ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΣΕ ΟΞΑΖΟΛΙ ΟΝΕΣ ΚΑΙ ΣΤΡΕΠΤΟΓΡΑΜΜΙΝΕΣ ΜΕ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: Καθηγήτρια Ε. ίζα-ματαυτσή ΠΑΝΕΠ.ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ.2845 ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΣΕ ΟΞΑΖΟΛΙ ΟΝΕΣ ΚΑΙ ΣΤΡΕΠΤΟΓΡΑΜΜΙΝΕΣ ΜΕ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ ΤΑΤΣΙΟΠΟΥΛΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΙΑΤΡΟΣ-ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: Καθηγήτρια Ε. ίζα-ματαυτσή ΠΑΝΕΠ.ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ.2845 ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΣΕ ΟΞΑΖΟΛΙ ΟΝΕΣ ΚΑΙ ΣΤΡΕΠΤΟΓΡΑΜΜΙΝΕΣ ΜΕ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ ΤΑΤΣΙΟΠΟΥΛΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΙΑΤΡΟΣ-ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ.ΑΛΕΞΙΟΥ- ΑΝΙΗΛ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.ΠΑΠΠΑ-ΚΟΝΙ ΑΡΗ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ.ΑΛΕΞΙΟΥ- ΑΝΙΗΛ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.ΠΑΠΠΑ-ΚΟΝΙ ΑΡΗ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ε.ΠΕΤΕΙΝΑΚΗ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μ. ΕΞΗΝΤΑΡΗ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Π. ΝΙΚΟΛΑΙ ΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ε. ΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Η έγκριση της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως» (Νόµος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 3

4 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 4

5 Στους γονείς µου και στη σύζυγο µου Ειρήνη 5

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 8 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑ ΡΟΜΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ Ταξινόµηση Γενικοί χαρακτήρες Ιδιότητες οµή κυτταρικού τοιχώµατος Τοξίνες και ένζυµα Αιµολυσίνες Πηκτάση (κοαγκουλάση) Λευκοκτονίνες Τοξίνες που δρουν ως υπεραντιγόνα Θερµοανθεκτική νουκλεάση Παραγωγή εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη από τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους Άλλες ουσίες ΠΑΘΟΓΟΝΟΣ ΡΑΣΗ Λοιµώξεις από S.aureus Λοιµώξεις από πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους (CoNS) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Καλλιέργεια-Μικροσκοπική εξέταση Ταυτοποίηση ΘΕΡΑΠΕΙΑ-ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Ανθεκτικότητα στην πενικιλλίνη και τα β-λακταµικά αντιβιοτικά Αντοχή στις αµινογλυκοσίδες Αντοχή στις µακρολίδες, λινκοσαµίδες και στρεπτογραµµίνες οµάδας Β (MLS B ) Αντοχή στις τετρακυκλίνες Αντοχή στις κινολόνες Αντοχή στο Φουσιδικό οξύ Μειωµένη ευαισθησία και αντοχή στα γλυκοπεπτίδια ΟΞΑΖΟΛΙ ΟΝΕΣ Μηχανισµός δράσης Αντιµικροβιακό φάσµα Ανθεκτικότητα στη λινεζολίδη ΣΤΡΕΠΤΟΓΡΑΜΜΙΝΕΣ Μηχανισµός δράσης 68 6

7 7.2 Αντιµικροβιακό φάσµα Μηχανισµός αντοχής Επιδηµιολογία της αντοχής στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη 73 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟ ΟΙ Υλικό Μέθοδοι 1. Αποµόνωση των σταφυλόκοκκων Ταυτοποίηση των σταφυλόκοκκων οκιµασίες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Μοριακή ταυτοποίηση στελεχών πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) 92 3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλινικά στελέχη Παραγωγή PBP2a Φαινότυποι αντοχής των σταφυλόκοκκων στα αντιβιοτικά Έλεγχος MIC σε Λινεζολίδη και Κινοπριστίνη/Νταλφοπριστίνη οκιµασία PCR για την ανίχνευση γονιδίων αντοχής Αποτελέσµατα από την µοριακή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των στελεχών Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 124 7

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η ανακάλυψη και εφαρµογή των αντιµικροβιακών φαρµάκων στη θεραπεία των λοιµώξεων αποτέλεσε σταθµό της ιατρικής επιστήµης. Ταυτόχρονα όµως ξεκίνησε και η ανάπτυξη της θεραπευτικής µικροβιακής αντοχής η οποία αποτελεί παγκόσµιο πλέον πρόβληµα περιορίζοντας τις επιλογές. Είναι γενικά παραδεκτό ότι η εισαγωγή µιας νέας αντιµικροβιακής ουσίας στην κλινική θεραπευτική έχει ως φυσικό επακόλουθο την ανάπτυξη, µακροπρόθεσµα ή βραχυπρόθεσµα, µικροβιακής αντοχής. Είναι εποµένως αναγκαία η συνεχής επιτήρηση αλλά και η διερεύνηση των µηχανισµών αντοχής. Η ραγδαία επιστηµονική πρόοδος των τελευταίων δεκαετιών στον τοµέα της µοριακής βιολογίας επέτρεψε την εκτενή µελέτη της µικροβιακής αντοχής των µικροβίων. Τεχνικές όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης και η αλληλούχιση περιοχών του γονιδιώµατος, αποτελούν πολύτιµα εργαλεία για την διερεύνηση των µηχανισµών αντοχής σε γονιδιακό επίπεδο. Τα στελέχη σταφυλόκοκκου και ιδιαίτερα τα ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη αποτελούν στις µέρες µας µια από τις κυριότερες ανθεκτικές µορφές των µικροβίων και αποτελούν µεγάλο κίνδυνο, όταν εµφανιστούν στο νοσοκοµειακό χώρο, καθώς προκαλούν αυξηµένη νοσηρότητα και θνησιµότητα. Η αυξανόµενη χρήση των γλυκοπεπτιδίων ως φαρµάκων εκλογής για την αντιµετώπιση των σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων οδήγησε στην εµφάνιση ανθεκτικών στα γλυκοπεπτίδια στελεχών. Τα στελέχη αυτά εµφάνισαν αρχικά ενδιάµεση αντοχή (VISA ή GISA) για να ακολουθήσει στη συνέχεια και η σποραδική ανάδυση στελεχών µε πλήρη αντοχή (VRSA και GRSA). Η αντοχή στα γλυκοπεπτίδια των σταφυλόκοκκων µπορεί να µην αγγίζει τα υψηλά επίπεδα αντοχής των εντερόκοκκων, αποτελεί όµως ένα υπαρκτό πρόβληµα. Για το λόγο αυτό η φαρµακευτική βιοµηχανία προχώρησε στην αναζήτηση νέων αντιµικροβιακών φαρµάκων, ικανών να ανταποκριθούν στις απαιτήσεις των πολυανθεκτικών Gram θετικών κόκκων. Οι οξαζολιδόνες και οι στρεπτογραµµίνες µε κυριότερους αντιπροσώπους την λινεζολίδη και την κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη αποτελούν 2 νέα φάρµακα µε πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσµατα στη θεραπεία των σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων. Η προσεκτική χρήση των νεότερων αντιµικροβιακών φαρµάκων είναι 8

9 θεµελιώδους σηµασίας στην εποχής µας, µιας και οι θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισµένες. Τα φάρµακα αυτά εισήλθαν στον ελληνικό χώρο στις αρχές της δεκαετίας του 2000 και η παρακολούθηση της in vitro δραστικότητα τους παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον. Η παρούσα διατριβή σχεδιάστηκε για αυτόν ακριβώς το λόγο. Επιχειρεί µια πρώτη καταγραφή της συµπεριφοράς της λινεζολίδης και της κινοπριστίνης/νταλφοπριστίνης έναντι των σταφυλόκοκκων στο χώρο του νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ κατά τα έτη Φιλοδοξεί να χρησιµεύσει ως βάση για επιτήρηση της αντοχής του σταφυλόκοκκου στα συγκεκριµένα αντιβιοτικά Η διερεύνηση της αντοχής των σταφυλόκοκκων σε οξαζολιδόνες και στρεπτογραµµίνες που είναι ο σκοπός της παρούσας διατριβής έχει ως στόχο να βοηθήσει στην κατανόηση των µηχανισµών αντοχής και διασποράς των ανθεκτικών στελεχών. Για τη βοήθεια τους στην εκπόνηση της διατριβής αυτής ευχαριστώ θερµά : Την καθηγήτρια και τέως διευθύντρια του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ κ. Στ.Αλεξίου- ανιήλ που ήταν και επιβλέπουσα της διατριβής. Το συνεχές ενδιαφέρον της µε τις πολύτιµες συµβουλές και η αµέριστη ψυχολογική υποστήριξη µε βοήθησαν καθοριστικά στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής. υστυχώς η ξαφνική ασθένεια της δεν της επέτρεψε να δει ολοκληρωµένη αυτή τη διατριβή, γεγονός που θα τη χαροποιούσε ιδιαίτερα. Αισθάνοµαι την ανάγκη να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς µου την αναπληρώτρια καθηγήτρια και διευθύντρια του Μικροβιολογικού εργαστηρίου του Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου Λάρισας κ. Ευθυµία Πετεινάκη. Η συµβολή της στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής ήταν καθοριστική. Με βοήθησε τόσο στον σχεδιασµό αυτής της µελέτης από τα αρχικά στάδια µε τις πολύτιµες γνώσεις που έχει πάνω στο αντικείµενο, όσο και στην πραγµατοποίηση τµήµατος του εργαστηριακού µέρος της διατριβής. Οι πολύτιµες συµβουλές της, το ενδιαφέρον της και η λεπτοµερής διόρθωση του κειµένου, συνέβαλαν στην αρτιότερη τελική εµφάνιση της διατριβής. Ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Ν. Μαλισιόβα για το ενδιαφέρον που έδειξε για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής µετά την ασθένεια της κ.αλεξίου και τη βοήθεια του σε αρκετά πρακτικά ζητήµατα. 9

10 Θερµές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στα µέλη της επταµελούς επιτροπής για τη συµβολή τους και τις χρήσιµες παρατηρήσεις τους που βοήθησαν στην ολοκλήρωση της διατριβής. Ευχαριστώ θερµά τις τεχνολόγους κ. Λεµονιά Βίτου και Μαρία Γεωργαντά για την τεχνική τους βοήθεια. Θερµές ευχαριστίες στην βιβλιοθηκονόµο του νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ κ. Μαρία Στάικου για την βοήθεια της στη συλλογή της βιβλιογραφίας. Τη µοριακή βιολόγο ήµητρα Κλάψα ευχαριστώ πολύ για τη συνδροµή της στην πραγµατοποίηση του εργαστηριακού µέρους. Ευχαριστώ τη φιλόλογο κ. Ευφροσύνη Κουφονίκου για τη φιλολογική επιµέλεια του κειµένου. Τέλος ευχαριστώ τη σύζυγο µου Ειρήνη για την ενθάρρυνση και τη συµπαράσταση που έδειξε στην όλη µου προσπάθεια. 10

11 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑ ΡΟΜΗ Οι σταφυλόκοκκοι παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά από τον R.Koch το 1878, καλλιεργήθηκαν σε υγρά θρεπτικά υλικά από τον Pasteur το 1880 και περιγράφηκαν ως Gram(+) κόκκοι αποµονωθέντες από οξείες και χρόνιες φλεγµονές από τον Ogston to 1881.Τρία χρόνια αργότερα το 1884, ο Rosenbach µελέτησε συστηµατικά τους σταφυλόκοκκους και κατάφερε να τους αποµονώσει σε καθαρές καλλιέργειες. Με βάση το χρώµα των αποικιών, τους διαχώρισε σε σταφυλόκοκκο πυογόνο χρυσίζοντα (Staphylococcus pyogenes aureus) µε αποικίες χρώµατος χρυσοκίτρινου και σε σταφυλόκοκκο πυογόνο λευκό (Staphylococcus pyogenes albus) µε αποικίες χρώµατος λευκού 1. Ο S. aureus αποµονωνόταν κυρίως από τραύµατα και φλεγµονές του δέρµατος σε αντίθεση µε τον S.albus-αργότερα ονοµαζόµενο epidermidisο οποίος θεωρήθηκε ως µη παθογόνος µικροοργανισµός. Τα δύο είδη διαχωρίζονται µεταξύ τους µε τη δοκιµασία της κοαγκουλάσης, ενζύµου το οποίο προκαλεί πήξη του πλάσµατος 2,3. Η ορολογική ταξινόµηση προτάθηκε για πρώτη φορά το 1902 από τους Kolle και Otto, που ανέφεραν ότι µε µεθόδους αιµοσυγκόλλησης ήταν δυνατό να διακριθούν τα παθογόνα από τα µη παθογόνα στελέχη. Ο Loeb το 1903 έδειξε ότι ο S. pyogenes aureus προκαλούσε πήξη του πλάσµατος µέσα σε µερικές ώρες, ενώ ο S. epidermidis albus δεν είχε αυτή την ικανότητα. Οι Menkin και Walston το 1935 απέδειξαν ότι υπεύθυνη για τη σταφυλοκοκκική οργανική βλάβη ήταν µια τοξίνη και όχι η πηκτάση. Ο Duthie (1954) έδειξε ότι υπήρχαν δυο µορφές σταφυλοκοκκικής πηκτάσης: η συνδεδεµένη πηκτάση (clumping factor ή bound coagulase) και η ελεύθερη πηκτάση (free coagulase) 4. Η ονοµασία σταφυλόκοκκος δεν έγινε εύκολα δεκτή και έτσι οι µικροοργανισµοί αυτοί συµπεριλήφθηκαν στο γένος των Μικρόκοκκων. Από τα 34 συστήµατα ταξινόµησης που χρησιµοποιήθηκαν την περίοδο µόνο 9 αναγνώριζαν το σταφυλόκοκκο ως ξεχωριστό γένος 5. Στα µέσα της δεκαετίας του 1950 διατυπώθηκαν αρκετές απόψεις για το διαχωρισµό η µη των σταφυλόκοκκων από τους µικρόκοκκους. Την ίδια περίοδο αναγνωρίστηκαν δύο είδη, ο Staphylococcus aureus και ο Staphylococcus epidermidis µε βάση την αναερόβια διάσπαση της µαννιτόλης και την 11

12 παραγωγή της πηκτάσης. Η αριθµητική ταξινόµηση το 1959 απέδειξε ότι οι πηκτάση θετικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούσαν µια οµοιογενή οµάδα, σε αντίθεση µε τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους. Το 1963 ο Baird- Parker διαχώρισε ειδικούς τύπους για τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους 6. Το 1965 η ιεθνής Επιτροπή για τη Συστηµατική Βακτηριολογία τυποποίησε τη δοκιµασία της αναερόβιας ζύµωσης της γλυκόζης και έτσι έγινε ο διαχωρισµός των σταφυλόκοκκων από τους µικρόκοκκους. Οι σταφυλόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη αεροβίως και αναεροβίως, ενώ οι µικρόκοκκοι τη διασπούν µόνο αεροβίως. Στα µέσα της δεκαετίας του 1960 ακολούθησε σαφής διαχωρισµός του γένους των σταφυλόκοκκων από το γένος των µικρόκοκκων µε βάση την περιεκτικότητα του DNA στις βάσεις γουανίνη και κυτοσίνη. Οι σταφυλόκοκκοι έχουν αναλογία βάσεων γουανίνης και κυτοσίνης (G+C) mol% ενώ οι µικρόκοκκοι mol% ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 2.1 Ταξινόµηση Το γένος των σταφυλόκοκκων ανήκει στην οικογένεια των Μικρόκοκκων (Micrococcaceae). Στην ίδια οικογένεια ανήκουν και τα είδη Planococcus, Micrococcus και Stomatococcus. Μετά από γενετικές µελέτες (υβριδισµός DNA-DNA και DNA-rRNA, αλληλούχιση του 16S RNA) βρέθηκε ότι η οικογένεια αυτή δεν αποτελεί µια φυλογενετικά συγγενή οµάδα. To γένος των σταφυλόκοκκων ανήκει στην φυλετική οµάδα των Bacillus/Lactobacillus/Streptococcus και σχετίζεται περισσότερο µε τα γένη των Enterococcus, Bacillus, Listeria, Planococcus και Brochothrix 8. Ο διαχωρισµός του γένους των σταφυλόκοκκων από το γένος των Μικροκόκκων βασίζεται στην αναερόβια διάσπαση της γλυκόζης και στον έλεγχο ευαισθησίας στη βακιτρακίνη. Οι σταφυλόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη αεροβίως και αναεροβίως, ενώ οι µικρόκοκκοι τη διασπούν µόνο αεροβίως και είναι ανθεκτικοί στη βακιτρακίνη ενώ οι µικρόκοκκοι είναι ευαίσθητοι 8. 12

13 Πίνακας 1. Ταξινόµηση του γένους των Σταφυλόκοκκων 1) Staphylococcus aureus Simulans S. aureus subsp. anaerobius S. simulans 3) Οµάδα Staphylococcus S. carnosus 2)Οµάδα Staphylococcus Epidermidis S. epidermidis 4) Οµάδα Staphylococcus Sciuri S. capitis S. sciuri S. capitis subsp. Ureolyticus S. lentus S. caprae Saprophyticus S. saccharolyticus 5 ) Οµάδα Απροσδιορίστων S. warneri S. auricularis S. haemolyticus S. intermedius S. hominis S. hyicus S. lugdunensis S. caseolyticus S. schleiferi S. delphini 6) Οµάδα Staphylococcus S. saprophyticus S. cohnii S. cohnii subsp. ureolyticus S. xylosus S. arlettae S. equorum S. gallinarium S. succinus S. kloossii S. chromogenes Η κατάταξη των σταφυλόκοκκων βασίζεται σήµερα στην ταξινόµηση των Kloos και Schleifer (1975) και περιλαµβάνει περισσότερα από 35 είδη, που διαχωρίζονται µεταξύ τους µε βάση τις βιοχηµικές τους ιδιότητες (Πίνακας 13

14 1). Οι σταφυλόκοκκοι είναι ευρέως διαδεδοµένοι στη φύση και βρίσκονται κυρίως στο δέρµα, τους δερµατικούς αδένες και τους βλεννογόνους πτηνών και θηλαστικών. Ορισµένα είδη όπως οι S.hyicus και S.intermedius βρίσκονται µόνο σε ζώα και έχουν αναγνωριστεί ως παθογόνα 1. Το είδος που έχει ξεχωριστούς φαινοτυπικούς και γενετικούς χαρακτήρες είναι ο Staphylococcus aureus (χρυσίζων) µε κύριο χαρακτηριστικό την παραγωγή πηκτάσης (κοαγκουλάσης). Το ένζυµο αυτό παράγεται από τον S. intermedius, τον S. hyicus, που είναι σταφυλόκοκκος των ζώων, και από τους S. schleiferi και S. lugdunensis που αποµονώνονται από ανθρώπους. Στους σταφυλόκοκκους αυτούς παράγεται η συνδεδεµένη πηκτάση. Οι µη παράγοντες πηκτάση σταφυλόκοκκοι (Coagulase Negative Staphylococci-CoNS) αποτελούν µια ξεχωριστή οµάδα. Ο S.epidermidis αποτελεί το συχνότερα αποµονούµενο είδος αυτής της οµάδας, µε ποσοστό που κυµαίνεται από 65-90%, ακολουθούµενος από τον S.haemolyticus Γενικοί χαρακτήρες Οι σταφυλόκοκκοι είναι Gram θετικοί κόκκοι µε διάµετρο 0,5-1,5µm. ιατάσσονται σε µικρές οµάδες µε σχήµα σταφυλιού ή σε σειρά τεσσάρων το πολύ κόκκων. ίνουν θετική την αντίδραση καταλάσης µε την οποία διακρίνονται από τους στρεπτόκοκκους οι οποίοι δεν παράγουν καταλάση Στερούνται βλεφαρίδων και είναι ακίνητοι. εν έχουν έλυτρο µε εξαίρεση ορισµένα στελέχη που φέρουν ένα λεπτό αµινογλυκουρονικό περίβληµα. Τα περισσότερα είδη είναι δυνητικά αναερόβια µε εξαίρεση τον S.aureus sudsp. anaerobius και τον S.saccharolyticus. Τα δύο αυτά είδη αναπτύσσονται σε αναερόβιες συνθήκες και είναι συνήθως καταλάση αρνητικά Ιδιότητες Οι σταφυλόκοκκοι αναπτύσσονται εύκολα σε διάφορα θρεπτικά υλικά, όπως το αιµατούχο άγαρ, το Brain Heart Infusion Agar (BHIA), το Nutrient Agar (NA), και σε µεγάλο εύρος θερµοκρασιών (10-45 C) µε ευνοϊκότερη θερµοκρασία τους C. Στα στερεά θρεπτικά υλικά ο σταφυλόκοκκος σχηµατίζει αποικίες στρογγυλές, λείες, υπερυψωµένες και λάµπουσες. Οι 14

15 αποικίες παράγουν διάφορες χρωστικές χρώµατος από άσπρο έως πορτοκαλί και ενίοτε γύρω από το αιµατούχο άγαρ παρατηρείται άλως αιµολύσεως, λόγω παραγωγής αιµολυσίνης. Η παραγωγή χρωστικών µπορεί να αυξηθεί µε την επιπρόσθετη επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 24 έως 48 ώρες. Οι αποικίες του χρυσίζοντος σταφυλόκοκκου έχουν χροιά χρυσοκίτρινη ή φαιά, ενώ του S.epidermidis είναι λευκές. Το χαρακτηριστικό κίτρινο-πορτοκαλί χρώµα των αποικιών του S.aureus οφείλεται στην ύπαρξη καροτινοειδών. Οι σταφυλόκοκκοι είναι ανάµεσα στα πιο ανθεκτικά µη σπορογόνα βακτήρια και µπορούν να επιζήσουν σε αρκετά δύσκολες περιβαλλοντικές συνθήκες. Αντέχουν στην ξήρανση του ατµοσφαιρικού αέρα και στη θέρµανση στους 56 ο C για 30 λεπτά. Χαρακτηριστική είναι η αντοχή τους σε θρεπτικά υλικά που περιέχουν NaCl σε υψηλή πυκνότητα (7,5-10%), ιδιότητα που επιτρέπει το διαχωρισµό των αποικιών τους από άλλους µικροοργανισµούς της µικροβιακής χλωρίδας 10,11. Οι σταφυλόκοκκοι διασπούν διάφορα σάκχαρα µε παραγωγή γαλακτικού οξέος. O S.aureus διασπά τη µανιτόλη, την τρεχαλόζη και τη σακχαρόζη και παράγει µια θερµοανθεκτική νουκλεάση, τη DNAάση, η οποία υδρολύει το DNA. Μεταξύ όλων των βακτηρίων µόνον ο S. aureus παράγει θερµοανθεκτική DΝΑάση, ενώ η DΝΑάση των άλλων βακτηρίων είναι θερµοευαίσθητη και καταστρέφεται µετά από θέρµανση σε θερµοκρασία µεγαλύτερη των 44 ο C. Η παραγωγή θερµοανθεκτικής DΝΑάσης από τον S. aureus αποτελεί βασικό κριτήριο για το χαρακτηρισµό του είδους και έχει την ίδια σηµασία µε την παραγωγή πηκτάσης για την τυποποίηση του S. aureus. Στο σχήµα 1 φαίνονται ορισµένες από τις δοκιµασίες που ακολουθούνται για τη διάκριση των διαφόρων ειδών σταφυλόκοκκων 15

16 Σχήµα 1. οκιµασίες που χρησιµοποιούνται για την αναγνώριση των ανθρωπίνων ειδών Σταφυλόκοκκου (αναπαραγωγή από Koneman 2006) 16

17 2.4 οµή κυτταρικού τοιχώµατος Το κυτταρικό τοίχωµα των σταφυλόκοκκων παρουσιάζει όλα τα τυπικά χαρακτηριστικά της δοµής του κυτταρικού τοιχώµατος των Gram-θετικών βακτηρίων. Αποτελείται από πεπτιδογλυκάνη και τειχοϊκά οξέα. Η πεπτιδογλυκάνη (µουκοπεπτίδιο), που είναι το κύριο δοµικό στοιχείο του τοιχώµατος αντιπροσωπεύοντας το 50% του βάρους του, αποτελείται από επαναλαµβανόµενες αλυσίδες 2 αµινοσακχάρων, της 1-4 β-νακετυλογλυκοζαµίνης και του 1-4-β-Ν-ακετυλοµουραµικού οξέος. Από κάθε µόριο Ν-ακετυλοµουραµικού οξέος ξεκινά µια πενταπεπτιδική αλυσίδα αποτελούµενη από τα αµινοξέα L-αλανίνη, D- γλουταµίνη, L-λυσίνη, D- αλανίνη και D-αλανίνη. Το 90% των πενταπεπτιδίων αυτών που αιωρούνται ως µίσχοι, συνδέονται εγκαρσίως µε µια αλυσίδα από πέντε µόρια γλυκίνης. Η πενταγλυκίνη αυτή είναι χαρακτηριστικό στοιχείο της σταφυλοκοκκικής πεπτιδογλυκάνης 12. Η πεπτιδογλυκάνη διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην παθογόνο δράση του σταφυλοκόκκου, καθώς προάγει τη σύνθεση ιντερλευκίνης-1(il-1) από τα µονοπύρηνα, ενεργοποιεί το συµπλήρωµα και έλκει τα πολυµορφοπύρηνα στο σηµείο της φλεγµονής οδηγώντας στο σχηµατισµό του αποστήµατος 4. Τα τειχοϊκά οξέα, που αποτελούν το 40% του κυτταρικού τοιχώµατος είναι πολυµερή της γλυκερόλης ή της ριβιτόλης. Ορισµένα από αυτά βρίσκονται συνδεδεµένα µε την πεπτιδογλυκάνη (τειχοϊκά οξέα του κυτταρικού τοιχώµατος) αποτελούµενα από µια εναλλασσόµενη ακολουθία φωσφορικής ριβιτόλης, ενώ άλλα είναι συνδεδεµένα µε λιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης (τειχοϊκά οξέα της µεµβράνης) και αποτελούνται από φωσφορική γλυκερόλη σε επαναλαµβανόµενες µονάδες. Συνδέονται µε την ινωδονεκτίνη (fibronectin) και προάγουν την προσκόλληση του µικροβίου στους βλεννογόνους του ξενιστή 4,11. Στην επιφάνεια και µέσα στο πλέγµα της πεπτιδογλυκάνης βρίσκονται οµάδες πρωτεϊνών που επιτελούν διάφορες λειτουργίες. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι : 17

18 α) H πρωτεΐνη Α. Είναι πρωτεΐνη συνδεδεµένη στην πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώµατος του S.aureus και έχει µεγάλη τάση σύνδεσης µε το Fc τµήµα των ανοσοσφαιρινών IgG1, IgG2, IgG4, IgM και IgA2, µε αποτέλεσµα να αποτρέπει την καταστροφή του µικροοργανισµού µε τη βοήθεια των αντισωµάτων. Όταν ένα µόριο ανοσοσφαιρίνης έλθει σε επαφή µε την πρωτεΐνη Α, το Fc κλάσµα της συνδέεται µε την πρωτεΐνη αυτή και το σύµπλεγµα που προκύπτει παραµένει συνδεδεµένο πάνω στο σταφυλόκοκκο. Με τον τρόπο αυτό το τµήµα Fab της ανοσοσφαιρίνης µένει ελεύθερο, στραµµένο προς τα έξω και µπορούν να συνδεθούν µε αυτό οµόλογα αντιγόνα. Η ιδιότητα αυτή της Α πρωτεΐνης χρησιµοποιείται σήµερα σε πολλές ορολογικές αντιδράσεις αναζητήσεως αντιγόνων και είναι γνωστή ως δοκιµασία επισυγκόλλησης 4,10. Η πρωτεΐνη Α δρα ως λοιµογόνος παράγοντας, παίζοντας ρόλο στην οψωνινοποίηση των µικροοργανισµών από τα πολυµορφοπύρηνα, ενεργοποιώντας το συµπλήρωµα και προκαλώντας την εκδήλωση αντιδράσεων υπερευαισθησίας άµεσου και επιβραδυνόµενου τύπου 11. β) Οι πενικιλλινοδεσµευτικές πρωτεΐνες(penicillin Binding Proteins-PBPs). Οι πενικιλλινοδεσµευτικές πρωτεΐνες είναι ένζυµα της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης, τα οποία δρουν στην τελική φάση της βιοσύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης και συγκεκριµένα στην αντίδραση τρανσπεπτιδίωσης της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώµατος. Οι PBPs έχουν δράση τρανσπεπτιδάσης και καρβοξυπεπτιδάσης. Ο κύριος ρόλος τους είναι να βοηθούν στη χιαστί σύνδεση (cross-linking) της πεπτιδογλυκάνης, συνδέοντας στερεά τις αλυσίδες των 2 αµινοσακχάρων. Η δράση των πενικιλλινών στηρίζεται στο γεγονός ότι ο β-λακταµικός δακτύλιος αποτελεί ανάλογο του διπεπτιδίου της D-αλανίνης, µε αποτέλεσµα να επέρχεται αναστολή της δράσης των ενζύµων (PBPs) 13. O S.aureus έχει 4 κύριες πενικιλλινοδεσµευτικές πρωτεΐνες, τις PBP1, PBP2, PBP3 και PBP4 µε αντίστοιχα µοριακά βάρη 87, 80, 75 και 41 kda. Τα υπόλοιπα είδη σταφυλόκοκκων εκφράζουν τρεις, τέσσερις ή και περισσότερες πενικιλλινοδεσµευτικές πρωτεΐνες 14. Οι µεγάλου µοριακού βάρους PBPs 1, 2, 3 έχουν υψηλή συγγένεια µε τα περισσότερα β-λακταµικά αντιβιοτικά και είναι απαραίτητες για την 18

19 κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση του µικροβιακού κυττάρου. έσµευση των πρωτεϊνών αυτών από τα β-λακταµικά αντιβιοτικά οδηγεί στο θάνατο του κυττάρου 15. Η χαµηλού µοριακού βάρους PBP4, παρόλο που µπορεί να είναι σηµαντική για τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώµατος, δεν θεωρείται κριτικής σηµασίας στόχος δράσης των β-λακταµικών αντιβιοτικών. Σε µελέτη των Γεωργοπαπαδάκου και συν. βρέθηκε ότι οι PBP2 και 3 είναι απαραίτητες για τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώµατος. Η µελέτη µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο έδειξε ότι µετά την έκθεση του µικροοργανισµού σε κεφοταξίµη η οποία συνδέεται εκλεκτικά µε την PBP2 προκαλείται λύση του κυττάρου, ενώ µετά την έκθεση του µικροοργανισµού στη κεφαλεξίνη που συνδέεται εκλεκτικά µε την PBP3 προκαλείται επιµήκυνση του κυττάρου και αναστολή του διπλασιασµού. Στους σταφυλόκοκκους η PBP2 είναι πιθανώς η κύρια τρασνσπεπτιδάση, ενώ η PBP3 διαδραµατίζει ουσιαστικό ρόλο στον διπλασιασµό 16. Αξίζει να σηµειωθεί ότι για τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώµατος των σταφυλόκοκκων είναι απαραίτητα τα γονίδια fem. Έχουν αναγνωρισθεί έξι διαφορετικά fem γονίδια, τα A, B, C, D, E και F, που εδράζονται σε διαφορετικές περιοχές του σταφυλοκοκκικού γονιδιώµατος. Πλην του femε, που είναι άγνωστης δράσης, όλα τα υπόλοιπα συµµετέχουν στα διάφορα στάδια σύνθεσης της πενταπεπτιδικής και πενταγλυνικής αλυσίδας του µορίου της πεπτιδογλυκάνης. Στελέχη µε µεταλλάξεις στα fem γονίδια εµφανίζουν διαφορετικής σύστασης πεπτιδογλυκάνη. Μετάλλαξη στο femc έχει ως συνέπεια τη µη παραγωγή του γλουταµινικού οξέος, του τρίτου αµινοξέως του πενταπεπτιδίου της πεπτιδογλυκάνης, ενώ η αναστολή της λειτουργίας του femd συνοδεύεται από την εξαφάνιση των µονοµερών δισακχαριδικών πενταπεπτιδίων από το κυτταρικό τοίχωµα. Τέλος η µετάλλαξη του femf γονιδίου αναστέλλει την ενσωµάτωση της λυσίνης κατά τα αρχικά στάδια της σύνθεσης του πενταπεπτιδίου της πεπτιδογλυκάνης

20 2.5 Τοξίνες και Ένζυµα Ο σταφυλόκοκκος παράγει διάφορες τοξίνες και ένζυµα καθώς και εξωκυττάριες πρωτεΐνες που ενισχύουν την παθογόνο δράση και συµβάλλουν στην εκδήλωση των λοιµώξεων µε τις οποίες έχει συσχετισθεί Αιµολυσίνες Είναι κυτταροτοξίνες που καταστρέφουν την κυτταρική µεµβράνη και διαφέρουν µεταξύ τους στην αντιγονική δοµή και στην δράση τους στα ερυθρά αιµοσφαίρια διαφορετικών ειδών. ιακρίνονται σε τέσσερις τάξεις: άλφα, βήτα, γάµα και δέλτα τοξίνες. Η α-αιµολυσίνη(α-τοξίνη) παράγεται από τα περισσότερα στελέχη S.aureus, λύει τα ερυθρά αιµοσφαίρια του κουνελιού και έχει δερµονεκρωτική και νευροτοξική δράση. Είναι πρωτεΐνη µεγάλου µοριακού βάρους (33000 kda) που κωδικοποιείται από το γονίδιο hla του χρωµοσώµατος του S.aureus. Στην επιφάνεια του κυττάρου-στόχου τα κυλινδρικά επταµερή της α-αιµολυσίνης σχηµατίζουν πόρους, οι οποίοι επιτρέπουν την απώλεια καλίου και µικροµοριακών ουσιών και την είσοδο νατρίου και ασβεστίου, µε τελικό αποτέλεσµα τη λύση του κυττάρου 17, 18, 19. Η β-αιµολυσίνη (β-τοξίνη ή σφιγγοµυελινάση C) παράγεται επίσης από πολλά στελέχη S.aureus, ιδίως αυτά που αποµονώνονται από ζώα, και κωδικοποιείται από το γονίδιο hlb του χρωµοσώµατος. Έχει δράση φωσφορυλάσης C εµφανίζοντας ειδικότητα για τη σφιγγοµυελίνη και φωσφατιδυλοχολίνη. Με τη δράση αυτή είναι τοξική για πολλά κύτταρα, περιλαµβανοµένων των ερυθρών αιµοσφαιρίων του ανθρώπου 17. Η γ-αιµολυσίνη παράγεται από την πλειονότητα των στελεχών S.aureus και ανήκει σε µια οµάδα τοξινών που αποτελούνται από δύο υποµονάδες, την S (Slow-eluting) και F (Fast-eluting). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τη σύνθεση της τοξίνης βρίσκονται στο χρωµόσωµα στην περιοχή hlg. Η υποµονάδα S κωδικοποιείται από δύο γονίδια (hlga και hlgc), µε αποτέλεσµα τη σύνθεση δύο διαφορετικών υποµονάδων, που συνδυάζονται σε µια υποµονάδα F (γονίδιο hlgb). Ο συνδυασµός αυτών των µορίων γίνεται στην επιφάνεια του κυττάρου-στόχου, όπου πρώτα συνδέεται το µόριο S, φωσφορυλιώνεται και ακολουθεί το µόριο F. Ο πολυµερισµός των 20

21 µορίων σε αναλογίες 4:4 ή 3:4 ή 4:3 οδηγεί στο σχηµατισµό πόρων και στη λύση του κυττάρου. Η ύπαρξη δύο µορίων για την υποµονάδα S έχει ως συνέπεια τη σύνθεση δυο τοξινών µε τους συνδυασµούς HlgA/HlgB και HlgC/HlgB, µε διαφορετική ειδικότητα ως προς τα κύτταρα-στόχος. H γ- αιµολυσίνη µπορεί να καταστρέψει λευκοκύτταρα και ερυθρά αιµοσφαίρια διαφόρων θηλαστικών 17, 20. H δ-αιµολυσίνη είναι πρωτεΐνη µικρού µοριακού βάρους (3000 kda) που παράγεται από το 97% των στελεχών S.aureus και από το 50-70% των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων. Κωδικοποιείται από το γονίδιο hld και προκαλεί αιµόλυση των ερυθρών αιµοσφαιρίων του ανθρώπου. Παρά το γεγονός ότι έχει ευρεία κυτταροτοξική δράση, παραµένει αδιευκρίνιστος ο ρόλος της στην παθογένεια των σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων. Η ταχεία δράση της στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη οδηγεί στο συµπέρασµα ότι δρα ως απορρυπαντικό Πηκτάση (κοαγκουλάση) Η πηκτάση είναι εξωκυττάρια πρωτεΐνη, που προκαλεί πήξη του πλάσµατος του ανθρώπου και του κουνελιού, του οποίου η πήξη έχει ανασταλεί µε κιτρικά ή οξαλικά άλατα Η παραγωγή πηκτάσης διαχωρίζει τον S.aureus από την οµάδα των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων. Παράγεται από τα 95% και πλέον των στελεχών χρυσίζοντος σταφυλοκόκκου. Από τους µη χρυσίζοντες σταφυλόκοκκους παράγουν πηκτάση µόνο οι S.intermedius και S.hyicus, που είναι παθογόνοι για τα ζώα. Η πηκτάση συνδέεται µε την προθροµβίνη και αποκτά ενζυµική δραστικότητα καταλύοντας τη µετατροπή του ινωδογόνου σε ινική. Με τον τρόπο αυτό η πηκτάση προστατεύει τον S.aureus από την φαγοκυττάρωση και την οψωνινοποίηση, δηµιουργώντας µια κάψα ινικής γύρω από το σηµείο προσβολής του ιστού. Η δράση της πηκτάσης διαφέρει από το φυσιολογικό µηχανισµό πήξης του αίµατος, επειδή δεν χρειάζεται την παρουσία ασβεστίου και δεν αναστέλλεται από την ηπαρίνη 8,21. Συναντάται σε δύο µορφές: την ελεύθερη και την συνδεδεµένη. Η ελεύθερη πηκτάση παράγεται όταν το µικρόβιο αναπτύσσεται σε ζωµό και προκαλεί πήξη του αίµατος συνδεόµενη µε έναν παράγοντα του πλάσµατος που µοιάζει µε την προθροµβίνη και ονοµάζεται CRF(coagulase reacting 21

22 factor). Η συνδεδεµένη πηκτάση είναι προσκολληµένη στην επιφάνεια των µικροβιακών κυττάρων και προκαλεί πήξη του πλάσµατος χωρίς τη µεσολάβηση του CRF Λευκοκτονίνες Στην οµάδα αυτή ανήκουν α) η Panton-Valentine (PVL -γονίδια luks- PV και lukf-pv) β) η LukE/D (γονίδια luke και lukd) και γ) η lukm/f -PV like (γονίδια lukm και lukf ). Έχουν δοµή όµοια µε αυτήν της γ-αιµολυσίνης, αποτελούµενες από δύο υποµονάδες. Οι υποµονάδες έχουν τοξική δράση µόνο ως διµερείς, ενώ µεµονωµένες είναι ανενεργείς. Τα γονίδια τους έχουν βρεθεί στο χρωµόσωµα, ενώ της PVL και σε υπολοιµογόνο βακτηριοφάγο, υποδηλώνοντας τη δυνατότητα οριζόντιας διασποράς. Επιπλέον τα συγκεκριµένα γονίδια έχουν µεγάλη οµολογία βάσεων µεταξύ τους καθώς και µε τα γονίδια της γ-αιµολυσίνης. Οι ερευνητές πιστεύουν ότι προέρχονται από ένα αρχικό κοινό γονίδιο που µε διπλασιασµούς και µεταλλάξεις οδηγήθηκε σε αυτή τη γενετική ποικιλοµορφία. Οι λευκοκτονίνες σχηµατίζουν οκταµερή (αναλογία υποµονάδων 4:4) στην επιφάνεια των µονοκυττάρων, µακροφάγων και πολυµορφοπύρηνων, µε αποτέλεσµα τη λύση των κυττάρων. Οι τοξίνες Luk δρουν και σε ερυθρά αιµοσφαίρια. Ισχυρό πλεονέκτηµα των στελεχών S.aureus, που κωδικοποιούν στο γονιδίωµα τους τις λευκοκτονίνες και τη γ- αιµολυσίνη, είναι ότι µπορούν τελικά να συνθέσουν τοξίνες-υβρίδια, µε αποτέλεσµα να προκύπτουν τοξίνες µε ευρύτερο φάσµα κυττάρων-στόχων και τελική ενίσχυση της λοιµογόνου ικανότητας του στελέχους 17,18,22. Η ικανότητα των προαναφερθεισών τοξινών να σχηµατίζουν πόρους αποτελεί σηµαντικό στοιχείο στην παθογένεια των σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων. Η λύση των κυττάρων-στόχων, που είναι το αποτέλεσµα της δράσης των τοξινών, απελευθερώνει µεγάλα ποσά µορίων που προάγουν τη φλεγµονή και ουσίες που είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασµό των µικροβίων, ενώ συγχρόνως δηµιουργεί και κύτταρα-φαντάσµατα που αποπροσανατολίζουν το ανοσοποιητικό σύστηµα. Τα στελέχη S.aureus που συνθέτουν λευκοκτονίνες έχουν αποµονωθεί µε συνεχώς αυξανόµενη συχνότητα από λοιµώξεις των µαλακών µορίων, νεκρωτική πνευµονία και σπανιότερα από εν τω βάθει λοιµώξεις. Η PVL 22

23 τοξίνη αποµονώνεται τα τελευταία χρόνια και σε ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη στελέχη σταφυλοκόκκου της κοινότητας (CA-MRSA) Τοξίνες που δρουν ως υπεραντιγόνα (Pyrogenic Toxin Superantigens, PTSAgs ) Στην κατηγορία αυτή ανήκουν η τοξίνη του συνδρόµου τοξικής καταπληξίας (Toxic Shock Syndrome Toxin-1, TSST-1), οι εντεροτοξίνες (Staphylococcal Enterotoxins, SEs) και οι επιδερµολυτικές τοξίνες (Exfoliatins/ Epidermolytic Toxins). Είναι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες που µπορεί να προκαλέσουν την εµφάνιση υψηλού πυρετού, έχουν υπεραντιγονική δράση και την ικανότητα να ενισχύουν την ευαισθησία του ξενιστή στις ενδοτοξίνες. Τα υπεραντιγόνα χαρακτηρίζονται από την ικανότητα να προκαλούν πολλαπλασιασµό και ενεργοποίηση των Τ-λεµφοκυττάρων ανεξάρτητα από την οδό ενεργοποίησης µε τα κλασσικά αντιγόνα. Οι τοξίνες προάγουν την πολυκλωνική διέγερση των Τ-λεµφοκυττάρων, συνδεόµενες µε τη µεταβλητή περιοχή (V β ) του υποδοχέα των Τ-λεµφοκυττάρων (TCR) και µε πρωτεΐνες του συστήµατος µείζονος ιστοσυµβατότητας τάξης ΙΙ (MHC-II). Η σύνδεση αυτή έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση τουλάχιστον 10% (5-30%) του πληθυσµού των λεµφοκυττάρων και την απελευθέρωση ιντερλευκίνης 1 (IL- 1), TNFα από τα µακροφάγα και IL-2, TNFβ, ιντερφερόνης γ (IFN-γ) από τα Τ-λεµφοκύτταρα. Οι κυτταροξίνες αυτές είναι υπεύθυνες για την ταυτόχρονη δυσλειτουργία πολλαπλών συστηµάτων και την εµφάνιση εικόνας καταπληξίας 17,24. Α) Εντεροτοξίνες (Staphylococcal Enterotoxins, SEs) Οι εντεροτοξίνες είναι διαλυτές εξωκυττάριες τοξίνες, που παράγονται από τους πηκτάση θετικούς σταφυλόκοκκους. Είναι ανθεκτικές στη δράση των πρωτεολυτικών ενζύµων όπως η πεψίνη και η τρυψίνη. Αξιοσηµείωτη είναι η θερµοανθεκτικότητα τους. Έχουν χαρακτηριστεί πολλές εντεροτοξίνες που ονοµάστηκαν µε τα γράµµατα του λατινικού αλφαβήτου (SEA-SEU). Ένα στέλεχος µπορεί να συνθέσει πολλές εντεροτοξίνες και έχει βρεθεί ότι τα γονίδια τους εδράζονται σε πλασµίδια (sed, sej), φάγους (sea,see), στο χρωµόσωµα (seb), αλλά και σε µεταθετά στοιχεία, τα νησίδια παθογονικότητας (Pathogenicity Islands) 17,24,25,26,27. 23

24 Οι εντεροτοξίνες αποτελούν το αίτιο του συνδρόµου τροφικής δηλητηρίασης που προκαλούν οι σταφυλόκοκκοι, που είναι πιθανότατα η πιο συχνή αιτία τροφικής δηλητηρίασης στις ΗΠΑ. Πρόσφατα βρέθηκε ότι οι εντεροτοξίνες Β και C εµπλέκονται στην παθογένεια της µη-εµµηνορρυσιακής µορφής του συνδρόµου τοξικής καταπληξίας. Ο ακριβής µηχανισµός δράσης των τοξινών είναι άγνωστος αλλά έχει αποδειχτεί ότι αυξάνουν τις εντερικές περισταλτικές κινήσεις. Η ανίχνευση των εντεροτοξινών έχει επιτευχθεί τόσο µε ανοσολογικές όσο και µε µοριακές µεθόδους. Οι ανοσολογικές µέθοδοι επιτρέπουν την απευθείας ανίχνευση της τοξίνης, ενώ οι µοριακές µέθοδοι βρίσκουν τα δοµικά γονίδια που κωδικοποιούν την παραγωγή των τοξινών. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί multiplex-pcr µέθοδοι για την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών εντεροτοξινών 28. ET) Β) Επιδερµολυτική (αποφολιδωτική) τοξίνη (exfoliative toxin- Η τοξίνη αυτή περιλαµβάνει δύο τουλάχιστον αντιγονικώς διάφορες πρωτεΐνες (ΕΤΑ και ΕΤΒ) µεγάλου µοριακού βάρους (24000kDa), κωδικοποιούµενες από το χρωµοσωµικό eta και το πλασµιδιακό etb γονίδιο αντίστοιχα. Πρόσφατα ανιχνεύτηκαν σε στελέχη S.aureus και άλλες δύο επιδερµολυτικές τοξίνες, οι ETC και ΕΤD. Έχει βρεθεί ότι περίπου το 5% των στελεχών S.aureus έχουν την ικανότητα παραγωγής αυτών των τοξινών. Οι επιδερµολυτικές τοξίνες είναι υπεύθυνες για τα δερµατολογικά συµπτώµατα του σταφυλοκοκκικού συνδρόµου αποκολλήσεως της επιδερµίδας (Staphylococcal Scalded Skin Syndrome). Το σύνδροµο περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1878, ενώ οι δύο πρώτες τοξίνες ταυτοποιήθηκαν 100 χρόνια αργότερα. Ο µηχανισµός δράσης των τοξινών αναλύθηκε πρόσφατα. Πρόκειται για πρωτεάσες της σερίνης που, όταν είναι ελεύθερες, είναι αδρανή ένζυµα. Όταν όµως συνδεθούν µε µια γλυκοπρωτεΐνη των δεσµοσωµάτων της επιδερµίδας-τη δεσµογλεϊνη 1 (desmoglein-1), εκδηλώνεται η δράση τους µε απόσπαση του εξωκυττάριου τµήµατος της γλυκοπρωτεΐνης και τελική καταστροφή των δεσµοσωµάτων που είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της επαφής των επιθηλιακών κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό καταστρέφεται η σύνδεση µεταξύ των κυττάρων του δέρµατος και προκαλούνται µεγάλες 24

25 περιοχές απολέπισης, οι οποίες προσοµοιάζουν και συγχέονται µε έγκαυµα. Οι τοξίνες είναι δραστικές στην επιδερµίδα καθώς και στους βλεννογόνους 29,30. Οι επιδερµολυτικές τοξίνες εµφανίζουν και υπεραντιγονική δράση µε εκλεκτική πολυκλωνική διέγερση ορισµένων υποδοχέων των Τ- λεµφοκυττάρων 29. Γ) Τοξίνη του συνδρόµου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) Εκτός από το σύνδροµο τοξικής καταπληξίας η TSST-1 εµπλέκεται και στην παθογένεια άλλων ασθενειών. Έχει αποµονωθεί από τους νεφρούς νεογνών που απεβίωσαν από σύνδροµο αιφνιδίου θανάτου καθώς και στο 60% των ασθενών που εκδήλωσαν σύνδροµο Kawasaki 31. Είναι θερµοανθεκτική πρωτεΐνη µικρού µοριακού βάρους (22000 kda) ανθεκτική στη δράση πρωτεολυτικών ενζύµων. H παραγωγή της ρυθµίζεται από το γονίδιο tst που βρίσκεται σε µια µεταθετή περιοχή του χρωµοσώµατος, το σταφυλοκοκκικό νησίδιο παθογονικότητας 1. Από τις προαναφερθείσες τοξίνες η TSST-1 έχει την ισχυρότερη υπεραντιγονική δράση. Είναι υπεύθυνη για το σύνδροµο τοξικής καταπληξίας, αν και έχουν αναφερθεί περιπτώσεις του συνδρόµου που ενοχοποιούσαν πηκτάση αρνητικό σταφυλόκοκκο και πυογόνο στρεπτόκοκκο 32,33. Μια τοξίνη παρόµοια µε την TSST-1 έχει αποµονωθεί από στελέχη S.aureus που βρίσκονται σε ζώα 34. Η ανίχνευση της τοξίνης έχει επιτευχθεί µε έµµεση συγκολλητινοαντίδραση, ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA, ραδιοανοσολογική µέθοδο RIA καθώς και µε την εφαρµογή PCR Θερµοανθεκτική νουκλεάση (t-dnaάση) Ο S.aureus παράγει µια θερµοανθεκτική νουκλεάση που υδρολύει τα νουκλεϊκά οξέα σε 3 -φωσφοµονονουκλεοτίδια. Η νουκλεάση αυτή που έχει χρησιµοποιηθεί για την ταξινόµηση των σταφυλόκοκκων παράγεται και από ορισµένα στελέχη S.schleiferi, S.intermedius και S.hyicus 8. 25

26 2.5.6 Παραγωγή εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη από τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους Μια ξεχωριστή ιδιότητα των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων µε κύριο αντιπρόσωπο τον S.epidermidis είναι η παραγωγή µιας εξωκυττάριας βλεννώδους ουσίας (slime), η οποία αποτελείται από 40% υδατάνθρακες και 27% πρωτεΐνες. Ο Younger και συν. βρήκαν ότι ενώ όλα τα στελέχη CoNS είχαν ικανότητα προσκολλήσεως, δεν είχαν όλα τη δυνατότητα παραγωγής slime. To γεγονός αυτό διαχώριζε ξεκάθαρα τις δύο αυτές ιδιότητες των CoNS 35. In vitro µελέτες έχουν δείξει ότι η παραγωγή slime διευκολύνει την προσκόλληση των CoNS σε πλαστικές επιφάνειες και τα συγκεκριµένα στελέχη εγκλείονται µέσα σε αυτό το προστατευτικό εξωκυττάριο βλεννώδες στρώµα, δηµιουργώντας µια βιοµεµβράνη (biofilm) 36, 37. Έτσι δηµιουργείται ένα προστατευτικό µικροβιακό περιβάλλον µέσα στο οποίο επικρατούν άριστες συνθήκες αναπτύξεως του µικροβίου. Έχει βρεθεί επίσης ότι το slime δρα εχθρικά προς την άµυνα του ξενιστή, αναστέλλοντας τη χηµειοταξία, τη φαγοκυττάρωση των µικροβίων και τις οξειδωτικές αντιδράσεις των κυκλοφορούντων φαγοκυττάρων 38. Σε in vitro µελέτες βρέθηκε επίσης ότι µετά από έκθεση µονοπύρηνων κυττάρων στο slime του S.epidermidis διαπιστώθηκε µειωµένη αντίδραση των µονοπύρηνων στα βακτηριακά αντιγόνα. Η παρατήρηση αυτή δείχνει ότι το slime ενδεχοµένως παρεµβαίνει στη λειτουργία του συστήµατος κυτταρικής ανοσίας, αναστέλλοντας την. Η προκαλούµενη από την παραγωγή slime καταστολή των φυσικών αντιδράσεων του ξενιστή πιθανόν να συµβάλλει όχι µόνο στην εκδήλωση λοίµωξης από τους CoNS παρουσία ενδοπροσθετικών συσκευών (ενδαγγειακοί καθετήρες), αλλά και να αυξάνει τον κίνδυνο για ανάπτυξη και άλλων ευκαιριακών λοιµώξεων 39,40. Σηµαντικό ρόλο στην προσκόλληση του S. epidermidis στα προσθετικά υλικά και τον σχηµατισµό βιοµεµβρανών παίζουν και διάφορες πρωτεΐνες επιφανείας του βακτηρίου που έχουν χαρακτηρισθεί ως προσκολλητίνες 41. Μετά την έκθεση των βιοϊατρικών υλικών στα υγρά του σώµατος, όπως αίµα, σίελος ή ούρα, προσροφώνται µακροµοριακά στοιχεία και σχηµατίζουν µια 'συµβατική µεµβράνη. Η συµβατική µεµβράνη αποτελεί τη βάση για το σχηµατισµό της ώριµης βιοµεµβράνης

27 2.5.7 Άλλες ουσίες Ο S.aureus παράγει επίσης υαλουρονιδάση που βοηθά στη διεισδυτικότητά του µε τη διάσπαση του υαλουρονικού οξέος, σταφυλοκινάση που προκαλεί λύση της ινικής και λιπάση. Ορισµένα στελέχη S.epidermidis παράγουν µια τοξίνη παρόµοια µε την δ-τοξίνη του S.aureus η οποία εµπλέκεται στην παθογένεια της νεογνικής νεκρωτικής εντεροκολίτιδας

28 3. Παθογόνος ράση Σταφυλόκοκκων 3.1 Λοιµώξεις από S.aureus Ο S.aureus αποτελεί το πιο παθογόνο είδος της οικογένειας των Σταφυλόκοκκων έχοντας ξεχωριστούς φαινοτυπικούς και γενετικούς χαρακτήρες. Βρίσκεται στο εξωτερικό περιβάλλον και στη ρινική κοιλότητα σε ποσοστό 20-40% των ενηλίκων. Αποτελεί επίσης µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του περινέου, της µασχαλιαίας κοιλότητας και του κόλπου. Πολλές φορές ο S.aureus αποικίζει παροδικά και το παχύ έντερο. Ο µικροοργανισµός, αν και αποτελεί µέρος της φυσιολογικής µικροβιακής χλωρίδας του δέρµατος και των βλεννογόνων, µπορεί υπό τις κατάλληλες συνθήκες να προκαλέσει σοβαρές λοιµώξεις στον άνθρωπο 44. Ευπαθείς σε επαναλαµβανόµενες και βαριές σταφυλοκοκκικές λοιµώξεις είναι ασθενείς µε συγγενή ανεπάρκεια της χηµειοταξίας και της φαγοκυττάρωσης (χρόνια κοκκιωµατώδης νόσος, σύνδροµα Job-Buckley και Wiskott-Aldrich), όπως και ασθενείς µε σακχαρώδη διαβήτη, ηλικιωµένοι, χρήστες ενδοφλέβιων ναρκωτικών και άτοµα που λαµβάνουν κορτικοστεροειδή 4,8. Ως παθογόνο βακτήριο έχει βιοχηµικούς µηχανισµούς που το καθιστούν ικανό να αποικίζει και να εξαπλώνεται γρήγορα στους ιστούς είτε κατά συνέχεια ιστών (παραγωγή υαλουρονιδάσης, ινωδολυσίνης, αιµολυσινών) είτε µετά από βακτηριαιµία και να προστατεύεται από τους αµυντικούς µηχανισµούς του οργανισµού. Ο αντιπροσωπευτικός τύπος της σταφυλοκοκκικής νόσου είναι η πυώδης φλεγµονή. Εξαίρεση αποτελούν τα τρία κλινικά σύνδροµα: η τροφική δηλητηρίαση, η τοξική επιδερµική νεκρόλυση και το σύνδροµο του τοξικού shock που οφείλονται στη δράση των αντίστοιχων εξωτοξινών που παράγονται από τον S.aureus. 1. Θυλακίτιδα Πρόκειται για καλοήθη φλεγµονή που περιορίζεται στους θυλάκους των τριχών και χαρακτηρίζεται από την παρουσία µικρών ερυθρών επώδυνων περιοχών και την απουσία συστηµατικών συµπτωµάτων 8. 28

29 2. οθιήνωση και ψευδάνθρακας Η δοθιήνωση αποτελεί τη συνέχεια της φλεγµονής του θυλάκου των τριχών και αποτελεί το πρότυπο της δερµατικής φλεγµονής. Η αρχή της βλάβης γίνεται στο θύλακο της τρίχας και ακολουθεί νέκρωση του ιστού. Εντοπίζεται στα τριχωτά µέρη του σώµατος, µε συχνότερη εµφάνιση στο πρόσωπο, στον αυχένα, στη µασχάλη και τους γλουτούς. Ο ψευδάνθρακας αποτελεί µια πιο σοβαρή εν τω βάθει φλεγµονή του θυλάκου της τριχός. Προκαλείται από διασπορά της λοίµωξης στον υποδόριο ιστό και εντοπίζεται συνήθως στη βάση του τραχήλου. Συχνά έχουµε την εµφάνιση ρίγους και πυρετού Μολυσµατικό κηρίο Πρόκειται για επιπολής δερµατική φλεγµονή που εµφανίζεται κυρίως σε παιδιά και εντοπίζεται κυρίως στο πρόσωπο και στα πόδια. Ο S.aureus είναι υπεύθυνος για το 80-90% των περιπτώσεων, ενώ ο β-αιµολυτικός στρεπτόκοκκος οµάδας Α είναι υπεύθυνος για τις υπόλοιπες Μαστίτιδα Χαρακτηρίζεται από την εµφάνιση οιδήµατος και περιστασιακά ερυθήµατος στην περιοχή γύρω από το µαστό. Η εµφάνιση µαστίτιδας σχετίζεται µε τη γέννηση και το θηλασµό. Το µικρόβιο συνήθως αποµονώνεται τόσο από τη µητέρα όσο και από το νεογνό Λοιµώξεις χειρουργικών τραυµάτων Οι λοιµώξεις των χειρουργικών τραυµάτων χαρακτηρίζονται από την προοδευτική εµφάνιση οιδήµατος, ερυθρότητας και πόνου στην περιοχή γύρω από τη χειρουργική τοµή δύο ή περισσότερες µέρες µετά τη χειρουργική επέµβαση. Η θεραπευτική προσέγγιση στις λοιµώξεις αυτές εξαρτάται από το βάθος της λοίµωξης, την ανοσολογική κατάσταση του ξενιστή, την παρουσία κλινικών συµπτωµάτων και την ύπαρξη ή όχι ξένων σωµάτων εντός του τραύµατος. Όταν υπάρχει πυώδης συλλογή δεν αρκεί για τη θεραπεία χορήγηση αντιβιοτικού, αλλά είναι απαραίτητη και η χειρουργική διάνοιξη για την παροχέτευσή της Βακτηριαιµία και ενδοκαρδίτιδα Η µικροβιαιµία από τον S.aureus µπορεί να προέλθει είτε από την εξάπλωση µιας τοπικής λοίµωξης (έγκαυµα, πνευµονία, έλκος, απόστηµα) είτε από την απευθείας είσοδο του µικροοργανισµού στην κυκλοφορία του αίµατος 29

30 από καθετήρες και άλλες προσθετικές συσκευές. Οι ασθενείς συνήθως παρουσιάζουν πυρετό και ρίγος. Είναι δυνατή η παρουσία βλαβών του δέρµατος, οι οποίες µπορεί να εξελιχθούν και να σχηµατίσουν µεγαλύτερες νεκρωτικές βλάβες. Η συχνότητα εµφάνισης µικροβιαιµίας από S. aureus έχει αυξηθεί δραµατικά τα τελευταία χρόνια και η θνητότητα κυµαίνεται από 20 έως 25% 45. Στους παράγοντες που σχετίζονται µε αυξηµένη θνητότητα περιλαµβάνονται η ηλικία άνω των 50 ετών καθώς και σοβαρές υποκείµενες καρδιακές, νευρολογικές και αναπνευστικές ασθένειες. Έχει παρατηρηθεί ότι η βακτηριαιµία που προκαλείται από τα µεθικιλλίνη ανθεκτικά στελέχη δεν σχετίζεται µε αυξηµένη θνητότητα. Η συχνότητα των επιπλοκών από την σταφυλοκοκκική βακτηριαιµία είναι επίσης υψηλή, κυµαινόµενη από 11 έως 53% 44,46. Για τον εργαστηριακό έλεγχο της νόσου απαιτείται η λήψη τουλάχιστον τεσσάρων αιµοκαλλιεργειών µε µεσοδιαστήµατα, καλλιέργειες από δερµατικές βλάβες ή πυώδη εξιδρώµατα και καλλιέργεια ούρων. Η σηψαιµία από S.aureus µπορεί να οδηγήσει σε πυελονεφρίτιδα, σε φλοιώδη αποστήµατα του νεφρού και σε οξεία ή χρόνια σπειραµατονεφρίτιδα 11. Η συχνότητα εµφάνισης ενδοκαρδίτιδας που οφείλεται στο χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο έχει αυξηθεί και αντιστοιχεί στο 25-35% όλων των περιπτώσεων 47,48. Εµφανίζεται κυρίως σε χρήστες ναρκωτικών ουσιών, ηλικιωµένους ασθενείς, σε ασθενείς µε προσθετικές βαλβίδες καθώς και σε νοσηλευόµενους ασθενείς. Σε αντίθεση µε τις ενδοκαρδίτιδες που προκαλούνται από λιγότερο παθογόνους µικροοργανισµούς, χαρακτηρίζεται από αιφνίδια έναρξη µε την εµφάνιση υψηλού πυρετού, καρδιακού φυσήµατος και ήχου περικαρδιακής τριβής. Στους χρήστες ναρκωτικών ουσιών η νόσος συνήθως εντοπίζεται δεξιά, η θνητότητα είναι χαµηλή και η πλειονότητα των ασθενών δεν αναφέρει ιστορικό βαλβιδοπάθειας. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις η ενδοκαρδίτιδα εντοπίζεται συχνότερα στις αριστερές κοιλότητες, η θνητότητα κυµαίνεται από 20 έως 44 % και προσβάλλονται κυρίως ηλικιωµένα άτοµα που στο ιστορικό τους έχει προηγηθεί βλάβη των καρδιακών βαλβίδων. Επιπλοκές εµφανίζονται αρκετά συχνά, περίπου στα 2/3 των ασθενών, και περιλαµβάνουν: συστηµατική θρόµβωση, συµφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, απόστηµα µυοκαρδίου, ανωµαλίες ηλεκτρικής αγωγιµότητας ή ρήξη των βαλβίδων 50,51. 30

31 Για τη θεραπεία της σηψαιµίας και ειδικά της ενδοκαρδίτιδας είναι απαραίτητη η άµεση και συστηµατική ενδοφλέβια χορήγηση συνδυασµού αντιβιοτικών για χρονικό διάστηµα που κυµαίνεται από δύο έως έξι εβδοµάδες Μηνιγγίτιδα Η µηνιγγίτιδα οφειλόµενη στον S.aureus αντιστοιχεί στο 1-9% όλων των περιπτώσεων µικροβιακής µηνιγγίτιδας και µπορεί να προκύψει ως επιπλοκή της µικροβιαιµίας, τοπικού τραυµατισµού µετά από χειρουργείο ή αποικισµό των καθετήρων που µπαίνουν στον υπαραχνοειδή χώρο 52,53. Αν και τα συµπτώµατα είναι παρόµοια µε τις µηνιγγίτιδες που οφείλονται σε άλλους µικροοργανισµούς, έχει παρατηρηθεί ότι είναι πιο συχνή η παρουσία ανοσοανεπάρκειας και υποκείµενων νοσηµάτων Περικαρδίτιδα Η περικαρδίτιδα µπορεί να προκληθεί είτε αιµατογενώς ή δευτεροπαθώς µετά από τραυµατισµό του θώρακα. Μπορεί επίσης να προκληθεί και ως επιπλοκή της σταφυλοκοκκικής ενδοκαρδίτιδας. Οι ασθενείς παρουσιάζουν θωρακικό πόνο, γενικευµένη καρδιακή ανεπάρκεια, ρίγος και µεσοθωρακίτιδα. Η επιβεβαίωση της διάγνωσης θα γίνει µε τη διενέργεια ακτινογραφίας θώρακα, υπερήχου καρδιάς και αξονικής τοµογραφίας, ενώ σε περιπτώσεις πυώδους περικαρδίτιδας είναι απαραίτητη η παρακέντηση και εξέταση του υγρού. Η νόσος σχετίζεται µε αυξηµένη θνητότητα και για το λόγο αυτό η έναρξη της θεραπείας πρέπει να είναι άµεση µε τη συστηµατική χορήγηση αντιβιοτικών. Η επιβεβαίωση της διάγνωσης µπορεί να οδηγήσει σε χειρουργική εξαίρεση ολόκληρου του περικαρδίου Λοιµώξεις αναπνευστικού συστήµατος Η σταφυλοκοκκική πνευµονία είναι συνήθως αποτέλεσµα εισρόφησης ή αιµατογενούς διασποράς. Η πνευµονία από εισρόφηση συναντάται συχνότερα στην κοινότητα και σε ηλικιωµένα άτοµα ως επιπλοκή ιογενούς λοίµωξης από τον ιό της γρίπης. Η πνευµονία από αιµατογενή διασπορά αποτελεί κυρίως επιπλοκή της δεξιάς ενδοκαρδίτιδας λόγω εµβολισµού από αλλοιώσεις του τοιχώµατος των γλωχίνων των βαλβίδων, οδηγώντας σε πνευµονικά έµφρακτα. Η ακτινολογική εικόνα συνδυάζεται συχνά µε περιοχές πυκνώσεως και αεριοβρογχογράµµατα. Σχετικά συχνός είναι και ο 31

32 σχηµατισµός κοιλότητας. Και στις δύο περιπτώσεις µπορεί να έχουµε την εµφάνιση τοπικών επιπλοκών (πλευριτικό εµπύηµα, απόστηµα του πνεύµονα) και την πρόκληση δευτεροπαθούς βακτηριαιµίας 56,57. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες στις ΗΠΑ έχουν αυξηθεί σηµαντικά οι περιπτώσεις πνευµονίας οφειλόµενες στον ανθεκτικό στη µεθικιλλίνη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο. Ο MRSA ευθύνεται για το 20-40% των πνευµονιών τόσο των ενδονοσοκοµειακών όσο και των σχετιζόµενων µε τη χρήση αναπνευστήρα. Πρόσφατα βρέθηκε ως αίτιο πνευµονίας και ο ανθεκτικός στη µεθικιλλίνη σταφυλόκοκκος της κοινότητας (CA-MRSA) Λοιµώξεις µυοσκελετικού συστήµατος Α) Οστεοµυελίτιδα Ο S.aureus είναι η κύρια αιτία οστεοµυελίτιδας σε όλες τις ηλικίες µε εξαίρεση τη νεογνική 59. Η οστεοµυελίτιδα από τον S.aureus προέρχεται είτε ως επιπλοκή τοπικής φλεγµονής του οστού είτε αιµατογενώς. Στη δεύτερη περίπτωση προσβάλλει συχνότερα τα αγόρια 3-10 ετών και εντοπίζεται κυρίως στις µεταφύσεις των µεγάλων οστών (µηριαίο, κνήµη, βραχιόνιο), ενώ στους ενήλικες η πάθηση εντοπίζεται συχνότερα στη σπονδυλική στήλη µε ποσοστό πάνω από 60% και εµφανίζεται µετά από ουρολοιµώξεις και επεµβάσεις στον προστάτη 60. Η οστεοµυελίτιδα έχει αιφνίδια έναρξη µε πυρετό, ρίγος, εµέτους και µε συµπτώµατα που αφορούν τη µετάφυση του οστού, όπως πόνος, ερυθρότητα, οίδηµα και µεγάλη ευαισθησία κατά την ψηλάφηση. Η µαγνητική τοµογραφία και το σπινθηρογράφηµα µε φωσφονικό 99m Tc αποτελούν τις εξετάσεις εκλογής για τη διάγνωση. Η πρόγνωση εφόσον η διάγνωση γίνει έγκαιρα, είναι πολύ καλή (ποσοστό ίασης 90%) 59. Β) Σηπτική αρθρίτιδα Ο S.aureus αποτελεί το κυρίαρχο αίτιο σηπτικής αρθρίτιδας στην προεφηβική ηλικία. Στους ενήλικες εµφανίζεται περιστασιακά µετά από σηψαιµία ή ρευµατοειδή αρθρίτιδα. Η νόσος εντοπίζεται συχνότερα στις αρθρώσεις του γόνατος, του ισχίου, του ώµου, του αγκώνα και στις µεσοφαλαγγικές. Κατά την κλινική εξέταση η άρθρωση εµφανίζεται θερµή, διογκωµένη και επώδυνη κατά την ψηλάφηση και την κίνηση. Η διάγνωση θα επιβεβαιωθεί µε την παρακέντηση της άρθρωσης και την καλλιέργεια του 32

33 πυώδους υγρού. Με την κατάλληλη αντιβιοτική αγωγή η πρόγνωση της νόσου είναι παρόµοια της οστεοµυελίτιδας 11. Γ) Πυοµυοσίτιδα Είναι πυώδης λοίµωξη των σκελετικών µυών που συνήθως προκαλείται µετά από τραύµα και συναντάται συχνότερα σε τροπικά κλίµατα ή σε µετανάστες από τροπικές περιοχές. Εµφανίζεται πυρετός και οι µύες είναι διογκωµένοι και ιδιαίτερα επώδυνοι. Για τη θεραπεία χρειάζεται χειρουργική παροχέτευση των βλαβών και χορήγηση κατάλληλης αντιµικροβιακής αγωγής Τροφική δηλητηρίαση (Staphylococcal food poisoning) Η σταφυλοκοκκική τροφική δηλητηρίαση οφείλεται στην κατανάλωση τροφίµων που έχουν µολυνθεί µε εντεροτοξινογόνα στελέχη S.aureus. Από τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους µόνο ο S.intermedius έχει ενοχοποιηθεί για την πρόκληση επιδηµίας 62. Στις τροφές που έχουν ενοχοποιηθεί περιλαµβάνονται οι πατατοσαλάτες, τα παγωτά, οι τούρτες, τα είδη αρτοποιείου, οι κονσέρβες και τα επεξεργασµένα γεύµατα. Η δηλητηρίαση αυτή που οφείλεται µόνο στις εντεροτοξίνες και όχι στον σταφυλόκοκκο, χαρακτηρίζεται από ναυτία, εµέτους κεντρικής αιτιολογίας και διάρροια που εµφανίζονται λίγες ώρες (2-6) µετά τη λήψη της µολυσµένης τροφής. Χαρακτηριστική είναι η απουσία πυρετού και νευρολογικών συµπτωµάτων. Η ανάρρωση είναι πλήρης µετά από 24 ώρες χωρίς να είναι απαραίτητη η χορήγηση αντιβιοτικών και σπάνια η νόσος καταλήγει στο θάνατο. H συχνότητα εµφάνισης δεν είναι γνωστή, αλλά πιθανολογείται ότι είναι η πιο συχνή αιτία τροφικών δηλητηριάσεων στις ΗΠΑ 8, Σταφυλοκοκκικό σύνδροµο αποκολλήσεως της επιδερµίδας ή σύνδροµο ζεµατισµένου δέρµατος (Staphylococcal Scalded Skin Syndrome- SSSS) Η περιγραφή του συνδρόµου έγινε για πρώτη φορά το 1878 από τον Ritter σε παιδιά µε την παρουσία µεγάλων ποµφολύγων και την αποκόλληση εκτεταµένων περιοχών της επιδερµίδας 63. Το 1956 ο Lyell και ο Lang ανέφεραν την εµφάνιση τοξικής επιδερµικής νεκρόλυσης σε ενήλικες µε 33

34 παρόµοια συµπτωµατολογία. To 1970 οι Melish και Glasgow ανακάλυψαν την επιδερµολυτική τοξίνη ως αιτιολογικό παράγοντα 64. Είναι µια νόσος που αφορά κυρίως νεογέννητα και παιδιά, αν και έχουν αναφερθεί περιπτώσεις και σε ενήλικες µε σοβαρές υποκείµενες παθήσεις. Η µεγαλύτερη επίπτωση του συνδρόµου στα παιδιά έχει αποδοθεί στην έλλειψη προστατευτικών αντισωµάτων έναντι των τοξινών και στην µειωµένη νεφρική λειτουργία. Η θνητότητα στα παιδιά κυµαίνεται από 1-5%, ενώ στους ενήλικες φτάνει το 60% 65,66. Η κλινική εικόνα του συνδρόµου µπορεί να ποικίλλει από την εµφάνιση τοπικά φυσαλίδων µέχρι και τη σοβαρή αποφολίδωση πάνω από το 90% της επιδερµίδας (εικόνα ζεµατισµένου δέρµατος). Η βαρύτητα της κλινικής εκδήλωσης εξαρτάται από την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή και κυρίως από την παραγωγή αντισωµάτων έναντι των τοξινών. Η έναρξη του συνδρόµου γίνεται µε την εµφάνιση επώδυνου κηλιδώδους εξανθήµατος γύρω από το πρόσωπο που σταδιακά επεκτείνεται σε ολόκληρο το σώµα και συνοδεύεται από πυρετό, C. Όταν το δέρµα τρίβεται ελαφρά, η επιδερµίδα συρρικνώνεται µη αντιστρεπτά, δίνοντας το χαρακτηριστικό σηµείο Nikolsky. Το διάστηµα από την προσβολή µέχρι την ίαση είναι 7 µε 10 µέρες. εν µένουν µόνιµα σηµάδια στο δέρµα καθώς η αποφολίδωση είναι επιφανειακή και οι τοξίνες, αυτές καθ αυτές, δεν είναι θανατηφόρες. Το µικρόβιο συνήθως αποµονώνεται από το ρινοφάρυγγα και το δέρµα και σε σπάνιες περιπτώσεις από το αίµα. Στις µέρες µας υπάρχει η δυνατότητα της απευθείας ανίχνευσης της τοξίνης από τα στελέχη S.aureus µε την εφαρµογή µεθόδων PCR, Elisa και συγκολλητινοαντιδράσεων µε µεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία 67,68, Σύνδροµο τοξικής καταπληξίας (Toxic Shock Syndrome-TSS) Το σύνδροµο περιγράφτηκε για πρώτη φορά από τον Todd το 1978 σε µια οµάδα 7 κοριτσιών ηλικίας 8-17 χρονών τα οποία εµφάνισαν υψηλό πυρετό, υπόταση, έντονη διάρροια, ερυθηµατώδες εξάνθηµα, νοητική σύγχυση και νεφρική ανεπάρκεια 70. Στις αρχές της δεκαετίας το 80 στις ΗΠΑ, παρόµοια συµπτώµατα εµφάνισαν νέες γυναίκες που έκαναν χρήση ταµπόν (υψηλής απορροφητικότητας) κατά την έµµηνο ρύση 71. Το

35 προσδιορίστηκε η τοξίνη TSST-1 ως αιτιολογικός παράγοντας. O S.aureus αποµονώθηκε από καλλιέργειες κολπικού εκκρίµατος στο 98% των περιπτώσεων του συνδρόµου που εµφανιζόταν κατά την έµµηνο ρύση, σε αντίθεση µε το δείγµα ελέγχου υγιών ατόµων που δεν ξεπέρασε το 10% 72. Έχουν παρατηρηθεί δύο κλινικές µορφές του συνδρόµου: Α) Η εµµηνορρυσιακή µορφή που σχετίζεται µε τη χρήση ταµπόν κατά τη διάρκεια της εµµήνου ρύσεως και οφείλεται αποκλειστικά στη δράση της τοξίνης TSST-1 η οποία έχει την ικανότητα να διαπερνά τους βλεννογόνους. Η ύπαρξη των ταµπόν δηµιουργεί στον κόλπο συνθήκες που ευνοούν την παραγωγή της TSST-1 (ουδέτερο ph, αυξηµένα επίπεδα Ο 2, CO 2 και πρωτεϊνών). Η TSST-1, όπως αναφέρθηκε, ανήκει στην κατηγορία των υπεραντιγόνων και τα συµπτώµατα οφείλονται είτε στην απευθείας δράση της στους βλεννογόνους είτε από τη δράση των µεσολαβητών που απελευθερώνει (ιντερλευκίνες, παράγοντας ιστικής νέκρωσης). Β) Η µη-εµµηνορρυσιακή µορφή που έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς µετά από: επιµολύνσεις χειρουργικών τραυµάτων, µεταγριπική πνευµονία από S.aureus, εγκαύµατα, ατοπική δερµατίτιδα και χρήση αντισυλληπτικού διαφράγµατος. Σε σπάνιες περιπτώσεις η µορφή αυτή έχει συσχετιστεί µε τη γέννηση (συνήθως προηγείται από την ενδοµητρίτιδα) και την παρουσία ξένων σωµάτων στη µήτρα και το ρινικό βλεννογόνο. Στην παθογένεια εκτός από την TSST-1 που συναντάται στο 50% των περιπτώσεων εµπλέκονται και οι εντεροτοξίνες SEΒ, SEC, SEG, SEI. O S.aureus αποµονώνεται από το δέρµα, τα οστά, τους πνεύµονες και τα κόπρανα, ενώ οι καλλιέργειες αίµατος και ΕΝΥ είναι συνήθως αρνητικές 8, 73, 74, 75. Σε ανασκόπηση 5296 περιπτώσεων και των δύο µορφών, που έγινε στις ΗΠΑ από το CDC κατά την περίοδο βρέθηκε ότι το σύνδροµο στη συντριπτική πλειοψηφία προσβάλλει νεαρές γυναίκες της λευκής φυλής. Η θνητότητα ήταν 3% για την εµµηνορρυσιακή µορφή και 5% για την µηεµµηνορρυσιακή. Η αναγνώριση των ταµπόν ως αιτιολογικού παράγοντα οδήγησε στη σταδιακή ελάττωση της επίπτωσης αυτής της µορφής (91% των περιπτώσεων την περίοδο και 59% την περίοδο )

36 Κριτήρια διάγνωσης συνδρόµου τοξικής καταπληξίας 77 Η διάγνωση του συνδρόµου είναι πιθανή, όταν συνυπάρχουν 5 από τα 6 κριτήρια και επιβεβαιωµένη µε την παρουσία και των 6 κριτηρίων. 1) Πυρετός µε θερµοκρασία >38,9 o C 2) ιάχυτη κηλιδώδης ερυθροδερµία 3) Απολέπιση που εµφανίζεται 1-2 εβδοµάδες µετά την έναρξη των συµπτωµάτων και εντοπίζεται στις παλάµες και τα πέλµατα 4) Υπόταση (συστολική πίεση < 90mm Hg) 5) Συµµετοχή τριών ή περισσοτέρων από τα παρακάτω συστήµατα: Γαστρεντερικό : εµετός και διάρροια κατά την έναρξη Μυϊκό : έντονη µυαλγία και διπλάσια αύξηση της CPK Βλεννογόνοι: Υπεραιµία κόλπου, φάρυγγα και επιπεφυκότων Νεφροί : Ουρία ή κρεατινίνη διπλάσια του φυσιολογικού µε συνοδό πυουρία Ήπαρ : Αύξηση ολικής χολερυθρίνης και ηπατικών ενζύµων (2Χ) Αίµα : Θροµβοπενία (<100,000/mm 3 ) ΚΝΣ : Αποπροσανατολισµός ή διαταραχές του επιπέδου συνείδησης χωρίς εστιακή νευρολογική συµπτωµατολογία όταν δεν υπάρχει πυρετός και υπόταση. 6) Αρνητικές ορολογικές δοκιµασίες για πυρετό Βραχωδών Ορέων, λεπτοσπείρωση και ερυθρά. Καλλιέργειες ΕΝΥ, αίµατος και φαρυγγικού επιχρίσµατος αρνητικές (εξαιρείται ο S.aureus). 36

37 3.2 Λοιµώξεις από πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους (CoNS) Οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι και κυρίως ο S.epidermidis, αποτελούν στις µέρες µας κύρια νοσοκοµειακά παθογόνα µικρόβια. Η σηµασία της κλινικής αξιολόγησης των CoNS είναι καθοριστική καθώς αποτελούν µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρωπίνου σώµατος. Από τα στοιχεία του Προγράµµατος Επιτήρησης Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων (NNIS) στις ΗΠΑ, από τον Ιανουάριο του 1990 µέχρι το Μάιο του 1999 προκύπτει ότι οι CoNS αποτελούν τα συχνότερα µικρόβια (37,3%) που αποµονώνονται από ασθενείς µονάδων εντατικής θεραπείας 78. Οι λοιµώξεις σχετίζονται µε ιατρικά προσθετικά υλικά και αφορούν κυρίως ασθενείς που υπόκεινται σε θεραπεία µε ανοσοκατασταλτικά φάρµακα, βαρέως πάσχοντες ασθενείς µονάδων εντατικής θεραπείας και ασθενείς που υφίστανται µεταµόσχευση 79. Σηµαντικό ρόλο στην παθογένεση των λοιµώξεων µε προσθετικά υλικά παίζει η ικανότητα των στελεχών CoNS να σχηµατίζουν βιοµεµβράνες. Η θεραπευτική αντιµετώπιση των λοιµώξεων αυτών καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη καθώς µέσα στο στρώµα της βιοµεµβράνης δεν µπορούν να εισέλθουν τα αντιµικροβιακά φάρµακα και τα φαγοκύτταρα. 1. Ουρολοιµώξεις O S.saprophyticus αποτελεί συχνό αίτιο λοιµώξεων τόσο του ανώτερου όσο και του κατώτερου ουροποιητικού συστήµατος, κυρίως σε νέες γυναίκες (16-35 ετών), σεξουαλικά δραστήριες. Σε αρκετές έρευνες έχει βρεθεί να είναι το δεύτερο πιο συχνό αίτιο ουρολοιµώξεων της κοινότητας µετά την Esherichia Coli σε γυναίκες ασθενείς µε ποσοστά που κυµαίνονται από 11-32% 80. Μελέτες in vitro έδειξαν ότι ο S.saprophyticus προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα της ουρήθρας και των άλλων τµηµάτων του ουροποιητικού συστήµατος σε πολύ µεγαλύτερους αριθµούς από ότι άλλα είδη σταφυλόκοκκων, ενώ δεν προσκολλάται σε άλλες ανατοµικές επιφάνειες, όπως τα κύτταρα της επιδερµίδας ή τα επιθηλιακά κύτταρα άλλων συστηµάτων 81. Οι ουρολοιµώξεις αυτές εµφανίζουν εποχική κατανοµή κατά το καλοκαίρι και φθινόπωρο. Στο 90% των περιπτώσεων είναι συµπτωµατικές µε τη εµφάνιση δυσουρίας, αιµατουρίας, χαµηλής πυρετικής κίνησης και 37

38 υπερηβικού άλγους. Οι πιο σοβαρές επιπλοκές είναι η οξεία πυελονεφρίτιδα, η σηψαιµία, η νεφρολιθίαση και η ενδοκαρδίτιδα. Τα συνήθως χρησιµοποιούµενα αντιβιοτικά είναι αποτελεσµατικά στη θεραπευτική αντιµετώπιση αυτών των ουρολοιµώξεων. Θεραπευτική αποτυχία έχει αναφερθεί µε τις σουλφοναµίδες και τη νιτροφουραντοϊνη και ενδογενής αντοχή στη νοβοβιοκίνη. Οι υποτροπές είναι σπάνιες, αλλά η λοίµωξη µπορεί να επανεµφανιστεί σε ποσοστό 10% των ασθενών 80,82. Οι υπόλοιποι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούν σπάνια αίτια ουρολοιµώξεων, µε τον S.epidermidis να αντιπροσωπεύει το 80-90% αυτών των περιπτώσεων. Πυουρία εµφανίζεται συνήθως µόνο στο 10% των ασθενών. Οι λοιµώξεις αυτές εµφανίζονται συχνότερα σε ηλικιωµένους και ενδονοσοκοµειακούς ασθενείς που έχουν επιπλοκές από το ουροποιητικό σύστηµα (µεταµόσχευση νεφρού, ουροκαθετήρα, ουρολιθίαση, πρόσφατη χειρουργική επέµβαση) 83, Οστεοµυελίτιδα Οι περισσότερες αναφορές που επιχειρούν να ενοχοποιήσουν τον S.epidermidis ως κύρια αιτία χρόνιας οστεοµυελίτιδας δεν είναι πειστικές. Ωστόσο υπάρχουν τρεις λοιµώξεις στις οποίες ο S.epidermidis είναι αίτιο λοιµώξεων των οστών. Αυτές είναι: α) Η στερνική οστεοµυελίτιδα λόγω µόλυνσης του τραύµατος της µέσης στερνοτοµής µετά από καρδιοχειρουργική επέµβαση 85. β) Η µόλυνση του οστού που περιβάλλει µια προσθετική άρθρωση γ) Η αιµατογενής οστεοµυελίτιδα µετά από µόλυνση των τεχνητών διόδων αιµοδιύλησης ή άλλων προσθετικών συσκευών Ενδοκαρδίτιδα φυσικών καρδιακών βαλβίδων Οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι είναι σπάνια αίτια ενδοκαρδίτιδας των φυσικών καρδιακών βαλβίδων, αποτελώντας το 5% όλων των περιπτώσεων 87. Η ενδοκαρδίτιδα αναπτύσσεται µετά από προσβολή των βαλβίδων από τα βακτήρια κατά τη διάρκεια παροδικής µικροβιαιµίας. Πάνω από το 50% αυτών των ασθενών εµφανίζουν επιπλοκές, όπως συµφορητική καρδιακή ανεπάρκεια και εµβολές. Στις µισές περίπου περιπτώσεις αιτιολογικός παράγοντας είναι ο S.epidermidis. Έχει αναφερθεί ότι ο 38

39 S.lugdunensis προκαλεί ασυνήθιστα σοβαρή ενδοκαρδίτιδα που οδηγεί σε µαζική καταστροφή των βαλβίδων Ενδοκαρδίτιδα προσθετικών βαλβίδων Σε αντίθεση µε την ενδοκαρδίτιδα των φυσικών βαλβίδων, στη λοίµωξη των προσθετικών βαλβίδων οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούν τον πιο συχνό αιτιολογικό παράγοντα. Ο S.epidermidis είναι το είδος που αποµονώνεται πιο συχνά. Οι περισσότερες από αυτές τις λοιµώξεις οφείλονται στον ενοφθαλµισµό µικρού αριθµού µικροοργανισµών κατά τη στιγµή τοποθέτησης της βαλβίδας. Για το λόγο αυτό τα συµπτώµατα της ενδοκαρδίτιδας εµφανίζονται σταδιακά κατά την περίοδο αρκετών µηνών 89, 90. Οι ασθενείς συνήθως εµφανίζουν πυρετό και σηµεία δυσλειτουργίας των βαλβίδων. Η διάγνωση δεν είναι εύκολη και βασίζεται σε µεγάλο βαθµό στην εγρήγορση του κλινικού ιατρού. Οι συνήθεις επιπλοκές είναι η καρδιακή ανεπάρκεια, το αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, τα ενδοκαρδιακά αποστήµατα και η επίµονη βακτηριαιµία 91. Μαζί µε τις προσθετικές βαλβίδες οι σταφυλόκοκκοι µπορεί να επιµολύνουν καλώδια από βηµατοδότες και αγγειακά µοσχεύµατα Λοιµώξεις ενδαγγειακών καθετήρων Ο S.epidermidis είναι ο µικροοργανισµός που αποµονώνεται συχνότερα στις ηµιποσοτικές καλλιέργειες καθετήρων 93. Όλοι οι τύποι καθετήρων (περιφερικών και κεντρικών γραµµών, υποκλείδιοι καθετήρες αιµοδιύλισης, καθετήρες Hickman, Broviac, Swan-Ganz) µπορεί να επιµολυνθούν και να αποτελέσουν την πηγή της µικροβιαιµίας 94. Τόσο οι λοιµώξεις των καθετήρων όσο και των υπολοίπων εµφυτεύσιµων βιοϊατρικών υλικών σχετίζονται µε το σχηµατισµό βιοµεµβράνης (biofilm). Εντός της βιοµεµβράνης αναπτύσσονται άριστες συνθήκες διαβίωσης των κυττάρων, δεδοµένου ότι δηµιουργούνται δίοδοι µεταφοράς θρεπτικών ουσιών, ενώ τα κύτταρα προστατεύονται από τους αµυντικούς µηχανισµούς του ξενιστή και τη δράση των αντιβιοτικών 95,96. Η κλινική εικόνα της ενδονοσοκοµειακής λοίµωξης, που έχει σχέση µε τη χρήση ενδαγγειακών καθετήρων, εκδηλώνεται ως τοπική φλεγµονή, φλεβίτιδα, πυώδης θροµβοφλεβίτιδα ή ως γενικευµένη λοίµωξη, µικροβιαιµία, 39

40 ενδοκαρδίτιδα και σήψη. Η διάγνωση συχνά είναι δύσκολη, ειδικά όταν δεν υπάρχουν σηµεία φλεγµονής στο σηµείο τοποθέτησης του καθετήρα. Η λήψη αιµοκαλλιεργειών τόσο από το άκρο του καθετήρα όσο και από περιφερική φλέβα σε συνδυασµό µε την καλλιέργεια του καθετήρα βοηθούν στην επιβεβαίωση της λοίµωξης. Αν και η προσεκτική παρακολούθηση των καθετήρων είναι δυνατόν να ελαττώσει τη συχνότητα των επεισοδίων µικροβιαιµίας, καλύτερα αποτελέσµατα επιτυγχάνονται µε την τοποθέτηση καθετήρων εµβαπτισµένων µε αντιβιοτικά (ριφαµπικίνη ή µινοκυκλίνη) 97.Η θεραπεία περιλαµβάνει την αφαίρεση του καθετήρα, όταν αυτή είναι δυνατή µαζί µε συστηµατική αντιµικροβιακή αγωγή. 6. Λοιµώξεις αναστοµώσεων εγκεφαλονωτιαίου υγρού O S.epidermidis αποτελεί το συχνότερο αίτιο λοίµωξης των αναστοµώσεων του ΕΝΥ. Αυτές οι λοιµώξεις συνήθως εµφανίζονται λίγες εβδοµάδες µετά την τοποθέτηση της αναστόµωσης. Κλινικά µπορεί να εµφανιστούν σηµεία µηνιγγιτισµού, αν και τις περισσότερες φορές οι ασθενείς εµφανίζουν χαµηλή πυρετική κίνηση, δυσλειτουργία της αναστόµωσης και αυξηµένη ενδοκρανιακή πίεση. Η εξέταση του ΕΝΥ δείχνει µέτρια αύξηση του αριθµού των κυττάρων, ενώ τα επίπεδα γλυκόζης µπορεί να είναι φυσιολογικά ή ελαφρώς χαµηλά 98. Η αποµάκρυνση της αναστόµωσης είναι συνήθως απαραίτητη για τη θεραπεία της λοίµωξης αν και έχουν αναφερθεί περιπτώσεις όπου η χορήγηση µόνο αντιµικροβιακής αγωγής ήταν αρκετή 99. Φάρµακα εκλογής είναι η βανκοµυκίνη ή η ριφαµπικίνη σε συνδυασµό µε αµινογλυκοσίδη. Η χορήγηση προφυλακτικής χηµειοθεραπείας κατά τη στιγµή τοποθέτησης της αναστόµωσης δεν έχει αποδειχτεί χρήσιµη ως προφυλακτικό µέσο Περιτονίτιδα από λοιµώξεις καθετήρων περιτοναϊκής διύλισης Η περιτονίτιδα αποτελεί την πιο σοβαρή επιπλοκή των ασθενών που υπόκεινται σε περιτοναϊκή διύλιση. Οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούν τη συχνότερη αιτία, µε τον S.epidermidis να είναι το είδος που αποµονώνεται σε µεγαλύτερη αναλογία. Η περιτονίτιδα χαρακτηρίζεται κλινικά από την εµφάνιση πόνου, ναυτίας, εµετού, πυρετού και την παρουσία 40

41 θολερότητας στο περιτοναϊκό υγρό, αν και αρκετοί ασθενείς δεν εµφανίζουν καθόλου συµπτώµατα. Η διάγνωση θα επιβεβαιωθεί µε την µικροσκοπική εξέταση (>100 πυοσφαίρια/mm 3 ) και την καλλιέργεια του υγρού 101, Λοιµώξεις αγγειακών µοσχευµάτων Οι περισσότερες λοιµώξεις αγγειακών µοσχευµάτων οφείλονται στον S.epidermidis. Τα µοσχεύµατα αποικίζονται µε µικρό αριθµό µικροβίων κατά τη στιγµή της τοποθέτησης τους και για το λόγο αυτό οι λοιµώξεις αυτές γίνονται κλινικά αντιληπτές µήνες ή και χρόνια µετά την τοποθέτηση τους.τις περισσότερες φορές είναι απαραίτητη η αντικατάσταση του µοσχεύµατος σε συνδυασµό µε την κατάλληλη αντισταφυλοκοκκική αγωγή 103, Μικροβιαιµία Οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούν την πιο συχνή αιτία νοσοκοµειακής βακτηριαιµίας ειδικά σε κλινικές, όπου η χρήση των ενδοφλεβίων ενδαγγειακών καθετήρων είναι συχνή. Επειδή όµως είναι αποικιστές του ανθρωπίνου δέρµατος η αποµόνωση τους από τις αιµοκαλλιέργειες µπορεί να σηµαίνει είτε πραγµατική βακτηριαιµία, είτε επιµόλυνση κατά τη διάρκεια συλλογής του δείγµατος. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η αντισηψία του δέρµατος και η λήψη επανειληµµένων αιµοκαλλιεργειών για τη σωστή αξιολόγηση του αποτελέσµατος της 105. Στα περισσότερα ιατρικά κέντρα ο S.epidermidis αποτελεί το πιο συχνό αίτιο µικροβιαιµίας ειδικά σε ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς και σε µονάδες εντατικής θεραπείας νεογνών. Στα νεογνά οι λοιµώξεις σχετίζονται µε την ύπαρξη µηχανικής υποστήριξης της αναπνοής, την παρεντερική διατροφή, την παρουσία καθετήρων και την πρόωρη γέννηση 106. Η θνητότητα στις διάφορες έρευνες κυµαίνεται από 4,9-28% και η αντίσταση στη µεθικιλλίνη ξεπερνά το 60% 107,108, Άλλες λοιµώξεις Οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι έχουν αναφερθεί ως αιτιολογικοί παράγοντες δερµατικών λοιµώξεων (κύστεων, δοθιηνώσεων, ψευδάνθρακα) µόνοι τους ή σε συνδυασµό µε άλλα πυογόνα µικρόβια. Ο S. epidermidis έχει αναφερθεί ως αίτιο της κακοήθους εξωτερικής ωτίτιδας 110. Αποτελούν επίσης 41

42 το συχνότερο αίτιο ενδοφθαλµίτιδας µετά από εγχειρήσεις καταρράκτη και τοποθέτησης φακών. Έχουν επίσης αναφερθεί περιπτώσεις βλεφαρίτιδας, πυώδους επιπεφυκίτιδας και κερατίτιδας τόσο από τον S.epidermidis όσο και από άλλα είδη (S.warneri, S.capitis, S. hominis, S.simulans, S.lugdunensis και S.xylosys) 111. Εικόνα 1. Σχηµατική αναπαράσταση της κατανοµής των σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων (αναπαραγωγή από Foster 2002) 42

43 4. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΙΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Στην καθηµερινή ρουτίνα του µικροβιολογικού εργαστηρίου η ταυτοποίηση των σταφυλόκοκκων ακολουθεί το εξής σχήµα: ΧΡΩΣΗ GRAM GRAM (+) ΚΟΚΚΟΣ ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΘΕΤΙΚΗ ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΣΤΡΕΠΤΟΚΟΚΚΟΣ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΟΣ ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΠΗΚΤΑΣΗΣ (+) (-) ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΟΣ ΧΡΥΣΙΖΩΝ ΠΗΚΤΑΣΗ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΟΣ 4.1 Καλλιέργεια-Μικροσκοπική εξέταση Για την αποµόνωση των σταφυλόκοκκων το δείγµα ενοφθαλµίζεται στα κατάλληλα θρεπτικά υλικά που περιλαµβάνουν οπωσδήποτε το αιµατούχο άγαρ. Στην περίπτωση δειγµάτων επιµολυσµένων και µε άλλους µικροοργανισµούς µπορεί να χρησιµοποιηθεί το Columbia άγαρ µε κολιστίνη και ναλιδιξικό οξύ (CNA) ή το φαινυλαιθυλ-αλκοολούχο άγαρ (PEA), υλικά που αναστέλλουν την ανάπτυξη των Gram αρνητικών µικροβίων. Το 43

44 αλατούχο µε µανιτόλη άγαρ κατά Chapman αποτελεί ένα εκλεκτικό θρεπτικό υλικό χρήσιµο για την αποµόνωση του χρυσίζοντος σταφυλοκόκκου κατά τον έλεγχο της ρινικής φορείας. Στο αιµατούχο άγαρ τα περισσότερα είδη σταφυλόκοκκων αναπτύσσονται σε 24 ώρες. Ορισµένα είδη όπως ο S.lentus, S.auricularis, S.caseoluticus και S.saccharoluticus µπορεί να χρειαστούν περαιτέρω επώαση για την εµφάνιση των αποικιών τους. Με τη Gram χρώση διαπιστώνουµε ότι πρόκειται για Gram θετικούς κόκκους που διατάσσονται άτακτα σε µικρές οµάδες σαν τσαµπιά σταφυλιού ή σε σειρά από τέσσερις το πολύ κόκκους. Οι αποικίες των περισσοτέρων ειδών σταφυλόκοκκου είναι λείες, κυρτές, ελαφρώς υπερυψωµένες µε χροιά που ποικίλλει ανάλογα µε το είδος. Σε περιπτώσεις ασθενών που λαµβάνουν για µεγάλο χρονικό διάστηµα αντιµικροβιακή χηµειοθεραπεία ή έχουν σοβαρές υποκείµενες παθήσεις (π.χ κυστική ίνωση) οι αποικίες του S.aureus που αποµονώνονται είναι µικρές µε άτυπη µορφολογία. Οι αποικίες αυτές είναι γνωστές ως παραλλαγές µικρών αποικιών (small colony variants) και αναπτύσσονται καλύτερα µε την παρουσία CO Ταυτοποίηση οκιµασία καταλάσης Το ένζυµο καταλάση βρίσκεται σε όλα σχεδόν τα αερόβια και δυνητικά αναερόβια βακτήρια που έχουν κυτοχρώµατα. Συνήθως τα βακτήρια τα οποία δεν έχουν κυτοχρώµατα δεν παράγουν καταλάση, όπως τα είδη του γένους Streptococcus. Η δοκιµασία της καταλάσης αποτελεί την κυριότερη µέθοδο διαχωρισµού του γένους Micrococcaceae από εκείνο των Streptococcaceae. Η δοκιµασία ανιχνεύει την παρουσία ενζύµων οξειδάσης του κυτοχρώµατος. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου σχηµατίζεται ως τελικό προϊόν της αεροβίου διάσπασης των σακχάρων. Πρέπει να αποφεύγεται η εκτέλεσή της στο αιµατούχο άγαρ, καθώς τα ερυθροκύτταρα έχουν την ιδιότητα να δίνουν θετική την αντίδραση 112. Με µικροβιολογικό κρίκο παραλαµβάνεται µια αποικία από το τρυβλίο και µεταφέρεται σε αντικειµενοφόρο πλάκα. Με πιπέτα Pasteur τοποθετείται στην αποικία µια σταγόνα διαλύµατος 3% υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ). Η εµφάνιση φυσαλίδων από τη διάσπαση του Η 2 Ο 2 σηµαίνει ότι το 44

45 στέλεχος παράγει καταλάση (θετική δοκιµασία). Τα είδη S.saccharolyticus και S.aureus subsp. anaerobius δίνουν την αντίδραση αρνητική οκιµασία πηκτάσης Η πιο χαρακτηριστική και αξιόπιστη δοκιµασία ταυτοποίησης του S.aureus είναι η δοκιµασία πηκτάσης. Υπάρχουν δύο διαφορετικές µέθοδοι για την διαπίστωση της ικανότητας παραγωγής πηκτάσης: η δοκιµασία του σωληναρίου (tube test) για την ελεύθερη πηκτάση και η δοκιµασία σε αντικειµενοφόρο πλάκα (slide test) για την συνδεδεµένη. To πλάσµα που συνιστάται και για τις δύο µεθόδους είναι αυτό του κουνελιού µε EDTA, ενώ πρέπει να αποφεύγεται το πλάσµα µε κιτρικά. Το ανθρώπινο πλάσµα περιέχει αντισταφυλοκκοκικά αντισώµατα και ποσότητες CRF και µπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσµατα 1,8. οκιµασία σωληναρίου (tube test) Η πηκτάση που ανιχνεύεται µε αυτή τη µέθοδο εκκρίνεται εξωκυτταρίως και αντιδρά µε τον παράγοντα CRF του πλάσµατος, για να σχηµατίσουν ένα σύµπλεγµα το οποίο µε τη σειρά του αντιδρά µε το ινωδογόνο και σχηµατίζουν την ινική. Η δοκιµασία του σωληναρίου γίνεται µε την προσθήκη 0,1ml καλλιέργειας του σταφυλοκόκκου σε ΒΗΙΑ ζωµό, σε 0,5ml πλάσµατος κουνελιού ή ανθρώπου αραιωµένου 1:10. Ακολουθεί επώαση του µίγµατος στους 37 ο C και αξιολόγηση µετά από 4 ώρες. Η δοκιµασία θεωρείται θετική όταν το πλάσµα µετατραπεί σε άκαµπτο gel και αρνητική όταν παραµείνει σε υγρή µορφή (8). Συνιστάται να γίνεται νέα εκτίµηση µετά ώρες, όταν η δοκιµασία είναι αρνητική στις 4 ώρες, γιατί ορισµένα στελέχη παράγουν ινιδωγονολυσίνη µετά παρατεταµένη επώαση στους 37 ο C προκαλώντας λύση του θρόµβου 113. Η δοκιµασία του σωληναρίου θεωρείται η µέθοδος αναφοράς για την ταυτοποίηση του S.aureus. Αν και σχεδόν πάντα γίνεται µε στελέχη προερχόµενα από στερεά θρεπτικά υλικά, έχουν προταθεί και ταχείες µέθοδοι αξιολόγησης στελεχών από ζωµό αιµοκαλλιεργειών µε ικανοποιητικά ποσοστά ευαισθησίας και ειδικότητας

46 οκιµασία σε αντικειµενοφόρο πλάκα (slide test) Η δοκιµασία γίνεται σε αντικειµενοφόρο πλάκα µε την προσθήκη µιας σταγόνας πλάσµατος σε πυκνό εναιώρηµα της υπό εξέταση αποικίας, οπότε εντός 30 δευτερολέπτων παρατηρείται συγκόλληση των σταφυλόκοκκων. Η δοκιµασία δεν πρέπει να εκτελείται σε αποικίες προερχόµενες από θρεπτικό υλικό µε υψηλή περιεκτικότητα σε αλάτι (π.χ άγαρ µαννιτόλης), γιατί η υψηλή συγκέντρωση άλατος προκαλεί αυτοσυγκόλληση σε ορισµένα στελέχη S.aureus. Κάθε στέλεχος που δίνει τη δοκιµασία αυτή αρνητική πρέπει να επιβεβαιώνεται και µε τη δοκιµασία του σωληναρίου, γιατί υπάρχουν στελέχη που εµφανίζουν ελλιπή παραγωγή συνδεδεµένης και παράγουν ελεύθερη πηκτάση. Ορισµένα στελέχη των ειδών S.lugdunensis και S.schleiferi subsp schleiferi παράγουν συνδεδεµένη πηκτάση και δίνουν θετική τη δοκιµασία 115, 116. Εναλλακτικά για τον προσδιορισµό της πηκτάσης µπορούν να εφαρµοστούν η δοκιµασία παραγωγής πρωτεΐνης Α και η παθητική αιµοσυγκόλληση. Στην πρώτη δοκιµασία σωµατίδια latex επικαλυµµένα µε πλάσµα ανθρώπου που περιέχει ανοσοσφαιρίνη G και ινωδογόνο αντιδρούν µε τη συνδεδεµένη πηκτάση και την πρωτεΐνη Α, δίνοντας αντίδραση συγκολλήσεως. Στο εµπόριο κυκλοφορούν αρκετά διαθέσιµα προϊόντα (Slidex Staph, StaphAurex, Staphylase) που βασίζονται σε αυτή τη δοκιµασία, δίνοντας αποτέλεσµα γρήγορα και µε ικανοποιητικά ποσοστά ευαισθησίας και ειδικότητας. Στη δεύτερη δοκιµασία χρησιµοποιούνται ερυθρά αιµοσφαίρια προβάτου ευαισθητοποιηµένα µε ινωδογόνο για την ανίχνευση της συνδεδεµένης πηκτάσης στην επιφάνεια του S.aureus. Και για αυτή τη δοκιµασία υπάρχουν διαθέσιµα εµπορικά kits (Staphylslide, Hemastaph, Staphyloslide) τα οποία έχουν ελεγχθεί για την ευαισθησία και την ειδικότητα µε τις κλασσικές δοκιµασίες της πηκτάσης σε αρκετές µελέτες. Έχει βρεθεί η ευαισθησία να κυµαίνεται µεταξύ % και η ειδικότητα µεταξύ % 117,118,119,120. Ο διαχωρισµός του S.aureus από τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους µπορεί εναλλακτικά να γίνει και µε τις δοκιµασίες δεοξυριβονουκλεάσης (Dnase test), θερµοανθεκτικής νουκλεάσης και ζύµωσης της µαννιτόλης. 46

47 4.2.3 Ταυτοποίηση βάσει βιοχηµικών ιδιοτήτων Στις µέρες µας υπάρχουν αρκετά διαθέσιµα εµπορικά kits για την ταυτοποίηση των σταφυλόκοκκων (Rapidec Staph, API Staph-Ident, API Staph ID 32) µε βάση τις βιοχηµικές ιδιότητες τους. Το API Staph (Biomerieux) είναι ένα σύστηµα ταυτοποίησης των ειδών του γένους Staphylococcus και Micrococcus το οποίο χρησιµοποιεί ειδικές βιοχηµικές δοκιµασίες. Οι βιοχηµικές αντιδράσεις πραγµατοποιούνται σε µια ταινία µε αφυδατωµένα υποστρώµατα σε µεµονωµένες θέσεις. Εναιώρηµα του προς µελέτη Gram θετικού κόκκου (0.5 της κλίµακας McFarland) εµβολιάζεται µε σύριγγα στις ειδικές θέσεις και η ταινία επωάζεται για ώρες στους 37 0 C σε υγρή ατµόσφαιρα. Ο χαρακτηρισµός του είδους γίνεται µε βάση την απάντηση στις βιοχηµικές ιδιότητες που ελέγχονται. Με το API Staph ελέγχονται 19 βιοχηµικές ιδιότητες και η ευαισθησία της µεθόδου κυµαίνεται από 82-99% Μοριακή ταυτοποίηση Στη σηµερινή εποχή έχουν αναπτυχθεί µοριακές µέθοδοι που επιτρέπουν την γρήγορη και ακριβή ταυτοποίηση των σταφυλόκοκκων σε επίπεδο είδους 123. Η αναζήτηση του γονιδίου tuf σε στελέχη πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων έχει χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία για την ταυτοποίηση των κυριοτέρων ειδών αυτής της οικογένειας

48 5. ΘΕΡΑΠΕΙΑ-ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Πολλά αντιβιοτικά είναι δραστικά εναντίον του σταφυλόκοκκου µε διαφορετικές ιδιότητες ως προς το αντιµικροβιακό τους φάσµα, τον µηχανισµό δράσης τους και τις φαρµακοκινητικές τους ιδιότητες. Λόγω της ανάπτυξης αντοχών είναι απαραίτητη η διενέργεια της δοκιµασίας ευαισθησίας στα αντιβιοτικά, για την εφαρµογή της κατάλληλης θεραπείας. Τα προτεινόµενα προς έλεγχο αντιβιοτικά για τους σταφυλόκοκκους, σύµφωνα µε τις οδηγίες του CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) είναι τα παρακάτω 125 : Α' επιλογή : έλεγχος και υποχρεωτική αναφορά Β' επιλογή : έλεγχος και επιλεκτική αναφορά επί αντοχής στην Α επιλογή Επιπλέον σε καλλιέργειες ούρων Penicillin (10u) Cefoxitin (30µg) ή Oxacillin (1 µg) Erythromycin (15 µg) Clindamycin (2 µg) Fusidic Acid (10 µg) Sulfamethoxazole/Trimethoprim (1.25/23.75 µg) Gentamicin (10 µg) Kanamycin (30 µg) Netilmicin (30 µg) Tobramycin (10 µg) Vancomycin (30 µg) Teicoplanin (30 µg) Ciprofloxacin (5 µg) Rifampin (5 µg) Tetracycline (30 µg) Linezolid (30 µg) Quinupristin/Dalfopristin (15 µg) Norfloxacin (10 µg) Nitrofurantoin (300 µg) 48

49 5.1 Ανθεκτικότητα στην πενικιλλίνη και τα β-λακταµικά αντιβιοτικά Πριν την εµφάνιση των αντιβιοτικών η θνησιµότητα των ασθενών από λοιµώξεις µε S.aureus ξεπερνούσε το 80%. Η ανακάλυψη της φυσικής πενικιλλίνης από τον Fleming και η εισαγωγή της στην κλινική πράξη στις αρχές της δεκαετίας του 1940 βελτίωσε σηµαντικά την πρόγνωση των ασθενών µε σταφυλοκοκκικές λοιµώξεις. Οι πενικιλλίνες ανήκουν στην κατηγορία των β-λακταµικών αντιβιοτικών και δρουν αναστέλλοντας τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώµατος των µικροβίων. Κοινό χαρακτηριστικό του µορίου των β-λακταµικών αντιβιοτικών είναι ο δακτύλιος της β-λακτάµης. Ένα χρόνο µετά την εισαγωγή της πενικιλλίνης ακολούθησε η εµφάνιση των πρώτων στελεχών σταφυλοκόκκου ανθεκτικών στην πενικιλλίνη, αρχικά στα νοσοκοµεία και στη συνέχεια στην κοινότητα, µε αποτέλεσµα το 1948 το 60% των στελεχών S.aureus να είναι πενικιλλίνη ανθεκτικά στο Ηνωµένο Βασίλειο. Στα τέλη της δεκαετίας του 1960 περισσότερα από το 80% των στελεχών σταφυλοκόκκου-ενδονοσοκοµειακών και κοινότητας-ήταν ανθεκτικά στην πενικιλλίνη. Στις µέρες µας το ποσοστό αντοχής των σταφυλόκοκκων στην πενικιλλίνη έχει ξεπεράσει το 90% 21,126, 127. Η ανθεκτικότητα έναντι της πενικιλλίνης και των άλλων β-λακταµικών αντιβιοτικών (κεφαλοσπορίνες, πενέµες, καρβαπενέµες, µονοµπακτάµες, αναστολείς β-λαλταµασών) οφείλεται στην παραγωγή ενός εξωκυττάριου ενζύµου, της β-λακταµάσης (πενικιλλινάσης), που κωδικοποιείται από το γονίδιο blaz. Η β-λακταµάση υδρολύει τον β-λακταµικό δακτύλιο, σχηµατίζοντας πενικιλλοϊκό οξύ το οποίο είναι ανενεργές κατά του µικροβίου. Το γονίδιο blaz βρίσκεται σε τρανσποζόνιο που συνήθως ενσωµατώνεται σε πλασµίδιο και µεταφέρεται µε σύζευξη µεταξύ των διαφόρων ειδών σταφυλόκοκκου, ενώ µπορεί να ενσωµατωθεί και στο χρωµατόσωµα. Το γονίδιο blaz βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο δύο γειτονικών ρυθµιστικών γονιδίων: του αντικατασταλτικού blar1 και του κατασταλτικού blai. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι για τη σύνθεση της β-λακταµάσης είναι απαραίτητη η διαδοχική διάσπαση των ρυθµιστικών πρωτεϊνών BlaR1 και BlaI. H BlaR1 είναι διαµεµβρανική πρωτεΐνη που συνδέεται µε το β-λακταµικό αντιβιοτικό στον εξωκυττάριο χώρο. Η σύνδεση αυτή έχει ως αποτέλεσµα τη διάσπαση της BlaR1 και την παραγωγή ενδοκυττάριας µεταλλοπρωτεάσης που µε τη σειρά της διασπά την πρωτεΐνη BlaI. Η διάσπαση της τελευταίας οδηγεί σε 49

50 έκφραση του γονιδίου blaz και στην παραγωγή β-λακταµάσης. Η αντοχή εποµένως είναι επαγώγιµη 128,129,130. Η προσπάθεια για την αντιµετώπιση της συνεχώς αυξανόµενης αντοχής στην πενικιλλίνη οδήγησε το 1961 στην εισαγωγή των ηµισυνθετικών πενικιλλινών (µεθικιλλίνη, οξασιλλίνη, κλοξασιλλίνη και δικλοξασιλλίνη) που έφεραν στο βασικό β-λακταµικό δακτύλιο πλάγιες αλύσους, που τις καθιστούσαν υδρολυτικά ανθεκτικές στη δράση της β-λακταµάσης. Παρά τις αρχικές ελπίδες για την επιτυχή θεραπεία των λοιµώξεων από στελέχη ανθεκτικά στην πενικιλλίνη, ακολούθησε την ίδια χρονιά η αποµόνωση των 3 πρώτων ανθεκτικών στη µεθικιλλίνη στελεχών χρυσίζοντος σταφυλοκόκκου (MRSA) σε αγγλικά νοσοκοµεία 131. Η αντοχή των σταφυλόκοκκων στη µεθικιλλίνη οφείλεται στην παρουσία του γονιδίου meca που κωδικοποιεί τη σύνθεση µιας νέας πενικιλλινοδεσµευτικής πρωτεΐνης, την PBP2a. Πρόκειται για µια υψηλού βάρους πρωτεΐνη (78kDa) που παρουσιάζει µειωµένη τάση σύνδεσης προς τα β-λακταµικά αντιβιοτικά. Τα β-λακταµικά αντιβιοτικά φυσιολογικά συνδέονται στις πενικιλλινοδεσµευτικές πρωτεΐνες του σταφυλοκόκκου (PBPs 1-4), οι οποίες είναι ένζυµα που καταλύουν τη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώµατος. Η σύνδεση των αντιβιοτικών µε τα ένζυµα αναστέλλει τη δράση των PBPs µε τελικό αποτέλεσµα την αναστολή της χιαστί σύνδεσης των αλύσων της πεπτιδογλυκάνης και τη δηµιουργία ασταθούς κυτταρικού τοιχώµατος το οποίο λύεται εξαιτίας της µεγάλης πίεσης του κυτταροπλάσµατος. Στα ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη στελέχη η πρωτεΐνη PBP2a η οποία υπάρχει παράλληλα µε τις φυσιολογικές PBPs, µπορεί και λειτουργεί παρά την παρουσία β-λακταµικού αντιβιοτικού, λόγω της χαµηλής συγγένειας που έχει µε αυτό. Έτσι το στέλεχος είναι σε θέση να δηµιουργεί σταθερό κυτταρικό τοίχωµα 126,132, 133. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι το γονίδιο meca (2,1kb) βρίσκεται σε µια ευρύτερη περιοχή του DNA που είναι µεταθετή και ονοµάζεται σταφυλοκοκκική χρωµοσωµική κασέτα (Staphylococcal Cassette Chromosome-SCCmec) (134,135). To SCCmec ενσωµατώνεται στο χρωµόσωµα του S.aureus στο τµήµα attbscc που βρίσκεται στο orfx, µια ανοικτή περιοχή µεταγραφής (ORF-Open Reading Frame). To SCCmec µεταφέρει γονίδια για δύο ειδικές ρεκοµπινάσες, τις ccra και ccrb, που είναι 50

51 υπεύθυνες για την ενσωµάτωση του SCCmec 136,137. Μέχρι σήµερα έχουν βρεθεί πέντε διαφορετικές περιοχές SCCmec, µε βάση τον αριθµό των νουκλεοτιδίων τους (µεγέθους 21-67kb-Σχήµα 2). Οι τύποι Ι, ΙV και V φέρουν µόνο το γονίδιο meca και εκφράζουν αντοχή µόνο στα β-λακταµικά αντιβιοτικά, ενώ οι τύποι ΙΙ και ΙΙΙ φέρουν και άλλα γονίδια αντοχής εκφράζοντας πολυαντοχή (Πίνακας 2). Ο τύπος I φαίνεται να είναι το τµήµα εκείνο που ενσωµατώθηκε για πρώτη φορά στον S. aureus, µε αποτέλεσµα να προκύψει ο αρχέγονος κλώνος των MRSA 138,139,140. Στην περιοχή αυτή εδράζονται και τα ρυθµιστικά γονίδια της έκφρασης του meca που είναι το meci (η πρωτεΐνη ΜecΙ καταστέλλει την έκφραση του meca) και το mecr1, που κωδικοποιεί µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη-σηµατοδότη της παρουσίας β- λακταµικών στον εξωκυττάριο χώρο. Η λειτουργία των γονιδίων είναι η ακόλουθη: Όταν στον εξωκυττάριο χώρο εµφανιστεί β-λακταµικό αντιβιοτικό, συνδέεται στην πρωτεΐνη MecR1 η οποία καταλύει τη δική της διάσπαση µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία µιας ενδοκυττάριας µεταλλοπρωτεάσης. Το ένζυµο διασπά τη MecI, οπότε αποσυµπιέζεται το γονίδιο meca και το µικρόβιο συνθέτει την PBP2a. Η αντοχή εποµένως στη µεθικιλλίνη είναι και αυτή επαγώγιµη στα στελέχη στα οποία υπάρχει ακέραιος ο µηχανισµός που αναλύθηκε. Σε µερικά στελέχη τα ρυθµιστικά γονίδια µπορεί να µην είναι λειτουργικά και η αντοχή στη µεθικιλλίνη εκφράζεται σε σταθερή βάση 126,133. Πίνακας 2. Οι τύποι της χρωµοσωµικής κασέτας mec (SCCmec) στον S.aureus. Τύποι SCCmec Μέγεθος (kb) Περιεχόµενο Ι 34,3 Μόνο το meca ΙΙ 53,0 Πολυαντοχή ΙΙΙ 66,9 Πολυαντοχή IV 20,9-24,3 Μόνο το meca V 28,0 Μόνο το meca 51

52 Σχήµα 2. Τύποι SCCmec Στην ευρύτερη περιοχή SCCmec είναι δυνατό να ενσωµατωθούν µεταθετά στοιχεία (τρανσποζόνια-τn) και ακολουθίες εισδοχής (Insertion Sequences-IS) που κωδικοποιούν γονίδια αντοχής σε διαφορετικές οµάδες αντιβιοτικών. Συγκεκριµένα το τρανσποζόνιο Tn554 βρίσκεται στο 5 άκρο του γονιδίου meca και φέρει το γονίδιο erma που είναι υπεύθυνο για την αντοχή σε µακρολίδες, λινκοσαµίδες και στρεπτογραµµίνες B. Απαντώνται επίσης ένα έως τέσσερα αντίγραφα της αλληλουχίας εισδοχής IS431, από τα οποία ένα τουλάχιστον βρίσκεται στο 3 άκρο του γονιδίου meca. Μέσω των αλληλουχιών εισδοχής διάφορα γονίδια αντοχής µπορούν και εισχωρούν στην περιοχή SCCmec. Το γονίδιο aad, που είναι υπεύθυνο για την αντοχή στην τοµπραµυκίνη, εδράζεται στο πλασµίδιο pub110 και εισχωρεί στην περιοχή mec µέσω της IS ,137. H ικανότητα της IS431 να δέχεται γονίδια 52

53 αντοχής µε όµοιες αλληλουχίες εξηγεί και την πολυανθεκτικότητα των ανθεκτικών στη µεθικιλλίνη στελεχών σταφυλόκοκκου (Methicillin Resistant Staphylococci=MRS). Στις µέρες µας τα περισσότερα MRS στελέχη παρουσιάζουν αντοχή στην ερυθροµυκίνη, κλινδαµυκίνη, χλωραµφενικόλη, τριµεθοπρίµη-σουλφαµεθοξαζόλη, και στις αµινογλυκοσίδες. Η παρουσία των τρανσποζονίων στη mec περιοχή ευνοεί τη διασπορά της αντοχής, αφού η περιοχή αυτή µεταφέρεται από στέλεχος σε στέλεχος 141,142. Η προέλευση του γονιδίου meca δεν είναι σαφής. Σε µελέτη των Couto και συν. βρέθηκε ένα γονίδιο µε 88% οµολογία αµινοξέων µε το meca γονίδιο των MRSA σε στελέχη S. sciuri (143). Το γονίδιο αυτό δεν προσέδιδε ανθεκτικότητα στη µεθικιλλίνη στα στελέχη αυτά. Υπάρχουν και άλλες µελέτες που υποστηρίζουν ότι η πιθανότερη πηγή προέλευσης του γονιδίου meca του S.aureus είναι οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι, µε κύριο υποψήφιο τον S.sciuri. Μέσω ανασυνδυασµού ειδικής θέσης τα στελέχη MRSA απέκτησαν το meca γονίδιο 144, Τρόπος ανίχνευσης µηχανισµών αντοχής α) Ανίχνευση πενικιλλινάσης (β-λακταµάσης) Ο έλεγχος παραγωγής β-λακταµάσης πραγµατοποιείται µε δίσκο νιτροσεφίνης (nitrocefin), που είναι µια χρωµογόνος κεφαλοσπορίνη (125). Αποικίες του µικροβίου από τη ζώνη αναστολής στην κεφοξιτίνη ή την πενικιλλίνη ενοφθαλµίζονται σε δίσκο nitrocefin που έχει εµποτιστεί µε απεσταγµένο H 2 O. Η εξέταση θεωρείται αρνητική αν µετά από 60 λεπτά δεν αναπτυχθεί χρώµα. Η σύνθεση β-λακταµάσης ελέγχεται επίσης, έµµεσα, από την ευαισθησία σε δίσκο penicillin (10U) 21,125. β) Ανίχνευση αντοχής στη µεθικιλλίνη Η ανίχνευση της πρωτεΐνης PBP2a χρησιµοποιείται µε επιτυχία για τον προσδιορισµό της αντοχής των στελεχών σταφυλόκοκκου στη µεθικιλλίνη. Η µέθοδος βασίζεται σε αντίδραση συγκόλλησης της πενικιλλινοδεσµευτικής πρωτεΐνης και µονοκλωνικών αντισωµάτων έναντι της PBP2a, µονιµοποιηµένων πάνω σε σωµατίδια latex. Μεγάλη αξιοπιστία παρουσιάζει και ο έλεγχος µε τη µέθοδο των δίσκων και διάχυσης σε άγαρ µε κεφοξιτίνη (cefoxitin 30µg). Έχει αποδειχτεί ότι η κεφοξιτίνη είναι καλύτερος επαγωγέας της έκφρασης της PBP2a σε σύγκριση 53

54 µε τη µεθικιλλίνη και την οξασιλλίνη, ενώ δεν απαιτείται και ο εµπλουτισµός του MHA (Muller Hinton Agar) µε 2% NaCl. Μέθοδος αναφοράς για τον έλεγχο αντοχής στη µεθικιλλίνη είναι η ανίχνευση του γονιδίου meca µε µοριακή µέθοδο (υβριδισµός, PCR, µικροσυστοιχίες). 21,146, Αντοχή στις αµινογλυκοσίδες Οι αµινογλυκοσίδες είναι βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση δεσµευόµενα στο 16S rrna της υποµονάδας 30S του ριβοσώµατος του µικροβίου. Παρεµποδίζουν την επιµήκυνση της πρωτεΐνης που συντίθεται και οδηγούν και σε αλλαγές της αλληλουχίας των αµινοξέων που ενσωµατώνονται 148. Οι σταφυλόκοκκοι αναπτύσσουν αντοχή στις αµινογλυκοσίδες µε την παραγωγή ενζύµων που τροποποιούν ή αδρανοποιούν τα αντιβιοτικά, µη επιτρέποντας τη σύνδεση τους µε το ριβόσωµα. Η παραγωγή των ενζύµων ρυθµίζεται από γονίδια που βρίσκονται σε πλασµίδια. Τα ένζυµα αυτά µπορεί να είναι ακετυλοτρανσφεράσες (AAC), αδενυλοτρανσφεράσες (ANT) ή φωσφοτρανσφεράσες (APH), ανάλογα µε το σηµείο δράσης στο µόριο των αµινογλυκοσιδών. Κάθε µια αµινογλυκοσίδη αδρανοποιείται από περισσότερα του ενός ένζυµα και κάθε ένζυµο δρα σε περισσότερες από µια αµινογλυκοσίδες. Αποτέλεσµα αυτού του µηχανισµού είναι ότι ο φαινότυπος αντοχής σπάνια µπορεί να δώσει πληροφορίες για τα ένζυµα που κωδικοποιεί ένα στέλεχος, ενώ επιπλέον κάθε βακτήριο µπορεί να φέρει γονίδια σύνθεσης περισσοτέρων του ενός ενζύµων 146, 148, Αντοχή στις µακρολίδες, λινκοσαµίδες και στρεπτογραµµίνες οµάδας Β (MLS Β ) Οι τρεις αυτές κατηγορίες αντιβιοτικών δρουν συνδεόµενες στην 50S υποµονάδα των ριβοσωµάτων και ιδιαίτερα στο σηµείο δράσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, αναστέλλοντας την πρωτεΐνοσύνθεση. Η ανάπτυξη αντοχής σε αυτά τα αντιβιοτικά µπορεί να οφείλεται: 1) σε τροποποίηση του στόχου δράσης 2) στην ύπαρξη µηχανισµού ενεργητικής απέκκρισης του αντιβιοτικού µέσω ενεργούς αντλίας εκροής και σπανιότερα 3) σε αδρανοποίηση των αντιβιοτικών από ένζυµα. Έχουν περιγραφεί τρεις φαινότυποι αντοχής : 54

55 α) ο φαινότυπος Μ, που συναντάται σπάνια, µε τα ανθεκτικά στελέχη να εµφανίζουν αντοχή µόνο στις µακρολίδες. Τα υπεύθυνα γονίδια είναι τα erea και ereb που υδρολύουν το δακτύλιο της λακτόνης του πυρήνα των αντιβιοτικών. β) ο φαινότυπος MS µε αντοχή στις µακρολίδες και επαγόµενη αντοχή στις στρεπτογραµµίνες οµάδας Β παρουσία ερυθροµυκίνης. Το υπεύθυνο γονίδιο είναι το msra που κωδικοποιεί µια αντλία εκροής εξαρτώµενη από το ATP. Συναντάται συχνότερα στους CoNS και σπανιότερα στον S.aureus. γ) ο φαινότυπος MLS Β που εκφράζει αντοχή σε µακρολίδεςλινκοσαµίδες και στρεπτογραµµίνες Β. Τα ανθεκτικά στελέχη έχουν µεθυλιωµένη τη θέση Α2058 του 23S rrna στην περιοχή V. Τα ένζυµα που καταλύουν αυτή τη µεθυλίωση ονοµάζονται erm (erythromycin resistance methylase) και κωδικοποιούνται από τα γονίδια erma, ermb, ermc. Στους σταφυλόκοκκους τα πλέον συχνά γονίδια είναι το erma, που εδράζεται στο τρανσποζόνιο Tn554, και το ermc που εδράζεται σε πλασµίδιο 146, Αντοχή στις τετρακυκλίνες Οι τετρακυκλίνες εκδηλώνουν τη δράση τους συνδεόµενες µε πρωτεΐνες της υποµονάδας 30S του rrna. Προκαλούν αλλαγή της διαµορφώσεως των ριβοσωµάτων και αδυναµία σύνδεσης του trna. Έχουν αναγνωριστεί δύο µηχανισµοί υπεύθυνοι για την ανάπτυξη αντοχής των σταφυλόκοκκων στις τετρακυκλίνες. Ο πρώτος οφείλεται σε µηχανισµό ενεργητικής εκροής του αντιβιοτικού και υπεύθυνα γονίδια είναι τα tetk και tetl που εδράζονται σε πλασµίδιο. Ο δεύτερος µηχανισµός είναι η προστασία του ριβοσώµατος µε την παραγωγή πρωτεϊνών που δεν επιτρέπουν τη σύνδεση των τετρακυκλινών µε τα ριβοσώµατα. Οφείλεται στα γονίδια tetm και teto τα οποία βρίσκονται είτε σε τρανσποζόνια είτε στο χρωµόσωµα. Έχει βρεθεί ότι στελέχη S.aureus που φέρουν µόνο το γονίδιο tetk είναι ανθεκτικά στην τετρακυκλίνη, αλλά ευαίσθητα στην µινοκυκλίνη. Αντίθετα το γονίδιο tetm συνδέεται µε την εµφάνιση αντοχής σε όλα τα φάρµακα της κατηγορίας των τετρακυκλινών 151,152,

56 5.5 Αντοχή στις κινολόνες Οι κινολόνες είναι βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά που αναστέλλουν τη σύνθεση του DNA µε παρεµβολή στη δράση της DNA-γυράσης Α και της τοποΐσοµεράσης IV. Έχουν περιγραφεί δύο µηχανισµοί αντοχής : 1) Μείωση συγγένειας λόγω τροποποίησης του στόχου δράσης. Η επίκτητη αυτή αντοχή οφείλεται σε χρωµοσωµικές µεταλλάξεις στα γονίδια gyra και gyrc που προκαλούν µείωση της σύνδεσης των κινολονών µε τους ενδοκυττάριους στόχους δράσης τους, τα συµπλέγµατα DNA-γυράσης και DNA τοποΐσοµεράσης IV και 2) η αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του αντιβιοτικού µέσω µιας πρωτεΐνης της µεµβράνης, της NorA (µηχανισµός αντλίας) Αντοχή στο Φουσιδικό οξύ Το φουσιδικό οξύ αναστέλλει την πρωτεΐνοσύνθεση εµποδίζοντας την απελευθέρωση του παράγοντα επιµήκυνσης G (EF-G) από το ριβόσωµα. Η αντοχή στο φουσιδικό οξύ οφείλεται είτε σε σηµειακές µεταλλάξεις στο γονίδιο fusa που κωδικοποιεί τον παράγοντα G, είτε στην ύπαρξη του γονιδίου fusb. Πρόσφατα σε στελέχη S.aureus και S.saprophyticus µε αντοχή στο φουσιδικό οξύ ταυτοποιήθηκαν δύο νέα γονίδια, τα fusc και fusd. Τα γονίδια αυτά είναι υπεύθυνα για την έκφραση των πρωτεϊνών FusC και FusD, που εµφανίζουν µεγάλη οµολογία βάσεων (>40%) µε την πρωτεΐνη FusB. Έχει παρατηρηθεί ότι αντοχή εµφανίζεται πιο συχνά όταν το φάρµακο δεν συνδυάζεται µε άλλα αντισταφυλοκοκκικά φάρµακα Μειωµένη ευαισθησία και αντοχή στα γλυκοπεπτίδια Τα γλυκοπεπτίδια αποτελούν οµάδα ουσιών που παράγονται από είδη ακτινοµυκήτων. Οι κυριότεροι εκπρόσωποι αυτής της κατηγορίας που βρίσκονται σε καθ ηµέρα κλινική χρήση είναι η βανκοµυκίνη και η τεϊκοπλανίνη. Η χηµική δοµή τους περιλαµβάνει έναν πολυκυκλικό πεπτιδικό πυρήνα (άγλυκο τµήµα) µε 6 πεπτιδικές γέφυρες, ένα ασύνηθες τµήµα τριφαινυλικού αιθέρα και σάκχαρα που συνδέονται σε διάφορα τµήµατα του µορίου. Η βανκοµυκίνη είναι περισσότερο δραστική από την τεϊκοπλανίνη, έναντι των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων

57 Τα γλυκοπεπτίδια δρουν ως αναστολείς της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώµατος εµποδίζοντας τη χιαστί σύνδεση της πεπτιδογλυκάνης. ρουν στη δεύτερη φάση σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώµατος. Ειδικότερα συνδέονται στο ελεύθερο καρβοξύλιο του τελικού άκρου (D-alanyl-D-alanine) του πενταπεπτιδίου του Ν-ακετυλοµουραµικού οξέος και το δεσµεύουν. Με τον τρόπο αυτό οι PBPs αδυνατούν να αποµακρύνουν την 5 η D-αλανίνη, ώστε να πραγµατοποιηθεί η σύνδεση ανάµεσα στην 4 η D-αλανίνη και στο πέµπτο µόριο της γλυκίνης. Η αντιµικροβιακή δράση εστιάζεται στην αναστολή των αντιδράσεων τρανσπεπτιδίωσης, µε αποτέλεσµα την αναστολή της σύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης και τη συσσώρευση των πρωίµων µονοµερών της. Υπάρχουν επίσης µελέτες που έχουν δείξει ότι τα γλυκοπεπτίδια µεταβάλλουν επιπρόσθετα και τη διαβατότητα της κυτταρικής µεµβράνης και µπορεί επιλεκτικά να αναστείλουν τη σύνθεση των ριβονουκλεϊκών οξέων 156,157. Η βανκοµυκίνη βρίσκεται στην κλινική πράξη από το 1958, ενώ η τεϊκοπλανίνη από τη δεκαετία του Οι πρώτες αναφορές για στελέχη πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων µε ελαττωµένη ευαισθησία στα γλυκοπεπτίδια έγιναν το και ακολούθησαν το 1986 και 1987 αναφορές για στελέχη S.haemolyticus µε αντοχή στην τεϊκοπλανίνη από ΗΠΑ, Αγγλία και Ιταλία 159,160,161. Οι αναφορές αυτές δεν προκάλεσαν ιδιαίτερη ανησυχία, γιατί το είδος αυτό των CoNS θεωρούνταν ως δυνητικά ενδονοσοκοµειακό παθογόνο και µε τάση να αναπτύσσει πολλαπλές αντοχές. Στη συνέχεια είχαµε αρκετές αναφορές για στελέχη S.epidermidis και S.haemolyticus µε αντοχή τόσο στην τεϊκοπλανίνη όσο και στη βανκοµυκίνη και το 1997 ο Hiramatsu στην Ιαπωνία παρουσίασε την πρώτη περίπτωση στελέχους S.aureus µε µειωµένη ευαισθησία στη βανκοµυκίνη (VISA=Vancomycin Intermediate Staphylococcus aureus) µε MIC=8µg/ml από επιµολυνθέν χειρουργικό τραύµα 162,163,164. Το 2002 είχαµε από τις ΗΠΑ την αναφορά των πρώτων δύο στελεχών S.aureus µε αντοχή στη βανκοµυκίνη µε MIC 1024 και 64 µg/ml (VRSA=Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus). Αφορούσαν ασθενείς µε σοβαρές υποκείµενες παθήσεις που είχαν λάβει βανκοµυκίνη για αρκετό χρονικό διάστηµα 165. Η πιο πρόσφατη αναφορά στελεχών VRSA προέρχεται από τις ΗΠΑ το 2007 και περιελάµβανε δύο στελέχη µε υψηλού επιπέδου αντοχή στην βανκοµυκίνη (MIC>1024 µg/ml)

58 Σε όλα τα στελέχη µε αντοχή η διερεύνηση του µηχανισµού αντοχής έδειξε ότι έφεραν το γονίδιο vana, που είναι υπεύθυνο για την αντοχή των εντερόκοκκων στη βανκοµυκίνη 167. Το γονίδιο αυτό µεταφέρεται στο VRSA στέλεχος µέσω του τρανσποζονίου Τn 1546 από στελέχη ανθεκτικών στη βανκοµυκίνη εντερόκοκκων (Vancomycin Resistant Enterococcus=VRE) 167. Το γονίδιο ενσωµατώνεται στη συνέχεια σε σύµπλοκο πλασµίδιο του S.aureus. Η απόκτηση του γονιδίου vana οδηγεί στην αντικατάσταση του διπεπτιδίου D-alanyl-D-alanine του κυτταρικού τοιχώµατος από το διπεπτίδιο D-alanyl-D-lactate. Το νέο διπεπτίδιο έχει ελαττωµένη τάση σύνδεσης µε τη βανκοµυκίνη, µε αποτέλεσµα τα γλυκοπεπτίδια να µη συνδέονται και να αδυνατούν να αναστείλουν τον περαιτέρω πολυµερισµό (Σχήµα 3). Στην Ελλάδα υπάρχουν αναφορές για στελέχη S.haemolyticus µε πλήρη αντοχή στην τεϊκοπλανίνη (MIC 64 µg/ml) καθώς και για 1 στέλεχος VISA και 1 S. sciuri µε ενδιάµεση αντοχή στην βανκοµυκίνη 168,169. Σε πρόσφατη έρευνα σε σύνολο 1337 στελεχών CoNS από 4 ελληνικά νοσοκοµεία (Γενικό Κρατικό Αθηνών, Ασκληπιείο Βούλας, Πανεπιστηµιακό Νοσοκοµείο Λάρισας και Πανεπιστηµιακό Νοσοκοµείο Πατρών) ανευρέθηκε ποσοστό 10,32% στελεχών µε ελαττωµένη ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη, από τα οποία το 2,8% ήταν ανθεκτικά και το υπόλοιπο 7,4% µε ενδιάµεση ευαισθησία 170. Ο µηχανισµός της αντοχής του γένους των σταφυλόκοκκων στα γλυκοπεπτίδια δεν είναι πλήρως κατανοητός. Μορφολογικές αλλαγές στο κυτταρικό τοίχωµα έχουν βρεθεί τόσο σε MRSA στελέχη 171 όσο και σε ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη στελέχη πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων 172. Παρατηρήθηκε ότι τα VISA στελέχη είχαν παχύτερο κυτταρικό τοίχωµα και συνέθεταν αυξηµένα ποσά διπεπτιδίων D-alanyl-D-alanyl. Η περίσσεια των ελεύθερων διπεπτιδίων συνδέεται στην εξωτερική επιφάνεια του τοιχώµατος µε τα γλυκοπεπτίδια, µη επιτρέποντάς τους να φτάσουν στο στόχο τους, που είναι η περιοχή πολυµερισµού της πεπτιδογλυκάνης. To πρώτο στέλεχος S.aureus µε ελαττωµένη ευαισθησία στη βανκοµυκίνη (Mu50) είχε στρώµατα πεπτιδογλυκάνης, σε σχέση µε τα 20 στρώµατα που υπάρχουν στα ευαίσθητα στελέχη 173. Πρέπει να σηµειωθεί ότι οι σταφυλόκοκκοι µε µειωµένη ευαισθησία στα γλυκοπεπτίδια εµφανίζουν το φαινόµενο της ετερογενούς αντοχής: λίγα µόνο 58

59 κύτταρα στο βακτηριακό πληθυσµό (1 στα 10 6 ) µπορεί να είναι ανθεκτικά. Ένα ετεροανθεκτικό στέλεχος (h-gisa ή h-visa) περιέχει 2 πληθυσµούς κυττάρων: την πλειοψηφία, που είναι ευαίσθητη στα γλυκοπεπτίδια, και έναν µικρότερο πληθυσµό, που είναι ανθεκτικός. Τα στελέχη αυτά έχουν MIC 2-4 µg/ml και περιέχουν ανθεκτικούς υποπληθυσµούς µε MICs 5-9 µg/ml σε συχνότητα 1x 10-6, που µπορεί να επιλέγονται in vitro στις καλλιέργειες παρουσία αυξηµένων συγκεντρώσεων βανκοµυκίνης. Θεωρούνται ότι είναι πρόδροµα της εµφάνισης στελεχών VRSA ή VISA και σχετίζονται µε θεραπευτική αποτυχία στη βανκοµυκίνη 174. Η επίπτωση των στελεχών σταφυλοκόκκου µε ετεροανθεκτικότητα στα γλυκοπεπτίδια είναι µεγαλύτερη από αυτή της ελαττωµένης ευαισθησίας, όπως αποτυπώθηκε στην πρώτη καταγραφή της στην Ιαπωνία, όπου έφτασε το 20% των στελεχών S.aureus 175,176. Παρόµοιες έρευνες που ακολούθησαν σε Ευρώπη, Νότια και Βόρεια Αµερική ανέφεραν ποσοστά που κυµαινόταν από 0-27% 177. Ο έλεγχος της ετερογενούς αντοχής είναι δύσκολος και στην τεχνική εφαρµογή αλλά και στην αξιολόγηση. Σήµερα από το CLSI δεν συνιστάται η εφαρµογή της µεθόδου των δίσκων αλλά είναι απαραίτητο να γίνεται προσδιορισµός της MIC µε E- test ή µε άλλη µέθοδο. 125,170,178. Το 2006 τα όρια ευαισθησίας στη βανκοµυκίνη για τον S.aureus σύµφωνα µε τα κριτήρια της CLSI ελαττώθηκαν και διαµορφώθηκαν ως εξής: ευαισθησία 2 mg/l, ενδιάµεση ευαισθησία 4-8 mg/l και αντοχή 16 mg/l. Η απόφαση αυτή ήταν απόρροια κλινικών αναφορών που έλεγαν ότι τα στελέχη S.aureus ήταν λιγότερο πιθανό να ανταποκριθούν στη θεραπεία µε βανκοµυκίνη όταν η MIC ήταν 1 mg/l 179,180,181. Ο Soriano και συν. αναφέρει αυξηµένη θνητότητα σε βακτηριαιµία από MRSA, όταν η βανκοµυκίνη χρησιµοποιήθηκε για την εµπειρική θεραπεία στελεχών µε MIC>1 mg/l

60 βανκοµυκίνη Σχήµα 3. Μηχανισµός αντίστασης των σταφυλόκοκκων στη 60

61 6. ΟΞΑΖΟΛΙ ΟΝΕΣ Οι οξαζολιδόνες αποτελούν µια καινούργια και σηµαντική κατηγορία συνθετικών αντιµικροβιακών φαρµάκων, καθώς αποτελούν την πρώτη νέα κατηγορία αντιµικροβιακών παραγόντων που εισάγεται στην κλινική πράξη µετά το Οι οξαζολιδόνες αρχικά αναπτύχθηκαν ως αναστολείς της µονοαµινοοξειδάσης (ΜΑΟ) για τη θεραπεία της κατάθλιψης. Στη συνέχεια ανακαλύφτηκε ότι είχαν αντιµικροβιακή δράση και στα τέλη της δεκαετίας του 1970 η φαρµακευτική εταιρεία Du Pont προχώρησε στην ανάπτυξη των πρώτων παραγόντων για τον έλεγχο των βακτηριακών και µυκητιασικών ασθενειών διαφόρων φυτών. Το 1987 έγινε η σύνθεση των πρώτων παραγώγων (DuP 105 και DuP 721), οι οποίοι όµως εµφάνιζαν υψηλή τοξικότητα και το πρόγραµµα περαιτέρω ανάπτυξης τους σταµάτησε το Στις αρχές της δεκαετίας του 1990 η φαρµακευτική εταιρεία Upjohn κατάφερε να ξεπεράσει τα αρχικά προβλήµατα και να προχωρήσει στη σύνθεση και την περαιτέρω κλινική δοκιµή δύο συνθετικών µη τοξικών παραγώγων : της λινεζολίδης (PNU ) και της επερεζολίδης (PNU ). Μολονότι και τα δύο παράγωγα εµφάνιζαν εξαιρετική in vitro δραστικότητα έναντι των Gram-θετικών βακτηρίων, η λινεζολίδη εµφανίζοντας καλύτερη βιοδιαθεσιµότητα και φαρµακοκινητική δράση προχώρησε πέρα από την φάση 1 των κλινικών δοκιµών. Η χορήγηση της ξεκίνησε στις ΗΠΑ τον Απρίλιο του 2000, όταν το φάρµακο εγκρίθηκε από την επιτροπή τροφίµων και φαρµάκων (FDA) των ΗΠΑ 183,184,185, Μηχανισµός δράσης Ο µηχανισµός δράσης των οξαζολιδονών είναι διαφορετικός και µοναδικός σε σχέση µε πολλά αντιβιοτικά. Η λινεζολίδη συνδέεται στην 50S υποοµάδα του ριβοσώµατος, εµποδίζοντας το σχηµατισµό συµπλόκου µε την 30S υποοµάδα, το mrna, τους παράγοντες έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης (initiation factors) και το φορµυλοµεθειονίνη-trna.(fmet-trna). Έτσι η λινεζολίδη αποτρέπει το σχηµατισµό του συµπλόκου έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, µη επιτρέποντας τη µετάφραση του αγγελιοφόρουrna 61

62 (mrna). Αυτός ο µηχανισµός δράσης διαφέρει από το µηχανισµό των υπαρχόντων αντιβιοτικών αναστολέων της πρωτεϊνικής σύνθεσης (όπως π.χ. οι µακρολίδες, η χλωραµφενικόλη, οι λινκοζαµίνες και οι τετρακυκλίνες) που επιτρέπουν την έναρξη της µετάφρασης του mrna και στη συνέχεια εµποδίζουν την επιµήκυνση της πεπτιδικής αλύσου (Σχήµα 4). Σχήµα 4. Μηχανισµός δράσης της λινεζολίδης Η διαφορά αυτή µπορεί να φαίνεται θεωρητική, αλλά είναι σηµαντική για δύο λόγους: Πρώτον γιατί µε αυτό τον τρόπο εµποδίζεται η σύνθεση σταφυλοκοκκικών και στρεπτοκοκκικών λοιµογόνων παραγόντων (π.χ πηκτάση, αιµολυσίνες και πρωτεΐνη Α) και δεύτερον λόγω του διαφορετικού στόχου δράσης (σύµπλοκο έναρξης) δεν παρουσιάζεται διασταυρούµενη αντοχή µε άλλα αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση Αντιµικροβιακό φάσµα Η λινεζολίδη έχει δράση βακτηριοστατική. Οι κλινικές έρευνες απέδειξαν ότι η λινεζολίδη εµφανίζει δραστικότητα έναντι σηµαντικού αριθµού Gram θετικών κόκκων όπως ο S.aureus, o S.epidermidis, οι Enterococcus 62

63 faecalis και faecium και αρκετά είδη Streptococcus. Είναι επίσης δραστική έναντι αερόβιων και αναερόβιων βακίλλων, αναερόβιων gram θετικών κόκκων, ορισµένων gram αρνητικών αναερόβιων καθώς και σε είδη Μυκοβακτηριδίου και Νοκαρδιών. Τα Gram αρνητικά αερόβια µικρόβια παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στη δράση της µε µηχανισµό ενεργητικής απέκκρισης (efflux pump). Το FDA έχει δώσει έγκριση στη λινεζολίδη για τη θεραπεία λοιµώξεων που προκαλούνται από ανθεκτικό στη βανκοµυκίνη Enterococcus faecium, συµπεριλαµβάνοντας τις περιπτώσεις µε συνυπάρχουσα βακτηριαιµία. Στην κλινική πράξη η λινεζολίδη χρησιµοποιείται για τη θεραπεία της πνευµονίας της κοινότητας και της νοσοκοµειακής πνευµονίας από S.aureus και Streptococcus pneumoniae καθώς και για τις επιπλεγµένες και µη λοιµώξεις του δέρµατος και των µαλακών µορίων από S.aureus και Streptococcus pyogenes 187. Σε δύο διπλές τυφλές µελέτες που έγιναν για τη θεραπεία της νοσοκοµειακής πνευµονίας υπήρχε µια τάση ανωτερότητας της λινεζολίδης σε σύγκριση µε τη βανκοµυκίνη 188,189. Τα όρια ανθεκτικότητας στη λινεζολίδη σύµφωνα µε το CLSI για τους σταφυλόκοκκους είναι : ευαισθησία MIC 4 µg/ml, αντοχή MIC> 4 µg/ml 190,191. Σε σύγκριση µε τα έως σήµερα διαθέσιµα αντιβιοτικά η λινεζολίδη διατηρεί οµοιόµορφη δράση έναντι του συνόλου των Gram θετικών κόκκων. Η βανκοµυκίνη παρουσιάζει σχεδόν παρόµοια δραστικότητα µε τη λινεζολίδη εναντίον των σταφυλόκοκκων και στρεπτόκοκκων, αλλά η αυξανόµενη εµφάνιση ανθεκτικότητας έναντι των εντερόκοκκων µε τη διασπορά των γονιδίων VanA και VanB περιορίζει τη χρήση της. Η τεϊκοπλανίνη έχει συνδεθεί επίσης µε την εµφάνιση ανθεκτικών εντερόκοκκων, ενώ παρουσιάζει ελαττωµένη δραστικότητα έναντι ορισµένων ειδών πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων. Η κινοπριστίνη-νταλφοπριστίνη είναι δραστική έναντι των σταφυλόκοκκων, στρεπτόκοκκων και του Enterococcus faecium αλλά εµφανίζει εγγενή αντοχή στον Enterococcus faecalis 187. Η λινεζολίδη έχει έναν αριθµό χαρακτηριστικών τα οποία κάνουν δύσκολη την ανάπτυξη αντοχής. Πρώτον είναι εντελώς συνθετικός παράγοντας και υπάρχει µικρή πιθανότητα προϋπάρχουσας φυσικής αντίστασης, όπως αυτή που συναντάται σε αντιβιοτικά που παράγονται από µικροοργανισµούς. εύτερον η λινεζολίδη συνδέεται στην περιοχή V του 23S 63

64 rrna της 50S ριβοσωµικής υποµονάδας. Η περιοχή αυτή κωδικοποιείται από γονίδια (rdna) τα οποία βρίσκονται σε πολλαπλά αντίγραφα σε φυλογενετικώς συσχετιζόµενα είδη. Για παράδειγµα 4 αντίγραφα βρίσκονται στον Enterococcus faecalis, 5-6 αντίγραφα στον Enterococcus faecium και τον S.aureus. Έτσι η ανάπτυξη αντοχής είναι δύσκολη, καθώς απαιτεί µεταλλάξεις σε πολλαπλά αντίγραφα του 23S rdna 192. Τέλος οι in vitro µελέτες έδειξαν ότι η παραγωγή µεταλλαγµένων στελεχών ανθεκτικών στη λινεζολίδη στα διάφορα είδη µικροβίων είναι εξαιρετικά δύσκολο να επιτευχθεί 193. Όταν τελικά επιτεύχθηκε ανάπτυξη αντοχής µε in vitro πέρασµα (passage) των σταφυλόκοκκων και των εντερόκοκκων, αυτή συνδέθηκε µε µεταλλάξεις στον κεντρικό βρόχο της περιοχής V του 23S rrna που βρίσκεται στην 50S ριβοσωµιακή υποµονάδα. Οι µεταλλάξεις αυτές έχουν ως αποτέλεσµα την αλλαγή της περιοχής σύνδεσης της λινεζολίδης. Ο S.aureus έχει από τέσσερα έως επτά αντίγραφα γονιδίων που κωδικοποιούν το 23S rrna και για να επιτευχθεί εµφάνιση αντοχής πρέπει να τροποποιηθούν περισσότερα από ένα αντίγραφα, γεγονός που εξηγεί τη δυσκολία της επιλογής µεταλλαγµένων στελεχών Ανθεκτικότητα στη λινεζολίδη Σε προκαταρκτικές µελέτες πριν από την εισαγωγή της λινεζολίδης στην κλινική θεραπευτική πράξη δεν ανιχνεύτηκε ανθεκτικό στέλεχος Gram θετικoύ κόκκου. Περίπου 1 χρόνο όµως µετά την έναρξη χρήσης της λινεζολίδης είχαµε την πρώτη αναφορά στελέχους S.aureus µε αντοχή. Σε ασθενή, στον οποίο είχε χορηγηθεί λινεζολίδη από του στόµατος για την θεραπεία περιτονίτιδας προερχόµενης από περιτοναϊκό καθετήρα για χρονικό διάστηµα 4 εβδοµάδων, αποµονώθηκαν 3 MRSA στελέχη µε αντοχή στο αντιβιοτικό. Ο έλεγχος των στελεχών µε ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) έδειξε ότι ήταν γενετικώς διαφορετικά από τα 11 αρχικά MRSA στελέχη που είχαν αποµονωθεί στον ασθενή κατά τη διάρκεια των προηγούµενων 3 εβδοµάδων και τα οποία ήταν ευαίσθητα στη λινεζολίδη. Η ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδίου 23S rrna αποκάλυψε µετάλλαξη στην θέση G2576T (σύµφωνα µε την νουκλεοτιδική αρίθµηση της E.Coli) 195. Στην περίπτωση αυτή δεν διαλευκάνθηκε αν το στέλεχος που παρουσίαζε αντοχή προήλθε από ένα δεύτερο προγενέστερο στέλεχος MRSA 64

65 που δεν είχε εντοπισθεί στον ασθενή, ή αν ο ασθενής απέκτησε το στέλεχος από µια εξωτερική πηγή. Το πρώτο ενδεχόµενο φαίνεται πιθανότερο και µε τον τρόπο αυτό δικαιολογείται εν µέρει και η απουσία στελεχών σταφυλόκοκκου µε αντοχή που είχαν αποµονωθεί πριν από τη χορήγηση του φαρµάκου. Το 2002 έγινε η δεύτερη αναφορά MRSA στελέχους µε αντοχή στη λινεζολίδη από τον Wilson και συν 196. Το στέλεχος αποµονώθηκε από ασθενή που είχε λάβει λινεζολίδη (αρχικά ενδοφλεβίως και έπειτα από το στόµα) για 21 ηµέρες για θεραπεία εµπυήµατος. Πριν τη θεραπεία µε λινεζολίδη το στέλεχος είχε MIC=2µg/ml. Τα ανθεκτικά στη λινεζολίδη στελέχη αποµονώθηκαν 20 µέρες µετά την έναρξη της αγωγής και είχαν MIC που κυµαινόταν από 8-32µg/ml. Η αλληλούχιση της περιοχής 23SrRNA αποκάλυψε µετάλλαξη στη θέση G2576T. Ένα στέλεχος µε MIC=8µg/ml είχε µεταλλάξεις σε 2 από τα 6 αντίγραφα του 23SrRNA, ενώ ένα δεύτερο στέλεχος µε MIC=32µg/ml είχε µεταλλάξεις σε 5 από τα 6 αντίγραφα του 23SrRNA. Ακολούθησαν και άλλες αναφορές στελεχών MRSA και MRCoNS µε αντοχή στη λινεζολίδη. Το 2003 ο Machado και συν. 197 αποµόνωσαν MRSA στέλεχος µε αντοχή στη λινεζολίδη από ασθενή µε κυστική ίνωση. Η αλληλούχιση της περιοχής 23SrRNA αποκάλυψε την ίδια µετάλλαξη G2576T. Την ίδια χρονιά ο Paterson και συν. από καλλιέργειες αίµατος ασθενούς µε πνευµονία αποµόνωσαν MRSA στέλεχος µε MIC=8µg/ml στη λινεζολίδη. H αλληλούχιση της περιοχής V που ακολούθησε, αποκάλυψε ότι σε 2 από τα 5 αντίγραφα του 23SrRNA γονιδίου υπήρχε η µετάλλαξη G2576T 198. Το 2004 ο Meka και συν. ανέφεραν την περίπτωση στελέχους MRSA µε αντοχή στη λινεζολίδη του οποίου η αλληλούχιση της περιοχής V του 23S rrna εντόπισε µετάλλαξη στη θέση Τ2500Α. Ταυτόχρονα η µετάλλαξη αυτή συνοδεύτηκε από απώλεια ενός αντιγράφου του 23S rrna γονιδίου σε δύο από τα ανθεκτικά στελέχη 199. Η πρώτη αναφορά για εµφάνιση επιδηµίας από στελέχη σταφυλόκοκκου µε αντοχή στη λινεζολίδη προέρχεται από νοσοκοµείο των ΗΠΑ µε ιστορικό στην επιδηµική εξάπλωση αντοχής και σε άλλους µικροοργανισµούς και αντιβιοτικά. Στο νοσοκοµείο αυτό στη διάρκεια του πρώτου εξαµήνου του 2005 αποµονώθηκαν 25 στελέχη S.epidermidis µε 65

66 αντοχή στη λινεζολίδη, που αποδόθηκε στη µακροχρόνια (>21 ηµέρες) χορήγηση του αντιβιοτικού σε συνδυασµό µε την από ασθενή σε ασθενή µετάδοση 200. Στην Ευρώπη είχαµε την εµφάνιση παρόµοιας επιδηµικής εξάπλωσης στελεχών για πρώτη φορά σε νοσοκοµείο της Ιρλανδίας κατά τη διάρκεια του δευτέρου εξαµήνου του Σε 16 ασθενείς της µονάδας εντατικής θεραπείας αποµονώθηκαν ανθεκτικά στη λινεζολίδη στελέχη S.epidermidis που η µοριακή ανάλυση έδειξε ότι έφεραν τη µετάλλαξη G2576T. Ο έλεγχος της επιδηµίας κατέστη δυνατός µε τη λήψη αυστηρών µέτρων υγιεινής (αποµόνωση ασθενών, σχολαστικός καθαρισµός) και τον περιορισµό της συνταγογράφησης λινεζολίδης 201. Σήµερα 9 χρόνια µετά την εισαγωγή της λινεζολίδης στην κλινική πράξη υπάρχουν σποραδικές αναφορές για στελέχη S.aureus που εµφανίζουν αντοχή. Η εξάπλωση είναι παγκόσµια µε την πλειονότητα των αναφορών να προέρχεται από τις ΗΠΑ 202,203,204,205,206. Όσον αφορά τα πηκτάση αρνητικά στελέχη σταφυλόκοκκου οι αναφορές είναι αρκετά περισσότερες, γεγονός που εν µέρει οφείλεται και στο µεγαλύτερο ποσοστό αποµόνωσης αυτών των στελεχών 200,201. Ο πιο κοινός µηχανισµός ανθεκτικότητας στη λινεζολίδη περιλαµβάνει µεταλλάξεις στον κεντρικό βρόχο της περιοχής V του 23S rrna. Συγκεκριµένα, η πιο συχνά εµφανιζόµενη µετάλλαξη που σχετίζεται µε ανθεκτικότητα έναντι της λινεζολίδης σε κλινικά αποµονωµένα στελέχη σταφυλόκοκκων είναι η G2576T 203. Μεταλλάξεις που έχουν επίσης αναφερθεί να συνδυάζονται µε αντοχή είναι η Τ2500Α σε στελέχη S.aureus 196 και οι C2534T, G2603T σε στελέχη S.epidermidis 207,208. Επιπρόσθετες µεταλλάξεις που έχουν παρατηρηθεί προς το παρόν µόνο σε εργαστηριακά αποµονωµένα στελέχη σταφυλόκοκκων και προσδίδουν ανθεκτικότητα στη λινεζολίδη είναι οι G2447T, G2444T, A2503G και T2504C 209. Εφόσον είναι γνωστό ότι τα περισσότερα βακτήρια διαθέτουν πολλαπλά αντίγραφα του γονιδίου του 23S rrna, αξίζει να σηµειωθεί ότι το επίπεδο της αντοχής εξαρτάται άµεσα από τον αριθµό των µεταλλαγµένων αντιγράφων του γονιδίου του 23S rrna. ηλαδή όσο µεγαλύτερο αριθµό µεταλλαγµένων αντιγράφων του γονιδίου 23S rrna έχει ένα στέλεχος, τόσο υψηλότερη είναι η αντοχή που εµφανίζει στη λινεζολίδη

67 Πρόσφατα τόσο σε στελέχη S.aureus όσο και σε ένα στέλεχος S.epidermidis είχαµε την περιγραφή ενός νέου µηχανισµού αντοχής στη λινεζολίδη, που σχετίζεται µε την ύπαρξη του γονιδίου cfr 210,211. Το γονίδιο cfr κωδικοποιεί µια µεθυλοτρανσφεράση, που πραγµατοποιεί µια µετα- µεταφραστική µεθυλίωση της αδενίνης στη θέση 2503 του 23S rrna της µεγάλης ριβοσωµικής υποµονάδας. Η µεθυλίωση αυτή επηρεάζει τη δέσµευση ορισµένων αντιµικροβιακών φαρµάκων (οξαζολιδόνες, φαινικόλες, λινκοσαµίδες), οδηγώντας σε έναν πολυανθεκτικό φαινότυπο Προηγουµένως το γονίδιο cfr είχε περιγραφεί ως µηχανισµός ανάπτυξης ανθεκτικότητας του S.sciuri στην χλωραµφενικόλη 213. Αξίζει να σηµειωθεί ότι το γονίδιο αυτό αρχικά εντοπίστηκε σε πλασµίδια που αποµονώθηκαν από στελέχη σταφυλόκοκκων ζώων, γεγονός που υποδηλώνει την ικανότητα του για οριζόντια µεταφορά µεταξύ στελεχών 214. Ωστόσο πρόσφατα το εν λόγω γονίδιο βρέθηκε ότι εδράζεται σε ενσωµατωµένα στο χρωµόσωµα ορισµένων MRSA στελεχών πλασµίδια, τα οποία διατηρούν την ικανότητα για εκτοµή και µεταβίβαση σε άλλα στελέχη 211. Στον Ελληνικό χώρο η πρώτη αναφορά στελέχους µε αντοχή στη λινεζολίδη προέρχεται από την οµάδα της Πετεινάκη και συν. και αφορά ένα στέλεχος S.haemolyticus µε MIC=12µg/ml που έφερε την µετάλλαξη G2576T. Στη συγκεκριµένη έρευνα ελέγχθηκαν 2500 στελέχη σταφυλόκοκκων (1100 S.aureus και 1400 CoNS) από 7 ελληνικά νοσοκοµεία στη διάρκεια ενός έτους. Τα στελέχη S.aureus παρέµειναν ευαίσθητα στο αντιβιοτικό µε µέση τιµή MIC=1,6 µg/ml. Τα πηκτάση-αρνητικά στελέχη σταφυλοκόκκου εµφάνισαν χαµηλότερη µέση τιµή MIC (0,93 µg/ml). Το στέλεχος S.haemolyticus αποµονώθηκε από την καλλιέργεια αίµατος ασθενούς που νοσηλευόταν στη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας χωρίς να έχει προηγηθεί χορήγηση λινεζολίδης 215. Το 2007 κατά τη διάρκεια µιας εκτεταµένης µελέτης, σχετικά µε τη δραστικότητα της λινεζολίδης, έναντι 2600 κλινικών στελεχών Staphylococcus προερχοµένων από διάφορα νοσοκοµεία της χώρας βρέθηκαν τέσσερα στελέχη S.xylosus και ένα στέλεχος S.epidermidis τα οποία εµφάνιζαν αντοχή έναντι της λινεζολίδης 216. Την ίδια χρονιά είχαµε την αποµόνωση στελεχών S.cohnii ανθεκτικών στη λινεζολίδη από 4 ασθενείς που νοσηλεύονταν στη µονάδα εντατικής θεραπείας του Σισµανόγλειου Γενικού Νοσοκοµείου. Όλα τα στελέχη έφεραν τη µετάλλαξη G2576T και

68 ανήκαν στον ίδιο κλώνο. Και στους 4 ασθενείς είχε χορηγηθεί ενδοφλεβίως λινεζολίδη για µέσο χρονικό διάστηµα 22 ηµερών 217. Το 2008 από το ίδιο νοσοκοµείο είχαµε την αναφορά ενός στελέχους S.epidermidis µε υψηλού επιπέδου αντοχή στη λινεζολίδη (MIC=256 µg/ml) το οποίο έφερε τη µετάλλαξη Τ2504Α για πρώτη φορά ΣΤΡΕΠΤΟΓΡΑΜΜΙΝΕΣ Οι στρεπτογραµµίνες είναι µεγάλη οµάδα φυσικών κυκλικών πεπτιδίων που παράγονται από είδη Streptomyces pristinaespiralis. Στην οικογένεια των στρεπτογραµµινών περιλαµβάνονται οι µικαµυκίνες, οι πριστιναµυκίνες, οι οστρεοµυκίνες και οι βιργινιαµυκίνες. Οι στρεπτογραµµίνες χωρίζονται σε 2 οµάδες: Α(S A ) και Β(S B ). Τα µέλη της οµάδας Α είναι ακόρεστα κυκλικά παράγωγα µακρολακτονών και περιλαµβάνουν την βιργιανυµικίνη Μ, την πριστιναµυκίνη ΙΙΑ και την νταλφοπριστίνη, ενώ την οµάδα Β αποτελούν η βιργιανυµικίνη S, η πριστιναµυκίνη ΙΑ και η κινοπριστίνη, παράγωγα κυκλικών εξαδοπεπτιδίων. Οι πριστιναµυκίνες έχουν χρησιµοποιηθεί σε ανθρώπους κυρίως στη Γαλλία για πολλά χρόνια για την αντιµετώπιση σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων 219. Η κινοπριστίνη και η νταλφοπριστίνη προέκυψαν από τροποποιήσεις των µορίων της πριστιναµυκίνης ΙΑ και της πριστιναµυκίνης ΙIA αντίστοιχα. Μείγµα αυτών των 2 στρεπτογραµµινών σε αναλογία 30/70 έδωσε τον πρώτο ενέσιµο ηµισυνθετικό συνδυασµό στρεπτογραµµινών (Quinupristin-Dalfopristin/ Synercid ) που µπήκε σε κλινική χρήση στις ΗΠΑ το Οι µοριακές τροποποιήσεις των φυσικών παραγώγων ήταν απαραίτητες για την αύξηση της διαλυτότητάς τους στο νερό επιτρέποντας τη χρήση του φαρµάκου σε ενέσιµη µορφή 220,221, Μηχανισµός δράσης Αν και τόσο η κινοπριστίνη όσο και η νταλφοπριστίνη έχουν βακτηριοστατική δράση, ο συνδυασµός τους δρα βακτηριοκτόνα, είναι πιο δραστικός και µπορεί να παραµείνει ενεργός ακόµα και όταν αναπτυχθεί αντοχή στο ένα από τα 2 αντιβιοτικά. Συνεπώς, η πρωτεϊνική σύνθεση εµποδίζεται προσωρινά από την ξεχωριστή δράση των µελών των οµάδων Α και Β και µόνιµα από την συνδυασµένη δράση των Α και Β. Το γεγονός αυτό αποδεικνύεται, όταν Gram(+) βακτήρια επωάζονται µε ένα µόνο ανάλογο 68

69 στρεπτογραµµίνης. Στην περίπτωση αυτή ο πολλαπλασιασµός των βακτηρίων σταµατά και ξαναρχίζει, όταν τα κύτταρα µεταφέρονται σε ένα µέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά. Έχει βρεθεί ότι ο συνδυασµός της κινοπριστίνης µε την νταλφοπριστίνη είναι οκτώ φορές πιο δραστικός από ότι καθένα από τα δύο αντιβιοτικά 223. Σε in vitro µελέτες έχει βρεθεί ότι ο συνδυασµός των 2 αντιβιοτικών έναντι στελεχών σταφυλόκοκκου δίνει χαµηλότερες MIC από ότι κάθε αντιβιοτικό χωριστά 224. Η συνεργική δράση της κινοπριστίνης-νταλφοπριστίνης προέρχεται από την αλληλεπίδραση καθενός από τα δύο παράγωγα µε το ριβόσωµα. Τόσο η κινοπριστίνη όσο και η νταλφοπριστίνη συνδέονται σε ειδικές ξεχωριστές θέσεις στην 50S ριβοσωµιακή υποµονάδα. Αρχικά προσδένεται η νταλφοπριστίνη µε αποτέλεσµα να αλλάζει η στερεοδιαµόρφωση της 50S υποµονάδας. Η νταλφοπριστίνη επιτρέπει τη συναρµολόγηση ενός φυσιολογικού συµπλόκου έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, αλλά λειτουργικά ανενεργού, γεγονός που υποδεικνύει ότι µπλοκάρει τη φάση επιµήκυνσης της πρωτεϊνοσύνθεσης, εµποδίζοντας τη σύνδεση του αµινοακυλο-trna (aatrna) στο ριβόσωµα και το σχηµατισµό πεπτιδικών δεσµών. Η αλλαγή αυτή της στερεοδιαµόρφωσης αυξάνει την τάση σύνδεσης της κινοπριστίνης στην 50S υποµονάδα, γεγονός που δικαιολογεί τη συνεργική δράση κινοπριστίνηςνταλφοπριστίνης. Η κινοπριστίνη φαίνεται να προκαλεί την αποσυναρµολόγηση (dissociation) του πεπτιδυλο-trna (peptidyl- trna) και πιθανόν αναστέλλει την έξοδο των ολοκληρωµένων πεπτιδικών αλυσίδων από το ριβόσωµα. Έτσι, λοιπόν, το τριπλό σύµπλοκο που προκύπτει (νταλφοπριστίνη + 50S ριβόσωµα + κινοπριστίνη) εµποδίζει όλα τα στάδια της πρωτεϊνοσύνθεσης, µε αποτέλεσµα να διακόπτεται και να σταµατά η βακτηριακή ανάπτυξη Αντιµικροβιακό φάσµα Η κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη είναι δραστική έναντι του S. aureus (περιλαµβανοµένων MRSA και VRSA στελεχών), των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων, των στρεπτόκοκκων, του Enterocoocus faecium, του αιµόφιλου της ινφλουέντζας, ειδών Ναϊσσεριών και Λεγεωνελλών. Ο Enterococcus faecalis και ο Staphylococcus cohnii παρουσιάζoυν εγγενή αντοχή µε µηχανισµό που δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Πιθανολογείται ότι 69

70 ευθύνεται το lsa γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί µια πρωτεΐνη η οποία αποµακρύνει την λινκοµυκίνη και τη στρεπτογραµµίνη έξω από το µικροβιακό κύτταρο. ρα επίσης έναντι αρκετών Gram(+) και Gram(-) αναεροβίων µικροβίων 225,226. Από τις in vitro έρευνες που έγιναν, βρέθηκε ότι ο συνδυασµός των 2 στρεπτογραµµινών µε άλλους αντιµικροβιακούς παράγοντες µπορεί να ελαττώσει ή και να αποτρέψει την ανάπτυξη αντοχής στην κινοπριστίνη-νταλφοπριστίνη 222. Στην κλινική πράξη χρησιµοποιείται για τη θεραπεία σοβαρών λοιµώξεων από ανθεκτικό στη βανκοµυκίνη εντερόκοκκο (VRE) που συνοδεύονται από µικροβιαιµία, για τις επιπλεγµένες λοιµώξεις δέρµατος και µαλακών µορίων και τις περιπτώσεις νοσοκοµειακής πνευµονίας οφειλόµενες στον S.aureus. Στην τελευταία περίπτωση έχει βρεθεί ότι η κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη εµφανίζει παρόµοια δραστικότητα µε τη βανκοµυκίνη 227. O συνδυασµός της κινοπριστίνης/νταλφοπριστίνη µε τη βανκοµυκίνη έχει χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία για την αντιµετώπιση MRSA λοιµώξεων που απέτυχαν να ανταποκριθούν στη µονοθεραπεία µε γλυκοπεπτίδιο 228.Το φάρµακο έχει χρησιµοποιηθεί επίσης µε επιτυχία για τη θεραπεία λοιµώξεων των οστών και των αρθρώσεων, λοιµώξεων του αναπνευστικού και περιπτώσεων ενδοκαρδίτιδας 229. Οι συχνότερες ανεπιθύµητες ενέργειες είναι η εµφάνιση αρθραλγίας, µυαλγίας θροµβοφλεβίτιδας και ναυτίας. Ωστόσο σε περιπτώσεις ηπατικής δυσλειτουργίας, µεταµόσχευσης ήπατος και ανοσοκατασταλτικής χηµειοθεραπείας το ποσοστό εµφάνισης αρθραλγίας αυξάνει σηµαντικά 230. Σύµφωνα µε το CLSI ως όριο ευαισθησίας ορίζεται τιµή MIC=1µg/ml ενώ τιµή MIC>4µg/ml ορίζεται ως αντοχή Τα στελέχη µε MIC=1-4µg/ml χαρακτηρίζονται ως ενδιάµεσης ευαισθησίας 187, Μηχανισµός αντοχής Υπάρχουν τρεις κύριοι µηχανισµοί αντοχής των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες: 1) Ενεργητική απέκκριση του αντιβιοτικού Επιτυγχάνεται µε την λειτουργία ενός µηχανισµού αντλίας εκροής (efflux pump), ο οποίος οδηγεί στην ενεργητική απέκκριση του αντιβιοτικού από το µικρόβιο. Για την ενεργητική απέκκριση µέσω του µηχανισµού αντλίας των στρεπτογραµµινών της οµάδας Α είναι υπεύθυνα τα γονίδια vga(a) και 70

71 vga(b), τα οποία κωδικοποιούν τις ATP-συνδεδεµένες πρωτεΐνες. Οι ATP πρωτεΐνες συνδέονται κατά µήκος της κυτταρικής µεµβράνης του µικροβιακού κυττάρου και δηµιουργούν ένα διαµεµβρανικό κανάλι εξόδου του αντιβιοτικού. Έχουν βρεθεί κυρίως σε πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους και σπανιότερα στον S.aureus 223,231. To 2000 ανακαλύφτηκε και µια παραλλαγή του γονιδίου vgaa(vgaav) σε κλινικά στελέχη S.aureus. Το γονίδιο εντοπίστηκε στο τρανσποζόνιο Τn5406 και ήταν υπεύθυνο για την αντίσταση στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Α 232. Στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Β υπεύθυνα για τον µηχανισµό αντλίας είναι τα γονίδια msr(a) και msr(b). Τα γονίδια msr κωδικοποιούν τις αντίστοιχων ATP πρωτεΐνες, δηµιουργώντας µηχανισµό εξώθησης (efflux) του αντιβιοτικού. Ο µηχανισµός αντοχής είναι επαγώγιµος, µε τις µακρολίδες (ερυθροµυκίνη και παράγωγα) να αποτελούν τον επαγωγέα του µηχανισµού αντλίας. Αυτό έχει ως συνέπεια όταν υπάρχει απουσία µακρολίδων οι στρεπτογραµµίνες Β να παραµένουν ενεργές. Ο αντίστοιχος φαινότυπος αντοχής είναι ο MS b. Το msr(a) γονίδιο αναγνωρίστηκε αρχικά στον S.epidermidis, για να βρεθεί αργότερα και στον S.aureus, ενώ το msr(b) βρέθηκε στον S.xylosus ) Απενεργοποίηση του αντιβιοτικού από ενδοκυττάρια ή εξωκυττάρια ένζυµα (antibiotic inactivation) Έχει βρεθεί ότι τα γονίδια vgb(a) και vgb(β) τα οποία κωδικοποιούν τις λακτονάσες (υδρολάσες) ενοχοποιούνται για την αδρανοποίηση των στρεπτογραµµινών της οµάδας Β. Συγκεκριµένα, οι λακτονάσες αποκόπτουν τον δακτύλιο της µακροκυκλικής λακτόνης του αντιβιοτικού. Ανακαλύφθηκαν το 1977 στη Γαλλία σε κλινικά στελέχη S.aureus. Tα γονίδια vat(a),vat(b) και vat(c) τα οποία κωδικοποιούν τις ακετυλοτρανσφεράσες είναι υπεύθυνα για την απενεργοποίηση των στρεπτογραµµινών της οµάδας Α. Προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά στη Γαλλία το 1975 σε στελέχη S.aureus 233,234. 3) Τροποποίηση του στόχου δράσης (target modification) Αποτελεί τον πιο συνηθισµένο µηχανισµό αντοχής στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Β. Η τροποποίηση του στόχου δράσης του αντιβιοτικού γίνεται µέσω µεθυλίωσης του 23S ριβοσωµικού RNA από τις µεθυλάσες τάξης erm (erythromycin ribosomal methylase), οι οποίες κωδικοποιούνται από τα γονίδια erma, ermb και ermc. Η µεθυλίωση τροποποιεί τη δοµή του 23S rrna, µε αποτέλεσµα την αδυναµία σύνδεσης 71

72 του αντιβιοτικού µε το ριβόσωµα. Η µεθυλίωση γίνεται στη θέση Α2058 του 23S rrna στην περιοχή V του ριβοσώµατος, που αποτελεί και το σηµείο πρόσδεσης των αντιβιοτικών της τάξης των µακρολίδων και λινκοσαµιδών. Με τον τρόπο αυτό η τροποποίηση του ριβοσωµικού στόχου συνοδεύεται από αντοχή στις µακρολίδες(μ), τις λινκοσαµίδες(l) και τις στρεπτογραµµίνες οµάδας Β(S B ). Ο αντίστοιχος φαινότυπος αντοχής είναι γνωστός ως MLS B και η πολυπλοκότητά του έγκειται στην έκφρασή του η οποία µπορεί να είναι συστασιακή ή επαγώγιµη. Στην περίπτωση του συστασιακού MLS B φαινοτύπου η παραγωγή της µεθυλάσης είναι συνεχής και τα στελέχη παρουσιάζουν διασταυρούµενη αντοχή σε µακρολίδες, λινκοσαµίδες και στρεπτογραµµίνες Β. Στον επαγώγιµο MLS B φαινότυπο η παραγωγή της µεθυλάσης επιτυγχάνεται παρουσία ενός επαγωγέα που είναι συνήθως µια µακρολίδη. Τα γονίδια που αποµονώνονται συχνότερα τόσο στον S.aureus όσο και στους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους είναι τα erm(a) και erm(c) 222,223. Ας σηµειωθεί ότι µε τον τρόπο που περιγράφηκε παραπάνω οι στρεπτογραµµίνες Α παραµένουν δραστικές έναντι των βακτηρίων που φέρουν τα erm γονίδια, µε µόνη διαφορά ότι η χορήγηση του συνδυασµού κινοπριστίνης-νταλφοπριστίνης έχει πλέον µόνο βακτηριοστατική δράση. Πρέπει να σηµειωθεί ότι ικανή και αναγκαία συνθήκη για την ανάπτυξη αντοχής στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη αποτελεί η ύπαρξη αντοχής στην νταλφοπριστίνη. Η παρουσία αντοχής στην κινοπριστίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα του συνδυασµού και τα στελέχη σταφυλόκοκκου παραµένουν φαινοτυπικά ευαίσθητα 222. Όταν η αντοχή στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Α συνδυάζεται µε ταυτόχρονη αντοχή στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Β, τα στελέχη εµφανίζουν υψηλού επιπέδου αντοχή 223. Στον πίνακα 3 που ακολουθεί συνοψίζονται τα υπεύθυνα γονίδια και οι µηχανισµοί για την ανάπτυξη αντοχής των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες. 72

73 Πίνακας 3. Γονίδια αντοχής σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες Στρεπτογραµµίνη Α (Νταλφοπριστίνη) Στρεπτογραµµίνη Β (Κινοπριστίνη) Υπεύθυνα γονίδια Μηχανισµός αντοχής vga(a), vga(b) Μηχανισµός αντλίας εκροής (efflux pump) vat(a), vat(b), vat(c) Απενεργοποίηση αντιβιοτικού µε ακετυλίωση msr(a), msr(b) Μηχανισµός αντλίας εκροής (efflux pump) vgb(a), vgb(b) Απενεργοποίηση αντιβιοτικού µε υδρόλυση erm(a),erm(b),erm(c) Τροποποίηση στόχου δράσης µε µεθυλίωση του 23S rrna 7.4 Επιδηµιολογία της αντοχής στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη Αντοχή στις στρεπτογραµµίνες µεταξύ των στελεχών σταφυλοκόκκου έχει αναφερθεί σε Γαλλικά νοσοκοµεία, όπου τα φυσικά παράγωγα (πριστιναµυκίνη, συνεργιστίνη) έχουν χρησιµοποιηθεί τόσο από του στόµατος όσο και τοπικά από τη δεκαετία του 60 για τη θεραπεία σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων. Τα πρώτα στελέχη σταφυλόκοκκου µε αντοχή στις στρεπτογραµµίνες (πριστιναµυκίνη) αναφέρθηκαν από τη Γαλλία το 1975, ενώ το ποσοστό της αντοχής σε καθένα από τα 2 συστατικά βρέθηκε να ποικίλλει από 0 έως 44%. Η αναλογία αυτών των στελεχών σταφυλόκοκκου για το συνδυασµό κινοπριστίνης-νταλφοπριστίνης υπολογίστηκε να είναι µικρότερη από 5% για τη Γαλλία. Τα στελέχη αυτά που αποµονώθηκαν από το δέρµα µετά από τοπική χρήση των στρεπτογραµµινών δεν θεωρήθηκαν κλινικά σηµαντικά 222.Η περιορισµένη χρήση των στρεπτογραµµινών στις µονάδες 73

74 εντατικές θεραπείας των γαλλικών νοσοκοµείων απέτρεψε την περαιτέρω εξάπλωση αυτών των στελεχών 219,222,235. Στις µεγάλες επιδηµιολογικές έρευνες που συνεχώς διεξάγονται το αντιβιοτικό συνεχίζει να έχει εξαιρετικά ποσοστά ευαισθησίας έναντι των στελεχών σταφυλόκοκκου. Στην έρευνα του προγράµµατος Smart που έγινε στη Βόρειο Αµερική το 1998 σε σύνολο στελεχών σταφυλόκοκκου πάνω από 99% των στελεχών S.aureus και 98% των στελεχών CoNS ήταν ευαίσθητα 221. Παρόµοια ποσοστά ευαισθησίας βρέθηκαν και σε έρευνα που διεξήχθη σε γερµανικά νοσοκοµεία την περίοδο Αρκετά στελέχη S.aureus από την Ιαπωνία και τις ΗΠΑ µε ενδιάµεση ευαισθησία στα γλυκοπεπτίδια βρέθηκαν να είναι ευαίσθητα στην κινοπριστίνη νταλφοπριστίνη 228. Στα πλαίσια του προγράµµατος Sentry στην Ευρώπη την περίοδο σε σύνολο 3052 στελεχών S.aureus βρέθηκαν 35 στελέχη µε MIC>2 mg/l. Τα στελέχη αυτά προήλθαν όλα εκτός από ένα από Γαλλικά νοσοκοµεία και ο µοριακός έλεγχος που ακολούθησε επιβεβαίωσε την παρουσία γονιδίων αντοχής στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Α και της οµάδας Β σε διαφορετικούς συνδυασµούς. Η αντοχή αυτών των στελεχών αποδόθηκε στην πίεση επιλογής από τη χρήση των πριστιναµυκινών στη Γαλλία, αν και η κατανάλωση του αντιβιοτικού δεν ήταν σε υψηλά επίπεδα 237. Σε µια πρόσφατη µελέτη µια µετάλλαξη στην L22 ριβοσωµική πρωτεΐνη ενός στελέχους S.aureus βρέθηκε να είναι υπεύθυνη για την αντοχή του στελέχους στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη. Η µετάλλαξη είχε ως αποτέλεσµα την ακύρωση της συνεργικής δράσης των 2 στρεπτογραµµινών. Στο στέλεχος αυτό, το οποίο αποµονώθηκε από ασθενή που νοσηλευόταν σε µονάδα εντατικής θεραπείας και στον οποίο είχε χορηγηθεί το αντιβιοτικό, δεν βρέθηκε κανένα από τα γονίδια αντοχής των στρεπτογραµµινών 238. Τα πιο πρόσφατα στοιχεία των επιδηµιολογικών ερευνών δείχνουν ότι το αντιβιοτικό εξακολουθεί να διατηρεί τη δραστικότητά του έναντι των στελεχών σταφυλόκοκκου σε πολύ ικανοποιητικό βαθµό και οι περιπτώσεις εµφάνισης αντοχής είναι µεµονωµένες. Συγκεκριµένα σε έρευνα που διεξάχθηκε σε 10 ευρωπαϊκές χώρες και 23 νοσοκοµεία σε σύνολο 2887 στελεχών σταφυλόκοκκου το ποσοστό αντοχής στην κινοπριστίνη-νταλφοπριστίνη ήταν 0,4% τόσο για τον S.aureus όσο και για τους CoNS 239. Σε αντίστοιχη έρευνα που έγινε στις ΗΠΑ στη διάρκεια του 2006 σε 50 νοσοκοµεία και σε σύνολο 74

75 3721 στελεχών σταφυλόκοκκου είχαµε την εµφάνιση ενδιάµεσης αντοχής στο 0,1% των στελεχών S.aureus και στο 1% των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων 240. Στην Ελλάδα η κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη εισήλθε στην κλινική πράξη το 2002 για τη θεραπεία λοιµώξεων από πολυανθεκτικά Gram θετικά µικρόβια. Μέχρι τότε δεν είχαν αποµονωθεί σταφυλόκοκκοι ανθεκτικοί στις στρεπτογραµµίνες. Η πρώτη αναφορά στελεχών σταφυλόκοκκου µε χαµηλού επιπέδου αντίσταση στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη προέρχεται από την οµάδα των Πετεινάκη και συν. από τα Πανεπιστηµιακά Νοσοκοµεία Λάρισας και Πατρών. Σε σύνολο 850 στελεχών σταφυλοκόκκου (350 S.aureus και 500 CoNS) τα οποία ελέγχθηκαν µε τη µέθοδο του Etest, ανευρέθηκαν 10 στελέχη S.hominis τα οποία εξέφραζαν χαµηλού επιπέδου αντοχή(1-4mg/l). H µελέτη των γονιδίων µε την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης έδειξε ότι όλα έφεραν το vga γονίδιο. Η κλωνικότητα των στελεχών µελετήθηκε µε την ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) και έδειξε ότι τα στελέχη ανήκουν σε 2 κλώνους 241. Σε έρευνα που ακολούθησε σε σύνολο 1200 στελεχών σταφυλόκοκκου από 4 ελληνικά νοσοκοµεία βρέθηκαν 20 στελέχη S.aureus µε MIC=2 mg/l και 40 στελέχη πηκτάση-αρνητικών σταφυλόκοκκων µε MIC>1 mg/l. Ο έλεγχος των γονιδίων υπευθύνων για την αντοχή των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες (vata, vatb, vatc, vgaa, vgab, vgb, vgbb) που ακολούθησε έδειξε ότι όλα τα στελέχη των πηκτάσηαρνητικών σταφυλόκοκκων έφεραν το γονίδιο vga, ενώ δεν βρέθηκε κανένα από τα παραπάνω γονίδια στα στελέχη S.aureus µε MIC=2 mg/l

76 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 76

77 1. ΣΚΟΠΟΣ Τα στελέχη σταφυλόκοκκου και ιδιαίτερα τα ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη (MRS=Methicillin Resistant Staphylococcus) αποτελούν από το 1961 µέχρι σήµερα έναν συνεχή κίνδυνο για νοσοκοµειακές λοιµώξεις-επιδηµίες 243. Μέχρι το 2000 πριν την εισαγωγή νεότερων αντιµικροβιακών φαρµάκων έναντι των Gram(+) κόκκων, τα στελέχη αυτά θεραπεύονταν µε γλυκοπεπτίδια δεδοµένου ότι στην πλειονότητα τους ήταν πολυανθεκτικά 244. Η χρήση των γλυκοπεπτιδίων στην κλινική θεραπευτική προκάλεσε την ανάδυση στελεχών µε ελαττωµένη ευαισθησία στα γλυκοπεπτίδια (VISA και GISA) αρχικά και µετέπειτα µε αντοχή (VRSA και GRSA) 245,246. Έτσι µετά την εµφάνιση αυτών των στελεχών, οι οξαζολιδόνες και οι στρεπτογραµµίνες αποκτούν πρωτεύοντα ρόλο στη θεραπεία των σταφυλοκοκκικών λοιµώξεων στο νοσοκοµειακό χώρο. Σύµφωνα µε το CDC (Center for Disease Control) των ΗΠΑ και το Ευρωπαϊκό ίκτυο Αντιµικροβιακής Επιτήρησης Αντοχής (EARSS) συνιστάται ο εκ των προτέρων έλεγχος της ευαισθησίας των στελεχών σταφυλόκοκκου στα παραπάνω αντιβιοτικά, προτού εµφανισθεί αντοχή 247,248. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η µελέτη της ευαισθησίας των στελεχών Staphylococcus aureus και CoNS στις ανωτέρω τάξεις των αντιµικροβιακών φαρµάκων. Στα ανθεκτικά στελέχη ακολούθησε διαδικασία διερεύνησης του υπεύθυνου µηχανισµού αντοχής. Στο νοσοκοµείο µας η εισαγωγή των οξαζολιδονών και στρεπτογραµµινών έγινε το 2003 και έτσι η µελέτη αυτή ήταν η πρώτη αποτύπωση της συµπεριφοράς των σταφυλόκοκκων στα εν λόγω αντιβιοτικά. 77

78 2. ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Υλικό Το υλικό της µελέτης αποτέλεσαν 475 στελέχη σταφυλόκοκκων που αποµονώθηκαν στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ κατά τη χρονική περίοδο Ιουλίου Όλα τα στελέχη σταφυλόκοκκων που µελετήθηκαν, αποµονώθηκαν από κλινικά δείγµατα διαφορετικών ασθενών που νοσηλεύονταν ή προσήλθαν ως έκτακτα περιστατικά στο ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ. Τα στελέχη αποµονώθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στις παθολογικές, χειρουργικές και παιδιατρικές κλινικές, στα εξωτερικά ιατρεία (ΕΙ), στη µονάδα τεχνητού νεφρού (ΜΤΝ) και στη µονάδα εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ) (πίνακας 4). Η κατανοµή τους ανάλογα µε το κλινικό δείγµα αποµόνωσης φαίνεται στον πίνακα 5. Πίνακας 4. Κατανοµή σταφυλόκοκκων στις κλινικές του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ ΚΛΙΝΙΚΕΣ S.aureus CoNS ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΕΣ ΠΑΙ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘ ΜΤΝ ΕΙ 10 2 ΣΥΝΟΛΟ

79 Πίνακας 5. Κλινικά δείγµατα από τα οποία αποµονώθηκαν οι σταφυλόκοκκοι ΚΛΙΝΙΚΑ ΕΙΓΜΑΤΑ S.AUREUS CoNS ΑΙΜΑ ΠΥΩ ΕΙΣ ΣΥΛΛΟΓΕΣ ΒΡΟΓΧΙΚΕΣ ΕΚΚΡΙΣΕΙΣ ΕΝ ΑΓΓΕΙΑΚΟΙ ΚΑΘΕΤΗΡΕΣ 9 55 ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΑΥΜΑΤΑ ΩΤΙΚΟ ΕΚΚΡΙΜΑ ΕΝΥ 2 8 ΠΛΕΥΡΙΤΙΚΟ 3 11 ΠΤΥΕΛΑ 3 2 ΛΟΙΠΑ ΥΛΙΚΑ 5 9 ΣΥΝΟΛΟ Μέθοδοι Οι µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν στη διατριβή αυτή είναι: 1. Αποµόνωση των σταφυλόκοκκων από τα κλινικά δείγµατα 2. Ταυτοποίηση και τυποποίηση των σταφυλόκοκκων I. Χρώση κατά Gram II. οκιµασία καταλάσης III. οκιµασία πηκτάσης IV. Ταυτοποίηση µε το αυτοµατοποιηµένο σύστηµα Vitek 2 (Biomerieux) 3. Έλεγχος ευαισθησίας των σταφυλόκοκκων σε αντιβιοτικά I. Έλεγχος της ευαισθησίας στη µεθικιλλίνη µε έλεγχο παραγωγής της πενικιλλινοδεσµευτικής πρωτεΐνης PBP2a. II. Έλεγχος της MIC σε συνήθη αντιβιοτικά µε το αυτοµατοποιηµένο σύστηµα Vitek 2. 79

80 III. Έλεγχος της MIC σε στρεπτογραµµίνες και οξαζολιδόνες µε τη µέθοδο του E-test. 4. ιερεύνηση των γονιδίων αντοχής vat(a,β,c), vga(a,b) vgb(a,b), erm(a,b,c) και msr(a,β) των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες µε τη µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (PCR). 5. Μοριακή ταυτοποίηση στελεχών πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων βάσει του γονιδίου tuf. 6. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis=PFGE) των ανθεκτικών στελεχών CoNS. 1. Αποµόνωση των σταφυλόκοκκων Η καλλιέργεια των διαφόρων κλινικών δειγµάτων έγινε σε κοινά στερεά θρεπτικά υλικά, όπως Αιµατούχο άγαρ, Mac Conkey άγαρ και σε κοινούς θρεπτικούς ζωµούς (Müller Hinton ζωµός, θειογλυκολικός και ζωµός αιµοκαλλιέργειας). Ο ενοφθαλµισµός σε υγρό θρεπτικό υλικό (σπορά ανάπτυξης) έγινε µε κρίκο, πιπέττα ή µε βελόνη και σύριγγα, ανάλογα µε το δείγµα. Ο ενοφθαλµισµός στα στερεά θρεπτικά υλικά (σπορά αποµόνωσης µικροβίου) έγινε µε κρίκο ή µε στυλεό. Η επώαση έγινε σε αερόβιες συνθήκες και σε θερµοκρασία 37 ο C για 24 έως 48 ώρες. Για τη συντήρηση των στελεχών χρησιµοποιήθηκε θρεπτικός ζωµός µε περιεκτικότητα 10% σε γλυκερόλη στους -70 ο C. 2. Ταυτοποίηση των σταφυλόκοκκων Η ταυτοποίηση των στελεχών σταφυλόκοκκου σε επίπεδο γένους έγινε µε τη χρώση Gram και τη δοκιµασία παραγωγής καταλάσης, ένζυµο που διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) σε H 2 O και O 2. Το ένζυµο καταλάση βρίσκεται σε όλα σχεδόν τα αερόβια και δυνητικά αναερόβια βακτήρια που έχουν κυτοχρώµατα. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου σχηµατίζεται ως τελικό προϊόν της αεροβίου διασπάσεως των σακχάρων. Η ταυτοποίηση των στελεχών σταφυλόκοκκου σε επίπεδο είδους έγινε µε τη δοκιµασία παραγωγής πηκτάσης σε αντικειµενοφόρο πλάκα (slide test) και µε τη βοήθεια του αναλυτή Vitek 2 (Biomerieux). Για την ταυτοποίηση των σταφυλόκοκκων χρησιµοποιήθηκε η κάρτα GP µε την οποία ελέγχονται 43 βιοχηµικές ιδιότητες (ID-GP card,biomerieux). 80

81 3. οκιµασίες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά Για τον έλεγχο της ευαισθησίας των αερόβιων και δυνητικά αναερόβιων µικροβίων στα αντιβιοτικά, υπάρχουν τρεις µέθοδοι: α) η µέθοδος διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ µέθοδος των δίσκων εµποτισµένων µε αντιβιοτικό. β) ο προσδιορισµός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC) µε τη µέθοδο αραίωσης των αντιβιοτικών σε υγρά ή στερεά θρεπτικά υποστρώµατα (µέθοδος µικροαραιώσεων). γ) ο προσδιορισµός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας MIC µε τη µέθοδο διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ, Ε-test. H ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα (MIC=Minimum Inhibitory Concentration) είναι η µικρότερη συγκέντρωση αντιβιοτικού που δεν επιτρέπει την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. H MIC 50 και MIC 90 είναι οι συγκεντρώσεις που αναστέλλουν την ανάπτυξη του 50% και 90% των στελεχών αντίστοιχα. 3.1 Έλεγχος της ευαισθησίας στη µεθικιλλίνη µε έλεγχο παραγωγής της πενικιλλινοδεσµευτικής πρωτεΐνης PBP2a Για την τεκµηρίωση της αντοχής στη µεθικιλλίνη είναι δόκιµο να ανιχνεύεται ή το γονίδιο που ευθύνεται (meca) ή η πρωτεΐνη PBP2a. Για την ανίχνευση της PBP2a χρησιµοποιήθηκε το Slidex MRSA Detection Test (Biomerieux). Το Slidex MRSA Detection Test αποτελεί µια ταχεία εξέταση έµµεσης συγκόλλησης για την ανίχνευση ανθεκτικών στη µεθικιλλίνη στελεχών Staphylococcus aureus µέσω ανίχνευσης της PBP2a. Πρόκειται για δοκιµασία όπου σε σωµατίδια latex έχει προσροφηθεί µονοκλωνικό αντίσωµα για την PBP2a. Η µέθοδος αν και είναι προτυποποιηµένη από τους κατασκευαστές για τον S.aureus µπορεί να εφαρµοσθεί και για τους CoNS συνδυάζοντας αυξηµένη ευαισθησία και ειδικότητα 249,250. Αρχικά, πυκνό βακτηριακό εναιώρηµα σε αντιδραστήριο εκχύλισης 1 (0.1M NaOH) επωάσθηκε για 4 λεπτά σε C. Μετά το πέρας της επώασης και αφού το µίγµα ήλθε σε θερµοκρασία δωµατίου, προστέθηκε µία σταγόνα αντιδραστηρίου εκχύλισης 2 (0.5M KH 2 PO 4 ) και οµογενοποιήθηκε 81

82 καλά. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 4500 rpm για 5 λεπτά. Πάνω στην ειδική καρτέλα µε τον κύκλο εξέτασης αναµίχθηκε µία σταγόνα του ευαισθητοποιηµένου αντιδραστηρίου latex µε 50 µl υπερκειµένου και πραγµατοποιήθηκε ανάµιξη µε κυκλική περιστροφή για 3 λεπτά. Η εµφάνιση συγκολλήσεων σηµαίνει την παραγωγή από το στέλεχος της πρωτεΐνης PBP2a. 3.2 Μελέτη φαινοτύπου αντοχής των στελεχών Σε όλα τα στελέχη έγινε έλεγχος της ευαισθησίας στα ακόλουθα αντιβιοτικά µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων, µε τον αναλυτή Vitek 2: Πενικιλλίνη, Οξακιλλίνη, Σιπροφλοξασίνη, Κλινδαµυκίνη, Γενταµυκίνη, Ερυθροµυκίνη, Τετρακυκλίνη, Ριφαµπικίνη, Φουσιδικό οξύ, Τριµεθοπρίµη/Σουλφοµεθοξαζόλη, Βανκοµυκίνη και Τεϊκοπλανίνη. Χρησιµοποιήθηκαν οι κάρτες GP και AST-P580 σε εναιώρηµα 0.5 της κλίµακας McFarland του µικροβιακού στελέχους σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. 3.3 Έλεγχος της MIC σε στρεπτογραµµίνες και οξαζολιδόνες µε τη µέθοδο του E-test Προκαταρκτικά πειράµατα µε τη µέθοδο αραίωσης των αντιβιοτικών σε άγαρ σε τυχαία επιλεγµένα στελέχη έδειξαν συµβατότητα των τιµών της MIC µε αυτές του Εtest. Έτσι ο έλεγχος της MIC σε λινεζολίδη και κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη στα 475 αποµονωθέντα στελέχη έγινε µε τη µέθοδο του Etest. Το Εtest είναι µια ποσοτική µέθοδος προσδιορισµού της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC). Το Εtest αποτελείται από µια πλαστική ταινία (5Χ60mm) βαθµονοµηµένη µε την κλίµακα MIC σε µg/ml. Στην άλλη όψη της ταινίας είναι καθηλωµένη µια προκαθορισµένη διαβάθµιση συγκεντρώσεων του αντιβιοτικού. Όταν η ταινία Etest τοποθετείται στην ενοφθαλµισµένη επιφάνεια του θρεπτικού υλικού, η ήδη διαµορφωµένη εκθετική διαβάθµιση του αντιµικροβιακού παράγοντα µεταφέρεται άµεσα στο θρεπτικό υλικό. Μετά από προκαθορισµένο χρόνο επώασης σχηµατίζεται µια έλλειψη αναστολής ανάπτυξης συµµετρική ως προς την ταινία. Η MIC διαβάζεται κατευθείαν από την κλίµακα, στο σηµείο όπου η άκρη της έλλειψης τέµνει την ταινία

83 H µέθοδος του Εtest πραγµατοποιήθηκε µε την ακόλουθη διαδικασία σύµφωνα µε οδηγίες του CLSI 252. Χρησιµοποιήθηκαν ταινίες Εtest λινεζολίδης (LZ: mg/L) και κινοπριστίνης/νταλφοπριστίνης (Q/D: mg/L) της εταιρείας AB Biodisk. 1. Με βαµβακοφόρο στυλεό παίρνουµε αποικίες καθαρού καλλιεργήµατος του µικροοργανισµού. 2. Σε σωληνάριο φτιάχνουµε εναιώρηµα 0.5 της κλίµακας McFarland όπως προτείνεται από το CLSI. 3. Ο βαµβακοφόρος στυλεός εµβαπτίζεται στο σωληνάριο για την παραλαβή του καλλιεργήµατος. Η περίσσεια του καλλιεργήµατος αφαιρείται µε πίεση του βαµβακοφόρου στυλεού στο εσωτερικό τοίχωµα του σωληναρίου. 4. Γίνεται επίστρωση του τρυβλίου Mueller-Hinton µε τον βαµβακοφόρο στυλεό σε 3 διευθύνσεις (οριζόντια, κάθετα και διαγώνια). 5. Αφήνουµε το τρυβλίο να στεγνώσει για λεπτά και στη συνέχεια τοποθετούµε την ταινία του Etest στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εφαρµόσει απόλυτα 6. Ακολουθεί επώαση στους 37 C για 48 ώρες και ανάγνωση. Η ανάγνωση της MIC γίνεται στο άκρο της ελλειψοειδούς καµπύλης που σχηµατίζεται (Εικόνα 2). Η επώαση του E-test επεκτάθηκε πέρα από τις 24 ώρες που αποτελούν το συνιστώµενο χρόνο από το CLSI, καθώς έχει αναφερθεί το φαινόµενο ότι η επώαση για 24 ώρες µπορεί να µην οδηγήσει στον εντοπισµό της αντίστασης στη λινεζολίδη

84 Εικόνα 2: Ε-test κινοπριστίνης/νταλφοπριστίνης σε στέλεχος σταφυλόκοκκου. MIC=1 µg/ml. 4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης είναι µια απλή και ευέλικτη τεχνική στην οποία µια θερµοσταθερή DNA πολυµεράση πολλαπλασιάζει in vitro το DNA που οριοθετείται από γνωστές αλληλουχίες. Η PCR επιτρέπει την παραγωγή αντιγράφων της οριοθετηµένης αλληλουχίας DNA σε πολύ µεγάλο βαθµό, για αυτό ονοµάζεται και in vitro κλωνοποίηση. Οι αλληλουχίες που οριοθετούν το υπό κλωνοποίηση τµήµα DNA είναι γνωστές και αντιστοιχούν σε συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια που λειτουργούν ως εκκινητές (primers) για την έναρξη της αντίδρασης. Στο ρυθµιστικό διάλυµα για την τέλεση της PCR επιπλέον του DNA στόχου, του ζεύγους των εκκινητών και της θερµοανθεκτικής DNA πολυµεράσης απαιτείται η παρουσία ελεύθερων 5 τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) για τη σύνθεση των θυγατρικών αλυσίδων, καθώς και δισθενών ιόντων µαγνησίου για τη βέλτιστη δράση της DNA πολυµεράσης. 84

85 Στη στοιχειώδη µορφή της PCR κάθε κύκλος επιτελείται σε τρία στάδια (εικόνα 3). Το πρώτο στάδιο είναι η αποδιάταξη του DNA στόχου (denaturation), κατά την οποία επιτυγχάνεται µετατροπή του δίκλωνου DNA σε µονόκλωνο συνήθως σε θερµοκρασίες C. Το δεύτερο στάδιο περιλαµβάνει τον υβριδισµό των εκκινητών (annealing), όπου σε θερµοκρασία C επιτυγχάνεται η σύνδεσή τους στις συµπληρωµατικές για αυτούς περιοχές του DNA στόχου. Στο τρίτο στάδιο γίνεται η επιµήκυνση των εκκινητών (extension) µε την προσθήκη δεοξυριβονουκλεοτιδίων στο εκµαγείο του DNA, µέσω της ενζυµικής δράσης της θερµοανθεκτικής DNA πολυµεράσης σε θερµοκρασία C και επιτυγχάνεται η σύνθεση της συµπληρωµατικής αλυσίδας 253. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης συνήθως πραγµατοποιείται για 25 έως 40 κύκλους. Κάθε φορά που συµπληρώνεται ένας κύκλος, η αλληλουχία στόχος διπλασιάζεται, µε αποτέλεσµα αυξάνοντας τον αριθµό των κύκλων να αυξάνεται εκθετικά και ο αριθµός των αντιγράφων του, διότι οι κλώνοι που σχηµατίζονται χρησιµοποιούνται ως εκµαγείο στον επόµενο κύκλο. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται µια γεωµετρική συσσώρευση αλληλουχιών στόχων 2 n, όπου n ο αριθµός των κύκλων, αυξάνοντας κατά πολύ την ευαισθησία της τεχνικής. 85

86 Εικόνα 3. Σχηµατική απεικόνιση σταδίων PCR ιερεύνηση των γονιδίων αντοχής των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες µε PCR Με τη µέθοδο αυτή εξετάσθηκαν όλα τα στελέχη σταφυλόκοκκων που µετά τον έλεγχο µε E-test είχαν MIC 1mg/L στην κινοπριστίνηνταλφοπριστίνη. Στη µελέτη µας αναζητήσαµε αρχικά τα γονίδια vat και vga που είναι υπεύθυνα για την αντοχή στην νταλφοπριστίνη. Στη συνέχεια σε όλα τα στελέχη, ανεξάρτητα από την αντοχή ή όχι στην νταλφοπριστίνη, προχωρήσαµε σε αναζήτηση των γονιδίων vgb, erm και msr που ευθύνονται για την αντοχή στην κινοπριστίνη. 86

87 Τα µικρόβια που µελετήθηκαν επιστρώθηκαν σε τρυβλία αιµατούχου άγαρ και επωάσθηκαν στους 37 C για 24 ώρες. Από την καλλιέργεια αυτή σχηµατίστηκε εναιώρηµα θολερότητας 2 της κλίµακας McFarland σε 1 ml νερού ελεύθερου νουκλεασών (dh 2 O), που φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις rpm. Έπειτα από την απόρριψη του υπερκειµένου, το ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 100 µl λυτικού ρυθµιστικού διαλύµατος (50 mm Tris-HCl, 1% Triton X-100, 1 mm EDTA ph 8) και 1µl πρωτεϊνάσης Κ (20 mg/ml) και επωάσθηκε για µία ώρα στους 56 0 C. Μετά το πέρας της επώασης, το ένζυµο απενεργοποιήθηκε µε θέρµανση για 10 λεπτά στους 95 0 C. Ακολούθησε φύλαξη των δειγµάτων DNA στους C ή αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR). Η αντίδραση πραγµατοποιήθηκε στον θερµοκυκλοποιητή Perkin Elmer- Gene Amp PCR System. Η διαπίστωση της ύπαρξης γονιδίων σε όλα τα δείγµατα έγινε µε ηλεκτροφόρηση του τελικού προϊόντος της αντίδρασης. Η τελευταία πραγµατοποιήθηκε σε 1.5% πηκτή αγαρόζης που περιείχε βρωµιούχο αιθίδιο. Χρησιµοποιήθηκε δείκτης µοριακών βαρών (DNA ladder) 100 bp. H ανάγνωση και φωτογράφηση των αποτελεσµάτων µετά την ηλεκτροφόρηση έγινε µε µεταφορά της πηκτής αγαρόζης σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). Τα παρακάτω στελέχη χρησιµοποιήθηκαν ως θετικοί µάρτυρες για τις αντιδράσεις PCR: στέλεχος S.aureus BM3002 για τα γονίδια vgaa, vgba, vata vatb και vatc, στέλεχος S.aureus BM12392 για το γονίδιο vgbb, στέλεχος S.aureus ΒΜ12235 για το γονίδιο vgab, στέλεχος Streptococccus pyogenes O2C1061 για το γονίδιο erm(a), στέλεχος E.faecium HM1032 για τo γονίδιo ermb, στέλεχος S.aureus HM290-1 για το γονίδιο ermc, στέλεχος S.aureus RN4220 για τα γονίδια msr(a) και msr(b). Τα στελέχη αυτά παραχωρήθηκαν από την κ.πετεινάκη. Στους πίνακες 6,7,8 φαίνονται η νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών και οι θερµικές συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν κατά την πραγµατοποίηση των αντιδράσεων PCR και στον πίνακα 9 η σύνθεση του µίγµατος αντίδρασης της PCR. 87

88 Πίνακας 6. Νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση των γονιδίων vat, vga 254. Εκκινητές Αλληλουχία νουκλεοτιδίων Γονίδιο vat-1 5 -TGGAGTGTGACAAGATAGGC-3 vat(a) vat-2 5 -GTGACAACAGCTTCTGCAGC-3 vatb-1 5 -GGCCCTGATCCAAATAGCAT-3 vat(b) vatb-2 5 -GTGCTGACCAATCCCACCAT-3 vatc-o 5 -ATGAATTCGCAAAATCAGCAAGG-3 vat(c) vatc-p 5 -TCGTCTCGAGCTCTAGGTCC-3 vga-1 5 -AGTGGTGGTGAAGTAACACG-3 vga(a) vga-2 5 -CTTGTCTCCTCCGCGAATAC-3 vgaav-1 5 -CTCCGTGTTGAAGATGTTTCG-3 vga(av) vgaav-2 5 -GGATTCAAACGCCTCTATAGCC-3 vgab-1 5 -TGACAATATGAGTGGTGGTG-3 vga(b) vgab-2 5 -GCGACCATGAAATTGCTCTC-3 Πίνακας 7. Νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση των γονιδίων vgb, erm, msr 254. Εκκινητές Αλληλουχία νουκλεοτιδίων Γονίδιο vgb-1 5 -TACAGAGTACCCACTACCGA-3 vgb(a) vgb-2 5 -TCAATTCCTGCTCCAGCAGT-3 vgbb-1 5 -CAGCAGTCTAGATCAGAGTGG-3 vgb(b) vgbb-2 5 -CATACGGATCCATCTTTTCC-3 erma-1 5'-GTTCAAGAAC AATCAATACA GAG-3' erm(a) erma-2 5'-GGATCAGGAA AAGGACATTT TAC-3' ermb-1 5'-CCGTTTACGAAATTGGAACAGGT AAAGGGC-3' erm(b) ermb-2 5'-GAATCGAGACTTGAGTGTGC-3' ermc-1 5'-GCTAATATTGTTTAAATCGTCAATTCC-3' erm(c) ermc-2 5'-GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC-3' msra-1 5'-GGCACAATAAGAGTGTTTAAAGG-3' msr(a) msra-2 5'-AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT-3' msrb-1 5'-TATGATATCCATAATAATTATCCAATC-3' msr(b) msrb-2 5'-AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT-3' 88

89 Πίνακας 8. Θερµικές συνθήκες της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων vat, vga, vgb, erm, msr 254. Γονίδια Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιµήκυνση Αριθµός κύκλων Τελική επιµήκυνση vat(a) 94 C 3 min 94 C 1 min 55 C 1 min 72 C 1 min C 10 min vat(b) 94 C 3 min 94 C 1 min 60 C 1 min 72 C 1 min C 10 min vat(c) 95 C 3 min 60 C 2 min 72 C 20 sec 95 C 20 sec 60 C 20 sec C 1 min vga(a) 94 C 3 min 94 C 1 min 55 C 1 min 72 C 1 min C 10 min vga(a)v 94 C 3 min 94 C 1 min 55 C 1 min 72 C 1 min C 10 min vga(b) 94 C 3 min 94 C 1 min 52 C 1 min 72 C 1 min C 10 min vgb(a) 94 C 3 min 94 C 1 min 52 C 1 min 72 C 1 min C 10 min vgb(b) erm (A), (Β), (C) msr (A), (B) 95 C 3 min 60 C 2 min 72 C 20 sec 95 C 20 sec 60 C 20 sec C 1 min 94 C 3 min 94 C 30 sec 52 C 30 sec 72 C 1 min C 10 min 94 C 3 min 94 C 1 min 50 C 1 min 72 C 1,5 min C 7 min 89

90 Πίνακας 9. Σύνθεση του µίγµατος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων vat, vga, vgb, erm, msr. Μίγµα αντίδρασης Ποσότητα (µl) Ρυθµιστικό διάλυµα (Buffer/0.89ΜTris, M Borate, EDTA) MgCl 2 (50mM) 3 Εκκινητής 1 (10 pm/µl) 0,5 Εκκινητής 2 (10 pm/µl) 0,5 Μίγµα dntps (25mM)- τριφωσφορικά 1 δεοξυνουκλεοτίδια Taq DNA polymerase (5 IU/µL) 0,4 Αποστειρωµένο H ,6 DNA 5 Τελικός όγκος Μοριακή ταυτοποίηση στελεχών πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων Στη µελέτη µας προτού προχωρήσουµε στην εφαρµογή της µοριακής επιδηµιολογικής συσχέτισης µε PFGE, που απαιτεί ακριβή ταυτοποίηση των στελεχών, εφαρµόσαµε ένα πρωτόκολλο µοριακής ταυτοποίησης των vga θετικών στελεχών σταφυλόκοκκου µε τη χρήση του γονιδίου tuf. Το γονίδιο tuf κωδικοποιεί τον παράγοντα επιµήκυνσης Tu (EF-Tu) που παίρνει µέρος στο σχηµατισµό της πεπτιδικής αλυσίδας και είναι απαραίτητο συστατικό του µικροβιακού DNA 255. Το 2001 έγιναν γνωστές οι επιµέρους αλληλουχίες του γονιδίου tuf για 11 είδη σταφυλόκοκκων 256. Το γονίδιο tuf πολλαπλασιάστηκε µε την πραγµατοποίηση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης, µε τη χρησιµοποίηση ειδικών για τους σταφυλόκοκκους ζεύγους εκκινητών, η ειδικότητα των οποίων έχει διερευνηθεί

91 Πίνακας 10. Νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για την ενίσχυση του γονιδίου tuf 257. Εκκινητές Αλληλουχία νουκλεοτιδίων Γονίδιο/Μέγεθος προϊόντος Tuf-1 5 -TACCATTTCAGTACCTTCTGGTAA-3 Tuf / 370 bp Tuf-2 5 -GGCCGTGTTGAACGTGGTCAAATCA-3 Πίνακας 11. Σύνθεση του µίγµατος αντίδρασης της PCR για την ενίσχυση του γονιδίου tuf Μίγµα αντίδρασης Ποσότητα (µl) Ρυθµιστικό διάλυµα (Buffer/0.89ΜTris, M Borate, EDTA) MgCl 2 (25mM) 3 Εκκινητής 1 (50 pm/µl) 0,5 Εκκινητής 2 (50 pm/µl) 0,5 Μίγµα dntps (20mM)- τριφωσφορικά 1 δεοξυνουκλεοτίδια Taq DNA polymerase (5 IU/µL) 0,4 Αποστειρωµένο H ,6 DNA 5 Τελικός όγκος 50 Η ενίσχυση του παρόντος τµήµατος του γονιδίου tuf έγινε σε 40 κύκλους σε θερµικό κυκλοποιητή µε τον ακόλουθο τρόπο. Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιµήκυνση Τελική επιµήκυνση 96 C 3 min 95 C 1 min 55 C 30 sec 72 C 30 sec 72 C 4 min Η παρουσία του τελικού προϊόντος (370 bp) επιβεβαιώθηκε µε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 2%. Στο τελικό προϊόν της αντίδρασης έγινε καθαρισµός µε τη χρήση ειδικού κιτ (PureLink PCR Purification Kit-Invitrogen), σύµφωνα µε τις οδηγίες του 91

92 κατασκευαστή, για την αποµάκρυνση των µη ειδικών προϊόντων που ενδεχοµένως να προκύπτουν από την αντίδραση. Η αλληλούχιση (sequencing) των στελεχών σταφυλόκοκκου πραγµατοποιήθηκε από την εταιρεία Cogenics (Hope End Takeley, Essex-UK). Η ταυτοποίηση κάθε στελέχους σταφυλόκοκκου ολοκληρώθηκε µε τη σύγκριση της αλληλουχίας του συγκεκριµένου τµήµατος µέσω του προγράµµατος BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), µε τις ήδη υπάρχουσες σε βάσεις δεδοµένων αλληλουχίες για το γονίδιο tuf. 6. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulse Field Gel Electrophoresis-PFGE) Η κλασσική ηλεκτροφόρηση του DNA σε αγαρόζη είναι ικανή να διαχωρίσει θραύσµατα DNA µοριακού βάρους µέχρι 50kbp. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα να δηµιουργούνται πάρα πολλές ζώνες και η ανάγνωσησύγκριση µεταξύ των στελεχών να καθίσταται δυσχερής. Το πρόβληµα ξεπεράστηκε µε τη χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών, οι οποίες αναγνωρίζουν το χρωµόσωµα σε λίγα σηµεία και δηµιουργούν έτσι µικρό αριθµό (κάτω των 30) θραυσµάτων. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα ένζυµα που αναγνωρίζουν έξι νουκλεοτίδια που περιέχουν την αλληλουχία CTAG, η οποία αποτελεί το σπανιότερο τετρανουκλεοτίδιο στο βακτηριακό γονιδίωµα 258. Η µέθοδος περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Cantor και Schwartz το 1984 και άρχισε να εφαρµόζεται συστηµατικά από τα τέλη της δεκαετίας του Περιλαµβάνει την αρχική κατάτµηση του χρωµοσωµικού DNA σε µεγάλα θραύσµατα και ακολούθως την ηλεκτροφόρησή τους σε διακυµαινόµενο ηλεκτρικό πεδίο. Η διακύµανσή του συνίσταται, τόσο ως προς την κατεύθυνση (αναγκάζοντας τα τµήµατα του DNA να επαναπροσανατολίζονται διαρκώς εντός του πηκτώµατος αγαρόζης), όσο και ως προς τη διάρκεια (πετυχαίνοντας έτσι τη µετακίνηση διαφορετικού µεγέθους θραυσµάτων). Με αυτόν τον τρόπο τα µεγάλα µόρια DNA παγιδεύονται στο πεδίο, κάθε φορά που η κατεύθυνσή του αλλάζει, και αδυνατούν να προχωρήσουν στην πηκτή αγαρόζης, αν δεν επαναπροσανατολιστούν κατά µήκος του νέου άξονα του ηλεκτρικού πεδίου. Όσο µεγαλύτερο είναι το µόριο του DNA, τόσο µεγαλύτερος είναι ο χρόνος 92

93 που απαιτείται για την επανευθυγράµµιση. Μόρια των οποίων ο χρόνος επαναπροσανατολισµού είναι µικρότερος από την περίοδο του ηλεκτρικού παλµού, θα κλασµατωθούν ανάλογα µε το µέγεθος τους. Για να αποφεύγεται ο τεµαχισµός του βακτηριακού DNA πριν από την πέψη µε το ένζυµο περιορισµού, η διαδικασία της εκχύλισης του γενετικού υλικού και η επακόλουθη πέψη του µε το ένζυµο περιορισµού γίνονται µέσα σε πλάκες ειδικής αγαρόζης χαµηλού σηµείου τήξεως, τα λεγόµενα agaroze plugs. Στη συνέχεια το πήκτωµα χρωµατίζεται µε βρωµιούχο αιθίδιο και οι ζώνες DNA αποτυπώνονται κάτω από υπεριώδες φως µε τη βοήθεια φωτογραφικής µηχανής. Η περαιτέρω ανάλυση και συσχέτιση µπορεί να διευκολυνθεί µε τη χρήση καταλλήλων προγραµµάτων λογισµικού 260. Η σηµαντικότερη ίσως αδυναµία της µεθόδου βρίσκεται στην έλλειψη κοινώς αποδεκτού πρωτοκόλλου αξιολόγησης των ηλεκτροφορητικών σχηµάτων. Προσπάθειες καθιέρωσης κριτηρίων αξιολόγησης έχουν γίνει από τα αρχικά στάδια εφαρµογής της µεθόδου, αλλά και αργότερα 261,262. Άλλα µειονεκτήµατα της µεθόδου αποτελούν ο µακρός χρόνος διενέργειάς της, καθώς η προετοιµασία κατάλληλου DNA µε τον εγκλεισµό του σε δίσκους αγαρόζης διαρκεί τρεις ηµέρες, ο ακριβός εξοπλισµός και η υψηλή τεχνογνωσία και εµπειρία που απαιτούνται. Από την άλλη µεριά η µέθοδος παρουσιάζει πλεονεκτήµατα έναντι των υπολοίπων µεθόδων επιδηµιολογικής συσχέτισης στελεχών. Με την PFGE αποδίδονται δειγµατοληπτικά διαφορές µεταξύ στελεχών σε όλη την έκταση του βακτηριακού χρωµοσώµατος και παρέχονται φάσµατα ζωνών DNA τα οποία είναι εύκολα συγκρίσιµα. Η µέθοδος διαθέτει υψηλό βαθµό επαναληψιµότητας και υψηλή διακριτική ικανότητα. Όταν χρωµόσωµα σταφυλόκοκκου, µεγέθους 2,800 Kb περίπου και περιεκτικότητα 34% σε G+C, πέπτεται µε το ένζυµο SmaI (αλληλουχία αναγνώρισης CCCGGG), η ανάλυση µε PFGE προσφέρει χρωµοσωµικό αποτύπωµα των πολύ καλά διαχωρισµένων θραυσµάτων που κυµαίνονται από 10 έως 800 Kb 263. Η PFGE είναι µια τεχνική µε υψηλή διακριτική ικανότητα και µεγάλη απόδοση στην τυποποίηση επιδηµιολογικά σχετιζόµενων στελεχών, καθώς είναι δυνατός ο εντοπισµός επιδηµίας και του υπεύθυνου κλώνου για αυτή. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Για την αξιολόγηση των αποτελεσµάτων της PFGE έχουν προταθεί διάφορα κριτήρια από πολλούς 93

94 ερευνητές. Σήµερα τα κριτήρια που χρησιµοποιούν οι περισσότεροι ερευνητές για την αξιολόγηση των ζωνών της PFGE είναι αυτά που πρότεινε ο Tenover και οι συνεργάτες τους το 1995 και τα οποία φαίνονται στο πίνακα Πίνακας 12. Κριτήρια αξιολόγησης ζωνών PFGE Κατηγοριοποίηση Στελεχών Αριθµός γενετικών διαφορών Αριθµός διαφοράς ζωνών Επιδηµιολογική σηµασία Παρόµοια 0 0 Τα στελέχη ανήκουν στον ίδιο τύπο Στενά σχετιζόµενα Τα στελέχη είναι πιθανόν συγγενικά Πιθανώς σχετιζόµενα Τα στελέχη είναι ενδεχοµένως συγγενικά ιαφορετικά 3 7 Τα στελέχη είναι διακριτά Σύµφωνα µε τα κριτήρια του Tenover δύο στελέχη θεωρείται ότι ανήκουν σε διαφορετικούς κλώνους (τύπους), όταν εµφανίζουν περισσότερες από 7 διαφορές στις ζώνες (θραύσµατα) της ηλεκτροφόρησης. Στελέχη που διαφέρουν από ένα έως έξι θραύσµατα καταχωρούνται στον ίδιο κλώνο(τύπο) και αναλόγως µε τη διαφορά των θραυσµάτων που παρουσιάζουν χαρακτηρίζονται ως πιθανώς σχετιζόµενα (4-6 διαφορετικές ζώνες) ή στενά σχετιζόµενα (2-3 διαφορετικές ζώνες). Αποµονωµένα στελέχη µπορούν να εµφανίσουν µικρές διαφορές στα αποτυπώµατα της PFGE ως αποτέλεσµα µερικών διαφορετικών γενετικών γεγονότων. Για παράδειγµα, η απώλεια µιας θέσης περιορισµού που σχετίζεται µε σηµειακή µετάλλαξη στην αλληλουχία αναγνώρισης θα προκαλέσει το συνδυασµό δύο θραυσµάτων σε ένα µεγαλύτερο. Ο πιο απλός τρόπος να περιγράψει κανείς αυτή την αλλαγή είναι να θεωρήσει ότι υπάρχει µια διαφορά τριών θραυσµάτων ανάµεσα στα δύο 94

95 PFGE αποτυπώµατα. Η εισδοχή ή απώλεια ενός λυσιγόνου φάγου δηµιουργεί µια αύξηση ή µείωση κατά 40kb σε ένα µόνο θραύσµα και εποµένως, έχει ως αποτέλεσµα µια διαφορά δύο θραυσµάτων ανάµεσα σε δύο αποτυπώµατα. Συνεπώς εάν κλινικά στελέχη εκτιµηθούν ότι επιδηµιολογικά σχετίζονται, αλλά τα PFGE αποτυπώµατά τους διαφέρουν κατά αυτόν τον τρόπο, τότε τα στελέχη θα πρέπει να θεωρηθούν τουλάχιστον ως πιθανώς σχετιζόµενα µεταξύ τους. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) στελεχών σταφυλόκοκκου A) Παρασκευή διαλυµάτων Ι) TE ρυθµιστικό διάλυµα (ΤΕ Βuffer-10mM Tris, 10mM EDTA Na 2 ) ph 7,5 Για να το παρασκευάσουµε ζυγίζουµε: 1.21 gr Tris και 3.72 gr EDTA. ιαλύουµε τα συστατικά σε 900 ml απεσταγµένου νερού, ρυθµίζουµε το ph και συµπληρώνουµε µέχρι τα 1000 ml µε απεσταγµένο νερό. Αποστειρώνουµε το διάλυµα σε 1.2 atm για 20 λεπτά. ΙΙ) Λυτικό διάλυµα EC 0.36 gr 6mM Tris, 100 ml EDTA(5M) ph 8.0, 100 ml NaCl(5M), 2.5 gr Brij 58 polyoxythelene(0,5% w/v), 1 gr Sodium deoxycholate (0,2% w/v), 2.5 gr N- laurosyl sacrosine (0,5% w/v), 1 ml MgCl 2 (0.5M). Σε 200 ml απεσταγµένου νερού προσθέτουµε 100 ml NaCl (5M) και στη συνέχεια προσθέτουµε τα υπόλοιπα συστατικά και τοποθετούµε το δοχείο σε υδατόλουτρο θερµοκρασίας 56 C µέχρις ότου διαλυθούν τα στερεά συστατικά. Ρυθµίζουµε το ph στο 7,5 και προσθέτουµε απεσταγµένο νερό µέχρι τα 500ml. ΙΙΙ) Proteolysis Buffer-Gram Negative lysis byffer Ζυγίζουµε 93 gr EDTA Na 2 και 5 gr N-laurosyl sacrosine και προσθέτουµε 300 ml απεσταγµένου νερού και στη συνέχεια NaOH ώστε να διαλυθεί το EDTA. Ρυθµίζουµε το ph στο 9,5 µε προσθήκη NaOH και συµπληρώνουµε µέχρι τα 500 ml µε απεσταγµένο νερό. IV) TBE ρυθµιστικό διάλυµα 0.5Χ ( TBE Buffer-44.5 mm Tris, 44.5 mm Boric acid, 1mM EDTA Na 2 ) ph

96 Το διάλυµα αυτό παρασκευάζεται πυκνότερο (5Χ) και αραιώνεται πριν ξεκινήσει η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης. Για να παρασκευάσουµε το 5Χ διάλυµα, ζυγίζουµε 162 gr Tris, gr EDTA και 83.5 βορικού οξέος και τα διαλύουµε σε 2.5 λίτρα απεσταγµένου νερού. Το ph δεν χρειάζεται ρύθµιση. Προσθέτουµε απεσταγµένο νερό, ώστε ο όγκος του διαλύµατος να γίνει 3 λίτρα. V) ιάλυµα περιοριστικής ενδονουκλεάσης Σε 44 µl απεσταγµένου νερού προσθέτουµε 1 µl πυκνού ενζύµου SmaI (10Units/ µl) και 5 µl πυκνού ρυθµιστικού διαλύµατος. Β) ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ I) Παρασκευή των plugs µε το βακτηριακό DNA Προχωρούµε σε ανακαλλιέργεια των στελεχών σε αιµατούχο άγαρ και επωάζουµε στους 37 C για ώρες. Για κάθε στέλεχος παρασκευάζουµε µικροβιακό εναιώρηµα θολερότητας µεγαλύτερης των 4 βαθµών της κλίµακας McFarland, σε TE ρυθµιστικό διάλυµα όγκου 2 ml. Μεταφέρουµε 200µl από αυτό το εναιώρηµα σε σωληνάρια eppendorf. Προσθέτουµε στο εναιώρηµα 5µl λυσοζύµης (1mg/ml-Sigma) και 15 µl λυσοσταφίνης (2mg/ml-Sigma), κάνοντας ήπια ανακίνηση µε την πιπέτα. Παρασκευάζουµε διάλυµα 2% LMT (low melting temperature-χαµηλού σηµείου τήξεως) αγαρόζης σε νερό και το διατηρούµε στους 55 C. Προσθέτουµε στα σωληνάρια eppendorf 200µl του διαλύµατος αγαρόζης και τοποθετούµε το µίγµα µετά από καλή ανακίνηση σε κάθε θέση της ειδικής φόρµας για plugs (εκµαγεία αγαρόζης). Ακολουθεί παραµονή στους 4 C για 10 λεπτά. Τοποθετούµε τα εκµαγεία αγαρόζης σε 2 ml λυτικό διάλυµα EC το οποίο περιέχει 1mg/ml λυσοζύµη και επωάζουµε όλη νύχτα σε κλίβανο στους 37 C. Την επόµενη ηµέρα γίνεται απόρριψη του λυτικού διαλύµατος EC, ξέπλυµα των εκµαγείων αγαρόζης µε 2 ml ρυθµιστικού διαλύµατος ΤΕ και επώαση αυτών σε 2 ml proteolysis buffer, το οποίο περιέχει 100µg/ml πρωτεΐνάση Κ. Ακολουθεί επώαση όλη νύχτα σε υδατόλουτρο στους 56 C. Την επόµενη ηµέρα γίνεται απόρριψη του proteolysis buffer,προσθήκη ρυθµιστικού διαλύµατος ΤΕ και επώαση στους 4 C για 30 λεπτά. Η όλη 96

97 διαδικασία επαναλαµβάνεται τουλάχιστον άλλες έξι φορές. Στο στάδιο αυτό υπάρχει η δυνατότητα αποθήκευσης στους 4 C για τουλάχιστον ένα µήνα σε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΕ. II) Πέψη των τµηµάτων του DNA µε το ένζυµο περιορισµού Σε ένα τρυβλίο κόβουµε το µπλοκ µε το βακτηριακό DNA. H διαδικασία αυτή γίνεται µε τη βοήθεια νυστεριού. Τα κοµµάτια πρέπει να κοπούν σε µέγεθος µικρότερο από τα µισό (περίπου 2mm).Αφού κοπούν, τοποθετούνται σε σωληνάρια eppendorf του 0.5ml. Στα σωληνάρια προστίθενται 100 µl από το ρυθµιστικό διάλυµα της περιοριστικής ενδονουκλεάσης σε συγκέντρωση 1Χ (για το ένζυµο SmaI παρέχεται σε συγκέντρωση 10Χ και γίνεται αραίωση αυτού µε απεσταγµένο και αποστειρωµένο νερό), ώστε να καλυφθούν τα µπλοκ. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά στους 4 ο C. Αφαιρείται το διάλυµα και προστίθενται 100µl φρέσκου διαλύµατος στο οποίο υπάρχουν 20 Units SmaI. Ακολουθεί επώαση για 2 ώρες στο υδατόλουτρο και στους 30 ο C. Στη συνέχεια προστίθενται και άλλα 100µl διαλύµατος µε 20 Units SmaI. Ακολουθεί πάλι επώαση για 2 ώρες στο υδατόλουτρο και στους 30 ο C. Μετά την επώαση αφαιρείται το διάλυµα του ενζύµου και τα µπλοκ µπορούν να χρησιµοποιηθούν αµέσως, οπότε επωάζονται για 30 λεπτά σε ΤΒΕ ρυθµιστικό διάλυµα, ώστε να γίνει εξισορρόπηση µε το διάλυµα της ηλεκτροφόρησης. Επίσης µπορούν να διατηρηθούν σε ΤΕ ρυθµιστικό διάλυµα για µια εβδοµάδα. Τα τµήµατα DNA γνωστού µοριακού βάρους βρίσκονται ενσωµατωµένα σε αγαρόζη. Κόβουµε ένα πολύ µικρό τµήµα και το επωάζουµε για µισή ώρα σε ΤΒΕ buffer και σε θερµοκρασία δωµατίου. ΙΙΙ) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ Παρασκευάζουµε ένα διάλυµα 100ml αγαρόζης 1% σε 0.5ΧΤΒΕ ρυθµιστικό διάλυµα. H αγαρόζη διαλύεται σε φούρνο µικροκυµάτων για 1 λεπτό. Συναρµολογούµε τη συσκευή για την παρασκευή του πηκτώµατος ώστε να έχει πλήρη εφαρµογή και να µην διαρρεύσει η αγαρόζη. Τοποθετούµε το χτένι σε απόσταση από τον πυθµένα της συσκευής ίση µε το πάχος µιας 97

98 αντικειµενοφόρου πλάκας. Αφήνουµε την αγαρόζη να αποκτήσει θερµοκρασία γύρω στους 60 ο C και µετά τη ρίχνουµε στη συσκευή. Περιµένουµε γύρω στη µισή ώρα, ώστε να σταθεροποιηθεί. Στη συνέχεια τοποθετούµε το µπλοκ µέσα στα πηγάδια προσέχοντας να µην υπάρχουν φυσαλίδες. Καλύπτουµε τα κενά µε ρευστοποιηµένη αγαρόζη 1% σε ΤΒΕ η οποία έχει θερµοκρασία περίπου 56 o C. Για το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης παρασκευάζουµε 2 λίτρα διαλύµατος 0.5ΧΤΒΕ και το τοποθετούµε στη συσκευή της ηλεκτροφόρησης, αφού προηγουµένως το έχουµε τοποθετήσει στο ψυγείο για 30 λεπτά. Φροντίζουµε ώστε να µην υπάρχουν φυσαλίδες µέσα στους σωλήνες του κυκλοφορητή και, εάν υπάρχουν, τις αποµακρύνουµε. Η θερµοκρασία του υγρού πρέπει να είναι στους 14 ο C και ακολουθεί η τοποθέτηση του πηκτώµατος. Προγραµµατίζουµε τη συσκευή για ώρες µε εναλλαγή της τάσης 5-35 sec σε κλίση τάσης 6V/cm. IV) ΒΑΦΗ ΚΑΙ ΦΩΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΤΟΥ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ Όταν ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, αποµακρύνεται το πήκτωµα από τη συσκευή, τοποθετείται σε ένα δοχείο και βάφεται για περίπου 1 ώρα µε βρωµιούχο αιθίδιο. Στη συνέχεια αποχρωµατίζουµε το πήκτωµα µε απεσταγµένο νερό. Το πήκτωµα τοποθετείται κάτω από λάµπα υπεριώδους ακτινοβολίας και φωτογραφίζεται. Ο δείκτης µοριακού βάρους που χρησιµοποιήθηκε ήταν ο Lambda Ladder PFGE Marker (BioLabs), ο οποίος έχει αποµονωθεί από το βακτηριοφάγο λ και παρέχεται εγκλωβισµένος σε 1% LMP αγαρόζη σε gelsyringe. Είναι ειδικά σχεδιασµένος για PFGE και το µέγεθός του κυµαίνεται στις Kb. 98

99 Σχήµα 3. Σχηµατική απεικόνιση της έγκλεισης DNA σε αγαρόζη, πέψη µε SmaI και ανάλυση των θραυσµάτων µε PFGE. 99

100 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Κλινικά στελέχη Κατά τη διάρκεια της περιόδου αποµονώθηκαν 475 στελέχη σταφυλόκοκκων από ασθενείς των διαφόρων κλινικών και των εξωτερικών ιατρείων του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ. Από τα 475 στελέχη σταφυλόκοκκων 140 ήταν S.aureus και 335 ήταν πηκτάση αρνητικοί. Η περαιτέρω ταυτοποίηση µε την κάρτα GP του αναλυτή Vitek 2 έδωσε την ακόλουθη κατανοµή: 251 S.epidermidis, 43 S.haemolyticus, 25 S.hominis, 7 S.warneri, 3 S.lugdunensis, 2 S.cohnii, 2 S.simulans, 2 S.capitis. 3.2 Παραγωγή PBP2a Η αντοχή των στελεχών σταφυλόκοκκου στη µεθικιλλίνη προσδιορίστηκε µε τον έλεγχο της παραγωγής της πρωτεΐνης PBP2a. Από τα 140 στελέχη S.aureus 50 παρήγαγαν την πρωτεΐνη PBP2a και ως εκ τούτου ήταν ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη (MRSA=36%), ενώ στους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους το ποσοστό που παρήγαγε PBP2a ήταν 76,1% (255 στελέχη-mrcons). Η αντοχή στη µεθικιλλίνη στο σύνολο των στελεχών που µελετήσαµε ήταν 64,8% (305 στελέχη=50 S.aureus+255 CoNS). Την υψηλότερη αντοχή εµφάνισαν τα στελέχη S.haemolyticus (MRSH=82%) και ακολούθησαν τα στελέχη S.epidermidis (MRSE=80%) και S.hominis (60%). 3.3 Φαινότυποι αντοχής των σταφυλόκοκκων στα αντιβιοτικά Με τη µέθοδο των µικροαραιώσεων ελέγχθηκε η ευαισθησία των 475 στελεχών σταφυλόκοκκου σε διάφορα αντιµικροβιακά φάρµακα µε τον αυτοµατοποιηµένο αναλυτή Vitek 2. Τα ποσοστά αντοχής των σταφυλόκοκκων φαίνονται στον πίνακα

101 Συγκεντρωτικά στο σύνολο των σταφυλόκοκκων τα ποσοστά αντοχής (%) ήταν: OX ER CLI FA SXT GM CIP TE Staph. 64,8 61,8 45,4 64, ,3 46,9 25,2 (n=475) (n=305) (n=293) (n=216) (n=306) (n=95 (n=182) (n=223) (n=120 Πίνακας 13. Ποσοστά αντοχής σταφυλόκοκκων S.aureus S.epidermidis S.haemoluticus S.hominis S.warneri % αντοχή % αντοχή % αντοχή % αντοχή % αντοχή (n=140) (n=251) (n=43) (n=25) (n=7) PE 84% (n=118) 94% (n=236) 93% (n=40) 84% (n=21) 86% (n=6) OX 36% (n=50) 80% (n=201) 82% (n=35) 60% (n=15) 29% (n=2) ER 35% (n=49) 71% (n=178) 90% (n=39) 76% (n=19) 57% (n=4) CLI 28% (n=39) 56% (n=141) 47% (n=20) 52% (n=13) 14% (n=1) FA 32% (n=45) 80% (n=201) 76% (n=33) 88% (n=22) 43% (n=3) SXT 5% (n=7) 24% (n=60) 48% (n=21) 16% (n=4) 14% (n=1) GM 20% (n=28) 46% (n=115) 67% (n=29) 28% (n=7) 14% (n=1) CIP 31% (n=43) 52% (n=130) 79% (n=34) 52% (n=13) 14% (n=1) TE 32% (n=45) 17% (n=43) 51% (n=22) 32% (n=8) 14% (n=1) VA 0% 0% 0% 0% 0% TEC 0% 0% 2% (n=1) 0% 0% 101

102 PE=Πενικιλλίνη, OX=Οξακιλλίνη, ER=Ερυθροµυκίνη, CLI=Κλινδαµυκίνη, FA=Φουσιδικό Οξύ, SXT=Τριµεθοπρίµη+Σουλφοµεθοξαζόλη, GM=Γενταµυκίνη, CIP=Σιπροφλοξασίνη, ΤΕ=Τετρακυκλίνη, VA=Βανκοµυκίνη, TEC=Τεϊκοπλανίνη Τα υψηλότερα ποσοστά αντοχής παρουσιάστηκαν στην ερυθροµυκίνη, µε τους S.aureus να βρίσκονται ανθεκτικοί στο 35% και τους CoNS στο 73,6%. Στους S.aureus η αντοχή στα αντιβιοτικά κυµάνθηκε από 20-35% µε την εξαίρεση της πενικιλλίνης που έφτασε το 84%. Στους CoNS την υψηλότερη αντοχή εµφάνισαν τα στελέχη S.haemolyticus. Όλα τα στελέχη παρέµειναν ευαίσθητα στα γλυκοπεπτίδια εκτός από ένα στέλεχος S.haemolyticus που εµφάνισε αντοχή στην τεϊκοπλανίνη. Χαµηλή αντοχή παρατηρήθηκε στην τριµεθοπρίµη-σουλφαµεθοξαζόλη για τα στελέχη S.aureus (5% αντοχή) και στην τετρακυκλίνη σε στελέχη πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων (22,3% αντοχή). 3.4 Έλεγχος MIC σε Λινεζολίδη και Κινοπριστίνη/Νταλφοπριστίνη Με τη µέθοδο του E-test ελέγχθηκε η MIC στα αντιβιοτικά λινεζολίδη και κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη στα 475 αποµονωθέντα στελέχη σταφυλόκοκκων. Το εύρος των MICs της λινεζολίδης και της κινοπριστίνης/νταλφοπριστίνης και τα ποσοστά ευαισθησίας για τον S.aureus και τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους φαίνονται στον πίνακα

103 Πίνακας 14 In vitro ευαισθησία Λινεζολίδης και Κινοπριστίνης/Νταλφοπριστίνης S.aureus (n=140) ΛΙΝΕΖΟΛΙ Η ΚΙΝΟΠΡΙΣΤΙΝΗ/ΝΤΑΛΦΟΠΡΙΣΤΙΝΗ ΕΥΡΟΣ MIC ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ MIC<4 ΕΥΡΟΣ MIC ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ MIC<1 ΕΝ ΙΑΜΕΣΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ MIC=1-4 ΑΝΤΟΧΗ MIC>4 0, ,4% 8,6% (n=128) (n=12) / MRSA (n=50) MSSA (n=90) CoNS (n=335) MRCoNS (n=255) MSCoNS (n=80) ΣΥΝΟΛΟ (n=475) 0, % (n=39) 0, ,8% (n=89) ,5% (n=320) ,1% (n=240) % (n=80) 0, % 0, ,8% (n=448) 22% (n=11) / 1,2% (n=1) / 3,5% 1% (n=12) (n=3) 4,7% 1,1% (n=12) (n=3) 0 / 2,5% 0,6% (n=24) (n=3) Κατά τον έλεγχο ευαισθησίας της λινεζολίδης δεν βρέθηκαν στελέχη σταφυλόκοκκου µε MIC>4mg/L που αποτελεί το όριο αντοχής στο αντιβιοτικό, σύµφωνα µε το CLSI. Παρατηρήθηκαν διαφορές στην MIC µεταξύ µεθικιλλίνη ευαίσθητων και µεθικιλλίνη ανθεκτικών στελεχών S.aureus. Τα MRSA στελέχη εµφάνισαν χαµηλότερες τιµές MIC στη λινεζολίδη σε σχέση µε τα MSSA. Η µέση τιµή της MIC για τους S.aureus ήταν 1.18 mg/l µε εύρος τιµών mg/l. Η MIC 50 ήταν 0.75mg/L και η MIC 90 1mg/L.Τα στελέχη των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων παρέµειναν επίσης ευαίσθητα στη λινεζολίδη µε µέση τιµή MIC 0.87 mg/l, MIC mg/l, MIC mg/l και εύρος τιµών mg/l. 103

104 Κατά τον έλεγχο ευαισθησίας στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη βρέθηκαν 12 στελέχη S.aureus και 12 στελέχη CoNS µε ενδιάµεση ευαισθησία (MIC=1-4mg/L) και 3 στελέχη µε αντοχή (1 S.epidermidis, 2 S.cohnii). Ο S.cohnii έχει φυσική αντοχή στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη διότι έχει πιθανότατα µηχανισµό αντλίας που αποµακρύνει την νταλφοπριστίνη εκτός µικροβιακού κυττάρου. H µέση τιµή της MIC ήταν 0.78 mg/l για τον S.aureus και 0.92 mg/l για τους CoNS.Οι τιµές των MIC 50 και MIC 90 ήταν 0.45 mg/l και 0.72 mg/l για τα στελέχη S.aureus και 0.5 mg/l και 0.85 mg/l για τους CoNS όπως φαίνεται στον πίνακα 14. Πίνακας 14. Τιµές MIC(µέση τιµή), MIC 50, MIC 90 σε S.aureus και CoNS Λινεζολίδη Κινοπριστίνη/Νταλφοπριστίνη MIC(mean) MIC 50 MIC 90 MIC(mean) MIC 50 MIC 90 S.aureus CoNS Στους πίνακες 15,16 φαίνονται τα στελέχη S.aureus και CoNS µε ενδιάµεση ευαισθησία και αντοχή µε τις MIC και τα χαρακτηριστικά τους. 104

105 Πίνακας 15. Στελέχη S.aureus µε MIC 1mg/l στην Κινοπριστίνη/Νταλφοπριστίνη α/α Στέλεχος MIC Κλινική / Υλικό 1 Β 2336/ S.aureus 2 ΚΧ /ΚΦΚ 2 B 2802/ S.aureus 2 ΚΧ / ΤΡΑΥΜΑ 3 B 2696/ S.aureus 2 ΚΧ / ΤΡΑΥΜΑ 4 D 267/ S.aureus 1.5 ΜΕΘ / ΑΙΜΑ 5 B 3040/ S.aureus 2 ΜΕΘ / ΒΕ 6 B 3226/ S.aureus 1.5 ΚΧ / ΤΡΑΥΜΑ 7 D 2010/ S.aureus 1,5 ΠΑΘ/ ΑΙΜΑ 8 B 4148/ S.aureus 2 ΕΙ /ΠΥΟ 9 B 4622/ S.aureus 1.5 ΜΕΘ /ΒΕ 10 B 1316/ S.aureus 2 ΜΕΘ / ΒΕ 11 D 636/ S.aureus 1 ΜΕΘ / ΑΙΜΑ 12 Β 1834/ S.aureus 1,5 ΠΑΘ / ΠΥΟ Πίνακας 16.Στελέχη CoNS µε MIC 1mg/l στην Κινοπριστίνη/Νταλφοπριστίνη α/α Στέλεχος MIC Κλινική / Υλικό 1 B 2022/ S.cohnii 6 ΧΕΙΡ / ΠΥΟ 2 B 3512/ S.hominis 1 ΚΧ / ΚΦΚ 3 B 3836/ S.epidermidis 8 ΜΕΘ / ΚΦΚ 4 D1341/ S.haemolyticus 1.5 ΜΤΝ / ΑΙΜΑ 5 B 2412/ S.epidermidis 3 ΜΕΘ /ΠΥΟ 6 D 1495/S.epidermidis 3 ΜΕΘ/ ΑΙΜΑ 7 D 1095/ S.cohnii 32 ΠΑΘ / ΑΙΜΑ 8 B 5124/ S.epidermidis 2 ΧΕΙΡ / ΤΡΑΥΜΑ 9 D 3051 S.haemolyticus 2 ΜΤΝ/ ΑΙΜΑ 10 D 227/ S.haemolyticus 2 ΠΑΘ / ΑΙΜΑ 11 D 516/ S.hominis 1 ΝΕΥΡ / ΑΙΜΑ 12 D 15 S.epidermidis 2 ΜΤΝ / ΑΙΜΑ 13 D 1722/ S.epidermidis 2 ΜΤΝ / ΑΙΜΑ 14 B 5722/ S.epidermidis 1.5 ΜΕΘ / ΚΦΚ 15 D 95/ S.epidermidis 3 ΜΤΝ / ΑΙΜΑ 105

106 ΚΧ: Καρδιοχειρουργική, ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΠΑΘ: Παθολογική, ΕΙ: Εξωτερικά Ιατρεία, ΚΦΚ: Κεντρικός Φλεβικός Καθετήρας, ΒΕ: Βρογχικό έκκριµα. ΜΤΝ: Μονάδα Τεχνητού Νεφρού, ΝΕΥΡ: Νευρολογική 3.5 οκιµασία PCR για την ανίχνευση γονιδίων αντοχής Όλα τα στελέχη που είχαν MIC 1mg/L µελετήθηκαν αρχικά για την ύπαρξη των γονιδίων που ευθύνονται για την αντοχή των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Α (vata, vatb, vatc, vgaa, vgab). Σε κανένα από τα στέλεχη S.aureus που παρουσίαζαν αντοχή µε τιµές MIC από 1 mg/l έως 2 mg/l δεν ανιχνεύτηκε κάποιο από τα παραπάνω γονίδια. Από τα 13 στελέχη των CoNS, σε 11 στελέχη ανιχνεύθηκε το vga(a) γονίδιο. Τα δύο στελέχη που ήταν vga(a) αρνητικά είχαν τιµή MIC=1mg/L. Εικόνα 4 Αντιπροσωπευτική εικόνα PCR για την ανίχνευση του γονιδίου vga. Θέση 1:Μάρτυρας µοριακού βάρος Θέση 2-4,6-8:στελέχη vga(a)+, Θέση 5:στέλεχος αρνητικό για vga, Θέση 9:Αρνητικός µάρτυρας Τα 13 στελέχη CoNS όπως και τα 12 στελέχη S.aureus µελετήθηκαν µε PCR για την ανίχνευση γονιδίων αντοχής στις στρεπτογραµµίνες της οµάδας Β (vgba, vgbβ,,erma, ermb, ermc, msra, msrb). Σε 7 στελέχη S.aureus 106

107 ανιχνεύτηκε το γονίδιο erm(c) και σε 2 στελέχη S.aureus το γονίδιο erm(a). Σε 12 στελέχη των CoNS ανιχνεύτηκε το γονίδιο erm(a). Κανένα στέλεχος δεν βρέθηκε θετικό για τα γονίδια ermb, msr και vgb. 3.6 Αποτελέσµατα από την µοριακή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των στελεχών Στα vga θετικά στελέχη έγινε µοριακή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους. Όλα τα στελέχη µελετήθηκαν βάσει του γονιδίου tuf. Το προϊόν της PCR υποβλήθηκε σε καθαρισµό και στη συνέχεια έγινε ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing). Ακολούθησε σύγκριση της αλληλουχίας του συγκεκριµένου τµήµατος µέσω του προγράµµατος BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) µε τις ήδη υπάρχουσες σε βάσεις δεδοµένων αλληλουχίες για το γονίδιο tuf. Η µοριακή ταυτοποίηση έδωσε τα ίδια αποτελέσµατα για τα 10 από τα 11 στελέχη, ενώ για το στέλεχος D1722 το οποίο αρχικά είχε ταυτοποιηθεί ως S.epidermidis µε το αυτοµατοποιηµένο σύστηµα Vitek2, µε τον µοριακό έλεγχο βρέθηκε S.haemolyticus. Τα χαρακτηριστικά των στελεχών στα οποία ανιχνεύτηκαν γονίδια αναλύονται στον πίνακα

108 Πίνακας 17. Περιγραφή των γονιδίων αντοχής σε συνδυασµό µε τις τιµές MIC στην Q/D και το φαινότυπο αντοχής στα στελέχη CoNS Στέλεχος MIC Κλινική Φαινότυπος αντοχής Γονίδιο 1 Β 3836 S.epidermidis 2 B 5124 S.epidermidis 3 B 5722 S.epidermidis 4 D 95 S.epidermidis 5 D 1495 S.epidermidis 6 D 15 S.epidermidis 7 B 2412 S.epidermidis 8 D 227 S.haemolyticus 9 D 3051 S.haemolyticus 10 D 1722 S.haemolyticus 11 D 1341 S.haemolyticus 8 ΜΕΘ CIP, CLI, ER, FA, OX, SXT vga(a)+erm(a) 2 ΧΕΙΡ CIP, CLI, ER, FA, GM, vga(a)+erm(a) OX, SXT, TE 1,5 ΜΕΘ CIP, CLI, ER, FA, OX, vga(a)+erm(a) SXT 3 ΜΤΝ CIP, CLI, ER, FA, OX, vga(a)+erm(a) SXT 3 ΜΕΘ CIP, CLI, ER, FA, OX, vga(a)+erm(a) SXT 2 ΜΤΝ CIP, CLI, ER, FA, GM, vga(a)+erm(a) OX, SXT 3 ΜΕΘ CIP, CLI, ER, OX, TE, vga(a)+erm(a) SXT 2 ΠΑΘ CIP, CLI, ER, FA, GM, OX, TE, SXT vga(a)+erm(a) 2 ΜΤΝ CIP, CLI, ER, GM, OX, vga(a)+erm(a) SXT 2 ΜΤΝ CIP, CLI, GM, OX FA, vga(a) SXT 1,5 ΜΤΝ CLI, FA, OX vga(a)+erm(a) 108

109 3.7 Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) Η γενετική συγγένεια των στελεχών σταφυλόκοκκου που παρουσίαζαν αντοχή στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη µελετήθηκε µε ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο. Μελετήθηκαν 7 στελέχη S.epidermidis, 4 στελέχη S.haemolyticus και 2 στελέχη S.cohnii που παρουσίαζαν αντοχή χωρίς να φέρουν το γονίδιο vga. Τα στελέχη αυτά αποµονώθηκαν από διάφορα κλινικά δείγµατα (αίµα 8, πύο 2, χειρουργικό τραύµα 2 και κεντρικό φλεβικό καθετήρα 1). L L Εικόνα 5. PFGE στελεχών σταφυλόκοκκων µε αντίσταση στην Q/D. Θέση 1: στέλεχος D 15, Θέση 2: στέλεχος B 3836, Θέση 3: στέλεχος B 5124, Θέση 4: στέλεχος B 5722, Θέση 5: στέλεχος D 1495, Θέση 6: στέλεχος D 95, Θέση 7: στέλεχος B 2412 S.epidermidis Θέση 8: στέλεχος D 227, Θέση 9: στέλεχος D 3051, Θέση 10: στέλεχος D 1722, Θέση 11: στέλεχος D 1341 S.haemolyticus Θέση 12: στέλεχος Β 2022, Θέση 13: στέλεχος D 1095 S.cohnii L: δείκτης µοριακού βάρους (Ladder) 109