ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 Μέρος Γ 1

2 ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ 1. Φωτονική Μικροσκοπία (α) Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου (β) Μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (γ) Μικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής (δ) Μικροσκοπία φθορισμού (ε) Συνεστιακή μικροσκοπία 2. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία (HM) (α) ΗΜ Διέλευσης (β) ΗΜ Σάρωσης ΙΙ. ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ (α) Διαφορική φυγοκέντριση (β) Υπερφυγοκέντριση (γ) Φυγοκέντριση σε διαβάθμιση πυκνότητας (δ) Φυγοκέντριση ταχύτητας (ε) Φυγοκέντριση ισορροπίας ΙΙΙ. ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΖΩΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ σε καλλιέργεια (α) Πρωτογενείς καλλιέργειες (β) Κυτταρικές σειρές IV. ΙΟΙ (α) Ζωϊκοί ιοί (β) Βακτηριοφάγοι ή φάγοι 2

3 ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Τα κύτταρα κάτω από το μικροσκόπιο Η οπτική παρατήρηση είναι απαραίτητη για τη μελέτη και κατανόηση της Βιολογίας του κυττάρου. Τα κύτταρα έχουν πολύ μικρό μέγεθος, αλλά είναι διακριτά με το Φωτονικό μικροσκόπιο. Μεγαλύτερη λεπτομέρεια της δομής και ορισμένων μακρομορίων του, αναλύεται με Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Η ανακάλυψη & εξέλιξη του Φωτονικού μικροσκοπίου 1665: Robert Hooke - Εξέταση φελλού 1670: Antony van Leeuwenhoek - Εξέλιξη μικροσκοπίου, παρατήρηση: βακτήρια έως ερυθροκύτταρα 1838: Matthias Schleiden (Βοτανολόγος) - Εξέταση φυτικών κυττάρων 1839: Theodor Schwann (Ζωολόγος) - Εξέταση ζωϊκών κυττάρων Οι Schleiden & Schwann θεμελίωσαν το δόγμα της Κυτταρικής Θεωρίας: «Ολοι οι οργανισμοί αποτελούνται από κύτταρα», που σηματοδότησε την γένεση της Σύγχρονης Κυτταρικής Βιολογίας 1860: Louis Pasteur - Προέκταση της κυτταρικής θεωρίας: «Τα κύτταρα δεν προκύπτουν αυθόρμητα (de novo), αλλά από διαίρεση προϋπαρχόντων» & κληρονομούν χαρακτηριστικά των μητρικών κυττάρων 1858: Charles Darwin - Θεωρία της εξέλιξης: Απέδειξε ότι «η τυχαία παραλλαγή & η φυσική επιλογή προάγουν τη δημιουργία οργανισμών με νέα χαρακτηριστικά». Η θεωρία της εξέλιξης ερμηνεύει την εμφάνιση της ποικιλότητας σε οργανισμούς με κοινούς προγόνους Η θεωρία της Εξέλιξης σε συνδυασμό με την Κυτταρική θεωρία παρέχει μια θεώρηση όλης της Ζωής 3

4 Ι. ΤΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ & ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΓΕΝΘΥΣΗ 0.2 mm (200 μm) Ελάχιστο διακριτό όριο δια γυμνού οφθαλμού 1 m = 10 3 mm = 10 6 μm = 10 9 nm ΚΥΤΤΑΡΑ 0.2 μm (200 nm ) Ελάχιστο διακριτό όριο του φωτονικού μικροσκοπίου ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΜΟΡΙΑ 0.2 nm Ελάχιστο διακριτό όριο του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου ΑΤΟΜΑ 4

5 ΤΟ ΠΡΩΤΟ ΦΩΤΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Ο Robert Hooke (1665), πρώτος επινόησε και χρησιμοποίησε ένα απλό φωτονικό μικροσκόπιο που μεγένθυνε δομές έως και 300 φορές σε σχέση με το πραγματικό τους μέγεθος. Παρατήρησε μια λεπτή τομή φελλού και διαπίστωσε ότι ο φυτικός ιστός χωρίζεται σε χιλιάδες μικρά κύτταρα, που πακετάρονται το ένα κοντά στο άλλο ή διαχωρίζονται από την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Η κυτταρική δομή του φελλού *Αναπαραγωγή από σχέδιο του Robert Hooke. Απεικονίζεται λεπτή τομή φελλού κάτω από το φωτονικό μικροσκόπιο. **Τα «κύτταρα» που παρατήρησε ήταν στην πραγματικότητα τα κυτταρικά τοιχώματα νεκρών κυττάρων 5

6 Το ΣΥΓΧΡΟΝΟ ΦΜ µεγεθύνει δοµές µέχρι 1000 φορές. Τα κύτταρα µ ΦΩΤΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ καθώς έχουν διάµετρο από µm. Μπορούν να παρατηρηθού µιτοχόνδρια & χλωροπλάστες. Όχι όµως λεπτοµέρειες της κυτταρικής ικανότητα (resolution) είναι σηµαντικότερη από την µεγαλύτερη µεγέθυνσ Το ΣΥΓΧΡΟΝΟ ΦΜ μεγεθύνει δομές μέχρι 1000 φορές. Τα κύτταρα μπορούν να παρατηρηθούν καθώς έχουν διάμετρο από μm. Μπορούν να παρατηρηθούν τα οργανίδια: πυρήνες, μιτοχόνδρια & χλωροπλάστες. Όχι όμως λεπτομέρειες της κυτταρικής δομής. Έτσι η Διακριτική Ικανότητα (resolution) είναι σημαντικότερη από την μεγαλύτερη μεγέθυνση, που προκαλεί θολότητα Προσοφθάλμιος φακός Αριθµητικ ε σ τ ι ά ζ ε συγκεντρ συλλέγετα φακό. Τ ορίζεται α φ ω τ ό ς αντικειµεν διάθλαση φακού κα Βασικά τεχνικά στοιχεία του ΦΜ 6 Αριθ nu

7 Αριθµητικό άνοιγµα ( ε σ τ ι ά ζ ε τ α ι σ τ ο συγκεντρωτικό φακ συλλέγεται από τον φακό. Το αριθµητι ορίζεται από τη γωνία κ φ ω τ ό ς π ο υ ε ι σ έ ρ αντικειµενικό φακό & τ διάθλασης αέρα ή λαδιο φακού και δείγµατος. ΦΩΤΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Τα τεχνικά χαρακτηριστικά του ΦM είναι 2: Βασικά τεχνικά στοιχεία του ΦΜ Αριθµητικό άνοιγµ numerical Apper 1. Αριθμητικό άνοιγμα (ΝΑ: Numerical Apperture) Το φως εστιάζεται στο δείγμα με συγκεντρωτικό φακό και μετά συλλέγεται από το αντικειμενικό φακό. Το αριθμητικό άνοιγμα ορίζεται: από τη γωνία κώνου (α) του φωτός που εισέρχεται στο αντικειμενικό φακό & το συντελεστή διάθλασης αέρα ή λαδιού μεταξύ φακού και δείγματος. 7

8 2. Η ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ (ΔΙ) είναι η ικανότητα ενός μικροσκοπίου να διακρίνει αντικείμενα που βρίσκονται σε μικρή απόσταση μεταξύ τους. Το όριο της ΔΙ ενός ΦΜ είναι 0.2 μm - Αν 2 αντικείμενα βρίσκονται σε μικρότερη απόσταση των 0.2μm τότε φαίνονται ως ΕΝΑ Το όριο της ΔΙ ΚΑΘΟΡΙΖΕΤΑΙ από 2 παράγοντες: (α) το μήκος κύματος (λ) του ορατού φωτός, και (β) τα τεχνικά χαρακτηριστικά του αντικειμενικού φακού του και δίνεται από την εξίσωση: ΔΙ = 0,61 λ NA (0.61= μία σταθερά) Η τιμή λ του ορατού φωτός που χρησιμοποιείται στα ΦΜ είναι 0.5μm. Το ΑΡΙΘΜΗΤΙΚΟ ΑΝΟΙΓΜΑ (NA) σχετίζεται με τις διαστάσεις του κώνου φωτός που εισέρχεται στον αντικειμενικό φακό, αφού έχει περάσει μέσω του δείγματος, και δίνεται από τον τύπο: NA = η sin α (sin=ημίτονο) η = δείκτης διάθλασης μέσου μεταξύ δείγματος & αντικειμενικού φακού; η = 1 (αέρα) & η = 1.4 (ειδικό λάδι) Η γωνία α αντιστοιχεί στο μισό πλάτος του κώνου φωτός που συγκεντρώνεται από τον αντικειμενικό φακό και η μέγιστη τιμής της είναι 90 ο (sinα = 1), έτσι ώστε η μέγιστη δυνατή τιμή του NA να είναι 1.4 Άρα το θεωρητικό όριο της ΔΙ του ΦΜ υπολογίζεται ως: ΔΙ = 0,61 λ = 0.61 x 0.5 = 0.22 μm NA 1.4 x1 8

9 ΤΥΠΟΙ ΦΩΤΟΝΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ (ΦΜ) 1. Μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου ή Οπτικό μικροσκόπιο 2. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων 3. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων-διαφορικής συμβολής - Αν χρησιμοποιηθούν φθορίζουσες χρωστικές ουσίες, τότε αξιοποιείται: α. Το Συμβατικό Μικροσκόπιο Φθορισμού για μεγαλύτερη λεπτομέρεια β. Το Συνεστιακό Μικροσκόπιο με φωτεινή δέσμη λέιζερ γ. Μικροσκοπία διέγερσης πολλαπλών φωτονίων, μια εναλλακτική μορφή συνεστιακής μικροσκοπίας Τι μπορούν να διακριθούν με το Φωτονικό Μικροσκόπιο ; -Διακρίνονται τα ανατομικά χαρακτηριστικά του κυττάρου: κυτταρική μεμβράνη, ο πυρήνας που είναι ένα μεγάλο σφαιρικό σωματίδιο και το κυτταρόπλασμα που βρίσκεται γύρω από τον πυρήνα και τα οργανίδια & ίνες. - Ωστόσο, λεπτομέρειες δομών μικρότερες από 0.2μm (200 nm) δεν μπορούν να διακριθούν * Βακτήρια & μιτοχόνδρια μεγέθους 0.5 μm, είναι τα μικρότερα που μπορούν να διακριθούν με ΦΜ 9

10 1. Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου - Στην μικροσκοπία φωτεινού πεδίου, το φως διέρχεται από το ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ του κυττάρου. -Η διάκριση κυτταρικών δομών εξαρτάται από την ΑΝΤΙΘΕΣΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ του ορατού φωτός των επιμέρους δομών του κυττάρου. -Προκειμένου να ενισχυθεί η αντίθεση μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών δομών, τα κύτταρα υποβάλλονται σε χρώση με χρωστικές ουσίες που αντιδρούν με πρωτεΐνες ή νουκλεϊκά οξέα. *Πριν τη χρώση τα δείγματα μονιμοποιούνται με αλκοόλη, οξικό οξύ ή φορμαλδεΰδη ώστε να διατηρηθούν οι δομές τους **Οι διαδικασίες χρώσης είναι τοξικές και ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ κατάλληλες για πειράματα παρατήρησης ΖΩΝΤΑΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Φωτογραφία ιστού μικροσκοπίας φωτεινού πεδίου μετά από χρώση. Τομή καλοήθους ηπατικού όγκου. Οι πυρήνες φαίνονται σκοτεινοί (άσπρα βέλη) 10

11 Χωρίς χρώση η διέλευση του φωτός ΔΕΝ παρέχει επαρκή αντίθεση διάκρισης πολλών κυτταρικών δομών. Έτσι, χρησιμοποιούνται διαφοροποιημένοι τύποι ΦΜ με ενίσχυση της αντίθεσης φωτός που διέρχεται από περιοχές με διαφορετική πυκνότητα. Δύο μέθοδοι απεικόνισης ζωντανών κυττάρων είναι: 2. Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεων & 3. Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεων-διαφορικής συμβολής Και τα 2 είδη, χρησιμοποιούν οπτικά συστήματα που μετατρέπουν διαφορές στην πυκνότητα ή στο πάχος μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών δομών σε διαφορές ΑΝΤΙΘΕΣΗΣ στην τελική εικόνα -Στην μικροσκοπία φωτεινού πεδίου, ο πυρήνας παρουσιάζει χαμηλή αντίθεση καθώς απορροφά ασθενώς το φώς. Εντούτοις, η ταχύτητα του φωτός επιβραδύνεται καθώς διέρχεται με αποτέλεσμα να τροποποιείται η φάση του σε σύγκριση με το κυτταρόπλασμα *Οι μικροσκοπίες αντίθεσης φάσης και αντίθεσης-διαφορικής συμβολής μετατρέπουν τις διαφορές φάσης σε διαφορές αντίθεσης που βελτιώνει την εικόνα ΖΩΝΤΑΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ, που: δεν είναι επεξεργασμένα με χρωστικές Μικροσκοπική παρατήρηση ζωντανών κυττάρων (Α) φωτεινού πεδίου, (Β) αντίθεσης φάσης, & (Γ) αντίθεσης-διαφορικής συμβολής 11

12 4. Μικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής, ενισχυόμενη από βίντεο Οι δυνατότητες του ΦΜ έχουν διευρυνθεί με χρήση ΒΙΝΤΕΟΚΑΜΕΡΑΣ & ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ. Αυτά ενισχύουν την αντίθεση εικόνων όπου επιτρέπεται η οπτική απεικόνιση μικρών δομών που δεν θα μπορούσαν να ανιχνευθούν σε άλλες συνθήκες Με την μικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής ενισχυόμενη από βίντεο: έγινε εφικτή η οπτική απεικόνιση της κίνησης ινιδίων κυτταροσκελετού με διάμετρο μm, κατά μήκος των μικροσωληνίσκων *Επειδή το όριο ΔΙ του ΦΜ παραμένει στο επίπεδο των 0.2μm, η μικροσκοπία αυτή επιτρέπει μεν την οπτική απεικόνιση μικροσωληνίσκων, αλλά αυτοί εμφανίζονται ως ΘΟΛΕΣ ΔΟΜΕΣ, ενώ μεμονωμένοι δεν διακρίνονται από δέσμες παρακείμενων δομών Μικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής ενισχυόμενη από βίντεο Η ηλεκτρονική επεξεργασία επιτρέπει την απεικόνιση μεμονωμένων μικροσωληνίσκων 12

13 Μικροσκοπία Μικροσκοπία φθορισμού φθορισµού Η Η ΜΦ ΦΜ μέσω µέσω σήμανσης σήµανσης μορίων µορίων συμβάλλει συµβάλλει την την απεικόνιση απεικόνιση δομών δοµών στο στο ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ εσωτερικό των των κυττάρων. κυττάρων. Τα Τα γονίδια γονίδια ανιχνεύονται ανιχνεύονται µετά μετά από από: υβριδισµό α. υβριδισμό µε με ιχνηθέτες ιχνηθέτες νουκλεϊκών νουκλεϊκών οξέων οξέων συµπληρωµατικής συμπληρωματικής αλληλουχίας, αλληλουχίας, ενώ ενώ β. οι οιπρωτεΐνες πρωτεΐνεςµε μεσηµασµένα σημασμένα αντισώµατα. αντισώματα. Στη Στη σήµανση σήμανση µονιµοποιηµένων μονιμοποιημένων ή ζωντανών ζωντανών κυττάρων κυττάρων χρησιμοποιείται χρησιµοποιείται μια µια φθορίζουσα φθορίζουσα χρωστική χρωστική (χημική (χηµική ένωση): ένωση): που που απορροφά απορροφά φως φως σε σε ένα ένα μήκος µήκος κύματος κύµατος και και εκπέμπει εκπέµπει σε σε ένα ένα δεύτερο δεύτερο μήκος µήκος κύματος κύµατος ακτίνα φθορισμού ακτίνα διέγερσης Ανίχνευση μικροσωληνίσκων (φθορίζουσα ουσία) Μικροσκοπία φθορισμού: φθορισµού: (Α) Το φως διέρχεται από φίλτρο διέγερσης, που επιλέγει το μήκος µήκος κύματος κύµατος (π.χ. μπλε) µπλε) της της ακτινοβολίας διέγερσης της φθορίζουσας χρωστικής. Ένα διχρωϊκό διχρωικό κάτοπτρο εκτρέπει τη τη δέσμη δέσµη φωτός προς το το δείγμα. δείγµα. Ο φθορισμός φθορισµός που εκπέμπεται εκπέµπεται από το δείγμα δείγµα (π.χ. (π.χ. μήκος µήκος κύματος κύµατος στο στο πράσινο) διέρχεται από το το διχρωϊκό διχρωικό κάτοπτρο & ένα φίλτρο φραγμού φραγµού για την την επιλογή του του μήκους µήκους κύματος κύµατος φθορισμού φθορισµού που εκπέμπει εκπέµπει η χρωστική. (Β) Φωτογραφία πνευμονικού πνευµονικού κυττάρου σαλαμάνδρας. σαλαµάνδρας. Το Το DNA εμφανίζεται εµφανίζεται μπλε µπλε ενώ οι μικροσωληνίσκοι µικροσωληνίσκοι στο κυτταρόπλασμα κυτταρόπλασµα μεµε πράσινο

14 Στην εξέλιξη της μικροσκοπίας φθορισμού συνέβαλε η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescence Protein; GFP) της μέδουσας. Η GFP μπορεί να συντηχθεί με οποιαδήποτε πρωτεΐνη μέσω τεχνικών ανασυνδυασμένου DNA. Η σημασμένη πρωτεΐνη εκφράζεται και ανιχνεύεται με μικροσκοπία φθορισμού. Στο κυτταρικό εντοπισμό της χρησιμοποιούνται ΚΑΙ ΖΩΝΤΑΝΑ κύτταρα χωρίς να είναι απαραίτητη η μονιμοποίηση των κυττάρων. Σήμερα, είναι διαθέσιμες φθορίζουσες πρωτεΐνες σε μπλε, κίτρινο ή κόκκινο φθορισμό, για την διεύρυνση εφαρμογής της τεχνικής Μικροσκοπία φθορισμού πρωτεΐνης σημασμένης με GFP. Απεικόνιση με Μικροσκοπία Φθορισμού νευρώνων ποντικού σε κυτταροκαλλιέργεια, μετά από εισαγωγή μιας GFP-συντηγμένης πρωτεΐνης που συνδέεται με μικροσωληνίσκους. Οι πυρήνες εμφανίζονται μπλε 14

15 Τεχνική της ανάκτησης φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (FRAP) FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching) Διάφορες τεχνικές αναπτύχθηκαν για την καταγραφή των ΚΙΝΗΣΕΩΝ και ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ πρωτεϊνών που έχουν σημανθεί με GFP στο εσωτερικό ζωντανών κυττάρων. Μια τέτοια μέθοδος είναι η τεχνική Ανάκτησης Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση Ανάκτηση φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (FRAP). Η περιοχή της σημασμένης με GFP πρωτεΐνης υφίσταται φωτολεύκανση με ακτίνα λέιζερ ΥΨΗΛΗΣ έντασης. Ο φθορισμός ανακτάται σταδιακά καθώς μόρια πρωτεΐνης που δεν έχουν υποστεί φωτολεύκανση μετακινούνται με διάχυση στην ακτινοβολημένη περιοχή. Ο ρυθμός ανάκτησης φθορισμού παρέχει ένα μέτρο της ταχύτητας κίνησης πρωτεϊνικών μορίων στο κύτταρο 15

16 Μεταφορά ενέργειας συντονισμού μεταξύ φθοριζουσών ομάδων (FRET) Η τεχνική μεταφορά ενέργειας συντονισμού μεταξύ φθοριζουσών ομάδων (FRET) χρησιμοποιείται για ανάλυση ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ μεταξύ 2 πρωτεϊνών σ ένα κύτταρο. Οι υπό εξέταση πρωτεΐνες συνδέονται με ΠΑΡΑΛΛΑΓΕΣ ΜΙΑΣ φθορίζουσας χρωστικής, (π.χ. της GFP) που απορροφούν και εκπέμπουν σε διακριτά μήκη κύματος και η μία μπορεί να ΔΙΕΓΕΙΡΕΙ την άλλη μέσω μεταφοράς ενέργειας (και ΟΧΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ) από τη μία στην άλλη, όταν βρίσκονται σε μικρή απόσταση * Προστέθηκε το ΔΕΝ. Στο βιβλίο είναι λάθος Η τεχνική μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθοριζουσών ομάδων (FRET) Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με φως μήκους κύματος που διεγείρει την GFP1. Αν οι δύο πρωτεΐνες δεν αλληλεπιδρούν, η εκπεμπόμενη ακτινοβολία θα ανιχνευθεί σε μήκος κύματος εκπομπής φθορισμού της GFP1. Αν όμως αλληλεπιδρούν: η διέγερση θα μεταφερθεί από την GFP1 στην GFP2, και η εκπεμπόμενη ακτινοβολία θα ανιχνευθεί σε μήκος κύματος εκπομπής φθορισμού της GFP2 16

17 Συνεστιακή Μικροσκοπία (Confocal Microscopy) - Ι Η εικόνα της Συμβατικής Μικροσκοπίας Φθορισμού είναι θολή λόγω μη εστιασμένου φθορισμού. Όμως μπορεί να βελτιωθεί με μαθηματική διόρθωση, ΜΕΣΩ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ, αναλύοντας εικόνες από ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ βάθη (επίπεδα) εστίασης. Έτσι προκύπτει ευκρινής εικόνα, για ένα μόνο σημείο εστίασης. Τέτοιες εικόνες υψηλής αντίθεσης & λεπτομέρειας μέσω ανάλυσης φθορισμού από ΕΝΑ και ΜΟΝΟ σημείο του δείγματος παρέχει η Συνεστιακή Μικροσκοπία. (βιντεοκάμερα) Συνεστιακή μικροσκοπία Το φως ακτίνας λέηζερ (συνήθως) εστιάζεται σε σημείο του δείγματος, σε συγκεκριμένο βάθος. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός καταγράφεται στη συνέχεια από έναν ανιχνευτή (π.χ. βιντεοκάμερα). Το εκπεμπόμενο φως πριν φτάσει στον ανιχνευτή, διέρχεται από μικρή οπή που ονομάζεται ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΗ ΙΡΙΔΑ, τοποθετημένη ακριβώς στο σημείο όπου εστιάζεται το φως από το επιλεγμένο βάθος του δείγματος. Επομένως, μόνον το φως που εκπέμπεται από το εστιασμένο σημείο μπορεί να φτάσει στον ανιχνευτή 17

18 Συνεστιακή Μικροσκοπία (Confocal Microscopy) - ΙΙ Με σάρωση ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΣΗΜΕΙΩΝ του δείγματος δημιουργείται δισδιάστατη εικόνα του επιπέδου εστίασης, πολύ πιο ευκρινέστερη από εκείνη της Συμβατικής Μικροσκοπίας Φθορισμού μικροσωλήνες Φωτογραφία Συνεστιακού Μικροσκοπίου ανθρώπινων κυττάρων. Οι μικροσωληνίσκοι έχουν υποστεί χρώση με κόκκινη, ενώ τα ινίδια ακτίνης με πράσινη φθορίζουσα χρωστική. ινίδια ακτίνης - Επιπλέον, είναι δυνατόν να καταγραφεί σε ψηφιακή μορφή μια σειρά δισδιάστατων εικόνων από διαφορετικά επίπεδα, ο συνδυασμός των οποίων οδηγεί σε ΤΡΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ εικόνα 18

19 Συνεστιακή Μικροσκοπία (Confocal Microscopy) - ΙΙ Παράδειγμα Συνεστιακού Μικροσκοπίου ανθρώπινων κυττάρων δέρματος. Παρουσιάζονται ενδοκυτταρικές ίνες κερατίνης χρωσμένες με φθορίζουσα ουσία 19

20 Μικροσκοπία διέγερσης Διέγερσης πολλαπλών Πολλαπλών φωτονίων Φωτονίων ναι Είναι εναλλακτική εναλλακτική µορφή μορφή Συνεστιακής Μικροσκοπίας. Η προσπίπτουσα Η ακτινοβολία λέιζερ λέιζερέχει έχει ιλεγµένο επιλεγμένο µήκος μήκος κύµατος κύματος έτσι έτσι ώστε ώστε να απαιτείται να απαιτείται ταυτόχρονη ταυτόχρονη απορρόφηση απορρόφηση 2 ή περισσοτέρων τονίων από 2 φωτόνια για διεγέρση γιατης διεγέρση φθορίζουσας της φθορίζουσας χρωστικής. χρωστικής. πιθανότητα Η αυτή πρόσπτωσης των 2 φωτονίων, 2 φωτονίων, είναι σηµαντική αφορά µόνο ΜΟΝΟστο τοσηµείο Σημείοεστίασης Εστίασης του του δείγµατος δείγματος και και πέµπεται εκπέμπεται φθορισµός φθορισμός µόνο ΜΟΝΟ από από το σηµείο το Σημείο αυτό. αυτό. Αυτή Αυτή η εξαιρετικά η εξαιρετικά εντοπισµένη εντοπισμένη διέγερση παρέχει αυτόµατα αυτόματατρισδιαστατη ανάλυση χωρίς χωρίςτην τηνανάγκη ανάγκη Ιριδας, Ιριδας, της στη Συνεστιακής κροσκοπίας μικροσκοπία. 1Χ φωτόνια 2Χ φωτόνια Μικροσκοπία διέγερσης δύο φωτονίων. Η διέγερση της φθορίζουσας χρωστικής απαιτεί ταυτόχρονη απορρόφηση δύο φωτονίων, που επιτυγχάνεται μόνο στο σημείο οπου εστιάζεται το εισερχόμενο φως. Έτσι, εκπέμπεται φθορισμός μόνο από το επιλεγμένο βάθος του δείγματος ικροσκοπία διέγερσης δύο φωτονίων Η διέγερση της φθορίζουσας χρωστικής απαιτεί υτόχρονη απορρόφηση δύο φωτονίων, που επιτυγχάνεται µόνο στο σηµείο οπου εστιάζεται το ερχόµενο φως. Έτσι, εκπέµπεται φθορισµός µόνο από το επιλεγµένο βάθος του δείγµατος

21 Μέρος Δ 21

22 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΗΜ) έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα (ΔΙ) από το ΦΜ, επειδή το μήκος κύματος λ (ηλεκτρονίων) του ΗΜ είναι 1000 φορές μικρότερο του ορατού φωτός. Θεωρητικά το λ αυτό θα μπορούσε να προσδώσει ΔΙ nm. Αυτό δεν είναι εφικτό, καθώς η ΔΙ δεν καθορίζεται μόνο από το λ αλλά και από το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού που είναι περιοριστικός παράγοντας. Έτσι, η ΔΙ του ΗΜ είναι ~ nm και σε βιολογικά δείγματα περιορίζεται μεταξύ 1-2 nm λόγω έλλειψης αντίθεσης, αλλά 1000 φορές μεγαλύτερη του ΦΜ Τύποι ηλεκτρονικού (ηλεκτρονιακού) μικροσκοπίου 1. ΗΜ διέλευσης: Χρησιμοποιείται για την εξέταση λεπτών ιστικών τομών. Οι βασικές αρχές του είναι παρόμοιες με αυτές του ΦΜ, αλλά αντί για φως χρησιμοποιείται δέσμη ηλεκτρονίων 2. ΗΜ σάρωσης: Χρησιμοποιείται στην εξέταση επιφανειακών κυτταρικών λεπτομερειών και άλλων δομών & στην εξέταση δομής βιολογικών μεμβρανών πάχους μόλις 2 μορίων (λιπιδίων). Σύγκριση τύπων ΗΜ μικροσκοπίας ΗΜ διέλευσης ΗΜ σάρωσης 22

23 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης - Προϋποθέτει επεξεργασία του δείγματος: Μονιμοποίηση (γλουταραλδεϋδη), Χρώση άλατα βαρέων μετάλλων (παρέχουν αντίθεση φάσης λόγω σκέδασης ηλεκτρονίων), Σκήνωση (αφυδάτωση σε στερεό κερί ή ρητίνη), Διατομή σε λεπτές φέτες ( nm), ~1/200 του πάχους του κυττάρου - Δέσμη επιταχυνόμενων ηλεκτρονίων διαπερνά το δείγμα και εστιάζεται σε οθόνη επικαλυμμένη με φθορίζουσα ουσία όπου σχηματίζεται η εικόνα του δείγματος. Τα ηλεκτρόνια διερχόμενα από το δείγμα προσκρούουν σε ιόν βαρέος μετάλλου, εκτρέπονται λόγω σκεδασμού και δεν συμβάλλουν στη δημιουργία εικόνας. Οι σημασμένες με βαρέα μέταλλα περιοχές εμφανίζονται σκοτεινές. Τα δείγματα ΗΜ διέλευσης υποβάλλονται σε διαδικασία είτε ΘΕΤΙΚΗΣ ή ΑΡΝΗΤΙΚΗΣ χρώσης: - Στη ΘΕΤΙΚΗ χρώση, ο ιστός τεμαχίζεται σε λεπτές τομές και σημαίνεται με άλατα βαρέων μετάλλων όπως: τετροξείδιο του οσμίου, οξικό ουράνιο ή κιτρικό μόλυβδο που αλληλεπιδρούν με λιπίδια, πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα Θετική χρώση. Φωτογραφία ΗΜ διέλευσης που δείχνει ΠΥΡΗΝΑ ενός «θετικά χρωματισμένου» αιμοσφαίριου. λευκού - Η Θετική χρώση χρησιμοποιείται επίσης για ανίχνευση πρωτεϊνών μέσω ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ, σημασμένων με βαρέα μέταλλα υψηλής ηλεκτρονιακής πυκνότητας, όπως χρυσού. Η τεχνική μοιάζει με τη χρήση αντισωμάτων σημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές όπως στη Μικροσκοπία Φθορισμού. *Τρισδιάστατη απεικόνιση δομών με ΔΙ 2-10nm γίνεται με ηλεκτρονική ΤΟΜΟΓΡΑΦΙΑ βασισμένη σε εικόνες 3D και ανάλυσης πολλαπλών δισδιάστατων εικόνων διαφορετικών οπτικών γωνιών 23

24 Η ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΧΡΩΣΗ χρησιμεύει για οπτική απεικόνιση ΑΚΕΡΑΙΩΝ βιολογικών δομών όπως απομονωμένων υποκυτταρικών οργανιδίων, μακρομορίων, ιών και βακτηρίων Το δείγμα τοποθετείται σε ΠΛΕΓΜΑ και υπόκειται σε χρώση με βαρέα μέταλλα. Μετά την απομάκρυνση της χρώσης, το μη-χρωσμένο ΕΣΩΤΕΡΙΚΑ δείγμα περιβάλλεται από στιβάδα ηλεκτρονιακά πυκνής χρώσης που «χρωματίζει» ΠΕΡΙΜΕΤΡΙΚΑ τις κυτταρικές δομές, επιφανειακές κοιλότητες ή προεκβολές αλλά ΔΕΝ ΔΙΕΙΣΔΥΕΙ στη μάζα του δείγματος, γι αυτό ονομάζεται ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΧΡΩΣΗ. Στην εικόνα που τελικά σχηματίζεται μετά τη διέλευση των ηλεκτρονίων από το δείγμα, οι περιοχές διείσδυσης των βαρέων μετάλλων φαίνονται σκοτεινές, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της επιφάνειας του δείγματος φαίνεται ΦΩΤΕΙΝΟ Αρνητική χρώση. Φωτογραφία ΗΜ διέλευσης που δείχνει αρνητικά «χρωματισμένα» ινίδια ακτίνης. 24

25 Η ΣΚΙΑΣΗ ΜΕ ΜΕΤΤΑΛΑ: Είναι μια άλλη τεχνική που χρησιμοποιείται για απεικόνιση της επιφάνειας απομονωμένων υποκυτταρικών δομών ή μακρομορίων με ΗΜ διέλευσης. ΣΤΟ ΔΕΙΓΜΑ εναποτίθεται ένα λεπτό στρώμα εξαχνωμένου μετάλλου π.χ. λευκόχρυσου, με ψεκασμό υπό ΚΑΤΑΛΛΗΛΗ ΓΩΝΙΑ, έτσι ώστε: στην επιφάνεια προς την πλευρά του ψεκασμού να συσσωρεύεται μεγαλύτερη ποσότητα μετάλλου σε σχέση με άλλες περιοχές. Απ αυτή τη διαφορική εναπόθεση μετάλλου προκύπτει ένα φαινόμενο Σκίασης που προσδίδει μια ΤΡΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ εμφάνιση στο δείγμα Σκίαση με μέταλλο. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης που δείχνει ινίδια ακτίνης/μυοσίνης κυτταροσκελετού μετά από σκίαση με μέταλλο. 25

26 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης με µε Σκίαση && Ψύξη δείγματος δείγµατος Η ΗΜ χρησιμοποιείται χρησιµοποιείται επίσης στη μελέτη µελέτη της ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗΣ ΔΟΜΗΣ. Τα Τα δείγματα δείγµατα καταψύχονται σε υγρό άζωτο (-196 οο C) και μετά µετά τέμνονται τέµνονται μεµε λεπίδα. Αυτή Αυτή η η διαδικασία διαρρηγνύει τη τη λιπιδική διπλοστιβάδα και καιεκθέτει τις τιςεσωτερικεσ επιφάνειες της της κυτταρικής µεµβράνης. μεμβράνης Ακολουθεί σκίαση µε μελευκόχρυσο και & διάλυση ΔΙΑΛΥΣΗ του δείγµατος του δείγματος σε οξύ σε που ΟΞΥ αφήνει που µια αφήνει ΜΕΤΑΛΛΙΚΗ μια ΜΕΤΑΛΛΙΚΗ ΜΗΤΡΑ της ΜΗΤΡΑ επιφάνειας της επιφάνειας του δείγµατος. του δείγματος. Η εξέταση Η τέτοιων εξέταση τέτοιων µητρών μητρών αποκαλύπτει αποκαλύπτει πολλές πολλές επιφανειακές επιφανειακές διογκώσεις διογκώσεις πρωτεΐνών πρωτεΐνών της λιπιδικής της λιπιδικής διπλοστιβάδας. διπλοστιβάδας. Τεμαχισμός Τεµαχισµός υπό ψύξη (Α) Ο τεμαχισμός τεµαχισµός διαρρηγνύει τη τη λιπιδική διπλοστιβάδα, αφήνοντας τις τις μεμβρανικές µεµβρανικές πρωτεΐνες συνδεδεμένες συνδεδεµένες με µε ένα ένα από τα τα δύο δύο μεμβρανικά µεµβρανικά τμήματα. τµήµατα. (Β) (Β) Φωτογραφία κυτταροπλασματικών κυτταροπλασµατικών μεμβρανών µεµβρανών δύο δύο γειτονικών κυττάρων μετά µετά από τεμαχισμό τεµαχισµό υπό υπό ψύξη. ψύξη. Πρωτεΐνες της λιπιδικής διπλοστιβάδας εμφανίζονται εµφανίζονται ως ως ενδομεμβρανικά ενδοµεµβρανικά σωµατίδια σωματίδια (βέλος). 2624

27 Ενδομεμβρανικές δομές/μόρια Γειτονικές μεμβράνες Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση 27

28 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης - Η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης παρέχει τρισδιάστατες εικόνες των κυττάρων. - Στην ΗΜ σάρωσης, η δέσμη ηλεκτρονίων ΑΝΤΙ ΝΑ ΔΙΕΡΧΕΤΑΙ από το δείγμα ΣΑΡΩΝΕΙ ΟΛΗ την επιφάνεια του, επικαλυμμένη με βαρύ μέταλλο. Τα ηλεκτρόνια που σκεδάζονται ή εκπέμπονται από την επιφάνεια κατά τη σάρωση συλλέγονται και σχηματίζουν μια ΤΡΙΔΙΑΣΤΑΤΗ εικόνα. - Καθώς η διακριτική ικανότητα της ΗΜ σάρωσης είναι ~10 nm, η χρήση της περιορίζεται στη μελέτη ολόκληρων κυττάρων και όχι υποκυτταρικών οργανιδίων ή μακρομορίων. Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης Φωτογραφία ΗΜ σάρωσης μακροφάγου κυττάρου 28

29 ΙΙ. ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ Η μικροσκοπία παρέχει λεπτοµερή απεικόνιση μόνο της κυτταρικής δοµής Για τη µελέτη λειτουργίας των ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΔΙΩΝ απαιτείται η αποµόνωση τους σε κατάλληλη µορφή µε βιοχηµικές µεθόδους, όπως η Υποκυτταρική Κλασµάτωση µε ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ σε υπερφυγόκεντρο (ultracentrifuge) Στάδια Κλασμάτωσης Το πρώτο στάδιο στην υποκυτταρική κλασμάτωση είναι η διάρρηξη της κυτταρικής μεμβράνης χωρίς να καταστραφούν τα ενδοκυτταρικά συστατικά (π.χ. υπέρηχοι ή μηχανικός ομογενοποιητής), διατηρώντας ανέπαφα τους πυρήνες, τα λυσοσώματα και υπεροξειδιοσώματα Το ομογενοποίημα διαχωρίζεται στα επιμέρους συστατικά μέσω φυγοκεντρήσεων σε υπερφυγόκεντρο (δυνάμεις έως xg μεγαλύτερες της βαρύτητας) σε υψηλές ταχύτητες (> rpm), που μετακινούν τα κυτταρικά συστατικά στον πυθμένα φυγοκεντρικού σωλήνα ως ίζημα (καθίζηση ή καταβύθιση). - Η φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας κατακρημνίζει: ακέραια κύτταρα & πυρήνες. Φυγοκέντρηση του υπερκείμενου υγρού σε υψηλότερη ταχύτητα καταβυθίζει: μιτοχόνδρια, χλωροπλάστες, λυσοσώματα & υπεροξειδιοσώματα - Η φυγοκέντρηση υψηλότερης ταχύτητας καταβυθίζει: τμήματατα κυτταρικής μεμβράνης & ενδοπλασματικού δικτύου - Φυγοκέντρηση σε ακόμη υψηλότερη ταχύτητα καταβυθίζει: ριβοσώματα, αφήνοντας μόνο τα διαλυτά συστατικά του κυτταροπλάσματος στο υπερκείμενο (κυτταροδιάλυμα) 29

30 1. Υποκυτταρική κλασµάτωση με διαφορική φυγοκέντρηση 1. Τα κύτταρα διαρρηγνύονται 2. Τα υποκυτταρικά συστατικά διαχωρίζονται µε µια σειρά φυγοκεντρήσεων με αυξανόµενη ταχύτητα / χρόνο 3. Τα οργανίδια καθιζάνουν στον σωλήνα και ανακτώνται από το ίζηµα 4. Το υπερκείµενο διάλυµα φυγοκεντρείται σε υψηλότερη ταχύτητα, για να διαχωριστούν τα αµέσως βαρύτερα οργανίδια. 30

31 2. Φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας * Χρησιμοποιείται για υψηλότερο βαθμό καθαρισμού 1. Το δείγμα τοποθετείται στην επιφάνεια διαλύματος σακχαρόζης διαβαθμισμένης πυκνότητας 2. Τα σωματίδια διαφορετικού μεγέθους καταβυθίζονται σε διακριτές ζώνες με φυγοκέντρηση 3. Μετά τη φυγοκέντρηση: οι διαχωρισμένες ζώνες συλλέγονται ΞΕΧΩΡΙΣΤΑ: ως μεμονωμένα κλάσματα με απλή διάτρηση του σωλήνα & συλλογή σταγόνων. 30

32 3. Φυγοκέντρηση ισορροπίας με διαβάθμιση πυκνότητας Oρισμένα διαλύματα όπως χλωριούχου καισίου σε υψηλή συγκέντρωση & μετά από φυγοκέντρηση: σχηματίζουν ΑΥΤΟΜΑΤΑ μία διαβάθμιση ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ Έτσι, με την ιδιότητα αυτή μπορούν να απομονωθούν: υποκυτταρικά συστατικά με βάση την πυκνότητα ΑΝΩΣΗΣ & ανεξάρτητα μεγέθους, αλλά και DNA σε συγκεκριμμένη συγκέντρωση 32

33 ΙΙΙ. ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΖΩΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Ζωικά κύτταρα σε καλλιέργεια. Φωτογραφία ΗΜ σάρωσης ινοβλαστών ανθρώπου σε επιφάνεια τρυβλίου καλλιέργειας (έχει προστεθεί τεχνητό χρώμα) -Οι καλλιέργεια ζωικών κυττάρων γίνεται με τη δημιουργία εναιωρήματος κυττάρων, που προστίθενται σε τρυβλία καλλιέργειας με θρεπτικό μέσο. Οι ινοβλάστες και τα επιθηλιακά κύτταρα αναπτύσσονται πάνω σε πλαστική επιφάνεια των τρυβλίων (πλαστικά δοχεία) -To αρχικό υλικό είναι ΕΜΒΡΥΑ ή ΟΓΚΟΙ επειδή περιέχουν ταχέως αναπτυσσόμενα κύτταρα -Οι εμβρυϊκές ινοβλάστες αναπτύσσονται ικανοποιητικά. Σε κατάλληλες συνθήκες αναπτύσσονται και τα Εμβρυϊκά Βλαστικά Κύτταρα (ESCs) που προέρχονται από πρώιμα έμβρυα και διατηρούν την ικανότητα διαφοροποίησης προς όλους τους τύπους κυττάρων των ενήλικων οργανισμών -Η έρευνα των ESCs έχει συμβάλλει στην κατανόηση της λειτουργίας πολλών γονιδίων κατά την Ανάπτυξη του Οργανισμού. Μπορούν δε να χρησιμοποιηθούν σε μεταμοσχεύσεις στη Θεραπευτική αντιμετώπιση ασθενειών *Ο περιοριστικός παράγοντας στην καλλιέργεια φυσιολογικών κυττάρων (εκτός ESCs) είναι ο περιορισμένος χρόνος ζωής τους (συγκεκριμένος αριθμός κυτταρικών διαιρέσεων) σε καλλιέργεια. Αντιθέτως, τα καρκινικά κύτταρα έχουν απεριόριστες κυτταρικές διαιρέσεις 33

34 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ & καλλιέργεια ζωικών κυττάρων Το πρώτο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ζωικών κυττάρων αναπτύχθηκε το 1955 από τον Harry Eagle και ονομάσθηκε Eagle s medium; MEM (Minimal Essential Medium) ή E-MEM Αργότερα έγιναν τροποποιήσεις του όπως: 1. αυτό του Renato Dulbecco (Dulbecco s-modified Eagle s medium; DMEM), Βραβείο Νόμπελ 1975, για ογκογόνους ιούς μαζί με τον H. Temin & D. Baltimore, & 2. το θρεπτικό υλικό Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) για καλλιέργεια διαφόρων κυτταρικών τύπων όπως λεμφοκυττάρων - Τα θρεπτικά μέσα εκτός από αλατούχες ενώσεις και γλυκόζη, περιέχουν: αμινοξέα και βιταμίνες: που δεν μπορούν να συνθέσουν μόνα τους τα κύτταρα & ΟΡΟ ΒΟΟΣ ως πηγή μεταγραφικών παραγόντων που προάγουν την κυτταρική διαίρεση - Επίσης περιέχουν ΑΥΞΗΤΙΚΟΥΣ παράγοντες: καθοριστικοί ρυθμιστές της κυτταρικής διαίρεσης και διαφοροποίησης που παρέχουν σήματα για κυτταρική επικοινωνία Η ταυτοποίηση μεμονωμένων αυξητικών παραγόντων κατέστησε εφικτή την καλλιέργεια ποικίλων κυττάρων σε θρεπτικό μέσο, χωρίς ορό 34

35 ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ - ΣΤΑΘΜΟΣ στη καλλιέργεια των ζωικών κυττάρων ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ - ΣΤΑΘΜΟΣ στη καλλιέργεια των ζωικών κυττάρων Harry Eagle Harry Eagle Επινόησε το πρώτο Επινόησε θρεπτικό τομέσο πρώτο καλλιέργειας θρεπτικό µέσο Ευκαρυωτικών κυττάρων καλλιέργειας Ευκαρυωτικών ΜΕΜ: κυττάρων Minimum (ΜΕΜ) Essential Medium 35

36 Η καλλιέργεια ζωικών κυττάρων Κύτταρα ιστού αναπτύσσονται σε τρυβλία καλλιέργειας με θρεπτικό μέσο Οι πρώτες καλλιέργειας που προκύπτουν από έναν ιστό ονομάζονται Πρωτογενείς καλλιέργειες και πολλαπλασιάζονται ώσπου να καλύψουν την επιφάνεια του τρυβλίου Αν μικρός αριθμός τους μετά από θρυψινοποίηση επανατοποθετηθεί σε νέο τρυβλίο με χαμηλότερη πυκνότητα, σχηματίζουν τις Δευτερογενείς καλλιέργειες *Τα φυσιολογικά κύτταρα δεν μπορούν να πολλαπλασιάζονται επ άπειρον, ενώ τα καρκινικά αναπτύσσονται συνεχώς και χαρακτηρίζονται ως Σταθερές Κυτταρικές Σειρές 36

37 Πολλαπλασιασμός Φυτικών κυττάρων σε Καλλιέργεια Φυτικά κύτταρα σε καλλιέργεια (Κάλος σε στερεό θρεπτικό μέσο) Τα φυτικά κύτταρα αναπτύσσονται όπως τα ζωϊκά σε θρεπτικά υλικά που περιέχουν μόρια ρύθμισης της ανάπτυξής των. Οι ρυθμιστές αυτοί είναι μικρά μόρια που διέρχονται την κυτταρική μεμβράνη Πολλαπλασιάζονται σε στερεό θρεπτικό μέσο δημιουργώντας μία μάζα κυττάρων ή ΚΑΛΟΣ, απ όπου σχηματίζεται οποιοσδήποτε ιστός: π.χ. ρίζες, μίσχος, φύλλα, κλπ 37

38 IV. ΟΙ ΖΩΙΚΟΙ ΙΟΙ Είναι ενδοκυτταρικά παράσιτα που ΔΕΝ αναπαράγονται μόνα τους. Για την αναπαραγωγή τους μολύνουν τα κύτταρα του ξενιστή & εκμεταλλεύονται/κλέβουν τους κυτταρικούς του μηχανισμούς Αποτελούνται μόνο από γονιδιωματικό νουκλεϊκό οξύ (DNA ή RNA) που περιβάλλεται από ένα πρωτεϊνικό καψίδιο * Είναι σημαντικοί στην Κυτταρική και Μοριακή βιολογία καθώς αποτελούν απλά συστήματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλεία για μελέτες ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ή/και ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑΣ (π.χ. Ο ανθρώπινος ιός HPV για Παπιλώματα ή κρεατοελιές) Δομή ενός ζωικού ιού: (Α) Τα σωμάτια του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) περιέχουν ένα μικρό κυκλικό μόριο DNA εγκλεισμένο σε πρωτεϊνικό περίβλημα (καψίδιο) (Β) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει σωμάτια του ιού θηλωμάτων HPV (έχει προστεθεί τεχνητό χρώμα) 38

39 ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΙ ΙΟΙ ή ΒΑΚΤΗΡΙΟΦΑΓΟΙ Μελέτες με ιούς βακτηρίων ή βακτηριοφάγους ή φάγους συνέβαλαν καθοριστικά, ως Βιολογικό εργαλείο στην κατανόηση ΒΑΣΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ της Μοριακής Γενετικής. Ο Τ4 είναι από τους σημαντικότερους βακτηριοφάγους. Προσβάλλει και αναπαράγεται στο βακτήριο E. coli Η μόλυνση με ένα μόνο σωμάτιο Τ4 οδηγεί στη δημιουργία ~200 θυγατρικών ιϊκών σωματίων. Το αρχικό προσβεβλημένο κύτταρο στη συνέχεια διαρρηγνύεται (λύεται) απελευθερώνοντας θυγατρικά ιικά σωμάτια στο θρεπτικό μέσο. Σε μια καλλιέργεια βακτηρίων E. coli σε θρεπτικό μέσο με άγαρ, η μόλυνση από Τ4 οδηγεί στη δημιουργία μιας καθαρής περιοχής λυμένων κυττάρων (μιας πλάκας). Πλάκες βακτηριοφάγου. Διακρίνονται πλάκες του Τ4 πάνω σε χλόη από E. coli. Κάθε πλάκα προκύπτει από πολλαπλασιασμό ενός ιικού σωματίου 39

40 Παραδείγματα ζωϊκών ιών (HIV) (HPV) *Το γονιδίωμα βακτηρίων και ρετροιϊών είναι σήμερα γνωστό. Έτσι, η εισαγωγή στο γένωμά των γονιδίων άγνωστης λειτουργίας συμβάλλει στη κατανόηση της λειτουργίας των σε: Βακτηριακά ή Ευκαρυωτικά κύτταρα, αντίστοιχα 40

41 Ύλη: ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ (THE CELL) Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ-ΜΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Γενική επισκόπηση των κυττάρων και της κυτταρικής βιολογικής έρευνας Σελ