Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών

Transcript

1 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Φυσιολογικές (Μη- µετουσιωτικές) Συνθήκες Μέγεθος Σχήµα Φορτίο Μετουσιωτικές Συνθήκες Μέγεθος

2 Αρχή της Μεθόδου Κάλυµµα από µόρια SDS Πολυπεπτιδική Αλυσίδα ιάλυµα πρωτεϊνών σε SDS έχει ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία επιµηκών µυκηλίων µε την πολυπεπτιδική αλυσίδα στο κέντρο να περιβάλλεται από ένα κάλυµµα µορίων SDS

3 Αποδιάταξη πρωτεϊνικών µορίων Αποδιάταξη µε απορρυπαντικό (SDS) και βρασµό ιάσπαση δισουλφιδικών δεσµών (S-S) µε αναγωγικό παράγοντα (β-me, DTT)

4 Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών σε Πηκτή Ακρυλαµιδίου Μετακίνηση αρνητικά φορτισµένων µορίων µεταξύ του θετικού και αρνητικού πόλου ηλεκτρικού πεδίου. ιαχωρισµός µορίων σε πηκτή πολυακρυλαµίδης µε βάση το µοριακό τους βάρος. Μικρότερα µόρια κινούνται ταχύτερα από εκείνα µεγαλύτερου µοριακού βάρους µε τη µορφή χαρακτηριστικών ζωνών.

5 Πήκτωµα Πολυακρυλαµίδης Μίγµαακρυλαµιδίου και δις-ακρυλαµιδίου που πολυµεριζόµενο σχηµατίζει ένα δίκτυο µε πόρους ορισµένης διαµέτρου. Η διάµετρος των πόρων καθορίζεται από την αναλογία δις-ακρυλαµίδης και ακρυλαµίδης (1:20, ελάχιστη διάµετρος). Ο πολυµερισµός επιταχύνεται από την παρουσία TEMED και απαιτεί την παρουσία υπερθειϊκού αµµωνίου (APS) για την έναρξη του πολυµερισµού. Το TEMED καταλύει τη δηµιουργία ελευθέρων ριζών από το APS, οι οποίες κατευθύνουν τον πολυµερισµό.

6 Προετοιµασία ειγµάτων Οµογενοποίηµαιστού, κυττάρων, πρωτεϊνικό διάλυµα, λυόφιλες πρωτεΐνες ιάλυση σε 2Χ διάλυµα µετουσίωσης O Farell (sample buffer) Tris-HCl ph 6,8 Glycerol SDS β-με ή DTT Bromophenol Blue ή pyronin y

7 Αρχή ιαχωρισµού Πρωτεϊνών Πήκτωµα Επιστοιβάσεως Πήκτωµα ιαχωρισµού

8 Κλίµακα ιαχωρισµού Πηκτής SDS-Ακρυλαµίδης Συγκέντρωση* Ακρυλαµίδης (%) ,5 5,0 Γραµµική Κλίµακα ιαχωρισµού (kd) *Αναλογία δις-ακρυλαµίδης/ακρυλαµίδης: 1:29

9 Εφαρµογές Μεθόδου Μοριακό βάρος πρωτεϊνών Καθαρότητα Βαθµός γλυκοσυλίωσης και περιεκτικότητα υδατανθράκων Αριθµός και Μοριακό βάρος υποµονάδων

10 ιάκριση µεταξύ µονοµερών και πολυµερών πρωτεϊνών

11 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Μη-ειδικές Χρώσεις Coomassie Brilliant Blue (αντιστρεπτή) Νιτρικός άργυρος (µη αντιστρεπτή) Κολλοειδές διάλυµα χρυσού (µη αντιστρεπτή) Ponceau S (αντιστρεπτή) Ειδικές Χρώσεις Ανοσόχρωση

12 Coomassie brilliant blue Τρι-φένυλο-µεθάνιο:xρωστική υφασµάτων. Το πήκτωµα µονιµοποιείται σε διάλυµα 45% µεθανόλης και 10% οξικού οξέως, για να κατακρηµνιστούν οι πρωτεΐνες και να αποφευχθεί η διάχυσή τους. Ανίχνευση πρωτεϊνών σε συγκέντρωση τουλάχιστον 0,1 µg.

13 Χρώση Πηκτής µε Άργυρο Αντίδραση ιόντων αργύρου µε τις πλευρικές αλυσίδες των αµινοξέων. Αναγωγή των ιόντων αργύρου που έχουν δεσµευθεί φορές µεγαλύτερη ευαισθησία από τη χρώση µε Coomassie Brilliant Blue (ανίχνευση µέχρι και 0,1-1 ng πρωτεΐνης).

14 Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνών σε µεµβράνες Οι πρωτεϊνικές ζώνες που έχουν διαχωριστεί στην πηκτή µπορούν να µεταφερθούν σε µεµβράνες (νιτροκυτταρίνης, PVDF, Immobilon). Η ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών από το πήκτωµαστη µεµβράνη που βρίσκεται σε άµεση επαφή µε την πηκτή, βασίζεται στην εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου, µε αποτέλεσµα οι αρνητικά φορτισµένες πρωτεΐνες να µετακινούνται από την αρνητικά φορτισµένη πηκτή προς τη µεµβράνη που βρίσκεται στην άνοδο, όπου και ακινητοποιούνται.

15 ιάταξη πηκτής-µεµβράνης στη συσκευή ηλεκτροµεταφοράς Σφουγγαράκι ιηθητικό Χαρτί Μεµβράνη Πηκτή ιηθητικό Χαρτί Σφουγγαράκι Άνοδος Σφουγγαράκι ιηθητικό Χαρτί Μεµβράνη Κάθοδος Σφουγγαράκι ιηθητικό Χαρτί Πηκτή

16 Ανοσόχρωση Πρωτεϊνών Υπόστρωµα Φως, Χρώµα Ένζυµο Προϊόν 1ο Αντίσωµα 2ο Αντίσωµα εσµευµένη πρωτεΐνη Μεµβράνη

17 Σύµπλοκη MBP-PrP IEGR MBP-PrP: 66.1 kda MBP: 42.5 kda MBP (42.5 kda) PrP (23.6 kda) Πέψη µε Παράγοντα Χ + PrP: 23.6 kda Αλληλουχία Αναγνώρισης του Παράγοντα Χ (Factor X): Ile-Glu-Gly-Arg

18 SDS-PAGE της ανθρώπινης PrP σε πηκτή ακρυλαµιδίου 12% kda Χρώση µε Coomassie Ανοσοανίχνευση µε anti-prp Ab MBP-PrP MBP PrP

19 Υπολογισµός Σχετικής Κινητικότητας Σχετική κινητικότητα (Relative mobility) = Απόσταση µετατόπισης ζώνης Απόσταση µετατόπισης του µετώπου Μετατόπιση ζώνης Μετατόπιση Μετώπου Αρχή πηκτώµατος Ζώνη πρωτεΐνης «Α» Μέτωπο (Dye Front) Βαµµένες πρωτεΐνες που δεν έχουν αναλυθεί Χρώση µε Coomassie Brilliant Blue

20 Ηλεκτροφορετική Ανάλυση Πρωτεϊνικών Μορίων Αν. Καθ. Θεόδωρος Σκλαβιάδης Σοφία Λαυρεντιάδου, Ph.D. Σπύρος Πετράκης, Υποψ. ιδάκτορας

21 Εφαρµογές Μεθόδου Χαρακτηρισµός αγνώστων πρωτεϊνικών µορίων (υποδοχείς, λειτουργικές και δοµικές πρωτεΐνες) ιαγνωστική

22 Αρχή ιαχωρισµού Πρωτεϊνών Ασυνεχές σύστηµα ρυθµιστικών διαλυµάτων Ρυθµιστικά διαλύµατα µε διαφορετικό ph και σύσταση. ηµιουργία ασυνεχούς διαβάθµισης ph και τάσης.

23 Πήκτωµα Επιστοιβάσεως (stacking gel) 30:0,8 ακρυλαµίδιο/δισακρυλαµίδιο (4-6%) Μ Tris-HCl, ph 6,8 SDS, APS, TEMED Μεγάλη διάµετρος πόρων, χαµηλή συγκέντρωση άλατος και χαµηλό ph. Ιόντα Χλωρίου (Cl - ) µε µεγαλύτερη ηλετροφορητική κινητικότητα από εκείνη των πρωτεϊνών (ιόντα οδηγοί, leading ions).

24 Ρυθµιστικό ιάλυµα Ηλεκτροφόρησης Μ Tris Base, ph M Γλυκίνη 0.1% SDS Ιόντα γλυκίνης µε µικρότερη ηλετροφορητική κινητικότητα από εκείνη των πρωτεϊνών (συρόµενα ιόντα, trailing ions).

25 Πήκτωµα ιαχωρισµού (separating gel) 30:0,8 ακρυλαµίδιο/δισακρυλαµίδιο (5-15%) 0.33 Μ Tris-HCl, ph 8,8 SDS, APS, TEMED Μικρή διάµετρος πόρων, υψηλή συγκέντρωση άλατος και βασικό ph Ιόντα γλυκίνης µε ηλετροφορητική κινητικότητα µεγαλύτερη από εκείνη των πρωτεϊνών. ιαχωρισµός πρωτεϊνών µε βάση το µέγεθός τους.

26 Αρχή ιαχωρισµού Πρωτεϊνών Τα ιόντα οδηγοί δηµιουργούν µία ζώνη χαµηλής αγωγιµότητας ανάµεσα σε αυτά και την πρωτεϊνική ζώνη. ιαβάθµιση υψηλής τάσης. πρωτεΐνες µετακινούνται γρηγορότερα και συσσωρεύονται στη ζώνη µεταξύ των οδηγών (Cl - ) και συρόµενων (Gly + ) ιόντων.

27 Μεταβολή του Rf σε συνάρτηση µε το % ακρυλαµιδίου