ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ MOROCCAN WATERMELON MOSAIC VIRUS (MWMV) ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΟΛΟΚΥΝΘΟΕΙΔΩΝ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ, ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗ ΤΟΥ ΜΕ ΑΦΙΔΕΣ Χρήστος Κ. Ξάνθης Γεωπόνος ΔΠΘ Μεταπτυχιακή Διατριβή Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Γεωπονίας, της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογιάς και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Τριμελής εξεταστική επιτροπή Ν.Ι Κατής Καθηγητής Εισηγητής Α. Λαγοπόδη Επίκουρη Καθηγήτρια Μέλος Β. Ι Μαλιόγκα Επίκουρη Καθηγήτρια Μέλος Θεσσαλονίκη, Σεπτέμβριος 2015

2 Χρήστος Κ. Ξάνθης ΑΠΘ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ MOROCCAN WATERMELON MOSAIC VIRUS (MWMV) ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΟΛΟΚΥΝΘΟΕΙΔΩΝ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ, ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗ ΤΟΥ ΜΕ ΑΦΙΔΕΣ Η ολοκλήρωση της διπλωματικής εργασίας συγχρηματοδοτήθηκε μέσω του Έργου «Υποτροφίες ΙΚΥ» από πόρους του ΕΠ «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση», του Ευρωπαϊκού Κοινοτικού Ταμείου (ΕΚΤ) του ΕΣΠΑ,

3

4

5 Στους γονείς μου, Κώστα και Ευγενία στον αδελφό μου, Δημήτρη στη Βίκυ

6

7 Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Γεωπονίας, της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογιάς και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.) στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του τομέα Φυτοπροστασίας. Με την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Νικόλαο Ι. Κατή για την ανάθεση του θέματος και τις υποδείξεις του, την υπομονή του, αλλά και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη καθηγήτρια κα.μαλιόγκα Βαρβάρα καθώς και τους κ. Ευθυμίου Κωνσταντίνο και υποψήφιο διδάκτορα Λεωνίδα Λώτο για τη βοήθειά τους στις διάφορες δυσκολίες που προέκυπταν στην πορεία των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στους επίκουρους καθηγητές κα. Λαγοπόδη Αναστασία και κα. Μαλιόγκα Βαρβάρα, μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την συμβολή τους στην κριτική ανάγνωση της διατριβής και τις ουσιαστικές υποδείξεις τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες αρμόζουν στον γεωπόνο κ. Παναγιώτη Λαϊνά για την φιλοξενία και την πολύτιμη βοήθεια του στην συλλογή δειγμάτων, καθώς επίσης και στους γεωπόνους της εταιρίας GEOPLANT Α.Ε.Ε.Γ.Ε, για την πολύτιμη βοήθεια τους στην συλλογή δειγμάτων κατά τις επισκέψεις μου τα έτη στις περιοχές του Νομού Ηλείας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Μενεξέ για την βοήθειά του στην στατιστική ανάλυση μέρους των αποτελεσμάτων της μεταπτυχιακής διατριβής καθώς επίσης και τον Δρα. Ιωάννη Μαργαριτόπουλο του Τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστήμιου Θεσσαλίας για την βοήθεια του στην αναγνώριση των αφίδων. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω την Δρ. Αμαλία Κατή για την παροχή των κλώνων του είδους Myzus persicae. Τους γεωπόνους κ. Βασίλη Μπουρνάκα, Θεόδωρο Βαγγόπουλο, Στέφανο Θεοδωράκη και κ. Νικόλαο Αναστασάκη για την βοήθεια τους στην συλλογή δειγμάτων από διάφορες περιοχές της Ελλάδος. Την εταιρεία Agris Α.Ε και τους γεωπόνους Δημήτριο Μαρκόπουλο και Χρήστο Δαγκίτση για την παροχή υγιών φυταρίων αγγουριάς, καρπουζιάς και πεπονιάς καθώς και την εταιρία ΕΛΛΑΝΚΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε.Β.Ε και τον γεωπόνο κ. Χάρη Φλώρο για την παροχή σπόρων κολοκυθιάς.

8 Ένα μεγάλο ευχαριστώ αρμόζει στην φίλη μου γεωπόνο MSc Βασιλική Μαντζάνα, για τις υποδείξεις και τη βοήθεια της στη συγγραφή της μεταπτυχιακής μου διατριβής καθώς και την ανιδιοτελή και ανυπολόγιστη υποστήριξη και τη συνεχή εμψύχωση της κατά τη διάρκεια δύσκολων στιγμών. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την φίλη μου αρχιτέκτονα μηχανικό MSc Διονυσία Δεδούση, για την βοήθεια της στο σχεδιασμό εικόνων που χρησιμοποιήθηκαν στην μεταπτυχιακή μου διατριβή. Σε μια πράξη ευγνωμοσύνης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου Κωνσταντίνο και Ευγενία, και τον αδερφό μου Δημήτρη, για την συμπαράσταση τους και την ψυχολογική στήριξη τους όλα αυτά τα χρόνια. Θα ήθελα να τους ευχαριστήσω για όλες τις θυσίες που έκαναν προκειμένου να μου δώσουν την δυνατότητα να πραγματοποιήσω τις σπουδές μου.

9 Περιεχόμενα Περιεχόμενα... i Συντομογραφίες... vi Ευρετήριο... ix Περίληψη... xiv Αbstract... xv Κεφάλαιο 1 ο : Γενική εισαγωγή Οικογένεια Potyviridae- Ταξινόμηση και χαρακτηριστικά Το γένος Potyvirus Γονιδιακή οργάνωση και λειτουργία(ες) των πρωτεϊνών Οι αφίδες ως φορείς φυτικών ιών Τροφική δραστηριότητα των αφίδων Πρωτεΐνες του γένους Potyvirus που εμπλέκονται στη μετάδοση με αφίδες Πρωτεΐνες του γένους Cucumovirus που εμπλέκονται στη μετάδοση με αφίδες Οι κυριότερες ιολογικές ασθένειες φυτών της οικογένειας Cucurbitaceae Ιοί του γένους Potyvirus Ιοί του γένους Cucumovirus Ιοί του γένους Polerovirus Μέθοδοι διάγνωσης Κεφάλαιο 2 ο : Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργιες κολοκυνθοειδών στην Ελλάδα Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό Τρόπος δειγματοληψίας και συλλογή δειγμάτων Ανίχνευση και ταυτοποίηση των ιών i

10 2.2.4 Ανάλυση δεδομένων Αποτελέσματα Συχνότητα εμφάνισης ιών ανά καλλιεργητική περίοδο και ξενιστή Συχνότητα εμφάνισης ιών σε μικτές και μονές μολύνσεις Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες κολοκυθιάς Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες καρπουζιάς Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες πεπονιάς Συζήτηση Κεφάλαιο 3 ο : Εύρος ξενιστών και προσδιορισμός της αλληλουχίας του γονιδιώματος μιας Ελληνικής απομόνωσης του MWMV από καρπουζιά Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση του MWMV Εργαστηριακό εύρος ξενιστών του MWMV Αξιολόγηση αυτοφυών φυτών ως ξενιστών του MWMV Εκχύλιση ολικού RNA και προσδιορισμός της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος του MWMV Απομονώσεις του MWMV και σύγκριση αλληλουχιών Αποτελέσματα Εργαστηριακό εύρος ξενιστών του MWMV Φυσικό εύρος ξενιστών του MWMV Αλληλούχιση της ελληνικής απομόνωσης (GR13DY5) του MWMV Φυλογενετική ανάλυση Συζήτηση Κεφάλαιο 4 ο : Μετάδοση του MWMV με αφίδες Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό Υλικό Απομόνωση του MWMV ii

11 4.2.3 Αποικίες αφίδων Αναγνώριση Μετάδοση του MWMV με αφίδες Ιολογικός έλεγχος Ανάλυση δεδομένων Αποτελέσματα Μετάδοση του MWMV με κλώνους του είδους Myzus persicae Είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας (Hemiptera: Aphididae) ως φορείς του MWMV Μετάδοση του MWMV από και προς διάφορα είδη καλλιεργούμενων ξενιστών με τα είδη M. persicae και A. gossypii Δ. Μετάδοση του MWMV από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς με τα είδη M. persicae και A. gossypii Συζήτηση Κεφάλαιο 5 ο : Μελέτη της αλληλεπίδρασης στα στιλέτα και της μικτής μόλυνσης των MWMV, WMV και CMV στην πρόσληψη/μετάδοση κάθε ιού από τα είδη A. gossypii και M. persicae Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό και αφίδες Απομονώσεις ιών Φυτά κολοκυθιάς εστίες των MWMV, WMV και CMV Δοκιμές αφιδομεταδόσεων Ιολογικός έλεγχος Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από μονές/μικτές μολύνσεις με τα είδη M. persicae και A. gossypii Αλληλεπίδραση των ιών MWMV, WMV και CMV στα στοματικά μόρια του είδους M. persicae Συζήτηση Βιβλιογραφία iii

12 Παράρτημα Ι Παράρτημα ΙΙ iv

13 v

14 Συντομογραφίες Συντομογραφίες ιών AWMV BaYMV Αλγερινός ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Algerian watermelon mosaic virus) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού του κριθαριού (Barley yellow mosaic virus) BBWV-1 Ιός 1 του μαρασμού του κουκιού (Broαd bean wilt virus 1) BPYV Iός του ψευδοίκτερου των τεύτλων (Beet pseudo-yellows crinivirus) BVY Ιός Υ του βατόμουρου (Blackberry virus Y) BYDV BYMV CABYV CCYV CGMMV ClYVV CMV CYSDV EMDV LMV MABYV MDMV MeCMV MNSV MWMV PeMV Ιός του κίτρινου νανισμού του κριθαριού (Barley yellow dwarf virus) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού της φασολιάς (Bean yellow mosaic virus) Αφιδομεταδιδόμενος ίκτερος των κολοκυνθοειδών (Cucurbit aphid-borne yellow virus) Ιός του χλωρωτικού ικτέρου των κολοκυνθοειδών (Cucumber chlorotic yellow virus) Ιός της πράσινης ποικιλοχλώρωσης με μωσαϊκό της αγγουριάς (Cucumber green mottle mosaic virus) Ιός των κίτρινων νεύρων του τριφυλλιού (Clover yellow vein virus) Iός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber mosaic virus) Ιός του κίτρινου παραμορφωτικού νανισμού των κολοκυνθοειδών (Cucurbit yellow stunting disorder virus) Ιός του ποικιλοχρωρωτικού νανισμού της μελιτζάνας (Eggplant mottled dwarf virus) Ιός του μωσαικού του μαρουλιού (Lettuce mosaic virus) Ιός του αφιδομεταδιδόμενου ίκτερου της πεπονιάς (Melon aphid-borne yellows virus) Ιός του μωσαϊκού με νανισμό του αραβόσιτου (Maize dwarf mosaic virus) Ιός του χλωρωτικού μωσαϊκού της πεπονιάς (Melon chlorotic mosaic virus) Ιός της νεκρωτικής κηλίδωσης της πεπονιάς (Melon necrotic spot virus) Μαροκινός ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Moroccan watermelon mosaic virus) Ιός της ποικιλοχλώρωσης της αραχίδας (Peanut mottle virus) vi

15 PLRV PPV PRSV-P PRSV-W PSbMV PStV Ιός του καρουλιάσματος των φύλλων της πατάτας (Potato leafroll virus) Ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus) Ιός της δακτυλιοειδούς κηλίδωσης της παπάγιαs (Papaya ringspot virus-p) Ιός της δακτυλιοειδούς κηλίδωσης της παπάγιαs (Papaya ringspot virus-w) Ιός του μωσαϊκού του μπιζελιού (Pea seed-borne mosaic virus) Ιός της ράβδωσης της αραχίδας (Peanut stripe virus) PVY Ιός Υ της πατάτας (Potato virus Y) RGMV RYMV SABYV SMV SqMV SqVYV WMV WSMV ZTMV ZYFV ZYMV Ιός του μωσαϊκού της ήρας (Ryegrass mosaic virus) Ιός της κίτρινης ποικιλοχλώρωσης του ρυζιού (Rice yellow mottle virus) Ιός του αφιδομεταδιδόμενου ικτέρου του Suakwa (Suakwa aphid-borne yellows virus) Ιός του μωσαϊκού της σόγιας (Soybean mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού της κολοκύθας (Squash mosaic virus) Ιός του κιτρινίσματος των νεύρων της κολοκυθιάς (Squash vein yellowing virus) Ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Watermelon mosaic virus) Ιός του ραβδωτού μωσαϊκού του σιταριού (Wheat streak mosaic virus) Ιός του τιγρέ μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini tigré mosaic virus) Ιός της κίτρινης στιγμάτωσης της κολοκυθιάς (Zucchini yellow fleck virus) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini yellow mosaic virus) Άλλες συντομογραφίες 5 -RACE aa AAP ANOVA BE bp cdna Ταχεία ενίσχυση του 5 άκρου του c-dna Άμινοξέα (amino acids) Χρόνος πρόσληψης (Acquisition Access Period) Ανάλυση παραλλακτικότητας (Analysis of Variation) Βαθμοί Ελευθερίας Ζεύγη Βάσεων (base pair) Συμπληρωματικό DNA (complementary DNA) vii

16 CP Καψιδιακή πρωτεΐνη (Coat Protein) DEPC Διαίθυλοπυροανθρακικός εστέρας (Diethylpyrocarbonate) DMSO Διμέθυλοσουλφοξίδιο (Dimethyl sulfoxide) DNA Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (Deoxyribonucleic acid) dntps 5 τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (Deoxynucleotides triphosphate) dsrna Δίκλωνο RNA (double stranded RNA) DTT Διθειοθρεϊτόλη (Dithiothreitol) EDTA Αιθύλενο διάμινο τετραοξικό οξύ (Εthylenediaminetetraacetic acid) ELISA Ανοσοενζυμική δοκιμή (Enzyme-linked immunosorbent assay) IAP Χρόνος μετάδοσης (Inoculation Access Period) ICTV Διεθνής Επιτροπή της Συστηματικής Ταξινόμησης των Ιών (International Committee on Taxonomy of Viruses) IgG γ-σφαιρίνη (Immonoglobulin G) kb Χιλιάδες βάσεων (kilo base) kda Χιλιάδες Dalton (kilo Dalton) MB Μοριακό βάρος mm Χιλιοστομοριακότητα (Millimolar) Mtr μεθυλοτρανσφεράση (Methylotransferase) nm Νανόμετρα (nanometer) nt Νουκλεοτίδια (nucleotide) ORF Ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης, ΑΠΑ (Open Reading Frame) PCR Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction) Poty-ιοί Ιοί του γένους Potyvirus rcf Σχετική φυγόκεντρος δύναμη (Relative centrifugal force) RdRp RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (RNA-dependent-RNA-polymerase) RNA Ριβονουκλεικό οξύ (Ribonucleic acid) rpm Στροφές ανά λεπτό (Revolutions per minute) RT-PCR Αντίστροφη μεταγραφή PCR (Reverse Transcription PCR) SD Τυπική απόκλιση (Standard Deviation) SE Τυπικό σφάλμα (Standard Error) ssrna Μονόκλωνο RNA (single stranded RNA) TRIS 2 άμινο 2 υδροξυμέθυλο 1,3 προπανοδιόλη [2 Amino 2 (hydroxymethyl) 1,3 propanediol] U Ενεργότητα ενζύμου (Enzyme unit) μμ Μικρομοριακότητα (Micromolar) viii

17 Ευρετήριο Εικόνες Εικόνα 1.1. (α)ηλεκτρονική μικρογραφία νηματοειδών ιικών σωματιδίων PPV και (β) κυλινδρικά έγκλειστα σωματίδια σε κύτταρα του φυτού Nicotiana benthamiana μολυσμένα με τον PPV (Ράβδος α, β= 200 nm) (López-Moya and García, 2008; King et al., 2012)... 3 Eικόνα1.2. Διάγραμμα της οργάνωσης του γονιδιώματος του γένους Potyvirus καθώς και λειτουργία(ες) των πρωτεϊνών. (τροποποιημένο από τους Mishra et al., 2013) (Α) Οι μαύρες γραμμές αναπαριστούν το RNA με την πρωτεΐνη VPg και την poly-a ουρά στο 5 και 3 άκρο, αντίστοιχα. Η πολυπρωτεΐνη είναι με γκρι χρώμα, ενώ η PIPO με σκούρο πράσινο. Τα πλαίσια αναπαριστούν τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα του ιού (Συντομογραφίες των ονομάτων των πρωτεϊνών αναγράφονται μέσα στα πλαίσια ενώ τα αντίστοιχα μεγέθη αυτών παρουσιάζονται κάτω από τα πλαίσια εκφρασμένα σε kda). Οι θέσεις τομής της πολυπρωτεΐνης συμβολίζονται με ( ) ενώ οι πρωτεινάσες (με πλάγια γράμματα) και η θέση την οποία κόβουν την πολυπρωτεΐνη παρουσιάζονται πάνω από αυτήν. Η πρωτεϊνάση Nia (κόκκινο) είναι υπεύθυνη για την διάσπαση όλων των πρωτεϊνών εκτός αυτών που διασπώνται από την P1 (πράσινο) και HC-Pro (γκρι) πρωτεϊνάση. (Β) Σχηματική αναπαράσταση των σημαντικότερων περιοχών της HC-Pro και CP χωρισμένων σε 3 περιοχές. Δίνονται οι λειτουργίες των περιοχών καθώς και η θέση των συντηρημένων λειτουργικών μοτίβων (αλληλουχία αμινοξέων, ΑΑ: amino acids); KITC και PTK: μετάδοση με αφίδες, FRNK: καταστολέας της σίγησης, IGN: διακυτταρική μετακίνηση και αναπαραγωγή, C(C,S)C: διασυστηματική μετακίνηση, DAG: μετάδοση με αφίδες (τροποποιημένο με βάση το μοντέλο που έχει προταθεί για την HC-Pro του ιού του μωσαικού του μαρουλιού (Lettuce mosaic virus, LMV) από τους Plisson et al., 2003)... 6 Εικόνα 1.3. Σχηματική αναπαράσταση του άκρου του στοματικού μορίου του είδους M. persicae (Τροποποιημένο από Taylor & Robertson, 1974). Β) Τελικό άκρο του στιλέτου όπου διακρίνονται: τροφικός αγωγός (FC), αγωγός σιέλου (SC) και κοινός (ή κεντρικός) αγωγός (CC) (Brault et al., 2010) Εικόνα 1.4. Τομή του άκρου του στιλέτου της αφίδας καθώς τρέφεται σε επιδερμικά κυτταρικά τοιχώματα και αναπαράσταση του μοντέλου μετάδοσης του ιού μέσω της θεωρίας έκκρισης σιέλου (salivation theory) (αριστερά), έκκριση σιέλου (πάνω) και λήψη φυτικού χυμού (κάτω) (τροποποιημένο από Martín et al., 1997). Διαγραμματική παρουσίαση του στιλέτου της αφίδας και της θέσης του ιοσωματίου σε αυτό (δεξιά), μοντέλο που απεικονίζει την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης HC-Pro, του στιλέτου της αφίδας και της CP του poty-ιού καθώς και τα λειτουργικά μοτίβα απαραίτητα για την μετάδοση (τροποποιημένο από Raccah et al., 2001) Εικόνα 1.5. Θέσεις διατήρησης των ιοσωματίων στα στοματικά μόρια των αφίδων-φορέων. Στον κεντρικό αγωγό στην άκρη του στιλέτου, οι μη-έμμονοι ιοί αλληλοεπιδρούν με τους υποδοχείς (ενσωματωμένοι στην επιδερμίδα) του στιλέτου της αφίδας. 1) Στην καψιδιακή στρατηγική (capsid strategy), τα ιοσωμάτια προσδένονται απευθείας στους υποδοχείς, μέσω ενός μοτίβου της CP (π.χ. ιοί του γένους Cucumovirus), 2) Στην βοηθητική στρατηγική (helper strategy), τα ιοσωμάτια προσδένονται στους υποδοχείς μέσω της HC-Pro του ιού (π.χ. ιοί του γένους Potyvirus) (Τροποποιημένο από Blanc et al., 2011) Εικόνα 1.6. Συμπτώματα που σχετίζονται με ιολογική προσβολή σε κολοκυνθοειδή. Ίκτερος σε αγγούρι (Α) και κολοκύθι (Ζ) από τους Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) και Cucurbit aphid-borne yellow virus (CABYV), ix

18 αντίστοιχα. Παραμόρφωση φύλλων σε πεπόνι από τους Watermelon mosaic virus (WMV) (Β), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) (Ε) και Cucumber mosaic virus (CMV) σε κολοκύθι (Δ), Eggplant mottled dwarf virus (EMDV) σε αγγούρι (Γ). Παραμόρφωση καρπών από μόλυνση με WMV σε κολοκύθι (Η) και πεπόνι (Θ).[Εικόνες (Α,Ε) από προσωπικό αρχείο κ. Ν.Ι. Κατή, (Β,Γ,Δ,Ζ,Η,Θ) από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη] Εικόνα 1.7. Γεωγραφική κατανομή του MWMV. Με μπλε χρώμα έχουν επισημανθεί οι χώρες όπου έχει γίνει αναφορά του ιού Εικόνα 1.8. Συμπτώματα προσβολής από τον MWMV. (Α) Μεταχρωματισμός, φλύκταινες και παραμόρφωση φύλλου σε κολοκυθιά, (Β) Παραμόρφωση καρπών κολοκυθιάς και (Γ) C. moschata. Παραμόρφωση φύλλου και μικροφυλλία σε καρπουζιά (Δ) (από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη) Εικόνα 1.9. Εικονική αναπαράσταση μετάδοσης μη-έμμονου ιού(ων) με αφίδες. (Α-Γ): Διαφορετικά στάδια ανάπτυξης επιδημίας από τους ιούς π.χ.: CMV και WMV σε καλλιέργεια κολοκυθιού. Με πράσινο χρώμα απεικονίζονται τα υγιή φυτά ενώ με κόκκινο τα μολυσμένα με τον ιό(ους). Τα βέλη αναπαριστούν τις τήσεις των αφίδων στην καλλιέργεια όπου με πράσινο και κόκκινο απεικονίζονται οι μη- ιοφόρες και ιοφόρες αφίδες, αντίστοιχα (Τροποποιημένο από τους Astier et al., 2007) Εικόνα 2.1. Νομοί της Ελλάδος όπου πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες (επισημαίνονται με γκρι), και τα φυτικά ειδή που συλλέχθηκαν από κάθε περιοχή τα έτη Εικόνα 2.2. Τρόπος διεξαγωγής της δειγματοληψίας. Η πράσινη γραμμή αναπαριστά την κατεύθυνση δειγματοληψίας ενώ οι κόκκινες κουκίδες τα δείγματα που επιλέγονταν Εικόνα 2.3. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε καλλιέργειες κολοκυθιάς και οι αντίστοιχοι ιοί που ανιχνεύθηκαν τα έτη Εικόνα 2.4. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε καλλιέργειες καρπουζιάς και οι αντίστοιχοι ιοί που ανιχνεύθηκαν τα έτη Εικόνα 2.5. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε καλλιέργειες πεπονιάς και οι αντίστοιχοι ιοί που ανιχνεύθηκαν τα έτη Εικόνα 2.6. Συμπτώματα παραμόρφωσης φύλλου που έχει προκληθεί από μόλυνση με τον CMV σε κολοκυθιά (Α). Δεσμίωση νεύρων και ποικιλοχλώρωση σε φύλλο καρπουζιάς από τον PRSV (Β). Μικτή μόλυνση από τους MWMV+CABYV (Γ) και WMV+CMV (Δ) σε κολοκυθιά και πεπονιά, αντίστοιχα. Παραμόρφωση φύλλων καρπουζιάς (Ε) και κολοκυθιάς (Ζ) από τον WMV. Παραμόρφωση και ποικιλοχλώρωση καρπών, καρπουζιάς (Η) και κολοκυθιάς (Θ) από μικτές μολύνσεις με τους MWMV+WMV και MWMV+WMV+PRSV, αντίστοιχα. (Από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη) Εικόνα 3.1. Απεικόνιση της οργάνωσης του γονιδιώματος του MWMV και στρατηγική αλληλούχησης, που περιλαμβάνει διαδοχικές αντιδράσεις τμημάτων του γονιδιώματος. Υποδεικνύονται η σχετική θέση των εκκινητών και τα αντίστοιχα προϊόντα (amplicons) των PCR (βλέπε Πίνακας 3.1). (Τα πλαίσια αναπαριστούν τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα του ιού: P1: P1- πρωτεΐνη, HC-Pro: Βοηθητική πρωτεΐνη, P3: P3- πρωτεΐνη, 6k1: Πρωτεΐνη 1 μεγέθους 6 kda, CI: Πρωτεΐνη κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων, 6k2: Πρωτεΐνη 2 μεγέθους 6 kda, Vpg: Πρωτεΐνη συνδεδεμένη στο ιϊκό γονιδίωμα, Nia-Pro: Πρωτεΐνη μικρών πυρηνικών εγκλείστων, Nib: Πρωτεΐνη μεγάλων πυρηνικών εγκλείστων, CP: καψιδιακή πρωτεΐνη) Εικόνα 3.2. Φυλογενετικό δέντρο ένωσης γειτόνων (Neighbor-Joining) αμινοξικών αλληλουχιών τμήματος του N-άκρου της Nib και CP 18 απομονώσεων του MWMV. Οι τιμές αριστερά στον κάθε κλάδο υποδεικνύουν το ποσοστό 500 επαναλήψεων της ανάλυσης bootstrap, η οποία υποστηρίζει την ομαδοποίηση σε κάθε κόμβο. Η κλίμακα αντιπροσωπεύει τον αριθμό αντικατάστασης των νουκλεοτιδίων ανά θέση. Το μήκος των βραχιόνων είναι ανάλογο με τις γενετικές x

19 αποστάσεις που υπολογίστηκαν. Οι κωδικοί αριθμοί των απομονώσεων δίνονται αριστερά από την κάθε περιοχή της απομόνωσης Εικόνα 4.1. Κουτιά εκτροφής αφίδων τύπου Blackman για την διατήρηση των αφίδων. Στην βάση διαθέτουν σπόγγο για κατακράτηση νερού και ανοίγματα με εντομοστεγές δίχτυ που παρέχουν αερισμό για τη συντήρηση του φύλλου Εικόνα 4.2. Ενήλικο άπτερο του είδους M. Persicae σε μόνιμο παρασκεύασμα (slide) (Α). Μορφολογία κεφαλής (Β), στοματικών μορίων (Γ), σιφωνίων και cauda (Δ) (από προσωπικό αρχείο Χ.Κ Ξάνθη) Εικόνα 4.3. Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας, πρόσληψης/μετάδοσης του MWMV που ακολουθήθηκε στα πειράματα των αφιδομεταδόσεων (Α-Γ) Εικόνα 5.1. Συμπτώματα σε φύλλα κολοκυθιάς (Borelina F1) 21 ημέρες μετά την μόλυνση από τους: Μονή μόλυνση των MWMV (Β), WMV (Γ) και CMV (Ε). Μικτή μόλυνση των MWMV+WMV (Δ) και MWMV+CMV (Ζ). Υγιές φυτό (Α). (Από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη) Εικόνα 5.2. Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε στην αλληλεπίδραση των ιών MWMV, WMV και CMV στα στοματικά μόρια του είδους M. persicae (Πείραμα Β) Πίνακες Πίνακας 1.1. Ταξινόμηση των μελών της Οικογένειας Potyviridae σε γένη. Δίνονται τυπικό μέλος, γονιδίωμα, φορέας και τρόπος μετάδοσης και αριθμός τακτικών μελών... 2 Πίνακας 1.2. Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από ιούς του γένους Potyvirus και η λειτουργία(ες) τους. Παρουσιάζονται με την σειρά που εμφανίζονται στην πολυπρωτεΐνη από το N- στο C- άκρο.(τροποποιημένο από Urcuqui-Inchima et al., 2001)... 5 Πίνακας 1.3. Οι κυριότερες ιολογικές ασθένειες των κολοκυνθοειδών. Δίνονται το γένος, ο ιός, εξάπλωση και πρώτη αναφορά παγκοσμίως (τροποποιημένο από Lecoq and Katis, 2014) Πίνακας 2.1. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες και συνολικός αριθμός ελεγχθέντων δειγμάτων τα έτη Πίνακας 2.2. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ειδική και γενική ανίχνευση των ιών. Δίνονται η ονομασία του εκκινητή, η αλληλουχία, προφίλ θερμοκυκλοποίησης καθώς και το μέγεθος του προβλεπόμενου προϊόντος Πίνακας 2.3. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στην Ελλάδα τις καλλιεργητικές περιόδους Πίνακας 2.4. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στην Ελλάδα τα έτη Πίνακας 2.5. Συχνότητα εμφάνισης μικτών μολύνσεων σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών τα έτη Πίνακας 3.1.Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του MWMV Πίνακας3.2. Εύρος ξενιστών και αντίδραση φυτοδεικτών σε μηχανική μόλυνση από την ελληνική απομόνωση του MWMV Πίνακας 3.3. Έλεγχος αυτοφυών φυτών για την παρουσία του MWMV Πίνακας 4.1. Είδη αφίδων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αφιδομεταδόσεων Πίνακας 4.2. Κλωνικές αποικίες του είδους Myzus persicae που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αφιδομεταδόσεων.. 73 Πίνακας 4.3. Μετάδοση του MWMV από και προς φυτά κολοκυθιάς με 8 κλώνους του είδους M. persicae (ενήλικα άπτερα θηλυκά) xi

20 Πίνακας 4.4. Αξιολόγηση 19 είδη αφίδων (ενήλικα άπτερα θηλυκά) ως φορέων του MWMV από και προς φυτά κολοκυθιάς και πιθανότητα μετάδοσης (P*) από ένα μεμονωμένο άτομο Πίνακας 4.5. Μετάδοση του MWMV από και προς καλλιεργούμενους ξενιστές του ίδιου είδους με τα είδη Aphis gossypii και Myzus persicae (ενήλικα άπτερα θηλυκά) Πίνακας 4.6. Μετάδοση του MWMV από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές με το είδος M. persicae (ενήλικα άπτερα θηλυκά) Πίνακας 4.7. Μετάδοση του MWMV με τα είδη M. persicae και A. gossypii (ενήλικα άπτερα θηλυκά) από μολυσμένους καρπούς και φύλλα κολοκυθιάς Πίνακας 5.1. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από τα είδη A. gossypii και M. persicae από μονές και μικτές μολύνσεις, από και προς φυτά κολοκυθιάς Πίνακας 5.2. Μετάδοση του MWMV και WMV από το είδος M.persicae μετά από διαδοχική διατροφή σε υγιή ή μολυσμένα με μονή μόλυνση από τον MWMV ή WMV φυτά κολοκυθιάς Πίνακας 5.3. Μετάδοση του MWMV και CMV από το είδος M.persicae μετά από διαδοχική διατροφή σε υγιή ή μολυσμένα με μονή μόλυνση από τον MWMV ή CMV φυτά κολοκυθιάς Διαγράμματα Διάγραμμα 2.1. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες κολοκυθιάς τα έτη Διάγραμμα 2.2. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες καρπουζιάς τα έτη Διάγραμμα 2.3. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες πεπονιάς τα έτη Διάγραμμα 4.1. Μετάδοση του MWMV από 19 είδη αφίδων (άπτερα ενήλικα θηλυκά), από και προς φυτά κολοκυθιάς. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου Διάγραμμα 4.2. Πιθανότητα μετάδοσης (± τυπικό σφάλμα) του MWV από ένα μεμονωμένο άτομο (άπτερο ενήλικο θηλυκό) 19 είδών αφίδων από και προς φυτά κολοκυθιάς. Η πιθανότητα μετάδοσης (P*) υπολογίστηκε από την εξίσωση των Gibbs and Gower (1960): P*=1-(1-R/N) 1/I. Πιθανότητες που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD) Διάγραμμα 4.3. Μετάδοση του MWMV, με τα είδη M. persicae και A. gossypii από και προς καλλιεργούμενους ξενιστές του ίδιου είδους. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Ποσοστά που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD) Διάγραμμα 4.4. Μετάδοση του MWMV, με το είδος M. persicae από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Ποσοστά που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD) Διάγραμμα 4.5. Μετάδοση του MWMV, με το είδος M. persicae και A.gossypii από μολυσμένους καρπούς και φύλλα κολοκυθιάς. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Ποσοστά που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD) Διάγραμμα 5.1. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από τα είδη M. persicae και A. gossypii, όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε από φυτά κολοκυθιάς με μονές μολύνσεις. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), xii

21 ± τυπικό σφάλμα (SE) του μέσου όρου. *Στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P<0.05) σύμφωνα με τον U-έλεγχο των Mann- Whitney Διάγραμμα 5.2. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από τα είδη M. persicae και A. gossypii, όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε από μολυσμένα φυτά κολοκυθιάς σε μικτές μολύνσεις. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπικό σφάλμα (SE) του μέσου όρου. *Στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P<0.05) σύμφωνα με τον U- έλεγχο των Mann-Whitney Διάγραμμα 5.3. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από το είδος M. persicae μετά από διαδοχική διατροφή σε υγιή ή μολυσμένα με μονή μόλυνση από τον MWMV ή WMV ή CMV φυτά κολοκυθιάς. (Υ: Υγιές, M: MWMV, W: WMV, C: CMV) xiii

22 Περίληψη Οι αφιδομεταδιδόμενοι ιοί των γενών Potyvirus, Cucumovirus και Polerovirus αποτελούν από τους πλέον διαδεδομένους ιούς παγκοσμίως προκαλώντας σημαντικές απώλειες στην παραγωγή. Ο Μαροκινός ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Moroccan watermelon mosaic virus, MWMV) του γένους Potyvirus, αποτελεί ένα αναδυόμενο παθογόνο της καλλιέργειας των κολοκυνθοειδών τόσο της Ελλάδα όσο όλης της Μεσογειακής λεκάνης. Στην παρούσα μελέτη για τη διερεύνηση των ιολογικών προσβολών αλλά και της συχνότητας εμφάνισης των αφιδομεταδιδόμενων ιών (MWMV, WMV, ZYMV, PRSV-W, CMV, CABYV) τα έτη , πραγματοποιήθηκαν εκτεταμένες δειγματοληψίες από καλλιέργειες κολοκυνθοειδών από 27 νομούς της χώρας μας. Ο ιός με την μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης σε καλλιέργειες κολοκυθιάς, καρπουζιάς και πεπονιάς ήταν ο WMV ενώ σε καλλιέργειες αγγουριάς ο πιο συχνά απαντώμενος ιός ήταν ο CMV. Επίσης, διερευνήθηκε το εύρος ξενιστών του MWMV καθώς επίσης προσδιορίστηκε η πλήρης αλληλουχία του γονιδιώματος μιας απομόνωσης του ιού από καρπουζιά. Η Ελληνική απομόνωση του ιού παρουσίασε υψηλά ποσοστά ομοιότητας (99%) με μια απομόνωση του ιού από την Τυνησία. Το εργαστηριακό εύρος ξενιστών του ιού περιορίζεται κυρίως σε είδη των οικογενειών Cucurbitaceae, Chenopodiaceae και Amaranthaceae, ενώ τα αυτοφυή είδη Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Conyza bonariensis και Malva sylvestris αποτελούν πηγές του ιού στη φύση. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μετάδοσης του ιού από/προς καλλιεργούμενους ξενιστές, οι οποίες ανέδειξαν την σχετικά υψηλή αποτελεσματικότητα μετάδοσής του με κλώνους του είδους Myzus persicae, ενώ τα είδη Aphis pomi, A. hederae, A. cytisorum, A. sedi και Hyalopterus. pruni, καταγράφηκαν για πρώτη φορά ως φορείς του ιού. Μελετήθηκε επιπλέον η αλληλεπίδραση στα στιλέτα και της μικτής μόλυνσης των MWMV, WMV και CMV στην πρόσληψη/μετάδοση από τα είδη M. persicae και A. gossypii. Και τα δύο είδη μετέδωσαν και τους τρεις ιούς σε μεγαλύτερο ποσοστό όταν τράφηκαν σε μολυσμένα από ένα μόνο ιό φυτά κολοκυθιάς σε αντίθεση με τις μικτές μολύνσεις. Αφίδες των ειδών M. persicae και A. gossypii, αποτέλεσαν αποτελεσματικότερους φορείς των MWMV και CMV, αντίστοιχα. Τέλος, όταν αφίδες του είδους M. persicae εκτέλεσαν διαδοχικά δοκιμαστικά νύγματα σε μολυσμένο με τον WMV ή CMV φυτό κολοκυθιάς δεν παρατηρήθηκε μείωση της ικανότητας μετάδοσης του MWMV. xiv

23 Abstract Aphid-borne viruses of the genera Potyvirus, Cucumovirus and Polerovirus constitute the most widespread viruses worldwide, causing significant losses in crop production. Moroccan watermelon mosaic virus (MWMV) belonging to the genus Potyvirus, is an emerging pathogen in cucurbit crops both in Greece and throughout the Mediterranean basin. In the current study, extensive sampling of cucurbit crops took place in 27 prefectures of Greece in order to investigate viral infections and the incidence of aphid-borne viruses (MWMV, WMV, ZYMV, PRSV-W, CMV, CABYV) during the years WMV was the virus with the highest incidence in either zucchini, watermelon or melon crops, while in cucumber crops CMV was the most common virus. The host range of MWMV was also investigated and the complete genome sequence of a MWMV Greek isolate from watermelon was determined. The Greek isolate showed high nucleotide sequence identity (99%) with a virus isolate from Tunisia. Mechanical inoculations in the laboratory showed that the virus host range is limited mainly to species of the families Cucurbitaceae, Chenopodiaceae and Amaranthaceae, while native species Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Conyza bonariensis and Malva sylvestris constitute alternative hosts of MWMV in the field. Moreover virus transmission tests were conducted from/to cultivated cucurbit hosts. The results highlighted a high transmission efficiency by clones of the species Myzus persicae, while the species Aphis pomi, A. hederae, A. cytisorum, A. sedi and Hyalopterus pruni were first recorded here as vectors of MWMV. Interaction in stylets and the effect of mixed infection of MWMV, WMV and CMV in the acquisition/transmission by the aphid species M. persicae and A. gossypii were further studied. Both species transmitted all three viruses at a greater rate when virus acquisition took place on singly infected than on mixed infected zucchini seedlings. M. persicae and A. gossypii, appeared to be more effective vectors of MWMV and CMV, respectively. Finally, individuals of the aphid species M. persicae that executed sequential probing in WMV or CMV infected zucchini plants, showed no reduction of MWMV transmission capacity. xv

24

25 Κεφάλαιο 1 ο Κεφάλαιο 1 ο Γενική Εισαγωγή 1

26 1.1 Οικογένεια Potyviridae- Ταξινόμηση και χαρακτηριστικά Η Οικογένεια Potyviridae αποτελεί την πολυπληθέστερη οικογένεια φυτικών ιών και περιλαμβάνει συνολικά 8 οριστικά γένη, ενώ ως τακτικά μέλη αναφέρονται 177 ιοί στην αναφορά της 9ης Διεθνoύς Επιτροπής για την Ταξινόμηση των ιών (International Committee on Taxonomy of Viruses ICTV) (King et al., 2012). Όλα τα μέλη της Οικογένειας Potyviridae έχουν θετικής πολικότητας μόριο ssrna, με εύκαμπτα, νηματοειδή ιοσωμάτια πλάτους nm και με μήκος που κυμαίνεται ανάλογα με το γένος από nm. Το γένος Bymovirus διαθέτει διμερές γονιδίωμα και μήκος ιοσωματίων nm, ενώ όλα τα άλλα γένη έχουν μονομερές γονιδίωμα (Πίνακας 1.1) (López-Moya & García, 2008). Πολλά μέλη της οικογένειας και πιο συγκεκριμένα του γένους Potyvirus, αποτελούν σημαντικά παθογόνα των φυτών προκαλώντας μεγάλες οικονομικές ζημιές. Ο ιός της δακτυλιοειδούς κηλίδωσης της παπάγιαs (Papaya ringspot virus, PRSV-P) θεωρείται ο πιο επιζήμιος ιός της παπάγιας παγκοσμίως (Tripathi et al., 2008), ο ιός του μωσαϊκού της γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV) προκαλεί σημαντικές οικονομικές ζημιές σε φυτά της οικογένειας Brassicaceae (Cruciferae) (Tomlinson, 1987; Ohshima et al., 2002), ενώ ο ιός Υ της πατάτας (Potato virus Y, PVY) προσβάλει ένα μεγάλο εύρος ξενιστών κυρίως της Οικογένειας Solanaceae (Valkonen, 2007). O ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus, PPV) είναι ένας από τους πιο διαδεδομένους, σημαντικούς και οικονομικά επιζήμιους ιούς σε δενδρώδεις καλλιέργειες πυρηνοκάρπων (Cambra et al., 2006; Sochor et al., 2012; García et al., 2014). Πίνακας 1.1. Ταξινόμηση των μελών της Οικογένειας Potyviridae σε γένη. Δίνονται τυπικό μέλος, γονιδίωμα, φορέας και τρόπος μετάδοσης και αριθμός τακτικών μελών Γένος Τυπικό μέλος Γονιδίωμα Brambyvirus Ιός Υ του βατόμουρου (Blackberry virus Y, BVY) Bymovirus Ιός του κίτρινου μωσαϊκού του κριθαριού (Barley yellow mosaic virus, BaYMV) Ιός της ήπιας ποικιλοχλώρωσης της Ipomovirus γλυκοπατάτας (Sweet potato mild mottle virus, SPMMV) Macluravirus Ιός του μωσαϊκού του Maclura (Maclura mosaic virus, MacMV) Poacevirus Ιός του μωσαϊκού του σιταριού (Triticum mosaic virus, TriMV) Potyvirus Ιός Υ της πατάτας (Potato virus Y, PVY) Rymovirus Tritimovirus Ιός του μωσαϊκού της ήρας (Ryegrass mosaic virus, RGMV) Ιός του ραβδωτού μωσαϊκού του σιταριού Wheat streak mosaic virus (WSMV) 2 Φορέας (Τρόπος μετάδοσης) α Μονομερές Άγνωστος 1 Διμερές Μονομερές Μύκητας (Polymyxa graminis) (Ε) Αλευρώδεις Αφίδες (ΗΕ) Αριθμός ειδών β Βιβλιογραφία (Susaimuthu et al., 2008) 6 (Zheng et al., 2002) 6 (Dombrovsky et al., 2014; Li et al., 2008) Μονομερές Αφίδες (ΜΕ) 6 (Kondo & Fujita, 2012) Μονομερές Ακάρεα Οικ. Eriophyidae (Aceria sp.) (ΗΕ) 2 (Tatineni et al., 2009) Μονομερές Αφίδες (ΜΕ) 146 (Gibbs et al., 2008) Μονομερές Μονομερές Ακάρεα Οικ. Eriophyidae (Aceria sp.) (ΗΕ) Ακάρεα Οικ. Eriophyidae (Aceria sp.) (ΗΕ) - Μονομερές Άγνωστος 2 Unassigned* *Δεν έχει προσδιοριστεί ακόμα α Ε: Έμμονος, ΗΕ: Ημι-έμμονος, ΜΕ: Μη έμμονος β Μόνο τα οριστικά μέλη αναφέρονται 3 5 (Zagula et al., 1992; French & Stenger, 2005) (Stenger & French, 2004) (Götz et al., 2002; Mollov et al., 2013)

27 1.2 Το γένος Potyvirus Το γένος Potyvirus έχει πάρει την ονομασία του από το τυπικό μέλος αυτού που είναι ο PVY όταν στα τέλη της δεκαετίας του 1920 ο Kenneth Smith μελέτησε τους ιούς που προσβάλλουν την πατάτα και ονόμασε ένα από αυτούς Potato virus Y (Smith, 1931). Αργότερα βρέθηκε ότι και άλλοι ιοί έχουν παρόμοιες με τον PVY ιδιότητες και το 1971 δόθηκε στην ομάδα των ιών αυτών το ακρωνύμιο Potyvirus.(Harrison et al., 1971). Το γένος Potyvirus περιλαμβάνει το μεγαλύτερο αριθμό ιών στην οικογένεια Potyviridae που προσβάλουν ένα μεγάλο εύρος μονοκοτυλήδονων και δικοτυλήδονων ξενιστών (Ward et al., 1995; Kehoe et al., 2014). Ιοί του γένους Potyvirus παρουσιάζουν μεγάλη συγγένεια με ιούς των γενών Comovirus και Nepovirus καθώς και του γένους Picornavirus των ζωικών οργανισμών, με βάση τη γονιδιωματική οργάνωσή τους καθώς και τις αλληλουχίες των πρωτεϊνών τους (Goldbach, 1986, 1992). Η παραλλακτικότητα μεταξύ των ιών του γένους Potyvirus με την βοήθεια φυλογενετικών αναλύσεων έχει αποτελέσει αντικείμενο έρευνας πολλών εργασιών (Shukla & Ward, 1989; Ward & Shukla, 1991; Bos, 1992; Gibbs et al., 2008; Gibbs & Ohshima, 2010). Οι ιοί του γένους μεταδίδονται με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο, ενώ αρκετοί όπως είναι ο ιός του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV) (Simmons et al., 2013) ή ο σπορομεταδιδόμενος ιός του μωσαϊκού του μπιζελιού (Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV) μεταδίδονται και με το σπόρο (Johansen et al., 1994, Roberts et al., 2003). Τα ιοσωμάτια των ιών του γένους είναι εύκαμπτα (Εικόνα 1.1α), νηματοειδή με μήκος που κυμαίνεται από nm, παρουσιάζουν ελικοειδή συμμετρία και δεν φέρουν φάκελο, ενώ το γονιδίωμά τους είναι ένα γραμμικό, μονόκλωνο θετικής πολικότητας μόριο RNA (ssrna) με μέγεθος περίπου της τάξεως των 9.7 kb (Langenberg & Zhang, 1997). α β Εικόνα 1.1. (α) Ηλεκτρονική μικρογραφία νηματοειδών ιικών σωματιδίων PPV και (β) κυλινδρικά έγκλειστα σωματίδια σε κύτταρα του φυτού Nicotiana benthamiana μολυσμένα με τον PPV (Ράβδος α, β= 200 nm) (López-Moya & García, 2008; King et al., 2012). 3

28 1.3 Γονιδιακή οργάνωση και λειτουργία(ες) των πρωτεϊνών Όλα τα μέλη του γένους Potyvirus φέρουν στο 3 άκρο πολύ-a ουρά (poly-a) του γενωμικού RNA (Hari et al., 1979), ενώ στο 5 άκρο είναι συνδεδεμένη ομοιοπολικά πρωτεΐνη VPg (genome- linked viral protein) (Hari, 1981; Siaw et al., 1985; Murphy et al., 1990). Το γονιδίωμα περιλαμβάνει ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (Open Reading Frame, ORF) η μετάφραση του οποίου δίνει μια πολυπρωτεΐνη η οποία στην συνέχεια υφίσταται συν- και μετα- μεταφραστικές τροποποιήσεις από τρεις πρωτεϊνάσες κωδικοποιημένες από τον ιό, οι οποίες την διασπούν σε 10 δομικές και μη δομικές πρωτεΐνες (Riechmann et al., 1992; Adams et al., 2005) (Εικόνα 1.2). Ορισμένες πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για τον σχηματισμό έγκλειστων σωματιδίων στα φυτικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της μόλυνσης (Dougherty & Carrington, 1988) (Εικόνα 1.1β). Η οργάνωση του γονιδιώματος καθώς και αναφορές για την λειτουργία(ες) των πρωτεϊνών δίνονται στην Εικόνα 1.2 και στον Πίνακα 1.2 αντίστοιχα. Πιο πρόσφατα, στον TuMV προσδιορίστηκε ακόμη μία πρωτεΐνη, η P3N- PIPO, η οποία προέρχεται από ένα μικρότερο ORF που ονομάστηκε pipo (Pretty Interesting Potyviridae ORF), και βρίσκεται εντός του ORF P3. Η πρωτείνη αυτή φαίνεται ότι κωδικοποιείται από ιούς του γένους Potyvirus και της οικογένειας Potyviridae γενικότερα (Chung et al., 2008).Το μέγεθος του ORF είναι μεταβλητό και ποικίλει ανάλογα με το γένος από 60 έως115 κωδικόνια (Chung et al., 2008; Hillung et al., 2013) Η P3N-PIPO επιτελεί κεντρικό ρόλο ως πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης (Wei et al., 2010; Vijayapalani et al., 2012). Η διάσπαση της PIPO δεν οδηγεί σε μεταλλάξεις της αλληλουχίας των αμινοξέων της πολυπρωτεΐνης, παρόλα αυτά μελέτες για την επίδραση πιθανών μεταλλάξεων αυτής και της πιθανής επίδρασης της στην διασυστηματική μόλυνση διερευνώνται. Σε πρόσφατη μελέτη βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη PIPO του ιού του μωσαϊκού της σόγιας (Soybean mosaic virus, SMV) εμποδίζει την μετακίνηση του ιού μέσα στο φυτό (Wen & Hajimorad, 2010), ενώ αργότερα αποδείχτηκε ότι η πρωτεΐνη P3 και όχι η PIPO ήταν υπεύθυνη για τις αλλαγές στην μολυσματικότητα του SMV (Wen et al., 2011). Πρόσφατη μελέτη υποδεικνύει ότι η P3N-PIPO είναι καθοριστικός παράγοντας για τη μολυσματικότητα του ιού των κίτρινων νεύρων του τριφυλλιού (Clover yellow vein virus, ClYVV) σε φυτά που φέρουν υπολειπόμενα γονίδια αντοχής έναντι potyιών και πιο συγκεκριμένα του ClYVV (Choi et al., 2013). Παρόλα αυτά, η επίδραση του μεγέθους της PIPO, η γενετική παραλλακτικότητά της καθώς και οι αλληλεπιδράσεις με παράγοντες του ξενιστή και την φαινοτυπική έκφρασή τους παραμένουν άγνωστες. 4

29 Πίνακας 1.2. Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από ιούς του γένους Potyvirus και η λειτουργία(ες) τους. Παρουσιάζονται με την σειρά που εμφανίζονται στην πολυπρωτεΐνη από το N- στο C- άκρο.(τροποποιημένο από Urcuqui-Inchima et al., 2001) Ονομασία Πρωτεΐνης 5 - UTR P1 HC-Pro P3 6Κ1 CI 6Κ2 VPg Nia-Pro Nib CP 3 - UTR Ονομασία και λειτουργία(ες) πρωτεΐνης 5 - Αμετάφραστη περιοχή (Un Translated Region) Ενίσχυση της μετάφρασης P1 πρωτεΐνη Πρωτεϊνάση (διάσπαση της P1/HC- Pro), Διακυτταρική μετακίνηση, Συμπτωματολογία Βοηθητική πρωτεΐνη (Helper component proteinase) Πρωτεϊνάση (διάσπαση HC- Pro/P3), Μετάδοση με αφίδες, Διασυστηματική μετακίνηση, Καταστολέας της μετα-μεταγραφικής σίγησης (PTGS) P3 πρωτεΐνη Πιθανός ρόλος στην αναπαραγωγή του ιού και έκφραση συμπτωμάτων Πιθανός ρόλος στην αναπαραγωγή του ιού και έκφραση συμπτωμάτων Πρωτεΐνη κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων (Cylindrical Inclusion protein) Ελικάση, Διακυτταρική μετακίνηση, Συμπτωματολογία Πιθανός ρόλος στην αναπαραγωγή του ιού και διασυστηματική μετακίνηση Πρωτεΐνη συνδεδεμένη στο ιϊκό γονιδίωμα (Viral genome-linked protein) Δρα ως εκκινητής για την αντιγραφή του ιού, Διακυτταρική και διασυστηματική μετακίνηση, Αλληλεπίδραση μεταξύ του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης της μετάφρασης (elf4e) και της ισομορφής της (elf(iso)4e) Πρωτεΐνη μικρών πυρηνικών εγκλείστων (Nuclear inclusion protein a) Πρωτεϊνάση (διάσπαση όλων των υπολοίπων πρωτεϊνών πέραν των P1/HC- Pro, HC- Pro/P3) Πρωτεΐνη μεγάλων πυρηνικών εγκλείστων ( Nuclear inclusion protein b) Πολυμεράση (RNA- dependent RNA polymerase, RdRp), Αναπαραγωγή του ιού Καψιδιακή πρωτεΐνη (Coat protein) Καψιδιώνει ιϊκό RNA, Μετάδοση με αφίδες, Διακυτταρική και διασυστηματική μετακίνηση, Εύρος ξενιστών, Συμπτωματολογία 3 - Αμετάφραστη περιοχή (Un Translated Region) Επαγωγή συμπτωμάτων Βιβλιογραφία (Carrington & Freed, 1990) (Verchot et al., 1991; Verchot & Carrington, 1995; Pruss et al., 1997; Arbatova et al., 1998; Valli et al., 2007; Rohozková & Navrátil, 2011) (Govier & Kassanis, 1974; Rojas et al., 1997; Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Carrington et al., 1989; Kasschau & Carrington, 1998; Plisson et al., 2003; Fukuzawa et al., 2010; Wu et al., 2010) (Riechmann et al., 1995; Langenberg & Zhang, 1997) (Sáenz et al., 2000; Waltermann & Maiss, 2006) (Laín et al., 1990; Carrington et al., 1998; Roberts et al., 1998) (Rajamäki & Valkonen, 1999; Spetz & Valkonen, 2004) (Schaad et al., 1997; Wittmann et al., 1997; Dunoyer et al., 2004; Tavert-Roudet et al., 2012;) (Carrington & Dougherty, 1987; Anindya & Savithri, 2004;) (Hong & Hunt, 1996; Li et al., 1997) (McDonald & Bancroft, 1977; Atreya et al., 1995; Dolja et al., 1994, 1995; Blanc et al., 1997; Desbiez et al., 2014; Weber & Bujarski, 2014) (Rodríguez-Cerezo et al., 1997) 5

30 Α Β Εικόνα 1.2. Διάγραμμα της οργάνωσης του γονιδιώματος του γένους Potyvirus καθώς και λειτουργία(ες) των πρωτεϊνών. (τροποποιημένο από τους Mishra et al., 2013) (Α) Οι μαύρες γραμμές αναπαριστούν το RNA με την πρωτεΐνη VPg και την poly-a ουρά στο 5 και 3 άκρο, αντίστοιχα. Η πολυπρωτεΐνη είναι με γκρι χρώμα, ενώ η PIPO με σκούρο πράσινο. Τα πλαίσια αναπαριστούν τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα του ιού (Συντομογραφίες των ονομάτων των πρωτεϊνών αναγράφονται μέσα στα πλαίσια ενώ τα αντίστοιχα μεγέθη αυτών παρουσιάζονται κάτω από τα πλαίσια εκφρασμένα σε kda). Οι θέσεις τομής της πολυπρωτεΐνης συμβολίζονται με ( ) ενώ οι πρωτεινάσες (με πλάγια γράμματα) και η θέση την οποία κόβουν την πολυπρωτεΐνη παρουσιάζονται πάνω από αυτήν. Η πρωτεϊνάση Nia (κόκκινο) είναι υπεύθυνη για την διάσπαση όλων των πρωτεϊνών εκτός αυτών που διασπώνται από την P1 (πράσινο) και HC-Pro (γκρι) πρωτεϊνάση. (Β) Σχηματική αναπαράσταση των σημαντικότερων περιοχών της HC-Pro και CP χωρισμένων σε 3 περιοχές. Δίνονται οι λειτουργίες των περιοχών καθώς και η θέση των συντηρημένων λειτουργικών μοτίβων (αλληλουχία αμινοξέων, ΑΑ: amino acids); KITC και PTK: μετάδοση με αφίδες, FRNK: καταστολέας της σίγησης, IGN: διακυτταρική μετακίνηση και αναπαραγωγή, C(C,S)C: διασυστηματική μετακίνηση, DAG: μετάδοση με αφίδες (τροποποιημένο με βάση το μοντέλο που έχει προταθεί για την HC-Pro του ιού του μωσαικού του μαρουλιού (Lettuce mosaic virus, LMV) από τους Plisson et al., 2003). 6

31 1.4 Οι αφίδες ως φορείς φυτικών ιών Οι ιοί μεταδίδονται από φυτό σε φυτό μέσω των φορέων τους, με τις αφίδες να αποτελούν τους κυριότερους φορείς. Η πλειοψηφία των αφίδων-φορέων ανήκουν στην οικογένεια Aphidoideae της υποοικογένειας Aphididae (Τάξη: Homoptera) (Blackman & Eastop, 2008) και είναι υπεύθυνες για τη μετάδοση περίπου του 50% των φυτικών ιών (Nault, 1997). Η επιτυχία των αφίδων ως φορέων ιών οφείλεται σε παράγοντες όπως: α) στην ικανότητα πολλών ειδών αφίδων να προσβάλλουν πολλούς ξενιστές (π.χ. Myzus persicae), γεγονός που συντελεί στην διασπορά ιών με μεγάλο εύρος ξενιστών, β) στην αγενή αναπαραγωγή τους (παρθενογένεση), όπου οι πληθυσμοί τους αυξάνονται με ιδιαίτερα υψηλούς ρυθμούς και γ) στη μορφολογία των στοματικών τους μορίων (νύσσοντος μυζητικού τύπου) (Εικόνα 1.3), που έχουν την ικανότητα να αποθέτουν τα ιοσωμάτια μέσα στα φυτικά κύτταρα χωρίς να προκαλούν σοβαρές ζημιές σ αυτά (Ng & Perry, 2004) Τροφική δραστηριότητα των αφίδων Τα νύσσοντος μυζητικού τύπου στοματικά μόρια αποτελούνται από δύο ζευγάρια εύκαμπτων στιλέτων (maxillary stylets) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά στη μετάδοση ιών. Τα στιλέτα προεκτείνονται έξω από την κάτω γνάθο κατά την διατροφή, ενώ ο τροφικός αγωγός (ή τροφικό κανάλι, alimentary canal) οδηγεί τα θρεπτικά στοιχεία των φυτικών κυττάρων προς την κεφαλή και τον πεπτικό σωλήνα των αφίδων. Κατά την διάρκεια της τροφικής δραστηριότητας οι αφίδες Εικόνα 1.3. Α) Σχηματική αναπαράσταση του άκρου του στοματικού μορίου του είδους M. persicae (Τροποποιημένο από Taylor & Robertson, 1974). Β) Τελικό άκρο του στιλέτου όπου διακρίνονται: τροφικός αγωγός (FC), αγωγός σιέλου (SC) και κοινός (ή κεντρικός) αγωγός (CC) (Brault et al., 2010). 7

32 εκκρίνουν σίελο στα φυτικά κύτταρα μέσω των στιλέτων από τον αγωγό σιέλου (salivary canal). Στους μη έμμονους ιούς, π.χ. των γενών Potyvirus, Cucumovirus τα ιοσωμάτια διατηρούνται στον κοινό (ή κεντρικό) αγωγό, στο τελικό άκρο του στιλέτου (acrostyle) (Uzest et al., 2010) (Εικόνα 1.3, 1.4). Η απόδειξη ότι οι poty-ιοί συγκρατούνται στο άκρο των στιλέτων επιτεύχθηκε πρώτη φορά με την βοήθεια της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Taylor & Robertson, 1974; Lim et al., 1977) Πρωτεΐνες του γένους Potyvirus που εμπλέκονται στη μετάδοση με αφίδες Η μετάδοση των ιών που ανήκουν στο γένος Potyvirus γίνεται με μη- έμμονο τρόπο, κατά τον οποίο ο ιός συγκρατείται στην άκρη των στοματικών μορίων της αφίδας (στιλέτα) (Wang et al., 1996). Η πρόσληψη των ιοσωματίων γίνεται έπειτα από εισαγωγή του στιλέτου της αφίδας στα επιδερμικά κύτταρα των φύλλων διάρκειας λίγων λεπτών (Powell et al., 2006), ενώ η μετάδοση γίνεται επίσης σε μικρό χρονικό διάστημα (λίγα λεπτά) με έκκριση σιέλου (θεωρία έκκρισης σιέλου, salivation theory) στα φυτικά κύτταρα (Εικόνα 1.4) (Collar et al., 1997; Martín et al., 1997; Powell, 2005). Για την πρόσληψη του ιού από την αφίδα-φορέα απαιτείται μια βοηθητική πρωτεΐνη (Helper component, HC-Pro), μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη η οποία επιτελεί επίσης και άλλες λειτουργίες όπως είναι η διακυτταρική και διασυστηματική μετακίνηση μέσα στον ξενιστή, η έκφραση συμπτωμάτων και η καταστολή της μετα-μεταγραφικής σίγησης (Maia et al., 1996; Hasiów- Jaroszewska et al., 2014;) (Πίνακας 1.2). Η μετάδοση μπορεί να γίνει μόνο εφόσον η αφίδα-φορέας έχει προσλάβει την HC-Pro πριν ή ταυτόχρονα με τα ιοσωμάτια (Govier & Kassanis, 1974). Όταν συγκρίθηκε η ικανότητα μετάδοσης του TuMV και του ιού της εσχάρωσης του καπνού (Tobacco etch virus, TEV) με τέσσερα διαφορετικά είδη αφίδων οι Wang et al., 1998 διαπίστωσαν ότι η αποτελεσματικότητα μετάδοσης διαφέρει μεταξύ των ειδών. Ο τροφικός αγωγός των αφίδων διαφέρει ως προς την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την HC-Pro, επομένως διαφέρει και η ικανότητα της αφίδας να διατηρήσει τα ιοσωμάτια στα στιλέτα της. Η HC-Pro διαθέτει δύο αρκετά συντηρημένα μοτίβα απαραίτητα για την μετάδοση με τις αφίδες-φορείς (Εικόνα 1.2) τα, K(I\L)(T\S)C (γνωστό και ως KITC, Lys- Ile- Thr- Cys) και το PTK (Pro- Thr- Cys) στο N- και C- άκρο αντίστοιχα (Atreya & Pirone, 1993; Huet et al., 1994; Blanc et al., 1998). Η καψιδιακή πρωτεΐνη (Coat protein, CP) είναι και αυτή μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη, η οποία διαδραματίζει ρόλο στη καψιδίωση του ιικού RNA, στη διακυτταρική και διασυστηματική μετακίνηση καθώς και στη μετάδοση με τις αφίδες-φορείς. Στο N-άκρο διαθέτει ένα συντηρημένο μοτίβο (τριπλέτα αμινοξέων), το οποίο είναι βασικό για τη μετάδοση με αφίδες. Η τριπλέτα των αμινοξέων αυτών φέρει μια παραλλακτικότητα στους ιούς του γένους Potyvirus, αλλά συνήθως 8

33 εμφανίζεται με την αλληλουχία Asp-Ala-Gly (DAG) (Εικόνα 1.2). Αλλαγές στην αλληλουχία αυτή επηρεάζουν την ικανότητα μετάδοσης (Atreya et al., 1990; López-Moya et al., 1999). Το μοτίβο DAG, είναι απαραίτητο για τη μετάδοση των poty-ιών με αφίδες. Σημειακές μεταλλάξεις της αλληλουχίας των αμινοξέων της τριπλέτας DAG καθώς και αμινοξέων κοντά στο μοτίβο DAG, οδηγούν σε σημαντική μείωση της αποτελεσματικότητα μετάδοσης ή ακόμα και στην απώλεια μετάδοσης, υποδεικνύοντας ότι το μοτίβο DAG αλλά και η αλληλουχία των αμινοξέων γύρω από αυτό διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιτυχή μετάδοση με τον φορέα (Atreya et al., 1991, 1995; López-Moya et al., 1999). Με βάση τα αποτελέσματα αυτά και της επίδρασης των μεταλλάξεων την μοτίβων της HC-Pro/CP καθώς και της αλληλεπίδρασης αυτών στη μετάδοση με αφίδες, υποδηλώνεται ότι υπάρχει μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών. Έχουν προταθεί πολλές θεωρίες για τον τρόπο Εικόνα 1.4. Τομή του άκρου του στιλέτου της αφίδας καθώς τρέφεται σε επιδερμικά κυτταρικά τοιχώματα και αναπαράσταση του μοντέλου μετάδοσης του ιού μέσω της θεωρίας έκκρισης σιέλου (salivation theory) (αριστερά), έκκριση σιέλου (πάνω) και λήψη φυτικού χυμού (κάτω) (τροποποιημένο από Martín et al., 1997). Διαγραμματική παρουσίαση του στιλέτου της αφίδας και της θέσης του ιοσωματίου σε αυτό (δεξιά), μοντέλο που απεικονίζει την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης HC-Pro, του στιλέτου της αφίδας και της CP του poty-ιού καθώς και τα λειτουργικά μοτίβα απαραίτητα για την μετάδοση (τροποποιημένο από Raccah et al., 2001). δράσης των πρωτεϊνών αυτών στο μηχανισμό μετάδοσης με την επικρατέστερη να είναι αυτή της υπόθεσης της γέφυρας (bridge hypothesis) (Pirone & Blanc, 1996), όπου η HC-Pro λειτουργεί ως γέφυρα μεταξύ των ιοσωματίων και του υποδοχέα στο στιλέτο της αφίδας. Το μοτίβο DAG της CP και το PTK μοτίβο της HC-Pro εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση του ιοσωματίου και της HC-Pro, αντίστοιχα και είναι απαραίτητα για την μετάδοση του ιού με τον φορέα, ενώ το μοτίβο KITC της 9

34 HC-Pro μπορεί να αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα στα στιλέτα της αφίδας (Εικόνα 1.2) (Blanc et al., 1997, 1998b, Flasinski & Cassidy, 1998; Peng et al., 1998) Πρωτεΐνες του γένους Cucumovirus που εμπλέκονται στην μετάδοση με αφίδες Οι ιοί του γένους Cucumovirus όπως ο ιός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber mosaic virus, CMV) μεταδίδονται επίσης με μη-έμμονο τρόπο, χωρίς όμως να είναι αναγκαία η ύπαρξη βοηθητικής πρωτεΐνης (Pirone & Blanc, 1996). Όπως περιγράφτηκε παραπάνω για τους poty-ιούς και στους cucumo-ιούς τα ιοσωμάτια διατηρούνται στο τελικό άκρο των στιλέτων (Εικόνα 1.5). Στην περίπτωση των Cucumo-ιών η CP είναι η μοναδική ιική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη μετάδοση με αφίδες και στην αποτελεσματικότητα αυτής και συμβάλει στη συγκράτηση των ιοσωματίων στα στιλέτα του φορέα (Chen & Francki, 1990; Megahed & Pirone, 1966). Τα αμινοξέα στις θέσεις της CP, είναι συντηρημένα μέσα στο γένος Cucumovirus (Liu et al., 2002) και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάδοση, καθώς εμπλέκονται στην σύνδεση μεταλλικών Εικόνα 1.5. Θέσεις διατήρησης των ιοσωματίων στα στοματικά μόρια των αφίδων-φορέων. Στον κεντρικό αγωγό στην άκρη του στιλέτου, οι μη-έμμονοι ιοί αλληλοεπιδρούν με τους υποδοχείς (ενσωματωμένοι στην επιδερμίδα) του στιλέτου της αφίδας. 1) Στην καψιδιακή στρατηγική (capsid strategy), τα ιοσωμάτια προσδένονται απευθείας στους υποδοχείς, μέσω ενός μοτίβου της CP (π.χ. ιοί του γένους Cucumovirus), 2) Στην βοηθητική στρατηγική (helper strategy), τα ιοσωμάτια προσδένονται στους υποδοχείς μέσω της HC-Pro του ιού (π.χ. ιοί του γένους Potyvirus) (Τροποποιημένο από Blanc et al., 2011). ιόντων που επηρεάζουν την πολικότητα στην επιφάνεια των ιοσωματίων και είναι κρίσιμα στην αλληλεπίδραση ιού-φορέα (Perry et al., 1998; Smith et al., 2000). Επίσης, αλλαγές των αμινοξέων στις θέσεις 25 (σερίνη σε προλίνη), 168 (κυστεΐνη σε τυροσίνη) και 214 (αργινίνη σε γλυκίνη) επηρεάζουν τη μετάδοση του CMV με το είδος M. persicae (Perry et al., 1994). Συνολικά αμινοξέα 10

35 σε 5 θέσεις της CP επηρεάζουν την μετάδοση του CMV με τα είδη A. gossypii και M.persicae (Perry et al., 1998; Ng & Falk, 2006). 11

36 1.5 Οι κυριότερες ιολογικές ασθένειες φυτών της οικογένειας Cucurbitaceae Τα κολοκυνθοειδή προσβάλλονται παγκοσμίως από τουλάχιστον 59 ιούς εκ των οποίων στην Μεσογειακή Λεκάνη έχουν αναφερθεί τουλάχιστον 28, που μεταδίδονται με αφίδες, αλευρώδεις και μύκητες (Lecoq & Desbiez, 2012) (Πίνακας 1.3). Η πλειονότητα των ιών αυτών, προσβάλλει μεγάλο αριθμό φυτικών ειδών που ανήκουν σε διαφορετικές οικογένειες, ενώ ορισμένοι περιορίζονται σε φυτικά είδη της οικογένειας Cucurbitaceae (Provvidenti, 1996). Tα τυπικά συμπτώματα ιολογικής προσβολής στα κολοκυνθοειδή κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες (Blancard et al., 1995): Μωσαϊκό και ποικιλοχλώρωση στα φύλλα, παραμορφώσεις του ελάσματος των φύλλων, φλύκταινες και νημάτωση των φύλλων, ενώ η παραμόρφωση και ποικιλοχλώρωση των καρπών υποβαθμίζουν την ποιότητα και την αξία τους. Έντονο κιτρίνισμα (ίκτερος) και πάχυνση των κατώτερων (παλαιότερων) φύλλων, χωρίς την παρουσία συμπτωμάτων στους καρπούς ενώ η παραγωγή συνήθως μειώνεται. Νέκρωση ή νεκρωτικές κηλίδες στα φύλλα και τους καρπούς ή και καθολικός μαρασμός. Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότεροι ιοί ή νέα στελέχη ιών κάνουν την εμφάνισή τους σε διάφορες περιοχές του κόσμου με τον αριθμό αυτών να έχει τριπλασιαστεί με περισσότερους του ενός ιούς να καταγράφονται για πρώτη φορά κάθε χρόνο (Lecoq & Katis, 2014). Ορισμένοι από τους νέους ιούς ενδέχεται να μην είναι νέοι αλλά η παρουσία τους στις καλλιέργειες να έχει επικαλυφθεί από την παρουσία άλλων ιών που προκαλούν παρόμοια συμπτώματα ή τα συμπτώματά τους να συγχέονταν και με άλλα αίτια όπως για π.χ. την έλλειψη ιχνοστοιχείων (τροφοπενίες). Επίσης, η έλλειψη κατάλληλων διαγνωστικών μεθόδων αποτελούσε σοβαρό πρόβλημα διερεύνησης για την ταυτοποίηση των παθογόνων αιτίων, διαφόρων ασθενειών. Για παράδειγμα, ο αφιδομεταδιδόμενος ίκτερος των κολοκυνθοειδών (Cucurbit aphid borne yellows virus, CABYV) του γένους Polerovirus ο οποίος προκαλεί συμπτώματα ικτέρου στα παλαιότερα φύλλα που παραπέμπουν σε τροφοπενία, προσδιορίστηκε για πρώτη φορά το 1988, ενώ ανιχνεύτηκε σε δείγματα που είχαν συλλεχθεί από το 1982 (Lecoq et al., 1992). O CABYV είναι ένας ιός με παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση και είναι ιδιαίτερα διαδεδομένος στη Μεσογειακή λεκάνη και στην Ασία. Τα τελευταία χρόνια έχουν προσδιοριστεί αρκετά νέα στελέχη του, που στη συνέχεια με τη βοήθεια της σύγκρισης των νουκλεοτιδικών τους αλληλουχιών και φυλογενετικών 12

37 αναλύσεων βρέθηκε ότι πρόκειται για νέα είδη μέσα στο γένος (Xiang et al., 2008; Shang et al., 2009; Knierim et al., 2010, 2014). Διεθνώς, οι πιο διαδεδομένοι ιοί των κολοκυνθοειδών είναι οι αφιδομεταδιδόμενοι που ανήκουν στα γένη Potyvirus, Cucumovirus και Polerovirus καθώς και οι αλευρωδομεταδιδόμενοι ιοί του γένους Crinivirus (Πίνακας 1.3). Οι ιοί του γένους Crinivirus τα τελευταία χρόνια παρουσιάζονται ως αναδυόμενοι και ορισμένοι έχει αναφερθεί ότι προκαλούν επιδημίες σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών σε διάφορες περιοχές του κόσμου (Tzanetakis et al., 2013). Αυτό οφείλεται κυρίως στην πληθυσμιακή αύξηση των αλευρωδών που αποδίδεται στην αλόγιστη χρήση των φυτοπροστατευτικών ουσιών καθώς και τη μεγάλη γεωγραφική εξάπλωση των αλευρωδών φορέων τους (Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum) (Wisler et al., 1998; Navas-Castillo et al., 2011, 2014). Ειδικότερα, ο ιός του κίτρινου παραμορφωτικού νανισμού των κολοκυνθοειδών (Cucumber yellow stunting disorder crinivirus, CYSDV) είναι από τους πιο διαδεδομένους ιούς στις υπό κάλυψη καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στην Ισπανία όπου υψηλοί πληθυσμοί αλευρωδών στις αρχές της καλλιεργητικής περιόδου ευνοούν την πρόκληση σοβαρών επιδημιών (Ruiz et al., 2006). Στην χώρα μας ενδημούν τρείς ιοί του γένους Crinivirus: ο ιός του ψευδοίκτερου των τεύτλων (Beet pseudoyellows virus, BPYV) ο CYSDV ενώ πιο πρόσφατα (2014) ταυτοποιήθηκε στη Ρόδο και την Κρήτη ένας νέος crini-ιός, ο ιός του χλωρωτικού ικτέρου των κολοκυνθοειδών (Cucumber chlorotic yellow virus, CCYV), που αποτελεί αναδυόμενο παθογόνο των κολοκυνθοειδών τόσο για την Ελλάδα όσο και για την υπόλοιπη Μεσογειακή λεκάνη (Abrahamian & Abou-Jawdah, 2014; Orfanidou et al., 2014). 13

38 Πίνακας 1.3. Οι κυριότερες ιολογικές ασθένειες των κολοκυνθοειδών. Δίνονται το γένος, ο ιός, εξάπλωση και πρώτη αναφορά παγκοσμίως (τροποποιημένο από Lecoq & Katis, 2014) Ιός Φορέας α Εξάπλωση Cucumovirus Πρώτη αναφορά β Βιβλιογραφία Cucumber mosaic virus (CMV) Αφίδες (ΜΕ) Παγκόσμια 1916 (Doolittle, 1916; Jacquemond, 2012) Potyvirus Watermelon mosaic virus (WMV) Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) Papaya ringspot virus-w (PRSV-W) Moroccan watermelon mosaic virus (MWMV) Αφίδες (ΜΕ) Αφίδες (ΜΕ) Αφίδες (ΜΕ) Αφίδες (ΜΕ) Παγκόσμια (εύκρατες) και Μεσόγειος 1954 Παγκόσμια 1981 Παγκόσμια (Τροπικές και υποτροπικές) Αφρική, Ευρώπη (Cohen & Nitzany, 1963; Webb & Scott, 1965; Avgelis, 1983) (Lisa, 1981; Kyriakopoulou & Varveri, 1991) (Webb & Scott, 1965; Dikova, 1995; Papayiannis et al., 2005) (Fischer & Lockhart, 1974; Malandraki et al., 2014) Polerovirus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) Αφίδες (Ε) Παγκόσμια 1992 (Lecoq et al., 1992; Lecoq et al., 1994; Mnari-Hattab et al., 2009) Crinivirus Beet pseudo-yellows virus (BPYV) Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) Cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV) Αλευρώδεις (ΗΕ) Αλευρώδεις (ΗΕ) Αλευρώδεις (ΗΕ) Παγκόσμια 1965 Ευρώπη, Αμερική, Μέση Ανατολή Ελλάδα, Κίνα, Μέση Ανατολή, Βόρεια Αφρική (Duffus, 1965; Coffin & Coutts, 1995; Boubourakas et al., 2006) (Hassan & Duffus, 1991; Berdiales et al., 1999; Papayiannis et al., 2005; Ruiz et al., 2006) (Okuda et al., 2010; Orfanidou et al., 2014) Comovirus Squash mosaic virus (SqMV) Κολεόπτερα (ΗΕ) Παγκόσμια 1941 (Freitag, 1941; Freitag, 1956; Fulton et al., 1987) Carmovirus Melon necrotic spot virus (MNSV) Μύκητας Παγκόσμια 1966 (Kishi, 1966; Avgelis, 1989) Tobamovirus Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) Δεν έχει φορέα (Μηχανικά) Παγκόσμια 1935 (Ainsworth, 1935; Antignus et al., 1990; Avgelis & Vovlas, 1986; Boubourakas et al., 2004; Varveri et al., 2002) Nucleorhabdovirus Eggplant mottled dwarf Άγνωστος Ευρώπη 1982 (Lecoq, 1982; Katis et al., 2000) virus (EMDV) α Δίνεται ο τρόπος μετάδοσης όπου: ΜΕ: Μη έμμονος, ΗΕ: Ημι-έμμονος, Ε: Έμμονος β Παγκοσμίως 14

39 1.5.1 Ιοί του γένους Potyvirus Ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Watermelon Mosaic Virus, WMV) Ιστορική αναδρομή: Η πρώτη αναφορά ασθενειών που προκαλούν μωσαϊκό στα κολοκυνθοειδή έγινε στη δεκαετία του 1920, ενώ το 1940 ο Milbrath κατέγραψε μια ασθένεια στην καρπουζιά (Citrullus lanatus) στην Καλιφόρνια με την ονομασία του παθογόνου αιτίου να παραμένει αμφιλεγόμενη μέχρι και το Το 1965 οι Webb & Scott σύγκριναν συνολικά 10 απομονώσεις από το νότιο τμήμα των ΗΠΑ του συμπλόκου watermelon mosaic virus όπως ήταν γνωστό τότε και με πειράματα σταυροειδούς προστασίας, ορολογικών ιδιοτήτων αλλά και με την αξιολόγηση του εύρους και της έκφρασης των συμπτωμάτων σε διάφορους ξενιστές, διαφοροποίησαν αυτές τις απομονώσεις σε δύο γκρουπ, τα WMV1 και WMV2. Αργότερα, το 1979, οι Purcifull και Hiebert, απέδειξαν με βάση τις ορολογικές ιδιότητες τους ότι πρόκειται για δύο διαφορετικούς ιούς. Γεωγραφική εξάπλωση: Ο WMV έχει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση και απαντάται σε πολλές περιοχές της Μεσογειακής λεκάνης αλλά και άλλες της εύκρατης ζώνης, ενώ απαντάται σπανίως ή δεν έχει ανιχνευθεί καθόλου σε τροπικές περιοχές (Lecoq & Desbiez, 2012). Στην Μεσογειακή λεκάνη, ο WMV καταγράφηκε για πρώτη φορά το 1963 στο Ισραήλ (Cohen & Nitzany, 1963), ενώ στην χώρα μας καταγράφηκε σε καλλιέργειες πεπονιάς στην Κρήτης το 1983 (Avgelis, 1983) (Πίνακας 1.3). Συμπτωματολογία, εύρος ξενιστών και επιδημιολογία: Τα συμπτώματα ενδέχεται να ποικίλουν ανάλογα με την απομόνωση του ιού, το χρόνο μόλυνσης, τις περιβαλλοντικές συνθήκες αλλά και την ποικιλία του ξενιστή. Τα συμπτώματα που προκαλεί είναι τυπικά των ιών του γένους Potyvirus όπως, μωσαϊκό, έντονη παραμόρφωση των φύλλων και των καρπών (Εικόνα 1.6), δεσμίωση των νεύρων, νημάτωση των φύλλων, μείωση του ελάσματος καθώς και έντονο νανισμό, αν η προσβολή γίνει σε πρώιμο στάδιο. Μια απομόνωση του ιού προκαλεί νεκρώσεις σε εμβολιασμένα καρπούζια στην Ιταλία (Crescenzi et al., 2001). O WMV έχει μεγάλο εύρος ξενιστών (φυσικό αλλά και εργαστηριακό) συγκριτικά με άλλους ιούς του γένους που προσβάλλουν τα κολοκυνθοειδή, με περισσότερα των 170 ειδών σε 27 οικογένειες μονο- ή δικοτυλήδονων φυτών (Shukla et al., 1994; Lecoq & Desbiez, 2008). Σε φυσικές συνθήκες, εκτός από τα κολοκυνθοειδή προσβάλλει και άλλα φυτικά είδη όπως το σπανάκι, ψυχανθή, όπως ο αρακάς (Schroeder & Provvidenti, 1971), το καρότο αλλά και βολβώδη όπως η βανίλια (Wang et al., 1993), η ορχιδέα και το Habenaria radiata (Gara et al., 1997; Parry & Persley, 2005). Ως εναλλακτικοί ξενιστές του WMV στην φύση έχουν αναφερθεί τα ζιζάνια Capsella bursa-pastoris, Senecio vulgaris, Fumaria officinalis, Sonchus oleraceus, Malva sp, Molucella laevis, Ranunculus 15

40 sardous και Amaranthus palmeri (Lecoq & Desbiez, 2012; Ali et al., 2012; Lecoq et al., 2014). Επιδημιολογικές μελέτες στην Ισπανία, έδειξαν ότι οι ελάχιστες θερμοκρασίες επηρεάζουν την επιδημιολογία του WMV, καθώς επηρεάζουν τους εναλλακτικούς ξενιστές του ιού ή τις αφίδεςφορείς που παρουσιάζουν ευαισθησία στις χαμηλές θερμοκρασίες (Alonso-Prados et al., 2003). Ως φορείς του ιού έχουν αναφερθεί τουλάχιστον 35 είδη αφίδων από 19 διαφορετικά γένη. Τα είδη M. persicae, Aphis gossypii, Aphis craccivora και Macrosiphum euphorbiae είναι αποτελεσματικοί φορείς των WMV καθώς και του ZYMV (Adlerz, 1987; Castle et al., 1992; Lecoq & Desbiez, 2008). Δεν έχει αναφερθεί μετάδοση του ιού με το σπόρο των κολοκυνθοειδών, όμως έχει αναφερθεί μετάδοση του WMV με το σπόρο της ψευδακακίας (Robinia pseudoacacia) μόνο όμως σε μικτή μόλυνση με τον PRSV (Laney et al., 2012). Γενετική Παραλλακτικότητα: Η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία μιας απομόνωσης του ιού, από την νοτιοανατολική Γαλλία (WMV-Fr) έγινε γνωστή το 2004 από τους (Desbiez & Lecoq, 2004), ενώ το 2006 δημοσιεύτηκαν οι πλήρεις γονιδιωματικές αλληλουχίες δύο ακόμη απομονώσεων, από την Κίνα (WMV-CH) και το Πακιστάν (WMV-PK) (Ali et al., 2006; Wu et al., 2006). Σήμερα στη διαδικτυακή βάση δεδομένων του NCBI ( είναι διαθέσιμες οι πλήρης γονιδιωματικές αλληλουχίες 33 απομονώσεων. Με βάση τα δεδομένα αυτά, προέκυψε ότι ο WMV προήλθε έπειτα από ανασυνδυασμό των ιών μωσαϊκού της σόγιας (Soybean mosaic virus, SMV) και του κοινού μωσαϊκού της φασολιάς (Bean common mosaic virus, BCMV), που προσβάλουν τα ψυχανθή (Desbiez & Lecoq, 2004; Valli et al., 2007). Ο WMV παρουσιάζει μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα, και με βάση την αλληλουχία των αμινοξέων της CP του ιού έχουν οριστεί τρεις ομάδες, οι G1-G3, ενώ έχουν περιγραφεί και νέα αναδυόμενα στελέχη ( EM από το emerging) από ανασυνδυασμούς στελεχών του ιού (Moreno et al., 2004; Desbiez & Lecoq, 2008; Desbiez et al., 2007, 2009, 2011; Lecoq et al., 2011) Ιός της δακτυλιοειδούς κηλίδωσης της παπάγιας (Papaya Ringspot Virus-W, PRSV-W) Ιστορική αναδρομή: Ο όρος Papaya ringspot virus (PRSV) χρησιμοποιήθηκε πρώτη φορά την δεκαετία του 1940 για να περιγράψει μια ιολογική ασθένεια της παπάγιας (Carica papaya L.). Αρχικά η ονομασία αυτή χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει τις δακτυλιοειδείς κηλίδες (ringspot) που εμφάνιζαν οι καρποί των ασθενών φυτών (Jensen, 1949), ενώ το 1980 του δόθηκε η ονομασία Papaya ringspot virus, PRSV (Gonsalves, 1998). Γεωγραφική εξάπλωση: Ο PRSV έχει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση και προσβάλει κυρίως την παπάγια αλλά και κολοκυνθοειδή, με καταστροφικές συνέπειες για την παραγωγή. Έχουν 16

41 περιγραφεί δύο ομάδες με βάση τις μοριακές, τις ορολογικές αλλά κυρίως τις βιολογικές ιδιότητές απομονώσεων του PRSV, το στέλεχος PRSV-P, από το Papaya απομονώσεις του οποίου προσβάλουν την παπάγια, ενώ σε μικρότερη συχνότητα τα κολοκυνθοειδή, και το στέλεχος PRSV- W (PRSV-W, από το watermelon), που προσβάλει φυτικά είδη των οικογενειών Cucurbitaceae και Chenopodiaceae αλλά όχι την παπάγια (Tripathi et al., 2008). Ο PRSV-W προσβάλει καλλιέργειες κολοκυνθοειδών σε πολλές περιοχές της Μεσογειακής λεκάνης, όπως στη Γαλλία, Βουλγαρία, Ισπανία, Τυνησία, Τουρκία και την Κύπρο (Dikova, 1995; Luis-Arteaga et al., 1998; Papayiannis et al., 2005; Köklü & Yilmaz, 2006; Mnari-Hattab et al., 2008). Στην χώρα μας, η πρώτη αναφορά του ιού έγινε το 1979 (Russo et al., 1979). Συμπτωματολογία, εύρος ξενιστών και επιδημιολογία: Τα συμπτώματα του PRSV-W είναι τυπικά του γένους Potyvirus και παρόμοια με αυτά που προκαλεί ο WMV, ενώ σε μερικές ποικιλίες πεπονιάς προκαλεί τοπικές αλλά και διασυστηματικές νεκρώσεις (Quiot-Douine et al., 1986). Σε φυσικές συνθήκες έχει αναφερθεί να προσβάλλει τα αυτοφυή φυτά Momordica charantia (Chin et al., 2007), Physalis angulate, Solanum nigrum, Cucurbita foetidissima και Amaranthus palmeri (Ali et al., 2012). Ως φορείς του ιού έχουν αναφερθεί τουλάχιστον 24 είδη αφίδων από 15 διαφορετικά γένη. Μεταξύ αυτών είναι τα είδη M. persicae, A. gossypii, A. craccivora, A. citricola και Macrosiphum euphorbiae (Mora-Aguilera et al., 1992; Kalleshwaraswamy & Kumar, 2008; Kumar et al., 2010). Δεν έχει αναφερθεί μετάδοση με τον σπόρο των κολοκυνθοειδών και της παπάγιας αν και ανιχνεύθηκε σε 2 από τους 1355 σπόρους παπάγιας (Bayot et al., 1990). Έχει αναφερθεί μετάδοση με τον σπόρο για την ψευδακακία (Robinia pseudoacacia) (Laney et al., 2012). Γενετική Παραλλακτικότητα: Μέχρι σήμερα στη διαδικτυακή βάση δεδομένων του NCBI ( είναι διαθέσιμες οι πλήρεις γονιδιωματικές αλληλουχίες 28 απομονώσεων. Σε εργαστηριακές συνθήκες μόνο μία μετάλλαξη του αμινοξέος στην 27 η θέση της NIaPro πρωτεΐνης του PRSV είναι ικανή για την αλλαγή του εύρους ξενιστών από την παπάγια στα κολοκυνθοειδή και αντίστροφα (Chen et al., 2008). Πολλοί ιοί του γένους Potyvirus παρουσιάζουν συγγένεια με τον PRSV, με παρόμοιες βιολογικές και ορολογικές ιδιότητες και με περιορισμένο εύρος ξενιστών, κυρίως κολοκυνθοειδή. Ο μοριακός χαρακτηρισμός είναι απαραίτητος για να διευκρινιστεί εάν μια ιϊκή απομόνωση αντιπροσωπεύει ένα νέο είδος ή είναι στέλεχος ενός ιού, που έχει ήδη περιγραφεί. Ένα στέλεχος του PRSV που προκαλεί διαφορετικά συμπτώματα από αυτά του PRSV απομονώθηκε από καλλιέργειες κολοκυθιάς στη Γουαδελούπη (Γαλλικές Δυτικές Ινδίες) και του δόθηκε η ονομασία PRSV-T (T, από το tiger ), λόγω των συμπτωμάτων του που έμοιαζαν με 17

42 ραβδώσεις (Quiot-Douine et al., 1986). Σήμερα, ο PRSV-T αποτελεί ένα νέο είδος του γένους Potyvirus με την ονομασία ιός του τιγρέ μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini tigré mosaic virus, ZTMV), έχει υψηλή συγγένεια με τον PRSV και ενδημεί στη Βενεζουέλα και στην Κόστα Ρίκα (Romay et al., 2014a). Στην Μεσογειακή Λεκάνη απαντώνται και άλλοι ιοί με υψηλή συγγένεια με τον PRSV, όπως είναι οι, Μαροκινός ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Moroccan watermelon mosaic virus, MWMV), ο Αλγερινός ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Algerian watermelon mosaic virus, AWMV) και ο ιός της κίτρινης στιγμάτωσης της κολοκυθιάς (Zucchini yellow fleck virus, ZYFV) (McKern et al., 1993; Desbiez et al., 2007b; Yakoubi et al., 2008). 18

43 Εικόνα 1.6. Συμπτώματα που σχετίζονται με ιολογική προσβολή σε κολοκυνθοειδή. Ίκτερος σε αγγούρι (Α) και κολοκύθι (Ζ) από τους Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) και Cucurbit aphid-borne yellow virus (CABYV), αντίστοιχα. Παραμόρφωση φύλλων σε πεπόνι από τους Watermelon mosaic virus (WMV) (Β), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) (Ε) και Cucumber mosaic virus (CMV) σε κολοκύθι (Δ), Eggplant mottled dwarf virus (EMDV) σε αγγούρι (Γ). Παραμόρφωση καρπών από μόλυνση με WMV σε κολοκύθι (Η) και πεπόνι (Θ).[Εικόνες (Α,Ε) από προσωπικό αρχείο κ. Ν.Ι. Κατή, (Β,Γ,Δ,Ζ,Η,Θ) από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη]. 19

44 Μαροκινός ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Moroccan Watermelon Mosaic Virus, MWMV) Ιστορική αναδρομή: Ο ΜWMV παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σε καλλιέργειες καρπουζιάς που παρουσίαζαν συμπτώματα μωσαϊκού στο Μαρόκο το 1974 και αρχικά θεωρήθηκε στέλεχος του ιού WMV (Fischer & Lockhart, 1974). Αργότερα, αποδείχθηκε ότι πρόκειται για νέο ιό (McKern et al., 1993). Στη χώρα μας ο ιός ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε περιοχές του νομού Ηλείας και Μεσσηνίας σε υβρίδια κολοκυθιάς ανεκτικά στους WMV, ZYMV και CMV (Malandraki et al., 2014). Γεωγραφική εξάπλωση: Έως τώρα έχει εντοπιστεί σε διάφορες χώρες της Αφρικής, όπως τη Νότια Αφρική (Meer & Garnett, 1987) τη Ζιμπάμπουε (Wechmar & Jaffar, 1991), τη Νιγηρία (Thouvenel et al., 1986), το Μπενίν (Kone et al., 2010), το Καμερούν (Yakoubi et al., 2008a), τη Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό (Arocha et al., 2008), το Σουδάν (Lecoq et al., 2001) καθώς και στο Νεπάλ (Dahal et al., 1997), ενώ στη Μεσογειακή λεκάνη έχει καταγραφεί στην Τυνησία (Yakoubi et al., 2008a), στη Νοτιοδυτική Ισπανία (Quiot-Douine et al., 1990) στις Καναρίους Νήσους (Yakoubi et al., 2008a), στην Κεντρική Ιταλία (Roggero et al., 1998) και στη Νοτιοδυτική Γαλλία (Lecoq et al., 2008) (Εικόνα 1.7). Εικόνα 1.7. Γεωγραφική κατανομή του MWMV. Με μπλε χρώμα έχουν επισημανθεί οι χώρες όπου έχει γίνει αναφορά του ιού. Συμπτωματολογία, εύρος ξενιστών και επιδημιολογία: Στα φύλλα προκαλεί έντονο μωσαϊκό, μεσονεύρια χλώρωση με υπερυψωμένες φλύκταινες σκούρου πράσινου χρώματος, παραμορφώσεις και νημάτωση. Οι παραγόμενοι καρποί, εάν η προσβολή των φυτών γίνει σε νεαρό στάδιο, είναι ελάχιστοι και είναι έντονα παραμορφωμένοι με φλύκταινες (Εικόνα 1.8). Τα ασθενή φυτά έχουν μειωμένη ανάπτυξη (Fischer & Lockhart, 1974). Παρόμοια συμπτώματα προκαλούν και άλλοι ιοί (CMV, ZYMV, WMV, PRSV-W). 20

45 Στη φύση ο MWMV προσβάλλει είδη της οικογένειας Cucurbitaceae (Fischer & Lockhart, 1974), ενώ προσβάλει και την παπάγια (Arocha et al., 2008). Σε συνθήκες εργαστηρίου βρέθηκε ότι μολύνει τα είδη C. amaranticolor και C. quinoa της Οικογένειας Chenopodiaceae (Yakoubi et al., 2008a), ενώ πρόσφατα ανιχνεύθηκε στα είδη Lagenaria breviflorous και Coccinia barteri της Οικογένειας Cucurbitaceae στη νοτιοανατολική Νιγηρία (Owolabi et al., 2012). Εικόνα 1.8. Συμπτώματα προσβολής από τον MWMV. (Α) Μεταχρωματισμός, φλύκταινες και παραμόρφωση φύλλου σε κολοκυθιά, (Β) Παραμόρφωση καρπών κολοκυθιάς και (Γ) C. moschata (Γ). Παραμόρφωση φύλλου και μικροφυλλία σε καρπουζιά (Δ) (από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη). Έχουν αναφερθεί ποικιλίες με αντοχή έναντι του MWMV. Έρευνα στα πλαίσια αναζήτησης γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στον ιό, έδειξε ότι η ποικιλία αγγουριάς Taichung Mou Gua είναι ανθεκτική στον ιό (Kabelka & Grumet, 1997). Σημειωτέο, ότι η ποικιλία αυτή διαθέτει επίσης αντοχή στους ιδιαίτερα επιζήμιους ιούς ZYMV, WMV και PRSV-W. Επίσης, γονίδια αντοχής στον ιό εντοπίστηκαν και σε άλλα είδη κολοκυνθοειδών, όπως στο C. moschata cv. Nigeria με αντοχή έναντι του ZYMV και σε πεπόνι C. melo WMR 29 (Quiot-Douine et al., 1990) με αντοχή έναντι του PRSV- W. Τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι προγράμματα γενετικής βελτίωσης μπορούν να παρέχουν αποτελεσματικό έλεγχο του ιού. Γενετική Παραλλακτικότητα: Στη διαδυκτιακή βάση δεδομένων NCBI ( είναι διαθέσιμη η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία μιας μόνο απομόνωσης του ιού, από κολοκυθιά από την Τυνησία (MWMV-Tn) (Κωδικός αριθμός: EF579955), 21

46 ενώ αλληλουχίες τμημάτων της πολυμεράσης (Nib) και της CP διαφόρων απομονώσεων σε χώρες όπου έχει καταγραφεί ο ιός είναι επίσης διαθέσιμες (Yakoubi et al., 2008a). Φυλογενετικές αναλύσεις, με συγκρίσεις άλλων ειδών ή απομονώσεων του γένους Potyvirus έδειξαν ομαδοποίηση του MWMV με τον PRSV. Συγκρίσεις της πλήρους γονιδιωματικής αλληλουχίας του MWMV με απομονώσεις του PRSV έδειξαν ομοιότητα 62,3-62,6% σε επίπεδο νουκλεοτιδικών (nt) αλληλουχιών και 65,3-65,8% σε επίπεδο αμινοξέων (aa) ενώ με άλλους ιούς του γένους Potyvirus που προσβάλουν τα κολοκυνθοειδή (WMV, ZYMV) η ομοιότητα είναι 52,7-53,8% σε επίπεδο νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και 48,6% σε επίπεδο αμινοξέων (Yakoubi et al., 2008a). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία του MWMV-Tn (EF579955) παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια με τους AWMV και ZTMV με ομοιότητα σε επίπεδο νουκλεοτιδικών αλληλουχιών 64,4% (66,8% σε επίπεδο αμινοξέων) και 61,4-61,5% (60,8-61,3% σε επίπεδο αμινοξέων), αντίστοιχα (Romay et al., 2014a) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini Yellow Mosaic Virus, ZYMV) Ιστορική αναδρομή: Το 1973 μια νέα ιολογική ασθένεια των κολοκυνθοειδών εντοπίσθηκε σε φυτά κολοκυθιάς (Cucurbita pepo) στη Βόρεια Ιταλία με συμπτώματα διαφορετικά από αυτά των ήδη γνωστών ιών των κολοκυνθοειδών (WMV, PRSV και CMV). Τα ασθενή φυτά παρουσίαζαν έντονο νανισμό και έντονη παραμόρφωση του ελάσματος των φύλλων και των καρπών. Τελικώς, το 1981, ταυτοποιήθηκε ως παθογόνο αίτιο της ασθένειας ένας νέος ιός του γένους Potyvirus, και του δόθηκε η ονομασία Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), (Lisa, 1981). Γεωγραφική εξάπλωση: Ο ZYMV έχει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση σε εύκρατα, υποτροπικά και τροπικά κλίματα όπου καλλιεργούνται τα κολοκυνθοειδή. Έχει ανιχνευθεί σε υπαίθριες αλλά και υπό-κάλυψη καλλιέργειες κολοκυνθοειδών σε πολλές χώρες της Ευρώπης όπως την Βουλγαρία, Ισπανία, Πορτογαλία και Ολλανδία, στην Ασία, Αφρική, Αμερική και Ωκεανία (Desbiez & Lecoq, 1997). Στην χώρα μας, η πρώτη καταγραφή του ιού σε καλλιέργειες κολοκυθιάς έγινε το 1991 (Kyriakopoulou & Varveri, 1991). Συμπτωματολογία, εύρος ξενιστών και επιδημιολογία: Τα συμπτώματα που προκαλεί είναι τυπικά ιών του γένους Potyvirus με κύρια χαρακτηριστικά την έντονη παραμόρφωση των καρπών και των φύλλων, έντονο νανισμό, εάν η μόλυνση γίνει σε πρώιμο στάδιο, και κίτρινο μεταχρωματισμό των φύλλων (Εικόνα 1.6). Οι σπόροι των ασθενών φυτών ενίοτε είναι παραμορφωμένοι και έχουν μικρή φυτρωτική ικανότητα (Lecoq & Desbiez, 2008). Εάν η μόλυνση γίνει σε πρώιμο στάδιο, οι απώλειες της παραγωγής εξαιτίας της παραμόρφωσης των καρπών οι 22

47 οποίοι καθίστανται μη εμπορεύσιμοι, μπορεί να φτάσουν και το 100% (Blua & Perring, 1989; Fletcher et al., 2000; Coutts et al., 2011a). Στο εργαστηριακό εύρος του ιού ανήκουν είδη από 11 βοτανικές οικογένειες δικοτυλήδονων φυτών όπως είναι οι Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae κ.α. (Desbiez & Lecoq, 1997; Massumi et al., 2011). Στους φυτοδείκτες, Chenopodium amaranticolor και Chenopodium quinoa της οικογένειας Chenopodiaceae προκαλεί τοπικές νεκρωτικές κηλίδες. Εκτός από φυτά της οικογένειας Cucurbitaceae ο ZYMV προσβάλει και το σουσάμι (Sesamum indicum) (Mahgoub et al., 1997), καθώς και ορισμένα καλλωπιστικά (Althaea rosae, Begonia sempervirens και Consolida ajacis) τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία του ιού καθώς και στη διατήρησή του, απουσία της κύριας καλλιέργειας (Choi et al., 2002; Hong & Chen, 2011; Lecoq et al., 2014). Τα αυτοφυή, Chenopodium album, Plantago media, Rumex obtusifolius, Lamium amplexicaule, Ranunculus sardous, Ipomoea hederaceae, Cucurbita foetidissima, Rhynocosia minima και Stellaria media αποτελούν εναλλακτικούς ξενιστές του ιού στη φύση (Riedle-Bauer et al., 2002; Svoboda et al., 2002; Müller et al., 2006; Coutts et al., 2011; Ali et al., 2012; Lecoq et al., 2014). Ως φορείς του ιού έχουν αναφερθεί τουλάχιστον 26 είδη αφίδων που αποικίζουν ή όχι τα κολοκυνθοειδή (Katis et al., 2006), μεταξύ των οποίων τα είδη M. persicae, A. gossypii, A. craccivora, A. nerii, A. fabae, Macrosiphum rosae κ.α. (Adlerz, 1987; Perring et al., 1992; Castle et al., 1992; Yuan, 1996). Μια ιδιαίτερη σχέση έχει παρατηρηθεί μεταξύ του ZYMV και της τροφικής δραστηριότητας ενός είδους που αποικίζει τα κολοκυνθοειδή του A. gossypii. Βρέθηκε ότι η διάρκεια ζωής αλλά και η αναπαραγωγή αφίδων του είδους A. gossypii ήταν υψηλότερη σε σχέση με την διατροφή των αφίδων στα υγιή φυτά, ενώ σημαντική ήταν επίσης και η αύξηση του αριθμού των πτερωτών μορφών του είδους όταν τρέφονταν σε φυτά κολοκυθιάς μολυσμένα με τον ZYMV. Ακόμη, φυτά που ήταν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα μολυσμένα με τον ZYMV, φάνηκε ότι το κίτρινο χρώμα το φύλλων, εξαιτίας των συμπτωμάτων που προκαλούσε ο ιός ήταν πιο ελκυστικά για τις αφίδες και η τροφική δραστηριότητα αυτών διαφοροποιήθηκε, κάνοντας περισσότερα νύγματα σε επιδερμικά κύτταρα του φυτού σε σχέση με το φλοίωμα παραμένοντας πάνω στο φυτό για μικρότερο χρονικό διάστημα σε σύγκριση με τα υγιή φυτά. Τα χαρακτηριστικά αυτά πιθανώς ευνοούν έμμεσα την εξάπλωση του ZYMV (Blua & Perring, 1989). Η μετάδοση του ZYMV με το σπόρο αποτελούσε για χρόνια ένα αναπάντητο ερωτηματικό. Όμως διάφορες μελέτες έδειξαν ότι μεταδίδεται με το σπόρο διαφόρων γενοτύπων κολοκυθιάς και η συχνότητα μετάδοσης κυμαίνεται από 0,047 έως 1,6% (Schrijnwerkers et al., 1991; Tóbiás & 23

48 Palkovics, 2003; Coutts et al., 2011b), ενώ δεν αποδείχτηκε μετάδοση με τον σπόρο στα είδη C. maxima και C. moschata αν και ελέγχθηκαν >9500 σπέρματα καρπών. Σε μια άλλη ποικιλία κολοκυθιού (C. pepo subsp. texana) το ποσοστό μόλυνσης έφτανε το 1,6%, ενώ η ανίχνευση του ιού ήταν εφικτή μόνον με την τεχνική της RT-PCR αλλά όχι με τις κλασσικές ορολογικές μεθόδους (Simmons et al., 2011). Δεν μεταδίδεται με το σπόρο πεπονιάς, καρπουζιάς και αγγουριάς (Robinson et al., 1993; Desbiez & Lecoq, 1997; Glasa & Kollerova, 2007). Η μετάδοση του ZYMV με τον σπόρο δικαιολογεί την ταχεία εξάπλωσή του σε πολλές χώρες του κόσμου αλλά και της Μεσογειακής λεκάνης τη δεκαετία του 1980 (Lecoq & Desbiez, 2012). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι ο ZYMV μπορεί να μεταδοθεί σε καλλιέργεια κολοκυθιάς μηχανικά κατά την διάρκεια των καλλιεργητικών εργασιών όπως, η φυτοπροστασία, η λίπανση, η συγκομιδή καθώς και με την ενδυμασία των καλλιεργητών (ρούχα, παπούτσια), παρέχοντας έτσι πολύτιμες πληροφορίες για την επιδημιολογία του ιού (Coutts et al., 2013). Τα αποτελέσματα αυτά τονίζουν την αναγκαιότητα για θέσπιση κανόνων υγιεινής στην καλλιέργεια κολοκυνθοειδών, για την αποφυγής μολύνσεων τόσο από τον ZYMV αλλά και από άλλους ιούς του γένους Potyvirus που ενδέχεται να μεταδίδονται με τον ίδιο τρόπο. Γενετική Παραλλακτικότητα: Μέχρι σήμερα στη διαδικτυακή βάση δεδομένων του NCBI ( είναι διαθέσιμη η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία 39 απομονώσεων. Από τα κύρια χαρακτηριστικά του ZYMV είναι η μεγάλη βιολογική παραλλακτικότητα των στελεχών του που διαφέρουν ως προς το εύρος ξενιστών καθώς και την έκφραση των συμπτωμάτων στα ασθενή φυτά (Lecoq & Purcifull, 1992). Με τη βοήθεια μοριακών και φυλογενετικών αναλύσεων έχουν αναγνωριστεί 3 διαφορετικές ομάδες του ιού (A,B και C) όπου στην ομάδα Α ανήκουν απομονώσεις του ιού από περιοχές της Ευρώπης (Ιταλία, Ισπανία, Γαλλία, Πορτογαλία κ.α.) (Desbiez et al., 2002), ενώ στις ομάδες B και C ανήκουν κυρίως απομονώσεις από την Κίνα, το Βιετνάμ καθώς και την Πολωνία (Pospieszny et al., 2007; Coutts et al., 2011b) Ιοί του γένους Cucumovirus Ιός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber Mosaic Virus, CMV) Ο CMV του γένους Cucumovirus είναι τυπικό μέλος της οικογένειας Bromoviridae. Η οργάνωση του γονιδιώματος καθώς και η μορφολογία των ιοσωματίων είναι διαφορετική από αυτή των ιών του γένους Potyvirus. Τα ιοσωμάτια είναι σφαιρικά μεγέθους nm, ενώ διαθέτει τριμερές διηρημένο RNA γονιδίωμα (Lot et al., 1974). Τα μόρια αυτά είναι μονόκλωνες θετικής πολικότητας αλυσίδες RNA (ssrna) και συμβολίζονται ως RNA 1, RNA 2 και RNA 3. Για την μόλυνση είναι απαραίτητα και τα τρία μόρια γενωμικού RNA (Suzuki et al., 1991; Canto et al., 1997). Πληροφορίες για την 24

49 γονιδιωματική οργάνωση, για το εύρος ξενιστών, τη μετάδοση, την επιδημιολογία, τη γενετική παραλλακτικότητα, τις μεθόδους διάγνωσης αλλά και τις πρακτικές για την αντιμετώπιση του ιού υπάρχουν στα άρθρα ανασκόπησης για τον ιό (Perry, 2001; Palukaitis & García-Arenal, 2003; Jacquemond, 2012; Palukaitis et al., 1992). Ιστορική αναδρομή: Περιγράφτηκε για πρώτη φορά το 1916 στο Michigan των ΗΠΑ, ως ένα παθογόνο της αγγουριάς και της πεπονιάς (Doolittle, 1916). Στη χώρα μας, παρατηρήθηκε για πρώτη φορά το 1982 σε καλλιέργειες κολοκυθιάς (Kyriakopoulou & Bem, 1982) και αργότερα σε καλλιέργειες μπανάνας στην Κρήτη (Avgelis, 1987). Γεωγραφική εξάπλωση: Έχει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση και απαντάται σε εύκρατες και τροπικές περιοχές, καθώς και σε όλες τις χώρες της Μεσογειακής λεκάνης. Συμπτωματολογία, εύρος ξενιστών και επιδημιολογία: Τα συμπτώματα που προκαλεί στα κολοκυνθοειδή μοιάζουν με αυτά των ιών του γένους Potyvirus και είναι κυρίως μωσαϊκό και παραμόρφωση των φύλλων και των καρπών. Στη πεπονιά και στην αγγουριά οι απώλειες της παραγωγής από την παραμόρφωση των καρπών είναι μεγάλες. Στην κολοκυθιά, προκαλεί έντονο νανισμό και κίτρινες κηλίδες στα φύλλα και έντονη παραμόρφωση φύλλων και καρπών (Εικόνα 1.6). Στην καρπουζιά λίγες φορές έχει αναφερθεί μόλυνση με τον CMV, με τα συμπτώματα να είναι κυρίως έντονος νανισμός, παραμόρφωση των φύλλων και μωσαϊκό (Milojević et al., 2012). Σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών, όπως η πεπονιά πολύ συχνά απαντώνται μικτές μολύνσεις του CMV με ιούς του γένους Potyvirus, που δρουν συνεργιστικά (Luis-Arteaga et al., 1998), γεγονός που οδηγεί στην αύξηση της συγκέντρωσης του CMV σε σύγκριση με τον poty- ιό (π.χ. ZYMV) καθώς και σε πιο έντονη συμπτωματολογία (Wang et al., 2002). Ο CMV είναι ένας από τους πιο επιζήμιους φυτικούς ιούς με πολύ μεγάλο εύρος ξενιστών. Ως ξενιστές του ιού έχουν αναφερθεί περισσότερα από 1300 είδη, που ανήκουν σε 50 γένη, 100 διαφορετικών οικογενειών μονοκοτυλήδονων αλλά και δικοτυλήδονων φυτών. Εκτός από καλλιεργούμενα φυτικά είδη, προσβάλει πολλά καλλωπιστικά φυτά, ενώ ως ξενιστές του αναφέρονται και πολλά αυτοφυή φυτικά είδη (Faan & Johnson, 1951; Rist, 1991), διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία του ιού, καθώς σε πολλά εξ αυτών είναι εφικτή και η μετάδοση με τον σπόρο πέραν ότι αποτελούν ξενιστές των αφίδων φορέων, όπως είναι τα ζιζάνια Lamium purpureum, Cerastium holosteoides, Spergula arvensis, Stellaria media κ.α. (Εικόνα 1.9) (Tomlinson & Carter, 1970; Tomlinson & Walker, 1973; Kazinczi et al., 2004). Επιδημιολογικές μελέτες σε καλλιέργειες πεπονιάς στην Ισπανία έδειξαν ότι 40 διαφορετικά είδη ζιζανίων αποτελούν ξενιστές του ιού (Sacristán et al., 2004). 25

50 Η μετάδοσή του γίνεται με αφίδες, με μη-έμμονο τρόπο με περισσότερα από 80 είδη αφίδων. Τα είδη M. persicae και A. gossypii είναι οι πιο αποτελεσματικοί και εργαστηριακά μελετημένοι φορείς του ιού (García-Arenal & Palukaitis, 2008). Μια πρόσφατη εργασία έδειξε μια πολύ ενδιαφέρουσα αλληλεπίδραση στο τρίγωνο ιός-φορέας-ξενιστής, καθώς η πυκνότητα πληθυσμού του A. gossypii ήταν πολύ μικρότερη στα μολυσμένα με τον ιό φυτά κολοκυθιάς σε σχέση με τα υγιή φυτά (Mauck et al., 2010). Μόλυνση με τον CMV είχε επίσης ως αποτέλεσμα την αύξηση πτητικών ουσιών του φυτού που έκανε το μολυσμένο φυτό πιο ελκυστικό για τα είδη A. gossypii και M. persicae. Παρόμοιες αλληλεπιδράσεις και μεταβολές στην τροφική δραστηριότητα του είδους A. gossypii σε φυτά αγγουριάς μολυσμένα από τον CMV, έχουν αναφερθεί και σε άλλες εργασίες και πιθανώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία του ιού (Carmo-Sousa et al., 2014). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ο CMV είναι σπορομεταδιδόμενος όχι μόνο σε αυτοφυή αλλά και σε καλλιεργούμενα φυτά. Στα κολοκυνθοειδή, έχει αναφερθεί μετάδοση με τον σπόρο πεπονιάς σε ποσοστό που κυμαίνεται μεταξύ 11-23% (Sandhu & Kang, 2007) ενώ στην αγγουριά και την κολοκυθιά, τα ποσοστά είναι της τάξεως του 1,4% και 0,07%, αντίστοιχα (Doolittle, 1920; Palukaitis et al., 1992). Η μετάδοση του CMV με τον σπόρο καλλιεργούμενών ή αυτοφυών φυτών είναι μια σημαντική παράμετρος για την ανάπτυξη επιδημιών, διότι τα μολυσμένα σπορόφυτα αποτελούν πρωταρχική πηγή μόλυνσης, απ όπου ο ιός στη συνέχεια εξαπλώνεται με τις αφίδες φορείς (Εικόνα 1.9). Γενετική Παραλλακτικότητα: Η γενετική παραλλακτικότητα του ιού έχει μελετηθεί πάρα πολύ, με τις απομονώσεις του ιού να χωρίζονται σε 3 μοριακές υποομάδες, την υποομάδα ΙI και ΙΑ και την υποομάδα IB (Roossinck et al., 1999; Roossinck, 2002). Οι υποομάδες II και IA περιλαμβάνουν απομονώσεις που έχουν παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση, ενώ στην υποομάδα IB ανήκουν απομονώσεις κυρίως από την Ασία. Στη βάση δεδομένων του NCBI ( είναι διαθέσιμη η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία εκατοντάδων απομονώσεων του ιού από διάφορους ξενιστές. Εξελικτικές μελέτες έχουν δείξει υψηλά ποσοστά μεταλλάξεων αλλά και ανασυνδυασμού μεταξύ διαφορετικών απομονώσεων και στελεχών του ιού, που έχουν ως αποτέλεσμα τη μεγάλη γενετική παραλλακτικότητά του στη φύση καθώς και του πολύ μεγάλου εύρους ξενιστών (Roossinck, 2001; Schneider & Roossinck, 2001). 26

51 Εικόνα 1.9. Εικονική αναπαράσταση μετάδοσης μη-έμμονου ιού(ων) με αφίδες. (Α-Γ): Διαφορετικά στάδια ανάπτυξης επιδημίας από τους ιούς π.χ.: CMV και WMV σε καλλιέργεια κολοκυθιού. Με πράσινο χρώμα απεικονίζονται τα υγιή φυτά ενώ με κόκκινο τα μολυσμένα με τον ιό(ους). Τα βέλη αναπαριστούν τις πτήσεις των αφίδων στην καλλιέργεια όπου με πράσινο και κόκκινο απεικονίζονται οι μη- ιοφόρες και ιοφόρες αφίδες, αντίστοιχα (Τροποποιημένο από τους Astier et al., 2007). 27

52 1.5.3 Ιοί του γένους Polerovirus Ιός του αφιδομεταδιδόμενου ίκτερου των κολοκυνθοειδών (Cucurbit Aphid-borne Yellows Virus, CABYV) Ο CABYV ανήκει στο γένος Polerovirus της οικογένειας Luteoviridae. Τα ιοσωμάτια του είναι σφαιρικά με διάμετρο 25 nm, ενώ το γονιδίωμά του είναι τυπικό του γένους Polerovirus και αποτελείται από ένα γραμμικό +ssrna, το οποίο κωδικοποιεί 6 ORFs, και το μέγεθος ποικίλει μεταξύ των απομονώσεων από 5669 έως 5682nt (Guilley et al., 1994; Mayo & Ziegler-Graff, 1996). Ιστορική αναδρομή: Ο ιός αναφέρθηκε για πρώτη φορά στη Γαλλία κατά τη διερεύνηση του παθογόνου αιτίου του έντονου ικτέρου, που παρατηρούνταν στα κολοκυνθοειδή από το 1988, όπου τα συμπτώματα αυτά αρχικά αποδίδονταν σε τροφοπενίες (κυρίως έλλειψη μαγνησίου) (Lecoq et al., 1992). Γεωγραφική εξάπλωση: Ο CABYV έχει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση και απαντάται σε πολλές χώρες της Μεσογειακής λεκάνης με τις πιο πρόσφατες αναφορές του ιού να έχουν γίνει στην Ισπανία (Juarez et al., 2004), Ιταλία (Tomassoli & Meneghini, 2007), την Τουρκία (Yardιmcι & Özgönen, 2007) και την Τυνησία (Mnari-Hattab et al., 2009). Στην Ελλάδα αναφέρθηκε το 1994 (Lecoq et al., 1994). Συμπτωματολογία, εύρος ξενιστών και επιδημιολογία: Προκαλεί έντονο κιτρίνισμα και πάχυνση των παλαιότερων φύλλων (Εικόνα 1.6). Δεν προκαλεί συμπτώματα στους καρπούς αλλά στην πεπονιά και την αγγουριά προκαλεί έντονη ανθόρροια μειώνοντας έτσι την παραγωγή καρπών ανά φυτό (Lecoq et al., 1992). Τα συμπτώματα είναι παρόμοια με αυτά των αλευροδομεταδιδόμενων ιών του γένους Crinivirus (Πίνακας 1.3). Στο εύρος ξενιστών του ιού περιλαμβάνονται κυρίως τα καλλιεργούμενα είδη της οικογένειας Cucurbitaceae καθώς και άλλα καλλιεργούμενα φυτά άλλων οικογενειών όπως το μαρούλι (Lactuca sativa) (Mnari-Hattab et al., 2009), καθώς και αυτοφυή φυτά διαφόρων οικογενειών όπως είναι το Ecballium elaterium (Kassem et al., 2013; Lecoq et al., 1992, Ξάνθης και Κατής, αδημοσιέυτα δεδομένα), Sencio vulgaris, Sonchus oleraceus, Sinapis arvensis, Bryonia dioica, Malva parviflora κ.α. (Lecoq et al., 1992; Kassem et al., 2013). Μεταδίδεται με αφίδες με έμμονο τρόπο, όπου οι αφίδες σε αντίθεση με τους προαναφερθέντες μη έμμονους ιούς, προσλαμβάνουν τον ιό από το φλοίωμα των φυτών μετά από τροφική δραστηριότητα αρκετών ωρών. Τα είδη A. gossypii και M. persicae αποτελούν του μοναδικούς φορείς του ιού καθώς είναι δύο είδη που αποικίζουν τα κολοκυνθοειδή (Lecoq et al., 1992). Η πρόσληψη και η μετάδοσή του επιτυγχάνεται μετά από τροφική δραστηριότητα αρκετών ωρών (6-28

53 24 ώρες), ενώ η ιοφόρος ικανότητα του φορέα διατηρείται για μεγάλες χρονικές περιόδους καθώς διατηρείται και μετά την έκδυση της αφίδας (Ng & Perry, 2004; Brault et al., 2010). Σε καλλιέργειες κολοκυθιάς, ο CABYV εμφανίζεται με μεγάλη συχνότητα σε μικτές μολύνσεις με ιούς του γένους Potyvirus. Μικτή μόλυνση του CABYV με τον ZYMV έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ιικού τίτλου του πρώτου χωρίς όμως να επηρεάζεται η αποτελεσματικότητα μετάδοσής του από τις αφίδες (Bourdin & Lecoq, 1994). Οι πρωτογενείς μολύνσεις εμφανίζονται νωρίς την άνοιξη με τον CABYV να εξαπλώνεται ταχύτερα σε σύγκριση με τον μη έμμονο WMV (Lecoq, 1999), ενώ συχνά στο τέλος της καλλιεργητικής περιόδου το σύνολο των φυτών είναι μολυσμένα (Lemaire, 1993). Γενετική Παραλλακτικότητα: Η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία του CABYV έγινε γνωστή για πρώτη φορά από τους Guilley et al. το 1994, ενώ με βάση φυλογενετικές αναλύσεις, οι απομονώσεις του CABYV ταξινομούνται στις Ασιατικές και τις Μεσογειακές. Συμπτώματα ικτέρου προκαλούν επίσης δύο νέοι ιοί συγγενικοί του CABYV, σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών οι ιός του αφιδομεταδιδόμενου ικτέρου της πεπονιάς (Melon aphid-borne yellows virus, MABYV) και ο ιός του αφιδομεταδιδόμενου ικτέρου του Suakwa (Suakwa aphid-borne yellows virus, SABYV) οι οποίοι περιορίζονται κυρίως στην Κίνα (Shang et al., 2009). 29

54 1.6 Μέθοδοι διάγνωσης Για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό των ιών χρησιμοποιούνται ορολογικές μέθοδοι, η ηλεκτρονική μικροσκοπία αλλά σύγχρονες μοριακές τεχνικές όπως η PCR. Για την λήψη μέτρων αντιμετώπισης των ιολογικών ασθενειών απαιτείται η ανάπτυξη σύγχρονων διαγνωστικών μεθόδων που θα επιτρέπουν τον προσδιορισμό αλλά και την ανίχνευση νέων αναδυόμενων παθογόνων. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία αν και σπανίως οδηγεί στην ταυτοποίηση των ιών, δίνει σημαντικές πληροφορίες για την μορφολογία των ιοσωματίων που διευκολύνουν την ταυτοποίηση του ιούαιτίου. Ορολογικές μέθοδοι, όπως η ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) και διάφορες παραλλαγές της όπως η διπλή άμεση παρεμβολή ELISA (Double Antibody Sandwich-ELISA, DAS- ELISA), αποτελούν χρήσιμα εργαλεία για την ανίχνευση φυτικών ιών (Clark & Adams, 1977; Torrance, 1998). Για την ανίχνευση των ιών του γένους Potyvirus (ZYMV, PRSV, WMV, MWMV) και Cucumovirus (CMV) είναι διαθέσιμα στο εμπόριο πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση των ιών αυτών ή σε έρευνες επισκοπήσεων για τον προσδιορισμό ιολογικών ασθενειών σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών (Massumi et al., 2007; Valizadeh et al., 2011; Vučurović et al., 2012). Ειδικά, για τους ιούς-είδη του γένους Poty κυκλοφορούν στο εμπόριο μονοκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης του συνόλου των ιών του γένους. Για τους ιούς του γένους Polerovirus, όπως ο CABYV αναφέρεται ότι οι μοριακές τεχνικές (RT-PCR) είναι πιο αξιόπιστες από τις ορολογικές (Mnari-Hattab et al., 2009), ενώ παρατηρείται διασταυρωτή σταυροειδής αντίδραση μεταξύ μελών του γένους (D Arcy et al., 1999). Η αλυσιδωτή αντιγραφή της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), είναι σήμερα η πλέον διαδεδομένη μοριακή μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση και των προσδιορισμό των φυτικών ιών, τον μοριακό χαρακτηρισμό καθώς και για την αλληλούχιση τμήματος ή του συνόλου της γονιδιωματικής αλληλουχίας τους (James et al., 2003; Subr et al., 2004; Desbiez et al., 2007b;). Στη διαδικτυακή βάση δεδομένων του NCBI ( είναι κατατεθειμένες χιλιάδες αλληλουχίες, βάση των οποίων γίνεται σχεδιασμός εκκινητών για την ενίσχυση ειδικών περιοχών της αλληλουχίας-στόχου. Για την ανίχνευση ιών του γένους Potyvirus και Cucumovirus η CP είναι η περιοχή που χρησιμοποιήθηκε περισσότερο για την ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης, καθώς είναι σχετικά συντηρημένη και παρουσιάζει υψηλά ποσοστά ομοιότητας μεταξύ των διαφόρων ιικών απομονώσεων (Rizos et al., 1992; Thomson et al., 1995). Για την ανίχνευση ιών του γένους Polerovirus συμπεριλαμβανομένου και του CABYV, χρησιμοποιούνται εκκινητές που 30

55 στοχεύουν κυρίως στην CP ή την ιική πολυμεράση (RdRp) (Knierim et al., 2010; Kassem et al., 2013; Lotos et al., 2014). Τα τελευταία χρόνια η εφαρμογή μιας νέας τεχνολογίας, της αλληλούχισης νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) έχει χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό νέων ιών που σχετίζονται με ασθένειες των οποίων το παθογόνο αίτιο ήταν άγνωστο (Boonham et al., 2014; Varveri et al., 2014; Maliogka et al., 2015). 31

56 32

57 Σκοπός της εργασίας Η παρούσα εργασία είχε ως στόχο τη μελέτη της επιδημιολογίας του MWMV. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν εκτεταμένες δειγματοληψίες, κατά τα έτη , για τον προσδιορισμό και τη διαπίστωση της συχνότητας εμφάνισης του ιού αλλά και των αφιδομεταδιδόμενων ιών WMV, ZYMV, PRSV-W, WMV, CMV και CABYV σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών της χώρας μας. Επίσης, μελετήθηκε το εύρος ξενιστών και προσδιορίστηκε η πλήρης νουκλεοτιδική αλληλουχία μιας Ελληνικής απομόνωσης του MWMV από καρπουζιά. Τέλος, διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά που επηρεάζουν τη μετάδοση του ιού με αφίδες, καταγράφηκαν νέα είδη της Ελληνικής αφιδοπανίδας ως φορείς του ιού και μελετήθηκε η επίδραση των ιών WMV και CMV στη μετάδοση του MWMV από δύο είδη αφίδων τα M. persicae και A. gossypii. 33

58 34

59 2 Κεφάλαιο 2 ο Κεφάλαιο 2 ο Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στην Ελλάδα 35

60 Περίληψη Τα κολοκυνθοειδή είναι ευπαθή σε τουλάχιστον 59 ιούς, ορισμένοι εκ των οποίων προκαλούν μεγάλες απώλειες παγκοσμίως. Στην Ελλάδα, τα δεδομένα για την συχνότητα εμφάνισής τους είναι ελάχιστα. Για τη διερεύνηση των ιολογικών προβλημάτων των κολοκυνθοειδών της χώρας μας, τα έτη , πραγματοποιήθηκαν επισκοπήσεις σε 27 νομούς. Συνολικά συλλέχθηκαν 1819 δείγματα (αγγούρι, καρπούζι, κολοκύθι, πεπόνι) με τυπικά συμπτώματα ιολογικής προσβολής όπως μωσαϊκού, παραμορφώσεων φύλλων και καρπών καθώς και ικτέρου. Ο ιολογικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε με ορολογικές μεθόδους (DAS-ELISA), χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα, και με RT-PCR με γενικούς και εξειδικευμένους εκκινητές και αφορούσε στην ανίχνευση των CMV, ZYMV, WMV, PRSV-W και MWMV που μεταδίδονται με μη-έμμονο τρόπο καθώς και του CABYV που μεταδίδεται επίσης με αφίδες αλλά με έμμονο τρόπο. Ο WMV είναι ο πιο συχνά απαντώμενος ιός της κολοκυθιάς, καρπουζιάς και πεπονιάς με ποσοστό προσβολής 71.9%, 72.9% και 87.6%, αντίστοιχα. Ο MWMV ανιχνεύθηκε σε καλλιέργειες κολοκυθιάς και καρπουζιάς σε ποσοστό 26.7% και 12.9%, αντίστοιχα στους Νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας και σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων πεπονιάς, ενώ δεν ανιχνεύθηκε σε δείγματα αγγουριάς ή σε άλλες περιοχές της χώρας. Σε καλλιέργειες αγγουριάς οι πιο συχνά απαντώμενοι ιοί ήταν οι CMV και WMV με ποσοστά προσβολής 87.9% και 54.5%, αντίστοιχα. Κυρίαρχη ήταν η παρουσία του WMV σε μονές μολύνσεις με ποσοστό 49.3% ενώ σε μικτές μολύνσεις με την μεγαλύτερη συχνότητα εμφανίστηκαν οι ιοί WMV+CABYV και WMV+CMV με ποσοστά προσβολής 10.5 και 8.0%, αντίστοιχα. 36

61 2.1 Εισαγωγή Για την Ελλάδα, η καλλιέργεια των κολοκυνθοειδών είναι ιδιαίτερη σημαντική, με την καλλιέργεια της καρπουζιάς να κατέχει την 10 η θέση με βάση την παραγόμενη ποσότητα ( τόνους), μετά την ελιά και το αμπέλι, ενώ η συνολική έκταση έφτασε τα στρέμματα (πηγή: FAO 2013). Στη Ελλάδα, τα δεδομένα για την συχνότητα εμφάνισης και γεωγραφικής κατανομής των αφιδομεταδιδόμενων ιών είναι ελάχιστα. Στη χώρα μας, ενδημούν ο CMV (Γένος Cucumovirus, Οικογένεια Bromoviridae), ο ZYMV, ο WMV, ο PRSV-W, ο MWMV (Γένος Potyvirus, Οικογένεια Potyviridae) που μεταδίδονται με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο καθώς και ο CABYV (Γένος Polerovirus, Οικογένεια Luteoviridae) που μεταδίδεται επίσης με αφίδες αλλά με έμμονο τρόπο (Avgelis, 1983; Kyriakopoulou & Varveri, 1991; Malandraki et al., 2013). Παλαιότερες αναφορές στη χώρα μας τα έτη 1999 και 2000 σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών, έχουν δείξει ότι σε καλλιέργειες κολοκυθιάς και καρπουζιάς, ο πιο συχνά απαντώμενος ιός ήταν ο WMV με ποσοστά προσβολής 78% και 49%, αντίστοιχα (Papavassiliou et al., 2002). Στην καρπουζιά ακολούθησε ο ZYMV (43%), ενώ στην κολοκυθιά ο CABYV (40%). Σε καλλιέργειες πεπονιάς, οι WMV (76%) και CMV (50%), ήταν οι πλέον διαδεδομένοι, ενώ η συχνότητα εμφάνισης του CABYV (20%) ήταν η μικρότερη. Στις καλλιέργειες αγγουριάς, ο CMV (53%) παρουσίασε τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης, ενώ οι WMV και CABYV ανιχνεύθηκαν στο 20% των δειγμάτων (Papavassiliou et al., 2002). Παρόμοιες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν τα έτη στην Κύπρο έδειξαν ότι σε καλλιέργειες κολοκυθιάς οι ZYMV, CABYV και PRSV-W ήταν οι πιο διαδεδομένοι με τα ποσοστά προσβολής να φτάνουν το 59%, 40% και 38% και 78%, 20% και 8% σε καλλιέργειες πεπονιάς, αντίστοιχα. Στις καλλιέργειες καρπουζιάς ήταν κυρίαρχος ο ZYMV (90%), ακολουθούμενος από τον PRSV-W (19%) (Papayiannis et al., 2005). Σκοπός της παρούσας μελέτης, ήταν η συστηματική μελέτη της συχνότητας εμφάνισης των αφιδομεταδιδόμενων ιών MWMV, WMV, ZYMV, PRSV-W, CABYV και CMVσε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών της Ελλάδας. Οι πληροφορίες αυτές είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη και την εφαρμογή αποτελεσματικών στρατηγικών, για την καταπολέμηση των ιολογικών ασθενειών που προσβάλουν τα κολοκυνθοειδή στη χώρα μας. 37

62 2.2 Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό Για τη μελέτη της συχνότητας εμφάνισης των αφιδομεταδιδόμενων ιών των κολοκυνθοειδών στη χώρα μας, πραγματοποιήθηκαν κατά τα έτη 2012, 2013 και 2014 δειγματοληψίες φυτών από υπαίθριες και θερμοκηπιακές καλλιέργειες κολοκυνθοειδών, που εμφάνιζαν τυπικά ιολογικά συμπτώματα όπως μωσαϊκό, φλύκταινες, νημάτωση, ίκτερο καθώς και παραμόρφωση των φύλλων και των καρπών. Η συλλογή των δειγμάτων επικεντρώθηκε στις κυριότερες περιοχές παραγωγής κολοκυνθοειδών της χώρας όπως είναι οι νομοί Ηλείας, Μεσσηνίας, Τρικάλων, Θεσσαλονίκης κ.α. (Πίνακας 2.1). Τα δείγματα προέρχονταν από καλλιέργειες κολοκυθιάς, καρπουζιάς, πεπονιάς και αγγουριάς. Συνολικά ελέγχθηκαν 1819 δείγματα και επιθεωρήθηκαν 185 αγροί σε 27 συνολικά νομούς. Στο σύνολο των δειγμάτων συμπεριλαμβάνονται 8 δείγματα ξυλαγγουριάς (Cucumis melo var. flexuosus) από την περιοχή της Χίου και 34 δείγματα κολοκύθας (Cucurbita moschata) από τον νομό Ηλείας. Από τις καλλιέργειες κολοκυθιάς συλλέχθηκαν συνολικά 988 δείγματα από 24 νομούς, από καλλιέργειες καρπουζιάς 247 από 9 νομούς, από καλλιέργειες πεπονιάς 476 από 14 νομούς και από καλλιέργειες αγγουριάς 66 δείγματα από 7 νομούς της χώρας. Τις καλλιεργητικές περιόδους 2012, 2013 και 2014 συλλέχθηκαν 200, 673 και 946 δείγματα, αντίστοιχα (Πίνακας 2.2).Οι περιοχές, στις οποίες πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες καθώς επίσης και ο συνολικός αριθμός των δειγμάτων και των αγρών που επιθεωρήθηκαν τα έτη παρουσιάζονται στην Εικόνα 2.1 και στον Πίνακα 2.1. Συνολικά συλλέχθηκαν και ελέγχθησαν δείγματα από 27 νομούς της χώρας, ενώ το 2012 οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν μόνο από τους νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας. Η κατανομή των δειγμάτων ανά καλλιεργητική περίοδο και ξενιστή παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.3. Εικόνα 2.1. Νομοί της Ελλάδος όπου πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες (επισημαίνονται με γκρι), και τα φυτικά ειδή που συλλέχθηκαν από κάθε περιοχή τα έτη

63 Πίνακας 2.1. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες και συνολικός αριθμός ελεγχθέντων δειγμάτων τα έτη Νομοί Δειγματοληψίας Αριθμός φυτών που ελέγχθηκαν (Αρ. αγροτεμαχίων) α 1. Αιτωλοακαρνανίας 20 (2) 2. Αργολίδας 39 (3) 3. Αρκαδίας 32 (4) 4. Αττικής 13 (1) 5. Γρεβενών 5 (*) 6. Δωδεκανήσων 18 (2) 7. Επτανήσων Ζακύνθου 53 (*) 8. Ευβοίας 122 (12) 9. Ηλείας 548 (57) 10. Ηρακλείου 14 (1) 11. Θεσσαλονίκης 330 (28) 12. Ιωαννίνων 15 (1) 13. Καβάλας 9 (1) 14. Καστοριάς 24 (4) 15. Λαρίσης 20 (2) 16. Λέσβου 137 (13) 17. Μεσσηνίας 100 (20) 18. Πέλλας 17 (2) 19. Πιερίας 39 (5) 20. Ροδόπης 40 (3) 21. Τρικάλων 93 (11) 22. Φθιώτιδας 35 (4) 23. Φλώρινας 5 (*) 24. Φωκίδας 32 (3) 25. Χαλκιδικής 37 (3) 26. Χανίων 5 (1) 27. Χίου 17 (2) Σύνολο 1819 (185) α Αριθμός αγροτεμαχίων όπου πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες * Τα δείγματα προέρχονται από οικιακούς λαχανόκηπους Τρόπος δειγματοληψίας και συλλογή δειγμάτων Συνολικά από κάθε αγρό συλλέχθηκαν δείγματα με τυπικά συμπτώματα ιολογικής προσβολής (Εικόνα 2.6), ενώ ο τρόπος δειγματοληψίας απεικονίζεται στην Εικόνα 2.2. Από κάθε φυτό συλλέγονταν ένα ως δύο πλήρως ανεπτυγμένα νεαρά φύλλα. Τα δείγματα τοποθετούνταν σε πλαστικές σακούλες και μεταφέρονταν στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του τμήματος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με φορητά ψυγεία και παγοκύστες σε ψυγεία (θερμοκρασία 4 C). Στη συνέχεια, τα δείγματα ταξινομήθηκαν και διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία 39

64 -80 C μέχρις ότου ελεγχθούν. Ιστός από όλα τα δείγματα λυοφιλοποιήθηκε για μακροχρόνια αποθήκευση στο εργαστήριο. Εικόνα 2.2. Τρόπος διεξαγωγής της δειγματοληψίας. Η πράσινη γραμμή αναπαριστά την κατεύθυνση δειγματοληψίας ενώ οι κόκκινες κουκίδες τα δείγματα που επιλέγονταν Ανίχνευση και ταυτοποίηση των ιών Ο έλεγχος των δειγμάτων για την παρουσία των ιών γινόταν 3 έως 5 ημέρες μετά την δειγματοληψία. Για την ανίχνευση των MWMV, WMV, ZYMV, PRSV-W, CABYV και CMV χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι: Α. Ορολογικός έλεγχος Τα δείγματα αρχικά ελέγχθηκαν με την μέθοδο DAS-ELISA (Clark & Adams, 1977) (βλέπε Παράρτημα I.1). Ο φυτικός ιστός ομογενοποιήθηκε με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (PBS- Tween) (1/10 wt/vol) και μετά την επώαση του υποστρώματος φωσφορική παρανιτροφαινόλη (pparanitrophenyl phosphate, PNPP) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα (OD) στα 405 nm (Labsystems multiskan RC). Σε κάθε δοκιμή ELISA εκτός από τα φυτικά δείγματα συμπεριλαμβάνονταν 2 θετικοί και 2 αρνητικοί μάρτυρες αντίστοιχοι των ιών, καθώς και 2 μάρτυρες ρυθμιστικού διαλύματος. Ως θετικά λαμβάνονταν τα δείγματα αυτά που εμφάνιζαν OD τριπλάσια από τον μέσο όρο της OD του αρνητικού μάρτυρα. Δείγματα με τυπικά συμπτώματα ιολογικής προσβολής που έδιναν αρνητικά ή οριακά θετικά αποτελέσματα με τη μέθοδο αυτή ελέγχονταν, με τη μέθοδο της RT-PCR. 40

65 Β. Μοριακός έλεγχος Εφαρμόστηκε η αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) με γενικούς και εξειδικευμένους εκκινητές για την ανίχνευση των προαναφερθέντων ιών (Πίνακας 2.2). Για την εκχύλιση ολικού RNA από το φυτικό ιστό χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο των (Chatzinasiou et al., 2010, μέθοδος Α) το οποίο στηρίζεται στη δέσμευση των μορίων του RNA από το διοξείδιο του πυριτίου (SiO2) (βλέπε Παράρτημα I.2) Ανάλυση δεδομένων Η συχνότητα εμφάνισης του κάθε ιού (σε μονές ή μικτές μολύνσεις) υπολογίστηκε ως ο αριθμός των θετικών δειγμάτων για κάθε ιό (MWMV, WMV, ZYMV, PRSV-W, CABYV και CMV είτε μόνοι τους είτε σε συνδυασμό) διαιρούμενο με τον συνολικό αριθμό των δειγμάτων που συλλέχθηκαν και ελέγχθηκαν. Η συχνότητα εμφάνισης των μικτών και απλών μολύνσεων υπολογίστηκε με βάση τις δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν μόνο τα έτη και όχι το έτος 2012, επειδή δεν πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος όλων των ιών στο σύνολο των δειγμάτων. Να σημειωθεί ότι το άθροισμα των συχνοτήτων που εκφράζονται σε ποσοστά (%) ξεπερνούν το 100% λόγω της παρουσίας μικτών μολύνσεων (βλέπε παρακάτω). 41

66 Πίνακας 2.2. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ειδική και γενική ανίχνευση των ιών. Δίνονται η ονομασία του εκκινητή, η αλληλουχία, προφίλ θερμοκυκλοποίησης καθώς και το μέγεθος του προβλεπόμενου προϊόντος Ιός Εκκινητής Αλληλουχία (5 3 ) MWMV WMV ZYMV PRS V CMV CABYV Potyvirus Polerovirus modet-f modet-r WMV-F WMV-R DAG-F DAG-R PRSV-F PRSV-R CMVup624C CMVdo1244C CMVup624a (nested) CMVup624b (nested) CMVdo1244 (nested) CABYVUp CABYVDo Poty Small AAR GAY GTT GAT GTT GGR AC CCA TAR TCA YTC TT GAC YCC ATC GTN TGG GTR ATG ATG GA ACG TCC CTT GCA GTG ATTTGCGCTGCGATG GCGTGGCAATGACAT ATT CT TGA ATG GGA CAA ATC TAA GCA CGA GTA TTA GAA ATG T AA TTT GTT ATG GAC AAA TCT GRA TC TGR TGC TCR AYG TCK ACA TGA GGA CAA ATC TGR ATC TCC CAA TGC GGA CAA ATC TGA ATC AAC CAG TGC TGC TCR AYG TCR ACA TGA AG GTC CGA AAC CGC CTG ACG C TCG AGG TTC GAG CAA GCT G ATG GTI TGG ICY ATH GAR AAY GG 28.V CGA TCC CGG GTTTTTTTTTTTTTTTTTV Y= C ή T, R= A ή G, K= G ή T, D= A, G ή T, H=A, C ή T, V= A, C ή G 42 Προφίλ θερμοκυκλοποίησης ( C/sec) Αποδιάταξη Υβριδοποίηση Επιμήκυνση Κύκλοι Μέγεθος προϊόντος (bp) 95 C/30s 55 C/30s 72 C/20s C/30s 50 C/30s 72 C/20s C/30s 51 C/30s 72 C/30s C/30s 55 C/30s 72 C/30s C/30s 45 C/30s 72 C/30s 95 C/30s 60 C/15s 57 C/15s PolGenRT3 ACC TCG ACT TTD A 45 C/ 1h, 70 C/15s PolGenUp2 PolGenDown2 GAT GAR GGT CGY TAC CG ACC TCG ACT TTR AAR CC 72 C/30s C/20s 60 C/20s 72 C/20s C/30s 51 C/30s 72 C/40s C/30s 58 C/15s 54 C/10s 52 C/10s 72 C/30s Βιβλιογραφία (Σε αυτήν την εργασία) (Σε αυτήν την εργασία) (Desbiez et al., 2002) (Laney et al., 2012) (Σε αυτήν την εργασία) (Lotos et al., 2014) (Pappu et al., 1993) (Lotos et al., 2014)

67 2.3 Αποτελέσματα Συχνότητα εμφάνισης ιών ανά καλλιεργητική περίοδο και ξενιστή Ο πιο συχνά απαντώμενος ιός στις καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στη χώρα μας τα έτη ήταν ο WMV με ποσοστό προσβολής 77,7% και 82,4% αντίστοιχα, ακολουθούμενος από τον CMV (23,9%) και CABYV (21,7%) για την καλλιεργητική περίοδο 2013, ενώ την καλλιεργητική περίοδο 2014 ο CABYV εμφάνισε υψηλότερα ποσοστά προσβολής σε σύγκριση με τον CMV της τάξεως 25,3 και 15,3%, αντίστοιχα. Το 2012 συλλέχθηκαν δείγματα κυρίως από καλλιέργειες κολοκυθιάς, και περιορισμένος αριθμός από καλλιέργειες καρπουζιάς, μόνο από τους νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας. Κυρίαρχος ήταν ο MWMV (71,5%) ακολουθούμενος από τον WMV, με μικρότερο όμως ποσοστό (40,5%). Ο ZYMV ανιχνεύτηκε σε μικρότερα ποσοστά, 8,0 και 1,1% για τα έτη 2013 και 2014, αντίστοιχα, ενώ το έτος 2012 δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα δείγμα (Πίνακας 2.3). Ο WMV ανιχνεύτηκε σε καλλιέργειες κολοκυθιάς, καρπουζιάς και πεπονιάς σε όλες τις περιοχές δειγματοληψίας και ήταν ο πιο διαδεδομένος ιός με ποσοστά προσβολής 71,9, 72,9 και 87,6%, αντίστοιχα ενώ σε καλλιέργειες αγγουριάς κυρίαρχη ήταν η παρουσία του CMV (87,9%) και δευτερευόντως του WMV (54,5%) (Πίνακας 2.3). Πίνακας 2.3. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στην Ελλάδα τις καλλιεργητικές περιόδους Ιός Αριθμός μολυσμένων δειγμάτων (%) Καλλιεργητική περίοδος α Ξενιστής β Cucurbita pepo Citrullus lanatus Cucumis melo Cucumis sativus Cucurbita moschata Cucumis melo var. flexuosus WMV 81 (40,5) 523 (77,7) 780 (82,4) 710 (71,9) 180 (72,9) 417 (87,6) 36 (54,5) 33 (97,0) 8 (100,0) CMV - γ 161 (23,9) 145 (15,3) 82 (8,3) 4 (1,6) 157 (33,0) 58 (87,9) 0 (0,0) 5 (62,5) CABYV (21,7) 239 (25,3) 271 (27,4) 18 (7,3) 82 (17,2) 7 (6,1) 4 (11,8) 3 (37,5) MWMV 143 (71,5) 72 (10,7) 103 (10,9) 264 (26,7) 32 (12,9) 2 (0,4) 0 (0,0) 20 (58,8) 0 (0,0) PRSV 16 (8,0) 55 (8,2) 83 (8,8) 56 (5,7) 39 (15,8) 47 (9,9) 0 (0,0) 12 (35,3) 0 (0,0) ZYMV 0 (0,0) 54 (8,0) 11 (1,1) 3 (0,3) 34 (13,8) 26 (5,5) 0 (0,0) 2 (5,9) 0 (0,0) α Τα ποσοστά μόλυνσης σχετίζονται με τον αριθμό των μολυσμένων δειγμάτων, όπου είναι 200, 673 και 946 για τα έτη 2012, 2013 και 2014, αντίστοιχα. β Τα ποσοστά μόλυνσης σχετίζονται με τον αριθμό των μολυσμένων δειγμάτων, όπου είναι 988, 247, 476, 66, 34 και 8 για τα Cucurbita pepo, Citrullus lanatus, Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata και Cucumis melo var. flexuosus, αντίστοιχα. γ Δεν ελέγχθηκαν 43

68 2.3.2 Συχνότητα εμφάνισης ιών σε μικτές και μονές μολύνσεις Παρατηρήθηκε ότι οι μονές μολύνσεις (στο σύνολο των ιών) εντοπίστηκαν σε υψηλότερα ποσοστά σε σύγκριση με τις μικτές (63,3 και 34,8%, αντίστοιχα) (Πίνακας 2.4, Πίνακας 2.5). Στην καρπουζιά ήταν πιο συχνή η εμφάνιση μονών μολύνσεων (77,5%), ενώ σε μικτές μολύνσεις ο πιο συχνός συνδυασμός ήταν οι CABYV+WMV με ποσοστό προσβολής 10,5% (Πίνακας 2.5). Στην αγγουριά, ο πιο συχνός συνδυασμός ήταν οι WMV+CMV (34,8%) και WMV+CABYV+CMV (7,6%), ενώ σε μονές μολύνσεις σε μεγαλύτερη συχνότητα βρέθηκαν οι CMV (42,4%) και WMV (12,1%) (Πίνακας 2.5). Πίνακας 2.4. Συχνότητα εμφάνισης μονών μολύνσεων σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών τα έτη Αριθμός μολυσμένων δειγμάτων (%) α Μονές μολύνσεις Cucurbita pepo Citrullus lanatus Cucumis melo Cucumis sativus Σύνολο WMV 421 (52,9) 126 (52,5) 222 (46,6) 8 (12,1) 777 (49,3) MWMV 41 (5,1) 5 (2,1) 0 (0,0) 0 (0,0) 46 (2,9) CMV 19 (2,4) 1 (0,4) 37 (7,8) 28 (42,4) 85 (5,4) CABYV 18 (2,3) 8 (3,3) 3 (0,6) 0 (0,0) 29 (1,8) PRSV 3 (0,4) 21 (8,7) 3 (0,6) 0 (0,0) 27 (1,7) ZYMV 1 (0,1) 26 (10,8) 7 (1,5) 0 (0,0) 34 (2,1) Σύνολο 503 (63,2) 187 (77,9) 272 (57,1) 36 (54,5) 998 (63,3) α Τα ποσοστά μόλυνσης σχετίζονται με τον αριθμό των μολυσμένων δειγμάτων, όπου είναι 795, 240, 476 και 66 για τα Cucurbita pepo, Citrullus lanatus, Cucumis melo και Cucumis sativus, αντίστοιχα. Πίνακας 2.5. Συχνότητα εμφάνισης μικτών μολύνσεων σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών τα έτη Αριθμός μολυσμένων δειγμάτων (%) β Μικτές μολύνσεις α Cucurbita pepo Citrullus lanatus Cucumis melo Cucumis sativus Σύνολο Διπλές CABYV+WMV 118 (14,9) 7 (2,9) 40 (8,4) 0 (0,0) 165 (10,5) CABYV+MWMV 56 (7,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 56 (3,5) WMV+CMV 23 (2,9) 2 (0,8) 79 (16,6) 23 (34,8) 127 (8,0) PRSV+CABYV 9 (1,1) 1 (0,4) 0 (0,0) 0 (0,0) 10 (0,6) WMV+MWMV 8 (1,0) 20 (8,3) 1 (0,2) 0 (0,0) 29 (1,8) CMV+CABYV 5 (0,6) 0 (0,0) 6 (1,2) 2 (3,0) 13 (0,8) WMV+PRSV 2 (0,2) 10 (4,2) 26 (5,7) 0 (0,0) 38 (2,4) WMV+ZYMV 1 (0,1) 5 (2,1) 10 (0,2) 0 (0,0) 16 (1,0) Τριπλές WMV+CABYV+PRSV 15 (1,9) 0 (0,0) 2 (0,4) 0 (0,0) 17 (1,1) WMV+CABYV+CMV 35 (4,4) 1 (0,4) 20 (4,2) 5 (7,6) 61 (3,9) MWMV+CABYV+PRSV 4 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 4 (0,2) MWMV+WMV+PRSV 2 (0,2) 3 (1,2) 0 (0,0) 0 (0,0) 5 (0,3) Παραπάνω από τρεις WMV+MWMV+PRSV+CABYV 3 (0,4) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 3 (0,2) WMV+CMV+PRSV+CABYV 0 (0,0) 0 (0,0) 5 (1,0) 0 (0,0) 5 (0,3) Σύνολο 281 (35,3) 49 (20,4) 189 (39,7) 30 (45,4) 549 (34,8) α Μόνο οι πιο συχνοί συνδυασμοί υποδεικνύονται. β Τα ποσοστά μόλυνσης σχετίζονται με τον αριθμό των μολυσμένων δειγμάτων, όπου είναι 795, 240, 476 και 66 για τα Cucurbita pepo, Citrullus lanatus, Cucumis melo και Cucumis sativus, αντίστοιχα. 44

69 2.3.3 Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες κολοκυθιάς Συνολικά τα έτη πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες από 24 νομούς (Εικόνα 2.3) και συλλέχθηκαν συνολικά 988 δείγματα (Πίνακας 2.3). Στην κολοκυθιά κυρίαρχη ήταν η παρουσία του WMV (71,9%), σε όλους τους νομούς με εξαίρεση το νομό Ροδόπης, ενώ εξίσου σημαντική ήταν η παρουσία των CABYV (27,4%) και MWMV (26,7%), αν και ο τελευταίος ανιχνεύτηκε μόνο σε δείγματα που προέρχονταν από τους νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας (Εικόνα 2.3, Διάγραμμα 2.1). Η συχνότητα των CMV και PRSV ήταν αρκετά περιορισμένη με ποσοστά 6,3 και 5,7%, αντίστοιχα, ενώ ο ZYMV (0,3%) ανιχνεύτηκε σε ελάχιστα δείγματα από τους νομούς Ηλείας, Εύβοιας και Ροδόπης (Εικόνα 2.3). Από το σύνολο των δειγμάτων, τα 503 ήταν προσβεβλημένα μόνον με τον WMV (52,9%) ακολουθούμενο από τους MWMV (5,1%), CMV (2,4%) και CABYV (2,3%) (Πίνακας 2.4). Σε μικτές μολύνσεις εντοπίστηκαν οι WMV+CABYV (14,9%), MWMV+CABYV (7,0%) και οι WMV+CABYV+CMV (4,4%) (Πίνακας 2.5). Μικρότερη συχνότητα εμφάνισης είχαν οι ιοί WMV+CMV (2,9%) και WMV+CABYV+PRSV (1,9%). Τέλος, σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων εντοπίστηκαν διπλές μολύνσεις από τους PRSV+CABYV (1,1%), WMV+MWMV (1,0%), ενώ οι τριπλές μολύνσεις (MWMV+CABYV+PRSV) ήταν σπάνιες (0,5%), ενώ σε 3 μόνο δείγματα ανιχνεύθηκαν ταυτόχρονα παραπάνω από τρεις ιοί (WMV+MWMV+PRSV+CABYV) (Πίνακας 2.5). Εικόνα 2.3. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε καλλιέργειες κολοκυθιάς και οι αντίστοιχοι ιοί που ανιχνεύθηκαν τα έτη Διάγραμμα 2.1. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες κολοκυθιάς τα έτη

70 2.3.4 Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες καρπουζιάς Συνολικά συλλέχθηκαν 247 δείγματα από 9 νομούς της χώρας (Εικόνα 2.4). Την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης παρουσίασε ο WMV (72,9%) και ακολούθησαν οι PRSV (15,6%), ZYMV (13,8%), MWMV (12,9%), CABYV (7,3%), ενώ ο CMV ανιχνεύτηκε σε πολύ περιορισμένο αριθμό δειγμάτων (1,6%) στο νομό Θεσσαλονίκης και στην Λέσβο (Διάγραμμα 2.2). Ο ZYMV ανιχνεύτηκε μόνο στο νομό Ροδόπης (Εικόνα 2.4). Σε μονές μολύνσεις ο WMV παρουσίασε τα μεγαλύτερα ποσοστά προσβολής (52,5%), ακολουθούμενος από τους ZYMV (10,8%) σε δείγματα του νομού Ροδόπης και του PRSV (8,7%), κυρίως στον νομό Ηλείας (Εικόνα 2.4). Ο πιο συχνός συνδυασμός μικτών μολύνσεων ήταν ο MWMV+WMV, που ανιχνεύθηκε συνολικά σε 20 δείγματα που προέρχονταν από τον νομό Ηλείας, ενώ στις ίδιες περιοχές με μικρότερη συχνότητα εμφάνισης εντοπίστηκαν σε διπλή μόλυνση οι WMV+PRSV (4,2%) και σε πολύ μικρότερο αριθμό δειγμάτων η τριπλή μόλυνση από τους MWMV+WMV+PRSV, σε 3 μόνο δείγματα από το σύνολο των 240 δειγμάτων (Πίνακας 2.5). Εικόνα 2.4. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε καλλιέργειες καρπουζιάς και οι αντίστοιχοι ιοί που ανιχνεύθηκαν τα έτη Διάγραμμα 2.2. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες καρπουζιάς τα έτη

71 2.3.5 Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες πεπονιάς Συλλογή δειγμάτων πεπονιάς πραγματοποιήθηκε μόνο τα έτη 2013 και 2014, από 14 νομούς της χώρας (Εικόνα 2.5) και συλλέχθηκαν συνολικά 476 δείγματα. Σε όλες τις περιοχές ήταν κυρίαρχη η παρουσία του WMV (87,6%). Εξίσου σημαντική ήταν η παρουσία των CMV (33%) και CABYV (17,2%), ενώ η συχνότητα εμφάνισης των PRSV (9,9%) και ZYMV (5,5%) ήταν πολύ χαμηλή, από δείγματα που προέρχονταν κυρίως από το νομό Ηλείας και Ροδόπης, αντίστοιχα (Διάγραμμα 2.3, Εικόνα 2.5). Μονές μολύνσεις από τους WMV και CMV ανιχνεύτηκαν σε 222 και 37 δείγματα, αντίστοιχα (Πίνακας 2.4). Σε διπλές μολύνσεις οι πιο συχνοί συνδυασμοί ήταν οι WMV+CMV και CABYV+WMV με ποσοστά προσβολής 16,6% και 8,4%, αντίστοιχα ενώ ο συνδυασμός WMV+PRSV (5,7%) εμφανίστηκε μόνον στο νομό Ηλείας (Εικόνα 2.5, Πίνακας 2.5). Τέλος, σε τριπλή μόλυνση εμφανίστηκαν οι ιοί WMV+CABYV+CMV σε ποσοστό προσβολής 4,2%, ενώ τέλος σε 5 μόνο δείγματα ανιχνεύθηκαν ταυτόχρονα οι WMV+CMV+PRSV+CABYV (Πίνακας 2.5). Εικόνα 2.5. Περιοχές όπου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε καλλιέργειες πεπονιάς και οι αντίστοιχοι ιοί που ανιχνεύθηκαν τα έτη Διάγραμμα 2.3. Συχνότητα εμφάνισης αφιδομεταδιδόμενων ιών σε καλλιέργειες πεπονιάς τα έτη

72 Εικόνα 2.6. Συμπτώματα παραμόρφωσης φύλλου που έχει προκληθεί από μόλυνση με τον CMV σε κολοκυθιά (Α). Δεσμίωση νεύρων και ποικιλοχλώρωση σε φύλλο καρπουζιάς από τον PRSV (Β). Μικτή μόλυνση από τους MWMV+CABYV (Γ) και WMV+CMV (Δ) σε κολοκυθιά και πεπονιά, αντίστοιχα. Παραμόρφωση φύλλων καρπουζιάς (Ε) και κολοκυθιάς (Ζ) από τον WMV. Παραμόρφωση και ποικιλοχλώρωση καρπών, καρπουζιάς (Η) και κολοκυθιάς (Θ) από μικτές μολύνσεις με τους MWMV+WMV και MWMV+WMV+PRSV, αντίστοιχα. (Από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη). 48

73 2.4 Συζήτηση Οι ιολογικές ασθένειες αποτελούν ένα από τα βασικότερα προβλήματα της καλλιέργειας των κολοκυνθοειδών, λόγω των δυσκολιών αντιμετώπισής τους αλλά και εξαιτίας της σοβαρότητας των απωλειών που προκαλούν (Lecoq & Desbiez, 2012). Τα δεδομένα για τη συχνότητα εμφάνισης των ιών που προσβάλουν τα κολοκυνθοειδή, καθώς και για τη γεωγραφική κατανομή και εξάπλωση στη χώρα μας είναι περιορισμένα (Papavassiliou et al., 2002). Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκαν εκτενείς δειγματοληψίες, για τον προσδιορισμό των ιολογικών προσβολών, χρησιμοποιώντας ορολογικές αλλά και μοριακές τεχνικές, αλλά και της διαπίστωσης της γεωγραφικής κατανομής τους. Κατά τη διάρκεια των τριών χρόνων ( ), παρατηρήθηκαν συμπτώματα όπως μωσαϊκό, ποικιλοχλωρώσεις, παραμόρφωση των φύλλων και των καρπών καθώς και ίκτερος. Στο σύνολο των καλλιεργειών που επιθεωρήθηκαν τα επίπεδα προσβολής στους αγρούς όπως εκτιμήθηκαν με οπτική παρατήρηση, κυμαίνονταν από %. Συνολικά συλλέχθηκαν 1819 δείγματα από καλλιέργειες κολοκυνθοειδών για την παρουσία των WMV, ZYMV, PRSV-W, CMV, MWMV και CABYV. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι στο σύνολο των δειγμάτων των κολοκυνθοειδών που συλλέχθηκαν, ο WMV ήταν ο πιο διαδεδομένος. Η συχνότητα εμφάνισης των ιών διέφερε ανάλογα με τον ξενιστή, την περιοχή δειγματοληψίας και το έτος δειγματοληψίας. Για παράδειγμα ο ZYMV ανιχνεύτηκε μόνο σε δείγματα που προέρχονταν από το νομό Ροδόπης καθώς και σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων από το νομό Ηλείας, σε δείγματα καρπουζιάς, πεπονιάς και κολοκυθιάς με ποσοστά προσβολής 13,8, 5,5 και 0,3%, αντίστοιχα. Παλαιότερες επισκοπήσεις στη χώρα μας, έδειξαν στις καλλιέργειες κολοκυνθοειδών ήταν κυρίαρχος ο WMV (67%) και ακολουθούσαν οι, ZYMV (27%), CMV (20%) και CABYV (20%) και σε ιδιαίτερα χαμηλή συχνότητα οι PRSV-W (3%) και o SqMV (2%). Στην Κύπρο, κυρίαρχος ήταν ο ZYMV και ακολουθούσαν οι CABYV, PRSV-W και WMV, με τον τελευταίο να εμφανίζεται μόνο σε καλλιέργειες κολοκυθιάς, ενώ ο CMV δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα δείγματα (Papayiannis et al., 2005). Πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες στη Γαλλία έδειξαν ότι ο ZYMV ανιχνεύθηκε σπανίως σε αυτοφυείς ξενιστές συγκριτικά με τον WMV (2 έναντι 159 δειγμάτων) (Lecoq et al., 2014). Η επικράτησή του WMV πιθανώς να οφείλεται στην ικανότητά του να μολύνει περισσότερους αυτοφυείς ξενιστές καθώς αυτοί επιτρέπουν την επιβίωσή του απουσία των καλλιεργούμενων ξενιστών σε μια περιοχή καθώς και την εξέλιξη επιδημιών νωρίς την καλλιεργητική περίοδο. Ο MWMV ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά στη χώρα μας το 2012 στους νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας (Malandraki et al., 2013) και αποτελεί ένα αναδυόμενο παθογόνο για την καλλιέργεια 49

74 των κολοκυνθοειδών τόσο για την Ελλάδα όσο και για την υπόλοιπη Μεσογειακή λεκάνη. Στην παρούσα μελέτη ο ιός ανιχνεύτηκε μόνον στις ίδιες περιοχές, ενώ το 2014 ανιχνεύτηκε σε καλλιέργειες καρπουζιάς στην περιοχή των Τρικάλων (Βαρβέρη Χ., προσωπική επικοινωνία). Ο MWMV ήταν ο πιο συχνά απαντώμενος ιός σε μονές μολύνσεις σε καλλιέργειες κολοκυθιάς, ενώ ο WMV ανιχνεύτηκε σε μικρότερο ποσοστό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε μικτές μολύνσεις τα μεγαλύτερα ποσοστά προσβολής είχαν οι MWMV+CABYV και MWMV+WMV σε καλλιέργειες κολοκυθιάς και καρπουζιάς, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Υπάρχουν αρκετές μελέτες που αφορούν στη συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών σε άλλες χώρες. Στην Τουρκία, οι πιο συχνά εμφανιζόμενοι ιοί τα έτη σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών ήταν οι WMV (53,9%) και ZYMV (38,8%) (Sevik & Arli-Sokmen, 2003). Σε μεταγενέστερες μελέτες (2005), σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών πιο κοντά στα σύνορα με την Ελλάδα, κυρίαρχος ήταν ο ZYMV ακολουθούμενος από τους WMV, CMV και PRSV-W (Köklü & Yilmaz, 2006). Στη Σερβία (2007), ως κυρίαρχοι ήταν οι WMV, ZYMV και CMV, ενώ τα έτη 2008 και 2009 ο ZYMV ήταν ο πιο συχνά απαντώμενος και ο μοναδικός με την μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης σε μονές μολύνσεις, ενώ ο PRSV-W δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα (Vučurović et al., 2012). Τέλος, σε χώρες εκτός της Μεσογειακής λεκάνης όπως η Βενεζουέλα, κυριαρχεί ο ιός του χλωρωτικού μωσαϊκού της πεπονιάς (Melon chlorotic mosaic virus, MeCMV) (65,8%), ένας αλευροδομεταδιδόμενος ιός που ενδημεί αποκλειστικά στην Βενεζουέλα, ενώ ακολουθούσαν οι PRSV, ZYMV, CMV και WMV με ποσοστά προσβολής 34,2, 32,4, 6,7 και 1,1%, αντίστοιχα, ενώ ο CABYV δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα (Romay et al., 2014b). Στο Ιλινόι (μεσοδυτική πολιτεία των ΗΠΑ), οι WMV, SqMV, CMV, PRSV-W και ZYMV παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης (Jossey & Babadoost, 2008). Στα κολοκυνθοειδή, είναι γνωστό ότι η ταυτόχρονη παρουσία περισσοτέρων από ενός ιών επηρεάζει την ένταση των συμπτωμάτων που οφείλεται στην αλληλεπίδραση των αφιδομεταδιδόμενων ιών (Massumi et al., 2007; Vučurović et al., 2012; Romay et al., 2014). Μικτές μολύνσεις μεταξύ ιών του γένους Potyvirus με ιούς που ανήκουν σε άλλα γένη, δρουν συνεργιστικά και προκαλούν πιο έντονα συμπτώματα σε σύγκριση με τις μονές μολύνσεις (Gil-Salas et al., 2011, 2012). Συνεργιστική δράση παρατηρείται μεταξύ του CMV και ιών του γένους Potyvirus, που έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης των συμπτωμάτων καθώς και της συγκέντρωσης του CMV (Wang et al., 2002; Zeng et al., 2007). Συνεργιστική δράση έχει επίσης αναφερθεί μεταξύ ιών της οικογένειας Luteoviridae και poty-ιών, όπου μικτή μόλυνση των CABYV+ZYMV έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ιικού τίτλου του πρώτου (Bourdin & Lecoq, 1994). Στην παρούσα έρευνα, υπήρχε μεγάλη παραλλακτικότητα στην έκφραση των συμπτωμάτων των δειγμάτων που 50

75 ελέγχθηκαν. Η ενίσχυση των συμπτωμάτων έχει αναφερθεί κατά την ύπαρξη μικτών μολύνσεων και σε άλλους ξενιστές πέραν των κολοκυνθοειδών (Gómez et al., 2009, 2010). Στις δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν τα έτη , παρατηρήθηκε ότι οι μονές μολύνσεις (στο σύνολο των ιών) εντοπίστηκαν σε υψηλότερα ποσοστά σε σύγκριση με τις μικτές μολύνσεις (63,2 και 34,8%, αντίστοιχα). Σε μικτές μολύνσεις ο πιο συχνός συνδυασμός ήταν ο CABYV+WMV (10,5%), με την κολοκυθιά (14,9%) να εμφανίζει τα υψηλότερα ποσοστά προσβολής. Παρόμοια μελέτη στο Ιράν ( ) σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών, έδειξε ότι μικτή μόλυνση από τους WMV+CABYV ήταν η πιο συχνή και ο CABYV ήταν ο πιο συχνά εμφανιζόμενος ιός. Παλαιότερες μελέτες στην ίδια περιοχή, που δεν συμπεριελάμβαναν στον έλεγχό τους τον CABYV έδειξαν ότι κυρίαρχοι ήταν οι CMV και ZYMV (Massumi et al., 2007). Επίσης μελέτες επισκοπήσεων σε καλλιέργειες κολοκυθιάς και πεπονιάς στην Ισπανία και πιο συγκεκριμένα στις περιοχές Μαυρίκιο ( ) και Βαλένθια ( ), έδειξαν ότι ο CABYV ήταν ο πιο συχνά απαντώμενος ιός, κυρίως σε μικτές μολύνσεις τόσο με τον αλευροδομεταδιδόμενο CYSDV όσο και με τους WMV και PRSV (Kassem et al., 2007; Juarez et al., 2013). Επίσης, ο CABYV κυριαρχεί σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών της Αιγύπτου (Omar & Bagdady, 2012) και της Τυνησίας (Mnari-Hattab et al., 2009). Στο Λίβανο ( ), οι ZYMV και CABYV ήταν οι πλέον διαδεδομένοι, με τα ποσοστά προσβολής σε καλλιέργειες κολοκυθιάς να είναι 65 και 64%, ενώ σε καλλιέργειες πεπονιάς 44 και 30%, αντίστοιχα (Abou-Jawdah et al., 2000). Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης του CABYV, κυρίως σε μικτές μολύνσεις με ιούς του γένους Potyvirus αλλά και του CMV που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη, καθώς η ευρεία εξάπλωση του σε πολλές χώρες της Μεσογειακής λεκάνης, υποδηλώνει ότι ο CABYV μπορεί στο μέλλον να αποτελέσει σημαντική απειλή για την καλλιέργεια των κολοκυνθοειδών. Την πεπονιά, αποικίζουν τα είδη A.gossypii, A. craccivora και M. persicae (Blackman & Eastop, 2008). Ενδιαφέρον παρουσιάζει η μικτή μόλυνση των WMV+CMV στην πεπονιά, η οποία είχε και τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης (16,6%) τα έτη Στην Ισπανία ( ) σε καλλιέργειες πεπονιάς, έδειξαν ότι οι CMV και WMV ήταν οι πιο συχνά απαντώμενοι ιοί, ενώ σχεδόν το σύνολο των φυτών ήταν μολυσμένα και με τους δύο ιούς (94%) (Luis-Arteaga et al., 1998). Επιδημιολογικές μελέτες σε καλλιέργειες πεπονιάς στην Ισπανία έδειξαν ότι, η εξάπλωση του CMV γίνεται κυρίως κατά μήκος γειτονικών φυτών, ενώ η εξάπλωση του WMV συνέβη σπάνια μεταξύ των γειτονικών φυτών (Alonso-Prados et al., 2003). Η εξάπλωση αυτή, υποδηλώνει ότι στην πεπονιά ο CMV μεταδίδεται κυρίως με αποικίζοντα είδη αφίδων, όπως το είδος A. gossypii, ενώ αντίθετα ο WMV μεταδίδεται κυρίως με μη-αποικίζοντα είδη. Μικτές μολύνσεις του CMV και άλλων ιών του 51

76 γένους Potyvirus (WMV, PRSV-W, ZYMV) επίσης έχουν αναφερθεί παγκοσμίως σε καλλιέργειες πεπονιάς (Nameth, 1986; Grafton-Cardwell et al., 1996). Η καλλιέργεια της αγγουριάς στη χώρα μας γίνεται αποκλειστικά σε θερμοκηπιακές καλλιέργειες. Στις καλλιέργειες που επιθεωρήθηκαν συμπτώματα μωσαϊκού και παραμόρφωσης των φύλλων και των καρπών ήταν σπάνια, ενώ συμπτώματα ικτέρου ήταν ιδιαίτερα διαδεδομένα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι υπό κάλυψη καλλιέργειες, προσβάλλονται κυρίως από αλευρώδεις, που μεταδίδουν ιούς τους γένους Crinivirus, όπως οι CYSDV, CCYV και BPYV (Boubourakas et al., 2006; Orfanidou et al., 2014). Από τους μη-έμμονους αφιδομεταδιδόμενους ιούς κυρίαρχος ήταν ο CMV με τον WMV να ακολουθεί., ενώ από τους αφιδομεταδιδόμενους ιούς που προκαλούν συμπτώματα ικτέρου ο CABYV ανιχνεύθηκε σε πολύ μικρό ποσοστό (6,1%). Συμπτώματα μωσαϊκού παρατηρήθηκαν κυρίως σε θερμοκήπια παλαιάς τεχνολογίας, με τα πλαϊνά ανοίγματα αυτών να επιτρέπουν την είσοδο στις αφίδες. Η ύπαρξη των ζιζανίων-ξενιστών των ιών εξωτερικά των θερμοκηπίων πιθανόν να αποτελούσε κύρια εστία μόλυνσης, αφού έχει αναφερθεί ότι ο CMV προσβάλει ένα μεγάλο εύρος αυτοφυών ξενιστών, ενώ για τον CABYV διαδραματίζουν κυρίαρχο ρόλο στην επιδημιολογία του (Kazinczi et al., 2004; Sacristán et al., 2004). Η διαφορετική συχνότητα εμφάνισης στους διαφορετικούς καλλιεργούμενους ξενιστές και γεωγραφικές περιοχές σχετίζεται με διάφορους παράγοντες όπως: η παρουσία και η αφθονία εναλλακτικών ξενιστών (Sacristán et al., 2004), η παρουσία, η δομή των πληθυσμών και η χρονική κατανομή των αφίδων-φορέων (Katis et al., 2006), οι καλλιεργητικές πρακτικές καθώς και οι γειτονικές καλλιέργειες. Τέλος, η μελέτη του μοριακού χαρακτηρισμού του WMV, η οποία θα παρέχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την πληθυσμιακή δομή του ιού στην Ελλάδα είναι υπό εξέλιξη. 52

77 3 Κεφάλαιο 3 ο Κεφάλαιο 3 ο Εύρος ξενιστών και προσδιορισμός της αλληλουχίας του γονιδιώματος μιας Ελληνικής απομόνωσης του MWMV από καρπουζιά 53

78 Περίληψη Ο MWMV ανήκει στο γένος Potyvirus (οικ. Potyviridae), μεταδίδεται με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο και αποτελεί ένα νέο παθογόνο των κολοκυνθοειδών που προκαλεί σημαντικές απώλειες. Στη χώρα μας, η πρώτη καταγραφή του έγινε τo 2012 στους Νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας σε υβρίδια κολοκυθιάς ανεκτικά στους CMV, ZYMV και WMV, με συμπτώματα μωσαϊκού και παραμορφώσεων των φύλλων και των καρπών, ενώ το 2013 ανιχνεύθηκε στους ίδιους Νομούς και σε καλλιέργειες καρπουζιάς. Στην παρούσα εργασία, προσδιορίστηκε η αλληλουχία σχεδόν του συνόλου του γονιδιώματος μιας απομόνωσης του MWMV που προήλθε από φυτό καρπουζιάς από την περιοχή της Αμαλιάδας, ενώ μελετήθηκε το φυσικό και εργαστηριακό εύρος ξενιστών του. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν από αγρούς προσβεβλημένους με τον MWMV, 128 αυτοφυή φυτά (15 φυτικά είδη), 9 διαφορετικών βοτανικών οικογενειών και ελέγχθηκαν μοριακά για την παρουσία του ιού, ενώ πραγματοποιήθηκαν μηχανικές μολύνσεις διαφόρων φυτοδεικτών. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία της ελληνικής απομόνωσης του MWMV παρουσίασε υψηλά ποσοστά ομοιότητας (99%) με μια απομόνωση του ιού από κολοκυθιά, από την Τυνησία, που είναι και η μοναδική πλήρως χαρακτηρισμένη απομόνωση του ιού. Το αποτέλεσμα αυτό συνάδει με πρόσφατες μελέτες που δείχνουν χαμηλά ποσοστά διαφοροποίησης μεταξύ απομονώσεων του ιού από χώρες της Μεσογειακής λεκάνης το οποίο υποδεικνύει ότι πιθανώς προήλθαν από έναν κοινό πρόγονο. Η ελληνική απομόνωση του MWMV εμφάνισε επίσης παρόμοιες βιολογικές ιδιότητες με την απομόνωση από την Τυνησία. Το εργαστηριακό εύρος ξενιστών του ιού περιορίζεται κυρίως σε είδη των οικογενειών Cucurbitaceae, Chenopodiaceae και Amaranthaceae, ενώ τα αυτοφυή είδη Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Conyza bonariensis και Malva sylvestris αποτελούν πηγές του MWMV στη φύση. 54

79 3.1 Εισαγωγή Ο MWMV ανήκει στο γένος Potyvirus της οικογένειας Potyviridae, μεταδίδεται με αφίδες με μηέμμονο τρόπο και προσβάλει καλλιέργειες κολοκυνθοειδών, ενώ έχει αναφερθεί να προσβάλει και την παπάγια (Carica papaya) (Fischer & Lockhart, 1974; Arocha et al., 2008). Ο ιός ενδημεί σε χώρες της Μεσογειακής λεκάνης όπως: την Τυνησία (Yakoubi et al., 2008a), τη Νοτιοδυτική Ισπανία (Quiot-Douine et al., 1990) τις Καναρίους Νήσους (Yakoubi et al., 2008a), την Κεντρική Ιταλία (Roggero et al., 1998) και τη Νοτιοδυτική Γαλλία (Lecoq et al., 2008) ενώ στη χώρα μας ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά το 2012 σε καλλιέργειες κολοκυθιάς σε περιοχές του νομού Ηλείας και Μεσσηνίας (Malandraki et al., 2013). Είναι διαθέσιμη η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία μιας μόνο απομόνωσης του ιού, από κολοκυθιά από την Τυνησία, η οργάνωσή του είναι τυπική των ιών του γένους Potyvirus και το γονιδίωμα του αποτελείται από 9730 νουκλεοτίδια (Yakoubi et al., 2008a). Φυλογενετικές αναλύσεις απομόνωσεων του ιού από χώρες όπου έχει καταγραφεί καταδυκνείουν χαμηλά ποσοστά διαφοροποίσης αυτού από χώρες της Μεσογειακής λεκάνης, σε αντίθεση με απομονώσεις του ιού από την Αφρική που διαφοροποιούνται μεταξύ τους (Yakoubi et al., 2008a). Το εύρος ξενιστών του ιού έχει μελετηθεί ελάχιστά (Yakoubi et al., 2008a) ενώ δεν έχουν αναφερθεί εναλλακτικοί αυτοφυείς-ξενιστές του ιού στη φύση. Συνολικά έχουν καταγραφεί 16 είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας ως φορείς του ιού, τα A. fabae, A. spiraecola, M. rosae, Uroleucon sonchi, A. nerii, A. spiraephaga, A. umbrella, Capitophorus eleagni, Dysaphis (Pomaphis) pyri, Macrosiphniella sanborni, Myzus cerasi, M. varians, Phorodon humuli, Ovatus cretaegarius, Takecallis arundicolens και Uroleucon (Uromelan) aeneum (Μπεναρδής και συν., 2014). Σκοπός της παρούσας μελέτης, ήταν ο μοριακός και βιολογικός χαρακτηρισμός μιας Ελληνικής απομόνωσης του MWMV από καρπουζιά, ο προσδιορισμός της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος του και η μελέτη του εύρους των φυσικών εναλλακτικών ξενιστών του από καλλιέργειες κολοκυνθοειδών στους νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας, με σκοπό την καλύτερη κατανόηση και μελέτη της επιδημιολογίας του. 55

80 3.2 Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση του MWMV Η απομόνωση του MWMV (GR13DY5), που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, συλλέχθηκε τον Ιούνιο του 2013 και προερχόταν από καρπουζιά από την περιοχή της Αμαλιάδας του νομού Ηλείας που παρουσίαζε τυπικά συμπτώματα ιολογικής προσβολής, όπως παραμόρφωση και δεσμίωση των νεύρων. Η παρουσία του MWMV στο φυτικό ιστό επιβεβαιώθηκε ορολογικά με τη μέθοδο DAS-ELISA (Παράρτημα I.1), με χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων (INRA, Montfavet), ενώ δεν ανιχνεύθηκαν οι CMV, ZYMV, WMV, PRSV-W και CABYV Εργαστηριακό εύρος ξενιστών του MWMV Για τον προσδιορισμό του εργαστηριακού εύρους ξενιστών πραγματοποιήθηκαν μηχανικές μολύνσεις 22 φυτικών ειδών, 7 διαφορετικών βοτανικών οικογενειών, καθώς και υβριδίων κολοκυθιάς με ανοχή έναντι άλλων ιών του γένους Potyvirus (Πίνακας 3.2). Η σπορά των φυτοδεικτών πραγματοποιήθηκε σε μίγμα τύρφης Terraplant (Compo) περλίτη σε αναλογία 3:1 σε πλαστικά δοχεία (7x7x6 εκ.), και τα σπορεία καθώς και τα μεταφυτευμένα φυτά αναπτύσσονταν σε θάλαμο ελεγχόμενης θερμοκρασίας (22-25 C) και φωτοπεριόδου (16:8h). Ως μόλυσμα χρησιμοποιήθηκε φυτικός ιστός που λειοτριβήθηκε με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (0,01 M NaH2PO4, ph 7,0 και 0,01 M Na2SO3) και το φυτικό εκχύλισμα αναμείχθηκε με ~ 75 ng/ml mesh Carborundum (ανθρακοπυρίτιο) σε πλαστικό σακουλάκι. Ακολούθησε η εφαρμογή του φυτικού εκχυλίσματος σε φύλλα των φυτοδεικτών τα οποία είχαν προηγουμένως σημανθεί (τρυπηθεί) με καρφίτσα. Στην περίπτωση των κολοκυνθοειδών, η μόλυνση γινόταν στο στάδιο των κοτυληδόνων, ενώ στα υπόλοιπα είδη γινόταν στο στάδιο των τριών πραγματικών φύλλων. Τρία λεπτά μετά τη μόλυνση, τα φύλλα ξεπλένονταν με νερό βρύσης και τα φυτά μεταφέρονταν στο θάλαμο ανάπτυξης. Συνολικά μολύνθηκαν 5 φυτά από το κάθε είδος και πραγματοποιήθηκαν 2 επαναλήψεις Αξιολόγηση αυτοφυών φυτών ως ξενιστών του MWMV Κατά τα έτη διερευνήθηκε η συχνότητα εμφάνισης του MWMV σε αυτοφυή φυτά σε περιοχές των νομών Ηλείας και Μεσσηνίας. Για τον σκοπό αυτό συλλέχθηκαν αυτοφυή φυτά από προσβεβλημένες με τον MWMV, καλλιέργειες κολοκυνθοειδών. Συνολικά συλλέχθηκαν 128 αυτοφυή φυτά (15 φυτικά είδη, 9 διαφορετικών οικογενειών) τα οποία μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Γεωπονίας, όπου έγινε αναγνώριση, 56

81 αρίθμηση και διατήρηση αυτών στους -80 C μέχρις ότου ελεγχθούν για την παρουσία του ιού. Η ταυτοποίηση του ιού έγινε με μέθοδο RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές modet-f/r (Πίνακας 3.1) Εκχύλιση ολικού RNA και προσδιορισμός της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος του MWMV Για την εκχύλιση του ολικού RNA, 0,2 gr φυτικού ιστού αναμείχθηκαν με 2 ml διαλύματος υδροχλωρικής γουανιδίνης σύμφωνα με τη μεθοδολογία εξαγωγής ολικού RNA (Chatzinasiou et al., 2010, μέθοδος Α) (βλέπε Παράρτημα I.2) και η συγκέντρωση του εξαγώγιμου RNA μετρήθηκε με νανοφωτόμετρο P330 (Implen GmbH, Germany). Για τον προσδιορισμό της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος της ελληνικής απομόνωσης (GR13DY5) του MWMV, σχεδιάστηκαν εκκινητές (Πίνακας 3.1) με βάση τη μοναδική πλήρη κατατεθειμένη αλληλουχία απομόνωσης του MWMV από την Τυνησία (Κωδικός καταχώρησης στη βάση δεδομένων EMBL-EBI: EF579955). Πραγματοποιήθηκε μια RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες. Αρχικά πραγματοποιήθηκε το πρώτο στάδιο της RT σε μικροσωλήνα των 0,2μl στον οποίο προστέθηκε διάλυμα αντίδρασης όγκου 50μl, το οποίο συνίστατο από ρυθμιστικό διάλυμα 5X First- Strand Buffer (250mM Tris-HCl, 375mM KCl, 15 mm MgCl2), 50u M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, The Netherlands), 10mM DDT (dithiothreitol, Sigma-Aldrich, Germany), 0,25mM από κάθε dntp (Deoxynucleotide triphosphates, Invitrogen, The Netherlands), 1,5mM τυχαία εξαμερή (Invitrogen, The Netherlands), 5μl δείγματος από ολικό εκχύλισμα RNA και νερό που έχει μεταχειριστεί με DEPC έως τελικού όγκου. Το προφίλ θερμοκυκλοποίησης περιελάμβανε αρχικά έναν κύκλο στους 18 C για 15 λεπτά, έναν κύκλο στους 37 C για 40 λεπτά, έναν στους 42 C για 15 λεπτά και η ολοκλήρωση της αντίδρασης γινόταν στους 95 C για 5 λεπτά. Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν οι PCR σε μικροσωλήνα των 0,2ml στον οποίο προστέθηκε διάλυμα αντίδρασης όγκου 20μl, το οποίο συνίστατο από ρυθμιστικό διάλυμα 1x [10mM Tris HCl (ph 8,8), 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 0,1% Triton X 100], 1U Platinum Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen, The Netherlands), 0,2mM από κάθε dntp, 0,2μM από τον ανοδικό και καθοδικό εκκινητή (που χρησιμοποιούνταν κάθε φορά στην αντίδραση και δίνονται στον Πίνακα 3.2), 2μl cdna από την RT και νερό που έχει μεταχειριστεί με DEPC έως τελικού όγκου. Το θερμικό προφίλ που χρησιμοποιήθηκε ήταν: Αποδιάταξη του εκμαγείου για 4 στους 94 o C, ακολούθησαν 40 κύκλοι αποτελούμενοι από τρία στάδια: α) αποδιάταξη του εκμαγείου στους 95 o C για 30, β) υβριδοποίηση των εκκινητών με το εκμαγείο στους x o C για y (οι τιμές x και y για το κάθε εκκινητή διέφεραν και αναγράφονται στον Πίνακα 3.1), γ) επέκταση των αλυσίδων στους 72 o C για 30 ή στους 68 o C για 57

82 60 (ανάλογα το μέγεθος του προϊόντος για την κάθε αντίδραση), και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 5 στους 72 o C. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας θερμοκυκλοποιητή LabCycler (SensoQuest, GmbH, Germany). Τα προϊόντα (amplicons) που ενισχύθηκαν από την κάθε αντίδραση (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.1) ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (βλέπε Παράρτημα I.3) και ακολούθησε εξαγωγή του DNA με το κιτ καθαρισμού NucleoTrap purification kit (Macherey Nagel, Duren, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή. Τα προϊόντα της ενίσχυσης (καθαρό πλέον DNA) στάλθηκαν για αλληλούχηση στη VBC Biotech (Vienna, Austria) (βλέπε Παράρτημα I.4) Ανάλυση της αλληλουχίας και κατασκευή φυλογενετικού δέντρου Οι αλληλουχίες που προσδιορίστηκαν στην παρούσα εργασία συναρμολογήθηκαν σε μια σχεδόν πλήρη αλληλουχία του MWMV η οποία συγκρίθηκε με τις καταχωρημένες αλληλουχίες του ιού στη διαδυκτιακή βάση δεδομένων NCBI ( χρησιμοποιώντας τις τιμές παραλλακτικότητας κατά ζεύγη που υπολογίστηκαν με την παράμετρο p distance του λογισμικού MEGA έκδοση 6.0 (Kumar et al., 2008; Tamura et al., 2013). Η στοίχιση πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο CLUSTALW του προγράμματος MEGA έκδοση 6.0 (Tamura et al., 2013). Τα κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης νουκλεοτιδίων βρέθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο πρόγραμμα. Για την ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων της ελληνικής απομόνωσης του MWMVχρησιμοποιήθηκε το τμήμα της NIb-CP και εφαρμόστηκε η μέθοδος της ένωσης γειτόνων (Neighbor-Joining-NJ) (Saitou & Nei, 1987), μέσω του προγράμματος MEGA 6.0. Το μοντέλο εξέλιξης που επιλέχτηκε ήταν το JTT+G, ενώ η αξιοπιστία της φυλογενετικής υπόθεσης αξιολογήθηκε με τη χρησιμοποίηση ανάλυσης bootstrap (500 επαναλήψεις). 58

83 Εικόνα3.1. Απεικόνιση της οργάνωσης του γονιδιώματος του MWMV και στρατηγική αλληλούχησης, που περιλαμβάνει διαδοχικές αντιδράσεις τμημάτων του γονιδιώματος. Υποδεικνύονται η σχετική θέση των εκκινητών και τα αντίστοιχα προϊόντα (amplicons) των PCR (βλέπε Πίνακας 3.1). (Τα πλαίσια αναπαριστούν τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα του ιού: P1: P1- πρωτεΐνη, HC-Pro: Βοηθητική πρωτεΐνη, P3: P3- πρωτεΐνη, 6k1: Πρωτεΐνη 1 μεγέθους 6 kda, CI: Πρωτεΐνη κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων, 6k2: Πρωτεΐνη 2 μεγέθους 6 kda, Vpg: Πρωτεΐνη συνδεδεμένη στο ιϊκό γονιδίωμα, Nia-Pro: Πρωτεΐνη μικρών πυρηνικών εγκλείστων, Nib: Πρωτεΐνη μεγάλων πυρηνικών εγκλείστων, CP: καψιδιακή πρωτεΐνη). Πίνακας 3.1. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του MWMV Αντίδραση PCR Ονομασία εκκινητή Αλληλουχία (5 3 ) Tm ( C) α Προϊόν PCR1 modet-f β AARGAYGTTGATGTTGGRAC 60,8 211 bp modet-r γ CCATARTCAYTCTTGACYCCATC 62,5 PCR2 modet-f AARGAYGTTGATGTTGGRAC 60,8 920bp Pr,28V CGATCCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTV 64,0 PCR2B MW2B-F GGGTTTTAGAGCAAGCG 51,0 476bp MW2B-R CAATTTGATTAGGATTGTACTGC 50,1 PCR3 moni-f GATTAGTTCGAAGTAGCTGCC 59,4 1082bp moni-r GACAATCCCCAYTCTCACTCC 62,9 PCR4 mop1-f GTTCTATTACTGTCGATACTAGC 57,0 968bp mop1-r CATCGTATAGTTTATCCTCG 53,8 PCR5 morp1-f GATTGTGAAACGAATCCAG 55,2 1117bp morp1-r TGAACATAATTACCTCGC 53,1 PCR6 mohc-f AAGAATCTCATAATTTCGACC 55,0 1130bp mohc-r ACTTAGCTCTTCCCATGC 57,6 PCR7 morhcp-f GTCACTTGAAACACTTGG 54,7 1136bp mocl-r CATAGTGGTCGTGTTGGC 58,9 PCR8 MWCI1-2F AGTGATTGCGTGTATAGGG 57,8 1298bp MWCI1-2R GTTCTAGCTTGTCTAACAGTGC 59,8 PCR8B MW8B-F GTGAGAATGTATGTAAGCAGC 57,8 769bp MW8B-R TTCTGTATGTCCAATTCTCAAAGC 60,5 PCR9 MWCI2-F CGTTATTCAAAGCAACCG 55,5 1104bp MWCI2-R CCTTAAACTTGAGCTTCTGTCG 60,0 PCR10 MWCI3-F AGCAATTCCAATGTCGAG 56,3 1207bp monia-r GCTAGCCTCTGAGACTTTG 58,2 PCR10B MW10B-F CACAATTGAGCATTTCTTCGG 59,0 728bp MW10B-R ACAATGTCAGTCTTTCCG 55,8 PCR11 moniab-f CCATTCCATAGTAGATTGCG 56,9 1041bp moniab-2r TGGCTCCTAACAATGTGTCG 60,9 PCR12 MWMSTR-F AAATAAAACATCTCAACAC 50,4 392bp MWMStr-R CTTTCTTGCTGAATGGC 54,5 α Θερμοκρασία υβριδοποίησης (Melting temperature, Tm). β Ανοδικός (Forward) εκκινητής. γ Καθοδικός (Reverse) εκκινητής. Y= C ή T, R= A ή G 59

84 3.3 Αποτελέσματα Εργαστηριακό εύρος ξενιστών του MWMV Για τον προσδιορισμό του εργαστηριακού εύρους ξενιστών μολύνθηκαν μηχανικά 22 φυτικά είδη, 7 διαφορετικών βοτανικών οικογενειών (Πίνακας 3.2). Το εργαστηριακό εύρος ξενιστών της ελληνικής απομόνωσης του MWMV φαίνεται να περιορίζεται σε είδη των οικογενειών Amaranthaceae, Chenopodiaceae και Cucurbitaceae. Tα φυτικά είδη Amaranthus retroflexus, Gomphrenna globosa, Chenopodium album και C. quinoa εμφάνισαν τοπικές νεκρωτικές κηλίδες, ενώ όλα τα είδη της οικογένειας Cucurbitaceae μολύνθηκαν διασυστηματικά: αρχικά εμφάνισαν λεύκανση των νευρώσεων στο πρώτο πραγματικό φύλλο που συνοδεύτηκε από έντονο μωσαϊκό και Πίνακας3.2. Εύρος ξενιστών και αντίδραση φυτοδεικτών σε μηχανική μόλυνση από την ελληνική απομόνωση του MWMV παραμόρφωση του ελάσματος των φύλλων. Το υβρίδιο πεπονιάς Lavigal Φυτικό Είδος Ποικιλία Συμπτώματα α Amaranthaceae παρουσίασε έντονη εμφάνιση Compositae Asteraceae Sonchus oleraceus - Brassicaceae Cucurbitaceae Amaranthus retroflexus Brassica rapa Chenopodium album ΤΝΚ Yuki ΤΝΚ - Gomphrenna globosa Chenopodiaceae Chenopodium quinoa ΤΝΚ ΤΝΚ φλυκταινών 2 εβδομάδες μετά την μόλυνση. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν σύμπτωματα και δεν ανιχνεύθηκε ο ιός σε είδη των οικογενειών Asteraceae, Brassicaceae, Fabaceae και Solanaceae (Πίνακας 3.2). Citrullus lanatus Celine ΔΜ, Π Obla ΔΜ, Π Cucumis melo Lavigal ΔΜ, Π, Φ Cucumis sativus Celcius ΔΜ, Π Cucurbita pepo Borelina F1 ΔΜ, Π Chivas β ΔΜ, Π Ortano γ ΔΜ, Π Otto γ ΔΜ, Π Rigas β ΔΜ, Π Cucurbita moschata ΔΜ, Π Lagenaria sp. ΔΜ, Π Fabaceae Phaseoulus vulgaris - Vicia Faba - Solanaceae Capsicum annum Sammy - Datura stramonium - Lycopersicon esculentum Elpida - Nicotiana benthamiana - Nicotiana glutinosa - Nicotiana tabacum Xanthi - Physalis floridana - Solanum nigrum - α - = όχι συμπτώματα, ΔΜ= Διασυστηματική μόλυνση (μωσαϊκό), Π= παραμόρφωση φύλλων, ΤΝΚ= τοπικές νεκρωτικές κηλίδες, Φ= φλύκταινες β Υβρίδιο με ανοχή στους ZYMV, WMV, CMV γ Υβρίδιο με ανοχή στους ZYMV, WMV 60

85 3.3.2 Φυσικό εύρος ξενιστών του MWMV Τα έτη συλλέχθηκαν συνολικά, 128 αυτοφυή φυτά από 15 είδη που ανήκουν σε 9 διαφορετικές οικογένειες, σε περιοχές του νομού Ηλείας και Μεσσηνίας από καλλιέργειες κολοκυνθοειδών μολυσμένες από τον ιό (Πίνακας 3.3). Τα αυτοφυή φυτά που συλλέχθηκαν δεν εμφάνιζαν συμπτώματα ιολογικής προσβολής. Μολυσμένα από τον ιό βρέθηκαν τα είδη: Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Conyza bonariensis και Malva sylvestris, ενώ κανένα από τα είδη Amaranthus blitoides (2 φυτά που ελέγχθηκαν), Heliotropium europium (1), Anthemis arvensis (5), Sonchus oleraceus (7), Sinapis arvensis (5), Convolvulus arvensis (8), Chrozophora tinctoria (1), Abutilon theophrasti (4), Portulaca oleracea (8), Solanum nigrum (10) και Datura stramonium (6), δεν βρέθηκε μολυσμένο. Πίνακας 3.3. Έλεγχος αυτοφυών φυτών για την παρουσία του MWMV Οικογένεια Κοινό Όνομα Λατινικό Όνομα Κατάταξη α Αριθμός ζιζανίων Αριθμός θετικών που ελέγχθησαν ζιζανίων β Amaranthaceae Πλαγιαστό βλήτο Amaranthus blitoides ΜΑ 2 0 Τραχύ βλήτο Amaranthus retroflexus ΜΑ 28 5 Boraginaceae Κοινό ηλιοτρόπιο Heliotropium europeum ΜΑ 1 0 Chenopodiaceae Λουβουδιά Chenopodium album ΜΑ 2 1 Compositae Ανθεμίδα Anthemis arvensis ΜΑ 5 0 Ζωχός Sonchus oleraceus MX 7 0 Κόνυζα Conyza bonariensis MX 5 1 Σινάπι Sinapis arvensis MX 5 0 Convolvulaceae Περικοκλάδα Convolvulus arvensis Π 8 0 Euphorbiaceae Χρωζοφόρα Chrozophora tinctoria Μ 1 0 Malvaceae Αγριοβαμβακιά Abutilon theophrasti ΜΑ 4 0 Μολόχα Malva sylvestris ΜΑ/Π 34 1 Portulacaceae Γλυστρίδα Portulaca oleracea ΜΑ 8 0 Solanaceae Αγριοτοματιά Solanum nigrum ΜΑ 10 0 Τάτουλας Datura stamonium ΜΑ 6 0 Σύνολο (6,25%) α ΜΑ= μονοετές ανοιξιάτικο, ΜΧ= μονοετές χειμωνιάτικο, Π= πολυετές β Αριθμός θετικών δειγμάτων/ελέγχθησαν με την μέθοδο της RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές modet-f/modet-r (Πίνακας 3.2) Αλληλούχιση της ελληνικής απομόνωσης (GR13DY5) του MWMV Η σχεδόν πλήρης νουκλεοτιδική αλληλουχία της ελληνικής απομόνωσης (GR13DY5) του MWMV, προσδιορίστηκε και κατατέθηκε στη βάση δεδομένων EMBL-EBI (Κωδικός Αριθμός: LN810061). Συνολικά προσδιορίστηκαν 9694 νουκλεοτίδια (99,6%) της αλληλουχίας του γονιδιώματος της Ελληνικής απομόνωσης του MWMV (βλέπε Παράρτημα II). 61

86 Η αλληλουχία του 5 άκρου (36nt) δεν προσδιορίσθηκε καθώς δεν κατέστη δυνατή η ενίσχυση της περιοχής αυτής με την τεχνική της 5 RACE. Η συνολική σύνθεση των βάσεων του γονιδιώματος βρέθηκε να είναι 32% A, 19% C, 23% G και 26% U. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία της Ελληνικής απομόνωσης παρουσίασε πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας (99%) με την απομόνωση του MWMV από κολοκυθιά από την Τυνησία (Κωδικός αριθμός: EF579955). Συνολικά εντοπίστηκαν 94 διαφορές σε νουκλεοτίδια και 24 σε αμινοξέα μεταξύ των αλληλουχιών. Η ελληνική απομόνωση του MWMV έχει στο γονιδίωμά της μοτίβα τα οποία είναι πολύ συντηρημένα στους poty-ιούς, όπως η τριπλέτα των αμινοξέων DAG, η οποία είναι συντηρημένη μεταξύ του ιών του γένους Potyvirus στο αμινοτελικό άκρο της CP της ελληνική απομόνωσης του MWMV. Επίσης, στην HC-Pro βρέθηκαν τα μοτίβα RITC, PTR και CSC σε σύγκριση με τα υψηλώς συντηρημένα KITC (ή KLSC), PTK και CCC μοτίβα που εμφανίζουν ιοί του γένους, αντιστοίχως Φυλογενετική ανάλυση Το φυλογενετικό δένδρο που προέκυψε από την σύγκριση των αμινοξικών (aa) αλληλουχιών τμήματος της Nib και της CP, διαχωρίζει το σύνολο των απομονώσεων του MWMV σε 3 διακριτές ομάδες (Εικόνα 3.2). Η Ελληνική απομόνωση ομαδοποιήθηκε με απομονώσεις από την Μεσογειακή λεκάνη, ενώ η απομόνωση από το Σουδάν είναι διαφοροποιημένη. Εικόνα 3.2. Φυλογενετικό δέντρο ένωσης γειτόνων (Neighbor-Joining) αμινοξικών αλληλουχιών τμήματος του N-άκρου της Nib και CP 18 απομονώσεων του MWMV. Οι τιμές αριστερά στον κάθε κλάδο υποδεικνύουν το ποσοστό 500 επαναλήψεων της ανάλυσης bootstrap, η οποία υποστηρίζει την ομαδοποίηση σε κάθε κόμβο. Η κλίμακα αντιπροσωπεύει τον αριθμό αντικατάστασης των νουκλεοτιδίων ανά θέση. Το μήκος των βραχιόνων είναι ανάλογο με τις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν. Οι κωδικοί αριθμοί των απομονώσεων δίνονται αριστερά από την κάθε περιοχή της απομόνωσης. 62

87 3.4 Συζήτηση Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε μια ελληνική απομόνωση του MWMV σε βιολογικό αλλά και μοριακό επίπεδο. Η ελληνική απομόνωση (GR13DY5) μολύνει διασυστηματικά διάφορους ξενιστές της οικογένειας Cucurbitaceae, ενώ μολύνει και είδη των οικογενειών Amaranthaceae και Chenopodiaceae. Η ελληνική απομόνωση εμφάνισε παρόμοιες βιολογικές ιδιότητες με την απομόνωση από την Τυνησία, προκαλώντας συμπτώματα παρόμοια με αυτά που περιγράφονται και σε άλλες μελέτες (Roggero et al., 1998; Yakoubi et al., 2008a). Η εξάπλωση πολλών αφιδομεταδιδόμενων ιών, ιδιαίτερα όσων δεν μεταδίδονται με το σπόρο εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από τα αυτοφυή φυτά-ξενιστές, τα οποία αποτελούν εστίες μόλυνσης αλλά και ξενιστές των φορέων τους και έχουν επισημανθεί ως σημαντικοί επιδημιολογικοί παράγοντες (Duffus, 1971; Cooper & Jones, 2006). Ο ρόλος των αυτοφυών στην επιδημιολογία του MWMV δεν έχει μελετηθεί επαρκώς, και για το λόγο αυτό στην εργασία αυτή έγινε προσπάθεια της καταγραφής των αυτοφυών ξενιστών του MWMV στους νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας όπου ο ιός ενδημεί. Συνολικά, συλλέχθηκαν από καλλιέργειες κολοκυνθοειδών 128 ζιζάνια από 15 φυτικά είδη που ανήκουν σε 9 οικογένειες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα είδη, A. retroflexus, C. album, C. bonariensis και M. sylvestris αποτελούν ξενιστές του ιού στη φύση και προφανώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία του. Τα είδη αυτά καταγράφονται για πρώτη φορά παγκοσμίως ως ξενιστές του MWMV. Πάντως θα πρέπει να τονιστεί το γεγονός ότι τα είδη A. retroflexus και C. album μολύνονται τοπικά (αυτό τουλάχιστον πρόκυψε στο εργαστήριο) γεγονός που δυσχαιρένει την πρόσληψη τους από τις αφίδες. Συνεπώς θα πρέπει να διερευνηθεί αν και οι άλλοι ξενιστές (C. bonariensis και M. sylvestris) μολύνονται διασυστηματικά καθώς επίσης, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες σε ότι αφορά τη μετάδοση του MWMV από τους αυτοφυείς ξενιστές σε καλλιεργούμενα φυτικά είδη. Για τον περιορισμό της περαιτέρω διασποράς και διαχείμασης των φυτικών ιών κρίνεται αναγκαία η λήψη προληπτικών μέτρων, όπως είναι η διαχείριση της αυτοφυούς βλάστησης πριν την εγκατάσταση, κατά τη διάρκεια αλλά και μετά το πέρας της καλλιεργητικής περιόδου. Ένα μέτρο το οποίο έχει βρει αποτελέσματα και για άλλους ιούς των κολοκυνθοειδών όπως του ιού του κιτρινίσματος των νεύρων της κολοκυθιάς (Squash vein yellowing virus, SqVYV), που μεταδίδεται όμως με αλευρώδεις (Adkins et al., 2011). Τα μολυσμένα φυτά των περισσότερων ειδών δεν παρουσίαζαν συμπτώματα, ένα φαινόμενο το οποίο έχει αναφερθεί για διάφορους ιούς (Chatzivassiliou et al., 2001) και μπορεί να σχετίζεται με παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των συμπτωμάτων όπως η θερμοκρασία αλλά και η συγκέντρωση του ιού στα αυτοφυή φυτά 63

88 (Muthukumar et al., 2009; Prendeville et al., 2012). Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να επικεντρωθούν σε πιο συστηματικές δειγματοληψίες ζιζανίων, καθ όλη την καλλιεργητική περίοδο για τον προσδιορισμό και άλλων εναλλακτικών ξενιστών του ιού ώστε να καθοριστεί ο ρόλος τους στην επιδημιολογία του ιού. Είναι απαραίτητος ο έλεγχος όχι μόνο αυτοφυών φυτών αλλά και άλλων εναλλακτικών ξενιστών, όπως για παράδειγμα καλλωπιστικών φυτών που καλλιεργούνται σε οικιακούς λαχανόκηπους, καθώς έχει αποδειχθεί ότι αποτελούν ξενιστές ιών του γένους Potyvirus όπως οι: ZYMV και WMV (Perring et al., 1992; Lecoq et al., 2014). Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκε επίσης η πλήρης αλληλουχία του γονιδιώματος της απομόνωσης MWMV (GR13DY5) από καρπουζιά που συλλέχτηκε στην περιοχή της Αμαλιάδας. Η ελληνική απομόνωση παρουσίασε πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας με την μοναδική πλήρως χαρακτηρισμένη απομόνωση του ιού από την Τυνησία (Yakoubi et al., 2008a). Η φυλογενετική ανάλυση απομονώσεων του MWMV έδειξε την ύπαρξη 3 διακριτών ομάδων με απομονώσεις του ιού από την Αφρική να διαφοροποιούνται μεταξύ τους. Στην 1 η ομάδα εντάσσονται απομονώσεις του ιού από τη Μεσόγειο, ενώ στη 2 η και 3 η ομάδα κατατάσσονται απομονώσεις του ιού από τη Νότια και κεντρική Αφρική, αντίστοιχα. Η ελληνική απομόνωση, εντάχθηκε στην ομάδα 1 με απομονώσεις από τη Γαλλία, Ιταλία, Ισπανία και Τυνησία. Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν με πρόσφατες μελέτες που δείχνουν χαμηλά ποσοστά διαφοροποίησης μεταξύ απομονώσεων του ιού από χώρες της Μεσογειακής λεκάνης, το οποίο υποδεικνύει ότι πιθανώς προήλθαν από έναν κοινό πρόγονο (Yakoubi et al., 2008a). Οι γενετικές αποστάσεις των απομονώσεων σε σύγκριση με τις γεωγραφικές τους προελεύσεις, υποδηλώνουν την περιορισμένη διασπορά του ιού σε μεγάλες αποστάσεις, η οποία ενδεχομένως να οφείλεται στον μη-έμμονο τρόπο μετάδοσης καθώς και στη μη-μετάδοση του ιού με το σπόρο. Αυτό το φαινόμενο έχει παρατηρηθεί και σε άλλους ιούς όπως για παράδειγμα στον ιό της κίτρινης ποικιλοχλώρωσης του ρυζιού (Rice yellow mottle virus, RYMV) (γένος Sobemovirus) (Abubakar, 2003; Fargette et al., 2004, 2006). Τα μοτίβα RITC και PTR που βρέθηκαν στη HC-Pro της ελληνικής απομόνωσης του MWMV, σε αντίθεση με τα υψηλώς συντηρημένα μοτίβα KITC (ή KLSC) και PTK, αντίστοιχα, που εμφανίζουν ιοί του γένους Potyvirus τα οποία όπως αναλύθηκε στο υποκεφάλαιο αλληλεπιδρούν με το μοτίβο DAG που βρίσκεται στην CP και είναι απαραίτητα για τη μετάδοση με τις αφίδες, έχουν βρεθεί και στους: ClYVV (Takahashi et al., 1997), PSbMV (Johansen et al., 1991) και στον ιό του κίτρινου μωσαϊκού της φασολιάς (Bean yellow mosaic virus, BYMV) (Guyatt et al., 1996), του γένους Potyvirus. Επίσης, το μοτίβο CSC της Ελληνικής απομόνωσης του MWMV σε σύγκριση με το επίσης πολύ συντηρημένο μοτίβο των poty-ιών έχει αναφερθεί και σε άλλους ιούς όπως τους, PSbMV και PRSV-W και όπως φαίνεται δεν επηρεάζει τη λειτουργία της πρωτεΐνης (Flasinski & 64

89 Cassidy, 1998). Τα μοτίβα RITC και PTR καθώς και η ύπαρξη του μοτίβου DAG στην CP δεν επηρεάζεoυν τη μετάδοση με τις αφίδες, όπως προκύπτει από τις μελέτες μετάδοση με αφίδες που πραγματοποιήθηκαν (βλέπε Κεφάλαιο 4). 65

90 66

91 4 Κεφάλαιο 4 ο Κεφάλαιο 4 ο Μετάδοση του MWMV με αφίδες 67

92 Περίληψη Ο MWMV, μεταδίδεται με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο και προκαλεί σημαντικές ζημίες σε καλλιέργειες κολοκυθιάς στους Νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η μετάδοση του MWMV με διάφορα είδη αφίδων. Έγιναν δοκιμές μετάδοσης του ιού με τα είδη αφίδων M. persicae και A. gossypii από διαφορετικούς ξενιστές (κολοκύθι, καρπούζι, πεπόνι, αγγούρι) ως πηγές του ιού, ενώ αξιολογήθηκε επίσης η ικανότητα πρόσληψης/μετάδοσης του ιού από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς με τα δύο αυτά είδη αφίδων. Επίσης, μελετήθηκε η μετάδοση του ιού από 8 κλώνους του M. persicae που συλλέχθηκαν κυρίως από καλλιέργειες καπνού και οπωρώνες ροδακινιάς και διέφεραν ως προς τα επίπεδα ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα. Τέλος, αξιολογήθηκαν 19 είδη αφίδων ως φορείς του ιού σε πειράματα υποχρεωτικής μετάδοσης από και σε φυτά κολοκυθιάς. Το είδος M. persicae ήταν πιο αποτελεσματικός ως φορέας του ιού από το είδος A. gossypii και παρουσίασε την υψηλότερη αποτελεσματικότητα όταν ως πηγή χρησιμοποιήθηκε η καρπουζιά. Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κλώνων του M. persicae στη μετάδοση του MWMV, χωρίς όμως να συνδέονται με τα διαφορετικά επίπεδα ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα. Και τα δύο είδη αφίδων, M. persicae και A. gossypii ήταν ικανά να προσλάβουν και να μεταδώσουν τον MWMV από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς. Όταν συγκρίθηκαν τα διάφορα είδη-αφίδων ως φορείς του ιού βρέθηκε ότι, το M. persicae είναι ο πιο αποτελεσματικός φορέας ακολουθούμενος από τα είδη Aphis gossypii, A. hederae, A. cytisorum, Α. fabae, A. nerii, Phorodon humuli, A. pomi, Macrosiphum rosae, Hyalopterus pruni, Aphis sedi (πρώτη καταγραφή της παρουσίας του στην Ελλάδα), A. umbrella, Myzus cerasi και Uroleucon sonchi. Τα είδη Aphis nasturtii, Acyrthosiphon pisum, Brevicoryne brassicae, Hyperomyzus lactucae, και Uroleucon aeneum δεν μετέδωσαν τον ιό. Τα είδη A. pomi, A. hederae, A. cytisorum, H. pruni, και A. sedi αναφέρονται για πρώτη φορά ως φορείς του MWMV. 68

93 4.1 Εισαγωγή Ο MWMV αποτελεί αναδυόμενη απειλή της καλλιέργειας των κολοκυνθοειδών για όλη τη λεκάνη της Μεσογείου (Lecoq & Desbiez, 2012). Μεταδίδεται με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο και προκαλεί συμπτώματα μωσαϊκού, παραμόρφωσης των φύλλων και των καρπών (Fischer & Lockhart, 1974; Yakoubi et al., 2008a). Μέχρι σήμερα 16 είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας έχουν καταγραφεί ως φορείς του ιού με τα περισσότερα είδη να είναι μη-αποικίζοντα (Μπεναρδής και συν., 2014). Οι αλληλεπιδράσεις ιού-φορέα και η συμπεριφορά των αφίδων καθορίζουν τον τρόπο που ο ιός μεταδίδεται καθώς και την αποτελεσματικότητα μετάδοσης από την αφίδα φορέα (Gray & Banerjee, 1999). Οι έμμονοι ιοί (και μερικοί ημι-έμμονοι) μεταδίδονται με αποικίζοντα είδη αφίδων (Gray & Gildow, 2003), ενώ οι μη-έμμονοι ιοί μεταδίδονται κυρίως με μη-αποικίζοντα είδη (Fereres et al., 1993; Katis et al., 2006; Fereres & Moreno, 2009). Την κολοκυθιά την αποικίζουν 12 είδη αφίδων, μεταξύ αυτών τα είδη, A. gossypii, M. persicae, A. craccivora και M. euphorbiae (Blackman & Eastop, 2008). Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης (transmission efficiency) ορίζεται ως η πιθανότητα μόλυνσης μιας ιικής απομόνωσης από ένα είδος/βιότυπο φορέα κάτω από συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες και προσδιορίζει την ικανότητα ενός συγκεκριμένου είδους/βιοτύπου ως φορέα του ιού (Sylvester, 1954). Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα μετάδοσης των poty-ιών ποικίλουν. Το είδος του φυτού ξενιστή, το είδος/βιότυπος της αφίδας-φορέα, η ιική απομόνωση, οι περιβαλλοντικές συνθήκες αλλά και η τροφική συμπεριφορά της αφίδας-φορέα (feeding behavior) εμπλέκονται στην μετάδοση των ιών του γένους Potyvirus (Raccah et al., 2001). Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μετάδοσης του MWMV με 19 είδη αφίδων σε πειράματα υποχρεωτικής μετάδοσης. Επίσης, αξιολογήθηκαν 8 κλώνοι του είδους M. persicae που διέφεραν ως προς τα επίπεδα ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα, στην αποτελεσματικότητα μετάδοσης του ιού από και προς φυτά κολοκυθιάς καθώς και η ικανότητα μετάδοσης του ιού από τα είδη A. gossypii και M. persicae από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές (κολοκύθι, καρπούζι, αγγούρι, πεπόνι). Επίσης, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μετάδοσης του ιού από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς. 69

94 4.2 Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό Υλικό Σε όλα τα πειράματα των αφιδομεταδόσεων χρησιμοποιήθηκαν φυτά κολοκυθιάς υβριδίου Borelina F1 καθώς και φυτά καρπουζιάς υβρίδιο Celine F1, αγγουριάς υβρίδιο Celcius και πεπονιάς υβρίδιο Lavigal. Τα φυτά αναπτύσσονταν σε πλαστικά δοχεία (7x7x6 εκ.) σε χώμα Terraplant (Compo) σε θάλαμο θερμοκρασίας 24±2 C και σταθερής φωτοπεριόδου (16:8h). Τα φυτά χρησιμοποιήθηκαν στο στάδιο των κοτυληδόνων-1 ου πραγματικού φύλλου Απομόνωση του MWMV Στα πειράματα αφιδομεταδόσεων χρησιμοποιήθηκε η απομόνωση του MWMV (GR12AA1) η οποία προερχόταν από υπαίθρια καλλιέργεια κολοκυθιάς από τα Λεχαινά του νομού Ηλείας και διατηρήθηκε στο εργαστήριο σε φυτά κολοκυθιάς υβριδίου Borelina F1 μέσω μηχανικών μολύνσεων. Για την αποφυγή επιμολύνσεων, τα μολυσμένα φυτά διατηρήθηκαν σε εντομοστεγές αυτοσχέδιο ξύλινο κλωβό σε θάλαμο με θερμοκρασία 24±2 C και σταθερή φωτοπερίοδο (16:8h) Αποικίες αφίδων Αναγνώριση Οι αποικίες των κλώνων (παρθενογενετικές σειρές) M. persicae διατηρούνταν σε αυτοσχέδια κουτιά εκτροφής αφίδων (Blackman, 1971) (Εικόνα 4.1) σε κομμένα φύλλα κινέζικου λάχανου (Brassica Σπόγγος rapa var pekinensis Yuki, Brassicaceae), ενός μηξενιστή του MWMV. Το είδος A. gossypii διατηρείτο επίσης σε αντίστοιχα κουτιά εκτροφής σε κομμένα φύλλα κολοκυθιάς υβρίδιο Borelina F1 που είχαν όμως αναπτυχθεί σε εντομοστεγές αυτοσχέδιο ξύλινο κλωβό για την αποφυγή επιμολύνσεων. Οι αποικίες Εικόνα 4.1. Κουτιά εκτροφής αφίδων τύπου Blackman για την διατήρηση των αφίδων. Στην βάση των αφίδων διατηρούνταν σε βιοκλιματικό θάλαμο διαθέτουν σπόγγο για κατακράτηση νερού και ανοίγματα με εντομοστεγές δίχτυ που παρέχουν σταθερής θερμοκρασίας (18 C) και φωτοπεριόδου αερισμό για τη συντήρηση του φύλλου. (16:8h). Συνολικά συλλέχθηκαν 19 είδη αφίδων από διάφορα φυτά τόσο καλλιεργούμενα όσο και αυτοφυή από το νομό Θεσσαλονίκης, μεταξύ αυτών τα περισσότερα είδη του γένους Aphis, καθώς και από άλλα γένη της οικογένειας Aphididae (Πίνακας 4.1). Η αναγνώριση των αφίδων έγινε με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των άπτερων μορφών καθώς και τα είδη των φυτών-ξενιστών που εντοπίστηκαν. Αρχικά δημιουργήθηκαν μόνιμα παρασκευάσματα (slides) (Εικόνα 4.2) (βλέπε 70

95 Παράρτημα Ι.5) από το εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Γεωπονίας του ΑΠΘ και έπειτα στάλθηκαν στο Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστήμιου Θεσσαλίας όπου η αναγνώριση των αφίδων πραγματοποιήθηκε από τον Δρ. κ. Ιωάννη Μαργαριτόπουλο. Εικόνα 4.2. Ενήλικο άπτερο του είδους M. Persicae σε μόνιμο παρασκεύασμα (slide) (Α). Μορφολογία κεφαλής (Β), στοματικών μορίων (Γ), σιφωνίων και cauda (Δ) (από προσωπικό αρχείο Χ.Κ Ξάνθη). Πίνακας 4.1. Είδη αφίδων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αφιδομεταδόσεων και φυτά-ξενιστές από όπου συλλέχτηκαν Είδος αφίδα Ξενιστής Acyrthosiphon pisum (Harris) Κουκιά (Vicia faba) Aphis cytisorum (Hartig) Aphis fabae (Scopoli) Aphis gossypii (Glover) Aphis hederae (Kaltenbach) Aphis nasturtii (Kaltenbach) Aphis nerii (Boyer de Fonscolombe) Aphis pomi (Linnaeus) Aphis sedi (Kaltenbach) Aphis umbrella (Börner) Brevicoryne brassicae (Linnaeus) Hyalopterus pruni (Geoffroy) Hyperomyzus lactucae (Linnaeus) Macrosiphum rosae (Linnaeus) Myzus cerasi (Fabricius) Myzus persicae (Sulzer) Phorodon humuli (Schrank) Uroleucon aeneum (Hille Ris Lambers) Σπάρτο (Spartium junceum) Κουκιά (Vicia faba) Κολοκύθι (Cucurbita pepo) Κισσός (Hedera helix) Λάχανο (Brassica oleracea) Πικροδάφνη (Nerium oleander) Μηλιά (Malus domestica) Παχύφυτο (Echeveria glauca) Μολόχα (Malva parviflora) Λάχανο (Brassica oleracea) Βερικοκιά (Prunus armeniaca) Ζωχός (Sonchus oleraceous) Τριανταφυλλιά (Rosa sp.) Κερασιά (Prunus avium) Πατάτα (Solanum tuberosum) Καλλ. Δαμασκηνιά (Prunus cerasifera) Γαϊδουράγκαθο (Silybum marianum) 71

96 4.2.4 Μετάδοση του MWMV με αφίδες Τα φυτά δότες (κολοκύθι, καρπούζι, αγγούρι, πεπόνι) μολύνονταν μηχανικά στο στάδιο των κοτυληδόνων με την απομόνωση του MWMV (5 φυτά) και χρησιμοποιούνταν ημέρες μετά την μόλυνση. Οι δοκιμές μετάδοσης πραγματοποιήθηκαν σε συνθήκες υποχρεωτικής (μη-έμμονος τρόπος) διατροφής και χρησιμοποιούνταν άπτερα ενήλικα θηλυκά άτομα (ίδιας ηλικίας 8-10 ημερών), τα οποία υποβάλλονταν σε νηστεία ~ ωρών σε τρυβλία Petri (Watson & Plumb, 1972). Για την πρόσληψη του ιού δόθηκε στις αφίδες χρόνος διατροφής (Acquisition Access Period, AAP) 3-5 λεπτών σε μολυσμένο φύλλο. Ο χρόνος πρόσληψης δεν ξεπέρναγε ποτέ τα 5 λεπτά, ώστε να αποφευχθεί να χάσουν οι αφίδες την ιοφόρο ικανότητα (Fereres & Moreno, 2009). Στην συνέχεια, οι αφίδες μεταφέρονταν σε ομάδες των 5 ή 10 ατόμων/φυτό, Πείραμα Β) σε ένα υγιές φυτό κολοκυθιάς (ή αντίστοιχου φυτικού είδους, Πείραμα Γ). Ο χρόνος μετάδοσης (Inoculation Access Period, IAP) κυμάνθηκε από 8-12 ώρες. Μετά την μεταφορά των αφίδων τα φυτά καλύπτονταν με πλαστικό ποτήρι το οποίο στην επάνω πλευρά είχε εντομοστεγές δίχτυ και το κάτω μέρος αυτού εφαπτόταν στο χώμα ώστε να εμποδίσει τις αφίδες να μετακινηθούν σε άλλο φυτό. Την επομένη μέρα, ψεκάζονταν με διασυστηματικό εντομοκτόνο imidacloprid (Confidor, Bayer Hellas) για την θανάτωση των αφίδων, και οι κλωβοί απομακρύνονταν 2-3 ημέρες αργότερα (Εικόνα 4.3). Εικόνα 4.3. Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας, πρόσληψης/μετάδοσης του MWMV που ακολουθήθηκε στα πειράματα των αφιδομεταδόσεων (Α-Γ). Τα φυτά μεταφέρονταν σε θάλαμο με θερμοκρασία (24±2 C) και σταθερή φωτοπερίοδο (16:8h). Τα πειράματα των αφιδομεταδόσεων γινόταν σε χώρο όπου η θερμοκρασία κυμαινόταν από C. Για τη διατροφή των αφίδων επιλεγόταν σταθερά το 4 ο πραγματικό φύλλο, ενώ σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιούνταν σε κάθε επανάληψη 5 φυτά μάρτυρες, 2 φυτά όπου οι αφίδες αρχικά είχαν αφεθεί 72

97 να διατραφούν σε υγιές αντί μολυσμένου φυτικού ιστού και 3 υγιή φυτά τα οποία δεν είχαν υποστεί καμία μεταχείριση και τα οποία τοποθετούνταν τυχαία ανάμεσα στις μεταχειρίσεις. Οι αρνητικοί μάρτυρες ελέγχονταν καθημερινά για την εμφάνιση τυχόν συμπτωμάτων. Τα ποσοστά μετάδοσης υπολογίστηκαν με βάση των αριθμό των μολυσμένων φυτών, διαιρούμενο με τον συνολικό αριθμό φυτών που χρησιμοποιήθηκαν Α. Μετάδοση του MWMV με κλώνους του είδους M. persicae Χρησιμοποιήθηκαν άπτερα ενήλικα θηλυκά άτομα 8 διαφορετικών κλώνων (αποικία από ένα θηλυκό άπτερο παρθενογενετικό άτομο) του είδους M. persicae που διέφεραν ως προς τα επίπεδα ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα. Οι περιοχές, ο ξενιστής και το έτος όπου συλλέχθηκαν οι αφίδες καθώς επίσης και τα διαφορετικά επίπεδα ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα συνοψίζονται στον (Πίνακα 4.2) (Kati et al., 2014, Α. Κατή προσωπική επικοινωνία). Ως φυτό δότης/δέκτης χρησιμοποιήθηκαν φυτά κολοκυθιάς (Borelina F1) και πραγματοποιήθηκαν συνολικά 5 επαναλήψεις των 10 φυτών/κλώνο (Πείραμα Α). Πίνακας 4.2. Κλωνικές αποικίες του είδους Myzus persicae που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αφιδομεταδόσεων Κλώνος Ημερομηνία συλλογής Περιοχή Ξενιστής Γονίδιο εστερασών α Καρβαμιδικά/ Οργαν/σφορικά β Kdr (πυρεθροειδή) γ Super-kdr (πυρεθροειδή) 1 Μάρτ Νιόκαστρο Καψέλα FE4 R2/R3 SS SS 89 Μάι Τύρναβος Ροδακινιά FE4 R2/R3 RR SS 193* Ιούλ Νιόκαστρο Καπνός FE4 S/R1 SS SS 270 Σεπτ.2012 Νιόκαστρο Πιπεριά FE4 R2/R3 RR SS 4106Α* Αύγ Σκωτία Πατάτα E4+FE4 S/R1 SS SS 5191Α Οκτ.2007 Ελλάδα Καπνός FE4 R2/R3 SS SS ΚΟΖΡ20 Απρ.2013 Βελβεντό Ροδακινιά FE4 R2/R3 SR SR ΚΟΖΡ28 Απρ Βελβεντό Ροδακινιά FE4 R2/R3 RR SS *Ευαίσθητοι στα εντομοκτόνα κλώνοι. α Γονίδια εστερασών (E4/FE4) (Field et al., 1999; Devonshire et al., 2009). β S/R1: ευαίσθητο ή ελάχιστα ανθεκτικό, R2/R3: μετρίως ή πολύ ανθεκτικό (Foster et al., 2002). γ SS: sensitive homozygote, SR: resistant heterozygote, RR: resistant heterozygote (Margaritopoulos et al., 2007) Β. Είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας (Hemiptera: Aphididae) ως φορείς του MWMV Αξιολογήθηκαν 19 είδη της Ελληνικής αφιδοπανίδας ως προς την ικανότητα μετάδοσης του MWMV, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν σε ομάδες των 5 ή 10 ατόμων ανά φυτό κολοκυθιάς ενώ για το είδος M. persicae χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας 1 αφίδα/φυτό. Ως φυτό δότης/δέκτης χρησιμοποιήθηκαν φυτά κολοκυθιάς υβρίδιο Borelina F1 και συνολικά πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις των 10 φυτών/επανάληψη για κάθε είδος αφίδας (Πείραμα Β). Για την σύγκριση της ικανότητας μετάδοσης των διαφορετικών ειδών αφίδων, υπολογίστηκε η πιθανότητα (συχνότητα) μετάδοσης από ένα μεμονωμένο άτομο, με τον τύπο P*=1-(1-R/N) 1/i, όπου R είναι ο αριθμός των 73

98 φυτών που μολύνθηκαν, N ο αριθμός αυτών που χρησιμοποιήθηκαν και i ο αριθμός των αφίδων ανά φυτό (Gibbs & Gower, 1960) Γ. Μετάδοση του MWMV με τα είδη M. persicae και A. gossypii από και προς διάφορα είδη καλλιεργούμενων ξενιστών Πραγματοποιήθηκαν δύο υποομάδες πειραμάτων και χρησιμοποιήθηκαν 4 φυτικά είδη (κολοκύθι, καρπούζι, αγγούρι, πεπόνι) (Πείραμα Γ). Στην πρώτη υποομάδα (Γ1) αξιολογήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του MWMV με τα είδη M. persicae και A. gossypii όταν ως δότης/δέκτης χρησιμοποιήθηκαν φυτά του ίδιου είδους. Στην δεύτερη υποομάδα (Γ2) πειραμάτων αξιολογήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του ιού με το είδος M. persicae από και προς τα 4 είδη καλλιεργούμενων ξενιστών. Για παράδειγμα οι αφίδες αρχικά τρέφονταν σε μολυσμένο με τον MWMV φυτικό ιστό π.χ. κολοκυθιάς και έπειτα μεταφέρονταν ατομικά και στα 4 φυτικά είδη (κολοκύθι, καρπούζι, αγγούρι, πεπόνι). Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις των 10 φυτών/επανάληψη Δ. Μετάδοση του MWMV από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς με τα είδη M. persicae και A. gossypii Την καλλιεργητική περίοδο 2014 έγινε συλλογή καρπών και φύλλων κολοκυθιάς από τον Νομό Ηλείας και έγινε έλεγχος για την παρουσία του MWMV με την μέθοδο DAS-ELISA. Στις δοκιμές μετάδοσης χρησιμοποιήθηκαν καρποί και φύλλα με μονή μόλυνση από τον ιό και για τις μεταδόσεις χρησιμοποιήθηκαν τα είδη M. persicae και A. gossypii όπως περιγράφτηκε προηγουμένως (σελ. 70). Αντίστοιχα, συνολικά πραγματοποιήθηκαν 4 επαναλήψεις των 10 φυτών/επανάληψη (Πείραμα Δ) Ιολογικός έλεγχος Τα φυτά ελέγχονταν καθημερινά για την παρουσία συμπτωμάτων και ημέρες μετά την μόλυνση τα φυτά ελέγχονταν για την παρουσία του ιού με την μέθοδο DAS-ELISA (Βλέπε Παράρτημα Ι.1). 74

99 4.2.6 Ανάλυση δεδομένων Η στατιστική ανάλυση όλων των δεδομένων υποστηρίχθηκε από το στατιστικό πακέτο IBM SPSS v.21 (SPSS 2012). Τα δεδομένα των μετρήσεων των ποσοστών μετάδοσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση παραλλακτικότητας με έναν παράγοντα (Οne-way ANOVA) των τιμών, από τους μέσους όρους των αποτελεσμάτων. Προτού πραγματοποιηθεί η ανάλυση ANOVA, σε όλα τα πειράματα έγινε εξέταση των υποθέσεων ομοιογένειας και κανονικότητας, ενώ για να επιτευχθεί η ακρίβεια, ομοιογένεια και η κανονικότητα των πειραμάτων έγινε λογαριθμική μετατροπή όλων των δεδομένων (x) σύμφωνα με τον τύπο log(x+1) (Gomez & Gomez, 1984). Η πολλαπλή σύγκριση των μέσων όρων των ποσοστών μετάδοσης πραγματοποιήθηκε με το κριτήριο Tukey s HSD (Honestly Significant Difference) σε επίπεδο σημαντικότητας P<

100 4.3 Αποτελέσματα Α. Μετάδοση του MWMV με κλώνους του είδους Myzus persicae Αξιολογήθηκαν ως προς την μετάδοση του MWMV 8 κλώνοι του είδους M. persicae που διέφεραν ως προς τα επίπεδα ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα. Η ικανότητα μετάδοσης του ιού από τους κλώνους του είδους M. persicae δίνεται στον Πίνακα 4.3. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα ανάλυσης παραλλακτικότητας, δεν βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κλώνων του είδους M. persicae (F=1.441, df=7, MS=1.939, P=0.224) και η μετάδοση κυμάνθηκε από 56% έως 74%. Το μεγαλύτερο ποσοστό μετάδοσης εμφάνισε ο κλώνος 4106Α (ευαίσθητος κλώνος) (74±1,81%), ενώ την μικρότερη οι κλώνοι 5191Α και 270 (ανθεκτικοί στα εντομοκτόνα κλώνοι), με ποσοστά μετάδοσης 58±1,92% και 56±0,89%, αντίστοιχα (Πίνακας 4.3). Πίνακας 4.3. Μετάδοση του MWMV από και προς φυτά κολοκυθιάς με 8 κλώνους του είδους M. persicae (ενήλικα άπτερα θηλυκά) Κλώνος M. persicae Ικανότητα μετάδοσης α 1 0,680±0,044 (0,225) a 89 0,700±0,158 (0,229) a 193* 0,640±0,054 (0,215) a 270 0,560±0,089 (0,193) a 4106Α* 0,740±0,181 (0,239) a 5191Α 0,580±0,192 (0,196) a ΚΟΖΡ20 0,720±0,083 (0,235) a ΚΟΖΡ28 0,700±0,070 (0,230) a *Ευαίσθητοι στα εντομοκτόνα κλώνοι. Ο κλώνος 4106Α προέρχεται από την Σκωτία (Μεγάλη Βρετανία) α Η ικανότητα μετάδοσης του MWMV, υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μολυσμένων φυτών/συνολικό αριθμό των φυτών των δοκιμών για κάθε κλώνο. Δίνονται ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου, [log(x+1) μετασχηματισμένες τιμές]. Η σύγκριση των μέσων όρων διεξήχθη μέσω των log(x+1) μετασχηματισμένων τιμών. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ελέγχου Tukey s (HSD) Β. Είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας (Hemiptera: Aphididae) ως φορείς του MWMV Συνολικά, 19 είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας (Hemiptera: Aphididae) ελέγχθηκαν για την ικανότητά τους να μεταδίδουν τον MWMV και από αυτά 14 τον μετέδωσαν επιτυχώς αλλά διέφεραν ως προς την ικανότητα μετάδοσης. Επίσης, υπολογίστηκε η πιθανότητα μετάδοσης (P*) από ένα μεμονωμένο άτομο, βάση της στατιστικής προσέγγισης των Gibbs & Gower, (1960) και τα αποτελέσματα δίνονται στον Πίνακα 4.4 και στο Διάγραμμα 4.1,

101 Τα αποτελέσματα ανάλυσης παραλλακτικότητας, έδειξαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην ικανότητα μετάδοσης του MWMV μεταξύ των διαφορετικών ειδών αφίδων (F=35.649, df=13, MS=1.486, P<0.001) καθώς επίσης και στην πιθανότητα μετάδοσης (P*) από ένα άτομο (F= , df=13, MS=0.160, P<0.001). Τα ποσοστά (%) μετάδοσης κυμάνθηκαν από 4% έως 72%, ενώ η πιθανότητα μετάδοσης (P*) από ένα μεμονωμένο άτομο κυμάνθηκε από έως (Πίνακας 4.4). Τα είδη Acyrthosiphon pisum, Aphis nasturtii, Brevicoryne brassicae, Hyperomyzus lactucae και Uroleucon aeneum δεν μετέδωσαν τον ιό. Με βάση την πιθανότητα μετάδοσης (P*) το είδος M. persicae είναι ο πιο αποτελεσματικός φορέας, ακολουθούμενος από τα είδη A. gossypii, A. hederae, Πίνακας 4.4. Αξιολόγηση 19 ειδών αφίδων (ενήλικα άπτερα θηλυκά) ως φορέων του MWMV από και προς φυτά κολοκυθιάς και πιθανότητα μετάδοσης (P*) από ένα μεμονωμένο άτομο Είδος αφίδας Ικανότητα μετάδοσης α Πιθανότητα μετάδοσης (P*) β Acyrthosiphon pisum 0 0 f Aphis cytisorum 0,620±0,13 (0,208) 0,0967±0,034 (0,039) c Aphis fabae 0,340±0,14 (0,125) 0,0815±0,032 (0,033) bc Aphis gossypii 0,720±0,08 (0,235) 0,2291±0,046 (0,089) d Aphis hederae 0,440±0,11 (0,015) 0,1120±0,037 (0,045) c Aphis nasturtii 0 0 f Aphis nerii 0,540±0,11 (0,186) 0,0769±0,024 (0,032) bc Aphis pomi 0,480±0,08 (0,169) 0,0642±0,015 (0,026) abc Aphis sedi 0,200±0,07 (0,078) 0,0223±0,008 (0,009) ab Aphis umbrella 0,080±0,08 (0,032) 0,0861±0,009 (0,003) a Brevicoryne brassicae 0 0 f Hyalopterus pruni 0,220±0,08 (0,085) 0,0249±0,010 (0,010) ab Hyperomyzus lactucae 0 0 f Macrosiphum rosae 0,280±0,08 (0,106) 0,0644±0,009 (0,027) abc Myzus cerasi 0,080±0,08 (0,032) 0,0086±0,004 (0,003) a Myzus persicae 0,660±0,08 (0,219) 0,6600±0,089 (0,219) e Phorodon humuli 0,580±0,13 (0,197) 0,0862±0,028 (0,035) bc Uroleucon aeneum 0 0 f Uroleucon sonchi 0,040±0,54 (0,016) 0,0041±0,057 (0,001) a α Η ικανότητα μετάδοσης του MWMV, υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μολυσμένων φυτών/συνολικό αριθμό των φυτών των δοκιμών για κάθε είδος. Δίνονται ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου, [log(x+1) μετασχηματισμένες τιμές]. β Πιθανότητα μετάδοσης από ένα μεμονωμένο άτομο σύμφωνα με την εξίσωση των Gibbs and Gower (1960). Δίνεται η τιμή P* ± τυπικό σφάλμα (SE), [log(x+1) μετασχηματισμένες τιμές]. Η σύγκριση των μέσων όρων διεξήχθη μέσω των log(x+1) μετασχηματισμένων τιμών. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ελέγχου Tukey s (HSD). 77

102 A. cytisorum, Α. fabae, A. nerii, P. humuli, A. pomi, M. rosae, H. pruni, A. sedi (πρώτη καταγραφή της παρουσίας του στην Ελλάδα), A. umbrella, M. cerasi και U. sonchi. Διάγραμμα 4.1. Μετάδοση του MWMV από 19 είδη αφίδων (άπτερα ενήλικα θηλυκά), από και προς φυτά κολοκυθιάς. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Διάγραμμα 4.2. Πιθανότητα μετάδοσης (± τυπικό σφάλμα) του MWV από ένα μεμονωμένο άτομο (άπτερο ενήλικο θηλυκό) 19 ειδών αφίδων, από και προς φυτά κολοκυθιάς. Η πιθανότητα μετάδοσης (P*) υπολογίστηκε από την εξίσωση των Gibbs and Gower (1960): P*=1-(1-R/N) 1/I. Πιθανότητες που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD). 78

103 4.3.3 Γ. Μετάδοση του MWMV από και προς διάφορα είδη καλλιεργούμενων ξενιστών με τα είδη M. persicae και A. gossypii Τα αποτελέσματα των αναλύσεων της πρώτης υποομάδας πειραμάτων (Γ1) έδειξαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην μετάδοση του MWMV ανάλογα με το είδος του φορέα M. persicae και A. gossypii (F= , df=1, MS=0.132, P<0.001), ενώ δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των 4 ξενιστών που αξιολογήθηκαν (F=2.485, df=1, MS=0.002, P=0.078). Η μετάδοση του MWMV από τα είδη M. persicae και A. gossypii από και προς 4 καλλιεργούμενους ξενιστές του ίδιου είδους, δίνονται στον Πίνακα 4.5. Το είδος M. persicae ήταν πιο αποτελεσματικό από το A. gossypii και παρουσίασε την υψηλότερη αποτελεσματικότητα ως φορέας του ιού όταν ως πηγή χρησιμοποιήθηκε η καρπουζιά (82±8.0%). Αντίθετα η ικανότητα μετάδοσης του A. gossypii δεν επηρεάστηκε από τον ξενιστή του ιού (Διάγραμμα 4.3). Πίνακας 4.5. Μετάδοση του MWMV από και προς καλλιεργούμενους ξενιστές του ίδιου είδους με τα είδη Aphis gossypii και Myzus persicae (ενήλικα άπτερα θηλυκά) Φυτικό είδος Ικανότητα μετάδοσης α Aphis gossypii Myzus persicae Αγγούρι 0,300±0,070 (0,110) a 0,680±0,080 (0,222) bc Καρπούζι 0,300±0,070 (0,110) a 0,820±0,080 (0,260) c Κολοκύθι 0,340±0,090 (0,130) a 0,760±0,110 (0,240) bc Πεπόνι 0,320±0,080 (0,120) a 0,600±0,070 (0,200) b α Η ικανότητα μετάδοσης του MWMV, υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μολυσμένων φυτών/συνολικό αριθμό των φυτών των δοκιμών. Δίνονται ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου, [log(x+1) μετασχηματισμένες τιμές]. Η σύγκριση των μέσων όρων διεξήχθη μέσω των log(x+1) μετασχηματισμένων τιμών. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ελέγχου Tukey s (HSD). Στην δεύτερη υποομάδα πειραμάτων (Γ2) αξιολογήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του MWMV με το είδος M. persicae από και προς διαφορετικά είδη καλλιεργούμενων κολοκυνθοειδών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα ανάλυσης παραλλακτικότητας, βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην ικανότητα μετάδοσης του MWMV από και προς διαφορετικούς καλλιεργούμενους ξενιστές (F=29.516, df=15, MS=0.016, P<0.001). Η υψηλότερη αποτελεσματικότητα μετάδοσης του είδους M. persicae παρουσιάστηκε όταν ως φυτό δότης/δέκτης χρησιμοποιήθηκε η καρπουζιά, με ποσοστό μετάδοσης 80±7.0%, ενώ όταν ως φυτό δότης/δέκτης χρησιμοποιήθηκαν τα φυτικά είδη αγγούρι, κολοκύθι και πεπόνι τα ποσοστά μετάδοσης ήταν 74±5.4%, 68±8.3% και 48±8.3%, αντίστοιχα. Η χαμηλότερη ικανότητα μετάδοσης του είδους M. persicae παρουσιάστηκε όταν ως φυτό δότης 79

104 χρησιμοποιήθηκε η πεπονιά και δέκτης η αγγουριά (38±8.3%) και η καρπουζιά (38±8.3%), ενώ τα ποσοστά μετάδοσης ήταν ελαφρώς μεγαλύτερα όταν ως φυτό δέκτης χρησιμοποιήθηκε η κολοκυθιά (46±11.4%) (Διάγραμμα 4.4). Πίνακας 4.6. Μετάδοση του MWMV με το είδος M. persicae (ενήλικα άπτερα θηλυκά) από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές Ικανότητα μετάδοσης α Φυτικό είδος Αγγούρι β Καρπούζι Κολοκύθι Πεπόνι Αγγούρι γ 0,740±0,054 (0,240) a 0,640±0,114 (0,214) abc 0,520±0,083 (0,181) bcd 0,540±0,089 (0,186) bcd Καρπούζι 0,680±0,083 (0,224) ab 0,800±0,070 (0,255) a 0,740±0,054 (0,240) a 0,600±0,070 (0,203) abc Κολοκύθι 0,620±0,083 (0,209) abc 0,640±0,089 (0,214) abc 0,680±0,083 (0,224) ab 0,480± 0,083 (0,169) cd Πεπόνι 0,380±0,083 (0,139) d 0,380±0,083 (0,139) d 0,460±0,114 (0,163) cd 0,480±0,083 (0,069) cd α Ικανότητα μετάδοσης του MWMV από και προς διαφορετικά φυτικά είδη, υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μολυσμένων φυτών/συνολικό αριθμό των φυτών των δοκιμών. Δίνονται ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου, [log(x+1) μετασχηματισμένες τιμές]. β Φυτά δέκτες (φυτά 8-10 ημερών, στάδιο κοτυληδόνων-1 ου πραγματικού φύλλου). γ Φυτά δότες (φυτά ημερών μολυσμένα με τον MWMV). Η σύγκριση των μέσων όρων διεξήχθη μέσω των log(x+1) μετασχηματισμένων τιμών. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ελέγχου Tukey s (HSD). 80

105 Διάγραμμα 4.3. Μετάδοση του MWMV, με τα είδη M. persicae και A. gossypii από και προς καλλιεργούμενους ξενιστές του ίδιου είδους. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Ποσοστά που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD). Διάγραμμα 4.4. Μετάδοση του MWMV, με το είδος M. persicae από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Ποσοστά που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD). 81

106 4.3.4 Δ. Μετάδοση του MWMV από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς με τα είδη M. persicae και A. gossypii Αξιολογήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του MWMV από μολυσμένους καρπούς και φύλλα κολοκυθιάς με τα είδη M. persicae και A. gossypii. Τα αποτελέσματα ανάλυσης παραλλακτικότητας καταδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην ικανότητα μετάδοσης του ιού μεταξύ των δύο ειδών αφίδων (F=38.565, df=1, MS=1.486, P<0.001) καθώς και μεταξύ του φυτικού ιστού που χρησιμοποιήθηκε ως πηγή μόλυνσής του (F=74.747, df=1, MS=0.160, P<0.001). Μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης σημειώθηκαν και από τα δύο είδη όταν οι αφίδες τράφηκαν σε μολυσμένο φύλλο σε σύγκριση με τον μολυσμένο καρπό. Όταν οι αφίδες τράφηκαν σε μολυσμένο καρπό κολοκυθιάς τα ποσοστά (%) μετάδοσης ήταν για τα είδη M. persicae και A. gossypii 20±8,1% και 7,5±9,5%, αντίστοιχα. Πίνακας 4.7. Μετάδοσης του MWMV με τα είδη M. persicae και A. gossypii (ενήλικα άπτερα θηλυκά) από μολυσμένους καρπούς και φύλλα κολοκυθιάς Είδος Αφίδας Δοκιμές μετάδοσης α Φύλλο β Καρπός β Myzus persicae 0,750±0,057 (0,242) a 0,200±0,081 (0,078) ab Aphis gossypii 0,300±0,081 (0,113) b 0,075±0,095 (0,030) c α Αφίδες του είδους M. persicae και A. gossypii αφήνονταν για διατροφή σε μολυσμένο με τον MWMV καρπό και φύλλο κολοκυθιάς για 3-5 λεπτά, έπειτα μεταφέρονταν ατομικά σε υγιή φυτά κολοκυθιάς. β Η ικανότητα μετάδοσης του MWMV από φύλλο και καρπό κολοκυθιάς, υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μολυσμένων φυτών/συνολικό αριθμό των φυτών των δοκιμών. Δίνονται ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου, [log(x+1) μετασχηματισμένες τιμές]. Η σύγκριση των μέσων όρων διεξήχθη μέσω των log(x+1) μετασχηματισμένων τιμών. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ελέγχου Tukey s (HSD). Διάγραμμα 4.5. Μετάδοση του MWMV, με το είδος M. persicae και A.gossypii από μολυσμένους καρπούς και φύλλα κολοκυθιάς. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου. Ποσοστά που συνοδεύονται από διαφορετικό γράμμα διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά σε επίπεδο σημαντικότητας (P<0,05) σύμφωνα με τον έλεγχο Tukey s (HSD). 82

107 4.4 Συζήτηση Πολλοί είναι οι παράγοντες που εμπλέκονται στη μετάδοση των ιών του γένους Potyvirus, καθώς στην αποτελεσματικότητα μετάδοσης ενός ιού σημαντικό ρόλο μπορεί να διαδραματίσει το φυτικό είδος και η προτίμηση του ξενιστή (host preference) (Symmes & Perring, 2007), το είδος/βιότυπος της αφίδας-φορέα (Garzo et al., 2004; Katis et al., 2006), καθώς επίσης και οι διαφορετικοί κλώνοι ενός είδους μιας αφίδας (Lucio-Zavaleta et al., 2001; Kanavaki et al., 2006).Η μετάδοση των ιών που ανήκουν στο γένος Potyvirus γίνεται με μη- έμμονο τρόπο, που χαρακτηρίζεται από μικρούς χρόνους (1-3 λεπτά) πρόσληψης και μετάδοσης του ιού (Ng & Falk, 2006, Katis et al., 2006). Οι ιοί που μεταδίδονται με μη-έμμονο τρόπο, οι οποίοι αποτελούν την πλειονότητα των αφιδομεταδιδόμενων ιών, μεταδίδονται κυρίως με μη-αποικίζοντα είδη αφίδων κατά τη διάρκεια δοκιμαστικών νυγμάτων στα επιδερμικά κύτταρα του φυτού, τα οποία γίνονται με σκοπό να εξεταστεί η καταλληλότητα του ξενιστή (Fereres & Moreno, 2009). Σκοπός της παρούσας εργασίας, ήταν η μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα μετάδοσης του MWMV. Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του ιού από 8 κλώνους του είδους M. persicae, η ικανότητα μετάδοσης του ιού από τα είδη A. gossypii και M. persicae από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές (κολοκύθι, καρπούζι, αγγούρι, πεπόνι) καθώς και από μολυσμένους με τον MWMV καρπούς κολοκυθιάς, ενώ τέλος αξιολογήθηκαν 19 είδη της ελληνικής αφιδοπανίδας (αποικίζοντα και μηαποικίζοντα τα κολοκυνθοειδή είδη) ως φορείς του ιού. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι το είδος M. persicae είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικός φορέας του MWMV. Όταν αξιολογήθηκαν 8 κλώνοι τους είδους M. persicae, με διαφορετικά επίπεδα ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των κλώνων, ενώ τα ποσοστά μετάδοσης του MWMV κυμάνθηκαν από 56% έως 74%. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι γεωγραφικά διαχωρισμένοι κλώνοι (Σκωτίας έναντι Ελλάδας) μετέδωσαν τον MWMV με παρόμοια αποτελεσματικότητα, με το κλώνο 4106Α (Σκωτίας) να καταγράφει το μεγαλύτερο ποσοστό μετάδοσης (74%). Η ικανότητα μετάδοσης μη-έμμονων ιών με διαφορετικούς κλώνους αφίδων έχει αποτελέσει αντικείμενο έρευνας πολλών ερευνητικών εργασιών. Κλώνοι των ειδών M. persicae και M. persicae nicotianae που διέφεραν ως προς τα επίπεδα ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα, δεν εμφάνισαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη μετάδοση του PVY N (Potyvirus), ενώ το είδος M. persicae nicotianae φάνηκε να είναι αποτελεσματικότερος φορέας (Kanavaki et al. 2006). Σε αντίθετη περίπτωση, έχει αναφερθεί μεγάλη ενδοειδική παραλλακτικότητα του είδους M. persicae στην ικανότητα μετάδοσης δύο ιών της οικογένειας Luteoviridae, του ιού του κίτρινου νανισμού του κριθαριού (Barley yellow dwarf virus, BYDV) και του ιού του καρουλιάσματος των φύλλων της πατάτας (Potato leafroll virus, PLRV), 83

108 καθώς αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών της αφίδας και του ιού κατά την κυκλοφορία του στο σώμα της αφίδας, μπορεί να επηρεάσουν την ικανότητα μετάδοσης (Terradot et al., 2007; Yu et al., 2013). Στόχος της εργασίας αυτής ήταν επίσης η καταγραφή της ικανότητας 19 ειδών της ελληνικής αφιδοπανίδας (Hemiptera: Aphididae), να προσλαμβάνουν/μεταδίδουν τον MWMV από μολυσμένα σε υγιή φυτά κολοκυθιάς. Δεκατέσσερα από τα 19 είδη που ελέγχθηκαν μετέδωσαν επιτυχώς τον MWMV, ενώ τα ποσοστά (%) μετάδοσης κυμάνθηκαν από 4 έως 72%. Με βάση την πιθανότητα μετάδοσης (P*) από ένα μεμονωμένο άτομο, το είδος M. persicae αποτέλεσε τον πιο αποτελεσματικό φορέα, ακολουθούμενο από τα είδη A. gossypii, A. hederae, A. cytisorum, Α. fabae, A. nerii, P. humuli, A. pomi, M. rosae, H. pruni, A. sedi (πρώτη καταγραφή της παρουσίας του στην Ελλάδα), A. umbrella, M. cerasi και U. sonchi. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι είδη αφίδων που δεν αποικίζουν τα κολοκυνθοειδή είναι ικανά να μεταδώσουν τον MWMV, όπως συνήθως συμβαίνει σε ιούς του γένους Potyvirus, που μεταδίδονται με μη-έμμονο τρόπο, καθώς οι αφίδες τους προσλαμβάνουν και τους μεταδίδουν μετά από δοκιμαστικά νύγματα διάρκειας λίγων λεπτών (Fereres & Moreno, 2009). Τα μη-αποικίζοντα είδη αφίδων διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία των ιών που μεταδίδονται με μη-έμμονο τρόπο. Το είδος Uroleucon pseudambrosiae, ένα είδος που δεν αποικίζει τα κολοκυνθοειδή, παρότι δεν είναι αποτελεσματικός φορέας του WMV, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξάπλωση του ιού στη Φλόριδα των ΗΠΑ εξαιτίας της μεγάλης πληθυσμιακής πυκνότητας που εμφανίζει (Webb & Leng Kok-Yokomi, 1993). Η ικανότητα μετάδοσης μη-έμμονων ιών, με μη αποικίζοντα είδη αφίδων, έχει μελετηθεί και για άλλους ιούς του γένους, όπως είναι ο ZYMV που προσβάλει τα κολοκυνθοειδή (Castle et al., 1992; Katis et al., 2006), ο PVY (Katis & Gibson, 1985) που προσβάλλει κυρίως σολανώδη, καθώς και για ιούς εκτός του γένους Potyvirus, όπως είναι ο Broαd bean wilt virus 1, BBWV-1 (γένος Fabavirus) (Ferriol et al., 2013). Στις μελέτες αυτές φάνηκε ότι, μεταξύ των ειδών αφίδων υπήρχε μεγάλη παραλλακτικότητα στην ικανότητα μετάδοσης των ιών αυτών, παραλλακτικότητα που παρατηρήθηκε και στην παρούσα μελέτη. Η διαφορετική ικανότητα μετάδοσης ιών που μεταδίδονται με μη-έμμονο τρόπο πιστεύεται ότι οφείλεται κυρίως στην τροφική συμπεριφορά (probing behavior) των ειδών αφίδων. Με τη βοήθεια της τεχνικής EPG (Electrical Penetration Graph), μια τεχνική που καταγράφει τις κυματομορφές σήματος (signal waveforms) κατά τη διάρκεια της εισαγωγής των στιλέτων της αφίδας στα φυτικά κύτταρα, μπορεί να μελετηθεί η ικανότητα μετάδοσης ενός ιού από ένα είδος καθώς αντικατοπτρίζεται η τροφική δραστηριότητα των αφίδων (Martín et al., 1997). Στην εργασία των Collar & Fereres, (1998) φάνηκε ότι, διαφορετικά είδη αφίδων διέφεραν ως προς την ικανότητα 84

109 μετάδοσης του PVY σε φυτά πιπεριάς, και οι αποτελεσματικοί φορείς του ιού (A. gossypii και M. persicae) πραγματοποίησαν πιο πολλά δοκιμαστικά νύγματα σε αντίθεση με τα είδη Sitobion avenae και Rhopalosiphum padi, τα οποία δεν πραγματοποιήσαν δοκιμαστικά νύγματα, αλλά και όταν αυτά καταγράφηκαν οι αφίδες δεν μετέδωσαν τον ιό. Επίσης, πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν ότι εκτός από την τροφική δραστηριότητα των αφίδων, η βοηθητική πρωτεΐνη (HC-Pro) των poty-ιών διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάδοση με τις αφίδες. Στα διαφορετικά είδη αφίδων μπορεί να υπάρχει διαφορετική αλληλεπίδραση μεταξύ της βοηθητικής πρωτεΐνης και των υποδοχέων στα στιλέτα των αφίδων-φορέων, καθώς ανατομικές διαφορές των στιλέτων μεταξύ των αφίδων μπορεί να εμπλέκονται στην πρόσληψη και την μετάδοση των μη-έμμονών ιών (Wang et al., 1998; Uzest et al., 2007). Το γεγονός ότι η πλειονότητα των ειδών αφίδων (14 από τα 19) που εξετάστηκαν μετέδωσαν επιτυχώς τον MWMV, υποδηλώνει ότι πολλά είδη αφίδων μπορεί να αποτελέσουν δυνητικούς φορείς του ιού. Επιπλέον, παρακολούθηση των αφίδων που απαντώνται στις καλλιέργειες κολοκυνθοειδών, με τη χρήση κολλητικών παγίδων αλλά και άλλων μέσων, καθ όλη την καλλιεργητική περίοδο κρίνεται αναγκαία για τον προσδιορισμό τους, την πληθυσμιακή τους διακύμανση, αλλά και τη σημασία τους ως φορέων του ιού, ώστε να μελετηθεί λεπτομερέστερα η επιδημιολογία του ιού. Επίσης μελετήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του ιού από τα είδη A. gossypii και M. persicae από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές. Το είδος M. persicae ήταν πιο αποτελεσματικός ως φορέας του ιού από το είδος A. gossypii και παρουσίασε την υψηλότερη αποτελεσματικότητα όταν ως πηγή χρησιμοποιήθηκε η καρπουζιά (82%). Παρά το γεγονός ότι στο είδος A. gossypii δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών καλλιεργούμενων ξενιστών, στο είδος M. persicae φάνηκε να υπάρχει μια παραλλακτικότητα μεταξύ των διαφορετικών ξενιστών που εξετάστηκαν. Όταν αξιολογήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του ιού από το είδος M. persicae από και προς διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές, παρατηρήθηκε ότι τα υψηλότερα ποσοστά μετάδοσης σημειώθηκαν όταν ως φυτά δότες/δέκτες χρησιμοποιήθηκαν φυτά του ίδιου είδους. Τα υψηλότερα ποσοστά μετάδοσης παρατηρήθηκαν όταν χρησιμοποιήθηκε ως πηγή μόλυνσης το φυτό καρπουζιά (60-80%), ενώ τα χαμηλότερα ποσοστά μετάδοσης όταν χρησιμοποιήθηκε ως πηγή μόλυνσης η πεπονιά (38-48%). Η συγκέντρωση του MWMV στους διαφορετικούς καλλιεργούμενους ξενιστές δεν μελετήθηκε στην συγκεκριμένη εργασία. Απαιτείται όμως περαιτέρω διερεύνηση, καθώς αποτελεί έναν ιδιαίτερα σημαντικό επιδημιολογικό παράγοντα, άμεσα συνυφασμένο με την αποτελεσματικότητα μετάδοσης από τους φορείς (Escriu et al., 2000; Ferriol et al., 2013). Επίσης, το είδος του φυτού ξενιστή έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει την πρόσληψη 85

110 και μετάδοση φυτικών ιών από τους φορείς, συνεπώς και την αποτελεσματικότητα μετάδοσής τους (Gray et al., 2002; Symmes & Perring, 2007). Η εισαγωγή ενός ιού σε μια περιοχή όπου δεν ενδημεί μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους. Η ικανότητα των πτερωτών μορφών αφίδων να μεταδίδουν ιούς του γένους Potyvirus σε μεγάλες αποστάσεις έχει αναφερθεί ως ένα πιθανό σενάριο (Irwin et al., 1988; Loxdale et al., 1993). Για παράδειγμα έχει καταγραφεί ότι αφίδες είναι ικανές να μεταδώσουν τον ιό του μωσαϊκού με νανισμό του αραβοσίτου (Maize dwarf mosaic virus, MDMV) από τις Νότιες Πολιτείες της Αμερικής στις Βόρειες (Zeyen et al., 1987). Η ικανότητα των πτερωτών μορφών αφίδων να διατηρούν στα στοματικά μόριά τους τα ιοσωμάτια ενός μη-έμμονου ιού περιορίζεται σε μικρό χρονικό διάστημα (λίγων ωρών) (Ng & Falk, 2006). Παρόλα αυτά, έχει καταγραφεί ότι τα είδη A. gossypii και M. persicae ήταν ικανά να μεταδώσουν τον ZYMV σε ποσοστό 1 και 2% 20 ώρες, αντίστοιχα μετά την πρόσληψη από τις αφίδες-φορείς. Δεν έχει αναφερθεί αλλά ούτε έχει μελετηθεί μετάδοση του MWMV με το σπόρο, όπως έχει αναφερθεί για άλλους ιούς του γένους που προσβάλουν τα κολοκυνθοειδή όπως είναι οι ZYMV και PRSV-W (Bayot et al., 1990; Riedle-Bauer et al., 2002). Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε επίσης η πρόσληψη του MWMV από μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς με τα είδη A. gossypii και M. persicae. Τα είδη M. persicae και A. gossypii, σε συνθήκες υποχρεωτικής μετάδοσης, μετέδωσαν τον ιό από τους μολυσμένους καρπούς κολοκυθιάς σε ποσοστό 20 και 7,5%, αντίστοιχα. Παρομοίως σε αντίστοιχες μελέτες, το είδος M. persicae ήταν ικανό να προσλάβει και να μεταδώσει τον PPV (γένος Potyvirus) από μολυσμένους καρπούς βερικοκιάς και ροδακινιάς (Labonne et al., 2001), καθώς και τους ιούς ZYMV και PRSV-W από μολυσμένους καρπούς πεπονιάς (Lecoq et al., 2003). Στην εργασία των Delatte et al., (2007), άτομα του είδους Bemisia tabaci, ήταν ικανά να προσλάβουν και να μεταδώσουν τον TYLCV από μολυσμένους καρπούς τομάτας. Το διεθνές εμπόριο και η διακίνηση καρπών από χώρα σε χώρα μπορεί να συντελέσει στη διάδοση των ιών σε μεγάλες αποστάσεις. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η περίπτωση του Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV, ο οποίος ανιχνεύθηκε σε καρπούς τομάτας στη Βόρεια Ευρώπη (Σουηδία και Εσθονία) από καρπούς που είχαν εισαχθεί από τον Νότια Ευρώπη, την Αφρική και την Μέση Ανατολή (Just et al., 2014). Τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν ότι μολυσμένοι καρποί κολοκυθιάς μπορεί να αποτελέσουν πηγή του MWMV, γεγονός που μπορεί να συμβάλλει στην εισαγωγή του ιού σε χώρες όπου δεν ενδημεί, μέσω της διακίνησης προσβεβλημένων καρπών. 86

111 5 Κεφάλαιο 5 ο Κεφάλαιο 5 ο Μελέτη της αλληλεπίδρασης στα στιλέτα και της μικτής μόλυνσης των, MWMV, WMV και CMV στην πρόσληψη/μετάδοση κάθε ιού από τα είδη A.gossypii και Μ. persicae 87

112 Περίληψη Στα κολοκυνθοειδή είναι πολύ συνηθισμένο φαινόμενο η ύπαρξη μικτών μολύνσεων. Η ύπαρξη αυτών οδηγεί σε ποικίλες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ιών στον ξενιστή και στον φορέα, αλληλεπιδράσεις που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία του(ων) ιού(ών). Στα πλαίσια της διαλεύκανσης της επιδημιολογίας του MWMV μελετήθηκε η ικανότητα μετάδοσης του ιού από τα είδη M. persicae και A. gossypii όταν τράφηκαν σε μολυσμένα φυτά κολοκυθιάς σε απλές/μικτές μολύνσεις με τους ιούς WMV και CMV. Επιπλέον, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση στα στιλέτα στην πρόσληψη/μετάδοση των ιών MWMV, WMV και CMV από το είδος Μ. persicae όταν προηγούνταν και έπονταν δοκιμαστικά νύγματα των αφίδων σε φυτά κολοκυθιάς μολυσμένα με τους ιούς MWMV, WMV και CMV ή σε υγιές φυτικό ιστό. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, έδειξαν ότι το είδος Μ. persicae αποτέλεσε αποτελεσματικότερο φορέα από το είδος A. gossypii, όταν αφίδες των δύο ειδών τράφηκαν σε μολυσμένο μόνο με τον MWMV ή WMV φυτό κολοκυθιάς, ενώ από μονή μόλυνση με CMV το είδος A. gossypii παρουσίασε μεγαλύτερη ικανότητα μετάδοσης (50,0%) σε σχέση με το είδος Μ. persicae (14,0%). Αντίστοιχα, όταν αφίδες και των δύο ειδών τράφηκαν σε μολυσμένα φυτά κολοκυθιάς με μικτή μόλυνση (MWMV+WMV και MWMV+CMV) η ικανότητα μετάδοσης των ιών MWMV, WMV και CMV μειώθηκε στατιστικώς σημαντικά σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μονές μολύνσεις. Για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης στα στιλέτα, σε άπτερα ενήλικα θηλυκά άτομα του είδους Μ. persicae, δόθηκε διαδοχική διατροφή σε υγιές φυτό κολοκυθιάς ή σε μολυσμένο με τους ιούς ΜWMV, WMV και CMV φυτό κολοκυθιάς. Όταν οι αφίδες τράφηκαν αρχικά ή μετέπειτα σε μολυσμένο με τον WMV ή CMV φυτό κολοκυθιάς δεν παρατηρήθηκε μείωση της ικανότητας μετάδοσης του MWMV. Σε όλες τις πιθανές μετακινήσεις που αξιολογήθηκαν φάνηκε ότι, ο MWMV επικράτησε έναντι των υπολοίπων ιών. 88

113 5.1 Εισαγωγή Τα κολοκυνθοειδή προσβάλλονται από τουλάχιστον 59 ιούς (Lecoq & Desbiez, 2012), και πολύ συχνά είναι μολυσμένα ταυτόχρονα από δύο ή περισσότερους ιούς. Στις μικτές μολύνσεις οι ιοί αλληλεπιδρούν στον ξενιστή είτε συνεργιστικά είτε ανταγωνιστικά (Syller, 2012). Μια συνεργιστική αλληλεπίδραση, έχει επίδραση είτε στον έναν είτε και στους δύο ιούς, αυξάνοντας την αναπαραγωγή του(ους) στο φυτό-ξενιστή. Επίσης, συνεργιστική αλληλεπίδραση υπάρχει όταν ο ένας ιός διευκολύνει την μετάδοση του άλλου με τις αφίδες-φορείς. Το φαινόμενο αυτό, γνωστό ως εξάρτηση από τον βοηθό ιό (helper dependence) απαντάται συχνά σε ορισμένα σύμπλοκα ιών (Syller, 2000, 2005; Zhang et al., 2000). Αντίθετα στην ανταγωνιστική αλληλεπίδραση, μόνο ένας από του δύο ιούς πιθανώς ωφελείται, και η παρουσία του ενός περιορίζει την αναπαραγωγή του άλλου (Syller, 2012). Συνεργιστικές και ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις έχουν αναφερθεί σε κολοκυνθοειδή μεταξύ ιών που ανήκουν στο στα γένη Potyvirus, Cucumovirus, Polerovirus και Crinivirus. Η συνύπαρξη των ιών αυτών επιδρά στην έκφραση των συμπτωμάτων, στον ιικό τίτλο, στη μολυσματικότητα αλλά και στη μετάδοση με τους φορείς (Bourdin & Lecoq, 1994; Zeng et al., 2007; Gil-Salas et al., 2012; Salvaudon et al., 2013). Παρόμοιες αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφόρων ιών έχουν αναφερθεί και σε άλλους ξενιστές (Murphy & Bowen, 2006; Untiveros et al., 2007; Wintermantel et al., 2008). Αλληλεπιδράσεις λαμβάνουν επίσης χώρα και στα στοματικά μόρια (στιλέτα) των αφίδωνφορέων, όταν εκτελούν διαδοχικά δοκιμαστικά νύγματα ή τρέφόνται σε μολυσμένα με μονή ή μικτή μόλυνση. Για την μετάδοση των ιών του γένους Potyvirus, είναι απαραίτητη η ύπαρξη μιας βοηθητικής πρωτεΐνης (HC-Pro) η οποία δρα ως γέφυρα μεταξύ των υποδοχέων στα στιλέτα της αφίδας και της CP του ιού (Dombrovsky et al., 2007). Αντίθετα, οι ιοί του γένους Cucumovirus όπως είναι ο CMV, δεν απαιτούν κάποια βοηθητική πρωτεΐνη για την μετάδοση τους με αφίδες, και η CP είναι η μοναδική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην μετάδοση όπου και προσκολλάται στους υποδοχείς της αφίδας-φορέα (Pirone & Blanc, 1996). Σκοπός της παρούσας ενότητας είναι η μελέτης της αποτελεσματικότητας μετάδοσης των ιών MWMV, WMV και CMV από τα είδη A.gossypii και Μ. persicae σε απλές/μικτές μολύνσεις και της αλληλεπίδρασης των ιών στα στιλέτα στην πρόσληψη/μετάδοση κάθε ιού από το είδος Μ. persicae. 89

114 5.2 Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό και αφίδες Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν φυτά κολοκυθιάς (υβρίδιο Borelina F1), τα οποία αναπτύσσονταν σε πλαστικά δοχεία (7x7x6 εκ.) σε τύρφη Terraplant (Compo) σε θάλαμο ελεγχόμενης θερμοκρασίας (22-25 C) και φωτοπεριόδου (16:8h). Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν άπτερα ενήλικα θυληκά των κλώνων A.gossypii και Μ. persicae (1 αφίδα/φυτό) τα οποία διατηρούνταν σε φυτά κολοκυθιάς και κινέζικου λάχανου, αντίστοιχα, όπως περιγράφτηκε στο υποκεφάλαιο Απομονώσεις ιών Χρησιμοποιήθηκαν οι απομονώσεις GR12AA1 του MWMV, GR14AG3 του WMV και GR14AB1 του CMV που προέρχονταν αππό φυτά κολοκυθιάς από τα Λεχαινά του νομού Ηλείας (MWMV) και από τον νομό Αργολίδος (WMV, CMV). Οι απομονώσεις διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μέσω μηχανικών μολύνσεων στο στάδιο των κοτυληδόνων-1 ου πραγματικού φύλλου (7-9 ημερών) σε εντομοστεγές αυτοσχέδιο ξύλινο κλωβό σε θάλαμο με θερμοκρασία 24±2 C και σταθερή φωτοπερίοδο (16:8h), για να αποφευχθούν οι επιμολύνσεις Φυτά κολοκυθιάς εστίες των MWMV, WMV και CMV Για τις μικτές μολύνσεις των MWMV+WMV και MWMV+CMV 2 gr από τον κάθε μολυσμένο φυτικό ιστό αναμειγνύονταν με το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα σε πλαστικό σακουλάκι, ακολουθούσε ομογενοποίηση και μηχανική μόλυνση των φυτών. Η τεχνική αυτή έχει χρησιμοποιηθεί και σε άλλα πειράματα μικτών μολύνσεων που συμπεριλαμβάνουν ιούς του γένους Potyvirus (Wang et al., 2002; Salvaudon et al., 2013). Παρόλα αυτά η μέθοδος αυτή δεν μας επιτρέπει τον ακριβή προσδιορισμό των ιοσωματίων στα οποία εκτέθηκαν τα πειραματικά φυτά. Συνολικά, σε κάθε μηχανική μετάδοση των ιών (σε μονές και μικτές μολύνσεις), μολύνονταν 3 φυτά κολοκυθιάς ενώ 3 ακόμα φυτά μολύνονταν με το ρυθμιστικό διάλυμα μόνο, ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα φυτά μεταφέρονταν σε θάλαμο με θερμοκρασία 24±2 C και σταθερή φωτοπερίοδο (16:8h) και ελέγχονταν καθημερινά για την παρουσία συμπτωμάτων, ενώ μετά από ημέρες ελέγχονταν για την παρουσία του(ων) ιού(ών) με την μέθοδο DAS-ELISA (βλέπε Παράρτημα Ι.1). 90

115 5.2.4 Δοκιμές αφιδομεταδόσεων Α. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από μονές/μικτές μολύνσεις με τα είδη M. persicae και A.s gossypii Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μετάδοσης με τα είδη M. persicae και A. gossypii από φυτά κολοκυθιάς μολυσμένα με τους ιούς MWMV, WMV και CMV σε μονές ή μικτές (MWMV+WMV, MWMV+CMV) μολύνσεις. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφηκε στο υποκεφάλαιο Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις των 10 φυτών/επανάληψη (Πείραμα Α). Εικόνα 5.1. Συμπτώματα σε φύλλα κολοκυθιάς (Borelina F1) 21 ημέρες μετά την μόλυνση από τους: Μονή μόλυνση των MWMV (Β), WMV (Γ) και CMV (Ε). Μικτή μόλυνση των MWMV+WMV (Δ) και MWMV+CMV (Ζ). Υγιές φυτό (Α). (Από προσωπικό αρχείο Χ.Κ. Ξάνθη). 91

116 Β. Αλληλεπίδραση των ιών MWMV, WMV και CMV στα στοματικά μόρια του είδους Myzus persicae Μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των MWMV, WMV και CMV στα στοματικά μόρια του είδους M. persicae και η επίδραση της στην μετάδοση των ιών αυτών. Στις δοκιμές μετάδοσης αξιολογήθηκαν οι πιθανές μετακινήσεις των αφίδων: MWMV(M) Υγιές(Υ) Υ, WMV(W) Υ Υ, CMV(C) Υ Υ, Y M Y, Y W Y, Y C Y, M W Y, W M Y, M C Y, C M Y (Εικόνα 5.1). Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις των 10 φυτών/επανάληψη (Πείραμα Β). Εικόνα 5.2. Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε στην αλληλεπίδραση των ιών MWMV, WMV και CMV στα στοματικά μόρια του είδους M. persicae (Πείραμα Β) Ιολογικός έλεγχος Τα φυτά ελέγχονταν καθημερινά για την παρουσία συμπτωμάτων ημέρες μετά το πέρας του πειράματος ελέγχονταν για την παρουσία του ιού με την μέθοδο DAS-ELISA (βλέπε Παράρτημα Ι.1). 92

117 5.2.6 Στατιστική ανάλυση Για τις συγκρίσεις των μέσων όρων χρησιμοποιήθηκε ο U-έλεγχος Mann-Whitney. Η παρατηρούμενη στάθμη σημαντικότητας (p value) υπολογίστηκε με τη μέθοδο προσομοίωσης Monte Carlo βασισμένη σε κύκλους επαναδειγματοληψίας (Mehta & Patel, 1996). Με την μέθοδο αυτή τα επαγωγικά συμπεράσματα είναι ακριβή ακόμα και όταν δεν ικανοποιούνται οι μεθοδολογικές και στατιστικές προϋποθέσεις εφαρμογής των ελέγχων. Το επίπεδο σημαντικότητας σε όλους τους ελέγχους προκαθορίστηκε σε a=0.05 και οι στατιστικές αναλύσεις όλων των δεδομένων υποστηρίχθηκε από το στατιστικό πακέτο IBM SPSS v.21 (SPSS 2012) με εγκατεστημένη τη λειτουργική μονάδα Exact tests (Monte Carlo προσομοίωση). 93

118 5.3 Αποτελέσματα Α. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από μονές/μικτές μολύνσεις με τα είδη M. persicae και A. gossypii Τα αποτελέσματα της ικανότητας μετάδοσης των MWMV, WMV και CMV από μονές/μικτές μολύνσεις από τα είδη M. persicae και A. gossypii παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.1. Παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ειδών αφίδων ως φορέων των MWMV, WMV και CMV, όταν η πρόσληψη τους πραγματοποιήθηκε από μονές μολύνσεις (Πίνακας 5.1). Πιο συγκεκριμένα, όταν οι αφίδες τράφηκαν σε μολυσμένα με έναν ιό μόλυνση φυτά τα ποσοστά μετάδοσης των MWMV και WMV με το είδος M. persicae, ήταν 74,0±4,0% και 60,0±4,5%, αντίστοιχα., ενώ για το είδος A. gossypii ήταν 32,0±5,8% και 42,0±3,7%, αντίστοιχα. Αντίθετα με τους MWMV και WMV, η ικανότητα μετάδοσης του CMV με το είδος A. gossypii ήταν υψηλότερη (50,0±4,0%) σε σύγκριση με το είδος M. persicae (14,0±3,2%) (Διάγραμμα 5.1). Η ικανότητα μετάδοσης των MWMV, WMV και CMV από μικτές μολύνσεις (MWMV+WMV, MWMV+CMV), και από τα δύο είδη αφίδων, μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την πρόσληψη των ιών από μονές μολύνσεις, καθώς παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές. Πίνακας 5.1. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από τα είδη A. gossypii και M. persicae από μονές και μικτές μολύνσεις, από και προς φυτά κολοκυθιάς Πηγή α Είδος Αφίδας Ικανότητα μετάδοσης και αριθμός μολυσμένων φυτών β P* MWMV WMV CMV MWMV+WMV MWMV+CMV MWMV Aphis gossypii 16/50 γ (32) δ a Myzus persicae 37/50 (74) b WMV Aphis gossypii - 21/50 (42) a Myzus persicae - 30/50 (60) b CMV Aphis gossypii /50 (50) a Myzus persicae /50 (14) b - - MWMV+WMV Aphis gossypii 06/50 (12) a 05/50 (10) a - 00/50 (0) a Myzus persicae 22/50 (44) b 00/50 (0) a - 04/50 (8) a MWMV+CMV Aphis gossypii 02/50 (4) a - 13/50 (26) a - 00/50 (0) a Myzus persicae 08/50 (16) b - 01/50 (2) b - 02/50 (4) a α Φυτά δότες [φυτά ημερών μολυσμένα με τον(ους) ιό(ούς)] που χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμές μετάδοσης. β Φυτά με συμπτώματα και θετικά με την μέθοδο DAS-ELISA. γ Αριθμός μολυσμένων φυτών/συνολικός αριθμός φυτών που χρησιμοποιήθηκαν. δ Ποσοστό (%) μετάδοσης. *Η στατιστική σύγκριση των μέσω όρων των δύο μεταχειρίσεων (είδος αφίδας) για την κάθε παράμετρο (ιική απομόνωση) έγινε με το έλεγχο Mann-Whitney U. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μιας σειράς ελέγχων Mann-Whitney. 94

119 Όταν αφίδες του είδους A. gossypii τράφηκαν σε φυτό μολυσμένο με τους MWMV+WMV, η ικανότητα μετάδοσης του MWMV μειώθηκε στατιστικώς σημαντικά (12,0±3,7%) σε σύγκριση με την αντίστοιχη μονή μόλυνση (32,0±5,8%) (P=0.049), ενώ για το είδος M. persicae τα ποσοστά μετάδοσης ήταν 44,0±4,0% και 74,0±4,0%, αντίστοιχα (P=0.006). Στατιστικώς σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν και στην ικανότητα μετάδοσης του WMV όταν οι αφίδες τράφηκαν σε φυτό κολοκυθιάς μολυσμένο με τους MWMV+WMV. Το ποσοστό μετάδοσης του WMV με το είδος A. gossypii ήταν 42,0±3,7% και 10,0±4,5 από την μονή και μικτή μόλυνση, αντίστοιχα (P=0.009), ενώ το είδος M. persicae δεν μετέδωσε τον WMV από την μικτή μόλυνση και στην περίπτωση της μονής μόλυνσης το ποσοστό μετάδοσης ήταν 60,0±4,5% (P=0.008). Συγκριτικά, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ειδών αφίδων στην μετάδοση του WMV από φυτά μολυσμένα με τους MWMV+WMV (P=0.166). Αντίθετα, παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη μετάδοση του MWMV από τα ίδια φυτά (P=0.050) (Πίνακας 5.1). Διάγραμμα 5.1. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από τα είδη M. persicae και A. gossypii, όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε από φυτά κολοκυθιάς με μονές μολύνσεις. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπικό σφάλμα (SE) του μέσου όρου. *Στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P<0.05) σύμφωνα με τον U-έλεγχο των Mann-Whitney. Η ικανότητα μετάδοσης των MWMV και CMV μειώθηκε σημαντικά και για τα δύο είδη αφίδων όταν τράφηκαν σε φυτά μολυσμένα με τους MWMV+CMV, συγκριτικά με τα ποσοστά μετάδοσης που σημειώθηκαν, όταν οι αφίδες τράφηκαν σε φυτό με μονή μόλυνση. Το είδος A. gossypii είναι ικανότερος φορέας του CMV από το είδος M. persicae, τόσο από μονή ή μικτή μόλυνση (MWMV+CMV) (Πίνακας 5.1). Η μετάδοση του CMV από το είδος A. gossypii, ήταν μεγαλύτερη από μονή μόλυνση (50,0±3,2%), ενώ από μικτή μόλυνση ήταν 26,0±2,0% (P=0.014). Το είδος M. persicae εμφάνισε μικρότερα ποσοστά μετάδοσης του CMV που ήταν 14,0±4,0% και 2,0±2,0% από μονή και μικτή μόλυνση, αντίστοιχα (P=0.038). 95

120 Ταυτόχρονη μετάδοση των MWMV+WMV και MWMV+CMV σημειώθηκε μόνο με το είδος M. persicae, με ποσοστά μετάδοσης 8,0±3,7% και 4,0±2,4%, αντίστοιχα ενώ για το είδος A. gossypii ουδέποτε μετέδωσε τους δύο ιούς ταυτόχρονα (Διάγραμμα 5.2). Και στις δύο περιπτώσεις όμως δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές για τα δύο είδη αφίδων (P=0.168 και P=0.449) (Πίνακας 5.1). Διάγραμμα 5.2. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από τα είδη M. persicae και A. gossypii, όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε από μολυσμένα φυτά κολοκυθιάς σε μικτές μολύνσεις. Δίνονται το ποσοστό (%) μετάδοσης (των μέσων όρων), ± τυπικό σφάλμα (SE) του μέσου όρου. *Στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P<0.05) σύμφωνα με τον U-έλεγχο των Mann-Whitney. 96

121 5.3.2 Β. Αλληλεπίδραση των ιών MWMV, WMV και CMV στα στοματικά μόρια του είδους M. persicae Συνολικά αξιολογήθηκαν 10 πιθανές μετακινήσεις αφίδων όταν προηγούνταν και έπονταν δοκιμαστικά νύγματα σε φυτά κολοκυθιάς μολυσμένα με του ιούς MWMV, WMV και CMV ή σε υγιή φυτικό ιστό. Το ποσοστό μετάδοσης του MWMV ήταν 42±6,6% όταν οι αφίδες τράφηκαν πρώτα σε φυτό κολοκυθιάς μολυσμένο με τον WMV, ενώ τα ποσοστά μετάδοσης ήταν μικρότερα (28±2,0%), όταν οι αφίδες τράφηκαν πρώτα σε μολυσμένο με τον MWMV φυτό κολοκυθιάς και ύστερα σε φυτό μολυσμένο με τον WMV, χωρίς όμως οι διαφορές να είναι στατιστικώς σημαντικές (P=0.138) (Πίνακας 5.2). Όταν οι αφίδες αρχικά τράφηκαν σε φυτό κολοκυθιάς μολυσμένο με τον MWMV και έπειτα σε υγιές τα ποσοστά μετάδοσης του MWMV ήταν 28±5,8%, ενώ στην αντίθετη περίπτωση (Υγιές MWMV) το ποσοστό μετάδοσης ήταν 50±3,2%, και οι διαφορές μεταξύ των δύο αυτών μεταχειρίσεων ήταν στατιστικώς σημαντικές (P=0.039). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην μετάδοση του MWMV όταν οι αφίδες τράφηκαν σε φυτό κολοκυθιάς μολυσμένο ή μη με τον WMV αρχικά (P=0.425) καθώς επίσης και δευτερευόντως (P=0.531). Η μετάδοση του WMV επηρεάστηκε στατιστικώς σημαντικά όταν προηγούνταν και έπονταν δοκιμαστικά νύγματα της αφίδας σε υγιές ή μολυσμένο φυτό κολοκυθιάς. Όταν οι αφίδες τράφηκαν αρχικά σε υγιές ή σε μολυσμένο φυτό κολοκυθιάς με τον MWMV και στη συνέχεια σε φυτό μολυσμένο με τον WMV, τα ποσοστά μετάδοσης του WMV ήταν 48±3,7% και 0%, αντίστοιχα (P=0.009). Δεν παρατηρήθηκε μετάδοση του WMV μετά από διαδοχική διατροφή των αφίδων σε φυτό κολοκυθιάς μολυσμένο με τον MWMV (Πίνακας 5.2), ενώ παρατηρήθηκε ταυτόχρονη μετάδοση των MWMV+WMV σε ποσοστό 12% (Πίνακας 5.2) (Διάγραμμα 5.3). Πίνακας 5.2. Μετάδοση του MWMV και WMV από το είδος M.persicae μετά από διαδοχική διατροφή σε υγιή ή μολυσμένα με μονή μόλυνση από τον MWMV ή WMV φυτά κολοκυθιάς Ιικές απομονώσεις α Ικανότητα μετάδοσης και αριθμός μολυσμένων φυτών β MWMV P* WMV P MWMV+WMV P WMV MWMV 42,0±6,60 γ (21/50) δ a (00/50) a ,0±5,80 (06/50) a MWMV WMV 28,0±2,00 (14/50) a 0 (00/50) a 12,0±7,30 (06/50) a Υγιές MWMV 50,0±3,20 (25/50) a MWMV Υγιές 28,0±5,80 (14/50) b - - Υγιές WMV ,0±3,70 (24/50) a WMV Υγιές - 26,0±4,00 (13/50) b - α Φυτά δότες (φυτά ημερών μολυσμένα με τον ιό) που χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμές μετάδοσης. Το σύμβολο υποδεικνύει τις μετακινήσεις των αφίδων από το ένα φυτό στο άλλο. β Φυτά με συμπτώματα και θετικά με την μέθοδο DAS-ELISA. γ Ποσοστό (%) μετάδοσης, ± τυπικό σφάλμα (SE) του μέσου όρου. δ Αριθμός μολυσμένων φυτών/συνολικός αριθμός φυτών που χρησιμοποιήθηκαν. *Η στατιστική σύγκριση των μέσω όρων των δύο μεταχειρίσεων για την κάθε παράμετρο έγινε με το έλεγχο Mann-Whitney U. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μιας σειράς ελέγχων Mann-Whitney. 97

122 Πίνακας 5.3. Μετάδοση του MWMV και CMV από το είδος M.persicae μετά από διαδοχική διατροφή σε υγιή ή μολυσμένα με μονή μόλυνση από τον MWMV ή CMV φυτά κολοκυθιάς Ιικές απομονώσεις α Ικανότητα μετάδοσης και αριθμός μολυσμένων φυτών β MWMV P* CMV P MWMV+CMV P CMV MWMV 40,0±4,50 γ (20/50) δ a (00/50) a (00/50) MWMV CMV 34,0±5,10 (17/50) a 0 (00/50) a 0 (00/50) Υγιές MWMV 50,0±3,20 (25/50) a MWMV Υγιές 28,0±5,80 (14/50) b - - Υγιές CMV - - 8,0±2,00 (04/50) a CMV Υγιές - 10,0±3,20 (05/50) a - α Φυτά δότες (φυτά ημερών μολυσμένα με τον ιό) που χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμές μετάδοσης. Το σύμβολο υποδεικνύει τις μετακινήσεις των αφίδων από το ένα φυτό στο άλλο. β Φυτά με συμπτώματα και θετικά με την μέθοδο DAS-ELISA. γ Ποσοστό (%) μετάδοσης, ± τυπικό σφάλμα (SE) του μέσου όρου. δ Αριθμός μολυσμένων φυτών/συνολικός αριθμός φυτών που χρησιμοποιήθηκαν. *Η στατιστική σύγκριση των μέσω όρων των δύο μεταχειρίσεων (είδος αφίδας) για την κάθε παράμετρο (ιική απομόνωση) έγινε με το έλεγχο Mann-Whitney U. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από διαφορετικό γράμμα με έντονη γραφή διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, σε επίπεδο σημαντικότητας P<0.05, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μιας σειράς ελέγχων Mann-Whitney. Η μετάδοση του MWMV δεν φάνηκε να επηρεάστηκε μετά από διαδοχική διατροφή των αφίδων σε μολυσμένο ή όχι με τον CMV φυτό κολοκυθιάς. Όταν άτομα του είδους M. persicae τράφηκαν αρχικά σε φυτό κολοκυθιάς υγιές ή μολυσμένο με τον CMV, τα ποσοστά μετάδοσης του MWMV ήταν 40±4,5% και 50±3,2%, αντίστοιχα (P=0.204). Τέλος, δεν παρατηρήθηκε μετάδοση του CMV όταν οι αφίδες τράφηκαν αρχικά ή έπειτα σε μολυσμένο με τον MWMV φυτό κολοκυθιάς (Πίνακας 5.3). Διάγραμμα 5.3. Μετάδοση των MWMV, WMV και CMV από το είδος M. persicae μετά από διαδοχική διατροφή σε υγιή ή μολυσμένα με μονή μόλυνση από τον MWMV ή WMV ή CMV φυτά κολοκυθιάς. (Υ: Υγιές, M: MWMV, W: WMV, C: CMV). 98