλύματος, έντασης και της ισχύος, θερμοκρασίας στο δοχείο ηλεκτροφόρησης, τρόπου χρώσης εμφάνισης των κλασμάτων (ζωνών) και του προσδιορισμού τους, κινητικότητα των ουσιών του μίγματος, κ.α. Κατά την εφαρμογή του ηλεκτρικού πεδίου τα λιγότερα ευκίνητα ιόντα ακολουθούν τα περισσότερο ευκίνητα και για το λόγο αυτό, για τα λιγότερο ευκίνητα εφαρμόζεται πιο μεγάλη ισχύς. Ειδικά οι πρωτεΐνες έχουν μέση κινητική ικανότητα, δηλαδήενδιάμεση μεταξύ των πιο ευκίνητων και των λιγότερο ευκίνητων ιόντων και για αυτό τον λόγο ο διαχωρισμός τους εξαρτάται από τη συγκέντρωση και το φορτίο Ταξινόμηση τεχνικών Ηλεκτροφόρησης Η ταξινόμηση των τεχνικών ηλεκτροφόρησης πραγματοποιείται με ποικίλα κριτήρια, όπως το είδος του υποστρώματος, τη διάταξη της πηκτής, το σχήμα της πηκτής, την ποσότητα του δείγματος, τις συνθήκες στις οποίες πραγματοποιείται η τεχνική, κ.α. (Πίνακας 5.3). Κριτήριο ταξινόμησης Είδος ηλεκτροφόρησης Αγαρόζης Είδος υποστρώματος Χάρτου Οξικής κυτταρίνης Διάταξη πηκτής Οριζόντια Κατακόρυφη Σχήμα πηκτής Επίπεδη Κυλινδρική Συνθήκες τεχνικής Μη αποδιατακτικκτική Αποδιατα- Ποσότητα δείγματος Παρασκευαστική Αναλυτική Πολυακρυλαμίδης Πηκτής αμύλου Οι κυριότερες τεχνικές ηλεκτροφόρησης είναι: ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου, τριχοειδής ηλεκτροφόρηση, δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, ισοηλεκτρική εστίαση. Πίνακας 5.3 Είδη τεχνικών ηλεκτροφόρησης. Στον Πίνακα 5.4. παρουσιάζονται τα βασικά είδη τεχνικών ηλεκτροφόρησης και τα μόρια ή κλάσματα που κατά κανόνα διαχωρίζονται με αυτές. 8

9 ηλεκτροφό- Είδος ρησης Διαχωρισμός Μορίων ή Κλασμάτων Πηκτής αγαρόζης Πρωτεΐνες ορού Ισοένζυμα (π.χ. LDH, ALP, CK, αιμοσφαιρινών, κ.α.) Πηκτής πολυακρυλαμιδίου Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ηλε- Δισδιάστατη κτροφόρηση Ισοηλεκτρική αση εστί- 9 Λιποπρωτεΐνες Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA) Πρωτεΐνες ορού Ισοενζύμα Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA) Πρωτεΐνες, Πεπτίδια Σάκχαρα Φαρμακευτικές Ουσίες Πρωτεΐνες Πρωτεΐνες Πίνακας 5.4 Είδη βασικών τεχνικών ηλεκτροφόρησης και διαχωρισμός μορίων/κλασμάτων. Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA), ολιγονουκλεοτιδίωνκαι Αλληλούχιση DNA Παρακάτω, παρουσιάζονται ορισμένα μόνο χαρακτηριστικά που αφορούν κάποιες από τις τεχνικές ηλεκτροφόρησης. 5.3 Τα χαρακτηριστικά ορισμένων τεχνικών Hλεκτροφόρησης Ηλεκτροφόρηση σε Oξική Κυτταρίνη και Nιτρική Kυτταρίνη Τα υλικά αυτά επιτρέπουν την ανάλυση πολύ μικρών δειγμάτων. Η χρώση του ηλεκτροφορήματος, όταν πρόκειται για χρώση πρωτεϊνών πάνω σε οξική κυτταρίνη, γίνεται συνήθως με PonceauS. Πλεονεκτήματα της η- λεκτροφόρησης σε κυτταρίνη (σε σχέση με το χαρτί) αποτελούν: η μεγαλύτερη ευαισθησία της μεθόδου, ο πιο ευδιάκριτος διαχωρισμός των ζωνών, η μικρότερη προσρόφηση των πρωτεϊνών, η μικρή παρατήρηση «ουράς» σε κάθε επιμέρους κλάσματος, κ.α Ηλεκτροφόρηση πηκτής Αγαρόζης Η αγαρόζη είναι ουδέτερος, καθαρός πολυσακχαρίτης και χρησιμεύει για το διαχωρισμό σχεδόν όλων των βιολογικών μακρομορίων με συγκεκριμένο ηλεκτρικό φορτίο. Υπάρχουν εξειδικευμένοι τύποι αγαρόζης, π.χ. για την ανοσοηλεκτροφόρηση ή για την παρασκευή στο εργαστήριο πηκτών, οι οποίες επιτρέπουν τον διαχωρισμό συστατικών στη βάση της διάχυσης και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των βιομορίων. Η αγαρόζη διαλύεται σε υδατόλουτρο και παραμένει υγρή σε θερμοκρασία έως 40 ο C. Ο χρωματισμός και ο αποχρωματισμός είναι εύκολες διαδικασίες. Το μέγεθος των πόρων και ο μοριακός ηθμός εξαρτώνται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις εξασφαλίζεται μικρότερο μέγεθος πόρων. Η συγκέντρωση της αγαρόζης κυμαίνεται συνήθως από 0,4 έως 4% (w/v). Το πάχος της πηκτής κυμαίνεται από 0,1 έως 5 mm. Το μέγεθος των πόρων συγκριτικά με την ακρυλαμίδη, είναι μεγαλύτερο. Το τελευταίο καθιστά την αγαρόζη περισσότερο χρήσιμη σε ανοσοηλεκτροφορητικές τεχνικές. Η διαύγεια της πηκτής μπορεί να βελτιωθεί με ξέπλυμα αυτής με 15% γλυκερόλης. Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για το διαχωρισμό πρωτεϊνών μεγάλου μοριακού βάρους, πρωτεϊνικών συμπλόκων και νουκλεϊκών οξέων ( βάσεων). Σήμερα χρησιμοποιούνται παραλλαγές της συγκεκριμένης ηλεκτροφόρησης, με σκοπό την αύξηση της διαχωριστικής της ικανότητας. Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα αγαρόζης αποτελούν: η ανοσοηλεκτροφόρηση, η ανοσοηλεκτροφόρηση τύπου ρουκέτας ή ζώνης,

10 η ανοσοηλεκτροφόρηση πολλαπλών πηκτών, η δισδιάστατη διασταυρούμενη ανοσοηλεκτροφόρηση με ενδιάμεσες πηκτές, η ανοσοπροσήλωση και η ηλεκτροφόρηση αγχιστείας. Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού νουκλεϊκών οξέων με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα αγαρόζης αποτελούν: η ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου και η ηλεκτροφόρηση comet Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aκρυλαμιδίου Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιβραδύνουν τη μετανάστευση των πρωτεϊνών περίπου ανάλογα με το λόγο φορτίου προς μάζα. Χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες ηλεκτροφορήσεις, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη και μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε σε συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς αυτή. Το μέσο μέγεθος της πηκτής ακρυλαμιδίου με συγκέντρωση από 5 έως 10% είναι αποτελεσματικό για διαχωρισμό πρωτεϊνών από έως Da (ή σύμφωνα με άλλους επιστήμονες από έως Da) και νουκλεοτιδίων από 5 έως βάσεις (Αντωνέλλου & Παπασιδέρη, 2015). Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα πολυακρυλαμιδίου αποτελούν: η ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες παρουσία SDS (SDS PAGE), η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF), η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (2D). Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού νουκλεϊκών οξέων με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα πολυακρυλαμιδίου αποτελούν (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001): η ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση σε παρασκευαστικά πηκτώματα κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου αλληλουχία (sequencing) κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση κάτω από διαβαθμισμένη συγκέντρωση μετουσιωτικού παράγοντα (DGGE), η ηλεκτροφόρηση διαβαθμισμένης θερμοκρασίας (TGGE), η ηλεκτροφόρηση μονόκλωνου DNA κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες. Τεχνική SSCPA Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aμύλου Το άμυλο σπάνια χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα. Διαθέτει μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από την αγαρόζη, αλλά η προετοιμασία της πηκτής είναι δύσκολη. Χρησιμοποιείται συνήθως σε παρασκευαστική ηλεκτροφόρηση. 5.4 Tριχοειδής ηλεκτροφόρηση Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (Σχήμα 5.4) αποτελεί μια μοντέρνα τεχνική διαχωρισμού και ανάλυσης. Βασικά χαρακτηριστικά της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης είναι (Hu, 1996): 1. ο διαχωρισμός των μορίων πραγματοποιείται με κίνηση διαμέσου τριχοειδούς σωλήνα (περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα), 2. η μετακίνηση εξαρτάται από το φορτίο και το μοριακό βάρος, 3. η μικρή εσωτερική διάμετρος του τριχοειδούς σωλήνα (30-70 mm), 10

11 4. χαρακτηριστικό της τεχνικής αποτελεί η υψηλή τάση (10-30 kv), το ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο ( V/cm) σε σχετικά λίγα Ampere (0-300 ma) και ισχύς (0,6W), 5. η ευαισθησία της τεχνικής αυξάνει, είτε με την αύξηση της εσωτερικής διαμέτρου του τριχοειδούς σωλήνα αποκλειστικά στη θέση της ανίχνευσης, είτε με την χρήση μεμβράνης στην αρχή του σωλήνα, με σκοπό την έκλουση συστατικών που παρεμποδίζουν την ανάλυση, 6. η ταχύτητα διαχωρισμού των συστατικών μπορεί να επιτευχθεί σε λεπτά και σε ορισμένες περιπτώσεις σε πιο μεγάλο χρονικό διάστημα, 7. ο τριχοειδής σωλήνας μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου μετά το πέρας της τεχνικής, μετά από διαδικασία αναγέννησης, 8. η ανίχνευση μέσω κατάλληλου ανιχνευτεί μπορεί να πραγματοποιηθεί α) με UV-VIS ανίχνευση, β) με συνδυασμό UV Laser γ) φθορισμομετρικά, δ) με έμμεση UV φθορισμομετρία - αμπερομετρία, ε) με αμπερομετρία, στ) φασματοφωτομετρία μάζας, κ.α., 9. ορισμένοι από τους ανιχνευτές μπορούν να ανιχνεύσουν μάζες από 10-5 έως mol, 10. ο συνδυασμός της συγκεκριμένης τεχνικής με άλλες, όπως η HPLC, GC, MS, PCR, κ.α., 11. τα διαχωρισθέντα συστατικά προσδιορίζονται μέσω ανιχνευτή και καταγράφονται με μορφή κορυφών. Κάθε ουσία που διέρχεται από τον ανιχνευτή καταγράφεται σε διάγραμμα με μορφή κορυφής απορρόφησης και κατ αυτό τον τρόπο στο τέλος λαμβάνεται διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου. Βασικά πλεονεκτήματα της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης αποτελούν: η μικρή απαιτούμενη ποσότητα δείγματος (από 1 έως 50 nl), η μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, η μικρή κατανάλωση διαλυτών, η ανάλυση διάφορων βιολογικών υγρών (αίμα, ορός, πλάσμα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, πλευριτικό υγρό, δείγματα βιοψιών κ.α.), η εισαγωγή του δείγματος στην ηλεκτροφόρηση χωρίς προαπαιτούμενη επεξεργασία, η υψηλή αναλυτική ικανότητα επαναληψιμότητα και ακρίβεια, η δυνατότητα άμεσης λήψης ποσοτικών αποτελεσμάτων και η αυτοματοποίηση της τεχνικής. Σχήμα 5.4 Αναπαράσταση οργανολογίας τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. 11

12 Η οργανολογία της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης περιλαμβάνει: μία γεννήτρια υψηλής διαφοράς δυναμικού, δύο ηλεκτρόδια, δύο ρεζερβουάρ ρυθμιστικών διαλυμάτων, τριχοειδή σωλήνα και έναν ανιχνευτή. Σήμερα χρησιμοποιούνται διάφορα επιμέρους είδη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (Πίνακας 5.5). Είδη Τριχοειδούς Ηλεκτροφόρησης Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζώνης Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση πηκτής Τριχοειδής ισοταχοφόρηση Μικκυλιακή ηλεκτροκινητική τριχοειδής χρωματογραφία Τριχοειδής ηλεκτροχρωματογραφία Τριχοειδής ισοηλεκτρική εστίαση Διαχωρισμός Ουσιών Στηρίζεται στις διαφορετικές ταχύτητες μετακίνησης των ιόντων στο ρυθμιστικό διάλυμα, που οφείλονται στις διαφορετικές ηλεκτροφορητικές κινητικότητες των διαλυτών και συστατικών. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό ιόντων, πεπτιδίων, ορμονών, πρωτεϊνών κ.α. Στηρίζεται στο μέγεθος διαλυτών συστατικών καθώς μετακινούνται μέσα από τους πόρους της πηκτής (μοριακός ηθμός). Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό κυρίως υδατανθράκων, πρωτεϊνών, λιπιδίων, απο-λιποπρωτεϊνών, ορμονών, προϊόντων DNA, κ.α. Μηδενική ηλεκτροωσμωτική ροή - EOF (κίνηση διαλύτη μαζί με διαλυμένες σε αυτόν ουσίες, και κατεύθυνση αντίθετη από αυτή του ηλεκτρικού ρεύματος). Αρχή κινητού ορίου (moving boundary). Χρησιμοποιείται για ανάλυση μικρών μορίων, βιταμινών, ορμονών και πεπτιδίων. Στηρίζεται στη κατανομή διαλυτών συστατικών μεταξύ της μικκυλιακής φάσης και της διαλυτής φάσης. Χρησιμοποιείται για ανάλυση φαρμάκων, μεταβολιτών, προϊόντων DNA, κ.α. Στηρίζεται στη βάση των διαφορετικών χρωματογραφικών ιδιοτήτων (πολικότητα ή λιποφιλικότητα του αναλύτη) και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας Με βάση τα ισοηλεκτρικά τους σημεία. Χρησιμοποιείται για διαχωρισμό πρωτεινών, πεπτιδίων, κ.α. Πίνακας 5.5 Είδη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζώνης στηρίζεται στην ηλεκτροφορητική ικανότητα των μορίων και την ηλεκτροοσμωτική ροή. Το φαινόμενο της ηλεκτροοσμωτικής ροής οφείλεται στην φορτισμένη εσωτερική επιφάνεια του τριχοειδούς. Ο βαθμός ιονισμού εξαρτάται από το ph του ρυθμιστικού διαλύματος. Το αρνητικά φορτισμένο τοίχωμα του τριχοειδούς έλκει τα θετικά φορτισμένα ιόντα του ρυθμιστικού διαλύματος, δημιουργώντας μια διπλοστοιβάδα φορτισμένων ιόντων. Όταν εφαρμόζεται διαφορά δυναμικού, τα κατιόντα της διπλοστοιβάδας μεταναστεύουν προς την κάθοδο μεταφέροντας μόρια νερού, με αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας ροής ρυθμιστικού διαλύματος προς την κατεύθυνση του αρνητικά φορτισμένου ηλεκτροδίου. Συνεπώς, οτιδήποτε βρίσκεται μέσα στο ρυθμιστικό διάλυμα μετακινείται μέσω ηλεκτροοσμωτικής ροής (Σχήμα 5.5). 12

13 Σχήμα 5.5 Παραγωγή ηλεκτρο-ωσμωτικής ροής προς την κάθοδο στην ηλεκτροφόρηση τριχοειδών. Στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείγμα τα διάφορα βιολογικά υγρά, κύτταρα, δείγματα βιοψίας, κ.α. Μπορούν να διαχωριστούν πρωτεΐνες, πεπτίδια, αμινοξέα, ένζυμα, ισοένζυμα, αιμοσφαιρίνες, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (βλ. Ενότητα 5.7), γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες, λιποπρωτεΐνες, υδατάνθρακες, ορμόνες, ηλεκτρολύτες, φάρμακα, κ.α. 5.5 Η Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη (ηλεκτροφόρηση ζώνης) Αρχή της μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση είναι μία μέθοδος διαχωρισμού μεγαλομοριακών ουσιών ή και κυττάρων ενός μίγματος. Η ηλεκτροφόρηση στηρίζεται στο γεγονός πως όταν μέσα σε ένα διάλυμα ηλεκτρολύτη βαπτιστούν δύο ηλεκτρόδια και εφαρμοστεί ηλεκτρικό πεδίο, τότε τα φορτισμένα μόρια κινούνται με βάση το φορτίο τους αντίστοιχα προς τον έναν ή τον άλλο πόλο. Οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος Οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος, όπως η αλβουμίνη και οι σφαιρίνες (α 1, α 2, β και γ) μπορούν να προσδιοριστούν με βιοχημικές μεθόδους. Στις πρωτεΐνες του πλάσματος συμπεριλαμβάνεται και το ινοδωγόνο. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού Τα πρωτεϊνικά μόρια του ορού με την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος μετακινούνται προς την άνοδο ή την κάθοδο με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με το φορτίο τους (Καρκαλούσος, 2012). Είναι γνωστό πως οι πρωτεΐνες ιονίζονται, όπως και τα αμινοξέα. Ο ιονισμός εξαρτάται από το ph. Οι πρωτεΐνες λόγω των πολλών διαφορετικών ομάδων στις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων ιονίζονται ως κατιόντα και ένα μέρος ως ανιόντα. Δηλαδή, συμπεριφέρονται ως πολυηλεκτρολύτες (πολυϊόντα). 13

14 Το ph στο οποίο οι πρωτεΐνες δεν φέρουν καθαρό ηλεκτρικό φορτίο ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο και συμβολίζεται με pi. Στη προκειμένη περίπτωση η πρωτεΐνη έχει ολικό φορτίο ίσο με το μηδέν. Όταν το ph του περιβάλλοντος είναι όξινο σε σχέση με το pi της πρωτεΐνης, αυτή φορτίζεται θετικά. Σε μια τέτοια περίπτωση η πρωτεΐνη κινείται προς την κάθοδο. Στην αντίθετη περίπτωση, όταν το ph του περιβάλλοντος είναι βασικό σε σχέση με το pi της πρωτεΐνης, αυτή φορτίζεται αρνητικά. Σε μια τέτοια περίπτωση η πρωτεΐνη κινείται προς την άνοδο. Όταν το ph του περιβάλλοντος είναι ίσο με το pι και συνεπώς το φορτίο της πρωτεΐνης είναι ίσο με το μηδέν, η πρωτεΐνη δεν μετακινείται. Η ταχύτητα (U) με την οποία κινείται ένα πρωτεϊνικό μόριο εξαρτάται: από το φορτίο του, από την ισχύ του ηλεκτρικού πεδίου, από το μέσο διαχωρισμού, από το ΜΒ των κλασμάτων, κ.λπ. Όπως έχουμε περιγράψει υπάρχουν πολλές μέθοδοι ηλεκτροφόρησης, από τις πιο απλές είναι η ηλεκτροφόρηση ζώνης όπου η ηλεκτροφόρηση σταματά στο σημείο που οι πρωτεΐνες σχηματίζουν ξεχωριστές ζώνες. Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης μπορούμε να χρωματίσουμε τα κλάσματα και να τα προσδιορίσουμε ποσοτικά. Η χρώση γίνεται με διάφορες κατάλληλες χρωστικές όπως το Red PonceauS, το κυανούν του Coomassie, το αμιδομέλαν, κ.α., που αντιδρούν με τις βασικές ομάδες των πρωτεϊνών. 5.6 Πειραματικό μέρος Αντιδραστήρια και αναλώσιμα Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού σε μη μετουσιωτικές συνθήκες θα χρησιμοποιηθούν τα παρακάτω αντιδραστήρια και αναλώσιμα: ρυθμιστικό διάλυμα: TEB (0,12 M Tris, 5 mm EDTA, 15 mm βορικό οξύ, ph 8,6), διάλυμα χρωστικής (PonceauS), διάλυμα αποχρωματισμού και σταθεροποίησης, μεμβράνες οξικής κυτταρίνης, διηθητικό χαρτί, αποστειρωμένα γυάλινα πλακάκια, γυάλινοι ράβδοι. Ως αντιδραστήρια μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε επίσης: ρυθμιστικό διάλυμα: 0,05 Μ βαρβιτουρικό ph 8,6, διάλυμα χρώσης: 0,5% w/v PonceauS σε 5% w/v TCA (τριχλωροοξικό οξύ), διάλυμα αποχρωματισμού: 5% v/v CH 3COOH Συσκευές και υλικά Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού θα χρησιμοποιηθούν οι παρακάτω συσκευές: Συσκευή ηλεκτροφόρησης που περιλαμβάνει (Φωτογραφία 5.1): βάση ηλεκτροφόρησης, γέφυρα ηλεκτροφόρησης, αpplicator (χτένα), dispocard Holder, λουτρό ηλεκτροφόρησης, τροφοδοτικό, αυτόματες πιπέτες (10 μl ή 20 μl). 14

15 Φωτογραφία 5.1 Συσκευή ηλεκτροφόρησης(τροφοδοτικό και λουτρό) χάρτου ή οξικής κυτταρίνης Προετοιμασία της διαδικασίας Η προετοιμασία πριν την ηλεκτροφόρηση αποτελεί βασική προϋπόθεση για την επιτυχία της. Συγκεκριμένα απαιτείται η προετοιμασία: του συστήματος, της βάσης της ηλεκτροφόρησης, των μεμβρανών και των δειγμάτων Προετοιμασία του συστήματος Πρώτο βασικό στάδιο αποτελεί η αποσύνδεση του λουτρού από το τροφοδοτικό και το γέμισμα των δύο διαμερισμάτων του με 400 ml ρυθμιστικού διαλύματος (Φωτογραφία 5.2). Φωτογραφία 5.2 Σύστημα ηλεκτροφόρησης Προετοιμασία της βάσης της ηλεκτροφόρησης Δεύτερο σημαντικό στάδιο της προετοιμασίας αποτελεί η προετοιμασία της βάσης της ηλεκτροφόρησης, την οποία γεμίζουμε με 80 ml από το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Στη βάση τοποθετούμε τη γέφυρα της ηλεκτροφόρησης (Φωτογραφία 5.3). 15

16 Φωτογραφία 5.3 Βάση και γέφυρα ηλεκτροφόρησης Προετοιμασία των μεμβρανών Οι μεμβράνες οξικής κυτταρίνης τοποθετούνται σε μία μικρή λεκάνη με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο πραγματοποιείται η ηλεκτροφόρηση. Αρχικά τοποθετείται στην επιφάνεια του ρυθμιστικού διαλύματος και στη συνέχεια τη βυθίζουμε στο υγρό. Η μεμβράνη παραμένει στο διάλυμα για πέντε λεπτά και στη συνέχεια μεταφέρεται και τοποθετείται μεταξύ δύο διηθητικών φύλλων. Με μία γυάλινη ράβδο απομακρύνουμε τη περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος, χωρίς να στεγνώσει η μεμβράνη, απομακρύνοντας ταυτόχρονα τυχόν φυσαλίδες, που υπάρχουν πάνω σε αυτή. Η μεμβράνη τοποθετείται στη γέφυρα με προσοχή ώστε να είναι τεντωμένη και επίπεδη, ώστε να μην εμποδίζεται η μετακίνηση των δειγμάτων και ο διαχωρισμός των κλασμάτων. Για περισσότερες από μία μεμβράνες χρησιμοποιούνται νέα φύλλα διηθητικού χαρτιού (Φωτογραφία 5.4) Προετοιμασία των δειγμάτων Φωτογραφία 5.4 Μεμβράνη οξικής κυτταρίνης. Τα δείγματα τοποθετούνται στο ονομαζόμενο dispocard, το οποίο έχει προκαταβολικά τοποθετηθεί στη θήκη του. Το dispocard που θα χρησιμοποιήσουμε, ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων προς εξέταση, διαθέτει σε κάθε σειρά τέσσερις, έξι ή οκτώ θέσεις δειγμάτων. Με αυτόματη πιπέτα τοποθετούμε την κατάλληλη ποσότητα ορού ασθενούς σε κάθε θέση του dispocard. Οι τύποι των dispocard που μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε είναι: Micro (D8, D6M, D6), semimicro (D4, D4MS, D4M), 16

17 macro (D2) Τοποθέτηση των δειγμάτων στη μεμβράνη Με τη χρήση του κατάλληλου applicator (χτενάκι) που ταιριάζει στο dispocard παίρνουμε τα δείγματα τοποθετώντας το χτενάκι κάθετα πάνω στο dispocard (Φωτογραφία 5.5). Το χτενάκι τοποθετείται στη συνέχεια κάθετα πάνω στη μεμβράνη για 10 περίπου δευτερόλεπτα, ώστε να πραγματοποιηθεί η μεταφορά των δειγμάτων στην μεμβράνη (το δείγμα προς την κάθοδο). Φωτογραφία 5.5 Dispocard και Applicator (χτενάκι) ηλεκτροφόρησης. 3 Τεχνική ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ορού Τα επιμέρους βήματα έχουν ως εξής (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001): 1. Αφαιρείται το καπάκι του λουτρού. 2. Η γέφυρα μεταφέρεται από τη βάση της ηλεκτροφόρησης μέσα στο λουτρό, έχοντας υπόψη ότι ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών θα γίνει προς την άνοδο. 3. Επιλογή της κατάλληλης τάσης. 4. Τοποθετείται το καπάκι του λουτρού. 5. Τίθεται σε λειτουργία το τροφοδοτικό. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τάση ίση με 0,5 ma/cm για μία ώρα. Όμως οι προτεινόμενες τάσεις με βάση τον τύπο του dispocard, που χρησιμοποιήσαμε έχουν ως εξής: Micro (D8, D6M, D6): 250 Vdc min, Semimicro (D4, D4MS, D4M): Vdc min, Macro (D2): Vdc min. Στο τέλος του χρόνου κλείνουμε το διακόπτη του τροφοδοτικού και αφαιρούμε το καπάκι του λουτρού. Σηκώνουμε τη γέφυρα, διατηρώντας τη μεμβράνη σε οριζόντιο επίπεδο. Απομακρύνουμε τη μεμβράνη από τη γέφυρα και κόβουμε τις προεκτάσεις τους στα σημεία, όπου υπάρχουν διάτρητες γραμμές Χρώση των κλασμάτων Γεμίζουμε μία λεκάνη με διάλυμα κατάλληλης χρωστικής (Φωτογραφία 5.6) και βαπτίζουμε τη μεμβράνη για δέκα λεπτά. Η χρωστική συμπλέκεται με τις πρωτεΐνες προσδίδοντας σε αυτές κόκκινο χρώμα. 17

18 Φωτογραφία 5.6 Χρωστική PonceauS και το διάλυμα αποχρωματισμού Αποχρωματισμός και Διαφανοποίηση της μεμβράνης Σε μία άλλη λεκάνη τοποθετούμε διάλυμα αποχρωματισμού και διαφανοποίησης (Φωτογραφία 5.5). Με μία λαβίδα η μεμβράνη μεταφέρεται από το διάλυμα χρωματισμού στο διάλυμα αποχρωματισμού και διαφανοποίησης. Με τη λαβίδα ή με μία γυάλινη ράβδο αναδεύουμε ελαφρά. Το διάλυμα αντικαθίσταται με νέο έως ότου η μεμβράνη αποχρωματιστεί πλήρως. Μετά το τέλος του αποχρωματισμού παραμένουν χρωματισμένες μόνο οι ζώνες των πρωτεϊνών. Η μεμβράνη τοποθετείται σε γυάλινο αποστειρωμένο πλακάκι, το οποίο τοποθετείται σε κλίβανο θερμοκρασίας ο C για 5-10 λεπτά. Στη συνέχεια η μεμβράνη, εφόσον είναι πλέον στεγνή και ξηρή, μπορεί να φωτομετρηθεί. Η φωτομέτρηση πραγματοποιείται στα 525 nm (εφόσον έχουμε χρησιμοποιήσει χρωστική Red PonceauS) ή στα 620 nm εάν έχει γίνει χρώση με Amidoschwartz Πυκνομετρία (Densitometry) Η πυκνομετρία πραγματοποιείται με ειδικό όργανο (Σχήμα 5.6), το οποίο καταγράφει και απεικονίζει τις ποσότητες των πρωτεϊνικών κλασμάτων με ειδικό γραμμικό διάγραμμα (Φωτογραφία 5.7). Σχήμα 5.6 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη. Ηλεκτρογράφημα υπολογισμός κλασμάτων με τη χρήση πυκνομέτρου (Φωτογραφία 5.7). Το δεξιό διάγραμμα είναι παθολογικό αφού οι γ σφαιρίνες κατέχουν ποσοστό 19% έναντι 18% που είναι το ανώτερο όριο (Πίνακας 5.6). 18

19 Φωτογραφία 5.7 Πυκνόμετρο (Minidensit Densitometer SEAC) Υπολογισμοί Καταγράφουμε τις οπτικές απορροφήσεις και τις προσθέτουμε. Υπολογίζουμε το ποσοστό επί τοις εκατό του κάθε κλάσματος. Εάν με κάποια άλλη μέθοδο προσδιορίσουμε το ολικό ποσό των πρωτεϊνών του ορού, τότε μπορούμε να βρούμε το ποσό του κάθε κλάσματος. Ο υπολογισμός μπορεί να γίνει και με Scanner. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να διαφανοποιήσουμε υποχρεωτικά την μεμβράνη (ταινία) μετά τον χρωματισμό. Με τη βοήθεια του Scanner βρίσκουμε το ποσοστό κάθε κλάσματος που μας δίδεται απ ευθείας από τον καταγραφέα Διαγνωστική αξία των αποτελεσμάτων Κατά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού λαμβάνονται πέντε ταινίες, κάθε μία εκ των οποίων αντιστοιχεί σε μία από τις εξεταζόμενες πρωτεΐνες (Σχήματα 5.7, 5.8): λευκωματίνη (η πιο παχιά και απομακρυσμένη από το σημείο έναρξης του διαχωρισμού), α 1-σφαιρίνη (η δεύτερη κατά σειρά), α 2-σφαιρίνη (η τρίτη κατά σειρά), β-σφαιρίνη (η τέταρτη κατά σειρά), γ-σφαιρίνη (η τελευταία κατά σειρά και η πλησιέστερη στο σημείο έναρξης του διαχωρισμού των κλασμάτων). Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών του ορού βοηθά στην εκτίμηση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων όπως: η απώλεια πρωτεϊνών, οι φλεγμονές, οι γαμμαπάθειες, κ.α. Στον Πίνακα 5.6 δίνονται ενδεικτικά οι φυσιολογικές τιμές πρωτεϊνών ορού (συνίσταται κάθε εργαστήριο να προσδιορίσει το δικό του εύρος τιμών). Πρωτεΐνες Ποσοστό (%) g/l Αλβουμίνες 55,0 69, α1 σφαιρίνη 1,5 4,0 1-3 α2 σφαιρίνη 8,0 13,0 5-8 β σφαιρίνες 7,0 15, γ σφαιρίνες 9,0 18, Πίνακας 5.6 Εκατοστιαία αναλογία πρωτεϊνών. 19

20 Η διαγνωστική αξία των πρωτεϊνικών κλασμάτων δίνεται για διάφορες παθήσεις στον Πίνακα 5.7. Στον πίνακα προσδιορίζονται οι περιπτώσεις, στις οποίες παρατηρείται αύξηση ή μείωση ενός ή περισσοτέρων κλασμάτων (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001ˑ Devlin, 2009). Παθήσεις Αλβουμίνη Πρωτεΐνες Ορού Σφαιρίνες α1 α2 β γ Αποφρακτικός ίκτερος Χρόνιος ηπατικός ίκτερος Κίρρωση του ήπατος Νεφρωσικό σύνδρομο Οξείες λοιμώξεις Χρόνιες λοιμώξεις Παθήσεις κολλαγόνου Οξείς τραυματισμοί Βαρύς διαβήτης Μυέλωμα & μακροσφαιριναιμίες Πίνακας 5.7 Διαγνωστική αξία πρωτεϊνικών κλασμάτων ορού. Σχήμα 5.7 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Πρωτεϊνόγραμμα. 20

21 Σχήμα 5.8 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Πρωτεϊνόγραμμα ασθενούς με μονοκλωνική γαμμαπάθεια (Monoclonalgammopathy, Multiple Myeloma). 5.7 Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Γαλακτικής Αφυδρογονάσης (LDH) Η γαλακτική αφυδρογονάση ή γαλακτική δεϋδρογενάση (Lactate Dehydrogenase ή LDH) αποτελεί ένζυμο του κυτταροπλάσματος και καταλύει την μετατροπή του γαλακτικού οξέος σε πυροσταφυλικό οξύ (Σχήμα 5.9). Πυροσταφυλικό Γαλακτικό Σχήμα 5.9 Η καταλυόμενη αντίδραση από την LDH. Το συγκεκριμένο ένζυμο βρίσκεται σε πολλούς ιστούς. Ιδιαίτερα σε μεγάλες συγκεντρώσεις βρίσκεται στο μυοκάρδιο, τους νεφρούς, το ήπαρ και τους σκελετικούς μύες. Σε μικρότερες συγκεντρώσεις απαντά στα ερυθρά αιμοσφαίρια, τους πνεύμονες, τον εγκέφαλο και το πάγκρεας. Στον ορό βρίσκεται σε πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις (τουλάχιστον 500 φορές). Αυτό σημαίνει, πως η αύξηση της LDH στον ορό δεν μπορεί να αποτελεί ειδικό δείκτη βλάβης των κυττάρων, λόγω του ότι βρίσκεται ευρέως κατανεμημένη στον οργανισμό. Συνεπώς, η όποια διαγνωστική αξία της εργαστηριακής διερεύνησης της LDH επιτυγχάνεται με τη διάκριση της ιστικής προέλευσης των ισοενζύμων της και της κλινικής εικόνας του ασθενούς (Φύτου-Παλλικάρη, 2005). Με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης μπορούν να διακριθούν τα πέντε (5) διαφορετικά ισοένζυμα της LDH (Σχήμα 5.10) με βάση τον αριθμό των υπομονάδων Η (Heart) και Μ (Muscle) που περιέχουν. Τα ισοένζυμα της LDH δίνονται στον Πίνακα 5.14 (Koomn & Roehm, 2007). Αύξηση της ολικής LDH με φυσιολογική κατανομή των ισοενζύμων μπορεί να παρατηρηθεί σε έμφραγμα του μυοκαρδίου, χρόνια καρδιακή ανεπάρκεια και ηπατικές νόσους. Στον Πίνακα 5.15 δίνονται ορισμένες από τις μεταβολές, που σχετίζονται με τα ισοένζυμα της LDH και αντίστοιχες παθολογικές καταστάσεις (Loeffler 2007ˑ Gaw et al., 2010). 21

22 Σχήμα 5.10 Ηλεκτροφορητική ικανότητα (διαχωρισμός) των ισοενζύμων της LDH. Ta αποτελέσματα κρίνονται φυσιολογικά σύμφωνα και με τον Πίνακα Ισοένζυμα LDH Υπομονάδες Τιμές Αναφοράς (%) * Όργανο LDH-1 H Στην καρδιά και στα ερυθρά αιμοσφαίρια (σε μικρότερες ποσότητες στο φλοιό του εγκεφάλου καιστους νεφρούς). LDH-2 H3M LDH-3 H2M Στους πνεύμονες, το σπλήνα, το πάγκρεας & τον πλακούντα. LDH-4 HM LDH-5 M Στους σκελετικούς μύες, το ήπαρ και το δέρμα. Ολική LDH U/L * Οι τιμές αναφοράς σχετίζονται με την μέθοδο ηλεκτροφόρησης οξικής κυτταρίνης. Πίνακας 5.14 Ισοένζυμα-υπομονάδες της γαλακτικής αφυδρογονάσης/όργανο και tιμές aναφοράς. Αύξηση ισοενζύμων LDH Παθολογικές καταστάσεις Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου * Κακοήθης αναιμία LDH-1 ή & LDH-2 Μεγαλοβλαστική αναιμία Δρεπανοκυτταρική αναιμία Οξεία νέκρωση του φλοιού του νεφρού Πνευμονική εμβολή Διαταραχές του κολλαγόνου Συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια LDH-2, LDH-3 & LDH-4 Καταστροφή αιμοπεταλίων έπειτα από μετάγγιση Λοιμώδης μονοπυρήνωση Λεμφώματα Λεμφοκυτταρική λευχαιμία Κίρρωση, ηπατίτιδα Οξεία ηπατική συμφόρηση Τραυματισμός σκελετικών μυών LDH-5 Εγκαύματα Δερματομυοσίτιδα Νεοπλασίες Κ.Ν.Σ * Σήμερα για τη διάγνωση-παρακολούθηση του οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου χρησιμοποιούνται CK, CK-MB και τροπονίνη Ι και Τ. Πίνακας 5.15 Μεταβολές στις συγκεντρώσεις των ισοενζύμων της LDH σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. 22

23 5.7.2 Η Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Αλκαλικής Φωσφατάσης Η αλκαλική φωσφατάση (Alkaline phosphatase ή ALP) υδρολύει τα φωσφορικά άλατα σε αλκαλικό ph 6,0 8,0. Η ALP κατανέμεται ευρέως σε πολλούς ιστούς, όπως στους οστεοβλάστες των ιστών, το ήπαρ, τον πλακούντα, τους νεφρούς, το εντερικό τοίχωμα και τους γαλουχούντες μαστικούς αδένες. Με την ηλεκτροφορητική τεχνική επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός και ο προσδιορισμός των ισοενζύμων της και είναι δυνατή η επιβεβαίωση της πηγής προέλευσής της. Τα κύρια ισοένζυμα της ALP και οι τιμές αναφοράς δίνονται στον Πίνακα Ισοένζυμα ALP Ποσοστό επί της ολικής ALP (%) Τιμές αναφοράς (U/L) Οστικό Ηπατικό Εντερικό Πλακουντιακό 0 Ολική ALP U/L Πίνακας 5.16 Κύρια ισοένζυμα και τιμές αναφοράς των ισοενζύμων της ALP. Στα φυσιολογικά άτομα, η αλκαλική φωσφατάση του ορού προέρχεται σχεδόν αποκλειστικά από τα ισοένζυμα του ήπατος και των οστών. Μερικές φορές, ελάχιστες ποσότητες προέρχονται από το έντερο και σε περιόδους κυοφορίας και γαλουχίας, από τον πλακούντα και το μαστό (Σχήμα 5.11). Σχήμα 5.11 Ηλεκτροφόρηση ισοενζύμων ALP (Ηλεκτροφητική κινητικότητα ισοενζύμων σε άτομο φυσιολογικό, με ηπατική και πάθηση οστών). Η ολική ALP αυξάνεται φυσιολογικά στις παρακάτω περιπτώσεις: κατά την κύηση, μετά το 2 ο τρίμηνο (πλακουντιακό ισοένζυμο), σε αναπτυσσόμενα παιδιά (οστικό ισοένζυμο), μετά από πρόσληψη τροφής σε άτομα ομάδας αίματος Ο και Β Lewis θετικά, που εκκρίνουν την ουσία Η της ομάδας αίματος (εντερικό ισοένζυμο). Η πιο κοινή αιτία αυξημένης ολικής ALP είναι η ηπατοχολική νόσος. Οι τιμές της ολικής ALP είναι παθολογικές στο 60% των περιπτώσεων. Σε συνδυασμό με τρανσαμινάσες και γgt βοηθά στην διαφορική διάγνωση χολοστατικών καταστάσεων. Τα επίπεδα της ALP είναι υψηλά σε σχέση προς τις τιμές των τρανσαμινασών σε χολόσταση και φυσιολογικά σε απουσία χολόστασης. Σε νόσους του ήπατος φυσιολογικές ή ελάχιστα αυξημένες τιμές ALP σε συνδυασμό με υψηλές τιμές γgt υποδηλώνουν αλκοολική ηπατική νόσο (Murray et al., 2011ˑ Nelson & Cox, 2008). 23

24 Στον Πίνακα 5.17 δίνονται οι μεταβολές της ALP σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Αύξηση της ALP Νόσος του Paget Υπερπαραθυρεοειδισμός Οστεομαλακία Ραχίτιδα Μεταστατικό καρκίνωμα οστών Οστεογενές σάρκωμα Κάταγμα οστών Μυέλωμα Νόσος του Hodgkin Σύνδρομο Cushing Μεγαλακρία Οξεία και χρόνια ιογενής ηπατίτιδα Αλκοολική ηπατίτιδα Κίρρωση ήπατος Αποφρακτικός ίκτερος Χολική κίρρωση Λοιμώδης μονοπυρήνωση Πρωτοπαθές ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Καρκίνος ωοθήκης Καρκίνος όρχεων Ηπατικές μεταστάσεις Ελκώδης κολίτιδα κ.α. Υποθυρεοειδισμός Αναιμία Υποφωσφαταιμία Σκορβούτο Αχονδροπλασία κ.α. Μείωση της ALP Πίνακας 5.17 Μεταβολές της ALP σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις H Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Κρετανικής Κινάσης Η κρεατινική κινάση (Creatine Kinase ή CK) αποτελεί ένα ένζυμο το οποίο καταλύει την αντιστρεπτή μεταφορά φωσφορικού από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) στην κρεατινίνη. Κρεατινίνη + ATP CK Φωσφορική κρεατινίνη + ADP Με την διαδικασία αποθηκεύεται φωσφορικό υψηλής ενέργειας σε μορφή σταθερότερη του ATP. Η CK βρίσκεται σε πολλούς ιστούς του ανθρώπινου οργανισμού. Οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις απαντούν στο σκελετικό μυ, στον καρδιακό μυ, στον θυρεοειδή, στον εγκέφαλο και στον προστάτη. Σε μικρότερες συγκεντρώσεις βρίσκεται στο ήπαρ, τους νεφρούς, τους πνεύμονες κ.α. Η αύξηση της CK του ορού αποδίδεται κατά κύριο λόγο σε βλάβη γραμμωτών σκελετικών ή καρδιακών μυών (Σχήμα 5.12). Η συγκέντρωση της CK του ορού αυξάνεται από 3-6 ώρες μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου και φτάνει μια μέγιστη τιμή μετά από 24 ώρες. 24

25 Σχήμα 5.12 Γραφική παράσταση συγκέντρωσης βιοδεικτών στο αίμα μετά από έμφραγμα. Η κρεατινική κινάση είναι ένα διμερές και αποτελείται από 2 υπομονάδες: Μ και Β. Η Μ υπομονάδα κυριαρχεί στο σκελετικό μυ και η Β υπομονάδα κυριαρχεί στον εγκέφαλο. Τρία ισοένζυμα τα οποία διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά συμπεριφέρονται ως διμερή: το CK-BB (CK1) αποτελείται από 2 Β υπομονάδες [κυρίως στον εγκέφαλο], το CK-MB (CK2) αποτελείται από μία υπομονάδα Μ και μία Β [κυρίως στην καρδιά] και το CK-MM (CK3) που αποτελείται από 2 υπομονάδες Μ [κυρίως στους σκελετικούς μυς και στην καρδιά]. Με την ηλεκτροφόρηση τα ισοένζυμα αυτά διαχωρίζονται και προσδιορίζονται (Σχήμα 5.13). Σχήμα 5.13 Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός ισοενζύμων CK (Πίνακας 5.18). 25

26 Στον Πίνακα 5.18 δίνονται τα ισοένζυμα της CK και οι τιμές αναφοράς τους. Η δοκιμασία δεν πρέπει να εκτελείται για επίπεδα της ολικής CK 150 U/L. Ισοένζυμα CK Θέση Τιμές αναφοράς ως % CK-BB (CK1) Κυρίως στον εγκέφαλο 0 CK-MB (CK2) Κυρίως στην καρδιά 0-3 CK-MM (CK3) Κυρίως στους σκελετικούς μυς και στην καρδιά Πίνακας 5.18 Ισοένζυμα της CK και οι φυσιολογικές τους τιμές. 5.8 Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρίνης (Γλυκοζυλιωμένη Αιμοσφαιρίνη) Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης [Hb] συμβάλλει στον προσδιορισμό των επιμέρους ειδών φυσιολογικών αιμοσφαιρινών στο αίμα, όπως της αιμοσφαιρίνης Α, της αιμοσφαιρίνης Α 2, της αιμοσφαιρίνης F, ή παθολογικών αιμοσφαιρινών, όπως οι S, C, E κ.α. Η σημασία της ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών συμβάλλει στη διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών (κληρονομικές παθήσεις που οφείλονται σε μεταλλάξεις των γονιδίων υπεύθυνων για την σύνθεση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης) (Φωτογραφία 5.8). Αιμοσφαιρινοπάθειες είναι η δρεπανοκυτταρική αναιμία, η μεσογειακή αναιμία (ή θαλασσαιμία), κ.α. Η συγκεκριμένη εξέταση αποτελεί ρουτίνα του προγεννητικού ελέγχου για την διάγνωση ή μη αιμοσφαιρινοπαθειών στην αρχόμενη κύηση. Φωτογραφία 5.8 Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. Οι φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες του ανθρώπινου οργανισμού είναι η Α, η Α 1 και η F. Η αιμοσφαιρίνη Α (ή Α 1) αποτελεί το βασικό συστατικό της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, ενώ η Α 2 αποτελεί μόνο το 2-3% της φυσιολογικής. Η εμβρυική αιμοσφαιρίνη F είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη του εμβρύου και μετά τη γέννηση αντικαθίσταται από την Α 1. Η αιμοσφαιρίνη S είναι μία παθολογική αιμοσφαιρίνη που συνδέεται με τη δρεπάνωση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και την δρεπανοκυταρική αναιμία. Στη δρεπανοκυτταρική αναιμία, τα ερυθρά αιμοσφαίρια έ- χουν σχήμα δρεπάνου), αντί του φυσιολογικού σφαιρικού, με αποτέλεσμα την πρόωρη καταστροφή τους, που οδηγεί στην αναιμία (Φωτογραφία 5.9) (Αντωνέλου & Παπασιδέρη, 2015). 26

27 Φωτογραφία 5.9 Ερυθρά αιμοσφαίρια με φυσιολογικό σχήμα (σφαιρικό) και με παθολογικό σχήμα (σχήμα δρεπάνου). Η κάθε μία από τις παραπάνω αιμοσφαιρίνες έχει κάποιο ηλεκτρικό φορτίο, συνεπώς μία καλή μέθοδος διαχωρισμού τους είναι η διάβαση τους μέσα από ηλεκτρικό πεδίο. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης τα συστατικά της αιμοσφαιρίνης διαχωρίζονται σε ευδιάκριτες χρωματισμένες ζώνες, που συγκρίνονται με τις ζώνες φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, για να εξαχθεί το ποσοστό του κάθε συστατικού. Στον Πίνακα 5.19 δίνονται οι τιμές για φυσιολογικές και κάποιες αιμοσφαιρινοπάθειες, που μπορεί να διαφέρουν από εργαστήριο σε εργαστήριο (Ζαμπέτα, 2015). Αιμοσφαιρίνες Φυσιολογικά Ποσοστά Ποσοστά σε Παθολογικές Καταστάσεις Ενήλικες (%) Παιδιά Μεσογειακή Αναιμία Hg H ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ Α (ή Α1) Μεσογειακή Α- ναιμία (στίγμα) Δρεαπανοκυτταρική Αναιμία Α ,8 < 2 F 0,8 2,0 6 μήνες: > 6 μήνες: 1 2 Νεογνά (Hgb F): ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ S Πίνακας 5.19 Ποσοστά (%) αιμοσφαιρινών σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Αύξηση της παραγωγής της HbF κατά την ενήλικη ζωή, οφείλεται κυρίως: σε μεταλλάξεις που ρυθμίζουν θετικά την παραγωγή της HbF, γνωστές ως Κληρονομική Παραμονή της HbF (HPFH), όπου η HbF κυμαίνεται από 3-20%, σε μεταλλάξεις που προκαλούν Μεσογειακή Αναιμία (δβ-μα), όπου η HbF κυμαίνεται από 5-20%, και σε περιπτώσεις πασχόντων από Μεσογειακή Αναιμία ή Δρεπανοκυτταρική Αναιμία, όπου η επαγωγή της παραγωγής της HbF βελτιώνει την αιματολογική κατάσταση και την κλινική εικόνα των ασθενών και σε υψηλό ποσοστό της HbF που παράγεται (20-40%) σε περιπτώσεις συνδυασμών της ετερόζυγης β-μεσογειακής αναιμίας και HPFH. Πολλές φορές για την διάγνωση σακχαρώδους διαβήτη και προδιαβήτη ή για την παρακολούθηση διαβητικών ατόμων και την υποβοήθηση λήψης θεραπευτικών αποφάσεων, απαιτείται ο προσδιορισμός της γλυκιωμένης αιμοσφαιρίνης, η οποία αποτελεί το 5-8% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Η γλυκιωμένη (γλυκοζυλιωμένη) αιμοσφαιρίνη (HbΑ 1c) αποτελεί μια φυσιολογική μορφή της αιμοσφαιρίνης, που βρίσκεται συνδεδεμένη με την γλυκόζη. Η αιμοσφαιρίνη συνδέεται μη ενζυμικά με την γλυκόζη σε περίπτωση υπεργλυκαιμίας. Όσο πιο υψηλή είναι η συγκέντρωση της γλυκόζης, τόσο πιο υψηλή είναι και η συγκέντρωση της γλυκιωμένης 27

28 αιμοσφαιρίνης. Η τιμή της HbA 1c εξαρτάται από τη μέση συγκέντρωση της γλυκόζης του αίματος τις τελευταίες 3 με 6 εβδομάδες, γι αυτό και αποτελεί δείκτη της πορείας της νόσου (Marshall & Bangert, 2001). Σχήμα 5.14 Αντιστοίχιση τιμών σακχάρου (τιμές γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης και τιμές γλυκόζης αίματος [μέσο ισοδύναμο πλάσματος]). Η τιμή της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης εκφράζεται σε εκατοστιαίο ποσοστό της ολικής αιμοσφαιρίνης. Στα φυσιολογικά άτομα η τιμή αυτή είναι η εξής: HbA 1 (A 1a, A 1b, A 1c) = 5,0-8,0%, μέση τιμή 6,5% HbA 1c = 4,5-6,5%, μέση τιμή 5,0% Στους διαβητικούς ασθενείς, στους οποίους δεν ελέγχονται τα επίπεδα της γλυκόζης, η τιμή του αιμοσφαιρινικού κλάσματος είναι σαφώς αυξημένο (2-3 φορές πάνω από τη φυσιολογικό) (Μάλιου, 2015). Σχήμα 5.15 Εφαρμογή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (ανάλυση HbA 1c σε φυσιολογικό και σε άτομο με διαβήτη). 28

29 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Eπίδειξη χειρισμού αναλυτή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση πηκτής (gel), (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση δισδιάστατη, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση αγαρόζης, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). 29

30 Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα glycated-hemoglobin (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Aναφορές 1. ΑΝΤΩΝΕΛΟΥ, Μ. & ΠΑΠΑΣΙΔΕΡΗ, Ι. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης διαχωρισμός πρωτεϊνών ερυθροκυτταρικής μεμβράνης. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 2. ΔΑΡΜΗ, Θ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. ΤΕΙ Αθήνας. στο: (τελευταία προσπέλαση ). 3. ΔΗΜΗΤΡΙΑΔΗΣ, Ι. (2015) Θεωρία και Πράξη των τεχνικών ηλεκτροφόρησης, ανοσοκαθήλωσης και ανοσοηλεκτροφόρησης. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 4. ΖΑΜΠΕΤΑ, Δ. (2015) Αιμοσφαιρινοπάθειες. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση: ). 5. ΠΕΤΡΟΣ, Κ., & ΑΥΓΟΥΣΤΙΝΟΣ, Α. (2015) Εργαστηριακές ασκήσεις βιολογίας. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 6. ΦΥΤΟΥ-ΠΑΛΛΗΚΑΡΗ, Α. (2005). Θεωρία Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος. 7. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2012) Αρχές Ηλεκτροφόρησης. 1η έκδοση. Αθήνα: ΑΤΕΙ Αθήνας. 8. ΛΙΑΝΙΔΟΥ, Ε. (2015) Ηλεκτροφορητικές τεχνικές. (τελευταία προσπέλαση ). 9. ΜΑΚΕΔΟΥ, Γ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών λιποπρωτεϊνών. τελευταία προσπέλαση (τελευταία προσπέλαση ) (τελευταία προσπέλαση ). 11. ΜΑΛΛΙΟΥ, Κ. (2015) Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ) 12. ΝΤΑΛΑΜΑΓΚΑ, Μ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, Πρακτική Εργαστηριακή Προσέγγιση. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 13. ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. & ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. (2001) Βασικά θέματα βιοχημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 14. ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. & ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. (2011) Εξειδικευμένα θέματα κλινικής χημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 15. ΣΑΟΥΛΗ, Ζ. (2015) Αιμοσφαιρινοπάθειες. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση: ). 16. BAYNES, J. & DOMINICZAK, M. (2002) Ιατρική Βιοχημεία. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου. 17. BECKETT, G., WALKER, S., RAE, P., ASHBY, P. (2010) Κλινική Βιοχημεία. 7 η έκδοση. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου. 18. DEVLIN, Μ. (2009) Βιοχημεία - Κλινικοί Συσχετισμοί Τόμος Ι & II. Αθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 30