ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΝΑΤΑΛΙ-ΝΕΦΕΛΗ Γ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΝΑΤΑΛΙ-ΝΕΦΕΛΗ Γ. ΚΑΜΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ., M.Sc. Χαρακτηριστικά βιοελέγχου των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens Piha5II και Bacillus cereus S76, από ελληνικά αγροοικοσυστήματα ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2018

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΝΑΤΑΛΙ-ΝΕΦΕΛΗ Γ. ΚΑΜΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ., M.Sc. Χαρακτηριστικά βιοελέγχου των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens Piha5II και Bacillus cereus S76, από ελληνικά αγροοικοσυστήματα ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2018

3 ΝΑΤΑΛΙ-ΝΕΦΕΛΗ Γ. ΚΑΜΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ., M.Sc. Χαρακτηριστικά βιοελέγχου των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens Piha5II και Bacillus cereus S76, από ελληνικά αγροοικοσυστήματα ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Γεωπονίας ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗΣ: ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ (Απόφαση ΓΣΕΣ782: ): ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΒΑΘΜΙΔΑ ΙΔΙΟΤΗΤΑ ΙΔΡΥΜΑ Αναστασία Λαγοπόδη Αναπλ. Καθηγήτρια Επιβλέπουσα Τμήμα Γεωπονίας, Α.Π.Θ. Γεώργιος Καραογλανίδης Αναπλ. καθηγητής Μέλος της 3μελούς συμβουλευτικής επιτροπής Τμήμα Γεωπονίας, Α.Π.Θ. Ουρανία Μενκίσογλου- Σπυρούδη Καθηγήτρια Μέλος της 3μελούς συμβουλευτικής επιτροπής Τμήμα Γεωπονίας, Α.Π.Θ. Μαρία Λιακοπούλου- Κυριακίδου Ομότιμη Καθηγήτρια Αφυπηρετήσαν μέλος της 3μελούς συμβουλευτικής επιτροπής Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Α.Π.Θ. Βαρβάρα Μαλιόγκα Επίκ. Καθηγήτρια Μέλος της 7μελούς εξεταστικής επιτροπής Τμήμα Γεωπονίας, Α.Π.Θ. Σωτήριος Τζάμος Ελένη Καρασαλή Πολύμνια Αντωνίου Επίκ. Καθηγητής Ερευνήτρια Α Αναπλ. Καθηγήτρια Μέλος της 7μελούς εξεταστικής επιτροπής Μέλος της 7μελούς εξεταστικής επιτροπής Μέλος της 7μελούς εξεταστικής επιτροπής Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γ.Π.Α. Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γ.Π.Α. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2018

4 ΝΑΤΑΛΙ-ΝΕΦΕΛΗ Γ. ΚΑΜΟΥ, 2018 ΑΠΘ, 2018 Χαρακτηριστικά βιοελέγχου των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens Piha5II και Bacillus cereus S76, από ελληνικά αγρο-οικοσυστήματα ISBN Η έγκριση της παρούσης διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Γεωπονίας δεν υποδηλώνει αποδοχή της γνώμης και των απόψεων της συγγραφέως (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

5 Education is not the learning of facts, but training the mind to think - Albert Einstein

6 Αφιερωμένο στον Γιωργάκη μας

7 Πρόλογος - Ευχαριστίες Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο πλαίσιο του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του τομέα Φυτοπροστασίας κατά τα έτη 2012 έως 2018, στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του τμήματος Γεωπονίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ., υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας, κυρίας Αναστασίας Λαγοπόδη. Ολοκληρώνοντας τη συγγραφή της διατριβής, θα ήθελα ειλικρινά να ευχαριστήσω όλους-ες εκείνους-ες που συνέβαλλαν στην πραγματοποίησή της. Ξεκινώντας θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την κυρία Λαγοπόδη για όλα αυτά τα όμορφα χρόνια (σχεδόν δέκα) άψογης συνεργασίας. Ευχαριστώ τη δασκάλα μου για την επιστημονική καθοδήγησή της, για τα όσα μου έμαθε και κυρίως για τον τρόπο που το έκανε, δείχνοντας κατανόηση, αγάπη και αυστηρότητα όπου χρειαζόταν. Το πάθος της για την επιστήμη με ενέπνευσε και με έκανε να την αγαπήσω με τη σειρά μου. Θεωρώ τιμή που με επέλεξε για αυτήν τη συνεργασία και την ευχαριστώ για τη συμπαράστασή της και την εμπιστοσύνη της τόσο στο πλαίσιο της εκπόνησης της παρούσας διατριβής όσο και σε προσωπικό επίπεδο. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κυρία Μαρία Λιακοπούλου-Κυριακίδου, Ομότιμη Καθηγήτρια του τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ. και αφυπηρετήσαν μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για την αποδοχή του ρόλου, για την ενεργή συμμετοχή, τις πολύτιμες συμβουλές και τη διαρκή καθοδήγησή της κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Την ευχαριστώ θερμά για το ειλικρινές ενδιαφέρον της όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ ιδιαιτέρως την κυρία Ουρανία Μενκίσογλου-Σπυρούδη, Καθηγήτρια του τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. και μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, αρχικά για την αποδοχή του ρόλου αλλά και την καθοδήγησή της κατά τη διάρκεια όλων αυτών των ετών. Οι εποικοδομητικές παρατηρήσεις της και το πραγματικό ενδιαφέρον της κατά την κριτική ανάγνωση του κειμένου, συνέβαλλαν ουσιαστικά στην τελική εμφάνιση της διατριβής. Ευχαριστώ την κυρία Μενκίσογλου επίσης για την ευγενική διάθεση εξοπλισμού και υποδομών στο εργαστήριο Γεωργικών Φαρμάκων. Τέλος, την ευχαριστώ ιδιαιτέρως για τον χρόνο που μου διέθεσε όλα αυτά τα χρόνια και για τις πολύ ενδιαφέρουσες συζητήσεις που κάναμε. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον κύριο Γεώργιο Καραογλανίδη, Αναπληρωτή Καθηγητή του τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. και μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, αρχικά για την αποδοχή του ρόλου αλλά κυρίως για την άριστη συνεργασία, τη διαρκή καθοδήγηση και το πραγματικό του ενδιαφέρον όλα αυτά τα χρόνια. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για τα εποικοδομητικά του σχόλια στο πλαίσιο των συζητήσεων στο εργαστήριο αλλά και μετά την κριτική ανάγνωση του κειμένου της διατριβής. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω και για τον χρόνο που διέθετε για να μας διδάξει διαγνωστική κάθε φορά που ερχόταν ένα δείγμα προς εξέταση στο εργαστήριο. Θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον Διευθυντή του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας κύριο Νικόλαο Κατή για τις πολύτιμες συμβουλές του και την καθοδήγησή του κατά τη διάρκεια της παραμονής μου στο εργαστήριο. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, την κυρία Βαρβάρα Μαλιόγκα, Επίκουρη Καθηγήτρια (τμήμα Γεωπονίας, Α.Π.Θ.), την κυρία Ελένη 1

8 Καρασαλή, Ερευνήτρια Α του Μπενάκειου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου, την κυρία Πολύμνια Αντωνίου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια (Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γ.Π.Α.) και τον κ. Σωτήριο Τζάμο, Επίκουρο Καθηγητή (Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γ.Π.Α.), αρχικά για την αποδοχή του ρόλου και κυρίως για την κριτική ανάγνωση και τη συμβολή τους στην τελική εμφάνιση του κειμένου της παρούσας διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως την Δρ. Ελένη Καρασαλή, για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που προσέφερε κατά την ανάλυση και διαχωρισμό του αντιβιοτικού καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) που πραγματοποιήθηκε κατά ένα μέρος στο Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο, στο εργαστήριο Χημικού Ελέγχου Γεωργικών Φαρμάκων, του τμήματος Ελέγχου Γεωργικών Φαρμάκων και Φυτοφαρμακευτικής. Επίσης ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Σωτήριο Τζάμο για την ευγενική παραχώριση του μετασχηματισμένου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici ώστε να εκφράζει την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (dsred). Αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω θερμά τον Δρ Μανώλη Παπαδάκη για την όμορφη συνεργασία μας και την καθοδήγησή του τόσο στο πλαίσιο της απομόνωσης και ταυτοποίησης των αντιβιοτικών PCN και προδιγιοσίνη, όσο και των ρυθμιστών ανάπτυξης. Τον ευχαριστώ για την πολύτιμη βοήθειά του στις τεχνικές χρωματογραφίας, για το συνεχές ενδιαφέρον του και την άψογη στάση του κατά τη συνεργασία μας. Επίσης ευχαριστώ τις κυρίες Αθηνά Κοτοπούλου και Κατερίνα Κιντζίκογλου για την κατανόηση και την υπομονή τους κατά την εργασία μου στο εργαστήριο Γεωργικών Φαρμάκων, του τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. και για το ενδιαφέρον και το χαμόγελό τους καθημερινά. Ευχαριστώ την κυρία Ευθυμία Παπαδοπούλου Μουρκίδου, Ομότιμη Καθηγήτρια (τμήμα Γεωπονίας, Α.Π.Θ.) για την ευγενική διάθεση εξοπλισμού και υποδομών στο εργαστήριο Γεωργικών Φαρμάκων. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στον Δρ Γιώργο Τζελέπη για την πολύτιμη βοήθειά του, το ενδιαφέρον του και τη συνεχή καθοδήγησή του κατά την παραμονή μου στην Ουψάλα της Σουηδίας, στο εργαστήριο του τμήματος Δασικής Μυκητολογίας και Φυτοπαθολογίας του Σουηδικού Πανεπιστημίου Γεωργικών Επιστημών, (Sveriges Lantbruksuniversitet, SLU). Η άριστη συνεργασία μας, οι εποικοδομητικές υποδείξεις του κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης των πειραμάτων αλλά και ο ευχάριστος χαρακτήρας του και η ζεστή φιλοξενία του μετέτρεψαν την παραμονή μου εκεί σε μια από τις ωραίες περιόδους της ερευνητικής μου πορείας. Ευχαριστώ ιδιαίτερα και τη σύντροφό του Σάρα για τις όμορφες στιγμές και τα γέλια που μοιραστήκαμε στην Ουψάλλα. Ευχαριστώ τον Καθηγητή Dan Funck Jensen και τον Δρ Mukesh Dubey του τμήματος Δασικής Μυκητολογίας και Φυτοπαθολογίας του Σουηδικού Πανεπιστημίου Γεωργικών Επιστημών, (Sveriges Lantbruksuniversitet, SLU), αρχικά για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθειά τους κατά την παραμονή μου στη Σουηδία και επίσης για τη διάθεση εξοπλισμού και αναλώσιμων για την εκτέλεση όλων των πειραμάτων κατά την παραμονή μου στο εργαστήριο του τμήματος Δασικής Μυκητολογίας και Φυτοπαθολογίας. Η καθοδήγησή τους κατά την εκτέλεση των πειραμάτων μου έμαθε πολλά και σημαντικά πράγματα σε ερευνητικό επίπεδο. Τους ευχαριστώ επίσης για την ευγενική διάθεση του ωφέλιμου μύκητα C. rosea IK726 και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν επιτρέποντάς μου να εργαστώ με αυτό το πολύτιμο στέλεχος. 2

9 Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στον Καθηγητή Ben Lugtenberg του Ινστιτούτου Βιολογίας του Πανεπιστημίου του Leiden για την ευγενική παραχώριση του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl (απομόνωση ZUM 2407/IPO-DLO). Επίσης ευχαριστώ τον Καθηγητή Fransisco Cazorla, του τμήματος Μικροβιολογίας του Πανεπιστημίου της Μάλαγας στην Ισπανία για την ευγενική παραχώριση του πλασμιδίου που περιέχει τo γονίδιο egfp και των στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό του στελέχους P.chlororaphis Toza7 και για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις του κατά την εκτέλεση των πειραμάτων αυτών. Εκφράζω ευχαριστίες στην Καθηγήτρια Linda Thomashow (USDA/ARS, Pullman, WA, USA) για την ευγενική διάθεση της καθαρής αντιβιοτικής ένωσης φαιναζίνη-1-καρβοξυλικό οξύ (PCA). Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Δρ Παναγιώτη Μαδέση και τους συνεργάτες του στο Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝ.Ε.Β.) του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ) για την ευγενική διάθεση υποδομών και εξοπλισμού για την εκτέλεση πειραμάτων που αφορούσαν τον μετασχηματισμό του P. chlororaphis ΤοZa7. Ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Μπαρμπαγιάννη για την ευγενική διάθεση εξοπλισμού και εργαστηριακών υποδομών καθώς και για την πολύτιμη βοήθειά του κατά τις αναλύσεις που αφορούσαν τα θρεπτικά στοιχεία των ρεπανιών οι οποίες πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Εδαφολογίας του Τομέα Εγγείων Βελτιώσεων, Eδαφολογίας και Γεωργικής Μηχανικής, του τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. Ευχαριστώ επίσης ιδιαίτερα τον Διευθυντή του εργαστηρίου Λαχανοκομίας του τμήματος Γεωπονίας, κ. Αναστάσιο Σιώμο για την ευγενική διάθεση θερμοκηπιακού χώρου στο Αγρόκτημα του τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. Επιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Εμμανουήλ-Νικόλαο Παντερή για την άριστη συνεργασία μας, τις εποικοδομητικές υποδείξεις του και κυρίως τον χρόνο που μου αφιέρωσε κατά τις παρατηρήσεις των μετασχηματισμένων μικροοργανισμών με το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες laser, που έγιναν στον τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας, του Α.Π.Θ. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Γεώργιο Μενεξέ, για την πολύτιμη βοήθειά του κατά τον πειραματικό σχεδιασμό, αλλά και για τις ουσιαστικές παρατηρήσεις και υποδείξεις του σχετικά με τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της παρούσας διατριβής και των δημοσιεύσεων που προέκυψαν. Ευχαριστώ για όλα μέσα από την καρδιά μου τους φίλους και συνάδελφους Μένια Κατσιάνη, Στέφανο Τεστέμπαση, Λεωνίδα Λώτο, Τάσο Σαμαρά, Γιώτα Ντάσιου και Άννα Γκιούρα αλλά και τα υπόλοιπα παιδιά του εργαστηρίου, Λητώ, Χρύσα, Κώστα, Αντώνη, Αντώνη, Μηνά, Γιώργο, Αμαλία, Ειρήνη, Λευκή, Μαρία, Νικόλα και Ελένη για την παρουσία τους στη ζωή μου σε προσωπικό και σε εργαστηριακό επίπεδο. Ευχαριστώ τους φίλους μου για την υπομονή τους στα δύσκολα και για τη συντροφιά τους στα ευχάριστα. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την αδερφική μου φίλη Μένια για την παρουσία της δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια και για όλα αυτά που δε χρειάζεται να πω. Επίσης ευχαριστώ τις φίλες μου Ζήνα, Μαρία και Πόπη για τη στήριξή τους χωρίς την οποία η πραγματοποίηση της διατριβής αυτής θα ήταν πολύ δυσκολότερη και τις ευχαριστώ για όλες τις όμορφες και αληθινές στιγμές μας όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος και πάνω απ όλα ευχαριστώ όλα τα άτομα που απαρτίζουν την οικογένειά μου. Ευχαριστώ την αδερφή μου Φρανσουάζ για το ότι ήταν και είναι η καλύτερή μου φίλη και το στήριγμα μου στα δυσκολότερα. Ευχαριστώ τη μητέρα μου Μαντλέν που με μεγάλωσε 3

10 όπως το έκανε και ήταν πάντα δίπλα μου. Ευχαριστώ τον μπαμπά μου Γιώργο που άφησε τις πιο γερές βάσεις στο μυαλό και την καρδιά μου και πάντα θα μου λείπει. Ευχαριστώ τον πατριό μου Γιώργο που ήρθε στη ζωή μου και με την αγάπη του και τη στήριξή του μας ξαναέκανε πλήρη οικογένεια. Ευχαριστώ τον φίλο μου Αλέκο Κατσιώτη χωρίς τον οποίον δε θα ήμουν αυτή που είμαι σήμερα. Τον ευχαριστώ μέσα από την καρδιά μου για τις ατελείωτες συζητήσεις μας που με έκαναν καλύτερο άνθρωπο και μου ακόνισαν το μυαλό, αλλά και για όσα μου παρείχαν αυτός και η γυναίκα του Ελένη και συνέβαλαν στο να μορφωθώ και να περάσω πολύ όμορφα φοιτητικά χρόνια. Ευχαριστώ τον σύντροφό μου Μαργαρίτη για την όμορφη κοινή μας ζωή, για όσα έκανε έμπρακτα και με βοήθησαν πραγματικά να ολοκληρώσω αυτήν τη διατριβή, αλλά και για όσα κάνει καθημερινά για τη μικρή μας οικογένεια. Ευχαριστώ επίσης τους γονείς του Γιώργο και Βέτα για τα όσα έκαναν και κάνουν για μας. Και τέλος ευχαριστώ τον Γιωργάκη μου που μου έμαθε με την παρουσία του στη ζωή μου τι είναι πραγματικά σημαντικό. Τον ευχαριστώ που καταλάβαινε γιατί λείπω και πάντα με περίμενε με το υπέροχο χαμόγελό του. 4

11 Περιεχόμενα Πρόλογος - Ευχαριστίες... 1 Περίληψη... 9 Abstract Συντομογραφίες ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Εισαγωγή Γενικά Καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών Βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών Αλληλεπιδράσεις στην περιοχή της ριζόσφαιρας Ο αποικισμός της ριζόσφαιρας Εργαλεία παρακολούθησης του αποικισμού Μηχανισμοί βιολογικής δράσης των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Υπερπαρασιτισμός Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών και αντιβίωση Ανταγωνισμός Επαγωγή διασυστηματικής αντοχής Συνδυασμός μηχανισμών δράσης παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Μηχανισμοί προαγωγής της αύξηση των φυτών από PGPR Επικρατέστερα γένη βακτηρίων που δρουν ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Τα βακτήρια του γένους Serratia ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Τα βακτήρια του γένους Bacillus ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK Ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici και η ασθένεια που προκαλεί στην τομάτα Ερευνητικό υπόβαθρο και στόχοι της διατριβής ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. Παραγωγή αντιβιοτικών από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 και αξιολόγησή τους στην αντιμετώπιση του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici Περίληψη

12 2.2. Εισαγωγή Βακτηριακή ανάπτυξη και παραγωγή αντιβιοτικών Το αντιβιοτικό καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN), από το Pseudomonas chlororaphis ToZa Το αντιβιοτικό προδιγιοσίνη (2-methyl-3-pentyl-6-methoxy prodigiosin) από το Serratia rubidaea S Αναλυτικές τεχνικές χαρακτηρισμού - ταυτοποίησης αντιμικροβιακών ενώσεων Σκοπός των πειραμάτων Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Τιμές συγκέντρωσης στο 50% της δραστικής δόσης EC 50 εκχυλισμάτων υγρών καλλιεργειών των βακτηριακών στελεχών Δημιουργία πρότυπων καμπυλών ανάπτυξης των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S Καθαρισμός και ταυτοποίηση του αντιβιοτικού καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) από το στέλεχος P. chlororaphis ToZa Καθαρισμός και ταυτοποίηση αντιβιοτικού προδιγιοσίνη (2-methyl-3- pentyl-6-methoxyprodigiosin) από το στέλεχος S. rubidaea S In vitro δράση της φαιναζίνης από το P. chlororaphis ToZa7 κατά του Forl και του C. rosea IK In vitro δράση της προδιγιοσίνης από το S. rubidaea S55 κατά του Forl και του C. rosea IK Αποτελέσματα EC 50 (Half maximal Effective Concentration) εκχυλισμάτων από υπερκείμενα καλλιέργειας των βακτηριακών στελεχών Πρότυπες καμπύλες ανάπτυξης των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S Ταυτοποίηση της φαιναζίνης από το P. chlororaphis Toza Παραγωγή προδιγιοσίνης από το στέλεχος S. rubidaea S In vitro δράση της φαιναζίνης του P. chlororaphis ToZa7 και της προδιγιοσίνης του S. rubidaea S55 επί των Forl και C. rosea IK Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών και ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S Περίληψη

13 3.2. Εισαγωγή Παραγωγή αντιμικροβιακών ενώσεων από τα βακτηριακά στελέχη Παραγωγή ενζύμων με αντιμυκητιακή δράση Παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Σκοπός των πειραμάτων Υλικά και Μέθοδοι Μικροοργανισμοί Παραγωγή σιδηροφόρων Παραγωγή υδροκυανίου Παραγωγή ενζύμων με αντιμυκητιακή δράση Παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Επίδραση των στελεχών στην αύξηση φυτών τομάτας, ρεπανιού και σιταριού Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών από τα βακτηριακά στελέχη Παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Επίδραση στελεχών στα χαρακτηριστικά αύξησης φυτών τομάτας και σιταριού σε σύστημα gnotobiotic, υπό αξενικές συνθήκες Επίδραση των στελεχών στα χαρακτηριστικά αύξησης φυτών τομάτας σε φυτοδοχεία, σε συνθήκες θερμοκηπίου Επίδραση των στελεχών στα χαρακτηριστικά αύξησης και στα θρεπτικά στοιχεία φύλλων και ρίζας ρεπανιού Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Ανάλυση αλληλεπιδράσεων μεταξύ των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Clonostachys rosea IK726 σε φυτά τομάτας Περίληψη Εισαγωγή Ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK Οι μυκητιακοί μεταφορείς ABC Γονίδια που σχετίζονται με την επαγωγή της αντοχής Σκοπός των πειραμάτων Υλικά και Μέθοδοι Καλλιέργεια και διατήρηση μικροοργανισμών και παραγωγή μολύσματος

14 In vitro μελέτη της επίδρασης των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 επί της ανάπτυξης των C. rosea IK726 και Forl Πειράματα in planta για τον έλεγχο του συνδυασμού των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης σε φυτά τομάτας Παρακολούθηση έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με αντιδράσεις αντοχής της τομάτας, παρουσία των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Ανάλυση έκφρασης γονιδίων Μελέτη του αποικισμού ριζών τομάτας από τους ωφέλιμους μικροοργανισμούς, με συνεστιακή μικροσκοπία Διερεύνηση ενδοφυτικής ανάπτυξης του Pseudomonas chlororaphis ToZa Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα In vitro μελέτη της επίδρασης των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 επί της ανάπτυξης των Clonostachys rosea IK726 και Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Έλεγχος της σήψης ριζών και λαιμού της τομάτας με συνδυασμό παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Διερεύνηση του μηχανισμού αντοχής του Clonostachys rosea IK726 στα Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 μέσω επαγωγής γονιδίων μεταφορέων ABC Επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με αμυντικούς μηχανισμούς της τομάτας, παρουσία των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Μελέτη του αποικισμού των ριζών της τομάτας από τον Clonostachys rosea IK726 και της αλληλεπίδρασής του με τον Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, με συνεστιακή μικροσκοπία Παρατήρηση του αποικισμού ρίζας τομάτας από το ωφέλιμο ριζοβακτήριο P. chlororaphis ToZa7, με συνεστιακή μικροσκοπία Συζήτηση Γενικά συμπεράσματα Βιβλιογραφία Παράρτημα Ι Λεζάντες Εικόνων Παράρτημα ΙΙ Λεζάντες Πινάκων και Διαγραμμάτων Παράρτημα ΙΙΙ Αναλυτικά αποτελέσματα της ANOVA και του τεστ Kruskal-Wallis

15 Περίληψη Η πίεση των καταναλωτών για παραγωγή ποιοτικών προϊόντων, καθαρών από υπολείμματα αγροχημικών, οδήγησαν στην ανάγκη υιοθέτησης μεθόδων που στοχεύουν στην παραγωγή προϊόντων µε το ελάχιστο δυνατό κόστος και τη μικρότερη επιβάρυνση του περιβάλλοντος. Στο πλαίσιο μιας τέτοιας στρατηγικής εντάσσεται και η χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών που πετυχαίνουν βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών και ονομάζονται παράγοντες βιολογικού ελέγχου ή παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης (biological control agents, BCAs). Οι βακτηριακοί παράγοντες βιολογικού ελέγχου σε πολλές περιπτώσεις προάγουν την αύξηση των φυτών και για αυτό καλούνται Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Η παρούσα εργασία στοχεύει στη διερεύνηση του τρόπου δράσης τεσσάρων στελεχών ριζοβακτηρίων με αποδεδειγμένη ικανότητα βιοελέγχου. Συγκεκριμένα, τα στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76 επιλέχθηκαν για την ικανότητά τους να καταστέλλουν, σε πειράματα in vitro και in planta, τον μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici (Forl). Στο πλαίσιο του παραπάνω στόχου, απομονώθηκαν, χαρακτηρίστηκαν και αξιολογήθηκαν in vitro, δύο σημαντικές αντιβιοτικές ενώσεις, το καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) και η προδιγιοσίνη (2-methyl-3-pentyl-6- methoxy prodigiosin), από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, αντίστοιχα. Η αναστολή της ανάπτυξης του παθογόνου μύκητα Forl αλλά και του μύκητα Clonostachys rosea IK726 μετά την εφαρμογή και των δύο μερικά καθαρισμένων αντιβιοτικών ουσιών, ήταν έντονη. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση ακατέργαστων εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βακτηρίων επί των δύο προαναφερθέντων μυκήτων σε in vitro πειράματα, υπολογίζοντας τις τιμές EC 50 (Half maximal Effective Concentration). Τα παραπάνω πειράματα συνεισφέρουν στην κατανόηση της σημασίας των αντιβιοτικών ουσιών για τη δράση των συγκεκριμένων βακτηριακών στελεχών κατά των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών αλλά και πώς αυτά μπορεί στο πεδίο δράσης τους να αναστέλλουν και ωφέλιμους μικροοργανισμούς. Στη συνέχεια μελετήθηκε η ικανότητα των βιοπαραγόντων να παράγουν άλλες αντιμικροβιακές ουσίες, πλην των αντιβιοτικών, αλλά και ρυθμιστές ανάπτυξης. Επιβεβαιώθηκε η ικανότητα παραγωγής σιδηροφόρων και πρωτεασών από όλα τα στελέχη ενώ το P. chlororaphis ToZa7 αποδείχτηκε ικανό να παράγει επιπλέον και υδροκυάνιο. Η παραγωγή αυτών των ενώσεων μπορεί να εξηγήσει την ικανότητά τους να περιορίζουν σημαντικά την ανάπτυξη του μύκητα Forl και την ένταση της σήψης λαιμού και ριζών της τομάτας που αυτός προκαλεί. Όσον αφορά στην παραγωγή και έκκριση φυτορμονών, όλα τα στελέχη αποδείχτηκαν ικανά να παράγουν ινδολοξικό οξύ με κορυφαίο στέλεχος το S. marcescens PiHa5II το οποίο προκάλεσε και την εντονότερη προαγωγή της αύξησης που παρατηρήθηκε σε διάφορα φυτά. Σε αυτό το πλαίσιο προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα των μακροστοιχείων N, C, S, Κ, Ca, Mg και Ρ σε φυτά ρεπανιού που είχαν δεχτεί επεμβάσεις με τα ριζοβακτήρια. Όσον αφορα το υπέργειο τμήμα, το βακτήριο S. marcescens PiHa5ΙΙ αύξησε σημαντικά την απορρόφηση του καλίου στα φύλλα, ενώ η επέμβαση με το P. chlororaphis ToZa7 αύξησε σημαντικά την απορρόφησή του μαγνησίου. Όσον αφορά το υπόγειο τμήμα, παρατηρήθηκαν διαφορές μόνο στις μετρήσεις απορρόφησης του ασβεστίου και του φωσφόρου, τα οποία αυξήθηκαν μετά 9

16 από τον εμβολιασμό με τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76 αντίστοιχα. Όσον αφορά στα βασικά θρεπτικά στοιχεία, άζωτο, άνθρακα και θείο (N, C, S), στο υπέργειο τμήμα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει στατιστικά σημαντικά την απορρόφηση και συσσώρευση του αζώτου, ενώ η απορρόφηση του άνθρακα επηρεάζεται από την παρουσία του B. cereus S76, το οποίο και αυξάνει σημαντικά την συγκέντρωση του στοιχείου στα φύλλα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Στο υπόγειο τμήμα, το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει σημαντικά τη συσσώρευση του αζώτου και του άνθρακα, ενώ η επέμβαση με το S. marcescens PiHa5II μειώνει τη συγκέντρωση του θείου σε σύγκριση με τα φυτά του μάρτυρα που δεν έχουν υποστεί βακτηριακή μεταχείριση. Στη συνέχεια μελετήθηκε η προοπτική συνδυασμού των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 με τον C. rosea IK726. Η διερεύνηση έγινε αρχικά μέσω της μελέτης της έκφρασης 14 γονιδίων μεταφορέων ABC στον C. rosea IK726, με τη χρήση της ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης έδειξε σημαντική επαγωγή στην έκφραση των γονιδίων abcb1, abcb26, abcg8 και abcg25 στο μυκήλιο που αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 ωρών, του S. rubidaea S55. Ωστόσο, καμία σημαντική επαγωγή δεν παρατηρήθηκε στο αντίστοιχο υπερκείμενο του P. chlororaphis ToZa7. Επιπλέον, όταν ο μύκητας αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 και 72 ωρών του S. rubidaea S55, 5 γονίδια (abcc14, abcc12, abcb20, abcb1, και abcb26) εκφράστηκαν σημαντικά περισσότερο, ενώ η αντίστοιχη ανάπτυξη σε υπερκείμενο 72 ωρών του P. chlororaphis ToZa7 προκάλεσε την επαγωγή 3 μόνο γονιδίων (abcc14, abcb1, και abcb26). Η σημασία των γονιδίων που κωδικοποιούν τους μεταφορείς ABC έγκειται στο ότι προσδίδουν στον μύκητα την ικανότητα αποτοξίνωσης του κυττάρου από δευτερογενείς μεταβολίτες. Η θετική επίδραση του συνδυασμού των βιοπαραγόντων διαπιστώθηκε σε in planta πειράματα σε τομάτα, σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες, όπου και παρουσίασαν ικανοποιητική φυτοπροστατευτική δράση έναντι του Forl. Προκειμένου να συνδεθεί η αρνητική επίδραση των βιοπαραγόντων S. rubidaea S55, P. chlororaphis ToZa7 και C. rosea IK726 στη σήψη ριζών και λαιμού, διερευνήθηκε η επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με μηχανισμούς άμυνας σε φυτά τομάτας, μετά από προσβολή από τον μύκητα Forl και εμβολιασμό των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 σε συνδυασμό με τον C. rosea IK726 και μεμονωμένα. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε σε ρίζες φυτών τομάτας που αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες και τα γονίδια που μελετήθηκαν ήταν τα PR-1a, GLUA και CHI3 τα οποία κωδικοποιούν αντιμικροβιακές πρωτεΐνες τύπου PR-1, PR-2, PR-3, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου PR-1a ήταν υψηλότερα στην τομάτα μετά από μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο 48 ώρες από τον εμβολιασμό επαγωγής με τον C. rosea IK726. Το ίδιο παρατηρήθηκε και ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με συνδυασμό του C. rosea IK726 με το P. chlororaphis ToZa7. Το γονίδιο αυτό έδειξε να εκφράζεται εντονότερα και όταν επέδρασε στο φυτό το S. rubidaea S55 και 72 ώρες αργότερα ακολούθησε μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο. Το γονίδιο CHI3 εκφράστηκε περισσότερο όταν η μόλυση πρόκλησης με το παθογόνο έγινα 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με C. rosea. Όσον αφορά στο γονίδιο GLUA, τα επίπεδα έκφρασής του στην τομάτα αυξήθηκαν ελάχιστα μετά από μόλυνση πρόκλησης που έγινε 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με S. rubidaea S55 και με C. rosea ΙΚ726 καιμε C. rosea ΙΚ726 S. rubidaea S55. Ωστόσο, 10

17 τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PR-1a και GLUA αυξήθηκαν σημαντικά στην τομάτα, μετά από έκθεση στο στέλεχος P. chlororaphis ToZa7, για 120 ώρες, χωρίς να ακολουθήσει μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο. Τέλος, στο πλαίσιο της μελέτης των αλληλεπιδράσεων του C. rosea IK726 και του Forl στη ριζόσφαιρα, οι δύο μύκητες μετασχηματίστηκαν με τα γονίδια της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) και της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (DsRed), αντίστοιχα. Οι παρατηρήσεις σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες laser φανέρωσαν την ικανότητα αποικισμού του ριζικού συστήματος της τομάτας από τον ωφέλιμο μύκητα C. rosea IK726. Παράλληλες παρατηρήσεις in vitro ενίσχυσαν την υπόθεση ότι ο βασικός τρόπος δράσης του C. rosea IK726 είναι ο υπερπαρασιτισμός των υφών του φυτοπαθογόνου μύκητα. Τέλος, μελετήθηκε ο αποικισμός του ριζικού συστήματος της τομάτας από το στέλεχος P. chlororaphis Τοζα7. Το στέλεχος ΤοΖα7 μετασχηματίστηκε με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης μέσω βακτηριακής σύζευξης. Έξι ημέρες μετά τον εμβολιασμό παρατηρήθηκε ότι το ριζοβακτήριο αποίκισε τα ριζικά τριχίδια και τα επιφανειακά κύτταρα της τομάτας, ενώ επιβεβαιώθηκε η ενδοφυτική του ικανότητα με απομόνωση από το εσωτερικό των επιδερμικών κυττάρων. 11

18 Abstract Consumer pressure for quality products free of agrochemical residues has led to the need for adopting methods by which products are produced at the lowest possible cost and with less environmental impact. Such a strategy also includes the use of beneficial microorganisms that achieve biological control of diseases and are called biological control agents (BCAs). Biological control agents in many cases promote plant growth and are therefore called Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). The present study is focused on investigating the mode of action of four rhizobacterial strains with proven antifungal and disease suppression activity. The strains Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II and Bacillus cereus S76 were selected for their ability to suppress Fusarium oxysporum f. sp. radicis - lycopersici (Forl), in in vitro and in planta experiments. While investigating the mode of action of S. rubidaea S55 and P. chlororaphis ToZa7, two important antibiotics were isolated, characterized and evaluated in vitro. P. chlororaphis ToZa7 produced phenazine (phenazine-1-carboxamide, PCN) and S. rubidaea S55 produced prodigiosin (2-methyl-3- pentyl-6-methoxy prodigiosin). The inhibition of the pathogenic fungus Forl, as well as the fungal biocontrol agent Clonostachys rosea IK726, after the effect of the partially purified antibiotics, was strong. The inhibitory action of the bacterial culture crude extracts was further studied, calculating EC 50 (Half maximal Effective Concentration) values. The above experiments underline the importance of antibiotics for bacterial biocontrol agents when they interact with phytopathogenic fungi but also with beneficial microorganisms. The ability of the biocontrol agents to produce antimicrobial compounds, other than antibiotics, as well as plant growth regulators, was also studied. All strains were proven capable of producing siderophores and proteases, while P. chlororaphis ToZa7 additionally produces hydrogen cyanide. The production of these compounds can explain their ability to significantly restrict the growth of Forl and the intensity of the tomato foot and root rot. Regarding the production and secretion of phytohormones, all strains were able to produce indoleacetic acid, and S. marcescens PiHa5II which was the most important producer, caused the strongest growth promotion observed in various plants. In this prospect, macro-elements N, C, S, K, Ca, Mg and P contents were determined in radish plants, treated with the aforementioned rhizobacteria. Regarding the abovegroung part of radish, S. marcescens PiHa5II significantly increased the absorption of potassium in leaves, while treatment with P. chlororaphis ToZa7 increased the absorption of magnesium. Regarding the underground part, differences in calcium and phosphorus concentration were observed, after treatment with P. chlororaphis Toza7 and B. cereus S76, respectively. Regarding nitrogen, carbon and sulfur (N, C, S), in the above-ground part, the results showed that P. chlororaphis ToZa7 increased the accumulation of nitrogen, while the accumulation of carbon was positively affected by the presence of B. cereus S76. In the underground part, P. chlororaphis ToZa7 significantly increased the accumulation of nitrogen and carbon, while sulfur concentration lowered after S. marcescens PiHa5II treatment, compared to control plants that were not treated with bacteria. 12

19 The possibility of combined application of strains S. rubidaea S55 and P. chlororaphis ToZa7 with C. rosea IK726 was also studied. Investigation of the possible combination was initially made by studying the expression of 14 ABC transporter genes in C. rosea IK726, using the quantitative reverse transcription PCR. The gene expression analysis showed significant induction in expression of abcb1, abcb26, abcg8 and abcg25 genes, in mycelium grown in 24-hour culture supernatant of S. rubidaea S55. However, no significant induction was observed in the 24-hour culture supernatant of P. chlororaphis ToZa7. In addition, when the fungus was grown in a 72-hour culture supernatant of S. rubidaea S55, 5 genes (abcc14, abcc12, abcb20, abcb1, and abcb26) were upregulated, whereas the growth in a 72-hour supernatant of P. chlororaphis ToZa7 caused induction of only 3 genes (abcc14, abcb1, and abcb26). The importance of the genes encoding the ABC transporters is that they putatively allow the fungus cells to detoxify from secondary toxic metabolites. However, positive effects of the combination of the above biocontrol agents was verified in in planta experiments on tomato, in pots, under controlled conditions, where suppression of tomato foot and root rot by Forl, was observed. In order to explain the ability of S. rubidaea S55, P. chlororaphis Toza7 and C. rosea IK726 to suppress the disease, the induction of genes related to mechanisms of resistance in tomato plants, was investigated after induction inoculation with S. rubidaea S55 and P. chlororaphis ToZa7 in combination with C. rosea IK726 and separately, followed by challenge inoculation with Forl. Gene expression was tested in tomato roots, under controlled conditions, and the genes studied were PR-1a, GLUA and CHI3 encoding PR- 1, PR-2, PR-3 proteins, respectively. PR-1a gene expression level was higher in tomato after treatment with C. rosea IK726, and challenge inoculation with Forl, 48 hours later. The same was observed after treatment of a combination of C. rosea IK726 with P. chlororaphis ToZa7. This gene was also expressed when challenge inoculation with Forl was applied 72 hours after the induction inoculation with S. rubidaea S55. Expression of CHI3 gene was higher when challenge inoculation with Forl was applied 48 hours after treatment with C. rosea IK726. Regarding the GLUA gene, its level of expression slightly increased after treatment with Forl, applied 72 hours after induction inoculation with S. rubidaea S55 and C. rosea IK726 and C. rosea IK726 + S. rubidaea S55. However, PR- 1a and GLUA gene expression levels increased significantly in tomato after exposure to the P. chlororaphis ToZa7 strain for 120 hours, without challenge inoculation with the pathogen Finally, in order to further study the interactions of C. rosea IK726 and Forl in the rhizosphere, the two fungi were transformed with the green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent protein (DsRed) genes, respectively. Observations under a confocal laser scanning microscope (CLSM) revealed the ability of C. rosea IK726 to colonize the root system of tomato rapidly and efficiently. In vitro observations have further supported the hypothesis that the primary mode of action of C. rosea IK726 is hyperparasitism of the phytopathogenic fungus. Finally, colonization of the tomato roots by P. chlororaphis Toza7 was studied. CLSM revealed that this strain successfully colonizes the tomato roots and further on, its endophytic ability was confirmed by isolation from the interior of the epidermal cells. 13

20 Συντομογραφίες ABA Αμπσισικό οξύ (ABscisic Acid) ABC transporter proteins (ή ABC transporters) Πρωτεΐνες-μεταφορείς (ATP-Binding Cassette transporter proteins) AFM Αντιμυκητιακοί μεταβολίτες (Antifungal Metabolites) ATP Tριφωσφορική αδενοσίνη (Adenosine TriPhosphate) BCA Παράγοντας βιολογικού ελέγχου (Biological Control Agent) CFU Αριθμός μονάδων που είναι ικανές να παράγουν αποικίες (Colony Forming Units) CLPs Κυκλικά λιποπεπτίδια (Cyclic Lipopeptides) CLSM Συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με ακτίνες laser (Confocal Laser Scanning Microscopy) DAMP Μοριακό μοτίβο που σχετίζεται με κατεστραμμένο ιστό (Damage-Associated Molecular Pattern) DAPG Διακετυλοφλορογλουκινόλη (2,4-diacetylphloroglucinol) EC 50 Συγκέντρωση στο 50% της δραστικής δόσης (Effective Concentration 50%, Half maximal Effective Concentration) ESI Ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionisation) ETI Ανοσία που ενεργοποιείται από έναν τελεστή (Effector-Trigged Immunity) GA Γιββεριλινικό οξύ (Gibberellinic Acid) GFP Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein) HPLC Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography) 14

21 IAA Ινδολοξικό οξύ (Indole Acetic Acid) IPA Ινδολοπυροβικό οξύ (Ιndole-3-pyruvic acid) IPM Ολοκληρωμένη Διαχείριση Ασθενειών (Integrated Pest Management) ISR Διεγειρόμενη Διασυστηματική Αντοχή (Induced Systemic Resistance) JA Ιασμονικό οξύ (Jasmonic Acid) LB Θρεπτικό μέσο Luria Bertani (Luria Bertani medium) LC/MS Υγρή Χρωματογραφία/ Φασματομετρία Μάζας (Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry) LOD Όριο ανίχνευσης αναλυτικής μεθόδου (Limit of Detection) LOQ Όριο ποσοτικού προσδιορισμού αναλυτικής μεθόδου (Limit of Quantification) LPs Λιπο-πολυσακχαρίτες (LipoPolysaccharides) MAMP Μοριακό μοτίβο που σχετίζεται με μικρόβιο (Microbial-Associated Molecular Pattern) MDR Πολυφαρμακευτική αντοχή (MultiDrug Resistance) NBDs Κυτοπλασματικές περιοχές πρόσδεσης νουκλεοτιδίων (cytoplasmic Nucleotide Binding Domains) NMR Πυρηνικός Mαγνητικός Συντονισμός (Nuclear Magnetic Resonance) PAMP Μοριακό μοτίβο που σχετίζεται με παθογόνο (Pathogen-Associated Molecular Pattern) PSB Βακτήρια που διαλυτοποιούν τον φώσφορο (Phosphate Solubilizing Bacteria) PCA Φαιναζίνη-1-καρβοξυλικό οξύ 15

22 (Phenazine-1-carboxylic acid) PCN Φαιναζίνη-1-καρβοξυαμίδιο (Phenazine-1-carboxamide) PDA Θρεπτικό μέσο PDA, Άγαρ Δεξτρόζης Πατάτας (Potato Dextrose Agar) PDR Πλειοτροπική αντοχή σε φάρμακα (Pleiotropic Drug Resistance) PGPR Ριζοβακτήρια που προάγουν την αύξηση των φυτών (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) PIPs Προστατευτικά που εισάγονται στο φυτό (Plant-Incorporated Protectants) PR Πρωτεΐνες που σχετίζονται με την παθογένεση (Pathogenesis Related Proteins) PTI Ανοσία που ενεργοποιείται από PAMP (PAMP-Triggered Immunity) QS Αίσθηση απαρτίας (Quorum Sensing) SA Σαλικυλικό οξύ (Salicylic Acid) SAR Επίκτητη Διασυστηματική Αντοχή (Systemic Acquired Resistance) TLC Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography) TMDs Διαμεμβρανικές περιοχές που συνδέονται με τη μεμβράνη (membrane associated TransMembrane Domains) 16

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Εισαγωγή 1.1. Γενικά Η σύγχρονη γεωργία αντιμετωπίζει σοβαρές προκλήσεις όσον αφορά στην παραγωγή τροφίμων που είναι ασφαλή προς κατανάλωση. Η αειφορία της γεωργικής πρακτικής πλήττεται από την εντατικοποίηση των καλλιεργειών που συνοδεύεται από την αλόγιστη χρήση λιπασμάτων αλλά και φυτοφαρμάκων, εξαιτίας της συσσώρευσης φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών (Skevas et al., 2010). Κατά συνέπεια, από την υπερβολική χρήση χημικών επηρεάζεται τόσο το περιβάλλον όσο και η δημόσια υγεία. Κανείς δε μπορεί να αμφισβητήσει τον καθοριστικό ρόλο των μικροοργανισμών στη γονιμότητα των εδαφών και στη φυτοπροστασία, αλλά και το ότι η αξία αυτών έχει τεθεί στο περιθώριο, στο όνομα της εντατικοποίησης των καλλιεργειών και της ευκολότερης διασφάλισης μεγάλων ποσοτήτων προϊόντων. Η χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών ώστε να επιτευχθεί μια αειφόρος αύξηση της παραγωγής, είναι μία πιθανή εναλλακτική λύση στο πρόβλημα της υπερβολικής χρήσης χημικών λιπασμάτων και φυτοφαρμάκων (Pal & McSpadden, 2006). Η προοπτική της αντιμετώπισης φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών και της προαγωγής της αύξησης των φυτών μέσω της χρήσης ωφέλιμων μικροοργανισμών, μυκήτων και ριζοβακτηρίων, έχει πλέον ευρεία αποδοχή (Antoun & Prévost, 2005; Pal & McSpadden, 2006; Pliego et al., 2011). Η πολυπλοκότητα και οι παραλλαγές των μηχανισμών δράσης μεταξύ των διαφορετικών γενών και ειδών μικροοργανισμών, ακόμα και μεταξύ των στελεχών του ίδιου είδους, αλλά και η αστάθεια της χρήσης έμβιων οργανισμών, καθιστούν τη βιολογική καταπολέμηση μια μέθοδο που δεν έχει ακόμα κατανοηθεί πλήρως και συνεπώς δεν έχει αξιοποιηθεί ούτε εφαρμόζεται ευρέως. Ωστόσο, μπορεί κανείς να εντοπίσει πολλές επιστημονικές προκλήσεις στη έρευνα πάνω στην αποτελεσματική χρήση και εφαρμογή ωφέλιμων μικροοργανισμών ακόμα και με τη μορφή βιοκτόνων. Η παρούσα διατριβή παρέχει πληροφορίες για το σύνθετο οπλοστάσιο των βακτηριακών στελεχών των ειδών Pseudomonas chlororaphis, Serratia rubidaea, S. marcescens και Bacillus cereus (Kamou et al., 2015), που μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο για την προστασία των φυτών όσο και για την προαγωγή της αύξησης αυτών, είτε από μόνα τους, είτε σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες βιολογικού ελέγχου, όπως τον ωφέλιμο μύκητα Clonostachys rosea IK726 (Jensen B. et al., 2000; 2002; 2004; Jensen D.F. et al., 2007) Καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών Τα φυτά τόσο σε φυσικές συνθήκες, όσο και κατά την καλλιέργειά τους, είναι εκτεθειμένα σε ένα ευρύ φάσμα παθογόνων μικροοργανισμών και εχθρών. Αυτοί περιλαμβάνουν τους μύκητες, τους ωομύκητες, τα βακτήρια, τους ιούς, τους νηματώδεις και τα αρθρόποδα (έντομα και ακάρεα) που προκαλούν ασθένεια ή καταστροφές στο φυτό (Agrios, 2005). Όλα τα φυτοπαράσιτα επηρεάζουν την ευρωστία του φυτού καταναλώνοντας, υποβαθμίζοντας ή καταστρέφοντας φυτικούς ιστούς και κάμπτοντας το σύστημα άμυνας του ξενιστή. Συνεπώς είναι επιτακτική ανάγκη να υπάρχει μια στρατηγική φυτοπροστασίας κατά τη γεωργική πρακτική ώστε να μη ζημιώνεται οικονομικά ο εκάστοτε παραγωγός και να εξασφαλίζεται η γεωργική παραγωγή. Σημαντική λεπτομέρεια κατά την καταπολέμηση των φυτοπαράσιτων είναι το ότι η καταστροφή του φυτικού 17

24 κεφαλαίου σχετίζεται άμεσα με την οικονομική ζημία που αυτά επιφέρουν. Έτσι, στοχεύοντας στην όσο πιο γρήγορη εξάλειψη των φυτοπαρασίτων ώστε να εξασφαλιστεί το κέρδος του παραγωγού, για πολλά χρόνια προτιμήθηκε η συμβατική καταπολέμηση που βασίζεται στα χημικά προϊόντα φυτοπροστασίας. Μια επιτυχημένη στρατηγική καταπολέμησης όμως μπορεί να περιλαμβάνει και άλλα μέσα εκτός από τα χημικά τα οποία μπορεί να είναι καλλιεργητικά, βιοτεχνολογικά και βιολογικά (Dent, 1995). Η συνειδητοποίηση μίας τέτοιας ανάγκης εκφράστηκε από την επιστημονική κοινότητα με την εισαγωγή των όρων «Ολοκληρωμένη Διαχείριση» ή «Ολοκληρωμένη Αντιμετώπιση» (Integrated Pest Management, Integrated Control), (Karuppuchamy & Venugopal, 2016). Καλλιεργητικά μέσα και μέτρα υγιεινής είναι αυτά που βελτιστοποιούν τις συνθήκες αύξησης του καλλιεργούμενου φυτού, περιορίζοντας παράλληλα την ανάπτυξη των φυτοπαράσιτων. Αυτά περιλαμβάνουν π.χ. το κλάδεμα, την αφαίρεση προσβεβλημένων φυτικών ιστών, την αμειψισπορά, την αγρανάπαυση, την επιλογή του χρόνου και τόπου σποράς, την κατεργασία του εδάφους κ.α. Όσον αφορά στους φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς, η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών αποτελεί τον οικονομικότερο και ασφαλέστερο τρόπο αντιμετώπισης των ασθενειών. Για αυτόν τον λόγο στα εργαστήρια Γενετικής Βελτίωσης η έρευνα έχει στραφεί προς τα γονίδια αντοχής των φυτών και την τελειοποίηση των ανθεκτικών ποικιλιών (Jones et al., 2014). Τα νομοθετικά μέσα περιλαμβάνουν τον υγειονομικό έλεγχο της εισόδου φυτικού υλικού ώστε με τις κατάλληλες νομοθετικές διαδικασίες, που ορίζονται από τη Διεθνή Σύμβαση Φυτοπροστασίας, να περιορίζεται η εξάπλωση επικίνδυνων φυτοπαράσιτων. Τέτοιο παράδειγμα είναι οι φυτοϋγειονομικοί έλεγχοι που αποδίδονται διεθνώς με τον όρο «καραντίνα» (quarantine) και οι οποίοι εκδίδουν πιστοποιητικά φυτοϋγειονομικού ελέγχου, ανάλογα με τις απαιτήσεις των χωρών εισαγωγής (Agrios, 2005). Οι χημικές μέθοδοι περιλαμβάνουν την εφαρμογή χημικών ουσιών που μπορούν να επιβραδύνουν ή να αναστέλλουν την ανάπτυξη των παθογόνων μικροοργανισμών, ή μπορούν να τους θανατώνουν. Ως βιολογικές μέθοδοι ορίζονται αυτές με τις οποίες επιδιώκεται η μείωση του μολύσματος ή η ελάττωση της δραστηριότητας του φυτοπαράσιτου με τη χρήση ενός ή περισσότερων οργανισμών, πλην του ανθρώπου (Agrios, 2005). Το σύνολο των προϊόντων που χρησιμοποιούνται κατά την καταπολέμηση των φυτοπαθογόνων και των εχθρών των φυτών, ονομάζονται φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Σύμφωνα με την κοινοτική οδηγία 1107/2009 της Ε.Ε., σαν φυτοπροστατευτικά προϊόντα (plant protection products) νοούνται οι δραστικές ουσίες και τα σκευάσματα που προορίζονται για προστασία των φυτών και των φυτικών προϊόντων από κάθε είδους επιβλαβή οργανισμό. Τα τελευταία χρόνια στη λίστα των φυτοπροστατευτικών σκευασμάτων προστέθηκαν και τα βιο-αντιπαθογονικά σκευάσματα (biopesticides). Αυτά, εντός Ε.Ε. ορίζονται ως «μια μορφή φυτοφαρμάκων που βασίζονται σε μικροοργανισμούς ή σε φυσικά προϊόντα» και στις Η.Π.Α. ορίζονται ως «σκευάσματα που περιλαμβάνουν α) φυσικές ουσίες που ελέγχουν παράσιτα (βιοχημικά σκευάσματα), β) μικροοργανισμούς που ελέγχουν παράσιτα (μικροβιακά φυτοπροστατευτικά σκευάσματα), και γ) διαλύματα από παρασιτοκτόνες ουσίες που παράγονται από φυτά στα οποία προστίθενται γενετικό υλικό (προστατευτικά που εισάγονται στο φυτό, plant incorporated protectants, PIPs)». 18

25 Βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών Οι Cook και Baker (1983), όρισαν τη βιολογική καταπολέμηση ως τη μείωση της ποσότητας του μολύσματος ενός παθογόνου, ή της δράσης του που προκαλεί ασθένεια, μείωση που επιτυγχάνεται μέσω ενός ή περισσότερων οργανισμών, πλην του ανθρώπου. Οι οργανισμοί που πετυχαίνουν τη βιολογική καταπολέμηση ονομάζονται παράγοντες βιολογικού ελέγχου (biological control agents, BCAs) (Pal & McSpadden, 2006). Πρόκειται για ένα είδος καταπολέμησης που εισήχθη σαν έννοια μισό αιώνα νωρίτερα, το 1965 σε ένα συμπόσιο στο Μπέρκλεϊ με θέμα «Οικολογία των εδαφογενών φυτοπαθογόνων προανάκρουσμα της βιολογικής καταπολέμησης» (Baker & Snyder, 1965). Παρά το ότι είναι μια γνωστή έννοια εδώ και πενήντα χρόνια, η εξέλιξη της βιολογικής καταπολέμησης κινείται αργά και ο αριθμός των γνωστών και αποτελεσματικών σκευασμάτων είναι περιορισμένος. Ήδη από τη δεκαετία του 1980 η στροφή προς μια πιο οικολογική μορφή γεωργικής εκμετάλλευσης αρχίζει να διαφαίνεται. Τα μέχρι τότε πολύ αποτελεσματικά σκευάσματα που χρησιμοποιούσαν οι συμβατικοί καλλιεργητές, αρχίζουν να εμφανίζουν και πολλά αρνητικά στοιχεία. Οι περιοχές με μεγάλες καλλιεργούμενες εκτάσεις αρχίζουν να εμφανίζουν προβλήματα όπως ευτροφισμό λιμνών, υποβάθμιση του υπόγειου υδροφόρου ορίζοντα, ερημοποίηση εδαφών, μείωση της βιοποικιλότητας. Εκείνη την περίοδο εμφανίζονται Ευρωπαϊκές Οδηγίες και Συνοδευτικά Μέτρα που μαρτυρούν τη στροφή προς μια πιο οικολογική γεωργική πρακτική: Οδηγία 91/676/ΕΟΚ σχετικά με την προστασία των υδάτων από τη νιτρορύπανση γεωργικής προέλευσης, κανονισμός 2078/92 «περί γεωργικών πρακτικών συμβατών με το περιβάλλον» κ.α. Η υποβάθμιση του περιβάλλοντος και της διατροφής που προκύπτει από την υπερβολική και αλόγιστη χρήση των αγροχημικών είναι πλέον μια πραγματικότητα. Ως εκ τούτου, συντελείται μέχρι σήμερα μια προσπάθεια σταδιακής μείωσης της χρήσης συμβατικών αγροχημικών. Πολλές δραστικές ουσίες, ή ολόκληρες ομάδες φυτοφαρμάκων, με μεγάλη υπολειμματική διάρκεια ή με τοξικές ιδιότητες καταργούνται (τριαζίνες, οργανοφωσφορικά, οργανοχλωριωμένα) και ταυτόχρονα θεσπίζονται αυστηρά όρια υπολειμματικότητας για τα περισσότερα από τα υπόλοιπα (Aktar et al., 2009). Παράλληλα αυξάνεται και η απαίτηση του καταναλωτικού κοινού για πιο υγιεινά τρόφιμα, τα οποία έχουν ελεγχθεί για υπολείμματα γεωργικών φαρμάκων και έχουν καλλιεργηθεί με συστήματα ολοκληρωμένης διαχείρισης ή είναι βιολογικά προϊόντα. Μια απάντηση σε αυτήν τη ζήτηση είναι η ενσωμάτωση στη γεωργική πρακτική της βιολογικής καταπολέμησης των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών. Η εφαρμογή της βιολογικής καταπολέμησης μπορεί να είναι άμεση ή έμμεση. Ως άμεση εφαρμογή ορίζεται η χρήση ανταγωνιστικών ή παρασιτικών μικροοργανισμών ή η χρήση μη παθογόνων στελεχών του μικροοργανισμού που προκαλεί την ασθένεια. Όταν ο παραγωγός χρησιμοποιεί ανθεκτικές ποικιλίες, καλλιεργητικές τεχνικές και γενικότερα μεταχειρίσεις που ενισχύουν το φυτό ξενιστή και την υπάρχουσα ωφέλιμη μικροβιακή κοινότητα, τότε γίνεται λόγος για έμμεση εφαρμογή της βιολογικής καταπολέμησης (Jones & Dangl, 2006). Τις τελευταίες δεκαετίες υπάρχει μια τάση να απομονώνονται και να αξιολογούνται ανταγωνιστικοί μικροοργανισμοί με απώτερο σκοπό να εισαχθούν στην παραγωγή νέοι βιολογικοί παράγοντες (Alabouvette et al., 2006). Παρατηρείται επίσης μια στροφή των εταιριών στην παραγωγή σκευασμάτων παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης που έχουν ανταγωνιστική δράση και καταστέλλουν τους παθογόνους μικροοργανισμούς. 19

26 Τέτοια παραδείγματα είναι τα σκευάσματα Galltrol, Nogall, που παράγονται από το μη παθογόνο Agrobacterium radiobacter Κ84, τα Bio Yield, YieldShield, Serenade, Eco- Guard, Companion, Rhizo-Plus και Kodiak που παράγονται από βακτηριακά στελέχη του γένους Bacillus, και τα BlightBan, Spot-Less, Cedomon, BioJect και Bio Save των βακτηρίων P. fluorescens, P. αureofaciens, P. chlororaphis και P. syringae (Tripathi et al., 2010) Αλληλεπιδράσεις στην περιοχή της ριζόσφαιρας Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μικροοργανισμών που εντοπίζονται στο έδαφος και των παθογόνων που προσβάλλουν τις ρίζες και το λαιμό των φυτών, διαβιούν στο έδαφος και ονομάζονται εδαφογενή παθογόνα. Η πιο έντονη δραστηριότητα εντοπίζεται στην οικοφωλεά που καλείται ριζόσφαιρα. Αυτή ορίζεται ως η ρίζα, η επιφάνεια της ρίζας και ο όγκος του εδάφους που την περιβάλλει και αλληλεπιδρά με αυτήν χημικά, φυσικά και βιολογικά (Barea et al., 2005). Στον ορισμό αυτόν περιλαμβάνονται η ενδοριζόσφαιρα (mucigel, επιδερμικά κύτταρα και ριζικά τριχίδια, εξωδερμίδα) και η εξωριζόσφαιρα (ριζικές εκκρίσεις, θρεπτικά στοιχεία, εδαφικά συσσωματώματα) (Sørensen, 1997). Οι μικροοργανισμοί της ριζόσφαιρας με διάφορους μηχανισμούς περιορίζουν τη δράση των εδαφογενών παθογόνων. Τα πιο συχνά απαντώμενα είδη της ριζόσφαιρας ανήκουν στα γένη Pseudomonas, Burkholderia, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Acenitobacter, Azospirillum, Bacillus, Chryseomonas, Klebsiella, Enterobacter, Flavobacterium, Stenotrophomonas, Xanthomonas, Lysobacter, Pantoea, και Serratia (Kremer, 2006). Η σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας σχετίζεται άμεσα με τις πολύπλοκες αβιοτικές και βιοτικές συνθήκες που επικρατούν στη ριζόσφαιρα (Philippot et al., 2013). Οι σύνθετες φυσικοχημικές εδαφικές παράμετροι που επηρεάζουν τη φυσιολογία των φυτών και το είδος των ριζικών εκκρίσεων σε ένα εδαφικό οικοσύστημα, είναι και αυτές που είναι υπεύθυνες για τη σύσταση της μικροβιακής κοινότητας (Philippot et al., 2013). Σύμφωνα με τις πιο πρόσφατες μελέτες μάλιστα, ο εδαφικός τύπος είναι και ο πιο καθοριστικός παράγοντας από όλους όσους συμβάλλουν στη δομή του μικροβιώματος της ριζόσφαιρας (Bulgarelli et al., 2012; Lundberg et al., 2012; Schlaeppi et al., 2014). Ωστόσο, ο αποικισμός της ριζόσφαιρας είναι άρρηκτα συνδεδεμένος με τις ριζικές εκκρίσεις (Lugtenberg & Dekkers, 1999). Μέρος του άνθρακα που δεσμεύεται από τα φυτά κατά τη φωτοσύνθεση μεταφέρεται στη ριζόσφαιρα και ελευθερώνεται ως ριζικό έκκριμα και μάλιστα αξιοσημείωτο είναι πως το 25% αυτού χρησιμοποιείται από τους μικροοργανισμούς για τις μεταβολικές τους ανάγκες (Bais et al., 2006; Philippot et al., 2013). Άλλες ουσίες, που εκκρίνονται από τις ρίζες, και αποτελούν υπόστρωμα ανάπτυξης των μικροοργανισμών, είναι αμινοξέα, λιπαρά οξέα, νουκλεοτίδια, στερόλες, βιταμίνες και σάκχαρα (Lugtemberg & Kamilova, 2009). Η δομή της μικροβιακής κοινότητας φαίνεται να ορίζεται και από τη σύσταση των ριζικών εκκρίσεων και κατ επέκταση από το φυτικό είδος ή/και την ποικιλία ακόμα (Manter et al., 2010; Yao & Wu 2010; İnceoğlu et al., 2012; Hardoim et al., 2012; Philippot et al., 2013). Πιο συγκεκριμένα, φαίνεται πως τα φυτά εκκρίνουν κάποιες ενώσεις ως ριζικά εκκρίματα, οι οποίες αλλοιώνουν την εδαφική σύσταση και ελκύουν συγκεκριμένους μικροοργανισμούς προς όφελός τους (Bever et al. 2012; Miransari, 2013; Lareen et al., 2016). Πρόκειται για πολύ σημαντική συνειδητοποίηση εκ μέρους της επιστημονικής κοινότητας, καθώς φαίνεται ότι τα φυτά 20

27 προσελκύουν συγκεκριμένους μικροοργανισμούς οι οποίοι μέσω του δευτερογενούς μεταβολισμού τους θα αποδώσουν στο φυτό που τους προσέλκυσε περισσότερα θρεπτικά στοιχεία και προστασία του ριζικού συστήματος (Lareen et al., 2016). Αξιοσημείωτο είναι το ότι οι ριζικές εκκρίσεις αλλάζουν τόσο σε συνάρτηση με το βλαστικό στάδιο ανάπτυξης (Chaparro et al., 2014), όσο και χωροταξικά, ανάλογα με το σημείο της ρίζας (DeAngelis et al., 2009), αλλάζοντας έτσι και το ριζοβίωμα (rhizobiome). Επιπλέον, πρόσφατη έρευνα έδειξε πως η μικροβιακή κοινότητα ανταποκρίνεται σε ριζικά εκκρίματα φαινολικής φύσεως, ακόμα και απουσία του φυτού, ανοίγοντας το δρόμο σε καινούργιες πρακτικές φυτοπροστασίας (Badri et al., 2013). Ως εκ τούτου, μπορεί κανείς να συμπεράνει πως υπάρχει χημική επικοινωνία μεταξύ του φυτού και των πληθυσμών των μικροοργανισμών (Verbon & Liberman, 2016), γεγονός που καθορίζει τον επιτυχημένο αποικισμό και κατ επέκταση τον επιτυχημένο παράγοντα βιολογικού ελέγχου (Ahmad & Baker, 1987) Ο αποικισμός της ριζόσφαιρας Ένας επιτυχημένος παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης είναι αυτός που αποικίζει αποτελεσματικά και γρήγορα τις κατάλληλες οικοθέσεις/οικοφωλεές, ακόμα και εις βάρος άλλων μικροοργανισμών (Lugtenberg & Kamilova, 2009; Verbon & Liberman, 2016). Αρχικά το φυτό αναγνωρίζεται από τον μικροοργανισμό, ο οποίος μέσω της χημειόταξης, κινείται προς την πηγή του χημικού ερεθίσματος χρησιμοποιώντας διάφορα όργανα (μαστίγια, τριχίδια) (Weert et al., 2007; Lugtenberg & Kamilova, 2009). Αυτό αποτελεί το πρώτο στάδιο του αποικισμού, γνωστό ως «στάδιο αναγνώρισης - μετακίνησης» (Dupuy & Silk, 2016). Σε δεύτερο χρόνο, ο μικροοργανισμός προσκολλάται στη ριζική επιφάνεια και σχηματίζει βιομεμβράνες (biofilm), μικροαποικίες (microcolonies), ή συμπλάσματα (symplasmata), δηλαδή συναθροίσεις χωρίς κανονική κατανομή, που βρίσκονται κατά κανόνα κατά μήκος των αυλακιών μεταξύ των επιδερμικών κυττάρων (Van Loon et al., 1998; Bolwerk et al., 2003; Lugtenberg & Kamilova, 2009; Verbon & Liberman, 2016; Dupuy & Silk, 2016). Στο στάδιο της προσκόλλησης συμμετέχουν ειδικές προσφυτικές πρωτεΐνες που καλούνται αδεσίνες (adhesins) και είναι συστατικά της επιφάνειας των βακτηριακών κυττάρων καθώς και άλλα συστατικά όπως οι λιποπολυσακχαρίτες (lipopolysaccharides, LPS), οι εξωκυτταρικοί πολυσακχαρίτες (extracellular polysaccharides, EPS) καθώς και η πλευρική αντιγονική αλυσίδας-ο της εξωτερικής μεμβράνης ή επιφανειακής λιποπρωτεΐνης των Gram- βακτηρίων (Compant et al. 2005; Rudrappa et al. 2008; Weller 2007; Mavrodi et al., 2011; Cytryn & Colton, 2011). Αφού ο μικροοργανισμός προσκολληθεί στην επιφάνεια της ρίζας και σχηματίσει τις ακανόνιστες συναθροίσεις που προαναφέρθηκαν, ακολουθεί το τελευταίο στάδιο του αποικισμού που είναι ο σχηματισμός των «οργανωμένων» αποικιών και η εγκατάσταση του μικροοργανισμού στη ριζόσφαιρα (Lugtenberg & Kamilova, 2009; Verbon & Liberman, 2016; Dupuy & Silk, 2016). Πρόκειται για ένα στάδιο στο οποίο παίζει σημαντικό ρόλο η διακυτταρική επικοινωνία μεταξύ των βακτηρίων του ίδιου είδους που απαρτίζουν έναν πληθυσμό (Lareen et al., 2016). Η επικοινωνία αυτή βασίζεται σε μόρια-σήματα και σχετίζεται με τις περισσότερες φυσιολογικές και μεταβολικές διεργασίες των βακτηρίων (Lareen et al., 2016), όπως οι μεταβολικοί ρυθμοί (An et al. 2014) και ο πολλαπλασιασμός (Rocha et al. 2012). Η ρύθμιση της διακυτταρικής επικοινωνίας συσχετίζεται με την πυκνότητα του πληθυσμού και αυτός ο τύπος ερεθίσματος καλείται «αίσθηση απαρτίας» (quorum sensing, QS) (Atkinson & Williams 2009; An et al. 2014; Lareen et al., 2016). 21

28 Αφού η ριζόσφαιρα αποικιστεί επιτυχώς και οι μικροοργανισμοί εγκατασταθούν, μπορεί να δημιουργηθούν σχέσεις αλληλεπίδρασης με το φυτό και με άλλους ωφέλιμους ή παθογόνους μικροοργανισμούς, οι οποίες θα καθορίσουν τη βιολογική καταπολέμηση και τους σύνθετους μηχανισμούς που την απαρτίζουν (Dupuy & Silk, 2016) Εργαλεία παρακολούθησης του αποικισμού Η χρήση της έκφρασης αυτοφθοριζουσών πρωτεϊνών από μικροοργανισμούς, ώστε να παρατηρείται η συμπεριφορά τους in planta, προτιμάται από πολλούς ερευνητές για τα πολλά πλεονεκτήματα που προσφέρει. Πρόκειται για μια μέθοδο η οποία είναι σταθερή και ανεξάρτητη από το είδος του μικροοργανισμού και δεν απαιτεί πολύπλοκα υποστρώματα ή συμπαράγοντες για να υπάρξει ορατό αποτέλεσμα. Οι μικροοργανισμοί αφού αρχίσουν να εκφράζουν την πρωτεΐνη φθορισμού μπορούν να γίνουν ορατοί και να παρατηρηθούν κατά τη διάρκεια του αποικισμού τους σε ιστούς με τη χρήση συνεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης με ακτίνες laser (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM). Η παρατήρηση με CLSM των μικροοργανισμών που εκφράζουν πρωτεΐνες αυτοφθορισμού είναι ένα αποτελεσματικό, γρήγορο και μη επεμβατικό εργαλείο που επιτρέπει τη μελέτη των μικροοργανισμών στο χώρο και το χρόνο, χωρίς ωστόσο να επηρεάζονται οι ίδιοι ή άλλοι μικροοργανισμοί που τυχόν υπάρχουν στο σύστημα που μελετάται (Gamalero, 2003). Η πρωτεΐνη που εκφράζεται συνήθως είναι η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein, GFP) που προέρχεται από τη μέδουσα Aequorea victoria (Chalfie & Kain, 1998; Tsien, 1998). Το γονίδιο που την εκφράζει προστίθεται στο γονιδίωμα του υπό μελέτη οργανισμού και κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 238 αμινοξέα (26,9 kda) το οποίο μετατρέπει το κυανό φως της φωτοπρωτεΐνης ακουαρίνης, σε πράσινο φθορισμό. Ο φθορισμός εμφανίζεται όταν η ακουαρίνη αντιδράσει με ιόντα ασβεστίου Ca 2+ (Chalfie et al., 1994; Inouye et al., 1994). Εκτός από τον άγριο τύπο της GFP που απαντάται στη φύση, έχουν κατασκευαστεί και διάφορα διαγονιδιακά παράγωγα της πρωτεΐνης. Σημαντικότερη βελτίωση ήταν αυτή που έγινε το 1995 από τον Roger Tsien και την ομάδα του και αφορούσε στην καλύτερη φασματοφωτομετρική έκφραση της πρωτεΐνης, στην αύξηση της έντασης του φθορισμού και στη βελτίωση της φωτοσταθερότητάς της. Πολλοί ερευνητές ασχολήθηκαν με τη γενετική τροποποίηση του πεπτιδίου και κατασκευάστηκαν πολλά παράγωγά του, μερικά ακόμα και 35 φορές πιο ισχυρά από τον άγριο τύπο. Αυτά τα παράγωγα εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος και τέτοια παραδείγματα είναι οι πρωτεΐνες: ενισχυμένου κυανού φθορισμού ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein), ενισχυμένου πράσινου φθορισμού EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) και ενισχυμένου κίτρινου φθορισμού EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) (Errampali et al., 1999; Gamalero et al., 2003). Αν και η GFP προτιμάται κατά κανόνα για τη σήμανση εισαχθέντων οργανισμών, το ενδιαφέρον για τη χρησιμοποίηση διαφορετικών, ανάλογων πρωτεϊνών αυξάνεται. Ανάλογη περίπτωση είναι και η κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη DsRed (Red Fluorescent Protein) η οποία προέρχεται από το κοράλι Discoma sp (Jach et al., 2001). 22

29 1.2. Μηχανισμοί βιολογικής δράσης των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Η διεθνής βιβλιογραφία κατατάσσει τους μηχανισμούς καταστολής των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης σε άμεσους και έμμεσους, με κύριο κριτήριο την αμεσότητα της επαφής του ωφέλιμου στελέχους με τον μικροοργανισμό-στόχο και τον βαθμό εκλεκτικότητας που επιδεικνύει ο παράγοντας βιολογικού ελέγχου για το παθογόνο. Με βάση αυτήν την παραδοχή, ο υπερπαρασιτισμός αποτελεί την πιο άμεση μορφή καταστολής καθώς πραγματοποιείται από τον ίδιο τον ωφέλιμο μικροοργανισμό ο οποίος έρχεται σε φυσική επαφή με τον παθογόνο (Pal & McSpadden, 2006). Άλλοι άμεσοι μηχανισμοί είναι ο ανταγωνισμός για θρεπτικά στοιχεία και κατάληψη οικοθέσεων στη ριζόσφαιρα, καθώς και η αντιβίωση που ασκούν οι ωφέλιμοι μικροοργανισμοί στους παθογόνους μέσω της παραγωγής αντιβιοτικών ενώσεων. Τέλος, έμμεσος μηχανισμός δράσης των παραγόντων βιολογικού ελέγχου έναντι των φυτοπαθογόνων είναι η ενεργοποίηση των μηχανισμών άμυνας του φυτού Υπερπαρασιτισμός Κατά τον υπερπαρασιτισμό ή μυκοπαρασιτισμό, ο φυτοπαθογόνος μύκητας καταστέλλεται άμεσα από έναν παράγοντα βιολογικού ελέγχου (Pal & McSpadden, 2006). Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει την περιέλιξη των υφών ενός υπερπαράσιτου μύκητα γύρω από αυτές του παθογόνου, ή τη διάβρωση των υφών του παθογόνου (διάτρηση και είσοδο) και την κατανάλωση πρωτοπλάσματος. Επιτυγχάνεται μέσω της παραγωγής ενζύμων όπως είναι οι χιτινάσες, οι κυτταρινάσες και οι πρωτεάσες, τα οποία λύουν τις υφές ή τα όργανα αναπαραγωγής ή διατήρησης του φυτοπαθογόνου μύκητα (σπόρια, σκληρώτια) και παράλληλα αποτελούν μέσα απόκτησης πηγών άνθρακα μέσω της αποσύνθεσης πολυσύνθετων πολυμερών. Έτσι, τα ωφέλιμα υπερπαράσιτα αντλούν τα απαραίτητα θρεπτικά στοιχεία για αυτά και ταυτόχρονα εμποδίζουν την εξάπλωση του παθογόνου και της ασθένειας (Ko et al., 2009; Neeraja et al., 2010). Παρασιτισμός υφών παθογόνων μυκήτων έχει παρατηρηθεί και από ριζοβακτήρια, αλλά δεν έχει εξηγηθεί η σημασία του φαινομένου αυτού, ούτε έχει μελετηθεί η πιθανή παρασιτική δράση επί του μύκητα (Bolwerk et al., 2003). Ωστόσο, οι χιτινάσες που παράγουν οι βακτηριακοί και μυκητιακοί παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης λύουν τις χιτίνες των κυτταρικών τοιχωμάτων φυτοπαθογόνων μυκήτων αλλά και τα τμήματα χιτίνης από τα οποία αποτελούνται τα τοιχώματα των αυγών των νηματωδών (Cohen-Kupiec & Chet 1998; Neeraja et al. 2010). Η δραστηριότητα κάποιων ωφέλιμων ριζοβακτηρίων επί των παθογόνων βασίζεται στην ικανότητά τους να παράγουν και να εκκρίνουν ένα δραστικό μίγμα υδρολυτικών ενζύμων όπως χιτινάσες, γλουκανάσες, κυτταρινάσες και πρωτεάσες. Η ικανότητά τους να διασπούν δυσδιάλυτους πολυσακχαρίτες όπως είναι η χιτίνη, ένα γραμμικό αδιάλυτο πολυμερές της ακετυλογλυκοσαμίνης (β-1,4-n-acetylglucosamine, GlcNAc), είναι αξιοσημείωτη. Για παράδειγμα, το 1986 ο Fuchs και οι συνεργάτες του κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα είδη του γένους Serratia παράγουν πέντε διαφορετικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη διάσπαση της χιτίνης. Αυτές αργότερα απομονώθηκαν, κλωνοποιήθηκαν και ονομάστηκαν ChiA, ChiB, (Fuchs et al., 1986; Jones et al., 1986), ChiC1, ChiC2 (Suzuki et al., 1999; Gal et al., 1998; Synstad et al., 2008) και CBP21 (Suzuki et al., 1998; Vaaje-Kolstad et al., 2005). Εκτός από το μεγάλο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον 23

30 που παρουσιάζουν αυτά τα ένζυμα λόγω της ικανότητάς τους να μετατρέπουν βιομάζα που περιέχει αδιάλυτη χιτίνη σε χρήσιμα μονομερή συστατικά, παρουσιάζουν και φυτοπαθολογικό ενδιαφέρον. Το πολυμερές της ακετυλογλυκοσαμίνης είναι βασικό συστατικό των κυτταρικών τοιχωμάτων των Ασκομυκήτων, Βασιδιομυκήτων και των ατελών μυκήτων. Η διάσπασή της, ως εκ τούτου, προκαλεί λύση των κυττάρων και έτσι επιτρέπεται ο παρασιτισμός. Επιπλέον, τα μονομερή της χιτίνης που προκύπτουν από τη λύση των μεγαλομορίων μπορεί να επάγουν διασυστηματική αντοχή (Induced Systemic Resistance, ISR) σε φυτά, υποδεικνύοντας έτσι ότι η καταστολή των φυτοπαθογόνων γίνεται με συνδυασμό μηχανισμών δράσης (Cytryn & Kolton, 2011). Πολλά είδη του γένους Bacillus είναι γνωστά για την χιτινολυτική τους δράση. Χαρακτηριστικά παραδείγματα τα στελέχη B. cereus QQ308 και B. subtilis W-118 που καταστέλλουν αποτελεσματικά τους εδαφογενείς φυτοπαθογόνους μύκητες Fusarium oxysporum, F. solani και τον ωομύκητα Pythium ultimum μέσω της έκκρισης χιτινασών και πρωτεασών (Wang et al., 2006; Chang et al., 2007). Οι ενδείξεις για υπερπαρασιτική δράση των βακτηριακών παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης υποστηρίζονται από την παραγωγή αρκετών επιπλέον ενζύμων, όπως είναι οι β-γλουκανάσες, οι λιπάσες, οι φωσφατάσες, οι πρωτεάσες κλπ. Οι τελευταίες, αν και δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς ως προς τον ρόλο τους στη βιολογική καταπολέμηση, έχουν αποδειχτεί ικανές να αναστείλλουν τη δράση πολύ σημαντικών εδαφογενών παθογόνων, όπως ο μύκητας Rhizoctonia solani (Al Askar et al., 2015). Επίσης, τα παραπάνω ένζυμα δρουν συνεργιστικά και με άλλους αντιμυκητιακούς μεταβολίτες (Antifungal Metabolites, AFM) (Cytryn & Kolton, 2011). Είναι γνωστό ότι και άλλα προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού μπορούν να συμβάλλουν στη βιολογική καταπολέμηση. Τέτοιο παράδειγμα είναι το υδροκυάνιο το οποίο είναι έντονα τοξικό για όλους τους αερόβιους μικροοργανισμούς, ακόμα και σε απειροελάχιστες συγκεντρώσεις (picomolar), διότι παρεμποδίζει τη βιοσυνθετική οδό του κυτοχρώματος της οξειδάσης στη διαδικασία της αναπνοής (Bakker & Schippers, 1987; Chet et al., 1990). Υδροκυάνιο παράγεται από πολλά είδη ψευδομονάδων που εμφανίζουν δράση παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης σε συνδυασμό με την παραγωγή αντιβιοτικών και λυτικών ενζύμων (Chin-A-Woeng et al., 1998; Iavicoli et al., 2003; Kamou et al., 2015). Εν τούτοις, είναι σημαντικό να τονιστεί ότι η παραγωγή αυτών των ουσιών σε επαρκείς ποσότητες ορίζεται από τα θρεπτικά και εδαφολογικά στοιχεία και τους περιβαλλοντικούς παράγοντες της κάθε περιοχής (Thomashow et al., 2008; Whipps, 2001) Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών και αντιβίωση Μια άλλη χαρακτηριστική περίπτωση άμεσης καταστολής της επίδρασης των εδαφογενών φυτοπαθογόνων είναι η παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών με αντιμικροβιακή δράση. Αυτές αποτελούν προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης και περιλαμβάνουν αντιβιοτικά, διάφορα ένζυμα και πτητικές ουσίες. Στις αντιμικροβιακές ενώσεις του δευτερογενούς μεταβολισμού ανήκουν η αμμωνία, το υδροκυάνιο, οι βουτυρολακτόνες, η 2,4- διακετυλοφλορογλουκινόλη (2,4-Diacetylphloroglucinol, DAPG), η κανοζαμίνη, η ολιγομυκίνη Α, η ωομυκίνη Α, η φαιναζίνη-1-καρβοξυλικό οξύ (Phenazine-1-carboxylic acid, PCA), η φαιναζίνη-1-καρβοξαμίδιο (Phenazine-1-carboxamide, PCN), η πυολουτεορίνη (Pyoluteorin, Plt), η πυρρολνιτρίνη (Pyrrolnitrin, Pln), η βισκοσιναμίδη, η θειοτροποσίνη, το σουμπτυλένιο, η ξανθοβασίνη, η σβιτερμυκίνη Α και η τενσίνη (Whipps, 24

31 1997; Thrane et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Nair et al., 2004; Van Loon & Baker, 2006). Τα αντιβιοτικά είναι χημικές ουσίες μικρού μοριακού βάρους οι οποίες, σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις, προκαλούν μείωση ή αναστολή της ανάπτυξης άλλων μικροοργανισμών. Σημαντικό στοιχείο αποτελεί το γεγονός ότι συνήθως οι μικροοργανισμοί που παράγουν αντιβιοτικές ουσίες, δεν έχουν μόνον αυτόν τον μηχανισμό στο οπλοστάσιό τους. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν κάποια στελέχη ψευδομονάδων, τα οποία αν και παράγουν αντιβιοτικά (2,4- διακετυλοφλορογλουκινόλη, φαιναζίνες), δρουν συνδυάζοντας και άλλους μηχανισμούς, όπως η επαγωγή της άμυνας του ξενιστή (Iavicoli et al., 2003) ή η παραγωγή υδροκυανίου (Chin-A-Woeng et al., 1998). Η παραγωγή αντιβιοτικών ενώσεων από ορισμένα ριζοβακτήρια καθορίζει συχνά και την επιτυχία της βιολογικής καταπολέμησης. Ακόμη και αν η ίδια η ένωση δεν μειώσει ή αναστείλει την ανάπτυξη του παθογόνου, οι ουσίες που αποτελούν τα προϊόντα διάσπασης των αντιβιοτικών είναι πολύ συχνά διεγέρτες της ISR (Iavicoli et al., 2003; Choudhary & Johri, 2009). Το ενδιαφέρον της έρευνας τα τελευταία χρόνια στρέφεται προς τη μελέτη των βιοσυνθετικών οδών και των γονιδίων που ελέγχουν την παραγωγή των αντιβιοτικών ενώσεων καθώς πολλά αντιβιοτικά έχουν απομονωθεί και προσδιοριστεί (Πίνακας 1.1). Ενώ όμως υπάρχουν βάσιμες αποδείξεις για τη σημασία των αντιβιοτικών στη βιολογική καταπολέμηση, συχνά η συμμετοχή των αντιβιοτικών ενώσεων στην καταστολή του παθογόνου αμφισβητείται. Αυτό συμβαίνει γιατί η in situ ανίχνευση των αντιβιοτικών ουσιών είναι μια σύνθετη διαδικασία. Οι ουσίες αυτές δύσκολα απομονώνονται και προσδιορίζονται διότι εκτός από το γεγονός ότι πρόκειται για χημικά ασταθείς ενώσεις, συχνά δεσμεύονται ισχυρά στα κολλοειδή ή την οργανική ύλη του εδάφους, ή/και αποσυντίθενται από άλλους μικροοργανισμούς (Thomashow et al., 1997; Whipps, 2001). Η επίδρασή τους όμως επαληθεύεται τόσο με τη χρήση μεταλλαγμένων στελεχών τα οποία δεν είναι ικανά να συνθέσουν τις ουσίες αυτές, όσο και με τη χρήση στελεχών που υπερεκφράζουν τις ενώσεις ή γενετικά τροποποιημένων άγριων τύπων που καθίστανται ικανοί να παράγουν το αντιβιοτικό. Στην πρώτη περίπτωση το στέλεχος που δεν παράγει το αντιβιοτικό, δεν αντιμετωπίζει το παθογόνο τόσο αποτελεσματικά όσο όταν παρήγαγε αντιβιοτικές ενώσεις και το αντίθετο φαινόμενο παρατηρείται κατά την υπερέκφραση των ουσιών αυτών. Στην περίπτωση της τροποποίησης των άγριων στελεχών, η ικανότητα καταστολής των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών αυξάνεται και έτσι ενισχύεται η υπόθεση ότι η παραγωγή αντιβιοτικών αν και αποτελεί διαφορετικό μέσο, συμβάλλει στον ανταγωνισμό ή σε άλλους μηχανισμούς δράσης, αντιμετωπίζοντας άλλους μικροοργανισμούς (Chin-A-Woeng et al., 1998; Raaijmakers et al., 2002; Haas & Défago, 2005). Σήμερα πληθώρα αυτών των ενώσεων έχουν χαρακτηριστεί χημικά και συμπεριλαμβάνουν κατά κύριο λόγο αζωτούχες ετεροκυκλικές ενώσεις, όπως είναι οι φαιναζίνες (Thomashow et al., 1988; Chin A Woeng et al., 1998), πυρρολικές ενώσεις όπως η πυρρολνιτρίνη και η προδιγιοσίνη (Yoshihisa et al., 1989, Kalbe et al., 1996; Duzhak et al., 2012), πυο-ενώσεις (pyo-compounds) (Howell & Stipanovic, 1980; Keel et al., 1992), και άλλα παράγωγα γνωστών χημικών ενώσεων (Shanahan et al., 1992; Silo- Suh et al., 1994; Milner et al., 1996; Sandra et al., 2001; Wilhite et al., 2001; Leclere et al., 2005; Islam et al., 2005) (Πίνακας 1.1.). Από τις πιο μελετημένες αντιβιοτικές ουσίες είναι οι φλορογλουκινόλες και συγκεκριμένα η 2,4 διακετυλοφλορογλουκινόλη (2,4 DAPG), η οποία παράγεται από 25

32 στελέχη του P. fluorescens (Shanahan et al., 1992; Keel et al., 1992, Raaijmakers & Weller, 2001). Στις παραπάνω μελέτες αποδεικνύεται η αντιμικροβιακή δράση της ένωσης αυτής κατά πολύ σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων και ωομυκήτων όπως ο Gaeumannomyces graminis var. tritici και ο Thielaviopsis basicola στο σιτάρι και στον καπνό, αντίστοιχα (Keel et al., 1992; Raaijmakers & Weller 2001) και ο Pythium ultimum (Shanahan et al., 1992) (Πίνακας 1.1.). Μια άλλη πολύ γνωστή δομή που παρουσιάζει αντιμικροβιακή δράση είναι αυτή των φαιναζινών. Πρόκειται για αζωτούχα μόρια τα οποία είναι προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού βακτηριακών στελεχών. Παρουσιάζουν ευρύ φάσμα δράσης διότι όχι μόνο παράγουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου αλλά και επειδή είναι ικανά να εναλλάσσουν τους τελικούς αποδέκτες ηλεκτρονίων στα κύτταρα, και άρα να επηρεάζουν την αναπνοή (Pierson & Pierson, 2010). Επιπλέον, οι φαιναζίνες δρουν ως μόρια-σηματοδότες που ελέγχουν την έκφραση γονιδίων, συμβάλλουν στη δημιουργία βιομεμβρανών και πιο συγκεκριμένα δίνουν σήματα που σχετίζονται με το μέγεθος του πληθυσμού του βακτηρίου, για τη λεγόμενη αίσθηση απαρτίας των βακτηρίων (Pierson & Pierson, 2010). Μέσω αυτών των μηχανισμών, ενισχύεται η επιβίωση των βακτηριακών στελεχών που τις παράγουν. Ωστόσο έχουν παρατηρηθεί και επιδράσεις στα φυτά καθώς φαίνεται να προάγουν την αύξηση των φυτών αλλά και να επάγουν την ISR (Pierson & Pierson, 2010). Οι φαιναζίνες μπορεί να έχουν και τον ρόλο σιδηροφόρων ενισχύοντας έτσι την συμμετοχή τους στον ανταγωνισμό κατά φυτοπαθογόνων μυκήτων (Pierson & Pierson, 2010). Η πυοκυανίνη (pyocyanin, 5-N-methyl-1-hydroxophenazinium betaine) ήταν η πρώτη φαιναζίνη που απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε το 1859 από τον Fordos, και έκτοτε στην ομάδα αυτή έχουν προστεθεί πολλά μέλη. Τα βακτήρια των γενών Pseudomonas και Streptomyces αποτελούν τους επικρατέστερους παραγωγούς φαιναζινών (Mentel et al., 2009). Η προδιγιοσίνη (prodigiosin, 2-methyl-3-pentyl-6-methoxyprodigiosin) είναι ένα αλκαλοειδές, προϊόν του δευτερογενούς μεταβολισμού κάποιων βακτηρίων το οποίο απομονώνεται από διάφορα είδη των γενών Serratia, Pseudomonas και Streptomyces. Παρουσιάζει μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον λόγω των αντιμικροβιακών, ανοσοκατασταλτικών και αντικαρκινικών ιδιοτήτων της (D Alessio et al., 2000; Càmpas et al., 2003; Williamson et al., 2005). Οι αντιμικροβιακές ιδιότητες των ενώσεων αυτών παρουσιάζουν φυτοπαθολογικό ενδιαφέρον καθώς εμφανίζουν κατασταλτική δράση εναντίον κάποιων παθογόνων μυκήτων όπως των Verticillium dahliae, R. solani, Sclerotinia sclerotiorum και Didimella applanata (Kalbe et al., 1996; Duzhak et al., 2012). Πίνακας 1.1 Ενδεικτικά παραδείγματα αντιβιοτικών ενώσεων που παράγονται από παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Αντιβιοτική ένωση Προέλευση Παθογόνο στόχος Ασθένεια Βιβλιογραφική αναφορά 2,4 diacetylphloroglucinol (DAPG) P. fluorescens CHA0 Thielaviopsis basicola, Gaeumannomyces graminis var tritici Μαύρη σήψη ριζών καπνού, Σήψη στελέχους σιταριού P. fluorescens F113 Pythium spp. Τήξη φυταρίων Keel et al., 1992 Shanahan et al.,

33 2,3-de-epoxy-2,3- didehydro-rhizoxin (DDR) Bacillomycin D Xanthobaccin Α Gliotoxin Herbicolin Mycosubtilin Phenazines Pyrrolnitrin P. fluorescens Q8r1-96 P. borealis MA342 Bacillus subtilis AU195 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 Lysobacter sp. strain SB K88 Stenotrophomonas sp. (πρώην Xanthomonas sp.) SB-K88 Gaeumannomyces graminis var tritici Pyrenophora teres, Tilletia caries Aspergillus flavus Fusarium oxysporum Aphanomyces cochlioides Σήψη στελέχους σιταριού Μόλυνση από αφλατοξίνες Αδρομύκωση Τήξη φυταρίων P. ultimum Τήξη φυταρίων Trichoderma virens R. solani Σήψη ριζών Pantoea agglomerans C9-1 B. subtilis BBG100 P. fluorescens 2-79 και P. chlororaphis PCL1391 Erwinia amylovora Pythium aphanidermatum Gaeumannomyces graminis var. tritici Fusarium oxysporum f. sp. radicis - lycopersici P. aureofaciens PGS12 Fusarium oxysporum Burkholderia cepacia Serratia spp. Prodigiosin S. plymuthica, S. rubidaea Pyoluteorin Kanosamine Zwittermycin A R. solani και Pyricularia oryzae V. dahliae, R. solani, S. sclerotiorum V. dahliae, R. solani, S. sclerotiorum S. marcescens B2 Botrytis cinerea S. marcescens Didimella applanata P. fluorescens Pf-5 P. fluorescens CHA0 Bacillus cereus UW85 B. cereus UW85 P. ultimatum, R. solani T. basicola, P. ultimum Phytophthora medicaginis P. medicaginis και P. aphanidermatum Βακτηριακό κάψιμο Τήξη φυταρίων Λευκοί στάχεις σιταριού Σήψη λαιμού και ριζών Τήξη φυταρίων και σήψη ρυζιού Τήξεις ελαιοκράμβης Τήξεις ελαιοκράμβης Τεφρά σήψη κυκλάμινου Σήψη στελεχών του βατόμουρου Τήξεις φυταρίων Μαύρη σήψη ριζών καπνού, Τήξεις φυταρίων Τήξη φυταρίων Τήξη φυταρίων Raaijmakers and Weller 2001 Hökeberg et al., 1998 Moyne et al., 2001 Koumoutsi et al., 2004 Islam et al., 2005 Nakayama et al., 1999 Wilhite et al., 2001 Sandra et al., 2001 Leclere et al., 2005 Thomashow et al., 1990 Chin A Woeng et al., 1998 Georgakopoulo s et al., 1994 Homma et al., 1989 Kalbe et al., 1996 Kalbe et al., 1996 Someya et al., 2001 Duzhak et al., 2012 Howell and Stipanovic, 1980 Keel et al., 1992 Milner et al., 1996 Silo-Suh et al., 1994 Η ταυτοποίηση των εν λόγω ουσιών γίνεται αφού αυτές απομονωθούν και καθαριστούν χημικά με TLC και HPLC. Συνήθως παραλαμβάνονται από υγρές καλλιέργειες των βακτηριακών στελεχών, οι οποίες διηθούνται ώστε να απομακρυνθούν τα βακτηριακά κύτταρα και στη συνέχεια διαχωρίζονται οι επιμέρους ουσίες με τη χρήση χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας, (Thin Layer Chromatography, TLC), αρχικά και υγρής 27

34 χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) στη συνέχεια. Συχνά ο διαχωρισμός γίνεται και μέσω της εκχύλισης στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction) ή Υγρής Χρωματογραφίας/ Φασματομετρίας Μαζών (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry, LC/MS). Στη συνέχεια οι ενώσεις ταυτοποιούνται με τη χρήση τεχνικών όπως η φασματομετρία μαζών (Mass Spectrometry, MS) και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) Ανταγωνισμός Ως μικροβιακός ανταγωνισμός ορίζεται εκείνος κατά τον οποίο οι μικροοργανισμοί που αλληλεπιδρούν μοιράζονται την ίδια οικοφωλέα ή οικοθέση (niche) (Alabouvette et al., 2006). Όπως προαναφέρθηκε, οι πιο επιτυχημένοι παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης είναι αυτοί που καταφέρνουν να αποικίσουν γρήγορα και αποτελεσματικά τη ρίζα, καταναλώνοντας ταχύτατα τα διαθέσιμα θρεπτικά στοιχεία τα οποία δεν είναι πλέον διαθέσιμα για τους φυτοπαθογόνους μικροργανισμούς οι οποίοι, κατά συνέπεια, δεν μπορούν να αναπτυχθούν. Αξίζει να τονιστεί λοιπόν και πάλι η σημασία της ικανότητας ταχύτατου και αποτελεσματικού αποικισμού που μπορεί να έχουν κάποια ριζοβακτήρια, καθώς ο ανταγωνισμός μεταξύ αυτών και κάποιου παθογόνου, αφορά τόσο την κατάληψη διαθέσιμου χώρου, όσο και τη διαθεσιμότητα σε ανόργανα στοιχεία. Ιδιαίτερη σημασία κατέχει ο ανταγωνισμός για τις πηγές άνθρακα καθώς αποτελεί βασικό και απαραίτητο στοιχείο για τη βλάστηση των σπορίων του εκάστοτε παθογόνου και ως εκ τούτου μειώνεται η μολυσματικότητά του (Alabouvette et al., 2006). Το είδος του ανταγωνισμού για θρεπτικά μικροστοιχεία που έχει μελετηθεί περισσότερο είναι αυτό που σχετίζεται με τον σίδηρο. Καθώς πρόκειται για εξαιρετικά σπάνιο αλλά ουσιώδες μικροστοιχείο, οι μικροοργανισμοί και τα φυτά, απαντούν με διάφορους μηχανισμούς για να αυξήσουν τη βιοδιαθεσιμότητά του. Αφενός, η στρατηγική Ι των δικοτυλήδονων φυτών χρησιμοποιεί ρεδουκτάσες και εξάγει πρωτόνια ώστε να οξινίσει την περιοχή της ριζόσφαιρας (Crowley, 2006). Έτσι εμποδίζονται οι οξειδοαναγωγικές διεργασίες στο έδαφος και αυξάνεται η διαλυτότητα του ανόργανου σιδήρου. Αφετέρου, οι μικροοργανισμοί και τα μονοκοτυλήδονα φυτά υιοθετούν τη στρατηγική ΙΙ και βασίζονται σε οργανικά μόρια για να αυξήσουν τη διαλυτότητα και τη βιοδιαθεσιμότητα του σιδήρου εκκρίνοντας βιογενή μόρια υψηλής συγγένειας με το σίδηρο, τα οποία σχηματίζουν πολύ σταθερά σύμπλοκα με αυτόν (χηλικές ενώσεις) και καλούνται σιδηροφόροι (Neilands, 1957; Neilands, 1995; Crowley, 2006). Ο σχηματισμός των σιδηροφόρων προάγεται σε συνθήκες περιορισμένης διαθεσιμότητας σιδήρου και η διαδικασία πρόσληψης αυτού διέρχεται από τα εξής στάδια (Boukhalfa & Crumbliss, 2002): - Ενδοκυτταρική βιοσύνθεση των σιδηροφόρων - Εξαγωγή των σιδηροφόρων στον εξωκυττάριο χώρο - Κινητοποίηση του σιδήρου λόγω σχηματισμού ανταγωνιστικών προς τα ορυκτά, συμπλόκων σιδήρου - Αναγνώριση και πρόσληψη των σιδηροφορικών συμπλόκων από το σύστημα μεταφοράς του εκάστοτε οργανισμού ή αποδέσμευση του σιδήρου από το σύμπλοκο πρόσληψής του 28

35 Μέσω αυτών, τα βακτήρια ανταγωνιστές αποκτούν ένα διατροφικό πλεονέκτημα, αποικίζουν πολύ αποτελεσματικά τη ριζόσφαιρα και ταυτόχρονα αποκλείουν την εγκατάσταση παθογόνων μικροοργανισμών. Η ανταγωνιστική ικανότητα κάθε μικροοργανισμού για σίδηρο βασίζεται στην ικανότητα των μορίων των σιδηροφόρων του να αντιστέκονται στην αποδόμηση, στην πιθανότητα να μπορεί να χρησιμοποιήσει σιδηροφόρους άλλων οργανισμών και στην εξειδίκευση του συστήματος μεταφοράς που διαθέτει για την απόκτηση του σιδήρου. Ο σημαντικότερος παράγοντας όμως είναι η χημική συγγένεια του κάθε σιδηροφόρου με το ίδιο το στοιχείο καθώς αυτή θα καθορίσει με ποιο κέντρο θα συνδεθεί ισχυρότερα ο σίδηρος και άρα, ποιος οργανισμός θα τον παραλάβει τελικά (Bouthalfa & Crumbliss, 2002). Οι σιδηροφόροι αποσπούν προσροφημένο Fe +3 και έχουν εξειδικευμένη συγγένεια με το σίδηρο (ο οποίος αποδεσμεύεται δύσκολα) και όχι με άλλα μεταλλικά ιόντα όπως για παράδειγμα το Al +3 ή το Ca +3, τα οποία βρίσκονται στο εδαφικό διάλυμα σε πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση. Η προτίμηση αυτή των σιδηροφόρων εξηγείται μέσω της σταθεράς Κ. Το σύμπλοκο του Fe +3 με τον τριυδροξαμικό (trihydroxamate) σιδηροφόρο δεσφερριοζαμίνη Β (DFO B), έχει κατά πολύ μεγαλύτερη σταθερά προσρόφησης συγκριτικά με τις αντίστοιχες σταθερές Κ των Al +3 και Ca +2 και άρα είναι πολύ σταθερό (Farkas et al., 2004). Η παραγωγή σιδηροφόρων έχει μελετηθει κυρίως σε PGPR του γένους Pseudomonas spp. (Duijff et al., 1993; Georges & Meyer, 1995; Sayyed et al., 2004), αλλά σιδηροφόροι εντοπίζονται σε άλλα γένη όπως τα Bacillus spp. (Wilson et al., 2006) και Serratia spp. (Seyedsayamdost et al., 2012). Έντονος ανταγωνισμός, λόγω των μεγάλων πληθυσμών ωφέλιμων μικροοργανισμών παρατηρείται στα λεγόμενα κατασταλτικά εδάφη (suppressive soils) (Baker & Cook, 1974). Τέτοια εδάφη έχουν καταγραφεί σε διάφορες περιοχές του κόσμου, για παράδειγμα στην Καλιφόρνια των Η.Π.Α. (Salinas Valley), στη Γαλλία (Chateaurenard, Cavaillon), στα Κανάρια Νησιά, στην Ελβετία (Broye Valley), κ.α. Ως κατασταλτικά εδάφη οι Baker και Cook (1974) ορίζουν τα εδάφη εκείνα στα οποία η ανάπτυξη μιας ασθένειας καταστέλλεται ακόμα και αν το παθογόνο εισαχθεί παρουσία ευαίσθητου ξενιστή. Ένας ακόμη ορισμός των Baker και Cook εξηγεί ότι η ασθένεια δεν εξαφανίζεται, αλλά προκαλεί μικρή ή αμελητέα προσβολή, αν και το παθογόνο εντοπίζεται στο έδαφος. Δύο γνωστοί τύποι καταστολής αναφέρονται στη βιβλιογραφία, ο γενικός και ο ειδικός τύπος. Ο πρώτος προκύπτει από τη δράση του συνόλου της μικροβιακής κοινότητας και αποτελεί χαρακτηριστικό του εκάστοτε εδάφους και, άρα δεν μπορεί να μεταφερθεί μεταξύ εδαφών. Ο δεύτερος οφείλεται στην επίδραση μεμονωμένων μικροοργανισμών ή ομάδων αυτών και η δράση μπορεί να μεταφερθεί από το ένα έδαφος σε άλλο (Weller et al., 2002). Έχουν αναφερθεί κατασταλτικά εδάφη για διάφορους σημαντικούς φυτοπαθογόνους μύκητες, όπως είναι οι G. graminis var. tritici, F. oxysporum, Aphanomyces euteiches, T. basicola και R. solani αλλά και για ωομύκητες, όπως οι Phytophthora cinnamomi, P. infestans, Pythium splendens, και P. ultimum (Weller et al., 2002). Τέλος, ας σημειωθεί ότι ο ανταγωνισμός για κατάληψη οικοθέσεων στη ριζόσφαιρα, αποτελεί το έναυσμα για την ενεργοποίηση ενός άλλου μηχανισμού έμμεσου ανταγωνισμού, κατά τον οποίο ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης δεν επιδρά άμεσα στο παθογόνο αλλά επιδρά στον ξενιστή και στη ριζόσφαιρα και συνδυάζεται και με επαγωγή αντοχής. 29

36 Επαγωγή διασυστηματικής αντοχής Η επαγωγή των μηχανισμών αντοχής ενός ξενιστή μπορεί να ενεργοποιείται από τη συσσώρευση σαλικυλικού οξέος, να σημαίνει την παραγωγή πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παθογένεση (Pathogenesis Related proteins, PR proteins) και να καλείται επίκτητη διασυστηματική αντοχή (Systemic Acquired Resistance, SAR) (van Loon et al., 1998). Μια άλλη περίπτωση είναι αυτή της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής (Induced Systemic Resistance, ISR) κατά την έκφραση της οποίας πρωταγωνιστούν το ιασμονικό οξύ (jasmonic acid, JA) και το αιθυλένιο (ethylene, ETH) (van Loon et al., 1998). Οι δύο αυτές μορφές αντοχής μπορούν να προκληθούν από διεγέρτες που ανήκουν σε ριζοβακτήρια όπως είναι, οι σιδηροφόροι και κάποιοι λιπο-πολυσακχαρίτες (lipopolysaccharides, LPS), ή από συσσώρευση σαλικυλικού οξέος (van Loon et al., 1998). Αυτοί οι μηχανισμοί προσδίδουν στο φυτό μια ενισχυμένη ικανότητα άμυνας και έτσι ο ρυθμός ανάπτυξης της ασθένειας μειώνεται, με αποτέλεσμα να βλέπουμε λιγότερα ασθενή φυτά ή φυτά με μειωμένη ένταση ασθένειας, σε σχέση με αυτά στα οποία δεν έχουν ενεργοποιηθεί οι παραπάνω μηχανισμοί (van Loon, 2007). Εδώ αξίζει να σημειωθεί ότι στις βιβλιογραφικές αναφορές υπάρχει σύγχυση στη χρήση και τη διάκριση της επίκτητης διασυστηματικής αντοχής (Systemic Acquired Resistance, SAR) και της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής (Induced Systemic Resistance, ISR). Οι De Vleesschauwer και Höfte (2009) περιγράφουν εύστοχα την ISR ως την αντοχή που επάγεται από μη παθογόνα ριζοβακτήρια και παρατηρούν πως αυτός ο ορισμός δε λαμβάνει υπόψη το μονοπάτι που τη σηματοδοτεί. Είναι σημαντικό να τονιστεί πως εφόσον ως SAR θεωρείται εκείνος ο τύπος της αντοχής που ενεργοποιείται από τη συσσώρευση σαλικυλικού οξέος (salicylic acid, SA) σε μια εντοπισμένη προσβολή, η ενεργοποίηση αυτής της αντοχής μπορεί ενδεχομένως να προκληθεί και από κάποια ριζοβακτήρια (De Vleesschauwer & Höfte, 2009; Beneduzi et al., 2012), από τη στιγμή που η παρουσία τους επάγει τη συσσώρευση SA. Η αμυντική απόκριση των φυτών κατά των φυτοπαθογόνων ή άλλων οργανισμών, περιγράφεται με πολύ παραστατικό τρόπο στο μοντέλο ζικ-ζακ των Jones και Dangl (2006). Εκεί περιγράφονται οι 2 βασικές αποκρίσεις των φυτών σε μια επίθεση: η ανοσία που ενεργοποιείται από μοριακό μοτίβο που σχετίζεται με το παθογόνο ή με τους ωφέλιμους μικροοργανισμούς [pathogen-associated molecular pattern (PAMP)-triggered immunity (PTI) ή microbial-associated molecular patterns, (MAMP)-triggered immunity (MTI)] και η ανοσία που ενεργοποιείται από έναν τελεστή [(effector-trigged immunity, ETI)]. Η MTI ενεργοποιείται όταν αναγνωρίζονται διεγέρτες (Εικόνα 1.1), δηλαδή μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με την προσβολή από παθογόνα (PAMP), από ωφέλιμους μικροοργανισμούς (microbial-associated molecular patterns, MAMP) και από καταστροφή ιστών (damage-associated molecular patterns, DAMP). Στους μύκητες οι διεγέρτες που ενεργοποιούν τους υποδοχείς, οι οποίοι βρίσκονται πάνω στην κυτταρική μεμβράνη του ξενιστή, και πυροδοτούν την προαναφερθείσα απόκριση, είναι οι εξής: ξυλανάσες, β- γλουκάνες, χιτίνη και εργοστερόλη (Nürnberger et al. 2004). Σε αντίθεση, η ΕΤΙ ενεργοποιείται από υποδοχείς εντός του κυττάρου οι οποίοι εντοπίζουν μόρια-τελεστές του παθογόνου. Η ΕΤΙ είναι πιο δυνατή και πιο γρήγορη απόκριση, αν και η ενεργοποίηση και των δύο ειδών αντοχής είναι απαραίτητη ώστε να υπάρξει μια ολοκληρωμένη τοπική ή διασυστηματική απόκριση (Jones & Dangl, 2006). Όπως προαναφέρθηκε, κάποια από τα σήματα που παράγονται κατά την άμυνα είναι το σαλικυλικό οξύ (salicylic acid, SA), 30

37 το ιασμονικό οξύ (jasmonic acid, JA) και το αιθυλένιο (ethylene, ETH). Αυτές οι φυτοορμόνες ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων άμυνας και είναι πιθανό το έναυσμα για την παραγωγή τους να δοθεί από ωφέλιμους μικροοργανισμούς/ανταγωνιστές (Hase et al., 2008; Bari & Jones, 2009; Salas-Marina et al., 2011; Kojima et al., 2013). Όπως προαναφέρθηκε και οι δύο αυτές μορφές αντοχής μπορούν να προκληθούν από διεγέρτες που προέρχονται από ριζοβακτήρια, όπως είναι οι σιδηροφόροι και οι λιπο-πολυσακχαρίτες (lipopolysaccharides, LPs) της εξωτερικής τους μεμβράνης (van Loon et al., 1998; Hase et al., 2008; Salas-Marina et al., 2011; Kojima et al., 2013) (Εικόνα 1.1). Επιπλέον, αντιβιοτικά της ομάδας των φαιναζινών, που παράγονται από τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης, είναι γνωστό ότι διεγείρουν διασυστηματική αντοχή σε ξενιστές όπως το ρύζι και η φασολιά (Ma et al., 2016). Μετά τη συσσώρευση σαλικυλικού οξέος (SA) στους ιστούς του ξενιστή, αυτό αλληλοεπιδρά με τον ρυθμιστή μεταγραφής του γονιδίου npr1 που πυροδοτεί την έκφραση γονιδίων αντοχής (PR1). Το φυτό βρίσκεται τότε σε κατάσταση διεγερμένης αντοχής και αυτό σημαίνει ότι εκτός από τη συσσώρευση των μορίων σημάτων, όπως είναι το σαλικυλικό οξύ, παρατηρείται οξειδωτική έκρηξη δηλαδή συσσώρευση δραστικών μορίων οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) αλλά και φωσφορυλίωση πρωτεϊνών (van Loon et al., 2000). Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα δύο αυτά μονοπάτια μεταφοράς σημάτων (SA και JA/ETH), αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Κάποιες φορές σημειώνεται ανταγωνισμός μεταξύ τους και κάποιες φορές συνεργισμός (van Wees et al., 2000; De Vos et al., 2005; Mur et al., 2006). Παρόλα αυτά πολλά είναι ακόμα άγνωστα σε σχέση με αυτήν την αλληλεπίδραση και δεδομένα προστίθενται συνεχώς. Για παράδειγμα, πρόσφατα αποδείχθηκε και η επίδραση των ρυθμιστών ανάπτυξης όπως είναι οι αυξίνες, οι γιββεριλίνες (gibberellin, GA) και το αμπσισικό οξύ (abscisic acid, ABA) στην έκφραση αυτών των γονιδίων (Bari & Jones 2009; Pieterse et al., 2012). Εικόνα 1.1. Αλλαγές στην αμυντική απόκριση του φυτών κατά τη διάρκεια αλληλεπιδράσεων με μη συμβιωτικά PGPR (Ριζοβακτήρια που προάγουν την αύξηση των φυτών, Plant Growth Promoting Rhizobacteria) και PGPF (Μύκητες που προάγουν την αύξηση των φυτών, Plant Growth Promoting Fungi). A: Οι ριζικές εκκρίσεις προσελκύουν τα PGPR και PGPF και τα προετοιμάζουν για αλληλεπιδράσεις. Τα φυτά ξενιστές αρχικά αναγνωρίζουν τα PGPR και PGPF ως πιθανούς εισβολείς και οι υποδοχείς αναγνωρίζουν διεγέρτες μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με ωφέλιμους μικροοργανισμούς (microbial-associated molecular patterns, MAMPs), βλέπε κίτρινα σχήματα στην εικόνα. Ως εκ τούτου, ξεκινά μια αλληλουχία σημάτων η οποία έχει ως αποτέλεσμα την ανοσία 31

38 που ενεργοποιείται από τα MAMP (MAMP-triggered immunity, MTI). B: Το PGPR Pseudomonas fluorescens WCS417 καταστέλλει την απόκριση MTI μέσω αποπλαστικής έκκρισης ενός ή περισσότερων μορίων-τελεστών. Ο τρόπος δράσης αυτών των μορίων-τελεστών παραμένει άγνωστος αλλά τα μόρια που εκκρίνονται από το σύστημα ΙΙΙ του P. fluorescens και άλλων PGPR συμβάλλουν αλλά όχι καθοριστικά στην καταστολή της MTI. Κάποιοι τελεστές τύπου III πιθανώς αναγνωρίζονται από τις πρωτεΐνες αντοχής του ξενιστή (R), οι οποίες με τη σειρά τους ενδεχομένως επηρεάζουν τη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας στη ριζόσφαιρα (Zamioudis & Pieterse, 2012) Συνδυασμός μηχανισμών δράσης παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Όπως προαναφέρθηκε, για να υπάρχει επιτυχημένη και σταθερή βιολογική καταπολέμηση, είναι προτιμότερο οι μηχανισμοί δράσης να συνδυάζονται από τον παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης (Πίνακας 1.2). Έτσι, μπορεί ένας αποτελεσματικός παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης να αντιμετωπίζει διάφορες ασθένειες σε έναν ξενιστή ή ένα συγκεκριμένο παθογόνο σε διάφορους ξενιστές (στελέχη Pseudomonas spp ή Trichoderma spp) (Alabouvette et al., 2006), ή να γίνεται συνδυασμένη εφαρμογή παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης. Για να επιτευχθεί αυτό στην πράξη στο ίδιο προϊόν θα πρέπει να συνδυάσουμε παράγοντες βιολογικού ελέγχου με διαφορετικούς τρόπους δράσης ή να συνδυαστούν πολλοί τρόποι δράσης από ένα στέλεχος, μέσω της γενετικής τροποποίησης. Ο συνδυασμός παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης έχει προταθεί στο παρελθόν για τον έλεγχο φουζαριώσεων, όπου το μη παθογόνο στέλεχος Fusarium oxysporum Fo47 συνδυάστηκε με στελέχη του P. fluorescens και παρατηρήθηκε βελτίωση της δράσης του πρώτου (Olivain et al., 2004). Η δεύτερη περίπτωση κατά την οποία συνδυάζονται τρόποι δράσης στον ίδιο παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης μέσω της γενετικής τροποποίησής του έχει επίσης δοκιμαστεί με πολύ καλά αποτελέσματα ακόμα και στον αγρό. Στελέχη P. fluorescens που τροποποιήθηκαν ώστε να παράγουν δύο αντιβιοτικά ταυτόχρονα (φαιναζίνη και φλορογουκινόλη), εμφάνισαν βελτιωμένη αποτελεσματικότητα (Thomashow & Weller, 1996). Πίνακας 1.2. Μηχανισμοί που οδηγούν στη βιολογική καταπολέμηση φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών (παραλλαγή του Πίνακα 1 των Pal & McSpadden Gardener, 2006) Μηχανισμός Υπερπαρασιτισμός Αντιβίωση Λυτικά ένζυμα Προϊόντα μεταβολισμού Ανταγωνισμός για θρεπτικά στοιχεία ή κατάληψη οικοθέσεων Παραδείγματα Χρήση λυτικών ενζύμων 2,4-διακετυλοφλορογλουκινόλη Φαιναζίνες Κυκλικά λιποπεπτίδια Χιτινάσες Γλουκανάσες Πρωτεάσες Αμμωνία Διοξείδιο του άνθρακα Υδροκυάνιο Κατανάλωση ριζικών εκκρίσεων Σιδηροφόροι Κατάληψη οικοφωλέων 32

39 Επαγωγή αντοχής ξενιστή Επαφή με στοιχεία του κυτταρικού τοιχώματος μυκήτων Μοριακά μονοπάτια που σχετίζονται με τα PAMPs Επαγωγή μέσω φυτοορμονών Μηχανισμοί προαγωγής της αύξηση των φυτών από PGPR Τα βακτηριακά γένη που προάγουν την αύξηση των φυτών καλούνται Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) (Kloepper & Schroth, 1978). Τα PGPR μπορούν να προάγουν την αύξηση των φυτών άμεσα, μέσω της δέσμευσης ατμοσφαιρικού αζώτου, της παραγωγής ρυθμιστών ανάπτυξης (ινδολοξικό οξύ, γιββεριλίνες, αμπσισικό οξύ, κυτοκινίνες), της ρύθμισης της παραγωγής αιθυλενίου, της διαλυτοποίησης ανόργανων ουσιών όπως είναι ο φώσφορος, και της πρόσληψης θρεπτικών στοιχείων (Bowen & Rovira, 1999; Vessey, 2003). Επιπλέον τα ριζοβακτήρια αυτά δρουν ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου συνδυάζοντας τους προαναφερθέντες μηχανισμούς άμεσης και έμμεσης δράσης. Πιο συγκεκριμένα, η προαγωγή της αύξησης προκύπτει γιατί τα PGPR μπορεί να παράγουν αντιβιοτικές ουσίες, να ανταγωνίζονται κάποιο παθογόνο για θέσεις αποικισμού και θρεπτικά στοιχεία όπως ο σίδηρος, ή να διεγείρουν την επαγόμενη διασυστηματική αντοχή των φυτών (Induced Systemic Resistance, ISR) και έτσι ο εν λόγω ξενιστής να αναπτύσσεται ταχύτερα (Whipps, 2001). Ακόμα μπορεί να διεγείρουν άλλες ωφέλιμες συμβιώσεις ή να αποδομούν τοξικές ενώσεις σε μολυσμένα εδάφη, προστατεύοντας έτσι τον ξενιστή (Jacobsen, 1997). Συνεπώς, κάποια στελέχη PGPR δρουν ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης και παράλληλα προάγουν την αύξηση των φυτών, όμως αυτό δεν συμβαίνει πάντα. Είναι δυνατόν μερικά PGPR να καταστέλλουν έναν φυτοπαθογόνο μικροοργανισμό χωρίς να υφίσταται άμεσος ανταγωνισμός. Αυτό συμβαίνει όταν η δράση του ριζοβακτηρίου εντοπίζεται στην ταχύτατη προαγωγή της αύξησης του φυτού και στη μετάβαση στο στάδιο ανάπτυξης όπου επέρχεται αντοχή λόγω ηλικίας. Αντίστροφα, είναι επίσης δυνατό να καταστέλλεται η ανάπτυξη μιας ασθένειας αλλά να μην προάγεται η αύξηση των φυτών. Σημαντική διάκριση που έχει προταθεί για τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης και αξίζει να αναφερθεί σε αυτό το σημείο είναι αυτή των ριζοβακτηρίων που προάγουν την αύξηση των φυτών (PGPR) (Kloepper & Schroth, 1978) από τους μικροοργανισμούς που καταπολέμούν τους φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς (BCAs) (Bashan & Holguin, 1997). Όπως προαναφέρθηκε η προαγωγή της αύξηση δεν χαρακτηρίζει όλους τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης. Κάποια στελέχη PGPR είναι δυνατόν όμως να προάγουν τη φυτική αύξηση και ανάπτυξη και παράλληλα να καταπολεμούν μια ασθένεια παράγοντας αντιβιοτικές ουσίες, για παράδειγμα. Οι μηχανισμοί με τους οποίους προάγουν την αύξηση είναι άμεσοι (αύξηση διαλυτότητας φωσφόρου, πρόσληψη σιδήρου, πρόσληψη αζώτου, παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης, ρύθμιση παραγωγής αιθυλενίου) και έμμεσοι. Οι έμμεσοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν όλο το οπλοστάσιο των αμιγώς ανταγωνιστικών στελεχών και είναι αυτοί που συμβάλλουν στην προαγωγή της φυτικής αύξηση προστατεύοντας το φυτό από παθογόνους μικροοργανισμούς. Σε αυτούς ανήκουν η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών (αντιβιοτικά, αντιμυκητιακοί μεταβολίτες), ο υπερπαρασιτισμός, ο ανταγωνισμός για θέσεις αποικισμού και θρεπτικά στοιχεία, και η 33

40 ISR. Παρακάτω θα αναλυθούν οι άμεσοι μηχανισμοί προαγωγής της αύξησης καθώς οι υπόλοιποι έχουν ήδη αναφερθεί. Ο φώσφορος είναι απαραίτητο μακροστοιχείο για την αύξηση των φυτών. Πρόκειται όμως για ένα στοιχείο που βρίσκεται σε αδιάλυτη μορφή και η συγκέντρωση του βιοδιαθέσιμου φωσφόρου είναι πολύ μικρή (1mg kg -1 εδάφους) (Goldstein, 1994). Οι ανόργανες αυτές μορφές φωσφόρου διαλυτοποιούνται από μια ομάδα μικροοργανισμών οι οποίοι εκκρίνουν οργανικά οξέα και φωσφατάσες και μετατρέπουν τα φωσφορικά άλατα ή/και τις χηλικές κατιονικές ενώσεις ιόντων φωσφόρου σε διαλυτές μορφές (Khan et al., 2009; Sarker et al., 2014). Τα βακτήρια που το καταφέρνουν ονομάζονται βακτήρια που διαλυτοποιούν τον φώσφορο (Phosphate Solubilizing Bacteria, PSB) και ανήκουν σε διάφορα γνωστά γένη, με σημαντικότερα τα Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium και Enterobacter spp. (Khan et al., 2009). Όσον αφορά στην πρόσληψη αζώτου, τα πιο μελετημένα γένη, για την ικανότητά τους να δεσμεύουν το άζωτο, ανήκουν στα ριζόβια (Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, και Sinorhizobium) (Vessey, 2003). Πολύ ενδιαφέρον θεωρείται το γεγονός ότι αν και τα PGPR προκαλούν μια εμφανή αύξηση της φυτικής ανάπτυξης, ο μηχανισμός που βρίσκεται πίσω από αυτήν την αύξηση δεν είναι η άμεση παροχή αζώτου στον ξενιστή. Η εξήγηση που δίνεται είναι ότι τα PGPR που επηρεάζουν τη μορφολογία της ρίζας, κυρίως αυξάνοντας την επιφάνειά της, μπορεί να έχουν τεράστια επίδραση στην πρόσληψη του συνόλου των θρεπτικών στοιχείων (Vessey, 2003). Πολλά είδη PGPR έχουν την ικανότητα να παράγουν φυτοορμόνες (phytohormones) οι οποίες δρουν ως ρυθμιστές ανάπτυξης. Πρόκειται για οργανικές ενώσεις, προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού, που δρουν σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Οι φυτοορμόνες επηρεάζουν τη μορφολογία της ρίζας, με αποτέλεσμα να προκύπτουν μεγαλύτερες, πιο διακλαδιζόμενες ρίζες ή/και ρίζες με μεγαλύτερη επιφάνεια (Vessey, 2003). Η πιο γνωστή φυτοορμόνη που παράγεται από τα ριζοβακτήρια σε υψηλές συγκεντρώσεις είναι το ινδολοξικό οξύ (indole-3-acetic acid, IAA). Αυτή σχετίζεται με την έκπτυξη ριζών, και την κυτταρική διαίρεση και επιμήκυνση, όταν η συγκέντρωσή της δεν ξεπερνάει κάποια συγκέντρωση κάθε φορά (Salisbury, 1994; Barazani & Friedman, 1999). Η επιθυμητή συγκέντρωση αυτή ρυθμίζεται από εξωγενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως είναι η διαλυτοποίηση, η έκπλυση και η οξείδωση (Barazani & Friedman, 1999). Τα περισσότερα PGPR συνθέτουν ΙΑΑ το οποίο επιδρά στα φυτά με τρόπο παρόμοιο με αυτόν του εξωγενούς ΙΑΑ. Συνήθως εκπτύσσονται μία ή περισσότερες πρωτογενείς (ή κεντρικές) ρίζες από τις οποίες προκύπτουν οι δευτερογενείς (ή πλάγιες) ρίζες, μέσω διαίρεσης ειδικών κυττάρων του περικυκλίου. Ως τυχαίες ρίζες ορίζονται αυτές που φύονται από οπουδήποτε εκτός του ριζιδίου, όπως από τον ιστό στη βάση του στελέχους ή επί μοσχευμάτων. Ενώ η έκπτυξη πλευρικών και τυχαίων ριζών επάγεται από υψηλές συγκεντρώσεις ΙΑΑ, οι πρωτογενείς ρίζες διεγείρονται από σχετικά χαμηλά επίπεδα ΙΑΑ (μεταξύ 10 9 και Μ) και η ανάπτυξή τους αναστέλλεται σε υψηλά επίπεδα ΙΑΑ (Pilet & Saugy, 1986; Meuwly & Pilet, 1991, Malamy & Benfry, 1997). Μια εξήγηση για αυτό το φαινόμενο είναι ότι οι αυξίνες πιθανόν να προκαλούν τη διέγερση ενζύμων που συμμετέχουν στη βιοσυνθετική διαδικασία του αιθυλενίου (Peck & Kende, 1995) και η παρουσία του αιθυλενίου αναστέλλει την ανάπτυξη των πρωτογενών ριζών (Stepanova et al., 2005; Swarup et al., 2002; 2003; 2007). 34

41 Οι αυξίνες συμμετέχουν επίσης στη μεταφορά σημάτων μεταξύ διαφόρων ριζοβακτηρίων όπως και μεταξύ ριζοβακτηρίων και φυτού (Spaepen et al., 2007). Αυτές σχετίζονται με τη διέγερση της κυτταρικής διαίρεσης, την αυξημένη έκπτυξη φυταρίων (αρτιβλάστου), την επιμήκυνση στελεχών και ριζών και την ενισχυμένη πρόσληψη θρεπτικών στοιχείων από τα φυτά (De Freitas & Germida, 1990; Malamy & Benfry, 1997; Jangu & Sindhu, 2011). Οι κυτοκινίνες (cytokinins) και οι γιββεριλίνες κυρίως το γιββεριλικό οξύ (gibberellins, gibberellic acid, GA) είναι επίσης πολύ σημαντικές φυτοορμόνες οι οποίες σχετίζονται με την κυτταρική διαίρεση και επιμήκυνση (Salisbury, 1994). Στις κυτοκινίνες ανήκει και η ζεατίνη (zeatin) η οποία σχετίζεται με την επιμήκυνση ιστών συγκεκριμένων φυτικών μερών, ενώ το γιββεριλικό οξύ προκαλεί μεγέθυνση των κυττάρων του στελέχους (Salisbury, 1994). Τέλος, τα PGPR μπορούν να επηρεάζουν θετικά τη φυτική αύξηση επιδρώντας στην παραγωγή αμπσισικού οξέος (abscisic acid, ABA), το οποίο είναι υπεύθυνο για την ταχεία αντιμετώπιση παραγόντων καταπόνησης που δρουν δυσμενώς στο φυτό (Jiang & Hartung, 2008) Επικρατέστερα γένη βακτηρίων που δρουν ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas είναι τα πιο γνωστά PGPR και κάποια είδη έχουν δοκιμαστεί ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου κατά των παθογόνων G. graminis f.sp. tritici, R. solani, Erwinia carotovora var. carotovora, P. ultimum και F. oxysporum (Quan et al., 2010). Το γένος Pseudomonas περιέχει 191 αναγνωρισμένα είδη. Είναι ραβδόμορφα, υποχρεωτικά αερόβια, Gram- βακτήρια, με ένα ή περισσότερα μαστίγια, τα οποία τους προσδίδουν ικανότητα κίνησης. Δεν παράγουν σπόρια και ανήκουν στο φύλο των Πρωτεοβακτηρίων και στην οικογένεια Pseudomonadaceae (Garrity et al., 2005). Οι αντιβιοτικές ενώσεις με μυκητοστατική δράση που παράγονται από είδη του γένους Pseudomonas ανήκουν σε έξι κλάσεις ενώσεων: φλορογλουκινόλες, φαιναζίνες, πυολουτεορίνες, πυρρολνιτρίνες, λιποπεπτίδια και υδροκυάνιο (Haas & Keel, 2003). Καταλαβαίνει λοιπόν κανείς εύκολα γιατί οι παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης που ανήκουν στο γένος Pseudomonas, αποτελούν τους πιο μελετημένους μικροοργανισμούς ως προς την ανταγωνιστική τους δράση. Εκτός από το ότι έχουν μεγάλη φαρέτρα με ουσίες που παράγουν, αποικίζουν με ευκολία τη ριζόσφαιρα, απομονώνονται και καλλιεργούνται εύκολα, τροποποιούνται γενετικά με σχετικά απλά πρωτόκολλα και αξιοποιούν ένα μεγάλο μέρος οργανικών στοιχείων, γεγονός που τα καθιστά κατάλληλο στόχο πειραματισμού με σπουδαίες προοπτικές χρήσης στην πράξη (Whipps, 2001). Στη σύγχρονη βιβλιογραφία συναντά κανείς πληθώρα εργασιών που εξηγούν τη δράση των βακτηρίων αυτών μέσω του άμεσου ή έμμεσου ανταγωνισμού και αποκλεισμού άλλων παθογόνων (Πίνακας 1.2). Οι ψευδομονάδες διακρίνονται σε φθορίζουσες ή μη φθορίζουσες, ανάλογα με το αν παράγουν χρωστικές οι οποίες φθορίζουν στο υπεριώδες φως (254 nm). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι όσο πιο σπάνιο είναι το στοιχείο του τρισθενούς σιδήρου, τόσο πιο έντονη είναι η παραγωγή των προαναφερθεισών χρωστικών, οι οποίες στις περισσότερες περιπτώσεις δρουν και ως 35

42 σιδηροφόροι (Neilands, 1995). Τα είδη του γένους Pseudomonas παράγουν και άλλους μεταβολίτες όπως ένζυμα, αντιβιοτικά, υδροκυάνιο, οι οποίες έχουν αντιμικροβιακή δράση (Weller, 1988; Haas & Défago, 2005). Η έρευνα τα τελευταία χρόνια έχει στραφεί κυρίως στην ικανότητα των βακτηρίων αυτών να παράγουν αντιβιοτικές ενώσεις και πιο συγκεκριμένα στις βιοχημικές οδούς παραγωγής αυτών, αλλά και στα γονίδια που τις ελέγχουν. Οι ενώσεις αυτές ακόμα και σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις καταστέλλουν την ανάπτυξη των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών και έτσι παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον για την επιστημονική κοινότητα κυρίως λόγω της εν δυνάμει έκφρασής τους από το ίδιο το φυτό (in planta) μελλοντικά. Η ποιότητα και η ποσότητα των διαθέσιμων θρεπτικών μικροστοιχείων συμπεριλαμβανομένου του σιδήρου, οι πηγές αζώτου και άνθρακα και οι περιβαλλοντικές συνθήκες (θερμοκρασία, υγρασία, οξυγόνο), είναι σημαντικοί παράγοντες που καθορίζουν το μέγεθος του βακτηριακού πληθυσμού και τη μεταβολική δραστηριότητα και κατ επέκταση επηρεάζουν την παραγωγή των αντιβιοτικών ενώσεων (Thomashow et al., 1997). Έτσι, τα στελέχη CHA0 και Pf5 του P. fluorescens είναι γνωστά εδώ και αρκετά χρόνια για την παραγωγή πολλών αντιβιοτικών ουσιών με διαφορετικές αλλά και επικαλυπτόμενες δράσεις κατά συγκεκριμένων φυτοπαθογόνων μυκήτων (Keel et al., 1996; Bender et al., 1999; Raiijmakers et al., 2002). Παραδείγματα επιτυχημένης ανταγωνιστικής δράσης των ειδών του γένους αυτού υπάρχουν πολλά. Μία πολύ γνωστή αντιβιοτική ένωση που παράγεται από στελέχη του είδους P. fluorescens, είναι η 2,4-διακετυλοφλορογλουκινόλη (2,4-DAPG). Αυτή αναστέλλει τη δράση αρκετών μυκήτων και βακτηρίων και η σημασία της στη βιολογική καταπολέμηση έχει αποδειχθεί (Bonsall et al., 1997; Raaijmakers and Weller, 1998; Bangera and Thomashow, 1999; Raaijmakers et al., 1999; Novinscak et al., 2016; Paulin et al., 2017). Το στέλεχος P. fluorescens 2-79 (NRRL B-15132) καταστέλλει τη σήψη στελέχους των σιτηρών (Take all decline) που προκαλείται από τον G. graminis f.sp. tritici (Thomashow και Weller, 1988). Το P. fluorescens Pf-5 παρεμποδίζει την ανάπτυξη του μύκητα Pyrenophora tritici repentis που προκαλεί μία ελμινθοσπορίαση (tan spot) στο σιτάρι παράγοντας πυρρολνιτρίνη (pyrrolnitrin). Το εν λόγω βακτήριο καταστέλλει την παραγωγή ασκοσπορίων του μύκητα τα οποία αποτελούν το πρωτογενές μόλυσμα στον αγρό (Pfender et al., 1993). Το ίδιο στέλεχος δρα προστατευτικά σε φυτάρια βαμβακιού μειώνοντας τις τήξεις από P. ultimum σε μεγάλα ποσοστά, παράγοντας την αντιβιοτική ένωση πυολουτεορίνη (pyoluteorin) (Howell and Stipanovic, 1980), ενώ το P. fluorescens F113 καταστέλλει το ίδιο παθογόνο με την παραγωγή της 2,4- διακετυλοφλορογλουκινόλης (2,4-DAPG) (Shanahan et al., 1992). Το P. fluorescens CHAO το οποίο απομονώθηκε από κατασταλτικό έδαφος από την περιοχή Payerne της Ελβετίας, καταστέλλει τη μαύρη σήψη της ρίζας του καπνού που προκαλείται από τον μύκητα T. basicola, λόγω της δράσης του υδροκυανίου που παράγει (Voisard et al., 1989). Το βακτήριο P. chlororaphis MA 342 σε πειράματα in vitro και in planta, σε ελεγχόμενες συνθήκες αλλά και στον αγρό, μείωσε σημαντικά την ένταση των ασθενειών που προκαλούν οι μύκητες Drechslera teres, Microdochium nivale και Tilletia caries, σε σημείο τα αποτελέσματα να μη διαφοροποιούνται από την επέμβαση με χημικά μέσα (Hökeberg et al., 1998). Το στέλεχος P. chlororaphis PCL1391, τόσο μόνο του, όσο και σε συνδυασμό με το P. fluorescens WCS365, προκαλεί αναστολή του F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε φυτά τομάτας (Dekkers et al., 2000), του Colletotrichum lindemuthianum 36

43 σε φυτά φασολιάς (Bardas et al., 2009) και του F. oxysporum f. sp. niveum σε φυτά καρπουζιάς (Tziros et al., 2007). Το P. chlororaphis παράγει το αντιβιοτικό καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (PCN) και ταυτόχρονα φαίνεται ότι ενισχύει την αντοχή των φυτικών οργανισμών, εξαιτίας της πρόκλησης ΙSR (Chin A Woeng et al., 1998; Chin A Woeng et al., 2000) Τα βακτήρια του γένους Serratia ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Τα μέλη του γένους Serratia διαφοροποιούνται από τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας Enterobacteriaceae λόγω της ικανότητάς τους να παράγουν τρία ένζυμα: τη DNAση (DNAse), τη λιπάση (lipase) και τη τζελατινάση (gelatinase) (Brenner et al., 2005). Τα βακτήρια του γένους Serratia είναι ραβδόμορφα Gram-, προαιρετικά αναερόβια και τα περισσότερα μέλη του γένους παράγουν μία χρωστική ουσία, την προδιγιοσίνη (prodigiosin). Πρόκειται για μια χαρακτηριστική κόκκινη ουσία τριπυρρολικής δομής (2- μεθυλ-3-πεντυλ-6-μεθοξυπροδιγιοσίνη,2-methyl-3-pentyl-6-methoxyprodigiosin) που είναι γνωστή για τις αντιμικροβιακές, ανοσοκατασταλτικές και αντικαρκινικές της ιδιότητες (Williamson et al., 2005). Τα είδη του γένους αυτού δεν είναι ιδιαίτερα γνωστά για τη φυτοπροστατευτική δράση τους, αλλά έχουν γίνει πολλές μελέτες για να προσδιοριστεί το κατά πόσο είναι ικανοί βιολογικοί παράγοντες. Τέσσερα είδη φαίνεται να ξεχωρίζουν ως προς αυτήν την ικανότητα, τα S. plymuthica, S. liquefaciens, S. marcescens και S. rubidaea. Το πιο μελετημένο μέλος του γένους είναι το S. marcescens το οποίο αναφέρεται ως δραστικός παράγοντας βιολογικού ελέγχου εδώ και αρκετά χρόνια (Ordentlich et al., 1988). Στελέχη του S. marcescens βρέθηκαν να είναι αποτελεσματικά κατά των μυκήτων Sclerotium rolfsii και R. solani σε φυτά φασολιάς, προκαλώντας μείωση της ασθένειας κατά 75% και 50%, αντίστοιχα και προκαλώντας αναστολή της ανάπτυξης του S. rolfsii κατά 36%. Στο ίδιο άρθρο (Ordentlich et al., 1988), δημοσιεύονται ενθαρρυντικά αποτελέσματα και μετά την εφαρμογή των στελεχών στο θερμοκήπιο. Τα βακτήρια του γένους Serratia οφείλουν τη δράση τους κυρίως στο πλήθος των ενζύμων που παράγουν (χιτινάσες, πρωτεάσες), αλλά και στην παραγωγή σιδηροφόρων και αντιβιοτικών (pyrrolnitrin, prodigiosin). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η μελέτη της δράσης των αντιβιοτικών ουσιών κόκκινου χρώματος που δρουν κατά του ωομύκητα Phytophthora capsici σε φυτά Salvia splendens (Okamoto et al., 1998). Ένα άλλο βακτήριο του γένους Serratia το οποίο παράγει προδιγιοσίνη, πρωτεάσες και σιδηροφόρους είναι το S. rubidaea και στελέχη του έχουν αναφερθεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη φυτοπαθογόνων μυκήτων in vitro και in planta (Kalbe et al., 1996; Kamou et al., 2015; Kamou et al., 2016). Αξιοσημείωτο είναι το ότι τα είδη S. marcescens και S. rubidaea είναι περιστασιακά παθογόνα του ανθρώπου (Mahlen, 2011). Τα υγιή άτομα δεν κινδυνεύουν να προσβληθούν, καθώς η μόλυνση του αναπνευστικού συστήματος και οι λοιμώξεις εκδηλώνονται σε άτομα με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα. Το βακτήριο S. marcescens είναι το μόνο γνωστό νοσοκομειακό παθογόνο του γένους Serratia αλλά έχουν βρεθεί σε κλινικά δείγματα και τα S. liquefaciens και S. rubidaea (Mahlen, 2011). Είναι σημαντικό, ωστόσο, να τονιστεί το ότι το είδος S. rubidaea απουσιάζει από την 37

44 ευρωπαϊκή οδηγία 2000/54/EC η οποία περιλαμβάνει τους δυνητικά επικίνδυνους μικροοργανισμούς για τον χρήστη Τα βακτήρια του γένους Bacillus ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Στο γένος Bacillus ανήκουν Gram+ ραβδόμορφα βακτήρια, τα οποία είναι προαιρετικά ή υποχρεωτικά αερόβια. Σε συνθήκες καταπόνησης παράγουν ενδοσπόρια, με τα οποία επιβιώνουν για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Ως ενδοσπόρια ορίζονται οι ανθεκτικές και προσωρινά μη αναπαραγωγικές κατασκευές που παράγουν τα βακτήρια του φύλου Firmicutes. Αν και χρησιμοποιείται ο όρος σπόριο, δεν πρόκειται για πραγματικό όργανο αναπαραγωγής αλλά για μια διαφοροποιημένη δομή του κυττάρου, που επιτρέπει στα βακτήρια να είναι σε λήθαργο, ώστε να ξεπεραστούν αντίξοες συνθήκες (Vos et al., 2011). Τα είδη του γένους αυτού παράγουν πολλά αντιβιοτικά καθώς και ένζυμα, όπως χιτινάσες, κυτταρινάσες, αμυλάσες, γλουκανάσες, κ.α. που λύουν τα κυτταρικά τοιχώματα παθογόνων. Τα αντιβιοτικά που παράγουν τα μέλη του γένους Bacillus είναι πολυπεπτίδια, τα οποία είναι γνωστά για τη σταθερή δομή τους και τη δράση τους εναντίον άλλων Gram+ και Gram- βακτηρίων αλλά και μυκηλιακών μυκήτων. Τα πεπτίδια αυτά χωρίζονται σε τρεις ομάδες, τα κυκλικά λιποπεπτίδια (cyclic lipopeptides, CLP), τα φωσφο ολιγοπεπτίδια (phospho oligopeptides) και τα διπεπτίδια (dipeptides) (Ongena & Jacques, 2007). Κυκλικά λιποπεπτίδια είναι και οι ιτουρίνες (iturins) και φενγκισίνες (fengicines) οι οποίες παρουσιάζουν ισχυρή αντιμυκητιακή δράση και αναστέλλουν πολλά παθογόνα (Hsieh et al., 2008). Οι βιβλιογραφικές αναφορές για έρευνα, που σχετίζεται με τη δράση των βακτηρίων του γένους Bacillus είναι πολυάριθμες και με την πάροδο των ετών ολοένα και αυξάνονται. Ο καλύτερος βιολογικός παράγοντας του γένους που, ωστόσο, αναφέρεται σε διαφορετικό πεδίο δράσης, αποτελεί και την πρώτη επιτυχημένη προσπάθεια σύνθεσης βιοεντομοκτόνου, είναι το βακτήριο B. thurigiensis (Bt). Αποτελεί την πρώτη ύλη για το 90% των εμπορεύσιμων βιοεντομοκτόνων και εκπροσωπεί μια πολύ μεγάλη αγορά. Στο γένος Bacillus ανήκουν και άλλα πολλά σημαντικά είδη, αναγνωρισμένα για τη δράση τους, όπως τα B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. megaterium, B. mycoides, B. pumilus, B. sphaericus, B. pasteurii και B. cereus (Choudhary & Johri, 2009). Τα είδη του γένους Bacillus είναι τα πλέον κατάλληλα για την παρασκευή σκευασμάτων παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης τόσο εξαιτίας της ικανότητάς τους να σχηματίζουν ανθεκτικές μορφές διατήρησης, όπως τα ενδοσπόρια, αλλά και λόγω του οπλοστασίου μεταβολιτών που διαθέτουν. Κάποια είδη, όπως το B. cereus, εκκρίνουν αντιβιοτικές ουσίες όπως η σβιτερμυκίνη Α (zwittermycin A) και η κανοσαμίνη (kanosamine) (Milner et al., 1996). Επιπλέον, το B. cereus έχει την ικανότητα να αλλάζει την ιονική σύσταση του μέσου στο οποίο αναπτύσσεται, να αυξάνει το ph, να διασπά το ασβέστιο και τέλος, να εκκρίνει αμμωνία (Emmert et al., 1999). Πολλά στελέχη έχουν τυποποιηθεί εδώ και κάποια χρόνια και χρησιμοποιούνται κατά την καταπολέμηση εδαφογενών παθογόνων μυκήτων. Τα μέλη του γένους αυτού παρουσιάζουν επίσης πολύ υψηλή ικανότητα αποικισμού του ριζικού συστήματος, λόγω κάποιων χαρακτηριστικών όπως η κατάληψη των διαθέσιμων οικοθέσεων και ο έντονος ανταγωνισμός για θρεπτικά στοιχεία (Choudhary & Johri, 2009). 38

45 Τα προαναφερθέντα χαρακτηριστικά καθιστούν τα είδη του γένους Bacillus εξαιρετικούς παράγοντες και αυτός είναι ο λόγος που πολλά στελέχη έχουν τυποποιηθεί και κυκλοφορούν ως εμπορικά σκευάσματα. Η πρώτη επιτυχημένη εφαρμογή και εμπορική παραγωγή BCA του γένους Bacillus ήταν το στέλεχος Α13 του B. subtilis το οποίο ανέστειλε επιτυχώς την ανάπτυξη 9 παθογόνων και ταυτόχρονα είχε θετική επίδραση στην αύξηση των φυτών (Quan et al., 2010). Έκτοτε πολλά στελέχη του γένους Bacillus, ειδικότερα των ειδών B. megaterium και B. subtilis έχουν χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για την μυκοστατική και μυκοτοξική τους δράση, ως σκευάσματα με τα εμπορικά ονόματα Serenade, EcoGuard, Kodiak, Yield Shield και BioYield (Idris et al., 2008; Kildea et al., 2008; Quan et al., 2010) Ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK726 Ο ωφέλιμος μύκητας Clonostachys rosea ΙΚ726 είναι ένας αποτελεσματικός ανταγωνιστής που παρουσιάζει ανασταλτική δράση εναντίον πολύ σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων, όπως των Bipolaris sorokiniana, F. culmorum (Knudsen et al., 1995; Jensen et al., 2000; 2002), Pythium spp. (Møller et al., 2003), Alternaria spp. (Jensen et al., 2004), B. cinerea (Li et al., 2004) και Fusarium spp. (Luongo et al., 2005). Έχει επίσης αναφερθεί ότι ο C. rosea IK726 αναπτύσσεται ενδοφυτικά στη ρίζα της αγγουριάς (Chatterton et al., 2009) και ότι επάγει την έκφραση γονιδίων αντοχής στο σιτάρι και την ελαιοκράμβη (Roberti et al., 2008; Lahlali & Peng 2013). Το στέλεχος ΙΚ726 εκτός από αποτελεσματικός παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης, προάγει και την αύξηση των φυτών (Knudsen et al. 1995; Jensen et al. 2000). Η ανάλυση του γονιδιώματος του C. rosea IK726 αποκάλυψε ότι ο ωφέλιμος μύκητας παράγει μειωμένο αριθμό χιτινολυτικών ενζύμων (Tzelepis et al., 2015) σε σχέση με άλλους μυκοπαρασιτικούς μύκητες, όπως ο Trichoderma sp. (Seidl-Seiboth et al., 2014). Παρά το γεγονός αυτό, ο συνδυασμός των υπόλοιπων μηχανισμών δράσης που επιστρατεύει ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης τον καθιστούν πολύ αποτελεσματικό Ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici και η ασθένεια που προκαλεί στην τομάτα Η σήψη του λαιμού και της ρίζας της τομάτας (Solanum lycopersicum) προκαλείται από τον μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl) (Jarvis & Shoemaker, 1978). Η ασθένεια αναφέρθηκε πρώτη φορά στην Ιαπωνία το 1969 από τους Sato και Araki (Menzies & Jarvis, 1994) και έκτοτε το παθογόνο εξαπλώθηκε σε Ευρώπη, Ασία και Αμερική (Koike et al., 2007). Στην Ελλάδα η πρώτη αναφορά έγινε το 1985 στην Κρήτη από τον Malathrakis (1985). Οι Jarvis και Shoemaker απομόνωσαν το παθογόνο από καλλιέργεια θερμοκηπιακής τομάτας στο Οντάριο του Καναδά (Jarvis, 1988) και το 1978 ο μύκητας κατατέθηκε στις διεθνείς συλλογές. Το 1940 οι Snyder και Hansen είχαν περιγράψει το είδος F. oxysporum f.sp. lycopersici (Fol) και έτσι ο Forl κατατέθηκε ως διαφορετική ειδική μορφή (forma specialis) διότι δεν προκαλούσε μια τυπική αδρομύκωση όπως ο προηγούμενος. Η διαφορά στην εξέλιξη της ασθένειας, έγκειται στο ότι τα αγγεία της τομάτας που έχει προσβληθεί, δεν αποικίζονται διασυστηματικά. Ο μύκητας συναντάται στο έδαφος και μολύνει τις ρίζες μέσω της διάτρησης της επιδερμίδας ή μέσω πληγών που μπορεί να 39

46 δημιουργούνται από έντομα ή κατά την έκπτυξη των δευτερευουσών ριζών (Lagopodi et al., 2002). Αποικίζει τον φλοιώδη ιστό και δημιουργεί καστανούς μεταχρωματισμούς, οι οποίοι εξαπλώνονται στο αγωγό σύστημα και διασπείρονται ανοδικά στο στέλεχος του φυτού, για 5 έως 10 εκατοστά και όχι παραπάνω από 25 εκατοστά (Brayford, 1996) (Εικόνα 1.2). Το παθογόνο μπορεί να απομονωθεί μόνο τοπικά γύρω από την περιοχή αποχρωματισμού και δεν διασπείρεται διασυστηματικά σε όλο το φυτό. Η διαφοροποίησή του, ωστόσο, από τον Fol εντοπίζεται εκτός από την συμπτωματολογία και στη επιδημιολογία (Jarvis & Shoemaker, 1978; Attitalla et al., 2004). Εικόνα 1.2. Συμπτώματα του Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl) σε φυτά τομάτας. Είναι εμφανής η μειωμένη αύξηση των προσβεβλημένων φυτών, σε σχέση με τα υγιή, (αριστερά) και ο μεταχρωματισμός του ριζικού συστήματος (δεξιά). Ο μύκητας κατά τη διάρκεια του βιολογικού του κύκλου παράγει τα τρία είδη σπορίων του είδους, μικροκονίδια, μακροκονίδια και χλαμυδοσπόρια. Τα μακροκονίδια αποτελούνται από τρία έως πέντε κύτταρα, και έχουν καμπυλωτές άκρες. Αυτά τα σπόρια εντοπίζονται στην επιφάνεια των ξενιστών που έχουν νεκρωθεί. Τα μικροκονίδια απαρτίζονται από ένα έως τρία κύτταρα, αποτελούν τον πιο συχνά παραγόμενο τύπο σπορίων και εντοπίζονται στο σημείο της μόλυνσης και στον αέρα του θερμοκηπίου. Με αυτά γίνεται η διασπορά εντός του αγρού ή εντός του θερμοκηπίου, μέσω του νερού άρδευσης ή των υδροπονικών συστημάτων. Τα μικροκονίδια μπορεί να παράγονται και πάνω στα υπολείμματα της καλλιέργειας και η διασπορά τους γίνεται με το τίναγμα αυτών, εντός του θερμοκηπίου (Rowe et al., 1980). Τα χλαμυδοσπόρια είναι στρογγυλά, πολυκύτταρα, με παχιά τοιχώματα και αποτελούν το μέσο διατήρησης στο έδαφος και πηγή πρωτογενούς μολύσματος (Groenewald, 2006). Η διασπορά σε απομακρυσμένες μεταξύ τους περιοχές γίνεται μέσω μολυσμένων φυτών, μολυσμένου εδάφους και μέσω των καλλιεργητικών εργασιών (υποδήματα, μηχανήματα, εργαλεία) καθώς ο μύκητας επιβιώνει για μεγάλα χρονικά διαστήματα στο έδαφος. Τέλος, έχει αναφερθεί και διασπορά του παθογόνου μηχανικά μέσω της δραστηριότητας εντόμων (Jarvis & Shoemaker, 1978; Jarvis, 1988). 40

47 Η ασθένεια προκαλεί έντονα συμπτώματα στην τομάτα όταν αυτή βρίσκεται στο στάδιο της ωριμότητας των καρπών. Εντοπίζεται αρχικά ένα περιθωριακό κιτρίνισμα των παλαιότερων φύλλων τα οποία αργότερα προοδευτικά νεκρώνονται. Κατά τις θερμές ώρες της ημέρας, τα φυτά εμφανίζουν μαρασμό με ανάκαμψη της εικόνας τις βραδινές ώρες. Προοδευτικά τα φυτά μαραίνονται και νεκρώνονται ή, σε ελάχιστες περιπτώσεις, διατηρούνται στον αγρό σε μια αποδυναμωμένη μη παραγωγική κατάσταση και πολλά από αυτά εμφανίζουν νανισμό (Koike et al., 2007). Χαρακτηριστικό σύμπτωμα είναι και η έκπτυξη μεγάλου αριθμού δευτερευουσών πλάγιων ριζών, στην περιοχή άνω του σημείου μόλυνσης και σε σημεία πλευρικά της κεντρικής ρίζας. Στην περιοχή του λαιμού συχνά παρατηρούνται έλκη κίτρινα, ερυθρωπά ή πορτοκαλί στα οποία μπορεί να εντοπίζεται και μυκήλιο του μύκητα, ανάλογα με την υγρασία που επικρατεί στον εκάστοτε αγρό. Όταν γίνει εγκάρσια τομή στο λαιμό ή τη ρίζα, γίνεται εμφανής ο καστανός μεταχρωματισμός που έχει σχηματιστεί στο εσωτερικό τους (Brayford, 1996). Η ασθένεια ευνοείται από χαμηλές θερμοκρασίες (20 o C 24 o C), χαμηλό εδαφικό ph, συνεκτικά εδάφη και από την παρουσία αμμωνιακού αζώτου. Ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici ανήκει στα εδαφογενή παθογόνα και ως τέτοιο ελέγχεται δύσκολα με τη χρήση συμβατικών αγροχημικών. Η απαγόρευση της εφαρμογής του βρωμιούχου μεθυλίου και άλλων μυκητοκτόνων εδάφους, καθιστά την καταπολέμηση με καλλιεργητικά μέσα τον βασικό τρόπο ελέγχου των φυτοπαθογόνων αυτών. Τέτοια μέτρα είναι η διατήρηση του ph σε τιμές μεγαλύτερες του 6, η ηλιοαπολύμανση, η αποφυγή εγκατάστασης καλλιέργειας σε μολυσμένο έδαφος και της χρήσης μολυσμένων εργαλείων, η απολύμανση των μηχανημάτων και εργαλείων και η εναλλαγή καλλιέργειας με ένα ανθεκτικό φυτό. Προτείνεται επίσης και η χρήση ανθεκτικών υποκειμένων και ποικιλιών (Koike et al., 2007). Ο μικρός αριθμός ποικιλιών που παρουσιάζουν ικανοποιητική αντοχή, το κόστος των ανθεκτικών υποκειμένων καθώς και το γεγονός ότι τα καλλιεργητικά μέτρα αντιμετώπισης είναι αρκετά χρονοβόρα και ενεργοβόρα, υποδεικνύουν την ανάγκη εύρεσης μιας εναλλακτικής μεθόδου καταπολέμησης. Αποτελεσματικοί παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης, που έχουν αναφερθεί για την επαρκή αναστολή της ανάπτυξης του F. oxysporum, σε ερευνητικό επίπεδο, είναι τα βακτήρια Pseudomonas fluorescens WCS365 (Dekkers et al., 2000), P. chlororaphis PCL1391 (Chin A Woeng et al., 1998), P. chlororaphis PCL1751 (Kamilova et al., 2006), και Collimonas fungivorans (Kamilova et al., 2007), αλλά και οι ανταγωνιστικοί μύκητες F. oxysporum Fo47 (Alabouvette & Couteaudier, 1992; Bolwerk et al., 2005), Trichoderma harzianum (Sivan, 1989; Bolwerk, 2005), και C. rosea ΙΚ726 (Tzelepis & Lagopodi, 2011; Kamou et al., 2016). Επιτυχημένη προσπάθεια βιολογικής καταπολέμησης αποτελεί και η εφαρμογή των βακτηρίων Bacillus megaterium και Burkholderia cepacia (Omar et al., 2006). Μείωση της έντασης της ασθένειας προκύπτει και από το συνδυασμό παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης. Τέτοιο παράδειγμα είναι ο συνδυασμός των μυκήτων T. harzianum και Glomus intraradices (Datnoff et al., 1995). Ενθαρρυντικά αποτελέσματα, αλλά όχι επιβεβαιωμένη δράση, έδωσαν και τρία στελέχη του βακτηρίου P. putida, καθώς και ένα στέλεχος κάθε φορά από τα Deftia tsuruhatensis, P. rhodesiae και Paenibacillus amylolyticus (Validov et al., 2007). 41

48 1.6. Ερευνητικό υπόβαθρο και στόχοι της διατριβής Η παρούσα εργασία στοχεύει στη διερεύνηση του τρόπου δράσης τεσσάρων στελεχών ριζοβακτηρίων με αποδεδειγμένη αντιμυκητιακή δράση. Τα στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76, επιλέχθηκαν για την ικανότητά τους να καταστέλλουν κάποιους εδαφογενείς μύκητες σε πειράματα in vitro και in planta. Ως παθοσύστημα μοντέλο χρησιμοποιείται το ζεύγος Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl)-τομάτα. Το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 απομονώθηκε από τη ριζόσφαιρα φυτού τομάτας (Solanum lycopersicum), από βιολογικό λαχανόκηπο, από την Καλλιθέα Ζακύνθου. Η προστασία που παρέχει σε πειράματα σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες και υπό φυσικές συνθήκες αλλά και σε πειράματα θερμοκηπίου και αγρού κατά της σήψης ριζών και λαιμού της τομάτας που προκαλείται από τον μύκητα Forl, είναι τεκμηριωμένη (Kamou et al., 2015). Το στέλεχος αυτό παρουσίασε πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσματα και κατά των φυτοπαθογόνων μυκήτων S. sclerotiorum, V. dahliae, B. cinerea και R. solani (αδημοσίευτα δεδομένα). Τόσο το υπερκείμενο της καλλιέργειας όσο και το οργανικό εκχύλισμα αυτού κατέστειλαν πλήρως την ανάπτυξη του Forl σε βιοδοκιμές in vitro (Kamou et al., 2015). Το βακτήριο S. rubidaea S55 απομονώθηκε από τη ριζόσφαιρα σιταριού (Triticum sp.), από καλλιεργούμενο αγρό, στην περιοχή Θέρμη Θεσσαλονίκης. Το εν λόγω στέλεχος παρουσίασε πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσματα όταν αξιολογήθηκε για τη δράση του εναντίον του Forl σε πειράματα σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες και σε θερμοκήπιο (Kamou et al., 2015 και αδημοσίευτα δεδομένα). Επίσης παρουσίασε σημαντική δράση σε in vitro βιοδοκιμές εναντίον των B. cinerea και S. sclerotiorum (δεδομένα που δεν παρουσιάζονται). Έντονη δράση κατά των σπορίων του Forl εμφάνισε το διήθημα από υπερκείμενο της καλλιέργειας του στελέχους αυτού κατά τη βιοδοκιμή σε πλάκες μικροτιτλοποίησης (Kamou et al., 2015). Το στέλεχος S. marcescens PiHa5II απομονώθηκε από τη ριζόσφαιρα φυτού πιπεριάς (Capsicum annuum), από βιολογικό λαχανόκηπο στην περιοχή του Αγίου Παύλου Χαλκιδικής. Το S. marcescens PiHa5II κατέστειλε επιτυχώς τους μύκητες V. dahliae και S. sclerotiorum (δεδομένα που δεν παρουσιάζονται). Η δράση του S. marcescens PiHa5II εναντίον του Forl αποδείχθηκε τόσο σε in vitro όσο και σε in planta πειράματα (Kamou et al., 2015). Τα in planta πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό πλήρως ελεγχόμενες συνθήκες, σε σύστημα gnotobiotic και σε φυτοδοχεία στο εργαστήριο και σε φυτοδοχεία υπό φυσικές συνθήκες, σε φυτά τομάτας. Τέλος, το εκχύλισμα υπερκειμένου υγρής καλλιέργειας αυτού του βακτηρίου έδειξε έντονα ανασταλτική δράση σε πειράματα in vitro σε πλάκες μικροτιτλοποίησης όπου αξιολογήθηκε για τη δράση του κατά του Forl. Η προσπάθεια διαχωρισμού των παραγόμενων ουσιών με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) έδειξε ότι το στέλεχος αυτό πιθανώς παράγει αντιμικροβιακές ουσίες υψηλής πολικότητας (Kamou et al., 2015). Το βακτήριο B. cereus S76 απομονώθηκε από τη ριζόσφαιρα υγιούς φυτού σιταριού (T. aestivum), από καλλιεργούμενο αγρό, στην Καλλικράτεια Χαλκιδικής. Το φυτό βρισκόταν ανάμεσα σε άλλα τα οποία εμφάνιζαν συμπτώματα προσβολής του στελέχους από Φουζαρίωση. Πρόκειται για έναν αποτελεσματικό παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης που αναστέλλει την ανάπτυξη του μύκητα Forl και την ένταση της ασθένειας που αυτός προκαλεί στην τομάτα (Kamou et al., 2015). Επίσης, προάγει 42

49 στατιστικώς σημαντικά την αύξηση των φυτών της τομάτας σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες αλλά και στον αγρό (Kamou et al., 2015 και αδημοσίευτα δεδομένα). Εμφανίζει μυκητοκτόνο δράση in vitro και κατά άλλων σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων όπως των V. dahliae, B. cinerea και R. solani (δεδομένα που δεν παρουσιάζονται). Στο παρόν Κεφάλαιο 1 παρουσιάστηκε γενική βιβλιογραφική ανασκόπηση που αφορά στο θέμα της διατριβής. Στο Κεφάλαιο 2 παρουσιάζεται αρχικά μελέτη της επίδρασης εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βακτηρίων σε in vitro πειράματα, υπολογίζοντας τις τιμές EC 50 (Half maximal Effective Concentration). Μετά την επιβεβαίωση της ανασταλτικής δράσης των τεσσάρων στελεχών κατά του Forl, μελετήθηκε η κινητική της ανάπτυξης των στελεχών P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 ώστε να σχεδιαστούν πρότυπες καμπύλες ανάπτυξης. Στη συνέχεια, στοχεύει στη διερεύνηση του τρόπου δράσης των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 μέσω της παραγωγής δύο σημαντικών αντιβιοτικών ουσιών, της προδιγιοσίνης και της φαιναζίνης αντίστοιχα. Ακολουθεί η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των αντιβιοτικών ενώσεων με αναλυτικές χημικές μεθόδους. Τέλος, παρουσιάζεται η επίδραση των μερικά καθαρισμένων αντιβιοτικών ουσιών στον φυτοπαθογόνο μύκητα Forl αλλά και στο μυκητιακό παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης C. rosea IK726. Τα παραπάνω πειράματα συνεισφέρουν στην κατανόηση της σημασίας των αντιβιοτικών ουσιών για τη δράση των συγκεκριμένων βακτηριακών στελεχών κατά των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών αλλά και πως αυτά μπορεί στο πεδίο δράσης τους να αναστέλλουν και ωφέλιμους μικροοργανισμούς. Στο Κεφάλαιο 3 της διατριβής διερευνάται βιοχημικά και με τη χρήση μεθόδων αναλυτικής χημείας η ικανότητα των βακτηρίων να παράγουν πλην των αντιβιοτικών άλλες αντιμικροβιακές ουσίες αλλά και ρυθμιστές ανάπτυξης. Αυτές οι ουσίες αποτελούν τη βασική τους μεταβολική πανοπλία και η παραγωγή τους μπορεί να εξηγήσει την ικανότητά τους να περιορίζουν σημαντικά την ανάπτυξη του μύκητα Forl και την ένταση της σήψης λαιμού και ριζών της τομάτας που αυτός προκαλεί. Η έκκριση φυτορμονών μπορεί να εξηγήσει την προαγωγή της αύξησης που παρατηρήθηκε σε διάφορα φυτά. Η πιθανότητα συνεργισμού των στελεχών P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 με τον C. rosea IK726 διερευνάται λεπτομερώς στο Κεφάλαιο 4. Σε αυτό παρουσιάζεται η μελέτη της έκφρασης 14 γονιδίων μεταφορέων ABC του C. rosea IK726, με τη χρήση της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) έπειτα από αντίστροφη μεταγραφή. Στο κεφάλαιο αυτό υπογραμμίζεται η σημασία των γονιδίων που κωδικοποιούν τους μεταφορείς ABC για την έξοδο από το κύτταρο τοξικών δευτερογενών μεταβολιτών, γεγονός που θα επέτρεπε το συνδυασμό του με βακτηριακούς παράγοντες βιολογικού ελέγχου που παράγουν αναστελτικές ουσίες. Η θετική επίδραση του συνδυασμού των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης επεκτάθηκε σε in planta πειράματα σε τομάτα, σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες, όπου και επέδειξαν ικανοποιητική φυτοπροστατευτική δράση. Προκειμένου να συνδεθεί η αρνητική επίδραση των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης S. rubidaea S55, P. chlororaphis ToZa7 και C. rosea IK726 στην ασθένεια, διερευνήθηκε η επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με την αντοχή σε φυτά τομάτας, μετά από προσβολή από τον μύκητα Forl και εμβολιασμό των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 σε συνδυασμό με τον C. rosea IK726 και μεμονωμένα. 43

50 Τέλος, στο πλαίσιο της μελέτης της συμπεριφοράς του C. rosea IK726 και του Forl στη ριζόσφαιρα, οι δύο μύκητες μετασχηματίστηκαν με τα γονίδια της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) και της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (DsRed), αντίστοιχα. Οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις φανέρωσαν την ικανότητα αποικισμού του ριζικού συστήματος της τομάτας από τον ωφέλιμο μύκητα C. rosea IK726. Παράλληλες παρατηρήσεις in vitro ενίσχυσαν και την υπόθεση ότι ο βασικός τρόπος δράσης του C. rosea IK726 είναι ο υπερπαρασιτισμός των υφών του φυτοπαθογόνου μύκητα. Τέλος, μελετήθηκε ο αποικισμός του ριζικού συστήματος της τομάτας από το στέλεχος P. chlororaphis Τοζα7. Το στέλεχος ΤοΖα7 μετασχηματίστηκε με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) μέσω βακτηριακής σύζευξης. Έξι ημέρες μετά τον εμβολιασμό παρατηρήθηκε ότι το ριζοβακτήριο αποίκισε επιτυχώς τα ριζικά τριχίδια και τα επιφανειακά κύτταρα της τομάτας, και το ΤοΖα7 παρουσίασε ενδοφυτική συμπεριφορά. Αποτελέσματα των παραπάνω ερευνών αποτέλεσαν κύριο υλικό για τις παρακάτω δημοσιεύσεις 1 και 2 και επιμέρους υλικό για τη δημοσίευση 3: 1. Kamou, N.N., Karasali, H., Menexes, G., Kasiotis, K.M., Bon, M.C., Papadakis, E.N., Tzelepis, G.D., Lotos, L., Lagopodi, A. L. (2015). Isolation screening and characterization of local beneficial rhizobacteria based upon their ability to suppress the growth of Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and tomato foot and root rot. Biocontrol Science and Technology, 25: doi: / Kamou, N.N., Dubey, M., Tzelepis, G., Menexes, G., Papadakis, E.N., Karlsson, M., Lagopodi, A.L., Jensen, D.F. (2016). Investigating the compatibility of the biocontrol agent Clonostachys rosea IK726 with prodigiosin producing Serratia rubidaea S55 and phenazine producing Pseudomonas chlororaphis ToZa7. Archives of Microbiology, 198: doi: /s Karlsson M., Durling M.B., Choi J., Kosawang C., Lackner G., Tzelepis G.D., Nygren K., Dubey M.K., Kamou N.N., Levasseur A., Zapparata A., Wang J., Amby D.B., Jensen B., Sarrocco S., Panteris E., Lagopodi A.L., Pöggeler S., Vannacci G., Collinge D.B., Hoffmeister D., Henrissat B., Lee Y.H., Jensen D.F. (2015). Insights on the evolution of mycoparasitism from the genome of Clonostachys rosea. Genome Biology Evolution, 7(2): doi: /gbe/evu

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. Παραγωγή αντιβιοτικών από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 και αξιολόγησή τους στην αντιμετώπιση του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici 2.1. Περίληψη Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76 επί της μυκηλιακής ανάπτυξης και της βλάστησης των σπορίων του Forl αλλά και του Clonostachys rosea IK726. Οι βιοδοκιμές έγιναν σε in vitro πειράματα και υπολογίστηκαν οι τιμές της συγκέντρωσης στο 50% της δραστικής δόσης, EC 50 (Half maximal Effective Concentration) εκχυλισμάτων από υγρές καλλιέργειες των βακτηρίων. Μετά την επιβεβαίωση της ανασταλτικής δράσης των τεσσάρων στελεχών κατά του Forl, μελετήθηκε η κινητική της ανάπτυξης των στελεχών P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 και σχεδιάστηκαν πρότυπες καμπύλες ανάπτυξης. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε και διαπιστώθηκε η ικανότητα παραγωγής των αντιβιοτικών φαιναζίνη-1-καρβοξαμίδιο (PCN) και προδιγιοσίνη, από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, αντίστοιχα. Τέλος, οι καθαρισμένες αντιβιοτικές ενώσεις μελετήθηκαν ως προς την επίδρασή τους στην ανάπτυξη του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl και του ωφέλιμου μύκητα C. rosea IK726, in vitro και διαπιστώθηκε ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των δύο μυκήτων, σε διαφορετικό βαθμό η κάθε μία Εισαγωγή Βακτηριακή ανάπτυξη και παραγωγή αντιβιοτικών Σε ένα κλειστό σύστημα καλλιέργειας, στο εργαστήριο, ένας βακτηριακός πληθυσμός παρουσιάζει μια τυπική καμπύλη αύξησης όπως αυτή που εμφανίζεται στην εικόνα 2.1. Αυτή η καμπύλη μπορεί να διακριθεί σε επιμέρους φάσεις: τη φάση υστέρησης, τη φάση εκθετικής ανάπτυξης, τη στάσιμη φάση και τη φάση θανάτου (Madigan et al., 2009). Πιο αναλυτικά, στη φάση της υστέρησης, η οποία μπορεί να είναι σύντομη ή παρατεταμένη, ο μικροβιακός πληθυσμός δεν αναπτύσσεται αμέσως. Αυτό συμβαίνει γιατί τα κύτταρα συνήθως «απογυμνώνονται» από κάποια ουσιώδη συστατικά τους και ο χρόνος αυτός κατά τον οποίον δεν αναπτύσσονται, είναι ο χρόνος που απαιτείται για να επανασυντεθούν τα εν λόγω συστατικά. Φάση υστέρησης παρατηρείται επίσης όταν μεταφερθούν τα βακτηριακά κύτταρα από ένα πλούσιο θρεπτικό μέσο σε ένα φτωχότερο, καθώς χρειάζεται κάποιος χρόνος για να συντεθούν όλα τα ένζυμα που είναι απαραίτητα για τη σύνθεση των ουσιωδών μεταβολιτών που λείπουν από το θρεπτικό μέσο. Η φάση της εκθετικής αύξησης είναι αυτή κατά την οποία παρατηρείται η πιο έντονη ανάπτυξη των κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά βρίσκονται στην πλέον υγιή τους κατάσταση, επομένως στο μέσο της φάσης αυτής είναι κατάλληλα για τη μελέτη των ενζύμων τους ή άλλων κυτταρικών συστατικών. Ο ρυθμός της εκθετικής αύξησης εξαρτάται άμεσα από εξωγενείς παράγοντες όπως είναι η θερμοκρασία, το είδος του θρεπτικού μέσου, αλλά και από ενδογενείς παράγοντες όπως είναι το γονιδίωμα του μικροοργανισμού (Madigan et al., 2009). Σε συνθήκες in vitro και ειδικότερα σε κλειστή καλλιέργεια, η εκθετική φάση είναι πεπερασμένης διάρκειας. Αυτό συμβαίνει γιατί με την πάροδο του χρόνου και τον έντονο 45

52 πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ένα ή περισσότερα ουσιώδη συστατικά του θρεπτικού μέσου εξαντλούνται ή/και κάποιο υπόλειμμα κάποιας μεταβολικής διεργασίας συσσωρεύεται σε σημείο να παρεμποδίζει και να σταματά την εκθετική φάση ανάπτυξης. Σε αυτό το χρονικό σημείο, ο πληθυσμός εισέρχεται στη στάσιμη φάση και αυτό συμβαίνει γιατί κάποια κύτταρα αναπτύσσονται ακόμη και κάποια κύτταρα πεθαίνουν με αποτέλεσμα η καθαρή αύξηση ή μείωση του αριθμού των κυττάρων να είναι μηδενική. Τα περισσότερα είδη των βακτηρίων τα οποία μελετώνται στην παρούσα διατριβή, ανήκουν στα γένη που παράγουν δευτερογενείς μεταβολίτες κατά τη στατική φάση ανάπτυξης (Madigan et al., 2009). Το τελευταίο στάδιο είναι η φάση θανάτου και στα αρχικά στάδια αυτής, τα κύτταρα παραμένουν ζωντανά και συνεχίζουν το μεταβολισμό τους ή νεκρώνονται και ακολουθεί λύση αυτών. Για τους μονοκύτταρους μικροοργανισμούς, η οπτική πυκνότητα είναι ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων, εντός κάποιων ορίων. Ως εκ τούτου, ο καθορισμός των ζώντων κυττάρων μπορεί να γίνει μέσω της μέτρησης της θολερότητας του δείγματος (Madigan et al., 2009). Εικόνα 2.1. Τυπική καμπύλη αύξησης ενός βακτηριακού πληθυσμού όπου διακρίνονται οι φάσεις υστέρησης, εκθετικής αύξησης, η στάσιμη φάση και η φάση θανάτου (Madigan et al., 2009 Brock s Biology of Microorganisms, 12th edition, Κεφ. 6.4: ). Όπως προαναφέρθηκε στην παράγραφο , οι αντιμικροβιακές ενώσεις είναι προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού και μπορεί να είναι ένζυμα, ουσίες όπως το υδροκυάνιο και αντιβιοτικά (Weller, 1988; Thomashow et al., 1997). Πιο συγκεκριμένα, οι αντιβιοτικές ενώσεις είναι οργανικά μόρια μικρού μοριακού βάρους που δρουν σε μικρές συγκεντρώσεις αναστέλλοντας ή παρεμποδίζοντας κάποια ειδική βιοχημική αντίδραση ενός άλλου μικροοργανισμού. Οι βασικότεροι μηχανισμοί δράσης των αντιβιοτικών είναι η παρεμπόδιση της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος του μικροοργανισμού στόχου, η διαταραχή της λειτουργίας της πρωτοπλασματικής μεμβράνης, η αναστολή κάποιας μεταβολικής διεργασίας και η παρεμπόδιση κάποιας βασικής λειτουργίας του γενετικού υλικού του στόχου (Fravel 1988; Thomashow et al., 1997; Raaijmakers et al., 2002). 46

53 Το αντιβιοτικό καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1- carboxamide, PCN), από το Pseudomonas chlororaphis ToZa7 Το είδος P. chlororaphis περιλαμβάνει αρκετά στελέχη που δρουν ως παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης, συνθέτοντας αντιβιοτικές ουσίες με αντιμυκητιακή δράση που ανήκουν σε έξι κλάσεις ενώσεων: φλορογλουκινόλες, φαιναζίνες, πυολουτεορίνες, πυρρολνιτρίνες, λιποπεπτίδια και υδροκυάνιο (Haas & Keel, 2003). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το στέλεχος P. chlororaphis (syn. P. aureofaciens), το οποίο απομονώθηκε από ρίζες σιταριού, και καταστέλλει το παρασιτικό πλάγιασμα των σιτηρών (Take-All disease), που προκαλείται από τον μύκητα Gaeumannomyces graminis f. sp. tritici. Ο έλεγχος της σοβαρής αυτής ασθένειας από το στέλεχος αυτό αποδόθηκε στην παραγωγή τριών αντιβιοτικών: των φαιναζίνη-1-καρβοξυλικό οξύ, (phenazine-1- carboxylic acid, PCA), 2-υδροξυφαιναζίνη-1- καρβοξυλικό οξύ, (2-hydroxyphenazine-1- carboxylic acid) και 2-υδροξυφαιναζίνη (2-hydroxyphenazine) (Thomashow et al., 1990; Pierson & Thomashow, 1992). Το στέλεχος P. chlororaphis (syn. P. aureofaciens) MA 342 εμφάνισε πολύ εντυπωσιακή δράση απέναντι στους φυτοπαθογόνους μύκητες Drechslera teres, Microdochium nivale και Tilletia caries (Hökeberg et al., 1998). Το στέλεχος P. chlororaphis PCL1391 παράγει το αντιβιοτικό φαιναζίνη-1-καρβοξυαμίδιο (phenazine-1- carboxamide, PCN) και προκαλεί αναστολή του F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε φυτά τομάτας (Dekkers et al., 2000), του Colletotrichum lindemuthianum σε φυτά φασολιάς (Bardas et al., 2009) και του F. oxysporum f. sp. niveum σε φυτά καρπουζιάς (Tziros et al., 2007). Η φαιναζίνη 1 καρβοξυαμίδιο (phenazine-1-carboxamide, PCN) (Εικόνα 2.2) και τα χημικά της ανάλογα είναι μια πολύ σημαντική αντιβιοτική ουσία με δράση αντικαρκινική (Gamage et al. 2002; Abdelfattah et al., 2011; Kennedy et al., 2015), αντιμυκητιακή (Thomashow & Weller, 1988; Chin-A-Woeng et al. 1998; Kerr et al., 1999) και αντιβακτηριακή (Abken et al., 1998). Επίσης επιδεικνύει δράση κατά του παθογόνου της ελονοσίας (Hussain et al., 2011), τρυπανοκτόνο δράση (Neves-Pinto et al., 2002), και δράση κατά του παθογόνου αιτίου της ηπατίτιδας C (Wang et al., 2000). Κατά πλειοψηφία οι ουσίες που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις μελέτες είναι χημικά συντιθέμενες. Η ουσία PCN όμως απαντάται και ως φυσικό προϊόν, για παράδειγμα παράγεται σε σημαντικές ποσότητες από το στέλεχος P. chlororaphis PCL1391 (Chin-A-Woeng et al. 1998) αλλά και το P. chlororaphis ToZa7 (Kamou et al., 2015). Η επιστημονική κοινότητα κατανοώντας τη σημασία των βιολογικών ιδιοτήτων και το οικονομικό όφελος της φυσικά συντιθέμενης φαιναζίνης, στρέφει την έρευνα στην παραγωγή της αντιβιοτικής ένωσης από μικροοργανισμούς που μπορούν να την συνθέσουν (Abken et al., 1998; Kerr et al., 1999; Giddens et al., 2002; Laursen & Nielsen, 2004; Mavrodi et al., 2006; 2010; Sanmugaiah et al., 2009; Pierson & Pierson, 2010; Gao et al., 2013, κ.α.). Ταυτόχρονα διερευνάται η καλύτερη μέθοδος σύνθεσης συνθετικών αναλόγων της φαιναζίνης, ώστε να παραχθούν μόρια τα οποία έχουν υψηλή αποτελεσματικότητα και χαμηλή τοξικότητα στον άνθρωπο, κυρίως λόγω των αντικαρκινικών ιδιοτήτων αυτής της ένωσης (Cimmino et al., 2012; 2013). 47

54 Εικόνα 2.2. Χημική δομή του αντιβιοτικού φαιναζίνη-1-καρβοξαμίδιο (C13H9N3O) (πηγή: Το αντιβιοτικό προδιγιοσίνη (2-methyl-3-pentyl-6-methoxy prodigiosin) από το Serratia rubidaea S55 Πρόκειται για μια χαρακτηριστική ερυθρή ένωση τριπυρρολικής δομής με το όνομα 2- μεθυλ-3-πεντυλ-6-μεθοξυπροδιγιοσίνη (2-methyl-3-pentyl-6-methoxyprodigiosin) (Εικόνα 2.3), που είναι γνωστή για τις αντιμικροβιακές, ανοσοκατασταλτικές και αντικαρκινικές της ιδιότητες (Montaner et al., 2000; Williamson et al., 2005). Αυτή η ένωση μπορεί να παραχθεί από το βακτήριο S. marcescens, από το οποίο και απομονώθηκε αρχικά, από ακόμη 3 είδη του γένους Serratia, τα S. plymuthica, S. liquefaciens, και S. rubidaea, αλλά και από άλλους μικροοργανισμούς όπως Zooshikella rubidus, Vibrio sp., Streptomyces griseoviridis, και Hahella chejuensis (Grimont & Grimont, 2006; Song et al., 2006; Huh et al., 2007; Alihosseini et al., 2008; Kawasaki et al., 2008; Kim et al., 2008a; Borić et al., 2011; Lee et al., 2011). Η προδιγιοσίνη παρουσιάζει τεράστιο οικονομικό και επιστημονικό ενδιαφέρον όχι μόνο λόγω των προαναφερθέντων χαρακτηριστικών της, αλλά επιπλέον τόσο για τη χρήση της ως εντομοκτόνου όσο και ως φυσικής χρωστικής ουσίας υφασμάτων (Siva et al., 2011; Patil et al., 2011;Wang et al., 2012; Zhou et al., 2016). Εικόνα 2.3. Χημική δομή του αντιβιοτικού 2-μεθυλ-3-πεντυλ-6-μεθοξυπροδιγιοσίνη (C20H25N3O) (πηγή: Ο ακριβής ρόλος της προδιγιοσίνης δεν είναι ακόμη γνωστός καθώς, όπως και για όλα τα αντιβιοτικά, είναι πολύ δύσκολο κανείς να τα μελετήσει in situ λόγω της μικροβιακής 48

55 και της χημικής αποσύνθεσης αλλά και της πρόσδεσής τους στα κολλοειδή και τις οργανικές ενώσεις του εδάφους (Thomashow et al., 1997; Bonsall et al., 2007). Συνοψίζοντας τις βιβλιογραφικές αναφορές, μπορεί κανείς να ισχυριστεί ότι τα αντιβιοτικά στη ριζόσφαιρα δε συσσωρεύονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις ώστε να παρουσιάζουν αναστολή βιολογικών διεργασιών των μικροοργανισμών. Αυτό που διαφαίνεται είναι η σημασία των ουσιών αυτών ως μορίων-σηματοδοτών που είναι πολύ σημαντικά στην επικοινωνία και τη φυσιολογία των βακτηρίων που τις παράγουν (Haas & Keel, 2003; Davies, 2006; Davies et al., 2006; Fajardo & Martinez, 2008). Στην πραγματικότητα η πιθανότερη εκδοχή είναι οι αντιβιοτικές ουσίες να χρησιμοποιούνται στον ανταγωνισμό για οικοθέσεις, αλλά ταυτόχρονα και ως σηματοδότες, αλλά οι δυσκολίες της παρατήρησης της κινητικής των αντιβιοτικών στο πεδίο εμποδίζουν την ασφαλή επιβεβαίωση αυτών των ενδείξεων (Haas & Défago, 2005; Bonsall et al., 2007; Mavrodi et al., 2010). Η προδιγιοσίνη φαίνεται να δρα ως ενισχυτικό της προσαρμοστικότητας (fitness) των μικροοργανισμών, αυξάνοντας την επιβίωση των βακτηρίων (Stankovic et al., 2014). Ωστόσο, ο ρόλος της δεν έχει ξεκαθαριστεί ακόμα, καθώς αναφέρονται μελέτες οι οποίες την παρουσιάζουν ως το βασικό μέσο βιοελέγχου του εκάστοτε παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης που την παράγει ενώ άλλες μελέτες που αφορούν εντομοπαθογόνα είδη Serratia spp., υποστηρίζουν ότι η ουσία αυτή δεν επιδρά καθόλου στη μολυσματικότητα (virulence) του μικροοργανισμού που την παράγει (Siva et al., 2012; Duzhak et al., 2012; Zhou et al., 2016). Πιο συγκεκριμένα οι Someya και συνεργάτες (2001) έδειξαν ότι η παρουσία της προδιγιοσίνης δρα συνεργιστικά με τις χιτινάσες που παράγει το στέλεχος S. marcescens B2 εναντίον του B. cinerea. Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν και όταν ο παράγοντας βιολογικού ελέγχου έδρασε κατά του F. oxysporum (Someya et al., 2007). Το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και όταν στελέχη του S. marcescens μελετήθηκαν για την ανταγωνιστική τους δράση απέναντι στον φυτοπαθογόνο μύκητα Didymella applanata (Duzhak et al., 2012). Από την άλλη, όσον αφορά στα εντομοπαθογόνα στελέχη S. marcescens SM-R και SM-SR αποδείχτηκε, με τη χρήση μεταλλαγμάτων ότι, η παραγωγή της προδιγιοσίνης είναι ανεξάρτητη της μολυσματικότητας των στελεχών (Zhou et al., 2016). Ο ρόλος της λοιπόν παραμένει ασαφής και η ενασχόληση των ερευνητών με το συγκεκριμένο θέμα αναμένεται να αυξηθεί τα επόμενα χρόνια Αναλυτικές τεχνικές χαρακτηρισμού - ταυτοποίησης αντιμικροβιακών ενώσεων Ως χρωματογραφία ορίζεται η τεχνική κατά την οποία τα επιμέρους συστατικά ενός μίγματος διαχωρίζονται καθώς κατανέμονται διαφορετικά μεταξύ μιας κινητής και μιας στατικής φάσης (Snyder et al., 2003; Robards et al., 2004). Σε αυτήν ανήκουν πολυάριθμες αναλυτικές τεχνικές οι οποίες είναι πρωτίστως μέθοδοι διαχωρισμού. Κατά τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) η στατική φάση είναι απλωμένη ως ένα πολύ λεπτό στρώμα σε μία πλάκα αδρανούς υλικού. Πρόκειται για μια τεχνική κατά την οποία μπορεί να ταυτοποιηθεί, να καθαριστεί, ή να εντοπιστεί μεγάλος αριθμός ενώσεων συνδυάζοντας την κατάλληλη κινητή και στατική φάση και για τον λόγο αυτόν προτιμάται για την απομόνωση άγνωστων αντιμικροβιακών ουσιών (Snyder et al., 2003). Πρόσφατες βιβλιογραφικές αναφορές δείχνουν πως η χρήση της TLC σε συνδυασμό με βιολογικές και χημικές μεθόδους ανίχνευσης χρησιμοποιείται 49

56 ευρέως στην έρευνα (Marston, 2011). Στην περίπτωση της χρήσης βιολογικού μέσου ανίχνευσης η TLC καλείται βιοαυτογραφική TLC (bioautographic TLC) και αποτελεί πολύ σημαντικό εργαλείο στη διαδικασία διερεύνησης αντιμικροβιακής δράσης ενός εκχυλίσματος (Marston, 2011; Dewanjee et al., 2015). Στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), η στατική φάση σε μορφή στερεού υλικού πακετάρεται σε στήλη διαμέσου της οποίας διέρχεται το προς ανάλυση δείγμα και η κινητή φάση (εκλουστικό) με υψηλή πίεση. Ο συνδυασμός φασματομετρίας μαζών και ενός συστήματος HPLC, ώστε να απομακρύνεται ο διαλύτης (κινητή φάση) να διαχωρίζονται οι εκλουόμενες ουσίες και να ιονίζονται, χρησιμοποιείται σήμερα ως μια από τις κυριότερες τεχνικές ανάλυσης και ταυτοποίησης ενώσεων (LC-MS) (Szultka et al., 2013). Το σύστημα που συνδυάζει το φασματόμετρο μαζών με την υγρή χρωματογραφία θεωρείται ως ένα από τα πιο εκλεκτικά, υψηλής δραστηριότητας και ευέλικτα συστήματα αναλυτικής χημείας (Robards et al., 2004; Szultka et al., 2013). Επιπλέον, η χρήση της HPLC/MS δίνει πληροφορίες όχι μόνο για τον τύπο και την ποσότητα των υπό ανάλυση ενώσεων, αλλά και για το μοριακό βάρος και τη διαδικασία απόκτησης θραυσμάτων (Szultka et al., 2013). Οι σύγχρονες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση του μεταβολικού προφίλ μικροοργανισμών και φυτών βασίζονται κυρίως στη χρήση της HPLC αντίστροφης φάσης με ανιχνευτή φασματοφωτόμετρο με διάταξη φωτοδιόδων και ιονιστή ηλεκτροδιασποράς (HPLC/PDA/ESI/MS) (Huhman & Sumner, 2002; Szultka et al., 2013) Σκοπός των πειραμάτων Κύριος στόχος των πειραμάτων που αναφέρονται στο παρόν κεφάλαιο ήταν η διερεύνηση της παραγωγής αντιβιοτικών από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, η απομόνωση αυτών και η ταυτοποίησή τους. Περεταίρω μελετήθηκε η in vitro δράση των καθαρισμένων αντιβιοτικών επί του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl και του ωφέλιμου μύκητα C. rosea IK726. Παράλληλα προσδιορίστηκαν οι τιμές της συγκέντρωσης στο 50% της δραστικής δόσης, EC 50 (Half maximal Effective Concentration) εκχυλισμάτων υγρών καλλιεργειών των τεσσάρων βακτηρίων επί της ανάπτυξης του μυκηλίου και της βλάστησης των σπορίων του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl αλλά και του ωφέλιμου μύκητα C. rosea IK Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Οι μύκητες C. rosea IK726 και Forl (απομόνωση ZUM 2407/IPO-DLO) παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον καθηγητή Dan Funck Jensen του Τμήματος Δασικής Μυκητολογίας και Φυτοπαθολογίας του Σουηδικoύ Πανεπιστημίου Γεωργικών Επιστημών, Sveriges Lantbruksuniversitet (SLU) και από τον καθηγητή Ben Lugtenberg του Ινστιτούτου Βιολογίας του Πανεπιστημίου του Leiden, αντίστοιχα. Οι μύκητες διατηρήθηκαν σε τρυβλία με Potato Dextrose Agar (PDA, BD Difco) στους 25 C. Τα κονίδια του C. rosea συλλέχθηκαν απευθείας από το τρυβλίο ως αιώρημα σε αποστειρωμένο νερό που αμέσως διηθήθηκε μέσω αποστειρωμένου Μiracloth (Calbiochem, USA) ώστε να απομακρυνθούν οι μυκηλιακές υφές. Ο Forl καλλιεργήθηκε σε υγρή καλλιέργεια Czapek-Dox Broth 50

57 (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands), για 5-7 ημέρες, στους 25 C, σε ανακινούμενο επωαστήρα, στις 150 στροφές/λεπτό και τα κονίδια διαχωρίστηκαν από το μυκήλιο με διήθηση μέσω αποστειρωμένου Miracloth. Η συγκέντρωση των κονιδίων καθοριζόταν κάθε φορά με αιματοκυττόμετρο (Thoma, Blaubrand GmbH, Germany, 0.1 mm x mm 2 ). Τα P. chlororaphis ToZa7, B. cereus S76, S. marcescens PiHa5ΙΙ και S. rubidaea S55 καλλιεργούνταν σε τρυβλία Luria Bertani (LB, Bertani, 1951) με άγαρ, στους 25 C και σε αντίστοιχο θρεπτικό μέσο, απουσία στερεοποιητικής ουσίας (άγαρ) για την ανάπτυξη σε υγρή καλλιέργεια Τιμές συγκέντρωσης στο 50% της δραστικής δόσης EC 50 εκχυλισμάτων υγρών καλλιεργειών των βακτηριακών στελεχών Στο πλαίσιο της μελέτης της επίδρασης βακτηριακών δευτερογενών μεταβολιτών πάνω στον φυτοπαθογόνο μύκητα Forl αλλά και στον μυκητιακό παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης C. rosea IK726 υπολογίστηκαν οι τιμές EC 50 δηλαδή η συγκέντρωση στο 50% της δραστικής δόσης (Half maximal Effective Concentration) εκχυλισμάτων από υπερκείμενα υγρών καλλιεργειών τους. Οι δράσεις των εκχυλισμάτων από καλλιέργειες των P. chlororaphis ToZa7, B. cereus S76, S. rubidaea S55 και S. marcescens PiHa5II, συγκρίθηκαν σε in vitro βιοδοκιμή, σε πλάκα μικροτιτλοποίησης, 96 φρεατίων, σύμφωνα με τους Kamou et al. (2015). Συγκεκριμένα, 500 ml από υγρές καλλιέργειες 72 ωρών φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενά τους εκχυλίστηκαν με οξικό αιθυλεστέρα και συμπυκνώθηκαν μέχρι ξηρού. Στη συνέχεια επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml οξικού αιθυλεστέρα. Η δοκιμή έγινε σε πλάκες μικροτιτλοποίησης όπου οι μύκητες εφαρμόστηκαν ως αιώρημα κονιδίων συγκέντρωσης 10 4 κονίδια ml -1, μέσα σε θρεπτικό διάλυμα Czapek-Dox Broth. Τα εκχυλίσματα δοκιμάστηκαν σε 6 επίπεδα συγκεντρώσεων: 75μl ml -1, 50 μl ml -1, 37.5 μl ml -1, 25 μl ml -1, 12.5 μl ml -1, 6.25 μl ml -1, ως προς την παραγωγή μυκηλίου των Forl και C. rosea IK726 και ο τελικός όγκος σε κάθε φρεάτιο ήταν 150 μl. Οι συγκεντρώσεις επιλέχθηκαν ώστε να εφαρμόζεται αρχικά αυτή που προκάλεσε πλήρη αναστολή (100%) της ανάπτυξης του μύκητα Forl σε προηγούμενα πειράματα (Kamou et al., 2015) και στη συνέχεια αραιώσεις αυτής ώστε να υπολογιστεί η συγκέντρωση στο 50% της δραστικής δόσης. Η μυκητιακή ανάπτυξη μετρήθηκε με βάση την αύξηση της οπτικής πυκνότητας (OD 620) ή αύξηση της θολερότητας στο χρόνο, που οφείλεται στη βλάστηση των σπορίων και περεταίρω ανάπτυξη του μυκηλίου. Οι μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας διήρκησαν 216 ώρες και οι μετρήσεις λάμβαναν χώρα κάθε 24 ώρες (9 χρονικά σημεία). Κάθε επέμβαση αποτελούταν από 5 επαναλήψεις και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Δεδομένου ότι τα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης δεν επηρέασαν την απορρόφηση και ο διαλύτης εκχύλισης δεν επηρέασε την ανάπτυξη των μυκήτων, η επί % αναστολή της ανάπτυξης εκφράστηκε σύμφωνα με παραλλαγή του τύπου του Püntener (1981): Ποσοστό Αναστολής % = (C E)/C * 100 % (Püntener, 1981), όπου το C αντιπροσωπεύει την οπτική απορρόφηση των μαρτύρων και το E αντιπροσωπεύει την οπτική απορρόφηση των εκάστοτε επεμβάσεων. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης σχεδιάστηκαν μέσω του προγράμματος JMP (SAS, Cary, USA) και συσχετίστηκαν οι τιμές της επί % αναστολής (άξονας Υ, εξαρτώμενη μεταβλητή) με τις 6 διαφορετικές συγκεντρώσεις (άξονας Χ). 51

58 Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα προηγούμενων πειραμάτων, επιλέχθηκαν να παρουσιαστούν στα αποτελέσματα 3 χρονικά σημεία από τα συνολικά 9 που μετρήθηκαν, όπως εξηγείται στη συνέχεια: Επιλέχθηκαν οι 48 ώρες με βάση την απόκριση του παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης C. rosea IK726 σε διηθημένα υπερκείμενα υγρών καλλιεργειών των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, όπου παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή της ανάπτυξής του, σε σύγκριση με την επίδραση του υπερκείμενου της καλλιέργειας των 24 ωρών αλλά και σε σύγκριση με τον μάρτυρα (βλ. Κεφ. 4 και Kamou et al., 2016). Οι 216 ώρες επιλέχτηκαν ως το σημείο κατά το οποίο η ανάπτυξη των δύο μυκήτων εισήλθε στη στατική φάση αύξησης. Πιο συγκεκριμένα, μετά τις 216 ώρες, οι μετρήσεις έδειξαν πως είχε επέλθει η στατική φάση ανάπτυξης του μύκητα. Από τα ενδιάμεσα των παραπάνω, το χρονικό σημείο των 96 ωρών επιλέχθηκε χάριν αντιστοιχίας της βλάστησης των κονιδίων των δύο μυκήτων in vivo, καθώς τέσσερις ημέρες μετά τον εμβολιασμό και οι δύο μύκητες έχουν αποικίσει το ριζικό σύστημα διαφόρων ξενιστών (Lagopodi et al., 2002; Chatterton et al., 2008; Lahlali & Peng, 2013). Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων υπολογισμού των τιμών EC 50 έγινε ανάλυση παραλλακτικότητας (ANOVA) η δοκιμή κάθε συγκέντρωσης αντιμετωπίστηκε ως χωριστό πείραμα με τις χρονικές στιγμές ως διαφορετικές επεμβάσεις. Η σύγκριση των μέσων όρων της οπτικής πυκνότητας (αφού διορθώθηκαν με βάση τον μάρτυρα), έγινε μέσω του τεστ του Dunnett Δημιουργία πρότυπων καμπυλών ανάπτυξης των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 Για τον σωστότερο προσδιορισμό του σωστού χρονικού σημείου παραγωγής των αντιβιοτικών ουσιών από τα βακτήρια, καθορίστηκαν η εκθετική και η στατική φάση ανάπτυξης των στελεχών στο χρόνο, μέσω της δημιουργίας πρότυπων καμπυλών ανάπτυξης. Οι καμπύλες ανάπτυξης των βακτηρίων καθορίστηκαν στις βέλτιστες συνθήκες μέσω του συνδυασμού δύο γνωστών μεθόδων: της μέτρησης ζώντων αποικιών σε τρυβλίο (viable cell/plate counting) και της μέτρησης οπτικής πυκνότητας (turbidimetric method) (Madigan et al., 2009). Εν συντομία, συσχετίστηκε η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στα 540nm (Optical Density, OD 540) με τον αριθμό των μονάδων που είναι ικανές να παράγουν αποικίες (Colony Forming Units, CFU). Η βαθμονόμηση έγινε με χρήση μάρτυρα που περιείχε καθαρό LB. Πιο συγκεκριμένα, τα βακτήρια καλλιεργήθηκαν σε 100 ml LB και κατά τη διάρκεια της επώασής τους έγιναν 7 δειγματοληψίες (0, 4, 8, 12, 24, 48 και 72 ώρες επώασης). Σε κάθε δειγματοληψία μεταφέρθηκε ασηπτικά 1 ml υγρής καλλιέργειας σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιείχε 9 ml απεσταγμένου και αποστειρωμένου νερού και ακολούθησαν 10 διαδοχικές αραιώσεις 1:10 (10-1 έως ). Στη συνέχεια, μεταφέρονταν 100 μl από τις αραιώσεις 10-4 έως σε τρυβλία με LB-agar και επιστρώνονταν ασηπτικά, με πλαστική ράβδο τύπου Drigalski. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 25± 2 o C μέχρι να εμφανιστούν οι αποικίες και μετρήθηκε μακροσκοπικά ο αριθμός τους. Στη συνέχεια υπολογίστηκε ο αριθμός των βακτηρίων ανά ml υποστρώματος (CFU/ml). Ταυτόχρονα μεταφερόταν και 1 ml από την καλλιέργεια σε φασματοφωτόμετρο (IMPLEN GmbH, Munich, Germany) ώστε να μετρηθεί η οπτική πυκνότητα στην εκάστοτε χρονική στιγμή, σε μήκος κύματος 540nm (OD 540). Με τα δεδομένα που προέκυψαν κατασκευάστηκαν οι καμπύλες ανάπτυξης, συσχετισμού χρόνου και οπτικής πυκνότητας καθώς και χρόνου και 52

59 ικανότητας σχηματισμού ζώντων αποικιών. Στην τελευταία υπολογίστηκαν οι τιμές Log CFU/ml LB Καθαρισμός και ταυτοποίηση του αντιβιοτικού καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) από το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 Η αντιμυκητιακή δράση του P. chlororaphis ToZa7, εναντίον του Forl μελετήθηκε με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας όπως περιγράφηκε από τον Keen και τους συνεργάτες του (1971), με κάποιες παραλλαγές (Kamou et al., 2015). Συγκεκριμένα, εκχυλίστηκαν 500 ml υγρής καλλιέργειας 72 ωρών, σε LB, του εν λόγω στελέχους, με ίσο όγκο οξικού αιθυλεστέρα και το εκχύλισμα συμπυκνώθηκε στο 1 ml. Δόσεις (aliquots) των 75 μl εφαρμόστηκαν σε πλάκα TLC (Silica gel 60 F254, C18 normal phase (Merck, Darmstadt, Germany) και ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα LB με οξικό αιθυλεστέρα ίσου όγκου. Οι πλάκες εκλούστηκαν με μεθανόλη:νερό 60:40, (v:v) και αφού στέγνωσαν, στο θάλαμο νηματικής ροής, επιστρώθηκαν με LB άγαρ στο οποίο είχαν προστεθεί κονίδια ml -1 του Forl. Ακολούθησε επώαση στους C, για 3 ημέρες. Μετά την επιβεβαίωση της αντιμυκητιακής δράσης πραγματοποιήθηκε και ένας επιπλέον διαχωρισμός των ουσιών που περιέχονταν στο ακατέργαστο εκχύλισμα μέσω προπαρασκευαστικής TLC. Οι διαχωρισμένες ουσίες εντοπίστηκαν ως 12 ξεχωριστές κηλίδες όπως αυτές οπτικοποιήθηκαν κάτω από υπεριώδες φως, στα 254 nm. Κάθε κηλίδα αποξέθηκε με αποστειρωμένο νυστέρι και συλλέχθηκε σε αποστειρωμένο Eppendorf. Αφού το υλικό της καθεμίας εκχυλίστηκε περαιτέρω με ακετόνη, το εκχύλισμα μεταφέρθηκε σε καινούργιο Eppendorf και αφέθηκε να στεγνώσει στον αέρα, όπως περιγράφεται από τους El-Sayed et al. (2008). Στη συνέχεια, το υλικό της κάθε κηλίδας που εκχυλίστηκε, επαναδιαλύθηκε σε ακετονιτρίλιο: νερό (Merck, Darmstadt Germany) 1:1 (v:v) και υποβλήθηκε σε ανάλυση LC-MS. Κάθε ένα από τα 12 διαχωρισθέντα εκχυλίσματα συγκρίθηκε με καθαρή αντιβιοτική ένωση φαιναζίνη-1-καρβοξυλικό οξύ phenazine-1-carboxylic acid, PCA), η οποία χορηγήθηκε ευγενικά από την καθηγήτρια Linda Thomashow (USDA/ARS, Pullman, WA, USA) και το καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) το οποίο καθαρίστηκε από εκχυλίσματα του στελέχους P. chlororaphis PCL1391, εφαρμόζοντας τη μέθοδο που περιγράφηκε από τους Chin-A- Woeng et al. (1998). Η χρωματογραφική ανάλυση των δειγμάτων που προέκυψαν πραγματοποιήθηκε σε σύστημα υγρού χρωματογράφου Surveyor, αποτελούμενο από αντλία HPLC με ενσωματωμένη διάταξη απαέρωσης της κινητής φάσης, αυτόματο δειγματολήπτη με ενσωματωμένο φούρνο χρωματογραφικής στήλης, και ανιχνευτή φασματογράφου μάζας τριπλού τετραπόλου TSQ Quantum Discovery Max (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA, USA). Η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε στήλη HyPURITY- C 18 (50 2.1, 3 μm, Thermo Scientific, USA). Η κινητή φάση Α αποτελούταν από μίγμα νερού:μεθανόλης, 90:10 (v:v), που περιείχε 5 mm οξικό αμμώνιο και η κινητή φάση Β αποτελούταν από μίγμα νερού:μεθανόλης σε αναλογία 10:90 (v:v), που περιείχε 5 mm οξικό αμμώνιο. H ροή και η αλλαγή της σύστασης της κινητής φάσης πραγματοποιούταν σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: 53

60 Ένωση Πίνακας 2.1. Ροή και αλλαγή της σύστασης της κινητής φάσης κατά τη χρωματογραφική ανάλυση του αντιβιοτικού καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) του στελέχους P. chlororaphis ToZa7 Χρόνος % Κινητής (min) Φάσης Β Ροή (ml/min) , , ,2 20,1 20 0,2 21,5 20 0,2 22,5 20 0,5 28,5 20 0,5 29,5 20 0,2 31,5 20 0,2 Ο ενέσιμος όγκος του κάθε δείγματος ήταν 20 μl και η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 40 o C. Ο φασματογράφος μάζας λειτούργησε σε συνθήκες SRM (selected reaction monitoring). Ο ιονισμός των αναλυτών επιτεύχθηκε με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionisation, ESI). Οι συνθήκες λειτουργίας του φασματογράφου μάζας δίνονται παρακάτω: Τάση ψεκασμού: 4000 V Θερμοκρασία τριχοειδούς σωλήνα: 325 o C Πίεση αερίου sheath (N 2): 30 μονάδες Πίεση βοηθητικού (Aux) αεριου (Ν 2): 10 μονάδες Πίεση αερίου σύγκρουσης (Ar): 1,5 mtorr Οι συνθήκες ανίχνευσης των υπό εξέταση ενώσεων δίνονται στον πίνακα 2.2. Πίνακας 2.2. Συνθήκες ανίχνευσης του καρβοξυλικού οξέος της φαιναζίνης (phenazine- 1-carboxylic acid, PCA) και του καρβοξαμιδίου της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) Χρόνος κατακράτησης (min) Μοριακό Ιόν Κύριο Ιόν Ενέργεια Σύγκρουσης (V) Δευτερεύον Ιόν Ενέργεια Σύγκρουσης (V) Πολικότητα PCA 1, PCN 10, Τα ίδια κλάσματα που αντιστοιχούσαν στο PCA και το PCN αναλύθηκαν περαιτέρω σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συζευγμένο σε σειρά με ανιχνευτή φασματοφωτόμετρο με διάταξη φωτοδιόδων (SPD-M20A) και φασματογράφο μάζας LCMS-2010 EV (Shimadzu, Kyoto, Japan). Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη Zorbax Eclipse Plus C18, 2,1 150 mm 3,5 μ (Agilent Technologies). Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα αποτελούμενο από 0,1% φορμικού οξέος σε νερό και ακετονιτρίλιο, σε αναλογία 3:7 και η ροή ορίστηκε στα 0,3 ml min -1. Η εισαγωγή των ενώσεων στον φασματογράφο μάζας πραγματοποιούταν με ιονισμό κάτω από ατμοσφαιρική πίεση και η πολικότητα ήταν θετική. Τα φάσματα μάζας αποκτήθηκαν σε πλήρη σάρωση (εύρος μάζας, m/z) και σε συνθήκες SIM (selected ion monitoring). Η τάση του ανιχνευτή ορίστηκε στα 1,4 kv. Τα δείγματα που συλλέχθηκαν διαλύθηκαν σε 1 ml ακετονιτρίλιο, διηθήθηκαν μέσω φίλτρων Whatman (Whatman, PuradiscTM 25 TF filters, 0,45 μm), μεταφέρθηκαν σε φιαλίδιο HPLC και 54

61 εγχύθηκαν στο σύστημα LC-DAD-MS. Ο συνολικός χρόνος ανάλυσης ήταν 25 λεπτά στοχεύοντας στην ανίχνευση και άλλων χημικών ενώσεων που ίσως υπήρχαν στα δείγματα Καθαρισμός και ταυτοποίηση αντιβιοτικού προδιγιοσίνη (2-methyl-3- pentyl-6-methoxyprodigiosin) από το στέλεχος S. rubidaea S55 Ο καθαρισμός και η ταυτοποίηση του αντιβιοτικού προδιγιοσίνη πραγματοποιήθηκαν με εκχύλιση και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Εκατό (100) ml υγρής καλλιέργειας σε LB, 48 ωρών, του S. rubidaea S55 φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 στροφές/λεπτό για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και εκχυλίστηκε με ίσο όγκο διαιθυλαιθέρα και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε στο 1 ml. Το σύστημα υγρής χρωματογραφίας φασματομετρία μάζας, όπως περιγράφηκε παραπάνω (Παράγραφος ). Η κινητή φάση αποτελούταν από 0,1 % μυρμηγκικού οξέος σε μίγμα νερού:ακετονιτριλίου 40:60 (v:v). Η ροή της κινητής φάσης ήταν 0,2 ml/min και ο όγκος έγχυσης 10 μl. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε στους 25 o C. Ο φασματογράφος μάζας λειτούργησε σε συνθήκες SRM (selected reaction monitoring) και ο ιονισμός των αναλυτών επιτεύχθηκε σε συνθήκες θετικού ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionisation, ESI). Η συλλογή των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με το λειτουργικό σύστημα Xcalibur (Thermo Electron Corporation). Οι συνθήκες λειτουργίας του φασματογράφου μάζας περιγράφηκαν στην παράγραφο Οι μεταπτώσεις και χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση και επιβεβαίωση της παρουσίας της ουσίας αντίστοιχα. Για την ταυτοποίηση της παρουσίας της υπό εξέτασης ένωσης στα εκχυλίσματα των καλλιεργειών και για τον ποσοτικό προσδιορισμό, χρησιμοποιήθηκε πρότυπη ουσία προδιγιοσίνης (prodigiosin reference standard, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) In vitro δράση της φαιναζίνης από το P. chlororaphis ToZa7 κατά του Forl και του C. rosea IK726 Η επίδραση της καθαρής φαιναζίνης που απομονώθηκε από το P. chlororaphis ToZa7 στην ανάπτυξη του Forl και του C. rosea IK726 μελετήθηκε συγκριτικά με αυτή του υπερκειμένου υγρής καλλιέργειας και των κυττάρων του βακτηρίου. Σε αυτή τη βιοδοκιμή χρησιμοποιήθηκαν πλάκες μικροτιτλοποίησης και ακολουθήθηκε η μέθοδος των Cuppers et al., (1997), με κάποιες σημαντικές παραλλαγές. Το βακτηριακό στέλεχος καλλιεργήθηκε για 48 ώρες, σε 7 ml LC, σε ανακινούμενο επωαστήρα. Η καλλιέργεια φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά, στις 6000 στροφές/λεπτό και στη συνέχεια 4 ml του υπερκείμενου μεταφέρθηκαν, υπό άσηπτες συνθήκες και διηθήθηκαν μέσω φίλτρου Whatman 0,22 μm (Whatman Inc., U.S.A.), σε νέο αποστειρωμένο σωλήνα, ώστε να αποκλειστούν οποιαδήποτε εναπομείναντα κατά τη φυγοκέντρηση βακτηριακά κύτταρα. Τα αποστειρωμένα διηθημένα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένες πλάκες μικροτιτλοποίησης, σε 5 φρεάτια, όπως περιγράφεται παρακάτω. Πέντε επαναλήψειςφρεάτια χρησιμοποιήθηκαν και για την καθαρισμένη φαιναζίνη (διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο ), σε συγκέντρωση 75μl/ ml. Συμπεριελήφθηκε ως μάρτυρας το εκχύλισμα θρεπτικού μέσου LC με οξικό αιθυλεστέρα. Από την προαναφερθείσα φυγοκέντρηση προέκυψε ίζημα βακτηριακών κυττάρων το οποίο 55

62 επαναδιαλύθηκε σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Τα βακτηριακά κύτταρα αραιώθηκαν σε δύο συγκεντρώσεις που αντιστοιχούσαν σε οπτική πυκνότητα 0.7 και 0.3, στα 620 nm. Τα κονίδια των μυκήτων παραλήφθηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο και η τελική συγκέντρωσή τους ρυθμίστηκε στο 1,5 x 10 4 κονίδια ml -1. Η ανάπτυξη των μυκήτων μετρήθηκε δια της μέτρησης της οπτικής πυκνότητας, σε μήκος κύματος 620 nm, και ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν επεμβάσεις που δεν περιείχαν τους αναστολείς. Το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές και οι στατιστικά σημαντικές διαφορές καθορίστηκαν με βάση την ελάχιστη σημαντική διαφορά και το κριτήριο του Bonferroni, σε επίπεδο σημαντικότητας 0, In vitro δράση της προδιγιοσίνης από το S. rubidaea S55 κατά του Forl και του C. rosea IK726 Η επίδραση της καθαρής προδιγιοσίνης που απομονώθηκε από το S. rubidaea S55 στην ανάπτυξη του Forl και του C. rosea IK726 μελετήθηκε συγκριτικά με αυτή του υπερκειμένου υγρής καλλιέργειας και των κυττάρων του βακτηρίου. Εκατό (100) ml υγρής καλλιέργειας σε LB, του στελέχους S. rubidaea S55, εκχυλίστηκαν με ίσο όγκο διαιθυλαιθέρα αφού απομακρύνθηκαν τα βακτηριακά κύτταρα όπως περιγράφεται στην προηγούμενη παράγραφο. Αφού συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού, το εκχύλισμα επαναδιαλύθηκε σε 4 ml μεθανόλη. Ακολούθησε καθαρισμός μέσω χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC), χρησιμοποιώντας ως μίγμα έκλουσης διάλυμα μεθανόλης:χλωροφορμίου:οξικού αιθυλεστέρα 5:30:65 (v:v:v) (Nakashima et al., 2005). Η κηλίδα που αντιστοιχούσε σε Rf= 0,61 αποξέθηκε και διαλύθηκε σε μεθανόλη. Το διηθημένο υπερκείμενο, τα βακτηριακά κύτταρα και τα κονίδια των μυκήτων παραλήφθηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο και η βιοδοκιμή έγινε σε πλάκες μικροτιτλοποίησης, όπως ακριβώς περιγράφεται στην εν λόγω παράγραφο. Το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές και οι στατιστικά σημαντικές διαφορές καθορίστηκαν με βάση το κριτήριο του Bonferroni και την ελάχιστη σημαντική διαφορά, σε επίπεδο σημαντικότητας 0, Αποτελέσματα EC 50 (Half maximal Effective Concentration) εκχυλισμάτων από υπερκείμενα καλλιέργειας των βακτηριακών στελεχών Με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία και παράλληλα πειράματα (βλ. ενότητα 4 της παρούσας διατριβής), επιλέχθηκαν 3 χρονικά σημεία από τα συνολικά 9 που μετρήθηκαν, ώστε να αναδεικνύεται η βιολογική σημασία των αποτελεσμάτων (Πίνακας 2.3.). Ενδιαφέρον παρουσίασαν τα αποτελέσματα που αφορούσαν τον Forl και τις τιμές EC 50 στις 96 ώρες, καθώς αυτές οι τιμές παρουσίασαν μια πτώση, για τα τρία στελέχη από τα τέσσερα. Φαίνεται δηλαδή να χρειάζεται μικρότερη δόση ώστε να επιτευχθεί το 50% της δράσης των ακατέργαστων εκχυλισμάτων των P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55 και B. cereus S76 στις 96 ώρες. 56

63 Πίνακας 2.3. In vitro αντιμυκητιακή δράση εκφραζόμενη ως τιμή EC 50 εκχυλισμάτων υγρής καλλιέργειας 72 ωρών των P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, S. marcescens PiHa5II και B. cereus S76 P. chlororaphis ToZa7 48h 96h 216h Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici x 27,33 y 22,33 38,33 S. rubidaea S ,67 S. marcescens PiHa5II 20, ,33 B. cereus S76 50,33 37,33 43,33 Clonostachys rosea IK726 P. chlororaphis ToZa ,67 48 S. rubidaea S55 11, S. marcescens PiHa5II 13, B. cereus S76 17,33 19,67 29 x τα εκχυλίσματα προστέθηκαν σε 6 διαφορετικές συγκεντρώσεις: 75μl ml -1, 50 μl ml -1, 37,5 μl ml -1, 25 μl ml -1, 12,5 μl ml -1, 6,25 μl ml -1, επί του μυκηλίου και των σπορίων των Forl και C. rosea IK726. Η ανάπτυξη των δύο μυκήτων μετρήθηκε με βάση την αύξηση της οπτικής πυκνότητας (OD620). Κάθε επέμβαση αποτελούταν από 5 επαναλήψεις και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. y οι αριθμοί αντιστοιχούν στην ποσότητα εκχυλίσματος (μl) που αναστέλλει την ανάπτυξη του μύκητα κατά 50% σε κάθε φρεάτιο της πλάκας μικροτιτλοποίησης (150 μl) Πρότυπες καμπύλες ανάπτυξης των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 Ο υπολογισμός του πληθυσμού των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 έγινε με δύο τρόπους. Στην πρώτη περίπτωση μετρήθηκε η αύξηση της οπτικής πυκνότητας του μέσου, σε 7 δειγματοληπτικές στιγμές (0, 4, 8, 12, 24, 48 και 72 ώρες). Όπως φαίνεται στην εικόνα 2.4, τα βακτηριακά στελέχη παρουσίασαν γρήγορη και έντονη ανάπτυξη στο διάστημα των 72 ωρών. Το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 παρουσίασε την μεγαλύτερη τιμή της οπτικής πυκνότητας και άρα του πληθυσμού στις 24 ώρες περίπου (Εικόνα 2.4). Ο μέγιστος αριθμός ζώντων κυττάρων συνέπιπτε χρονικά με τη μέγιστη οπτική πυκνότητα που καταγράφηκε. Έτσι, η δεύτερη μέθοδος, η μέτρηση των ζώντων αποικιών, έδειξε πως ο ρυθμός πολλαπλασιασμού αυτού του στελέχους, από τις 24 ώρες μέχρι τις 48 ώρες, είναι σταθερός και εμφανίζει στασιμότητα (Εικόνα 2.4). 57

64 Εικόνα 2.4. Ανάπτυξη του στελέχους Pseudomonas chlororaphis ToZa7 σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα LB μέσω της μέτρησης της οπτικής πυκνότητας στα 540 nm (επάνω) και μέσω της μέτρησης των ζώντων αποικιών με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων (κάτω), για 72 ώρες. Κάθε τιμή αντιστοιχεί στη μέση τιμή τριών επαναλήψεων. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση του μέσου όρου. Η ανώτατη τιμή οπτικής πυκνότητας για το S. rubidaea S55 μετρήθηκε στις 48 ώρες, αλλά ο μέγιστος αριθμός ζώντων αποικιών καταγράφηκε στις 24 ώρες με εμφάνιση αρκετά μεγάλης μείωσης (πάνω από μια λογαριθμική μονάδα) του αριθμού των CFU, στις 48 ώρες (Eικόνα 2.5). 58

65 Εικόνα 2.5. Ανάπτυξη του στελέχους Serratia rubidaea S55 σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα LB μέσω της μέτρησης της οπτικής πυκνότητας στα 540 nm (επάνω) και μέσω της μέτρησης των ζώντων αποικιών με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων (κάτω), για 72 ώρες. Κάθε τιμή αντιστοιχεί στη μέση τιμή τριών επαναλήψεων. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση του μέσου όρου Ταυτοποίηση της φαιναζίνης από το P. chlororaphis Toza7 Οι βέλτιστες συνθήκες SRM για την ανίχνευση του PCA και του PCN καθορίστηκαν με απευθείας έγχυση της ένωσης στον φασματογράφο μάζας. Απουσία σχετικής πρότυπης ουσίας, οι συνθήκες ανίχνευσης των αντιβιοτικών ενώσεων ανακτήθηκαν από τη βιβλιογραφία (Chin-A-Woeng et al., 1998). Εντοπίστηκε μια κορυφή που αντιστοιχεί στο ιόν [M + H] + (μοριακό ιόν) με λόγο μάζα προς φορτίο (m/z) ίσο με 225 το οποίο μετά από θραύση έδωσε 2 δευτερεύοντα ιόντα με m/z 207 και 179 αντίστοιχα. Επιλέχθηκαν 2 μεταπτώσεις SRM, και Υπό τις εφαρμοσθείσες χρωματογραφικές συνθήκες, το PCA εκλούστηκε στα 1,73 min. Όταν εγχύθηκε το κλάσμα του P. chlororaphis Toza7, προέκυψε μια μοναδική κορυφή στα 10,66 min για τις μεταπτώσεις και , δίνοντας ισχυρές ενδείξεις της παρουσίας του PCN στο δείγμα. Σχετικά με αυτήν την ένωση, η ολική σάρωση αλλά και η σάρωση σε συνθήκες SIM, της ανάλυσης LC-PDA-ESI-MS, έδειξαν ενδιαφέροντα δεδομένα. Ως εκ τούτου, το χρωματογράφημα συνολικής σάρωσης εμφάνισε μια χαρακτηριστική κορυφή στα 4,33 59

66 Ένταση Σήματος Ανιχνευτή min, η οποία αποδόθηκε στο PCN σύμφωνα με τα στοιχεία που παρατίθενται παρακάτω (Εικόνα 2.6). Χρόνος κατακράτησης (min) Εικόνα 2.6. Χρωματογράφημα ολικής σάρωσης του κλάσματος της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC) του εκχυλίσματος της υγρής καλλιέργειας του Pseudomonas chlororaphis ToZa7 που αντιστοιχεί σε Rf = 0,48. Οι κορυφές πριν τα 4.33 min αντιστοιχήθηκαν σε απειροελάχιστες ποσότητες ουσιών, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν ή/και ήταν παραπροϊόντα των μεθόδων καθαρισμού και ανάλυσης, και δεν επηρέασαν τη διαδικασία ταυτοποίησης της αντιβιοτικής ουσίας καθώς το δείγμα παρουσίαζε 92% καθαρότητα. Η επιβεβαίωση των παραπάνω ουσιών (PCN και διαλύτες) βασίστηκε αρχικά στα φάσματα μαζών των αντίστοιχων κορυφών (Εικόνα 2.7). Πιο συγκεκριμένα οι κορυφές (κάποιες από τις οποίες εντοπίστηκαν και στην ανίχνευση του PCΝ με LC-MS/MS) ήταν οι εξής: (1) στα m/z 224 εμφανίζεται η μοριακή κορυφή του ιόντος [Μ+Η] + του PCN, (2) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 246 αντιστοιχεί στο ιόν προσθήκης με νάτριο (sodium adduct) του PCN, τα οποία παρουσία του ακετονιτριλίου σχηματίζουν μια μικρή και ευδιάκριτη κορυφή, (3) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 225 αποδόθηκε στο αντίστοιχο ισότοπο (C 13) του PCN, (4) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 207, οφειλόταν στην απώλεια της άμινο-ομάδας (-NH 3), και (5) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 179 αποδόθηκε στον πρωτονιωμένο δακτύλιο της φαιναζίνης από τον οποίον είχε αφαιρεθεί η καρβοξαμιδική ομάδα. 60

67 Ένταση του σήματος 8.5 Inten.(x100,000) m/z Λόγος μάζας προς φορτίο, m/z Εικόνα 2.7. Φάσματα μάζας της ολικής σάρωσης της κορυφής που εκλούστηκε στα 4.33 min. Πιο συγκεκριμένα οι κορυφές ήταν οι εξής: (1) στα m/z 224 εμφανίζεται η μοριακή κορυφή του ιόντος [Μ+Η] + του PCN, (2) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 246 αντιστοιχεί στο ιόν προσθήκης νατρίου (sodium adduct) του PCN, (3) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 225 αποδόθηκε στο αντίστοιχο ισότοπο (C13) του PCN, και (4) η κορυφή-θραύσμα στα m/z 207, οφειλόταν στην απώλεια της άμινοομάδας. Για να ενισχυθούν ακόμη περισσότερο τα παραπάνω ευρήματα, πραγματοποιήθηκε μια αντίστοιχη μελέτη SIM η οποία παρακολούθησε αποκλειστικά τα ιόντα στα m/z 246, 225, 224, 207 και 179 (Εικόνα 2.8). Τα τελευταία έχουν αναφερθεί και από άλλους ερευνητές και χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη και ταυτοποίηση του PCN (Chin-A-Woeng et al., 1998). Στην εν λόγω ανάλυση και στις συνθήκες ιονισμού που εφαρμόστηκαν, εντοπίστηκαν ακριβώς τα ίδια ιόντα, αποδεικνύοντας έτσι την ευαισθησία της αναλυτικής μεθόδου. 61

68 Απορρόφηση Ένταση του σήματος Χρόνος κατακράτησης (min) Εικόνα 2.8. Χρωματογράφημα επιλεκτικής σάρωσης ιόντων (Selected Ion Monitoring, SIM) της ένωσης φαιναζίνη-1-καρβοξαμίδιο (PCN). Όσον αφορά στο φάσμα υπεριώδους (UV spectrum), γίνεται αντιληπτό ότι η μέγιστη απορρόφηση της ουσίας PCN που παράγει το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7, παρατηρείται στα 247 nm, γεγονός που συνάδει με αντίστοιχες δημοσιευμένες εργασίες που αφορούν στο PCN (Εικόνα 2.9; El-Sayed et al., 2008). mau 4.33/ nm Μήκος κύματος (nm) Εικόνα 2.9. Φάσμα υπεριώδους της ένωσης φαιναζίνη-1-καρβοξαμίδιο (PCN) Παραγωγή προδιγιοσίνης από το στέλεχος S. rubidaea S55 Οι βέλτιστες συνθήκες SRM για την ανίχνευση της προδιγιοσίνης (2-methyl-3-pentyl- 6-methoxyprodigiosin), καθορίστηκαν κάνοντας έγχυση της πρότυπης ουσίας στον φασματογράφο μάζας. Ο χρόνος κατακράτησης ήταν 3,43 min (Εικόνα 2.10). Μετά την 62

69 Ένταση του σήματος αναγωγή στο αρχικό δείγμα υπολογίστηκε η συγκέντρωση και φάνηκε ότι προκύπτουν 0,4339 mg προδιγιοσίνης από 100 ml υγρής καλλιέργειας. Χρόνος κατακράτησης (min) Εικόνα Χρωματογράφημα SIM της ένωσης προδιγιοσίνης (2-methyl-3-pentyl-6- methoxyprodigiosin) In vitro δράση της φαιναζίνης του P. chlororaphis ToZa7 και της προδιγιοσίνης του S. rubidaea S55 επί των Forl και C. rosea IK726 Τα αποτελέσματα της παρούσας βιοδοκιμής έδειξαν ότι η φαιναζίνη που απομονώθηκε προκαλεί απόλυτη αναστολή της ανάπτυξης του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl αλλά και του ωφέλιμου μύκητα C. rosea ΙΚ726 (Εικόνες 2.11 και 2.12). Ο C. rosea ΙΚ726 αναστάλθηκε εντονότερα (1,5 φορά) από το αιώρημα βακτηριακών κυττάρων στη μεγαλύτερη συγκέντρωση, ενώ η αναστολή του Forl προκλήθηκε από τη μικρότερη συγκέντρωση των βακτηριακών κυττάρων. Αξιοσημείωτο είναι το ότι το διηθημένο υπερκείμενο του P. chlororaphis ToZa7 προκάλεσε παρόμοια επίδραση επί της ανάπτυξης των δύο μυκήτων. Πιο συγκεκριμένα κατά τις πρώτες 12 ώρες παρουσιάζεται αναστολή της ανάπτυξης των μυκήτων. Ωστόσο, η παρουσία του διηθημένου υπερκείμενου της καλλιέργειας του P. chlororaphis ToZa7 φαίνεται να προάγει την ανάπτυξη, για τον μεν Forl από τις 24 ώρες και μέχρι τις 60 ώρες, για τον δε C. rosea IK726 από τις 24 ώρες και μέχρι τις 84 ώρες. Στη συνέχεια, παρατηρείται μια παρόμοια συμπεριφορά ως προς την αναστολή της ανάπτυξης και των δύο μυκήτων, με μια κατώτατη τιμή στις 108 ώρες περίπου και μια άνοδο από τις 120 έως τις 190 ώρες. Η παράλληλη πορεία των καμπυλών ανάπτυξης των C. rosea IK726 και του Forl στην παρούσα βιοδοκιμή, υποδηλώνει ένα παρόμοιο επίπεδο ανοχής/ ευαισθησίας των δύο μυκήτων στο P. chlororaphis ToZa7, 63

70 σύμφωνα με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς του Bonferroni (a= 0,05) (Εικόνες 2.13 και 2.14). Εικόνα In vitro μελέτη της δράσης κατά του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici των εξής: φαιναζίνη-1-καρβοξαμίδιο (PCN) που απομονώθηκε από καλλιέργεια του Pseudomonas chlororaphis ToZa7, διηθημένα υπερκείμενα υγρής καλλιέργειας του P. chlororaphis ToZa7, και αιωρήματα κυττάρων του P. chlororaphis ToZa7, σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ο μύκητας απουσία των αναστολέων. Η ανάπτυξη παρακολουθήθηκε μετρώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 620 nm. Εφαρμόστηκαν 5 επαναλήψεις της κάθε επέμβασης και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Η σύγκριση έγινε με βάση το κριτήριο του Bonferroni και της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (Least Significant Difference), LSD0.05= 0,751. Εικόνα In vitro μελέτη της δράσης κατά του Clonostachys rosea IK726 των εξής: φαιναζίνη- 1-καρβοξαμίδιο (PCN) που που απομονώθηκε από καλλιέργεια του Pseudomonas chlororaphis ToZa7, διηθημένα υπερκείμενα υγρής καλλιέργειας του P. chlororaphis ToZa7, και αιωρήματα κυττάρων του P. chlororaphis ToZa7, σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ο μύκητας απουσία των αναστολέων. Η ανάπτυξη παρακολουθήθηκε μετρώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 620 nm. Εφαρμόστηκαν 5 επαναλήψεις της κάθε επέμβασης και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Η σύγκριση έγινε με βάση το κριτήριο του Bonferroni και της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (Least Significant Difference), LSD0.05= 0,254. Στη βιοδοκιμή όπου μελετήθηκε η επίδραση της μερικώς καθαρισμένης αντιβιοτικής ουσίας προδιγιοσίνης, των υπερκείμενων, και των κυττάρων του S. rubidaea S55 κατά 64

71 των δύο προαναφερθέντων μυκήτων, ήταν αξιοσημείωτη η επίδραση της προδιγιοσίνης (PG). Πιο συγκεκριμένα, η επέμβαση με το αντιβιοτικό δεν διαφοροποιήθηκε από τον μάρτυρα στην περίπτωση του Forl (Εικόνα 2.13), ενώ στην περίπτωση του C. rosea IK726 είχε πιο έντονη ανασταλτική δράση (Εικόνα 2.14). Το διηθημένο υπερκείμενο της καλλιέργειας του εν λόγω στελέχους ανέστειλε και τους δύο μύκητες, ειδικά μετά το πέρας των 120 ωρών. Επιπλέον, και για τους δύο μύκητες, την ισχυρότερα ανασταλτική δράση επέδειξαν τα βακτηριακά κύτταρα που προστέθηκαν σε συγκέντρωση που αντιστοιχούσε σε οπτική πυκνότητα 0.3 (εικόνες 2.13 και 2.14). Εικόνα In vitro μελέτη της δράσης κατά του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici των εξής: μερικώς καθαρισμένη αντιβιοτική ένωση προδιγιοσίνη (PG) που απομονώθηκε από καλλιέργεια του Serratia rubidaea S55, διηθημένα υπερκείμενα υγρής καλλιέργειας του S. rubidaea S55, και αιώρημα κυττάρων του S. rubidaea S55, σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ο μύκητας απουσία των αναστολέων. Η ανάπτυξη παρακολουθήθηκε μετρώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 620 nm. Εφαρμόστηκαν 5 επαναλήψεις της κάθε επέμβασης και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Η σύγκριση έγινε με βάση το κριτήριο του Bonferroni και της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (Least Significant Difference), LSD0.05= 0,621. Εικόνα In vitro μελέτη της δράσης κατά του Clonostachys rosea IK726 των εξής: μερικώς καθαρισμένη αντιβιοτική ένωση προδιγιοσίνη (PG) που απομονώθηκε από καλλιέργεια του Serratia rubidaea S55, διηθημένα υπερκείμενα υγρής καλλιέργειας του S. rubidaea S55, και αιώρημα κυττάρων του S. rubidaea S55, σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ο μύκητας απουσία των αναστολέων. Η μυκητιακή ανάπτυξη παρακολουθήθηκε 65

72 μετρώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 620 nm. Εφαρμόστηκαν 5 επαναλήψεις της κάθε επέμβασης και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Η σύγκριση έγινε με βάση το κριτήριο του Bonferroni και της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (Least Significant Difference), LSD0.05= 0, Συζήτηση Τα αποτελέσματα των παραπάνω βιοδοκιμών έδειξαν την παρουσία ουσιών (πιθανόν αντιβιοτικών ή ενζύμων), στις υγρές καλλιέργειες των βακτηρίων που αναστέλλουν ή διακόπτουν την ανάπτυξη των υφών του Forl και του C. rosea IK726 ή/και τη βλάστηση των κονιδίων τους. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε αρχικά η επίδραση των τεσσάρων επιλεγμένων στελεχών P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, S. marcescens PiHa5II και B. cereus S76 κατά της ανάπτυξης του Forl και του C. rosea IK726, υπολογίζοντας τις τιμές EC 50 των εκχυλισμάτων των τεσσάρων αυτών βακτηρίων. Οι τιμές EC 50 στην παρούσα βιοδοκιμή, αντιστοιχούν στη συγκέντρωση εκείνη του εκχυλίσματος που προκαλεί 50 % αναστολή (τοξικότητα) στους δυο μύκητες που μελετήθηκαν. Όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα, η αναστολή των μυκήτων από τα βακτηριακά στελέχη επέρχεται με την επίδραση χαμηλότερων ποσοτήτων των εκχυλισμάτων στις 48 ώρες, ενώ στις 216 ώρες είναι αναγκαίες μεγαλύτερες ποσότητες του εκχυλίσματος για να ανασταλεί κατά 50% η ανάπτυξη του κάθε μύκητα, όπως αυτή εκτιμάται από την οπτική πυκνότητα. Στην περίπτωση του B. cereus S76 κατά του Forl συμβαίνει το αντίθετο καθώς στις πρώτες 48 ώρες η τιμή EC 50 = 50,33 μl εκχυλίσματος ενώ στις 216 ώρες η τιμή EC 50 = 43,33 μl. Στις 96 ώρες παρατηρείται μια μείωση της απαιτούμενης συγκέντρωσης των εκχυλισμάτων των P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76 που προκαλεί 50% τοξικότητα στον Forl. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύονται από τη βιοδοκιμή της μελέτης της βλάστησης των κονιδίων του Forl. Η συγκέντρωση των 75μl εκχυλίσματος του B. cereus S76 ανέστειλε πλήρως τη βλάστηση των κονιδίων του Forl για 12 ώρες και η ίδια συμπεριφορά παρατηρήθηκε στην καμπύλη δόσης-απόκρισης στην εν λόγω συγκέντρωση. Όπως παρατηρεί κανείς στα δεδομένα που προκύπτουν από τη βιοδοκιμή του υπολογισμού των τιμών EC 50 η συνήθης παρατήρηση είναι να μειώνονται οι αναγκαίες δόσεις για την αναστολή με την πάροδο του χρόνου και με την ανάπτυξη των μυκήτων. Ωστόσο, στην περίπτωση του P. chlororaphis ToZa7 κατά του Forl, παρατηρείται μια μείωση της αναγκαίας συγκέντρωσης στις 96 ώρες και μια αύξησή της στις 216 ώρες. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην εργασία των De muynck et al. (2004), όπου μελετήθηκε η επίδραση διηθημάτων υπερκειμένων καλλιεργειών, διαφόρων λακτοβάκιλων κατά των μυκήτων Aspergillus flavus MUCL 19945, Endomyces fibuliger MUCL 11443, Eurotium repens MUCL 15977, Penicillium paneum MUCL 40611, P. roqueforti MUCL και Rhizopus oryzae MUCL Σε αυτήν την εργασία κάποιοι βάκιλοι (Lactobacillus fermentum LMG6902, L. rhamnosus ATCC7469 και L. mesenteroides NRRL B-512F) παρουσίασαν μια αντίστοιχη συμπεριφορά με το P. chlororaphis ToZa7 καθώς η συγκέντρωση με την οποία επιτυγχανόταν η αντιμυκητιακή δράση αυξομειωνόταν με την πάροδο του χρόνου (De muynck et al., 2004). Μια ενδιαφέρουσα εξήγηση δίνεται στη βιβλιογραφία και αφορά στην επίδραση των οργανικών οξέων που παράγονται από τα βακτήρια κατά την αναστολή των μυκήτων. Τα οργανικά οξέα μπορούν να εισχωρήσουν στο κύτταρο του μύκητα στην αδιάστατη μορφή τους, ιδανικά σε ph του οποίου η τιμή είναι μικρότερη της pka των οξέων αυτών. Η τιμή pka των πιο συνηθισμένων οξέων που παράγονται από ωφέλιμα βακτήρια είναι γύρω στο 66

73 5.0 (Magnusson & Schnürer, 2001; Magnusson et al., 2003; De muynck et al., 2004). Ως εκ τούτου η αυξομείωση του ph μπορεί να εξηγήσει την αυξομείωση στην αντιμυκητιακή δραστηριότητα η οποία βασίζεται στην παραγωγή και δράση οργανικών οξέων. Η άλλη προσέγγιση που εξηγεί αυτά τα φαινόμενα, είναι αυτή της μελέτης της απόκρισης του μύκητα που δέχεται την επίδραση των τοξικών ουσιών που παράγουν τα βακτήρια. Όσον αφορά στον C. rosea IK726, είναι γνωστό πως διαθέτει μηχανισμούς αποτοξικοποίησης (Jensen et al. 2007; Kosawang et al. 2014; Dubey et al. 2014; Karlsson et al., 2015). Πιο συγκεκριμένα πρόκειται για έναν ωφέλιμο μύκητα που έχει μεγάλο αριθμό γονιδίων που κωδικοποιούν μεταφορείς ABC και οι οποίοι σχετίζονται φυλογενετικά με τις υποοικογένειες Β (πολυφαρμακευτική αντοχή, Multidrug resistance) και G (πλειοτροπική αντοχή, Pleiotropic Drug resistance) (Karlsson et al., 2015; Kamou et al., 2016). Η έκφραση 6 τέτοιων γονιδίων που ανήκουν στις υποοικογένειες B και G, αυξήθηκε μετά από έκθεση στη μυκοτοξίνη ζεαραλενόνη (zearalenone), στο μυκητοκτόνο boscalid ή σε δευτερογενείς μεταβολίτες του βακτηρίου P. chlororaphis (Karlsson et al., 2015; Kamou et al., 2016). Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την υπόθεση της ικανότητας αποτοξικοποίησης του συγκεκριμένου μύκητα. Παρόμοια εργασία παρουσίασαν και οι Schoonbek et al. (2002), όπου μελέτησαν την επίδραση 2 φαιναζινών (PCA και PCN) που παράγονται από είδη του γένους Pseudomonas spp., στον φυτοπαθογόνο μύκητα B. cinerea. Ανακάλυψαν πως το γονίδιο BcatrB που κωδικοποιεί έναν μεταφορέα ABC, είναι υπεύθυνο για την προστασία του μύκητα από τις προαναφερθείσες ουσίες, καθώς όχι μόνο σημειώθηκε επαγωγή του γονιδίου παρουσία των αντιβιοτικών, αλλά τα μεταλλάγματα ΔBcatrB ήταν πιο ευαίσθητα στα αντιβιοτικά σε σύγκριση με το αρχικό (parental) στέλεχος (Schoonbeek et al. 2002). Ομόλογα του γονιδίου αυτού είναι πιθανό να εντοπίζονται και στο είδος F. oxysporum (Schoonbeek et al. 2002). Το είδος αυτό μελετήθηκε ως προς την έκφραση των μεταφορέων ABC και μάλιστα η αλληλούχηση του προαγωγέα ενός μεταφορέα ABC του F. oxysporum έδειξε ότι οι αλληλουχίες διέφεραν ανάμεσα στα φυτοπαθογόνα και τα ωφέλιμα στελέχη (Fravel et al., 2008). Συμπερασματικά, όχι μόνο επιβεβαιώνεται η ικανότητα του μύκητα να υπερεκφράζει γονίδια που κωδικοποιούν μεταφορείς ABC όταν είναι αναγκαία η αποτοξικοποίηση του, αλλά μπορεί κανείς να συμπεράνει ότι κάποια γονίδια, όπως το FoABC1 μπορεί να εκφράζονται διαφορετικά ανάμεσα στα παθογόνα και τα στελέχη που είναι παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης (Fravel et al., 2008). Το γένος Fusarium spp., έχει μελετηθεί και ως προς τα είδη που προσβάλλουν τα σιτηρά. Για παράδειγμα έχει βρεθεί ότι ο μύκητας F. graminearum υπερεκφράζει το γονίδιο FgABC1 το οποίο τον προστατεύει από αντιμυκητιακές ενώσεις αλλά συμμετέχει και στη διαδικασία της προσβολής του σιταριού (Gardiner et al., 2013; Abou Ammar et al., 2013). Ως εκ τούτου, είναι ασφαλές να υποθέσουμε ότι οι αυξομειώσεις στις απαιτούμενες συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων για την αναστολή των Forl και C. rosea IK726, μπορεί να συσχετίζονται με τη διαδικασία αποτοξικοποίηση των κυττάρων των μυκήτων μέσω των μεταφορέων ABC. Μετά την επιβεβαίωση της ανασταλτικής δράσης των τεσσάρων στελεχών κατά του Forl, μελετήθηκε η κινητική της ανάπτυξης των στελεχών P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 ώστε να σχεδιαστούν οι καμπύλες ανάπτυξής τους. Οι καμπύλες αυτές καθορίζουν τις διάφορες φάσεις ανάπτυξης ώστε να μπορεί να υπολογιστεί σε ποια χρονική στιγμή παράγονται κάποιες ουσίες όπως τα αντιβιοτικά. Αυτά είναι προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού που παράγονται κατά τη φάση στασιμότητας (Madigan et 67

74 al., 2009), η οποία, για τα στελέχη που μελετήθηκαν, εντοπίζεται από τις 24 έως τις 48 ώρες περίπου. Οι περισσότεροι μικροοργανισμοί που διαβιούν στη ριζόσφαιρα παράγουν αντιβιοτικές ουσίες και αρκετοί παράγουν ταυτόχρονα και άλλους δευτερογενείς μεταβολίτες που διευρύνουν το οπλοστάσιό τους έναντι ανταγωνιστών (Chin-A-Woeng et al., 1998; Nair et al., 2004; Pal & McSpadden, 2006). Χαρακτηριστικό είναι το ότι κάποιες ουσίες φαίνεται ότι παράγονται σε καλλιέργεια του στελέχους, σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα το οποίο μπορεί μάλιστα να είναι εξειδικευμένο ώστε να εξασφαλίσει την παραγωγή αυτή (Madigan et al., 2009). Ανατρέχοντας στη βιβλιογραφία φαίνεται ότι η παραγωγή φαιναζινών συνοδεύεται από πράσινη χρωστική στην καλλιέργεια των ειδών του γένους Pseudomonas spp. σε στερεό υπόστρωμα (Chin-A-Woeng et al., 1998; Saha et al., 2008) ενώ η προδιγιοσίνη είναι έντονα ερυθρή έως ιώδης (Bennet & Bentley 2000; Khafanari et al., 2006; Siva et al., 2012). Με βάση τις μακροσκοπικές παρατηρήσεις των καλλιεργειών των στελεχών P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, μελετήθηκε η ικανότητα παραγωγής δύο γνωστών αντιβιοτικών από τα εν λόγω στελέχη, της φαιναζίνης-1-καρβοξαμίδιο (PCN) και της προδιγιοσίνης αντίστοιχα. Για την απομόνωση αντιβιοτικών από υγρές καλλιέργειες των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης, ακολουθήθηκαν καθιερωμένες τεχνικές ανάλυσης. Η επιλογή της HPLC ως μεθόδου προσδιορισμού των αντιβιοτικών είναι συνήθης στην έρευνα. Υπάρχουν πολλές αναφορές επιτυχημένου προσδιοριμού αρκετών αντιβιοτικών με την εν λόγω μέθοδο, ακόμα και in situ, όπως της φαιναζίνης-1- καρβοξυλικού οξέος (phenazine-1-carboxylic acid), της ερμπικολίνης Α (herbicolin A), πυρρολνιτρίνης (pyrrolnitrin), πυολουτεορίνης (pyoluteorin), σουρφακτίνης (surfactin) και της διακετυλοφλορογλουκινόλης (DAPG) (ανασκόπηση από τους Thomashow et al., 1997). Πιο συγκεκριμένα, η δράση των φαιναζινών που παράγονται από στελέχη του είδους P. chlororaphis, κατά των εδαφογενών φυτοπαθογόνων μυκήτων μελετάται εκτενώς τις τελευταίες τρεις δεκαετίες (Thomashow et al., 1990; Pierson & Thomashow, 1992; Chin-A-Woeng et al., 1998; Hökeberg et al., 1998; Dekkers et al., 2000; Kamilova et al., 2006). Όπως φαίνεται και στη βιοδοκιμή πλάκας μικροτιτλοποίησης της παρούσας διατριβής, η παραγωγή φαιναζίνης, ως επιμέρους συστατικού ενός πλούσιου χημικού μίγματος από ανασταλτικές ουσίες, φαίνεται να συνδέεται άμεσα με την αναστολή της ανάπτυξης του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl. Η δράση του καρβοξαμιδίου της φαιναζίνης (PCN) του P. chlororaphis PCL 1391, εναντίον του παθογόνου μύκητα F. oxysporum f. sp. radicis - lycopersici (Forl), συνίσταται στην επίσπευση της γήρανσης του μυκηλίου με αύξηση του αριθμού των χυμοτοπίων, στη διόγκωση των υφών, στη διαταραχή του Spitzenkorper και στην αύξηση των διακλαδώσεων των υφών (Bolwerk et al., 2003). Στη βιοδοκιμή σε πλάκα μικροτιτλοποίησης που περιγράφεται στην παρούσα διατριβή (παράγραφος 2.5.5), μελετήθηκε η κατά 95% καθαρισμένη αντιβιοτική ουσία φαιναζίνη- 1-καρβοξαμίδιο κατά του Forl και η αναστολή ήταν σχεδόν απόλυτη. Καταλαβαίνει συνεπώς κανείς πως η δράση του στελέχους ΤοΖα7 στα πειράματα in planta σε φυτά τομάτας, οφείλεται πιθανώς στην παραγωγή της φαιναζίνης. Πέρα από τον ρόλο αυτόν όμως, οι φαιναζίνες σχετίζονται και με το οικολογικό πλεονέκτημα κατά τον αποικισμό της ριζόσφαιρας των ειδών που τις παράγουν (Mazzola et al., 1992; Pierson & Pierson, 1996; 2010). Οι Mazzola et al. (1992), απέδειξαν πως σε αποστειρωμένα εδάφη, απουσία μεγάλων πληθυσμών ριζοβακτηρίων, τα μεταλλαγμένα στελέχη που δεν παρήγαγαν φαιναζίνη είχαν την ίδια ικανότητα αποικισμού με αυτά που παρήγαγαν, ενώ όταν ο 68

75 ανταγωνισμός ήταν εντονότερος, τα στελέχη που ήταν ικανά να παράγουν το αντιβιοτικό υπερίσχυσαν εμφανώς έναντι των άλλων (Mazzola et al., 1992). Εκτός από τον ρόλο τους ως τοξικών ουσιών για άλλους μικροοργανισμούς, τα αντιβιοτικά επηρεάζουν και την οξειδοαναγωγική δραστηριότητα στη ριζόσφαιρα (Hernandez et al., 2004). Οι φαιναζίνες είναι οξειδοαναγωγικά ενεργές ενώσεις και επηρεάζουν έμμεσα τη διαθεσιμότητα του σιδήρου και άλλων θρεπτικών στοιχείων, όπως τα φωσφορικά άλατα, κάποια ίχνη μετάλλων αλλά και οργανικές ενώσεις, τόσο για τα άλλα ριζοβακτήρια όσο και για το ίδιο το φυτό (Hernandez et al., 2004). Αυτός ο ρόλος των οξειδοαναγωγικά ενεργών αντιβιοτικών ενώσεων μπορεί να εξηγήσει το οικολογικό πλεονέκτημα που εμφανίζουν τα στελέχη που τα παράγουν καθώς αυτή η ικανότητα να μεταφέρουν ηλεκτρόνια και να «ελέγχουν» τα θρεπτικά στοιχεία τους παρέχει ένα αξιοσημείωτο προβάδισμα. Ένας ακόμη πολύ σημαντικός ρόλος των φαιναζινών είναι αυτός που έχουν στην αίσθηση απαρτίας (QS), δηλαδή στον μηχανισμό διακυτταρικής σηματοδότησης μεταξύ των βακτηρίων ώστε να μεταβάλλεται η συμπεριφορά τους ανάλογα με τις ανάγκες του περιβάλλοντος και να σχηματίζουν βιομεμβράνες (Bogino et al., 2013). Μεγάλος αριθμός βακτηρίων χρησιμοποιούν μόρια μικρού μοριακού βάρους ώστε να σηματοδοτήσουν την αίσθηση απαρτίας και να ρυθμίσουν την έκφραση στοχευμένων γονιδίων (Miller et al., 2001). Στην περίπτωση του στελέχους P. chlororaphis (syn. aureofaciens) 30-84, έχουν μελετηθεί δύο συστήματα που ελέγχουν την αίσθηση απαρτίας (QS), τα συστήματα PhzR/PhzI (Pierson et al., 1994; Wood & Pierson, 1996) και CsaR/CsaI (Zhang & Pierson, 2001). Το σύστημα PhzR/PhzI ελέγχει την παραγωγή φαιναζίνης σε συνάρτηση με την αίσθηση απαρτίας και το CsaR/CsaI ρυθμίζει ένα αντίστοιχο σύστημα QS μέσω της παραγωγής πρωτεάσης (Pierson et al., 1994; Wood & Pierson, 1996; Zhang & Pierson, 2001). Οι Maddula et al., (2006) απέδειξαν ότι αν και τα δύο συστήματα σχετίζονται με την αίσθηση απαρτίας του στελέχους P. chlororaphis 30-84, η ικανότητα δημιουργίας βιομεμβράνης επηρεάζεται κυρίως από την παραγωγή φαιναζίνης. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η ικανότητα του στελέχους S. rubidaea S55 να παράγει το αντιβιοτικό προδιγιοσίνη. Πρόκειται για μια ένωση της οποίας ο ρόλος εντός του μικροοργανισμού ή για τον μικροοργανισμό, παραμένει άγνωστος. Μετά από εκτενή βιβλιογραφική ανασκόπηση, διαπιστώνει κανείς πως οι δημοσιεύσεις αφορούν κυρίως τις αντιμυκητιακές, αντιβακτηριακές, αντιπρωτοζωικές, αντικαρκινικές και εντομοτοξικές ιδιότητές της (Bennet & Bentley, 2000; Montaner & Pérez-Tomás, 2001; Furstner, 2003; Khanafari et al., 2006; Pandey et al., 2009; Wang et al., 2012; Zhou et al., 2016). Ως εκ τούτου, το επιστημονικό ενδιαφέρον για την ουσία αυτήν εντοπίζεται κυρίως στη δυνατότητα της κλινικής εφαρμογής, στο πεδίο της ιατρικής, του αντιβιοτικού και των συνθετικών παραγώγων του τα οποία παρουσιάζουν ιδιότητες που διαχωρίζονται από αυτές των υπόλοιπων γνωστών φαρμάκων (Siva et al., 2012; Darshan & Manonmani, 2015; Zhou et al., 2016), αφήνοντας αυτό της φυτοπροστασίας ακόμα ανεξερεύνητο. Κάποιες από τις προαναφερθείσες ιδιότητες, ωστόσο, θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην αύξηση του οικολογικού πλεονεκτήματος των βακτηρίων που την παράγουν, μέσω του ανταγωνισμού για νέες οικοφωλεές. Αναφορικά με τη δράση της προδιγιοσίνης στο πλαίσιο της βιολογικής καταπολέμησης φυτοπαθογόνων, ο ρόλος της δεν είναι ξεκάθαρος. Ωστόσο σε κάποιες ελάχιστες περιπτώσεις, σε βιοδοκιμές in vitro, βρέθηκε πως η ικανότητα καταστολής του μύκητα Didymella applanata από το S. marcescens βασίζεται κυρίως στην ποσότητα προδιγιοσίνης που παράγεται από αυτό (Duzhak et al., 2012). 69

76 Έχουν αναφερθεί όμως πολύ ενδιαφέρουσες ιδιότητές της, όπως η ενίσχυση της δράσης των χιτινασών που παράγει το στέλεχος S. marcescens B2, κατά των φυτοπαθογόνων F. oxysporum f. sp. cyclaminis και B. cinerea (Someya et al., 2000; 2001). Επιπλέον, οι Meschke et al. (2012) απέδειξαν πως η καθαρισμένη ενδεκυλ-προδιγιοσίνη (undecylprodigiosin) μειώνει σημαντικά τον σχηματισμό μικροσκληρωτίων από τον φυτοπαθογόνο μύκητα V. dahliae, σε βιοδοκιμές in vitro. Η προδιγιοσίνη και η ενδεκυλπροδιγιοσίνη ανήκουν στην ομάδα των γραμμικών τριπυρρολών (Stankovic et al., 2014). Σε επιπλέον in planta βιοδοκιμές σε φυτά Arabidopsis thaliana, έδειξαν πως η παρουσία του βακτηρίου Streptomyces lividans που παρήγαγε την ενδεκυλ-προδιγιοσίνη, μείωσε αποτελεσματικά την ποσότητα του μυκηλίου και τον αριθμό μικροσκληρωτίων σε ρίζες (Meschke et al. 2012). Επίσης μια πολύ σημαντική ιδιότητα είναι αυτή του ρυθμιστή ενέργειας του κυττάρου σε είδη του γένους S. marcescens, δηλαδή της αποδέσμευσης της μεταφοράς πρωτονίων και της σύνθεσης ATP, μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, μειώνοντας έτσι την παραγωγή ATP μέσω της διαδικασίας που καλείται απορροή ενέργειας (energy spilling) (Russell, 2007; Haddix et al. 2008). Ως εκ τούτου, η προδιγιοσίνη θα μπορούσε να μειώσει την παραγωγή των ενεργών μορφών οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) εντός του οργανισμού που την παράγει. Η παραγωγή των ROS συσχετίζεται με την έντονη παραγωγή (έκρηξη) ενέργειας μετά την επίδραση τοξικών ουσιών που προκαλούν οξειδωτική καταπόνηση όπως η τετρακυκλίνη, η καναμυκίνη κ.α. (Stankovic et al., 2014). Ως εκ τούτου, ρυθμίζοντας την παραγωγή ενέργειας, η προδιγιοσίνη συμβάλλει στην αποτοξικοποίηση/αντοχή σε αντιβιοτικές ουσίες (Stankovic et al., 2014). Ανάλογα αποτελέσματα περιγράφονται και στην εργασία των Schloss et al. (2010), οι οποίοι απέδειξαν ότι βακτήρια από εδάφη της Αλάσκας τα οποία παρήγαγαν προδιγιοσίνη επέδειξαν μεγαλύτερη αντοχή σε αντιβιοτικά της ομάδας β-λακτάμης (Schloss et al., 2010). Εκτός από την προαναφερθείσα ιδιότητα να προστατεύει τον μικροοργανισμό που την παράγει από τις ROS, στα στελέχη Vibrio sp. DSM και Streptomyces sp. JS520 έχει αποδειχθεί ότι η προδιγιοσίνη παρέχει προστασία και από τις υπεριώδεις ακτίνες (Boric et al. 2011; Stankovic et al. 2012). Με βάση τα παραπάνω καταλαβαίνει κανείς ότι η ουσία αυτή είναι σημαντική προσθήκη στο οπλοστάσιο των βακτηριακών ειδών που την παράγουν και αξίζει να σημειωθεί ότι τα στελέχη του S. marcescens που εντοπίζονται στο φυσικό περιβάλλον την παράγουν κατά πλειοψηφία, ενώ εκείνα που δεν την παράγουν (τα μη χρωματισμένα στελέχη) είναι αυτά που συνήθως απομονώνονται εκτός της οικοφωλεάς τους, όπως για παράδειγμα τα νοσοκομειακά στελέχη (Hejazi & Falkiner, 1997). Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία διαπιστώθηκε η παραγωγή δύο αντιβιοτικών ενώσεων,της φαιναζίνης και της προδιγιοσίνης, που είναι σημαντικές για το εκάστοτε βακτηριακό στέλεχος καθώς αφιερώνεται ένα μεγάλο μέρος του γενετικού υλικού αλλά και της ενέργειας του καθενός στην παραγωγή αυτών (Chin-A-Woeng et al., 2001a; 2001b; Stankovic et al., 2014). Τα αποτελέσματα της σχετικής βιοδοκιμής της σε πλάκες μικροτιτλοποίησης αποδεικνύουν πως σε καθαρισμένη μορφή η φαιναζίνη αναστέλλει πλήρως την ανάπτυξη των δύο μυκήτων, του Forl και του C. rosea IK 726, τονίζοντας την αντιμικροβιακή ιδιότητά της. Η μερικώς καθαρισμένη προδιγιοσίνη από την άλλη αν και καταφέρνει να μειώσει την ανάπτυξη των μυκήτων με την πάροδο του χρόνου, δεν εμφανίζει τόσο εντυπωσιακά αποτελέσματα. Το γεγονός ότι τόσο το διηθημένο υπερκείμενο του S. rubidaea S55, όσο και τα κύτταρα τα ίδια καταφέρνουν μια 70

77 σημαντικότερη αναστολή ανάπτυξης των μυκήτων μπορεί να εξηγηθεί μέσω της θεωρίας της συνεργιστικής δράσης της προδιγιοσίνης με άλλες ουσίες που παράγει το εκάστοτε στέλεχος (Someya et al., 2000; 2001). Σε κάθε περίπτωση είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι τόσο η φαιναζίνη όσο και η προδιγιοσίνη είναι αντιβιοτικές ουσίες, προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των βακτηρίων που προαναφέρθηκαν, και ως τέτοιες είναι εξαιρετικά ευαίσθητες υπό μη ελεγχόμενες συνθήκες, όπως είναι ο αγρός, συνεπώς η παραγωγή και συμπεριφορά τους σε ανοιχτό αγρό δεν μπορεί να προβλεφθεί (Thomashow et al., 1997; Stankovic et al., 2014). 71

78 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών και ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S Περίληψη Μελετήθηκε η ικανότητα παραγωγής αντιμικροβιακών ουσιών, πλην των αντιβιοτικών, από τα βακτηριακά στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76, στο πλαίσιο του προσδιορισμού του τρόπου δράσης τους ως παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης. Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθηκε η ικανότητά τους να παράγουν σιδηροφόρους, υδροκυάνιο και ένζυμα με αντιμυκητιακή δράση (χιτινάσες, πρωτεάσες), αλλά και η ικανότητα παραγωγής ρυθμιστών ανάπτυξης των φυτών. Κατ επέκταση, διερευνήθηκε η επίδραση των στελεχών στην προαγωγή της αύξησης φυτών τομάτας, ρεπανιού και σιταριού καθώς και η επίδραση τους στη συσσώρευση 7 βασικών θρεπτικών στοιχείων, του αζώτου (Ν), άνθρακα (C), θείου (S), καλίου (Κ), ασβεστίου (Ca), μαγνησίου (Mg) και φωσφόρου (P) από τα φυτά ρεπανιού. Διαπιστώθηκε ότι όλα τα στελέχη παράγουν σιδηροφόρους με επικρατέστερα τα P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, ενώ μόνο το P. chlororaphis ToZa7 παράγει υδροκυάνιο. Το στέλεχος S. marcescens PiHa5II έδειξε ελαφρώς αυξημένη παραγωγή εξωχιτινασών ενώ όλα τα στελέχη είναι ικανά να παράγουν πρωτεάσες και ινδολοξικό οξύ (ΙΑΑ). Το βακτήριο S. marcescens PiHa5ΙΙ επηρέασε σημαντικά και την απορρόφηση του καλίου στα φύλλα και η επέμβαση με το P. chlororaphis ToZa7 αύξησε σημαντικά την απορρόφησή του μαγνησίου σε αυτά. Όσον αφορά στο υπόγειο τμήμα, παρατηρήθηκαν διαφορές μόνο στις μετρήσεις απορρόφησης του ασβεστίου και του φωσφόρου, τα οποία αυξήθηκαν μετά από τον εμβολιασμό με τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76, αντίστοιχα ενώ το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 επιπλέον, αυξάνει σημαντικά τη συσσώρευση του αζώτου και του άνθρακα. Τέλος θετική επίδραση στην αύξηση όλων των φυτών που μελετήθηκαν, διαπιστώθηκε για το στέλεχος S. marcescens PiHa5II, ενώ το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 δεν φάνηκε να προάγει την αύξηση κανενός φυτού Εισαγωγή Παραγωγή αντιμικροβιακών ενώσεων από τα βακτηριακά στελέχη Παραγωγή σιδηροφόρων Ο σίδηρος είναι ένα πολύ βασικό στοιχείο για όλους τους οργανισμούς που διαβιούν στο έδαφος και η έλλειψή του δεν οφείλεται στη μη ύπαρξή του σε αυτό, αλλά στη χαμηλή του βιοδιαθεσιμότητα. Αυτή προκαλείται από την αργή ταχύτητα των αντιδράσεων διάλυσης των ορυκτών που φέρουν σίδηρο καθώς και από τη χαμηλή διαλυτότητα του στοιχείου. Σε ουδέτερα ή βασικά εδάφη (ανθρακούχα) το πρόβλημα εντείνεται (Kraemer, 2004). Η παραγωγή σιδηροφόρων ως απόκριση στην έλλειψη σιδήρου (για περισσότερα, βλέπε παράγραφο ) είναι σύνηθες φαινόμενο στους αερόβιους μικροοργανισμούς (Neilands et al., 1987). Για παράδειγμα, από 302 διαφορετικές απομονώσεις φθοριζουσών 72

79 ψευδομονάδων, τα 297 στελέχη (98%) παρήγαγαν σιδηροφόρους σε συνθήκες έλλειψης σιδήρου (Cocozza & Ercolani, 1997). Τα βακτήρια που παράγουν σιδηροφόρους απομονώνονται από τη ριζόσφαιρα του φυτού και αποδεικνύεται ότι σχηματίζουν σύμπλοκα σιδήρου όταν καλλιεργηθούν σε μέσο με κατάλληλο δείκτη όπως το Chrome Azurol S (CAS) (Koedam et al., 1994; Milagres et al., 1999; Calvente et al., 2001). Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί κατά τη μέτρηση της συσσώρευσης των σιδηροφόρων στη ριζόσφαιρα και αυτοί οφείλονται στην έλλειψη εξειδικευμένων μεθόδων εντοπισμού για περισσότερους του ενός τύπους σιδηροφόρων. Οι συνηθέστερες μέθοδοι παρακολούθησης είναι οι ορολογικές και η χρήση γονιδίων ανταποκριτών (Crowley, 2006). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί αυτό του Marschner και των συνεργατών του (1997) οι οποίοι έδειξαν ότι σε συνθήκες έντονης έλλειψης σιδήρου, στελέχη ψευδομονάδων παρήγαγαν ποσότητα σιδηροφόρων που εντός 24 ωρών υπερέβη το βάρος της κυτταρικής βιομάζας. Σε συνθήκες αγρού τα αποτελέσματα αυτά είναι λιγότερο εντυπωσιακά καθώς η καταπόνηση δεν είναι τόσο έντονη όσο σε ελεγχόμενες συνθήκες in vitro (Marshner et al., 1997). Τα ριζοβακτήρια παρουσιάζουν μεγάλες απαιτήσεις σε σίδηρο κατά τη φάση της ταχείας ανάπτυξής τους σε εκκρίσεις ρίζας και, αν αυτός είναι περιορισμένος στις συγκεκριμένες μικροθέσεις, η παραγωγή σιδηροφόρων θα προαχθεί σε βαθμό ώστε να καλυφθούν οι ανάγκες των βακτηρίων. Σε τέτοια περίπτωση, η δέσμευση του διαθέσιμου σιδήρου καταστέλλει άμεσα την ανάπτυξη των φυτοπαθογόνων μυκήτων. Αναλυτικότερα, οι σιδηροφόροι των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης αποτρέπουν τους πληθυσμούς των φυτοπαθογόνων μυκήτων από το να αυξηθούν σε αριθμό που να είναι ικανοί να προκαλέσουν ασθένεια, στερώντας τους το σίδηρο (Fgaier & Eberl, 2009). Ένας ακόμη έμμεσος μηχανισμός αντιμετώπισης φυτοπαθογόνων μυκήτων που σχετίζεται με το σίδηρο είναι η επαγωγή διασυστηματικής αντοχής στα φυτά-ξενιστές (Leeman et al., 1996; Van Loon et al., 1998; Beneduzi et al., 2012). Όπως τονίστηκε παραπάνω (παράγραφος ), ο τύπος της αντοχής των φυτών που ενεργοποιείται δια της οδού του σαλικυλικού οξέος (SA) μπορεί να προκληθεί και από κάποια ριζοβακτήρια (De Vleesschauwer & Höfte, 2009; Beneduzi et al., 2012). Αυτά τα συμπεράσματα ενισχύονται από παλαιότερες παρατηρήσεις κατά τις οποίες παρατηρήθηκε ενεργοποίηση αντοχής που σηματοδοτείται από το SA σε εδάφη με έλλειψη σιδήρου (Leeman et al., 1996; Van Loon et al., 1998; Beneduzi et al., 2012). Μερικά είδη του γένους Pseudomonas spp., παράγουν τον σιδηροφόρο πυοχελίνη (pyochelin) η οποία αποτελείται από ένα κυστεϊνικό πεπτίδιο, υποκατάστατο του SA και το SA θεωρείται ενδιάμεση ένωση στην παραγωγή της πυοχελίνης (Cox et al., 1981; Ankenbauer & Cox, 1988). Ο σιδηροφόρος αυτός παράγεται σε συνθήκες έλλειψης σιδήρου και έτσι συσσωρεύεται και σημαντική ποσότητα SA (Visca et al., 1993). Αντίστοιχο παράδειγμα είναι ο σιδηροφόρος ψευδοβακτίνη (pseudobactin) του στελέχους P. putida WCS358 (Leeman et al., 1996; Press et al., 2001) ο οποίος συνδέεται με την ενεργοποίηση αντοχής ως απόκρισης στο SA, σε συνθήκες έλλειψης σιδήρου, στο ρεπάνι. Ομοίως, οι Press et al. (1997) κατέγραψαν την επαγωγή αντοχής στην ανθράκωση της αγγουριάς από το στέλεχος S. marcescens , επίδραση η οποία μειωνόταν με την προσθήκη σιδήρου στο θρεπτικό μέσο. Αυτή η ανακάλυψη της δευτερογενούς δράσης των σιδηροφόρων κατά την απόκριση SAR, ή πιο σωστά κατά την αντοχή που σηματοδοτείται από το SA, 73

80 έχει οδηγήσει στην ανάγκη επαναπροσδιορισμού του τρόπου δράσης τους εναντίον φυτοπαθογόνων μυκήτων. Η συνηθέστερη βιοδοκιμή ελέγχου ικανότητας παραγωγής σιδηροφόρων από ριζοβακτήρια, βασίζεται στον ανταγωνισμό για τη δημιουργία δεσμού μεταξύ του συμπλόκου του σιδήρου με το δείκτη Chrome Azurol S (CAS) (Schwyn & Neilands, 1987) και του σιδηροφόρου που παράγει ο μικροοργανισμός. Ο σίδηρος απομακρύνεται από τον CAS, καθώς χημικά συγγενεύει περισσότερο με τον σιδηροφόρο και επέρχεται αλλαγή του χρώματος (συνήθως από κυανό σε πορτοκαλί). Οι Milagres, Napoleão και Machuca (1999), ενσωμάτωσαν το δείκτη χρώσης στο στερεό θρεπτικό μέσο ώστε να γίνεται άμεση επίστρωση του μικροοργανισμού και έτσι το στερεό υπόστρωμα να λειτουργεί ως εκλεκτικό μέσο επιλογής βακτηρίων που παράγουν σιδηροφόρους (Ames-Gottfred et al., 1989; Alexander & Zuberer, 1991; Hirst et al., 1991; Manninen & Mattila-Sandholm, 1994; Payne, 1994) Παραγωγή υδροκυανίου Τα ριζοβακτήρια παράγουν μεγάλο εύρος δευτερογενών μεταβολιτών, στους οποίους περιλαμβάνονται και κάποιες τοξίνες. Μια τέτοια τοξίνη είναι και το υδροκυάνιο το οποίο συντίθεται κυρίως από Πρωτεοβακτήρια και κάποια Κυανοβακτήρια (Blumer & Haas, 2000). Η παραγωγή υδροκυανίου από Πρωτεοβακτήρια έχει αρκετά χαρακτηριστικά δευτερογενούς μεταβολισμού (Castric, 1975). Αρχικά το υδροκυάνιο δεν διαδραματίζει κάποιον εμφανή ρόλο στην επιβίωση του μικροοργανισμού και η βέλτιστη παραγωγή του συμβαίνει σε συνθήκες περιορισμένου οξυγόνου. Επιπλέον, ο οργανισμός που παράγει την τοξίνη είναι ανθεκτικός σε αυτήν. Τέλος η κυανογένεση παρέχει στον οργανισμό που παράγει το υδροκυάνιο οικολογικό πλεονέκτημα καθώς προκύπτει μια έντονα τοξική ουσία για όλους τους αερόβιους μικροοργανισμούς, που παρεμποδίζει τη λειτουργία της αναπνοής (Bakker & Schippers, 1987). Πιο συγκεκριμένα, το υδροκυάνιο αντιδρά ισχυρά με την οξειδάση του κυτοχρώματος C και με άλλα μεταλλο-ένζυμα, γεγονός που οδηγεί στην αναχαίτηση της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και άρα εμποδίζεται η μεταφορά ενέργειας και αναστέλλεται η αναπνοή στους αερόβιους μικροοργανισμούς. Αξιοσημείωτο είναι το ότι παρά την υψηλή τοξικότητα της ουσίας, δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις φυτοτοξικότητας. H παραγωγή του υδροκυανίου ρυθμίζεται αυστηρά στα βακτήρια, τόσο ώστε, η τελική συγκέντρωση τοπικά να μην ξεπερνάει το 1 mm, ποσότητα η οποία είναι ανεκτή από τα περισσότερα ζώντα κύτταρα των ανώτερων οργανισμών (Blumer & Haas 2000). Επιπλέον, υπό φυσιολογικές συνθήκες και ph 7, το κυανίδιο υπάρχει με τη μορφή υδροκυανίου (HCN), με βάση την τιμή pka που ισούται με 9,3. Μια άλλη εξήγηση είναι το ότι το HCN, είναι πτητική ουσία που είναι λιγότερο πυκνή από τον ατμοσφαιρικό αέρα και άρα μπορεί γρήγορα να διασπαρεί στο περιβάλλον, άρα δε συσσωρεύεται τοπικά σε μεγάλες ποσότητες. Το HCN παράγεται κυρίως από είδη βακτηρίων του γένους Pseudomonas, μέσω της οξείδωσης της γλυκίνης. Παρουσία αυτής και του τρισθενούς σιδήρου η παραγωγή υδροκυανίου αυξάνεται (Castric, 1977). Οι σύγχρονες τεχνικές εντοπισμού υδροκυανίου σε βακτηριακές καλλιέργειες χρησιμοποιούν κυρίως χρωματομετρικές μεθόδους, είτε απευθείας στο υπερκείμενο των καλλιεργειών, είτε μετά από απόσταξη και καθαρισμό της τοξίνης (Askeland & Morrison, 74

81 1983). Για αυτόν τον σκοπό έχουν αναπτυχθεί αρκετά κιτ ανίχνευσης του υδροκυανίου σε υγρά θρεπτικά μέσα Παραγωγή ενζύμων με αντιμυκητιακή δράση Το κυτταρικό τοίχωμα των μυκήτων είναι μία δυναμική δομή που προστατεύει τα κύτταρα από τις αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις παρέχοντας την απαραίτητη μηχανική στήριξη. Η ακαμψία αυτή οφείλεται κατά κύριο λόγο στη χιτίνη, η οποία είναι βασικό δομικό στοιχείο του κυτταρικού τοιχώματος, αν και εντοπίζεται σε σχετικά μικρές συγκεντρώσεις σε αυτό. Ενδεικτικά η χιτίνη αποτελεί μόνο το 1-2% του ξηρού βάρους του κυτταρικού τοιχώματος των ζυμών (Klis, 1994), ενώ τα κυτταρικά τοιχώματα των μυκηλιακών μυκήτων αποτελούνται από 10-20% χιτίνη (De Nobel et al., 2000). Πρόκειται για ένα πολυμερές που αποτελείται από Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (N-acetylglucosamine, GlcNAc) που ενώνεται με β-1,4- γλυκοσιδικούς δεσμούς. Τα υδρολυτικά ένζυμα που λύουν τους β-1,4- δεσμούς καλούνται χιτινάσες και απελευθερώνουν ολιγομερή, διμερή (χιτοβιόζη, chitobiose) και μονομερή (Ν-ακετυλγλυκοζαμίνη, GlcNAc) προϊόντα (Bowman & Free, 2006). Όταν διακοπεί η συνέχεια των δεσμών της χιτίνης επέρχεται αστάθεια στο κυτταρικό τοίχωμα το οποίο υποκύπτει σε ωσμωτικές και άλλες καταπονήσεις και γίνεται μεταβλητό. Ανάλογα με τον τρόπο που λύνουν τους δεσμούς, οι χιτινάσες χαρακτηρίζονται ως ενδοχιτινάσες οι οποίες υδρολύουν το πολυμερές της χιτίνης σε τυχαίες θέσεις, ή ως εξωχιτινάσες οι οποίες απελευθερώνουν χιτοβιόζη από κάποια από τις δύο άκρες του πολυμερούς (Horn et al., 2006). Σε δεύτερο χρόνο η χιτοβιόζη διασπάται από τις β-ν-ακετυλοεξοζαμινιδάσες (b-nacetylhexosaminidases, NAGases) και απελευθερώνονται μονομερή GlcNAc (Horsch et al., 1997). Οι μυκητιακές χιτινάσες ταξινομούνται στην οικογένεια των γλυκοσιδο-υδρολασών 18 (glycoside hydrolases family 18, GH18), ενώ οι μυκητιακές β-ν-ακετυλοεξοζαμινιδάσες (NAGases) ανήκουν στην οικογένεια των γλυκοσιδο-υδρολασών 20 (glycoside hydrolases family 20, GH20) (Seidl, 2008), όπως ορίζονται στη βάση δεδομένων CAZy (Carbohydrate Active Enzymes) (Cantarel et al., 2009). Το οπλοστάσιο των ωφέλιμων μικροοργανισμών εμπλουτίζεται από ένζυμα που λύουν κάποιους δεσμούς ώστε να παρέχεται στο φυτό ή στον ίδιο τον μικροοργανισμό η απαραίτητη ποσότητα ανόργανων στοιχείων για την ανάπτυξή του. Εκτός από τις χιτινάσες που προαναφέρθηκαν, η απόκτηση αζώτου από οργανικές πηγές γίνεται και μέσω της λύσης δεσμών πρωτεϊνικής φύσης από εξωκυτταρικές πρωτεάσες (ανασκόπηση από τους Leake & Read, 1997 και τους Lindahl et al. 2005). Τυπικά η παραγωγή εξωκυτταρικών πρωτεασών ορίζεται από την ικανότητα των στελεχών (βακτηριακών ή μυκητιακών) να αναπτύσσονται σε αμιγώς πρωτεϊνικό υπόστρωμα και αυτό να αποτελεί την μοναδική πηγή ανόργανων στοιχείων (Finlay et al., 1992; Lilleskov et al., 2002; Nygren et al., 2007). Η ικανότητα διάσπασης της πρωτεΐνης γίνεται ορατή καθώς σχηματίζεται μια καθαρή ζώνη γύρω από τον μικροοργανισμό πάνω στο υπόστρωμα αυτό, στα τρυβλία ανάπτυξης (Taylor et al., 2000) Παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Όπως προαναφέρθηκε, τα βακτήρια που είναι ικανά να αποικίζουν τη ριζόσφαιρα ή τις ρίζες των φυτών και έχουν ωφέλιμη επίδραση στο φυτό μέσω έμμεσων ή άμεσων 75

82 μηχανισμών, καλούνται PGPR (Kloepper & Schroth, 1978). Οι άμεσοι μηχανισμοί προαγωγής της αύξησης περιλαμβάνουν τη σύνθεση ουσιών ή τη διευκόλυνση της πρόσληψης θρεπτικών στοιχείων. Αναλυτικότερα, οι άμεσοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν α) τη δέσμευση αζώτου, β) την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας στοιχείων όπως του φωσφόρου ή του σιδήρου (παραγωγή σιδηροφόρων) και γ) την επαγωγή παραγωγής φυτοορμονών όπως είναι οι αυξίνες, οι κυτοκινίνες, το αμπσισικό οξύ, το αιθυλένιο και οι γιββεριλίνες (Glick, 1995; Glick et al., 1999; Bowen & Rovina, 1999; Patten & Glick, 2002; Vessey, 2003). Ως έμμεσοι, ορίζονται οι μηχανισμοί που κατά την αποτροπή των δυσμενών επιπτώσεων της προσβολής από φυτοπαθογόνους οργανισμούς, παράγονται ανασταλτικές ουσίες ή ενισχύεται η άμυνα του φυτού (Glick, 1995). Τα PGPR χωρίζονται σε δύο ομάδες: τα ενδοκυτταρικά PGPR (intracellular PGPR, ipgpr) που διαβιούν εντός της ρίζας και παράγουν φυμάτια και τα εξωκυτταρικά (extracellular, epgpr) τα οποία εντοπίζονται στη ριζόσφαιρα, στην επιφάνεια της ρίζας και στα μεσοκυττάρια διαστήματα της επιδερμίδας της ρίζας (Gray & Smith, 2005). Τα βασικά βακτηριακά είδη που εντοπίζονται στην περιοχή της ριζόσφαιρας ανήκουν στα γένη Acetobacter, Arthrobacter, Azospirillium, Azotobacter, Bacillus, Flavobacter, Pseudomonas, Proteus, Rhizobium, Serratia, Xanthomonas, κ.α. (Glick, 1995). Τα ωφέλιμα βακτήρια παράγουν ινδολο-3-οξικό οξύ (indole-3-acetic acid, IAA), κυρίως μέσω μιας εξαρτώμενης από την τρυπτοφάνη βιοχημικής οδού και, πιο συγκεκριμένα, μέσω της παραγωγής ινδολοπυρουβικού οξέος. Ο ακριβής ρόλος του βακτηριακού ινδολοπυρουβικού οξέος στην προαγωγή της αύξησης των φυτών παραμένει αδιευκρίνιστος. Στη ριζόσφαιρα, η τρυπτοφάνη μπορεί να προέρχεται από δύο πηγές: απελευθερώνεται κατά την αποσύνθεση της ρίζας και των μικροβιακών κυττάρων και εντοπίζεται και σε εκκρίσεις ριζών. Η ποσότητα της τρυπτοφάνης που εκκρίνεται από τις ρίζες των φυτών ποικίλει ανάλογα με το φυτικό είδος και οι συγκεντρώσεις αυτής είναι αρκετά χαμηλές (Kravchenko et al., 2004; Idris et al., 2004; 2007). Η σύνθεση αυξίνης μέσω της βιοχημικής οδού που χρησιμοποιεί τρυπτοφάνη είναι πολύ κοινή στους μικροοργανισμούς (Idris et al., 2004; 2007). Η μέτρηση της αύξησης των ριζών, σε σύγκριση με έναν μάρτυρα που δεν έχει υποστεί μεταχείριση, αποτελεί τον βασικό δείκτη της ωφέλιμης επίδρασης των ριζοβακτηρίων στο φυτό. Η ταχύτερη αύξηση των ριζών, είτε λόγω επιμήκυνσης της κεντρικής ρίζας είτε λόγω του μεγαλύτερου αριθμού πλευρικών ριζών δίνει οικολογικό πλεονέκτημα στα νεαρά φυτά. Αυτά εγκλιματίζονται ταχύτερα στο εκάστοτε έδαφος και το νερό και τα θρεπτικά στοιχεία λαμβάνονται ευκολότερα, αυξάνοντας έτσι την ευρωστία τους και τις πιθανότητες επιβίωσης. Για τον αρχικό εντοπισμό του ΙΑΑ και της πρόδρομης ένωσης, του ινδολο-3- πυρουβικού οξέος (IPyA), χρησιμοποιείται το διάλυμα του Salkowski. Το διάλυμα αυτό είναι μια ένωση που περιέχει 35% υπεροξείδιο του υδροχλωρίου (HClO 4) και 10 mm FeCl 3 και όταν αναμειγνύεται με ΙΑΑ σχηματίζεται ένα σύμπλοκο με τον τρισθενή σίδηρο (ΙΙΙ). Το σύμπλοκο αυτό δίνει χρώση ερυθρών αποχρώσεων. Ως εκ τούτου, η παρουσία ερυθρού χρώματος αποτελεί θετική ένδειξη και άρα αποδεικνύεται η ικανότητα μεταβολισμού της τρυπτοφάνης (L-tryptophan, TRP) σε ΙΑΑ ή σε ανάλογες ενώσεις του ΙΑΑ (Rahman et al., 2010). Παρά το ότι οι επιστημονικές εργασίες επικεντρώνονται κυρίως στην ικανότητα των ωφέλιμων ριζοβακτηρίων να παράγουν αυξίνες και ειδικότερα ΙΑΑ, κάποια άρθρα 76

83 διερευνούν την ικανότητα παραγωγής ή/και την ικανότητα αλλαγής της συγκέντρωσης και άλλων πολύ σημαντικών ρυθμιστών ανάπτυξης, όπως είναι το γιββεριλικό οξύ (GA), το αιθυλένιο (ΕΤΗ), ή οι κυτοκινίνες (Martinez-Toledo et al., 1988; Bottini et al., 1989; Karadeniz et al., 2006; Ahmad et al., 2008) Σκοπός των πειραμάτων Οι στόχοι των πειραμάτων που αναφέρονται στο παρόν κεφάλαιο είναι οι εξής: α) η περεταίρω διερεύνηση του τρόπου δράσης των βακτηριακών στελεχών και πιο συγκεκριμένα ως προς την ικανότητά τους για παραγωγή λυτικών ενζύμων (χιτινάσες, πρωτεάσες), σιδηροφόρων και υδροκυανίου, μέσω βιοχημικών και χρωματομετρικών μεθόδων, β) η διερεύνηση της παραγωγής ρυθμιστών ανάπτυξης των φυτών από τα εν λόγω βακτήρια με τη χρήση χρωματομετρικών τεχνικών και υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) και, κατ επέκταση, γ) η διερεύνηση της επίδρασής τους στην αύξηση φυτών τομάτας, ρεπανιού και σιταριού Υλικά και Μέθοδοι Μικροοργανισμοί Τα βακτήρια διατηρήθηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο του Κεφαλαίου Παραγωγή σιδηροφόρων Η παραγωγή σιδηροφόρων μελετήθηκε στα στελέχη P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, S. marcescens PiHa5II και B. cereus S76, εφαρμόζοντας μια παραλλαγή της μεθόδου του δείκτη Chrome Azurol S (CAS), των Schwyn και Neilands (1987), όπως αυτή τροποποιήθηκε από τους Milagres, Napoleão και Machuca (1999). Η τροποποίηση της μεθόδου των Schwyn και Neilands (1987), θεωρήθηκε αναγκαία λόγω της τοξικότητας που εμφανίζει η ένωση hexadecyltrimethyl-ammonium bromide (HDTMA) που χρησιμοποιείται κατά την παρασκευή του CAS, απέναντι σε κάποιους μικροοργανισμούς. Το CAS-blue agar παρασκευάστηκε σύμφωνα με τους Schwyn και Neilands (1987). Αρχικά 60.5 mg CAS διαλύθηκαν σε 50 ml απεσταγμένου νερού και αναμείχθηκαν με 10 ml διαλύματος τρισθενούς σιδήρου (1 mm FeCl 36H 2Ο, 10 mm HCl). Αυτό το διάλυμα προστέθηκε αργά σε 72.9 mg HDTMA που είχαν προηγουμένως διαλυθεί σε 40 ml νερό, υπό διαρκή ανάδευση. Το σκοτεινόχρωμο κυανό υγρό που προέκυψε αποστειρώθηκε στους 120 ο C, για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, αναμείχθηκαν 750 ml νερό, 15 gr άγαρ, gr ρυθμιστικού διαλύματος Pipes (Piperazine-1,4-2-ethanesulfonic acid) και 12 gr διαλύματος 50% (w/w) NaOH ώστε να ανέλθει το ph στο σημείο της pka της ουσίας Pipes (6,8). Το διάλυμα που προέκυψε αποστειρώθηκε επίσης στους 120 ο C, για 15 λεπτά. Το κάθε μίγμα αναμείχθηκε με προσοχή και ελαφριά ανάδευση ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία αφρού. Στη συνέχεια πληρώθηκαν χωριστά τρυβλία Petri 9 cm με 30 ml Nutrient Agar (nutrient agar: 0,5% πεπτόνη (peptone), 0,3% εκχύλισμα μαγιάς (yeast extract), 1,5% άγαρ, 0,5% χλωριούχο νάτριο (sodium chloride) και ίσος αριθμός τρυβλίων πληρώθηκε με 30 ml CAS-blue agar. Μόλις τα υποστρώματα στερεοποιήθηκαν, κόπηκαν στη μέση με αποστειρωμένο νυστέρι και μεταφέρθηκαν, μισό από το καθένα, υπό 77

84 ασηπτικές συνθήκες, σε νέα τρυβλία που με αυτόν τον τρόπο, περιείχαν κατά το ήμισυ CAS-blue agar (15 ml) και κατά το υπόλοιπο ήμισυ nutrient agar (Εικόνα 3.1), στα οποία και εμβολιάστηκαν τα βακτήρια. Ο εμβολιασμός έγινε κατά μήκος της χορδής του ημικυκλίου του nutrient agar, που ήταν σε άμεση επαφή με το ημικύκλιο του CAS-blue agar. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 25 o C, στο σκοτάδι, για 3 εβδομάδες και η ανάπτυξη των βακτηρίων παρακολουθήθηκε ημερησίως. Η ολοκλήρωση της ανάπτυξης εκφράστηκε ως ο χρόνος που χρειάζεται για να επέλθει ο θάνατος της αποικίας του εκάστοτε βακτηρίου, ο οποίος οριζόταν μέσω της αδυναμίας ανάπτυξης των αποικιών όταν αυτές μεταφέρονταν εκ νέου. Η αντίδραση CAS ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας την έκταση της αλλαγής χρώματος του CAS-blue agar, ξεκινώντας από το σημείο επαφής των δύο μέσων. Η αλλαγή του χρώματος κυμάνθηκε μεταξύ πορτοκαλί, ιώδους και σκοτεινού ερυθροϊώδους. Κάθε βακτήριο εμβολιάστηκε σε 3 διαφορετικά τρυβλία-επαναλήψεις για κάθε πείραμα και έγιναν 3 χρονικές επαναλήψεις του πειράματος. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία που περιείχαν μόνο το CAS-blue agar ώστε να ελέγχεται η διατήρηση του χρώματος. Όλα τα γυαλικά που χρησιμοποιήθηκαν καθαρίστηκαν προηγουμένως με 6 M HCl ώστε να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα σιδήρου. Εικόνα 3.1. Tρυβλία που περιέχουν κατά το ήμισυ CAS-blue agar (15 ml) και κατά το άλλο ήμισυ nutrient agar (αριστερά). Κίτρινο διάλυμα τρισθενούς σιδήρου (1 mm FeCl36H2Ο, 10 mm HCl) και σκοτεινόχρωμο κυανό διάλυμα CAS (Chrome Azurol-S) και HDTMA (hexadecyltrimethyl-ammonium bromide) Παραγωγή υδροκυανίου Η διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής υδροκυανίου στα τέσσερα στελέχη P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, S. marcescens PiHa5ΙΙ και B. cereus S76 έγινε με τη χρήση της δοκιμής παρουσίας ελεύθερων ιόντων κυανιδίου «Aquaquant Testsystem» (Merck). Η δοκιμή βασίζεται στην αντίδραση των ιόντων κυανιδίου με έναν παράγοντα χλωρίωσης προς σχηματισμό κυανο-χλωριδίου, το οποίο με τη σειρά του αντιδρά με το 1,3-διμεθυλοβαρβιτουρικό οξύ, παρουσία πυριδίνης ώστε να προκύψει ιώδης χρώση (αντίδραση König). Η συγκέντρωση του υδροκυανίου προσδιορίζεται με ημιποσοτικοποίηση μέσω οπτικής σύγκρισης του χρώματος που παράγεται με τα χρώματα της κλίμακας που παρέχει το κιτ. Η δοκιμή επαναλήφθηκε 3 φορές. 78

85 Παραγωγή ενζύμων με αντιμυκητιακή δράση Η ικανότητα παραγωγής ενδοχιτινάσης, εξωχιτινάσης και ακετυλοεξοαμινιδάσης (NAGase) από τα ριζοβακτήρια P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, S. marcescens PiHa5ΙΙ και B. cereus S76, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα τα (GlcNAc)3, (GlcNAc)2 και GlcNAc, αντίστοιχα, ενωμένα με 4-methylumbelliferyl (4-MU) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) σύμφωνα με τον Tzelepis et al., (2012). Τα βακτήρια καλλιεργήθηκαν σε υγρές καλλιέργειες που περιείχαν 1% (w:v) κολλοειδή χιτίνη (Merck, Darmstadt, Germany), για 96 ώρες. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης, συλλέχθηκε το υπερκείμενο ώστε να μετρηθεί η ενζυμική δραστηριότητα σε αυτό. Ογδόντα πέντε (85) μl κάθε δείγματος αναμείχθηκαν με 15 μl του αντίστοιχου προαναφερθέντος υποστρώματος (35 μm), σε πλάκα μικροτιτλοποίησης 96 φρεατίων και ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τα βακτήρια μόνα τους καθώς και τα αντιδραστήρια μόνα τους. Η πλάκα επωάστηκε στο σκοτάδι, για 20 λεπτά και μετά το πέρας του χρόνου επώασης προστέθηκαν 100 μl διαλύματος τερματισμού (1 M ρυθμιστικού διαλύματος γλυκίνης, ph = 10,6). Ο φθορισμός της ουσίας 4-MU που απελευθερώθηκε, εντοπίστηκε με τη χρήση φασματόμετρου φθορισμού LS50B (Perkin Elmer, Waltham, MA) (Tzelepis et al., 2012). Η ικανότητα παραγωγής εξωκυτταρικής πρωτεάσης μελετήθηκε στα προαναφερθέντα ριζοβακτήρια με τη χρήση υποστρώματος που περιείχε σκόνη γάλακτος του εμπορίου, σύμφωνα με τους Nygren et al., (2007), με κάποιες μικρές τροποποιήσεις (Tzelepis et al., 2012). Εν συντομία, 10 μl υγρής καλλιέργειας των βακτηριακών στελεχών, OD 624=0,7, εμβολιάστηκαν στο κέντρο τρυβλίων Petri διπλής στρώσης, που περιείχαν σκόνη γάλακτος και 1,5% (w:v) άγαρ, ως άνω στρώση και LC άγαρ ως κάτω στρώση. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 25 o C, σε σκοτάδι, για 96 ώρες και η διάχυση της εξωκυτταρικής πρωτεάσης στο μέσο ανάπτυξης επιβεβαιώθηκε μετρώντας την διάμετρο της διαυγούς ζώνης με κέντρο την αποικία. Τα στελέχη ελέγχθηκαν επίσης για την ικανότητά τους να προκαλούν αιμόλυση και να αναπτύσσονται σε θερμοκρασιακό εύρος 37±2 o C. Ο έλεγχος της αιμόλυσης έγινε μέσω της ανάπτυξης των ριζοβακτηρίων σε τρυβλία που περιείχαν Blood Agar (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), σε 2 διαφορετικές τιμές θερμοκρασιακού εύρους, o C και o C Παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Χρωματομετρικός έλεγχος παραγωγής ινδολοξικού οξέος (ΙΑΑ) Η ικανότητα παραγωγής ινδολοξικού οξέος από τα τέσσερα επιλεγμένα στελέχη ελέγχθηκε με βάση τη χρωματομετρική μέθοδο του αντιδραστηρίου του Salkowski (Ehmann, 1977; Patten & Glick, 1996). Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε ήταν παραλλαγή του Karnwal (2009) σε συνδυασμό με εκείνο του Imperial College of London ( Τα βακτηριακά στελέχη καλλιεργήθηκαν σε LB, απουσία και παρουσία τρυπτοφάνης σε συγκεντρώσεις 50 και 100 μg/ml (L-tryptophan, Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands). Η προσθήκη της τρυπτοφάνης σε αυτό το στάδιο γίνεται διότι λειτουργεί ως υπόστρωμα της αντίδρασης σχηματισμού του ινδολοπυροβικού οξέος (indole-3-pyruvic acid, IPA), το οποίο είναι πρόδρομη ένωση για τη βιοσύνθεση της αυξίνης (Stepanova et al., 2008). Η 79

86 επώαση έγινε στους 25±2 C, για 48 ώρες. Στη συνέχεια τα βακτηριακά κύτταρα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στις rpm, για 20 λεπτά, στους 4ºC. Ένα (1) ml από κάθε υπερκείμενο που προέκυψε, διηθήθηκε σε φίλτρα PURADISC TM, Whatman πολυπροπυλενίου 0,2 μm (Whatman Inc., Florham Park, U.S.A.) και αναμείχθηκε με 2 ml αντιδραστηρίου του Salkowski. Το κάθε μίγμα στη συνέχεια επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου, για 20 λεπτά και αφού μεταφέρθηκαν 150 μl από αυτά, σε πλάκες μικροτιτλοποίησης, μετρήθηκε η απορρόφηση στα 535 nm, σε φασματοφωτόμετρο Labsystems Multiscans RC, με τη χρήση του λογισμικού Genesis V3.03. Η αλλαγή του χρώματος από κίτρινο σε ερυθρό-ρόδινο, ήταν ενδεικτική της παρουσίας ΙΑΑ. Το αντιδραστήριο Salkowski παρασκευάστηκε ως εξής: 0,811 gr άνυδρου FeCl 3 διαλύθηκαν σε 10 ml νερού ώστε να προκύψει ένα μίγμα 0,5Μ (εξώθερμη αντίδραση). Ένα ml αυτού του μίγματος προστέθηκε σε 50 ml διαλύματος 35% υπερχλωρικού οξέος (perchloric acid, HClO 4). Η διατήρηση του διαλύματος έγινε σε θερμοκρασία δωματίου, απουσία φωτός. Κάθε επέμβαση αποτελούταν από 3 τεχνικές επαναλήψεις και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές Καλλιέργεια βακτηρίων, εκχύλιση και καθαρισμός δειγμάτων για την ανίχνευση ρυθμιστών ανάπτυξης Τα βακτήρια καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο LB, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Για την εκχύλιση και τον καθαρισμό των ρυθμιστών ανάπτυξης, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα των 100 ml από την εκθετική και τη στατική φάση ανάπτυξης του κάθε βακτηρίου. Σε κάθε δείγμα προστέθηκε 1 mg βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (Butylated Hydroxy Toluene, BHT) (Applichem, Panreac, Darmstadt, Germany), ώστε να καθυστερήσει η οξείδωση των φυτοορμονών (Ross et al., 1987). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις rpm, για 10 λεπτά και ακολούθησε η εκχύλισή τους. Η εκχύλιση, ο καθαρισμός και ο ποσοτικός προσδιορισμός των IAA, GA3, ζεατίνης και ABA, έγιναν συνδυάζοντας τα πρωτόκολλα των Űnyayar et al., (1996) και Karadeniz et al., (2006). Η διαδικασία της εκχύλισης και της ανάλυσης του εκχυλίσματος με τεχνικές χρωματογραφίας (TLC και HPLC), έγινε όπως παρουσιάζεται στο Διάγραμμα 3.1. Με σκοπό την βελτιστοποίηση της παραπάνω διαδικασίας, τα δείγματα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας τους παρακάτω οργανικούς διαλύτες: οξικό αιθυλεστέρα, τολουόλιο, διχλωρομεθάνιο, διεθυλαιθέρα και πετρελαϊκό αιθέρα. Επίσης δοκιμάστηκε και η είσοδος στο σύστημα HPLC διηθημένων υπερκειμένων (χωρίς να προηγηθεί εκχύλιση), από δύο καλλιέργειες, 48 ωρών, σε 100 ml LB, η μία με προσθήκη 100μg ml -1 τρυπτοφάνης και η άλλη χωρίς. Για τα πειράματα ικανότητας ανάκτησης των ρυθμιστών ανάπτυξης, μετά από εκχύλιση με τους παραπάνω διαλύτες, πρoστέθηκαν 100 μl από πρότυπο διάλυμα 10 μg ml -1 σε θρεπτικό μέσο LB. Η ανάλυση των εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε πλάκες χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας επιστρωμένες με Silica gel 60 F 254, (normal phase, Merck, Darmstadt, Germany) και η κινητή φάση ήταν ένα μίγμα ισοπροπανόλης:αμμωνίας:νερού (10:1:1, v:v:v). 80

87 Διηθημένο υπερκείμενο καλλιέργειας (100 ml) Ρύθμιση του ph στo 2.5 με την προσθήκη 7Μ HCl. Τριπλή εκχύλιση με τον οργανικό διαλύτη (3 x 30 ml) Ρύθμιση του ph στo 2.5 με την προσθήκη 7Μ HCl. Τριπλή εκχύλιση με τον οργανικό διαλύτη (3 x 30 ml) Ρύθμιση του ph στα 11 με την προσθήκη 7Μ ΝαΟΗ. Υδρόλυση για 1 ώρα στους 70 o C Ρύθμιση του ph στo 7 με την προσθήκη 7Μ HCl. Τριπλή εκχύλιση με τον οργανικό διαλύτη (3 x 30 ml) Υγρή φάση Υγρή φάση Υγρή φάση Οργανικός διαλύτης (ελεύθερα ΙΑΑ, GA 3 και ΑΒΑ) Οργανικός διαλύτης (ελεύθερη ζεατίνη) Εξάτμιση του διαλύτη TLC (iprooh/nh4oh/h2o 10:1:1 v/v/v) Έκλουση της μεθανόλης: Απόσπαση κηλίδων και επαναδιάλυση σε HPLC μεθανόλη Οργανικός διαλύτης (δεσμευμένη ζεατίνη) Ρύθμιση του ph στo 7 με την προσθήκη 7Μ HCl. Τριπλή εκχύλιση με τον οργανικό διαλύτη (3 x 30 ml) Υγρή φάση Υγρή φάση (απόρριψη) Οργανικός διαλύτης (δεσμευμένα ΙΑΑ, GA 3 και ΑΒΑ) Εξάτμιση του διαλύτη TLC (iprooh/nh4oh/h2o 10:1:1 v/v/v) Έκλουση της μεθανόλης: Απόσπαση κηλίδων και επαναδιάλυση σε HPLC μεθανόλη Διάγραμμα 3.1. Διάγραμμα ροής εργασιών που περιγράφει την εκχύλιση και τον καθαρισμό των ΙΑΑ, GA3, ABA και ζεατίνης πριν από την ανάλυση HPLC. Οι ζώνες των IAA, GA3, ABA και ζεατίνης, εντοπίστηκαν βάσει των τιμών του παράγοντα κατακράτησης των πρότυπων ουσιών (Retention factor, Rf) και οπτικοποιήθηκαν σε υπεριώδες φως, στα 254 nm. Οι ζώνες στη συνέχεια ξύθηκαν από την πλάκα και οι ενώσεις διαλύθηκαν σε μεθανόλη. Μετά την εξάτμιση της μεθανόλης, τα 81

88 δείγματα επαναδιαλύθηκαν σε μίγμα ακετονιτριλίου:νερού σε αναλογία 60:40 (v:v) και αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, με ανιχνευτή φασματογράφο μάζας (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS/MS). Η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας Surveyor, αποτελούμενης από αντλία HPLC με ενσωματωμένη διάταξη απαέρωσης της κινητής φάσης, αυτόματο δειγματολήπτη με ενσωματωμένο φούρνο χρωματογραφικής στήλης και ανιχνευτή φασματογράφου μάζας τριπλού τετραπόλου TSQ Quantum Discovery Max (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA, USA). Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη HyPURITY-C 18 (50 2.1, 3 μm, Thermo Scientific). Η κινητή φάση αποτελείτο από δυαδικό σύστημα διαλυτών: 0,1% μυρμηγκικό οξύ σε νερό (Κινητή Φάση Α) και 0,1% μυρμηγκικό οξύ σε μεθανόλη (Κινητή φάση Β). H ροή και η αλλαγή της σύστασης της κινητής φάσης πραγματοποιούταν σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 3.1. Ροή και αλλαγή της σύστασης της κινητής φάσης κατά τη χρωματογραφική ανάλυση των ρυθμιστών ανάπτυξης Χρόνος (min) % Κινητής Φάσης Β a Ροή (ml/min) , , , ,2 15, , , , , ,2 a Κινητή φάση Β: 0,1% μυρμηγκικό οξύ σε μεθανόλη Ο ενέσιμος όγκος του κάθε δείγματος ήταν 20 μl και η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 40 o C. Ο φασματογράφος μάζας λειτούργησε σε συνθήκες SRM (selected reaction monitoring). Ο ιονισμός των αναλυτών επιτεύχθηκε με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionisation, ESI). Οι συνθήκες λειτουργείας του φασματογράφου μάζας περιεγράφηκαν στην παράγραφο Πίνακας 3.2. Συνθήκες ανίχνευσης των ρυθμιστών ανάπτυξης Ένωση Χρόνος κατακράτησης (min) Μοριακό Ιόν Κύριο Ιόν Ενέργεια Σύγκρουσης (V) Δευτερεύον Ιόν Ενέργεια Σύγκρουσης (V) 82 Πολικότητα IAA 11,89 176,1 103, , ABA 14,04 263,0 153, , GA3 12,04 345,1 143, , zeatin 2,17 220,1 136, , Η ρύθμιση των παραμέτρων της ανάλυσης και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκαν με το λειτουργικό σύστημα Xcalibur (Thermo Electron Corporation). Οι προαναφερθείσες φυτοορμόνες ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση του χρόνου παραμονής και των χαρακτηριστικών δευτερευόντων ιόντων (σύμφωνα με τον παραπάνω πίνακα) των χρωματογραφικών κορυφών των εκχυλισμάτων με τις αντίστοιχες των πρότυπων ουσιών. Για τη χρωματογραφική ανάλυση των εκχυλισμάτων χρησιμοποιήθηκε ακετονιτρίλιο, μεθανόλη και νερό υψηλής καθαρότητας (HPLC grade, Merck, Darmstadt, Germany). Για

89 την εκχύλιση δοκιμάστηκαν 5 διαλύτες καθαρότητας 99.5 (pro analysis, Merck, Darmstadt, Germany). Οι οργανικοί διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: οξικός αιθυλεστέρας (ethyl acetate), τολουόλιο (toluene), διχλωρομεθάνιο (dichloromethane), διαιθυλαιθέρας (diethyl ether) και πετρελαϊκός αιθέρας (petroleum benzene). Για τον ανάλυση των δειγμάτων με τη μέθοδο της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) χρησιμοποιήθηκε μίγμα ισοπροπανόλης:αμμωνίας:απεσταγμένου νερού (Chem-Lab, Zedelgem, Belgium). Οι πρότυπες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: IAA (Sigma, I-2886), GA3 (Sigma, G-7645), zeatin (Sigma, Z-0164) και ABA (Sigma, A-1049) Επίδραση των στελεχών στην αύξηση φυτών τομάτας, ρεπανιού και σιταριού Ανάπτυξη φυτικού υλικού και εφαρμογή βακτηριακών στελεχών Η επίδραση των P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55, S. marcescens PiHa5ΙΙ και B. cereus S76, στην αύξηση φυτών ρεπανιού και τομάτας αξιολογήθηκαν σε πειράματα σε φυτοδοχεία. Η επίδραση στην αύξηση της τομάτας μελετήθηκε επιπλέον σε δοκιμαστικούς σωλήνες, σε αξενικές συνθήκες (gnotobiotic), όπως περιγράφεται από τους Kamou et al. (2015), με ελάχιστες τροποποιήσεις. Στις ίδιες αξενικές συνθήκες μελετήθηκε και η επίδραση στην αύξηση του σιταριού. Για τα πειράματα σε φυτοδοχεία χρησιμοποιήθηκαν σπόροι τομάτας (Solanum lycopersicum) ποικιλίας ACE55 και ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2. Στα φυτοδοχεία προστέθηκαν 100 g μίγματος τύρφης: περλίτη σε αναλογία 3:1 (v:v). Για το πείραμα της τομάτας χρησιμοποιήθηκαν 10 φυτά ανά επέμβαση τα οποία αναπτύχθηκαν υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία, στους 25±5 C, σε φυσικό φωτισμό (φωτοπερίοδος 14 ώρες). Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές, στις περιόδους Απριλίου-Μαΐου 2013, Μαΐου- Ιουνίου 2013 και Σεπτεμβρίου-Οκτωβρίου Το πείραμα του ρεπανιού πραγματοποιήθηκε σε θερμοκήπιο του εργαστηρίου Λαχανοκομίας του Τμήματος Γεωπονίας Α.Π.Θ., χρησιμοποιήθηκαν 36 φυτά ανά επέμβαση, με 2 βιολογικές επαναλήψεις σε κάθε επανάληψη του πειράματος και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές, Απρίλιο-Ιούνιο 2013 και Αύγουστο-Οκτώβριο Το πείραμα σε σύστημα gnotobiotic, υπό αξενικές συνθήκες, ήταν μία παραλλαγή εκείνου που περιγράφηκε από τους Simons et al. (1996). Χρησιμοποιήθηκαν σπόροι τομάτας και μαλακoύ σιταριού (Triticum aestivum) ποικιλίας Βεργίνα. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε γυάλινους κυλινδρικούς σωλήνες, ύψους 95 mm και εσωτερικής διαμέτρου 40 mm. Οι σωλήνες πληρώθηκαν με περλίτη, σε ύψος 2,5 cm και στη συνέχεια, αφού κλείστηκαν με ανυδρόφιλο βαμβάκι και καλύφθηκαν με αλουμινόχαρτο, τοποθετήθηκαν στην αποστείρωση στους 120 o C, για 60 min. Μετά το πέρας της αποστείρωσης, οι σωλήνες πληρώθηκαν σε άσηπτες συνθήκες, με αποστειρωμένη άμμο (Quartz sand, Sea sand pure, Applichem, Darmstdt, Germany), με περίπου 30 gr ο καθένας. Η άμμος είχε διάμετρο κόκκων από 0,1 0,3 mm και προηγουμένως είχε αναμειχθεί με 10% (v:w) αποστειρωμένο θρεπτικό διάλυμα (Plant Nutrition Solution, PNS, Hoffland, 1992). Οι σπόροι τομάτας και σιταριού απολυμάνθηκαν επιφανειακά σε διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (NaOCl) 5% (v:v) για 3 λεπτά, και ακολούθησαν διαδοχικές αναδεύσεις και τρία ξεπλύματα με απεσταγμένο νερό, κάθε μισή ώρα, για 2 ώρες. Στη 83

90 συνέχεια οι απολυμασμένοι σπόροι τοποθετήθηκαν για 72 ώρες σε τρυβλίο PNS-agar ώστε να βλαστήσουν και έπειτα τοποθετήθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες (ένας σε κάθε σωλήνα), υπό ασηπτικές συνθήκες, σε βάθος περίπου 1cm, μέσα στη στήλη της άμμου. Χρησιμοποιήθηκαν 6 φυτά ανά επέμβαση και αυτά αναπτύχθηκαν στο απομονωμένο σύστημα, για 15 ημέρες, σε θάλαμο ανάπτυξης, με σταθερή θερμοκρασία 24 ο C και φωτοπερίοδο 16 ωρών. Η εφαρμογή των αντίστοιχων βακτηριακών κυττάρων γινόταν στον σπόρο, ως αιώρημα σε PBS, (O.D. 620 = 0,7) σε υδατικό διάλυμα μεθυλικής κυτταρίνης (4%) σε αναλογία 1:1 (v:v) (Kamou et al., 2015) Μέτρηση χαρακτηριστικών αύξησης Στο πείραμα της τομάτας σε φυτοδοχεία μετρήθηκαν τα εξής χαρακτηριστικά αύξησης: μήκος βλαστού (cm), βάρος βλαστού (gr), ξηρό βάρος βλαστού (gr), μήκος ρίζας (cm), βάρος ρίζας (gr), ξηρό βάρος ρίζας (gr) και ο αριθμός φύλλων. Στο πείραμα του ρεπανιού μετρήθηκαν ο όγκος της ρίζας (ml) εμβαπτίζοντας την υποκοτύλη και τη ρίζα σε ογκομετρικό σωλήνα που περιείχε νερό, το βάρος του υπέργειου τμήματος (gr), το ξηρό βάρος του υπέργειου τμήματος (gr), το βάρος του υπόγειου τμήματος (gr) και το ξηρό βάρος του υπόγειου τμήματος (gr). Στο πείραμα gnotobiotic της τομάτας μετρήθηκαν το μήκος βλαστού (cm), το βάρος βλαστού (gr) και ο αριθμός φύλλων, ενώ στο αντίστοιχο πείραμα με σιτάρι μετρήθηκαν επιπλέον και το μήκος και το βάρος της ρίζας, ενώ δε μετρήθηκε ο αριθμός φύλλων Μέτρηση θρεπτικών στοιχείων φύλλων και ρίζας ρεπανιού Δεκαπέντε πλήρως ανεπτυγμένα φυτά ρεπανιού από κάθε επέμβαση επιλέχτηκαν τυχαία στο τέλος κάθε πειράματος, για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των ιχνοστοιχείων του υπέργειου και του υπόγειου τμήματός τους. Τα φυτά ξηράθηκαν στους 68 o C, για 48 ώρες και στη συνέχεια κονιορτοποιήθηκαν με γουδί και γουδοχέρι σε τέτοιο βαθμό ώστε να περνούν από κόσκινο οπής 1mm. Ο προσδιορισμός του Ν και του S έγινε με στοιχειακό αναλυτή ΕΑ3000 της εταιρείας Eurovector (Pavia, Italy). Τα δείγματα ζυγίστηκαν σε κάψες κασσιτέρου, σε ποσότητες 2 ως 20 mg, ανάλογα με την περιεκτικότητα του δείγματος στα παραπάνω στοιχεία. Το δείγμα μέσω αυτόματου δειγματολήπτη εισήχθη στο χώρο καύσης (~1000 o C) και στη συνέχεια με την εισαγωγή οξυγόνου η θερμοκρασία ανέβηκε στους o C, με τη βοήθεια του κασσιτέρου που έδρασε σαν καταλύτης. Tα αέρια της καύσης διερχόμενα από σειρά καταλυτών μετατράπηκαν σε αέριο Ν, CΟ 2 και SΟ 2 και οδηγήθηκαν σε χρωματογραφική στήλη όπου διαχωρίστηκαν και στη συνέχεια οδηγήθηκαν στον ανιχνευτή. Το όριο ανίχνευσης για τα στοιχεία N, C και S ήταν 1 μg. Τα μακροστοιχεία Κ, Ca, Mg και Ρ προσδιορίστηκαν μετά από ξηρή καύση και παραλαβή της τέφρας με HCl/HNO 3. Το κάλιο μετρήθηκε με φλογοφωτόμετρο PFP7 (Jenway, Cole-Parmer, Staffordshire, UK). Τα Ca και Mg με φασματοφωτόμετρο ατομικής απορρόφησης ΑΑ 6300 (SHIMADZU) και ο Ρ χρωματομετρικά, με τη μέθοδο του μολυβδαινικού αμμωνίου, σε φασματοφωτόμετρο UV1800 (SHIMADZU, Japan). 84

91 Στατιστική ανάλυση Στα δεδομένα που προέκυψαν από τα πειράματα παραγωγής σιδηροφόρων, υδροκυανίου, πρωτεασών και χιτινασών έγινε στατιστική επεξεργασία μέσω της ανάλυσης παραλλακτικότητας (ANalysis Of VAriance, ANOVA). Οι μέσοι όροι προέκυψαν από 3 επαναλήψεις για την κάθε επέμβαση και 3 χρονικές επαναλήψεις του κάθε πειράματος. Οι συγκρίσεις έγιναν με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (Least Significant Difference, LSD), με βάση το τεστ του Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας 0,05. Τα δεδομένα που προέκυψαν από τα πειράματα με φυτικό υλικό (σε φυτοδοχεία και στο σύστημα gnotobiotic) αναλύθηκαν μέσω της ANOVA. Οι αναλύσεις βασίστηκαν στο πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο πειραματισμού (Completely Randomized Design, CRD), και οι μέσοι όροι προέκυψαν από 10 και 50 φυτά σε κάθε επέμβαση, όσον αφορά τα πειράματα σε φυτοδοχεία με τομάτα και ραπανάκια, αντίστοιχα και 6 φυτά ανά επέμβαση για τα πειράματα υπό αξενικές συνθήκες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές για την τομάτα και το σιτάρι (σε αξενικές και σε συνθήκες θερμοκηπίου) και 2 φορές για το ραπανάκι. Σύμφωνα με το F τεστ της ANOVA, οι διαφορές μεταξύ των μέσων όρων συγκρίθηκαν με βάση το τεστ του Tukey. Το επίπεδο σημαντικότητας για όλες τις υποθέσεις και διαδικασίες στατιστικού ελέγχου, ορίστηκε εκ των προτέρων ως το P 0,05. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πρόγραμμα SPSS v 19.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Η ίδια ανάλυση έγινε και για τα αποτελέσματα της ανίχνευσης των θρεπτικών στοιχείων, με 2 τεχνικές επαναλήψεις ανά επέμβαση και συνολικά 2 επαναλήψεις ολόκληρου του πειράματος Αποτελέσματα Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών από τα βακτηριακά στελέχη Παραγωγή σιδηροφόρων και υδροκυανίου Κατά την βιοδοκιμή CAS, όλα τα βακτηριακά στελέχη προκάλεσαν την ίδια αλλαγή στο χρώμα (από κυανό σε πορτοκαλί), γεγονός το οποίο είναι ενδεικτικό της παραγωγής σιδηροφόρων και από τα τέσσερα στελέχη. Κάποιες διαφορές σημειώθηκαν στην ένταση της αντίδρασης (ένταση του χρώματος που προκύπτει) και στο μέγεθος του μετώπου της ζώνης μεταχρωματισμού. Οι διαφορές αυτές μπορούν να συσχετιστούν με τη συγκέντρωση των παραγόμενων σιδηροφόρων (Payne, 1994; Milagres et al., 1999). Ως εκ τούτου, τα στελέχη με την εντονότερη παραγωγή σιδηροφόρων ήταν τα P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 και ακολούθησαν τα S. marcescens PiHa5II και B. cereus S76. Οι αποκρίσεις ήταν ίδιες και στις 3 επαναλήψεις (Πίνακας 3.3). Η δοκιμή της in vitro παραγωγής του κυανιδίου με τη χρήση της δοκιμής Aquaquant Testsystem (Merck), έδειξε θετικό αποτέλεσμα μόνο για το P. chlororaphis ToZa7 (Πίνακας 3.3). 85

92 Πίνακας 3.3. Παραγωγή σιδηροφόρων και υδροκυανίου από επιλεγμένα βακτήρια Gramκαι Gram+ με χρήση της δοκιμής CAS σε στερεό υπόστρωμα και της δοκιμής Aquaquant Testsystem (Merck), αντίστοιχα Στελέχη CAS-blue agar (αλλαγή χρώματος) Αντίδραση CAS a Παραγωγή HCN b Gram αρνητικά P. chlororaphis ToZa7 Πορτοκαλί (Σ) ++ + S. rubidaea S55 Πορτοκαλί (Σ) ++ - S. marcescens PiHa5II Πορτοκαλί (Α) + - Gram θετικά B. cereus S76 Πορτοκαλί (Α) + - a Το κυανό CAS-agar μεταχρωματίστηκε σε σκοτεινόχρωμο (Σ) ή ανοιχτόχρωμο (Α) πορτοκαλί: + σημαίνει 1,0 4,0 και ++ σημαίνει 4,0 8,0 mm/ημέρα, μετακίνηση του μετώπου αλλαγής χρώματος στο κυανό CAS-agar (Milagres et al., 1999). b + σημαίνει θετική αντίδραση, - σημαίνει αρνητική αντίδραση. Σύμφωνα με το Merck Schnelltest 14417: - αντιπροσωπεύει παραγωγή HCN < 0,001 mg/l (Kalbe et al., 1996) Παραγωγή ενζύμων με αντιμυκητιακή δράση Η μέτρηση της χιτινολυτικής δραστηριότητας στα στελέχη P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55 και B. cereus S76, έδειξε ελάχιστη αντίδραση σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Το στέλεχος S. marcescens PiHa5II έδειξε ελαφρώς αυξημένη παραγωγή εξωχιτινασών, αλλά οι διαφορές με βάση το κριτήριο του Τukey δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές. Η παραγωγή εξωκυτταρικής πρωτεάσης των P. chlororaphis ToZa7, S. marcescens PiHa5II και S. rubidaea S55 ήταν παρόμοια για τα τρία στελέχη. Η παραγωγή του B. cereus S76, ωστόσο, ήταν σημαντικά χαμηλότερη συγκριτικά με τα τρία προαναφερθέντα στελέχη (Εικόνα 3.2). 86

93 Ζώνη αποχρωματισμού (cm) Εξωκυτταρική πρωτεάση a P. chlororaphis ToZa7 ab S. rubidaea S55 S. marcescens PiHa5ΙΙ a b B. cereus S76 Βακτηριακά στελέχη Εικόνα 3.2. Παραγωγή εξωκυτταρικής πρωτεάσης από τα επιλεγμένα στελέχη, όπως αυτή ορίζεται από τη ζώνη αποχρωματισμού στα τρυβλία με σκόνη γάλακτος-άγαρ, μετά το πέρας 48 ωρών. Τα διαφορετικά γράμματα τονίζουν τις στατιστικά σημαντικές διαφορές (p 0,05) βάσει του τεστ Mann Whitney. Το σφάλμα αντιπροσωπεύει την παραλλακτικότητα τριών βιολογικών επαναλήψεων. Αξίζει να αναφερθεί ότι κανένα από τα βακτηριακά στελέχη που επιλέχθηκαν δεν προκαλεί αιμόλυση, με βάση την απουσία ζώνης αποχρωματισμού γύρω από τις αποικίες τους σε Blood Agar και στις δύο θερμοκρασίες που δοκιμάστηκαν Παραγωγή ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη Χρωματομετρικός έλεγχος παραγωγής ινδολοξικού οξέος (ΙΑΑ) Με βάση τη χρωματομετρική μέθοδο του αντιδραστηρίου του Salkowski (Ehmann, 1977; Patten & Glick, 1996; Karnwal, 2009), τα επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη έδειξαν ότι παράγουν ινδολοξικό οξύ. Η πιο έντονη παραγωγή (με βάση την ένταση του ερυθρού χρώματος και την οπτική πυκνότητα) παρατηρήθηκε στην περίπτωση του B. cereus S76 απουσία τρυπτοφάνης. Ανάλογη αντίδραση παρατηρήθηκε και από το P. chlororaphis ToZa7, παρουσία τρυπτοφάνης σε συγκέντρωση 100 μg ml -1. Τα S. rubidaea S55 και S. marcescens PiHa5II παρουσίασαν παρόμοια συμπεριφορά, καθώς ενώ άλλαξε το χρώμα από κίτρινο σε ανοιχτό ερυθρό, η ένταση του χρώματος ήταν μειωμένη όταν προστέθηκαν 50 μg ml -1 τρυπτοφάνης και αυξημένη αρκετά, ιδίως στην περίπτωση του S. marcescens PiHa5II, με την προσθήκη των 100 μg ml -1 (Πίνακας 3.4). 87

94 Πίνακας 3.4. Χρωματομετρική μελέτη ικανότητας παραγωγής ινδολοξικού οξέος (ΙΑΑ) από τα επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη Παραγωγή IAA x Στελέχη 0 μg ml -1 L- tryptophan 50 μg ml -1 L- tryptophan 100 μg ml -1 L- tryptophan P. chlororaphis ToZa7 0,463ab 0,386ab 0,608a S. rubidaea S55 0,303ab y 0,205b 0,340a S. marcescens PiHa5II 0,292b 0,198b 0,594ab B. cereus S76 0,626a 0,415a 0,507ab x Η παρουσία του ΙΑΑ στα διηθημένα υπερκείμενα των βακτηριακών καλλιεργειών ελέγχθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο του αντιδραστηρίου του Salkowski, και οι τιμές αντιστοιχούν στην οπτική πυκνότητα των δειγμάτων μετά την αλλαγή του χρώματος από κίτρινο σε ερυθρό-ρόδινο. Η ικανότητα παραγωγής ΙΑΑ μελετήθηκε τόσο παρουσία 2 συγκεντρώσεων L-tryptophan (50 και 100 μg ml -1 ), όσο και απουσία αυτής. Τα δεδομένα προέκυψαν από 2 επαναλήψεις του πειράματος με 3 τεχνικές επαναλήψεις για την κάθε επέμβαση. y Τα διαφορετικά γράμματα, σε κάθε στήλη, φανερώνουν τις στατιστικά σημαντικές διαφορές (p 0,05) με βάση το τεστ του Tukey Ανίχνευση ρυθμιστών ανάπτυξης από τα βακτηριακά στελέχη σε σύστημα HPLC (LC-MS/MS) Τα αποτελέσματα των πειραμάτων ανάκτησης έδειξαν ότι η ζεατίνη μπορούσε να ανακτηθεί μόνο με διαλύτη εκχύλισης οξικό αιθυλεστέρα και με αρκετά υψηλό ποσοστό (45%). Οι υπόλοιπες τιμές των ανακτήσεων για τον ίδιο οργανικό διαλύτη ήταν 57% για το ΙΑΑ, 64% για το GA3 και 53% για το ΑΒΑ. Το τολουόλιο και ο πετρελαϊκός αιθέρας αποδείχτηκαν ακατάλληλοι διαλύτες εκχύλισης για την παρούσα δοκιμή και αναλυτική μέθοδο, καθώς η ανάκτηση του ΙΑΑ ήταν 5 % και μηδενική για τις υπόλοιπες τρεις ενώσεις, ενώ ο πετρελαϊκός αιθέρας δεν παρέλαβε καμία από τις υπό εξέταση ενώσεις. Τα ποσοστά ανάκτησης για το διχλωρομεθάνιο ήταν 29,6% και 49,2% για το ΙΑΑ και το ΑΒΑ, αντίστοιχα, ενώ ο διαιθυλαιθέρας ανέκτησε το 51,5% του ΙΑΑ, το 27,71% του GA3 και το 35,9% του ΑΒΑ. Η μόνη ουσία που εντοπίστηκε σε όλες τις δοκιμές και φάνηκε ότι παράγεται από όλα τα στελέχη, ήταν το ινδολοξικό οξύ. Πιο συγκεκριμένα το στέλεχος S. marcescens PiHa5II υπολογίστηκε ότι παράγει 2,177 mg IAA στα 95 ml LB, καλλιέργεια που αντιστοιχεί σε ποσότητα 0.02 gr ml -1 ξηρής βιομάζας ή 1,5 x CFU ml -1 LB. Το B. cereus S76 παρήγαγε 3,8 μg ΙΑΑ στα 95 ml καλλιέργειας (0,06 gr ml -1 ξηρής βιομάζας ή 5,2 x CFU ml -1 LB) και, το P. chlororaphis ToZa7 παρήγαγε αντίστοιχα 4,14 μg ΙΑΑ στα 90 ml καλλιέργειας (0,009 gr ml -1 ξηρής βιομάζας ή 9,46 x CFU ml -1 LB). Το στέλεχος S. rubidaea S55 υπολογίστηκε ότι παράγει 1,142 mg IAA στα 95 ml LB (0,01 gr ml -1 αφυδατωμένης βιομάζας ή 9,1 x CFU ml -1 LB). Τα δεδομένα της απευθείας έγχυσης στον χρωματογράφο, χωρίς καμία κατεργασία του δείγματος, παρά μόνο την προσθήκη 100 μg ml -1 τρυπτοφάνης, φαίνονται στον πίνακα 3.5. Από τον πίνακα φαίνεται ότι τα στελέχη B. cereus S76 και P. chlororaphis ToZa7 παράγουν μικρές ποσότητες ΙΑΑ και ο καθαρισμός με βάση τα προαναφερθέντα πρωτόκολλα μειώνει ακόμη περισσότερο την ποσότητα που ανακτάται. Το αντίθετο παρατηρείται για το στέλεχος S. rubidaea S55, 88

95 για το οποίο η ποσότητα που εντοπίστηκε μετά τον καθαρισμό ήταν εμφανώς περισσότερη. Όσον αφορά το στέλεχος S. marcescens PiHa5II, παρατηρείται μια αύξηση της παραγωγής ΙΑΑ με την προσθήκη τρυπτοφάνης, ενώ απουσία τρυπτοφάνης και μετά από καθαρισμό η ποσότητα κυμάνθηκε στα ίδια επίπεδα. Πίνακας 3.5. Δείγματα εκχυλισμάτων των ριζοβακτηρίων που αναλύθηκαν μετά από απευθείας έγχυση της καλλιέργειας στο χρωματογραφικό σύστημα Συγκέντρωση (μg/ml) x Δείγμα Απευθείας Έγχυση - Try + Try Παραλαβή και καθαρισμός P. chlororaphis ToZa7 3,07 1,17 0,046 S. rubidaea S55 3,53 9,64 12,025 S. marcescens PiHa5II 25,41 53,35 22,92 B. cereus S76 6,30 nd y 0,040 x Η συγκέντρωση προσδιορίστηκε σε υγρή καλλιέργεια LB 100ml y O όρος nd σημαίνει not detectable, μη ανιχνεύσιμο Επίδραση στελεχών στα χαρακτηριστικά αύξησης φυτών τομάτας και σιταριού σε σύστημα gnotobiotic, υπό αξενικές συνθήκες Στο παρόν πείραμα παρατηρήθηκε η ξεκάθαρη υπεροχή του στελέχους S. marcescens PiHa5ΙΙ ως προς την ικανότητά του να προάγει τα χαρακτηριστικά αύξησης των φυτών τομάτας και σιταριού. Η επίδραση αφορά στη σημαντική αύξηση του μήκους και βάρους βλαστού και αριθμού φύλλων για την τομάτα (Πίνακας 3.6) καθώς και του μήκους και βάρους βλαστού και μήκους και βάρους της ρίζας για το σιτάρι (Πίνακας 3.7). Το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 δεν προκάλεσε προαγωγή της αύξησης σε κανέναν από τους δύο ξενιστές καθώς δεν μετρήθηκε κανένα χαρακτηριστικό αύξησης που να διαφέρει στατιστικά από τον μάρτυρα τόσο στην τομάτα όσο και στο σιτάρι (Πίνακες 3.6 και 3.7). Το ίδιο παρατηρήθηκε και για το στέλεχος S. rubidaea S55, το οποίο έδειξε μια ελάχιστη θετική επίδραση μόνο στην αύξηση του βλαστού του σιταριού (Πίνακας 3.7). Το στέλεχος B. cereus S76 παρουσίασε μια σημαντική ικανότητα προαγωγής της αύξηση καθώς αύξησε σημαντικά το βάρος βλαστού (Πίνακας 3.6) και η θετική επίδραση αυτή μετρήθηκε και στο μήκος και βάρος βλαστού του σιταριού (Πίνακας 3.7). 89

96 Πίνακας 3.6. Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στα χαρακτηριστικά αύξησης της τομάτας (Solanum lycopersicum) ποικιλίας ACE55 σε σύστημα gnotobiotic, υπό αξενικές συνθήκες Επεμβάσεις x Μήκος βλαστού (cm) Βάρος βλαστού (gr) Αριθμός φύλλων Μάρτυρας 3,86b y 0,039c 0,22bc P. chlororaphis ToZa7 3,88b 0,044ab 0,06c S. rubidaea S55 4,08b 0,048ab 0,39bc S. marcescens PiHa5ΙΙ 5,58a 0,079a 0,78a B. cereus S76 4,79ab 0,059b 0,56b x Μάρτυρας= φυτά τομάτας χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0,05 Αξίζει να αναφερθεί επιπλέον, ότι οι επεμβάσεις των B. cereus S76 και S. marcescens PiHa5ΙΙ προκάλεσαν βλάστηση όλων των σπόρων του σιταριού εντός 4 και 2 ημερών αντίστοιχα, ενώ ο μάρτυρας βλάστησε μετά το πέρας 10 ημερών. Πίνακας 3.7. Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στα χαρακτηριστικά αύξησης μαλακoύ σιταριού (Triticum aestivum) ποικιλίας Βεργίνα, σε σύστημα gnotobiotic, υπό αξενικές συνθήκες Επεμβάσεις x Μήκος βλαστού (cm) Βάρος βλαστού (gr) Μήκος ρίζας (cm) Βάρος ρίζας (gr) Μάρτυρας 10c y 0,81c 3,28b 0,039b P. chlororaphis ToZa7 11,29bc 1,04bc 3,81b 0,050b S. rubidaea S55 13,16ab 1,048bc 3,96b 0,069b S. marcescens PiHa5ΙΙ 14,74a 2,93a 7,26a 0,243a B. cereus S76 13,92a 1,78b 3,34b 0,103b x Μάρτυρας= φυτά μαλακoύ σιταριού χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0, Επίδραση των στελεχών στα χαρακτηριστικά αύξησης φυτών τομάτας σε φυτοδοχεία, σε συνθήκες θερμοκηπίου Με σκοπό την περαιτέρω διερεύνηση της θετικής επίδρασης των ριζοβακτηρίων στα φυτά τομάτας, το πείραμα επαναλήφθηκε και σε συνθήκες θερμοκηπίου. Σε αυτή τη βιοδοκιμή μετρήθηκαν περισσότερα χαρακτηριστικά αύξησης καθώς επρόκειτο για μεγαλύτερα φυτά και συνεπώς ήταν πιο εύκολα στην καταγραφή. Επίσης σε αυτό το πείραμα τα μεγέθη της ξηρής βιομάζας (υπέργειου και υπόγειου τμήματος) ήταν 90

97 μετρήσιμα, γεγονός που δε συνέβαινε στα πειράματα σε σύστημα gnotobiotic, όπου τα φυτά ήταν πολύ μικρά. Παρατηρήθηκε μια συνέπεια στα αποτελέσματα, καθώς η θετική επίδραση του στελέχους S. marcescens PiHa5ΙΙ ήταν ξεκάθαρη για όλα τα χαρακτηριστικά αύξησης των φυτών τομάτας (Πίνακας 3.8). Θετική επίδραση επέδειξε και το στέλεχος B. cereus S76, το οποίο προκάλεσε σημαντική αύξηση στο μήκος και το βάρος βλαστού, αλλά και στο μήκος, βάρος και ξηρό βάρος ρίζας (Πίνακας 3.8). Σημαντική παρατήρηση ήταν η πρόκληση σχετικής πρωΐμισης της βλάστησης του σπόρου από τα δύο προαναφερθέντα ριζοβακτήρια, καθώς το 80% και 70% των φυταρίων στα B. cereus S76 και S. marcescens PiHa5ΙΙ, αντίστοιχα, φύτρωσαν την 9 η μέρα ενώ ο μάρτυρας φύτρωσε την 13 η μέρα. Το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 δεν προκάλεσε κάποια προαγωγή σε κανένα από τα χαρακτηριστικά αύξησης που μετρήθηκαν, ενώ το S. rubidaea S55 προκάλεσε μια μικρή αύξηση σε όλα τα χαρακτηριστικά αύξησης, εκτός του ξηρού βάρους της ρίζας και του αριθμού των φύλλων που δεν διέφεραν από τον μάρτυρα (Πίνακας 3.8). Πίνακας 3.8. Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στα χαρακτηριστικά αύξησης της τομάτας (Solanum lycopersicum) ποικιλίας ACE55 σε φυτοδοχεία, σε θερμοκήπιο Επεμβάσεις x Μήκος βλαστού (cm) Βάρος βλαστού (gr) Ξηρό βάρος βλαστού (gr) Μήκος ρίζας (cm) Βάρος ρίζας (gr) Ξηρό βάρος ρίζας (gr) Αριθμός φύλλων Μάρτυρας 11,37c y 1,11d 0,054c 3,1c 0,049d 0,006b 4,1b P. chlororaphis ToZa7 13,87bc 1,58cd 0,074c 3,56bc 0,1cd 0,013ab 3,8b S. rubidaea S55 14,86ab 2,07bc 0,129b 5,15b 0,132bc 0,014ab 4,4b S. marcescens PiHa5ΙΙ 16,6a 3,15a 0,191a 7,72a 0,223a 0,021a 5,4a B. cereus S76 16,03a 2,7ab 0,174ab 6,26ab 0,191ab 0,020a 5,3a x Μάρτυρας= φυτά τομάτας χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Οι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0, Επίδραση των στελεχών στα χαρακτηριστικά αύξησης και στα θρεπτικά στοιχεία φύλλων και ρίζας ρεπανιού Για το παρόν πείραμα ελέγχου προαγωγής της αύξησης, επιλέχθηκε το ρεπάνι, λαμβάνοντας υπόψη το ότι οι μελέτες προαγωγής της αύξησης από ριζοβακτήρια σε ξενιστές με υπόγεια αποθηκευτικά όργανα, όπως η πατάτα (Solanum tuberosum), το ζαχαρότευτλο (Beta vulgaris) και το ρεπάνι (Raphanus sativus) (Kloepper, 1993), δίνουν πιο εμφανή αποτελέσματα εξαιτίας του όγκου του υπόγειου φυτικού τμήματος. Το ρεπάνι θεωρείται ως ένα από τα κορυφαία φυτικά είδη για αυτόν τον σκοπό λόγω της ταχύτατης ανάπτυξής του και της ικανότητάς του να αναπτύσσεται πολύ εύκολα τόσο σε συνθήκες θερμοκηπίου όσο και στον αγρό (Kloepper & Schroth, 1978). Στην παρούσα δοκιμή, στο ρεπάνι, τα στελέχη επέδειξαν παρόμοια συμπεριφορά με αυτήν επί των προηγούμενων φυτών όσον αφορά στην προαγωγή των χαρακτηριστικών αύξησης του ρεπανιού (Πίνακας 3.9). Κάποια ριζοβακτήρια επηρέασαν την πρώιμη ανάπτυξη των φυταρίων, τον 91

98 όγκο, το βάρος και το ξηρό βάρος του υπόγειου τμήματος, το βάρος του υπεργείου. Επιπλέον παρατηρήθηκε θετική επίδραση στην πρόσληψη φωσφόρου, καλίου και μαγνησίου. Πιο αναλυτικά, ο εμβολιασμός με το στέλεχος S. marcescens PiHa5ΙΙ επηρέασε στατιστικώς σημαντικά τον όγκο της ρίζας, το βάρος του υπέργειου τμήματος και το βάρος και ξηρό βάρος του υπόγειου τμήματος (Πίνακας 3.9). Η επίδραση του εν λόγω στελέχους ήταν ακόμη μια φορά η πιο σημαντική και οι διαφορές ήταν εντονότερες στα αρχικά στάδια ανάπτυξης των φυτών καθώς τα πρώιμα φύλλα ήταν σχεδόν διπλάσια σε μέγεθος συγκριτικά με τον μάρτυρα (οπτική, μη καταγεγραμμένη παρατήρηση). Λιγότερο έντονη επίδραση παρουσίασε το στέλεχος B. cereus S76 το οποίο επηρέασε θετικά το ξηρό βάρος του υπόγειου τμήματος (Πίνακας 3.9). Το βακτήριο S. marcescens PiHa5ΙΙ επηρέασε σημαντικά και την απορρόφηση του καλίου στα φύλλα, καθώς παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της ποσότητας που εντοπίστηκε σε αυτά (Πίνακας 3.10). Το άλλο θρεπτικό στοιχείο που επηρεάστηκε από τον εμβολιασμό με τα στελέχη ήταν το μαγνήσιο, καθώς η επέμβαση με το P. chlororaphis ToZa7 αύξησε σημαντικά την απορρόφησή του στα φύλλα (Πίνακας 3.10). Όσον αφορά το υπόγειο τμήμα, παρατηρήθηκαν διαφορές μόνο στις μετρήσεις απορρόφησης του ασβεστίου και του φωσφόρου, τα οποία αυξήθηκαν μετά από τον εμβολιασμό με τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76 αντίστοιχα (Πίνακας 3.11). Πίνακας 3.9. Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στα χαρακτηριστικά αύξησης του ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 σε φυτοδοχεία, σε θερμοκήπιο Επεμβάσεις x Όγκος ρίζας (ml) Βάρος υπεργείου τμήματος (gr) Ξηρό βάρος υπεργείου τμήματος (gr) Βάρος υπογείου τμήματος (gr) Ξηρό βάρος υπογείου τμήματος (gr) Μάρτυρας 204,87b y 6,88b 0,62a 4,60b 0,31c P. chlororaphis ToZa7 205,62b 7,32b 0,64a 5,41b 0,44bc S. marcescens PiHa5ΙΙ 208,71a 8,65a 0,71a 8,31a 0,61a B. cereus S76 206,02b 7,55ab 0,67a 5,80b 0,48ab x Μάρτυρας= φυτά ρεπανιού χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0,05 Πίνακας Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στην ικανότητα απορρόφησης θρεπτικών στοιχείων (K, Ca, P, Mg) των φύλλων ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 που αναπτύχθηκε σε φυτοδοχεία, σε θερμοκήπιο Επεμβάσεις x Κ (mg/l) Ca (mg/l) P(mg/L) Mg (mg/l) Μάρτυρας 4,025b y 0,555a 1,555a 0,471b P. chlororaphis ToZa7 4,2ab 0,607a 1,598a 0,556a S. marcescens PiHa5ΙΙ 4,775a 0,753a 1,643a 0,512ab 92

99 B. cereus S76 4,375ab 0,617a 1,657a 0,500ab x Μάρτυρας= φυτά ρεπανιού χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0,05 Πίνακας Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στην ικανότητα απορρόφησης θρεπτικών στοιχείων (K, Ca, P, Mg) της υποκοτύλης και της ρίζας ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 που αναπτύχθηκε σε φυτοδοχεία, σε θερμοκήπιο Επεμβάσεις x Κ (mg/l) Ca (mg/l) P (mg/l) Mg (mg/l) Μάρτυρας 4,35a y 0,194b 1,570b 0,174a P. chlororaphis ToZa7 4,35a 0,368a 1,583ab 0,151a S. marcescens PiHa5ΙΙ 4,43a 0,19b 1,508b 0,147a B. cereus S76 4,55a 0,234b 1,657a 0,145a x Μάρτυρας= φυτά ρεπανιού χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0,05 Όσον αφορά στα βασικά θρεπτικά στοιχεία, άζωτο, άνθρακα και θείο (N, C, S), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει στατιστικά σημαντικά την απορρόφηση και συσσώρευση του αζώτου στα φύλλα (Πίνακας 3.12). Η απορρόφηση του άνθρακα επηρεάζεται από την παρουσία του B. cereus S76, το οποίο και αυξάνει σημαντικά την συγκέντρωση του στοιχείου στα φύλλα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (Πίνακας 3.12). Πίνακας Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στην ικανότητα απορρόφησης θρεπτικών στοιχείων (N, C, S) των φύλλων ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 που αναπτύχθηκε σε φυτοδοχεία, σε θερμοκήπιο Επεμβάσεις x N (%) C (%) S (%) Μάρτυρας 0,645b y 5,37b 0,095a P. chlororaphis ToZa7 0,870a 6,675ab 0,108a S. marcescens PiHa5ΙΙ 0,713ab 6,015ab 0,08a B. cereus S76 0,850ab 6,876a 0,105a x Μάρτυρας= φυτά χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0,05 Στο υπόγειο τμήμα, πιο συγκεκριμένα στο τμήμα της υποκοτύλης και της ρίζας των ρεπανιών, το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει σημαντικά τη συσσώρευση του αζώτου και του άνθρακα, ενώ τα δύο αυτά στοιχεία δεν επηρεάζονται από το S. marcescens PiHa5ΙΙ. Η συγκέντρωση του θείου είναι υψηλότερη στα φυτά του μάρτυρα 93

100 που δεν έχουν υποστεί βακτηριακή μεταχείριση, ενώ τα φυτά που εμβολιάστηκαν με το S. marcescens PiHa5ΙΙ είναι αυτά που παρουσιάζουν τη μικρότερη συγκέντρωση θείου στο υπόγειο τμήμα (Πίνακας 3.13). Πίνακας Επίδραση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων στην ικανότητα απορρόφησης θρεπτικών στοιχείων (N, C, S) της υποκοτύλης και της ρίζας ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 που αναπτύχθηκε σε φυτοδοχεία, σε θερμοκήπιο Επεμβάσεις x N (%) C (%) S (%) Μάρτυρας 0,395b y 5,69ab 0,085a P. chlororaphis ToZa7 0,453a 5,915a 0,08ab S. marcescens PiHa5ΙΙ 0,343b 5,003b 0,056c B. cereus S76 0,39ab 5,425ab 0,065ab x Μάρτυρας= φυτά ρεπανιού χωρίς βακτηριακό εμβολιασμό y Oι μέσοι όροι στην ίδια στήλη, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ του Tukey, σε επίπεδο σημαντικότητας p=0,05 Η συνολική εικόνα στο θερμοκήπιο έδειξε πιο εύρωστα φυτά στα πρώιμα στάδια, στις περιπτώσεις που είχε προϋπάρξει εμβολιασμός με ένα από τα προαναφερθέντα στελέχη. Πιο συγκεκριμένα, τα φύλλα αναπτύχθηκαν ταχύτερα και τα φυτά έφτασαν στο σημείο της ωριμότητας συντομότερα (Εικόνα 3.3). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και από τις οπτικές παρατηρήσεις στα υπόγεια τμήματα, όπου η επίδραση των στελεχών ήταν εμφανής (Εικόνα 3.4). Εικόνα 3.3. Επίδραση των στελεχών Bacillus cereus S76 και Serratia marcescens PiHa5ΙΙ (αριστερά) στην πρώιμη ανάπτυξη και τη βλάστηση φυτών ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 που αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία, σε συνθήκες θερμοκηπίου, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (δεξιά) που δεν είχε υποστεί μεταχείριση με βακτήρια. 94

101 Εικόνα 3.4. Επίδραση του στελέχους Serratia marcescens PiHa5ΙΙ (αριστερά) στην ανάπτυξη της υποκοτύλης και της ρίζας φυτών ρεπανιού (Raphanus sativus) ποικιλίας Saxa 2 που αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία, σε συνθήκες θερμοκηπίου, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (δεξιά) που δεν είχε υποστεί βακτηριακή μεταχείριση Συζήτηση Οι μικροοργανισμοί που διαβιούν στο έδαφος, και πιο συγκεκριμένα στην περιοχή της ριζόσφαιρας μπορούν να ωφελήσουν το φυτό που αποικίζουν με ποικίλους τρόπους. Οι βασικότεροι, εν συντομία, είναι η προστασία της ριζόσφαιρας από φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς μέσω του υπερπαρασιτισμού, της παραγωγής αντιβιοτικών και άλλων προϊόντων δευτερογενούς μεταβολισμού (υδροκυάνιο, αμμωνία), της παραγωγής λυτικών ενζύμων και του ανταγωνισμού για θρεπτικά στοιχεία (παραγωγή σιδηροφόρων, κατανάλωση ριζικών εκκρίσεων) (Pal & McSpadden, 2006). Επίσης πολλά ριζοβακτήρια ευνοούν με την παρουσία τους το φυτό μέσω της προαγωγής της αύξησής του. Η παραγωγή και έκκριση ορμονών ανάπτυξης, η διαλυτοποίηση των δεσμευμένων ανόργανων θρεπτικών στοιχείων, καθιστά τα ωφέλιμα αυτά ριζοβακτήρια σημαντικούς παράγοντες προαγωγής της αύξησης (Vessey, 2003; Crowley & Kraemer 2007). Στο παρόν κεφάλαιο διερευνήθηκε η ικανότητα τεσσάρων βακτηριακών στελεχών, των P. chlororaphis ToZa7, B. cereus S76, S. marcescens PiHa5II και S. rubidaea S55 να παράγουν διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες, με σκοπό να στοιχειοθετηθεί η δράση τους ως υποσχόμενων παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης (Kamou et al., 2015). Η παρούσα μελέτη είναι από τις ελάχιστες που συμπεριλαμβάνουν το ριζοβακτήριο S. rubidaea και τη δράση του ως παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης. Οι λίγες μελέτες που έχουν γίνει με αυτό το είδος, συνήθως αφορούν τις ουσίες που αυτό παράγει και όχι τόσο την απευθείας χρήση του ριζοβακτηρίου με εμβολιασμό (Kalbe et al., 1996; Nalini & Parthasarathi, 2014). Τα υπόλοιπα τρία είδη έχουν απασχολήσει συχνά τους ερευνητές στον τομέα της βιολογικής καταπολέμησης και της βακτηριακής οικολογίας καθώς πρόκειται για μικροοργανισμούς με πολλά και ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά (ενδεικτικά: Weller, 1988; Ordentlich et al., 1988; Milner et al., 1996; Whipps, 1997; Hökeberg et al., 1998; Chin A Woeng et al., 1998; Okamoto et al., 1998; Emmert et al., 1999; Haas & Défago, 2005; Choudhary & Johri, 2009; Quan et al., 2010). Από τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας προκύπτει ότι όλα τα βακτηριακά στελέχη που ελέγχθηκαν παράγουν σιδηροφόρους και μάλιστα σε διαφορετικές ποσότητες, καθώς η ένταση της αλλαγής του χρώματος, το μέγεθος του μετώπου της ζώνης μεταχρωματισμού και κατ επέκταση η ένταση της αντίδρασης στα ειδικά υποστρώματα σημείωσαν διαφορές που συσχετίζονται με τη συγκέντρωση των 95

102 παραγόμενων σιδηροφόρων (Payne, 1994; Milagres et al., 1999). Η υψηλότερη παραγωγή από τα P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 μπορεί να συσχετιστεί με τη δράση τους ως παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης καθώς η παραγωγή σιδηροφόρων στερεί από το φυτοπαθογόνο τον σίδηρο που είναι αναγκαίος για τους περισσότερους μικροοργανισμούς αλλά και πολύ σπάνιος στο εδαφικό περιβάλλον (Chet et al., 1990; Boukhalfa & Crumbliss, 2002; Pierson & Pierson, 2010). Η παραγωγή σιδηροφόρων από τα δύο αυτά στελέχη μπορεί να σχετίζεται και με την ικανότητά τους να επάγουν διασυστηματική αντοχή (βλ. Κεφάλαιο 4). Τέτοια απόκριση προκαλείται από διεγέρτες βακτηριακής προέλευσης όπως είναι το σαλικυλικό οξύ, οι σιδηροφόροι και οι λιποπολυσακχαρίτες (lipopolysaccharides, LPS) της εξωτερικής του μεμβράνης (van Loon et al., 1998). Η παραγωγή σιδηροφόρων στο πλαίσιο βιολογικής καταπολέμησης έχει διερευνηθεί κυρίως σε PGPR του γένους Pseudomonas spp. (Duijff et al., 1993; Georges & Meyer, 1995; Sayyed et al., 2004), Bacillus spp. (Wilson et al., 2006) και Serratia spp. (Seyedsayamdost et al., 2012), όπου συσχετίζεται η ικανότητα παραγωγής αυτών με την επιτυχημένη δράση των βακτηριακών στελεχών ως παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης. Η παραγωγή κυανιδίου διαπιστώθηκε μόνο για το P. chlororaphis ToZa7. Πολλά είδη του γένους Pseudomonas sp. έχουν αποδειχτεί ικανά να παράγουν υδροκυάνιο και αυτό έχει φανεί ότι επηρεάζει δυσμενώς τους εδαφογενείς φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς. Από το 1989 ο Voisard και οι συνεργάτες του, μετασχηματίζοντας το στέλεχος P. fluorescens CHAO ώστε να μην παράγει HCN, απέδειξαν πως αυτό χάνει την ικανότητά του να καταστέλλει τη μαύρη σήψη των ριζών του καπνού που προκαλείται από τον μύκητα T. basicola. Κάποια χρόνια αργότερα, με τη χρήση του ίδιου μεταλλαγμένου στελέχους, αποδείχτηκε η αδυναμία να καταπολεμηθεί η ασθένεια της σήψης στελεχών του σιταριού (take-all) που προκαλείται από τον Gaeumannomyces graminis f.sp. tritici όταν δεν παράγεται υδροκυάνιο από το βακτηριακό στέλεχος (Haas et al., 1991). Από την άλλη, υπάρχουν και κάποιες μελέτες που δείχνουν ότι η παραγωγή HCN από κάποιες ψευδομονάδες μπορεί σε κάποιες περιπτώσεις να αποδειχτεί καταστροφική για την ανάπτυξη του ξενιστή (Bakker & Schippers, 1987; Schippers et al., 1988; Bakker et al., 1989). Συμπερασματικά, η παραγωγή του HCN δεν είναι αμιγώς ωφέλιμη για τον ξενιστή, κυρίως όσον αφορά στην προαγωγή/αναστολή της αύξησής του. Είναι πιθανό η παραγωγή του υδροκυανίου να έχει διαφορετική επίδραση ανάλογα με τον ξενιστή. Για τα φυτά καπνού για παράδειγμα, η επίδραση είναι εμφανώς θετική (Voisard et al., 1989) ενώ όπως προαναφέρθηκε, σε φυτά πατάτας, μαρουλιού και φασολιάς, η αύξηση φαίνεται ότι αναστέλλεται (Bakker & Schippers, 1987; Bakker et al., 1989; Åström & Burns, 1989). Συχνά, η παραγωγή υδροκυανίου συσχετίζεται με την παραγωγή σιδηροφόρων και με την αποτελεσματικότητα καταπολέμησης του εκάστοτε στελέχους (O Sullivan & O Gara, 1992; De Bellis & Ercolani, 2001; Nagrajkumar et al., 2004). Στην παρούσα διατριβή αποδεικνύεται η ικανότητα του P. chlororaphis ToZa7 από τη μία να δρα αποτελεσματικά ως παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης στην περίπτωση της σήψης ριζών και λαιμού από Forl και από την άλλη να μην επιδρά θετικά στην προαγωγή της αύξησης της τομάτας. Ενώ λοιπόν βλέπει κανείς ότι είναι ένα στέλεχος που παράγει ινδολοξικό οξύ σε σημαντικές ποσότητες και αναμένεται να προάγει την αύξηση των φυτών στα οποία δοκιμάστηκε, τα αποτελέσματα δείχνουν ακόμη και περιορισμό των χαρακτηριστικών αύξησης που μετρήθηκαν και στα τρία φυτικά είδη (τομάτα, σιτάρι, ρεπάνι). Αυτό μπορεί να εξηγηθεί 96

103 με βάση τις προαναφερθείσες μελέτες που επικεντρώνονται στην επίδραση των ειδών του γένους Pseudomonas sp. που παράγουν HCN, καθώς είναι πολύ πιθανό αυτό το τελευταίο να περιορίζει την αύξηση των συγκεκριμένων φυτών, στις συγκεκριμένες συνθήκες. Τα αποτελέσματα που αφορούσαν τη μέτρηση της χιτινολυτικής δραστηριότητας στα στελέχη P. chlororaphis ToZa7, S. rubidaea S55 και B. cereus S76, έδειξαν ότι η παραγωγή χιτινολυτικών ενζύμων δεν συμβαίνει στα εν λόγω στελέχη. Από την άλλη, η παραγωγή εξωκυτταρικής πρωτεάσης των P. chlororaphis ToZa7, S. marcescens PiHa5II και S. rubidaea S55 ήταν παρόμοια και αυξημένη για τα τρία στελέχη. Το B. cereus S76 φάνηκε να παράγει μικρότερες ποσότητες πρωτεϊνολυτικών ενζύμων. Οι μικροβιακές πρωτεάσες είναι από τα πιο σημαντικά υδρολυτικά ένζυμα καθώς πρόκειται για ένζυμα που παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στις κυτταρικές μεταβολικές διαδικασίες. Οι εξωκυτταρικές πρωτεάσες, ιδιαίτερα, παίζουν έναν σημαντικό ρόλο στην υδρόλυση των πρωτεϊνών στο εξωκυτταρικό περιβάλλον του βακτηρίου. Αφενός, οι παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης χρησιμοποιούν ουσίες πρωτεϊνικής φύσεως ως θρεπτική βάση, συνεπώς ενιχύουν την ικανότητά τους για τροφικό ανταγωνισμό. Αφετέρου οι πρωτεΐνες είναι δομικά στοιχεία των φυτοπαθογόνων και κατ επέκταση το φαινόμενο μπορεί να συνοδεύεται και από υπερπαρασιτισμό. Αποδομώντας το κύτταρο-στόχο, τα εκάστοτε βακτήρια μπορούν να απορροφήσουν και να χρησιμοποιήσουν τα υδρολυθέντα προϊόντα, χαρακτηριστικά σημαντικά και αναγκαία για τους εν δυνάμει παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης που θα αντιμετωπίσουν φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς στη ριζόσφαιρα (Kalisz, 1988; Gupta et al., 2002). Όσον αφορά στην ικανότητα των ριζοβακτηρίων να παράγουν ρυθμιστές ανάπτυξης των φυτών, τα στελέχη αποδείχτηκαν ικανά να παράγουν ινδολοξικό οξύ (ΙΑΑ) σε σημαντικές ποσότητες. Τα αποτελέσματα αυτά συνδυάζονται απόλυτα με τα ευρήματα περί προαγωγής της αύξησης τομάτας και σιταριού σε σύστημα gnotobiotic και τομάτας και ρεπανιού σε θερμοκηπιακές συνθήκες. Με βάση τα αποτελέσματα μπορεί να συσχετιστεί η εξαιρετική ικανότητας παραγωγής ΙΑΑ με την ικανότητα να προάγεται η αύξηση των προαναφερθέντων φυτικών ειδών, καθώς ειδικότερα το στέλεχος S. marcescens PiHa5II έδειξε μια ξεκάθαρη υπεροχή τόσο στην παραγωγή του ΙΑΑ όσο και στην προαγωγή της αύξησης των παραπάνω φυτών. Αντίστοιχα, το στέλεχος με τη μικρότερη ικανότητα προαγωγής αύξησης ήταν το P. chlororaphis ToZa7 το οποίο δεν παρήγαγε μεγάλες ποσότητες ΙΑΑ, σε σύγκριση με τα υπόλοιπα στελέχη. Αυτά τα ευρήματα συνάδουν με τα αποτελέσματα πολλών εργασιών της διεθνούς βιβλιογραφίας (Lalande et al., 1989; Glick, 1995; Bowen & Rovira, 1999; Idris et al., 2004; 2007; Kakar et al., 2014; Almoneafy et al., 2014) στις οποίες παρατηρήθηκε συσχέτιση της ικανότητας προαγωγής της αύξησης με την ικανότητα παραγωγής ΙΑΑ. Ο Idris και οι συνεργάτες του μάλιστα εμποδίζοντας την έκφραση ενός γονιδίου υπεύθυνου για τη βιοσύνθεση ΙΑΑ στο στέλεχος B. amyloliquefaciens FZB42, παρατήρησαν μείωση της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΙΑΑ και ταυτόχρονα αντίστοιχα μειωμένη φυτική ανάπτυξη (Idris et al., 2007). Παρόμοια αποτελέσματα καταγράφηκαν και στην εργασία των Kakar et al. (2014), όπου το στέλεχος B. amyloliquefaciens Bk7 που προκάλεσε την πιο έντονη προαγωγή της αύξησης φυτών ρυζιού ήταν και αυτό με τη μεγαλύτερη ικανότητα παραγωγής ΙΑΑ. Στην παρούσα εργασία το στέλεχος S. marcescens PiHa5ΙΙ είναι αυτό που επηρεάζει σημαντικά και την απορρόφηση καλίου στα φύλλα του ρεπανιού. Το κάλιο είναι ένα στοιχείο που παρέχει πολλά οφέλη στα φυτά καθώς προάγει την αύξηση των ριζών και 97

104 ενισχύει την αντίσταση στην ξηρασία διατηρώντας έτσι τα κύτταρα σε σπαργή και μειώνοντας τις απώλειες σε νερό (Armstrong et al., 1998). Αυτό οφείλεται στο σημαντικό ρόλο του καλίου στο άνοιγμα και κλείσιμο των στομάτων. Επιπλέον είναι ένα αναγκαίο στοιχείο για πολλές βιοχημικές διεργασίες, καθώς ενεργοποιεί πολλά ενζυμικά συστήματα και συμμετέχει στη μεταφορά σακχάρων και αμύλου εντός των κυττάρων και διακυτταρικά. Το S. marcescens PiHa5ΙΙ αύξησε με την παρουσία του την ποσότητα καλίου που εντοπίστηκε στα φύλλα πράγμα που μπορεί να συσχετιστεί με την προαγωγή της αύξησης καθώς το κάλιο συμβάλλει στη φωτοσύνθεση και μειώνει τη διαπνοή, εμποδίζοντας έτσι τις απώλειες ενέργειας (Armstrong et al., 1998). Το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 από την άλλη, αύξησε σημαντικά την απορρόφηση του μαγνησίου στα φύλλα του ρεπανιού. Το μαγνήσιο συμμετέχει σε πολυάριθμες φυσιολογικές και βιοχημικές διεργασίες οι οποίες επηρεάζουν την αύξηση του φυτού, κυρίως αν το στοιχείο είναι σε έλλειψη (Shaul, 2002). Παραδείγματα ενζύμων που ενεργοποιούνται από το Mg είναι τα εξής: ATPάσες (ATPases), καρβοξυλάση της διφωσφορικής ριβουλόζης (ribulose-1,5-bisphosphate, RuBP carboxylase), RNA πολυμεράση και πρωτεϊνικές κινάσες (Marschner, 1995; Shaul, 2002). Ο πιο γνωστός ρόλος του μαγνησίου είναι το ότι είναι το κεντρικό μόριο του ατόμου της χλωροφύλλης και λόγω αυτού η έλλειψη μαγνησίου σχετίζεται με την ανάπτυξη μεσονεύριας χλώρωσης του φύλλου (Shaul, 2002). Το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 αύξησε σημαντικά και την ποσότητα ασβεστίου στο υπόγειο τμήμα του ρεπανιού. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το ρεπάνι, ένα μέλος της οικογένειας των Σταυρανθών (Brassicaceae syn. Cruciferae), η οποία είναι γνωστή για τη συσσώρευση διαλυτού ασβεστίου στους ιστούς των φυτών που ανήκουν σε αυτήν, σε βαθμό μάλιστα που τα φυτά της οικογένειας αυτής να καλούνται ασβεστότροφα φυτά (calciotrophs) (Kinzel & Lechner, 1992). Πρόκειται για ένα στοιχείο το οποίο αποδεικνύεται βασικό για την αύξηση του φυτού αλλά ο ρόλος του πολλές φορές δεν είναι ξεκάθαρος καθώς τα όρια εντός των οποίων είναι ωφέλιμο για την αύξηση του φυτού ποικίλλουν ανάλογα με το φυτικό είδος (White και Broadley, 2003). Σε πολλές περιπτώσεις έχει αναφερθεί μια ανασταλτική επίδραση στην αύξηση όταν συσσωρεύεται μεγάλη ποσότητα ασβεστίου εντός του φυτικού ιστού, καμία μελέτη όμως δε μπορεί να καταλήξει με σιγουριά στο ότι το φαινόμενο αυτό οφείλεται μόνο στην αυξημένη συγκέντρωση του ασβεστίου (Hepler, 2005). Επιπλέον, το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει σημαντικά την απορρόφηση του αζώτου στο υπέργειο τμήμα και του αζώτου και του άνθρακα στο υπόγειο τμήμα, σε σύγκριση με τον μη εμβολιασμένο μάρτυρα. Διερευνώντας τη βιβλιογραφία, φαίνεται πως τα στελέχη του γένους Pseudomonas είναι ικανά να δράσουν ως λιπαντές αζώτου για το φυτό. Ο Minorsky (2008) απέδειξε την ικανότητα του στελέχους P. fluorescens B16, να αποικίζει αποτελεσματικά τη ριζόσφαιρα της τομάτας προάγοντας την αύξηση των φυτών μέσω της πρόσληψης αζώτου. Ένα ακόμη παράδειγμα είναι η μελέτη των Mirza et al. (2006), όπου αποδεικνύεται ότι η μη συμβιωτική (ή ριζοσφαιρική) πρόσληψη αζώτου γίνεται και από διαζωτροφικά ελεύθερα βακτήρια του γένους Pseudomonas (Mirza et al., 2006). Σε αυτές τις περιπτώσεις ωστόσο η αύξηση της πρόσληψης του αζώτου συνοδεύεται και από ανάλογη προαγωγή της αύξησης. Συμπερασματικά, όσον αφορά στο στέλεχος P. chlororaphis ToZa7, παραμένει προς διερεύνηση το ζήτημα της μειωμένης αύξησης που παρατηρείται μετά τον εμβολιασμό 98

105 του φυτού με το στέλεχος αυτό, αλλά και τα αντικρουόμενα αποτελέσματα της ανάλυσης των θρεπτικών στοιχείων Ca, N, C, S. Πιο συγκεκριμένα θα πρέπει να διερευνηθεί το κομμάτι που αφορά την αναστολή της αύξησης από το συγκεκριμένο στέλεχος. Τέλος, όσον αφορά στο υπόγειο τμήμα του ρεπανιού, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απορρόφηση του φωσφόρου αυξήθηκε μετά από τον εμβολιασμό με το στέλεχος B. cereus S76. Τα φυτά προσλαμβάνουν τον φώσφορο από το εδαφικό διάλυμα με τη μορφή φωσφορικού άλατος. Ο φώσφορος είναι το λιγότερο κινητό στοιχείο εντός του φυτού αλλά και στο έδαφος συγκριτικά με τα υπόλοιπα μακροστοιχεία (Mohammadi, 2012). Το γένος Bacillus είναι γνωστό για την ικανότητά του να διαλυτοποιεί τον φώσφορο και έτσι αυτός να γίνεται περισσότερο διαθέσιμος για τα φυτά, χωρίς το στέλεχος να αποικίζει το φυτό (Kucey et al., 1989). Συνοψίζοντας, τα PGPR είναι ικανά να μεταβάλουν τη φυσιολογία του φυτού καθώς και τις φυσικές και χημικές ιδιότητες του εδάφους, και κατ επέκταση να επηρεάσουν τον αποικισμό των εδαφογενών μικροοργανισμών στη συγκεκριμένη περιοχή. Ο εμβολιασμός φυτών με ριζοβακτήρια μπορεί να αυξήσει την απορρόφηση θρεπτικών στοιχείων όπως Ca, K, Fe, Cu, Mn και Zn, μέσω της διέγερσης των αντλιών πρωτονίων ATPάσης (proton pump ATPase) (Mantelin & Touraine, 2004). Αυτή η αύξηση της απορρόφησης θρεπτικών στοιχείων από τα φυτά μπορεί να εξηγηθεί κατά ένα μέρος και από την παραγωγή οργανικών οξέων από τα φυτά και τα PGPRs, τα οποία μειώνουν έτσι το εδαφικό ph στη ριζόσφαιρα και κατ επέκταση αυξάνουν τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών στοιχείων για τα φυτά (Phillips, 1980; Forde, 2000; Glass et al. 2002). Η διαλυτοποίηση αδιάλυτων, μη διαθέσιμων θρεπτικών στοιχείων είναι άλλωστε η βασικότερη προϋπόθεση της διευκόλυνσης της μεταφοράς αυτών (Glick, 1995). 99

106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Ανάλυση αλληλεπιδράσεων μεταξύ των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Clonostachys rosea IK726 σε φυτά τομάτας 4.1. Περίληψη Σε αυτό το κεφάλαιο διερευνήθηκε ο συνδυασμός των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 με τον ωφέλιμο μύκητα Clonostachys rosea IK726. Δοκιμές in vitro έδειξαν πως σε διπλές καλλιέργειες ο C. rosea IK726 παρουσιάζει υψηλή ανεκτικότητα στο στέλεχος S. rubidaea S55, αλλά όχι στο P. chlororaphis ToZa7. Με σκοπό τη διερεύνηση του μηχανισμού αυτής της ανεκτικότητας, ελέγχθηκε η έκφραση 14 γονιδίων ABC-transporter στον C. rosea IK726 με τη χρήση της RT-qPCR. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε σε μυκήλιο του C. rosea IK726 που αναπτύχθηκε σε υπερκείμενα καλλιεργειών των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης έδειξε σημαντική επαγωγή στην έκφραση των γονιδίων abcb1, abcb26, abcg8 και abcg25 στο μυκήλιο που αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 ωρών, του S. rubidaea S55. Ωστόσο, καμία σημαντική επαγωγή δεν παρατηρήθηκε στο αντίστοιχο υπερκείμενο του P. chlororaphis ToZa7. Επιπλέον, όταν ο μύκητας αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 72 ωρών του S. rubidaea S55, 5 γονίδια (abcc14, abcc12, abcb20, abcb1, και abcb26) εκφράστηκαν σημαντικά περισσότερο, ενώ η αντίστοιχη ανάπτυξη σε υπερκείμενο 72 ωρών του P. chlororaphis ToZa7 προκάλεσε την επαγωγή 3 μόνο γονιδίων (abcc14, abcb1, και abcb26). Η παρούσα μελέτη υπογραμμίζει τη σημασία των μεταφορέων ABC για την εκροή από το κύτταρο των βακτηριακών τοξικών μεταβολιτών, γεγονός που θα επέτρεπε το συνδυασμό του με βακτηριακούς παράγοντες βιολογικού ελέγχου, σε εφαρμογές βιολογικής καταπολέμησης. Η θετική επίδραση του συνδυασμού των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης ελέγχθηκε σε in planta πειράματα σε τομάτα, σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες, όπου και παρουσίασαν ικανοποιητική φυτοπροστατευτική δράση. Ως εκ τούτου, για τη διερεύνηση του ενδεχόμενου επαγωγής διασυστηματικής αντοχής στον ξενιστή από τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης, ελέγχθηκε η έκφραση 3 γονιδίων που κωδικοποιούν στοιχεία των αμυντικών μηχανισμών της τομάτας, με τη χρήση RT-qPCR. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε σε ρίζες φυτών τομάτας που αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες και τα γονίδια που μελετήθηκαν ήταν τα PR-1a, GLUA και CHI3 τα οποία κωδικοποιούν αντιμικροβιακές πρωτεΐνες τύπου PR-1, PR-2, PR- 3, αντίστοιχα. Οι παραπάνω δοκιμές συνδυάστηκαν και με παρατηρήσεις στο μικροσκόπιο με σκοπό τη μελέτη της συμπεριφοράς του ωφέλιμου μύκητα C. rosea ΙΚ726 πάνω στις ρίζες της τομάτας και ιδιαίτερα του τρόπου αποικισμού ώστε να συγκριθεί με τον ήδη γνωστό τρόπο αποικισμού του παθογόνου Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici (Forl). Ο φυτοπαθογόνος μύκητας Forl μετασχηματίστηκε με τo γονίδιο της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης DsRed και ο ωφέλιμος μύκητας C. rosea ΙΚ726 με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (Green Fluorescent Protein, GFP). Τέλος, μελετήθηκε ο αποικισμός του ριζικού συστήματος της τομάτας από το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7. Το βακτήριο μετασχηματίστηκε με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης μέσω βακτηριακής σύζευξης. Ο αποικισμός παρατηρήθηκε σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες laser, ύστερα από εμβολιασμό του 100

107 μετασχηματισμένου βακτηρίου σε βλαστημένους σπόρους τομάτας. Έξι ημέρες μετά τον εμβολιασμό παρατηρήθηκε ότι το βακτήριο αποίκισε τα ριζικά τριχίδια και τα επιφανειακά κύτταρα της τομάτας εμφανίζοντας ενδοφυτική συμπεριφορά Εισαγωγή Ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK726 Όπως προαναφέρθηκε στο Κεφάλαιο 1 (1.4), ο παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης C. rosea ΙΚ726 είναι ένας αποτελεσματικός ανταγωνιστής που παρουσιάζει ανασταλτική δράση εναντίον πολύ σημαντικών φυτοπαθογόνων μυκήτων, δρώντας άμεσα επί αυτών και έμμεσα επάγοντας την έκφραση γονιδίων αντοχής σε κάποιους ξενιστές (Roberti et al., 2008; Lahlali & Peng, 2013). Εκτός από το ότι δρα ως αποτελεσματικός παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης, προάγει και την αύξηση των φυτών (Knudsen et al., 1995; Jensen et al., 2000) Οι μυκητιακοί μεταφορείς ABC Οι μεταφορείς ABC επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την αλληλεπίδραση των μυκητιακών παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης με άλλους μικροοργανισμούς. Πρόκειται για πρωτεΐνες, ο ρόλος των οποίων στην ενεργή εκροή τοξικών ενώσεων από το κύτταρο υπογραμμίζεται σε πληθώρα ερευνητικών εργασιών. Η επαγωγή των γονιδίων των μεταφορέων ABC έχει παρατηρηθεί μετά από έκθεση σε αντιβιοτικά (Schoonbeek et al., 2002; Schouten et al., 2008). Μια πολύ σημαντική προϋπόθεση για να ενσωματωθεί ένας παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης στη γεωργική πράξη είναι το να είναι ικανός να ανέχεται χημικά μυκητοκτόνα και εντομοκτόνα ή/και άλλους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης (Jensen et al., 2007). Οι μεταφορείς ABC έχει αναφερθεί ότι προστατεύουν τους μυκητιακούς παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης, όπως μύκητες του γένους Trichoderma spp. (Ruocco et al., 2009) και C. rosea (Dubey et al., 2014; Kosawang et al., 2014), τόσο από δευτερογενείς μεταβολίτες που παράγονται από τους μύκητες που αποτελούν τη λεία, όσο και από μυκητοκτόνα. Το γονιδίωμα του C. rosea IK726 περιέχει 86 γονίδια μεταφορέων ABC, με μεγάλο αριθμό εξ αυτών να ανήκουν στην υποοικογένεια Β, η οποία σχετίζεται με την πολυφαρμακευτική αντοχή (multidrug resistance, MDR) και στην υποοικογένεια G, που σχετίζεται με την πλειοτροπική αντοχή (pleiotropic drug resistance, PDR) σε εξωγενείς τοξικές ενώσεις (Karlsson et al., 2015). Στη διάρκεια ενός πιθανού συνδυασμού μυκητιακών και βακτηριακών παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης, οι μυκητιακοί μεταφορείς ABC θα μπορούσαν να παίξουν έναν πολύ σημαντικό ρόλο, διατηρώντας τη συγκέντρωση των βακτηριακών αντιμυκητιακών ενώσεων σε μη τοξικά επίπεδα (Del Sorbo et al., 2000; Schoonbeek et al., 2002). Οι πρωτεΐνες-μεταφορείς ABC προσδένουν και υδρολύουν τριφωσφορική αδενοσίνη (adenosine triphosphate, ATP) ώστε να παραχθεί η απαραίτητη ενέργεια για να μεταφερθούν οι διαλυτές ουσίες μέσω της πρωτοπλασματικής μεμβράνης. Οι μεταφορείς ABC είναι υπεύθυνοι για την εκροή μεγάλου αριθμού τοξικών ενώσεων, όπως είναι τα αντιβιοτικά που παράγονται από άλλους μικροοργανισμούς, τα συνθετικά μυκητοκτόνα, καθώς και οι αντιμικροβιακές ουσίες που παράγονται από τα φυτά στο πλαίσιο της αμυντικής απόκρισης (Del Sorbo et al., 2000; Coleman & Mylonakis 2009). 101

108 Οι μυκητιακές πρωτεΐνες ABC, με βάση τη φυλογενετική ανάλυση αυτών, χωρίζονται σε 8 υποοικογένειες (από Α μέχρι Η) και σε μια ακόμη «μη ταξινομημένη» ομάδα (Kovalchuk & Driessen 2010). Ένας τυπικός μεταφορέας ABC (πλήρους μεγέθους) αποτελείται από 4 σταθερές περιοχές στον πυρήνα του, 2 κυτοπλασματικές περιοχές πρόσδεσης νουκλεοτιδίων (cytoplasmic nucleotide binding domains, NBDs) και 2 διαμεμβρανικές περιοχές που σχετίζονται με τη μεμβράνη (membrane associated transmembrane domains, TMDs). Οι μεταφορείς μισού μεγέθους έχουν μόνο μία NBD με μία μοναδική TMD (Coleman & Mylonakis 2009; Lamping et al., 2010). Διάφοροι μεταφορείς των υποοικογενειών B (πλήρους μεγέθους) και G σχετίζονται με την MDR ή την PDR. Επιπρόσθετα μέλη των υποοικογενειών B (μισού μεγέθους) και C (πρωτεΐνη σχετιζόμενη με την πολυφαρμακευτική αντοχή, MRP) σχετίζονται με τη μεταφορά τοξινών εκτός των κυττάρων, ή με την εκροή δευτερογενών μεταβολιτών (Coleman & Mylonakis 2009) Γονίδια που σχετίζονται με την επαγωγή της αντοχής Η συσσώρευση του σαλικυλικού οξέος που ενεργοποιείται από τα MAMPs (βλέπε παράγραφο 1.2.4), παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα (Pieterse et al., 2001; Robert-Seilaniantz et al., 2011; Pieterse et al., 2012; Zamioudis & Pieterse, 2012). Ως εκ τούτου, είναι σημαντική η παρακολούθηση των γονιδίων που σχετίζονται με το μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος, όπως τα PR-1a και GLUA (Aimé et al., 2013). Ενώ μέχρι πρόσφατα η συσσώρευση του SA ήταν γνωστό ότι γινόταν μετά από μόλυνση πρόκλησης από κάποιο παθογόνο στέλεχος, πολλές αναφορές καταγράφουν το συγκεκριμένο φαινόμενο να συμβαίνει μετά από εμβολιασμό με μη παθογόνα στελέχη μυκήτων. Το στέλεχος F. oxysporum που προστατεύει το Asparagus officinalis από προσβολές από παθογόνα στελέχη Fusarium spp., προκαλεί συσσώρευση ενζύμων που σχετίζονται με την άμυνα (υπεροξιδάση και αμμωνιακή λυάση της φαινυλαλανίνης) στις ρίζες στις οποίες εμβολιάζεται (He et al., 2002). Παρόμοια αποτελέσματα παρατήρησαν οι Paparu et al. (2007) όταν ρίζες μπανανιάς αφού εμβολιάστηκαν από μη παθογόνα ενδόφυτα στελέχη F. oxysporum εμφάνισαν αντοχή στο Rodopholus similis και παρουσίασαν αυξημένη παραγωγή καταλάσης και πρωτεϊνης PR-1. Επιπρόσθετα, σε ρίζες φυτών πιπεριάς που προεμβολιάστηκαν με το στέλεχος Fo47 και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν με Verticillium dalhiae, υπερεκφράστηκαν τρία γονίδια τα οποία κωδικοποιούσαν μια βασική πρωτεΐνη PR-1, μια χιτινάση τύπου II και μια κυκλάση (σεσκιτερπενοειδή κυκλάση) (Veloso & Díaz, 2012). Το στέλεχος P. fluorescens WCS417r, προκάλεσε την επαγωγή της ISR σε φυτά Arabidopsis, μέσω βιοσυνθετικής οδού ανεξάρτητης του σαλικυλικού οξέος (SA), χωρίς να ενεργοποιούνται πρωτεΐνες PR (Pieterse et al., 1996, 1998; 2000; Van Wees et al., 1997), αλλά μέσω της παραγωγής ιασμονικού οξέος (JA) και αιθυλενίου (ET) (Pieterse et al., 1998). Ομοίως, το στέλεχος P. fluorescens CHA0 προκάλεσε επαγωγή της ISR, μέσω της βιοσυνθετικής οδού του ιασμονικού οξέος, ανεξαρτήτως της συσσώρευσης SA (Iavicoli et al., 2003). Σε αντιδιαστολή με τα δύο προαναφερθέντα στελέχη, το P. aeruginosa 7NSK2 προκάλεσε επαγωγή της αντοχής σε φυτά καπνού με έναν τρόπο που εξαρτάται από το SA, αλλά χωρίς να επάγεται η έκφραση της PR-1a (De Meyer et al., 1999). Η 102

109 διασυστηματική αντοχή που επήχθη από το Paenibacillus polymyxa συσχετίστηκε με την υπερέκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούσαν και τις τρεις ενώσεις-σηματοδότες (SA, JA και ET) (Timmusk & Wagner, 1999). Είναι σημαντικό λοιπόν να μελετηθεί η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται και με τις δύο οδούς σήμανσης, του σαλικυλικού οξέος και του ιασμονικού οξέος-αιθυλενίου (Pieterse et al., 2001; 2012; Wang et al., 2005; Zamioudis & Pieterse 2012; Aimé et al., 2013). Κάποια τέτοια ενδεικτικά γονίδια που σχετίζονται με την επαγωγή αντοχής στην τομάτα είναι τα CHI3 και CHI9 που κωδικοποιούν μια όξινη και μια βασική εξωκυτταρική χιτινάση αντίστοιχα, τα GLUA και GLUB που κωδικοποιούν μια όξινη και μια βασική εξωκυτταρική β-1,3-γλουκανάση, το LOXD που κωδικοποιεί μια λιποξυγενάση και το PR-1a που κωδικοποιεί τον όξινο τύπο της PR-1 (Van Kan et al., 1992; Danhash et al., 1993; Heitz et al., 1997; Kavroulakis et al., 2006). Αξιοσήμειωτη είναι η συσχέτισή των γονιδίων αυτών με την αντοχή σε διάφορα είδη του γένους Fusarium spp. που προκαλούν αδρομυκώσεις (Cachinero et al., 2002; Wróbel- Kwiatkowska et al., 2004). Η έκφραση των προαναφερθέντων γονιδίων PR μπορεί να γίνει και στα έτοιμα (primed) φυτά, τα οποία βρίσκονται σε μια διεγερμένη κατάσταση μετά από τον εμβολιασμό τους με ριζοβακτήρια (Verhagen et al., 2004). Τα φυτά χαρακτηρίζονται ως έτοιμα ή σε ετοιμότητα (priming), γιατί είναι πλέον ικανά να αντιδράσουν γρηγορότερα και εντονότερα απέναντι σε ένα παθογόνο ύστερα από μόλυνση πρόκλησης, σε σύγκριση με ένα φυτό το οποίο δεν έχει διεγερθεί (Kavroulakis et al., 2006) Σκοπός των πειραμάτων Οι στόχοι των πειραμάτων που αναφέρονται στο παρόν κεφάλαιο ήταν οι εξής: α) η διερεύνηση της δυνατότητας συνδυασμού του ωφέλιμου μύκητα C. rosea IK726 με τα ριζοβακτήρια P. chlororaphis ToZa7 ή S. rubidaea S55 και ο έλεγχος του μηχανισμού της αντοχής του πρώτου στους τοξικούς μεταβολίτες των βακτηρίων, μέσω της έκφρασης 14 γονιδίων μεταφορέων ABC του μύκητα παρουσία των βακτηρίων, β) η παρακολούθηση της διέγερσης διασυστηματικής αγωγής στην τομάτα, ύστερα από εφαρμογή των ανωτέρω παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης, μέσω έκφρασης 3 γονιδίων που κωδικοποιούν στοιχεία των αμυντικών μηχανισμών στο φυτό και γ) η μελέτη, με τη χρήση μικροσκοπίου, της αλληλεπίδρασης των μυκήτων C. rosea IK726 και Forl πάνω στο ριζικό σύστημα της τομάτας, καθώς και του ριζοβακτηρίου P. chlororaphis ToZa Υλικά και Μέθοδοι Καλλιέργεια και διατήρηση μικροοργανισμών και παραγωγή μολύσματος Οι μύκητες C. rosea IK726 και Forl (απομόνωση ZUM 2407/IPO-DLO) παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον καθηγητή Dan Funck Jensen του Τμήματος Δασικής Μυκητολογίας και Φυτοπαθολογίας του Σουηδικoύ Πανεπιστημίου Γεωργικών Επιστημών (Sveriges Lantbruksuniversitet, SLU) και από τον καθηγητή Ben Lugtenberg του Ινστιτούτου Βιολογίας του Πανεπιστημίου του Leiden, αντίστοιχα και διατηρήθηκαν σε τρυβλία με Potato Dextrose Agar (PDA, BD DifcoTM, Le pont de Claix, France), στους 25 C. Τα κονίδια του C. rosea IK726 συλλέχθηκαν απευθείας από το τρυβλίο ως αιώρημα σε αποστειρωμένο νερό που αμέσως διηθήθηκε μέσω miracloth (Calbiochem, USA) ώστε να 103

110 απομακρυνθούν οι μυκηλιακές υφές. Ο Forl καλλιεργήθηκε σε Czapek-Dox Broth (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Nethelands), για 5-7 ημέρες, στους 25 C, σε αναδευτήρα, στα 150 rpm και τα κονίδια διαχωρίστηκαν από το μυκήλιο με διήθηση μέσω miracloth. Η συγκέντρωση των κονιδίων των δύο μυκήτων υπολογιζόταν κάθε φορά με αιματοκυττόμετρο (Thoma, Blaubrand GmbH, Germany, 0.1 mm x mm 2 ). Τα P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 καλλιεργούνταν σε τρυβλία LB, στους 25 C In vitro μελέτη της επίδρασης των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 επί της ανάπτυξης των C. rosea IK726 και Forl Βιοδοκιμές μυκηλιακής ανάπτυξης και βλάστησης σπορίων σε διπλές καλλιέργειες Πραγματοποιήθηκαν 2 βιοδοκιμές διπλών καλλιεργειών και 2 βιοδοκιμές βλάστησης σπορίων: (1) P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 απέναντι στον C. rosea IK726, και (2) P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 απέναντι στον Forl. Στις βιοδοκιμές διπλών καλλιεργειών, τα βακτήρια εμβολιάστηκαν σε δύο γραμμές (αποικίες 2,5 cm), σε απόσταση 1 cm από την περιφέρεια τρυβλίου Petri, 9 cm, το οποίο περιείχε LB-άγαρ. Οι μύκητες εμβολιάστηκαν με εμβόλια διαμέτρου 4 mm στο κέντρο του τρυβλίου και σε απόσταση 3 cm από το βακτήριο κάθε φορά. Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία με τον εκάστοτε μύκητα να αναπτύσσεται απουσία των βακτηρίων (Εικόνα 4.1). Η αναστολή υπολογίστηκε ως: Ποσοστό Αναστολής % = (C E)/C * 100 % (Püntener W., 1981), όπου το C αντιπροσωπεύει τη μέση διάμετρο των αποικιών της ομάδας των αρνητικών μαρτύρων και το E αντιπροσωπεύει τη μέση διάμετρο των αποικιών της ομάδας των επεμβάσεων. Γενικά αν το ποσοστό αναστολής ξεπερνούσε το 20%, ο μύκητας εθεωρείτο υπό αναστολή. Τα τρυβλία επωάστηκαν για 12 ημέρες στους 25 C, στο σκοτάδι, οι τεχνικές επαναλήψεις ήταν 5 και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Εικόνα 4.1. In vitro αλληλεπίδραση του Clonostachys rosea IK726 και του Pseudomonas chlororaphis ToZa7 σε σύγκριση με τον μάρτυρα C. rosea (αριστερά) και αλληλεπίδραση του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici με το P. chlororaphis ToZa7 σε σύγκριση με τον μάρτυρα Forl (δεξιά). Όσον αφορά στη βιοδοκιμή βλάστησης κονιδίων, η αλληλεπίδραση μελετήθηκε σε τρυβλία Petri, 9 cm, τα οποία είχαν προεμβολιαστεί με κονίδια του κάθε μύκητα χωριστά, σε συγκέντρωση 10 4 σπόρια ml 1. Δύο βακτηριακές αποικίες (2,5 cm) εμβολιάστηκαν σε δύο αντιδιαμετρικά σημεία του τρυβλίου. Όλα τα τρυβλία επωάστηκαν στους 25 C, στο σκοτάδι, για 12 ημέρες και γινόταν μακροσκοπική παρατήρηση αυτών, ανά τακτά χρονικά 104

111 διαστήματα, ώστε να ελεγχθεί η δημιουργία ζωνών αναστολής γύρω από τις βακτηριακές αποικίες. Η ζώνη αναστολής μετρήθηκε με ένα παχύμετρο τύπου «Vernier» και ορίστηκε κάθε φορά ως ο μέσος όρος 2 μετρήσεων όπως προέκυπταν μετρώντας από την άκρη της βακτηριακής αποικίας μέχρι το όριο του μυκηλίου (Εικόνα 4.2). Το πείραμα αποτέλεσαν 5 επαναλήψεις κάθε επέμβασης και συνολικά επαναλήφθηκε 2 φορές. Εικόνα 4.2. In vitro αλληλεπίδραση του ριζοβακτηρίου Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (αριστερά) και του ωφέλιμου μύκητα Clonostachys rosea IK726 (δεξιά), σε τρυβλία τα οποία έχουν προεμβολιαστεί με 10 4 κονίδια/ml Μέτρηση μυκηλιακής βιομάζας ύστερα από ανάπτυξη σε υπερκείμενα βακτηριακών καλλιεργειών Διηθημένα υπερκείμενα υγρών καλλιέργειών των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα αυτό, λήφθηκαν διηθώντας, μέσω μεμβράνης κυτταρίνης 0,20 μm (VWR, Radnor, PA), 100 ml υγρής βακτηριακής καλλιέργειας, 24 και 48 ωρών. Οι υγρές καλλιέργειες των βακτηρίων φυγοκεντρήθηκαν στα 5000 rpm, για 10 λεπτά. Ο Forl και ο C. rosea εμβολιάστηκαν χωριστά σε 100 ml των προαναφερθέντων διηθημάτων και επωάστηκαν σε ανακινούμενο επωαστήρα, στα 200 rpm, στους 25 C. Η ξηρή βιομάζα λήφθηκε με διήθηση μέσω αντλίας κενού μετά το πέρας 4 ημερών από τον εμβολιασμό Πειράματα in planta για τον έλεγχο του συνδυασμού των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης σε φυτά τομάτας Η επίδραση συνδυασμένων επεμβάσεων του C. rosea ΙΚ726 με τα P. chlororaphis ΤοΖα7 και S. rubidaea S55, για την αντιμετώπιση της σήψης του λαιμού και ριζών της τομάτας που προκαλείται από τον Forl, μελετήθηκε σε φυτοδοχεία, όπως περιγράφεται από τους Kamou et al. (2015) με ελάχιστες τροποποιήσεις. Προβλαστημένοι σπόροι της τομάτας επενδύθηκαν με κονίδια του C. rosea ΙΚ726 χρησιμοποιώντας μίγμα 1:1 (v:v) κονιδίων σε απεσταγμένο νερό (10 4 κονίδια ml 1 ) και 4% υδατικού διαλύματος μεθυλικής κυτταρίνης. Η συγκέντρωση των κονιδίων του Forl ήταν 10 4 κονίδια ml 1. Ο συνδυασμός των δύο παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης έγινε εφαρμόζοντας ένα μίγμα 1:1:2 (v:v:v), από αιώρημα βακτηριακών κυττάρων σε PBS (σε συγκέντρωση που αντιστοιχούσε σε O.D. 620 = 0,7), αιώρημα κονιδίων σε νερό (σε συγκέντρωση 10 4 κονιδίων ml 1 ) και 4 % υδατικού διαλύματος μεθυλικής σελουλόζης. Χρησιμοποιήθηκαν 105

112 18 φυτά ανά επέμβαση τα οποία παρέμειναν σε θάλαμο ανάπτυξης στους 22 C, με φωτοπερίοδο 14 ωρών φωτός, για έξι εβδομάδες. Στη συνέχεια τα φυτά αξιολογήθηκαν ως προς τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων με βάση δείκτη ασθένειας της εξής κλίμακας: (1) εμφανώς υγιές φυτό, κανένα ορατό σύμπτωμα στη ρίζα, (2) υπέργειο τμήμα χωρίς συμπτώματα και ήπια συμπτώματα στη ρίζα και το λαιμό, (3) υπέργειο τμήμα χωρίς συμπτώματα και σοβαρά συμπτώματα στη ρίζα και το λαιμό όπου φαίνεται ξεκάθαρα ο καστανός μεταχρωματισμός, (4) προχωρημένη σήψη στο λαιμό και τη ρίζα και μαρασμός του φυτού, και (5) νεκρά ή σχεδόν νεκρά φυτά (Kamou et al., 2015). Κατά τη διάρκεια των έξι εβδομάδων η παρουσία των μικροοργανισμών επιβεβαιώθηκε 2 φορές με επαναπομόνωση σε τρυβλία. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και οι επεμβάσεις ήταν οι εξής: 1. Μάρτυρας Forl 2. Μάρτυρας τομάτα 3. Μάρτυρας C. rosea ΙΚ C. rosea ΙΚ726 + S. rubidaea S55 5. C. rosea ΙΚ726 + P. chlororaphis ToZa7 6. C. rosea ΙΚ726 + Forl 7. C. rosea ΙΚ726 + Forl + S. rubidaea S55 8. C. rosea ΙΚ726 + Forl + P. chlororaphis ToZa Παρακολούθηση έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με αντιδράσεις αντοχής της τομάτας, παρουσία των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Ύστερα από διαπίστωση της επιτυχίας του συνδυασμού του C. rosea ΙΚ726 με το P. chlororaphis ToZa7 ή/και το S. rubidaea S55 στον έλεγχο της ασθένειας που προκαλεί ο Forl, διερευνήθηκε η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με αντιδράσεις αντοχής στην τομάτα. Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκαν μεμονωμένα ή σε συνδυασμό το C. rosea ΙΚ726 με το P. chlororaphis ToZa7 ή/και το S. rubidaea S55, σε φυτά τομάτας, ενώ ακολούθήσε ή δεν ακολούθησε (μάρτυρας) μόλυνση πρόκλησης (challenge inoculation) με Forl. Η επίδραση των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης αξιολογήθηκε σε φυτοδοχεία όπου χρησιμοποιήθηκαν φυτά τομάτας ποικιλίας ACE55 έξι εβδομάδων, στα οποία αυτοί εμβολιάστηκαν 48 και 72 ώρες νωρίτερα από το παθογόνο (εμβολιασμός επαγωγής, induction inoculation). Η συγκέντρωση των κονιδίων του Forl και του C. rosea ΙΚ726 ρυθμίστηκε στα 10 4 κονίδια ml 1 και η μόλυνση έγινε με ριζοπότισμα χρησιμοποιώντας μίγμα 1:1 (v:v) κονιδίων σε νερό (10 4 κονίδια ml 1 ) με 4 % υδατικό διάλυμα μεθυλικής κυτταρίνης. Ο συνδυασμός 2 ή 3 BCAs γινόταν με εφαρμογή της παραπάνω μεθόδου χρησιμοποιώντας μίγμα 1:1:2 (v:v:v): 1) βακτηριακά κύτταρα ως αιώρημα σε PBS, (O.D. 620 = 0,7), 2) αιώρημα κονιδίων σε νερό (10 4 κονίδια ml 1 ) και 3) υδατικό διάλυμα μεθυλικής κυτταρίνης. Ο εμβολιασμός τους γινόταν με ριζοπότισμα. Χρησιμοποιήθηκαν 6 φυτά ανά επέμβαση τα οποία αναπτύχθηκαν υπό ελεγχόμενες συνθήκες στους 22 C, με σταθερή φωτοπερίοδο (14 ωρών ). Οι επεμβάσεις ήταν οι εξής: 1. Μάρτυρας Forl 2. Μάρτυρας τομάτα 3. Μάρτυρας S. rubidaea S55 4. Μάρτυρας P. chlororaphis ToZa7 5. Forl + S. rubidaea S55 106

113 6. Forl + P. chlororaphis ToZa7 7. Μάρτυρας C. rosea ΙΚ C. rosea ΙΚ726 + S. rubidaea S55 9. C. rosea ΙΚ726 + P. chlororaphis ToZa7 10. C. rosea ΙΚ726 + Forl 11. C. rosea ΙΚ726 + Forl + S. rubidaea S C. rosea ΙΚ726 + Forl + P. chlororaphis ToZa7 Η ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αντοχής έγινε 48 και 72 ώρες μετά τη μόλυνση πρόκλησης με τον φυτοπαθογόνο μύκητα Forl. Επιπλέον έγιναν επεμβάσεις των 2 ριζοβακτηρίων σε φυτά που αναπτύχθηκαν στη συνέχεια για 120 ώρες, χωρίς να ακολουθήσει μόλυνση πρόκλησης με παθογόνο, με σκοπό να μελετηθεί η πιθανή επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα της τομάτας, απουσία κάποιου άλλου μικροοργανισμού. Το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές Ανάλυση έκφρασης γονιδίων Όσον αφορά στην ανάλυση μεταγραφής των πιθανών γονιδίων μεταφορέων ABC, ο C. rosea εμβολιάστηκε σε διηθημένα υπερκείμενα υγρών καλλιεργειών του P. chlororaphis ToZa7 ή του S. rubidaea S55. Οι υγρές καλλιέργειες έγιναν σε Potato dextrose Broth (PDB, BD Difco TM, Le pont de Claix, France) και αφού επωάστηκαν για 24 και 72 ώρες, αντίστοιχα, διηθήθηκαν με αποστειρωμένες μεμβράνες οξικής κυτταρίνης 0,45 mm (cellulose acetate membrane VWR). Μυκήλιο του C. rosea IK726 (τρία εμβόλια διαμέτρου 5mm) το οποίο είχε προηγουμένως αναπτυχθεί σε PDB, σε ανακινούμενο επωαστήρα, για 5 ημέρες, στους 25 C, χρησιμοποιήθηκε για να εμβολιαστούν 25 ml του παραπάνω υπερκείμενου των βακτηριακών καλλιεργειών. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε καλλιέργεια του μύκητα σε PDB. Μετά το πέρας 1 και 4 ωρών, το μυκήλιο συλλέχθηκε, μεταφέρθηκε σε θάλαμο υγρού αζώτου, για 12 ώρες, ώστε να ψυχθεί και να απομακρυνθεί πλήρως το νερό. Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το Qiagen RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany). Ενδεχόμενα υπολειπόμενα ίχνη DNA, απομακρύνθηκαν μετά από προσθήκη DNase I (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) και η ποιότητα και ποσότητα του RNA καθορίστηκε μέσω του Agilent Bioanalyzer (RNA 6000 Nanochip, Agilent Technologies). Στη συνέχεια, 1 μg του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε συνολικό όγκο 20 μl χρησιμοποιώντας το Maxima First Strand cdna Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany). Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές εξειδικευμένοι ως προς τα γονίδια, που σχεδιάστηκαν από τους Karlsson et al. (2015). Ως γονίδιο αναφοράς στον C. rosea επιλέχθηκε αυτό της ακτίνης (act) (Mamarabadi et al. 2008; Zapparata, 2014). Η έκφραση 12 γονιδίων πιθανών μεταφορέων ABC, που ανήκουν στις υποοικογένειες B, C και G, υπολογίστηκε μέσω της ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής (quantitative Reverse Transcriptase PCR, RT-qPCR) χρησιμοποιώντας το μίγμα SsoFast EvaGreen (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι αντιδράσεις της RT-qPCR πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή iq5 qpcr System (Bio-Rad, Hercules, CA), όπως περιγράφονται από τους Tzelepis et al. (2012) και η αξιολόγηση της εξειδίκευσης της μεθόδου ορίστηκε μέσω της ανάλυσης καμπύλης τήξης. Τα επίπεδα της μεταγραφής ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας 5 βιολογικές επαναλήψεις, και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε μέσω της σχετικής ποσοτικοποίησης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2- ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001) και η κανονικοποίηση των δεδομένων βασίστηκε στα επίπεδα 107

114 έκφρασης του γονιδίου αναφοράς. Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν (Πίνακας 4.1), αξιολογήθηκαν ως προς την απόδοση κατά την PCR, χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις γενωμικού DNA του C. rosea. Πίνακας 4.1. Γονίδια των μεταφορέων ABC και ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την RT-qPCR Όνομα γονιδίου Εμπρόσθιος εκκινητής (5 3 ) Ανάστροφος εκκινητής (5 3 ) Φυλογενετική ομάδα 1 abcb1 GAAGCGCTCATCCCCCACTG GCGGTTCGGATTTGACGGAT ABC B-I AG abcb3 GGACAAAGACGCCCACTCG GGTTCGTCCACTTCGGTTCC ABC B-II T abcb4 TCGCGGTCAAGGAGGATACTA CCAGAGACGGGCGAATGAG ABC B-II abcb18 CTGGCCGAGATGACTTGGGTAA AGGTCCGGGCTGAATGTCTG ABC B-IV AT TT abcb20 TCAAAGGAAACCGGGCAGAAT AGACGGCTTGGACAGGGTT ABC B-IV AGAGA abcb26 GATGGCTCGCGATTGCTCTC AGTAAGGCCGAAAAGTTTGA TGTCT ABC half size B- IV abcc12 CAACCACGCGACTCACCATTC ATAACAACGAGGCGGCAAGA ABC C-V TAGA abcc14 GACCCGAGTATCTGGAGCAAAAC TCGGGACCCAAGTAGAATGA ABC C-V A GC abcg8 GCAGTACTTTGAGGAGCTGGGT GGGCTTCGAGGCGTCTTATT ABC G-I TTC CT abcg11 GGTTCCCGACTTCCTCACTTCAA CGGGGGACCTGGCTCTCG ABC G-I abcg25 CAGGCCGAGTCCATATTGTCTTC T TGCTCCAGGGGCGATTGA ABC G-V 1 Η ονοματολογία της φυλογενετικής ταξινόμησης βασίζεται στους Kovalchuk και Driessen (2010) Όσον αφορά στην παρακολούθηση της έκφρασης 3 γονιδίων που κωδικοποιούν στοιχεία των αμυντικών μηχανισμών της τομάτας με τη χρήση της ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής, το συνολικό RNA απομονώθηκε από τις ρίζες της τομάτας, 48 και 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό. Τα επίπεδα της μεταγραφής ποσοτικοποιήθηκαν μέσω RT-qPCR, σε θερμοκυκλοποιητή Stratagene Mx3005P TM σε 6 βιολογικές επαναλήψεις και συνολικά το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου PR1- a που κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη PR-1 (όξινος τύπος), το γονίδιο GLUA που κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη PR-2 (β-1,3 γλουκανάση, βασικός τύπος) και το γονίδιο CHI3 που κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη PR-3 (χιτινάση) (Πίνακας 4.2). Τα δύο πρώτα σχετίζονται με την οδό του SA, ενώ το τρίτο με αυτήν των JA/ETH. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε μέσω της σχετικής ποσοτικοποίησης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2 -ΔΔCT (Livak & Schmittgen 2001) και η κανονικοποίηση των δεδομένων βασίστηκε στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων αναφοράς (Πίνακας 4.2). 108

115 Πίνακας 4.2. Γονίδια που σχετίζονται με την επαγωγή της αντοχής στην τομάτα Όνομα γονιδίου PR1-a GLUA CHI3 ACTIN CyOXID Πρωτεΐνη που κωδικοποιεί PR-1 (όξινος τύπος) PR-2 (β-1,3 γλουκανάση, βασικός τύπος) PR-3 (Χιτινάση) Ακτίνη Κυτόχρωμα οξειδάσης A Αλληλουχία εκκινητή (5-3 ) For TCTTGTGAGGCCCAAAATTC Rev ATAGTCTGGCCTCTCGGACA For GGTCTCAACCGCGACATATT Rev CACAAGGGCATCGAAAAGAT For TGCAGGAACATTCACTGGAG Rev TAACGTTGTGGCATGATGGT For GAAATAGCATAAGATGGCAGACG Rev ATACCCACCATCACACCAGTAT For TGGTAATTGGTCTGTTCCGATT Rev TGGAGGCAACAACCAGAATG Πηγή Aimé et al., (2013) Aimé et al., (2013) Aimé et al., (2013) Aimé et al., (2013) Papayiannis et al., (2011) Μελέτη του αποικισμού ριζών τομάτας από τους ωφέλιμους μικροοργανισμούς, με συνεστιακή μικροσκοπία Τα φυτά τομάτας που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του αποικισμού του C. rosea ΙΚ726, αναπτύχθηκαν σε σύστημα gnotobiotic το οποίο ήταν μία παραλλαγή εκείνου που περιγράφηκε από τους Simons et al. (1996). Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε γυάλινους κυλινδρικούς σωλήνες, ύψους 95mm και εσωτερικής διαμέτρου 40mm. Οι σωλήνες πληρώθηκαν με περλίτη, σε ύψος 2,5cm και στη συνέχεια, αφού κλείστηκαν με ανυδρόφιλο βαμβάκι και καλύφθηκαν με αλουμινόχαρτο, τοποθετήθηκαν στην αποστείρωση στους 120 o C, για 60min. Μετά το πέρας της αποστείρωσης, οι σωλήνες πληρώθηκαν σε άσηπτες συνθήκες, με αποστειρωμένη άμμο (quartz sand, Sea sand pure, Applichem, Darmstdt, Germany), με περίπου 30gr ο καθένας. Η άμμος είχε διάμετρο κόκκων από 0,1mm 0,3mm και προηγουμένως είχε αναμειχθεί με 10% (v:w) αποστειρωμένο θρεπτικό διάλυμα PNS (Plant Nutrition Solution, Hoffland, 1992). Προβλαστημένοι σπόροι τομάτας (ποικιλίας ACE55) τοποθετήθηκαν, ένας σε κάθε σωλήνα, υπό ασηπτικές συνθήκες, σε βάθος περίπου 1 cm, στη στήλη της άμμου. Τα φυτά στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε αυτό το απομονωμένο σύστημα, για 15 ημέρες, σε θάλαμο ανάπτυξης, με σταθερή θερμοκρασία 24 ο C και φωτοπερίοδο 16 ώρες. O ωφέλιμος μύκητας C. rosea IK726 μετασχηματισμένος με το γονίδιο gfp, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Dan Funck Jensen του Τμήματος Δασικής Μυκητολογίας και Φυτοπαθολογίας του Σουηδικoύ Πανεπιστημίου Γεωργικών Επιστημών, Sveriges Lantbruksuniversitet (SLU). Ο φυτοπαθογόνος μύκητας Forl, μετασχηματισμένος ώστε να εκφράζει την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (dsred), ήταν ευγενική χορηγία του 109

116 καθηγητή κ. Σωτηρίου Τζάμου από το Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Επιστημών Φυτικής Παραγωγής του ΓΠΑ. Ο μετασχηματισμός του P. chlororaphis έγινε με μεταφορά DNA μέσω βακτηριακής σύζευξης (bacterial conjugation), με χρήση του πλασμιδίου pmp4655 που εκφράζει την αυτοφθορίζουσα πρωτεΐνη egfp (enhanced Green Fluorescent Protein) σε αρνητικά κατά gram βακτήρια (Bloemberg et al., 2000). Το στέλεχος P.chlororaphis ToΖa7 ήταν το βακτήριο-δέκτης, με φυσική αντοχή όπως όλες οι ψευδομονάδες, στο αντιβιοτικό Νιτροφουραντοϊνη (Nf R ) και τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν για εισαγωγή του πλασμιδίου που περιέχει τo γονίδιο egfp ήταν ευγενική χορηγία του καθηγητή Fransisco Cazorla, του τμήματος Μικροβιολογίας του Πανεπιστημίου της Μάλαγας στην Ισπανία και ήταν τα παρακάτω: 1. Βακτήριο-δότης: E. coli E-26: E. coli DH5α με αντοχή σε αμπικιλλίνη (Amp R ), καναμυκίνη (Km R ) και χλωραμφενικόλη (Cm R ). Περιέχει το πλασμίδιο PbkminiTn7-gfp1που φέρει το γονίδιο gfp1, που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. 2. Βακτήριο-βοηθός: Ε. coli E-57: E. coli SM10λpir με αντοχή στην αμπικιλλίνη (Amp R ). Επιπλέον φέρει γονίδιο που μεταφράζει την μεταθετάση ενός μεταθετού στοιχείου που περιέχει το παραπάνω πλασμίδιο της gfp. 3. Bακτήριο-βοηθός: E. coli E-37: E. coli HB101 με αντοχή στην χλωραμφενικόλη (Cm R ). Επιπλέον, φέρει το οπερόνιο tra και μια περιοχή έναρξης της αντιγραφής που παρατηρείται στο γονιδίωμα του E.coli, αλλά όχι σε είδη του γένους Pseudomonas. Τα παραπάνω στελέχη, συμπεριλαμβανομένου και του P. chlororaphis Toza7, καλλιεργήθηκαν σε υγρές καλλιέργειες με το αντίστοιχο αντιβιοτικό στο οποία διαθέτουν αντοχή, για ένα 24ωρο. Πιο συγκεκριμένα, τα E. coli E-26, E. coli E-57 και E. coli Ε-37, εμβολιάστηκαν σε 30ml υγρό θρεπτικό υπόστρωμα LB, και περιεκτικότητα σε αντιβιοτικά Km 50μg ml -1, Amp 100μg ml -1 και Cm 6μg ml -1, αντίστοιχα. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν, σε ανακινούμενο επωαστήρα, στις 150στροφές/λεπτό, στους 37 ο C. Με το πέρας της επώασης, ακολούθησε η παρακάτω διαδικασία για βακτηριακή σύζευξη: Από κάθε καλλιέργεια λήφθηκε 1,5 ml και προστέθηκε σε σωλήνες Eppendorf. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, στις στροφές/λεπτό για 2 λεπτά. Αφαιρέθηκε το υπερκείμενο και το βακτηριακό ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 1 ml αποστειρωμένου διαλύματος NaCl 0,9%. Η φυγοκέντρηση-επαναδιάλυση επαναλήφθηκε 2 φορές, και την τελευταία το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 50μl για το P. chlororaphis Toza7, και 30 μl για τα 3 στελέχη του E. coli. Στη συνέχεια για την βακτηριακή σύζευξη (ΒΣ), από τα παραπάνω αιωρήματα έγινε ανάμειξη σε eppendorf, με αναλογία 1:1:1:3, με την τριπλάσια ποσότητα να αφορά τα βακτηριακά κύτταρα του δέκτη. Έπειτα, τοποθετήθηκε 1 σταγόνα από την ανάμειξη (ΒΣ), σε μεμβρανώδες φίλτρο (EMD Millipore, Durapore ), με διάμετρο πόρων 0,22 μm, το οποίο στερεώθηκε με αποστειρωμένες λαβίδες σε τρυβλίο με θρεπτικό υπόστρωμα LB. Το ίδιο εφαρμόστηκε για τους 2 μάρτυρες, που περιείχαν μόνο βακτηριακά κύτταρα του δέκτη ο ένας (Μ1) και μόνο βακτηριακά κύτταρα των Ε. coli ο άλλος (Μ2). Τα τρυβλία επωάστηκαν για 24 ώρες στους 25 ο C και μετά το πέρας των 24 ωρών, το φίλτρο με τη σταγόνα από κάθε τρυβλίο μεταφέρθηκε σε σωλήνες Falcon των 15 ml υπό ασηπτικές συνθήκες. Προστέθηκαν 1,5 ml διαλύματος NaCl 0,9% και έγινε ανακίνηση μέχρι την πλήρη διάλυση της σταγόνας. Στη συνέχεια από τους σωλήνες Falcon 110

117 έγινε μεταφορά όλης της ποσότητας σε καινούριους αποστειρωμένους σωλήνες eppendorf και φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό, για 2 λεπτά. Μετά την αφαίρεση του υπερκείμενου, ακολούθησε προσθήκη 1ml διαλύματος NaCl 0,9% και ανακίνηση. Στη συνέχεια 100μl του βακτηριακού αιωρήματος από το σωλήνα ΒΣ εμβολιάστηκαν σε τρυβλίο LB με τα αντιβιοτικά Nf 20μg ml -1 και Κm 25μg ml -1. Σε άλλα δύο τρυβλία με τις ίδιες περιεκτικότητες αντιβιοτικών, εμβολιάστηκαν ομοίως οι μάρτυρες (Μ1 και Μ2). Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 25 ο C για 2-3 ημέρες. Στη συνέχεια, το τρυβλίο ΒΣ επωάστηκε στους 4 ο C για 12 ώρες και εξετάστηκε σε οπτικό μικροσκόπιο ανίχνευσης φθορισμού Multizoom Nikon, model AZ-100 με εύρος ανίχνευσης nm για την GFP. Η μετασχηματισμένη βακτηριακή αποικία μεταφέρθηκε σε νέο τρυβλίο LBagar, με τις ίδιες περιεκτικότητες σε αντιβιοτικά και επωάστηκε στους 25 ο C, για 24 ώρες. Το βακτήριο αναπτύχθηκε πλήρως, διατηρώντας την ιδιότητα φθορισμού. Από αυτή την καλλιέργεια, μεταφέρθηκαν σε σωλήνες eppendorf σε μίγμα αποστειρωμένης γλυκερόλης (50% v/v): αποστειρωμένου νερού, με αναλογία 1:1, αναδεύθηκαν, και διατηρήθηκαν στην κατάψυξη στους -80 ο C, για μεταγενέστερη χρήση. Το μετασχηματισμένο βακτηριακό στέλεχος παρουσίαζε έντονο φθορισμό και τα κύτταρα ήταν ορατά ακόμα και σε χαμηλή μεγέθυνση ( 100). Δεν παρατηρήθηκε απώλεια της ικανότητας φθορισμού κατά την παρατήρηση με το μικροσκόπιο και λήφθηκε υπόψη κάθε φορά και ο κόκκινος αυτοφθορισμός των κυττάρων της τομάτας. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν μετά το πέρας 24 ωρών και κάθε 24 ώρες για 12 ημέρες. Σε κάθε παρατήρηση στο μικροσκόπιο, δηλαδή σε κάθε χρονική στιγμή (timepoint), μελετήθηκε το ριζικό σύστημα 5 φυτών. Το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές και τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια. Η in vitro παρατήρηση της αλληλεπίδρασης των C. rosea IK726 και Forl έγινε σε αντικειμενοφόρο πλάκα στην οποία προστέθηκε λεπτή στρώση PDA ώστε να αναπτυχθούν και να αλληλεπιδράσουν χωρίς την παρουσία του φυτού. Η βιοδοκιμή πραγματοποιήθηκε ώστε να μελετηθεί η πιθανότητα μυκοπαρασιτισμού του Forl από τον C. rosea και οι παρατηρήσεις έγιναν ανά 24 ώρες, για 96 ώρες. Η παρατήρηση των δειγμάτων του συνόλου των μετασχηματισμένων μικροοργανισμών έγινε με συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης ακτίνων λέιζερ Nikon D- Eclipse C1, με τη χρήση των προκαθορισμένων φίλτρων. Οι ψηφιακές εικόνες οπτικοποιήθηκαν μέσω του λογισμικού του κατασκευαστή Διερεύνηση ενδοφυτικής ανάπτυξης του Pseudomonas chlororaphis ToZa7 Μια επιπλέον βιοδοκιμή διεξήχθη με σκοπό να ερευνηθεί η ενδοφυτική συμπεριφορά του P. chlororaphis ToZa7 σε ρίζες τομάτας. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε, με ελάχιστες τροποποιήσεις, περιγράφεται από τους Devi et al. (2017). Το ριζικό σύστημα από φυτά τομάτας, τεσσάρων εβδομάδων, στο στάδιο των δύο πραγματικών φύλλων εμβαπτίστηκε σε αιώρημα του ριζοβακτηρίου για 0,5, 1 και 2 ώρες. Οι χρόνοι αφορούσαν 3 διαφορετικές επεμβάσεις και χρησιμοποιήθηκαν 2 φυτά ανά επέμβαση. Τα φυτά μεταφυτεύτηκαν σε τύρφη, σε φυτοδοχεία των 100 gr όπου αναπτύχθηκαν για μια εβδομάδα, σε θάλαμο με ελεγχόμενη φωτοπερίοδο (16 ώρες) και θερμοκρασία (24 o C). Στη συνέχεια οι ρίζες αφού αφαιρέθηκαν με προσοχή από το υπόστρωμα, πλύθηκαν με άφθονο νερό βρύσης ώστε να απομακρυνθεί κάθε υπόλειμμα τύρφης. Αφού 111

118 απομακρύνθηκαν τα φύλλα, τα φυτά της κάθε επέμβασης χωριστά τοποθετήθηκαν σε Falcon με 70% αιθανόλη για ένα λεπτό και στη συνέχεια σε 5% υποχλωριώδες νάτριο (NaOCl) για τρία λεπτά. Ακολούθησαν πέντε πλυσίματα με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό σε Falcon με έντονη ανάδευση και απόρριψη του νερού. Εκατό μικρόλιτρα από το τελικό νερό της κάθε επέμβασης μεταφέρθηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλίο TGY (Tryptone Glucose Yeast agar). Στη συνέχεια κομμάτια ρίζας μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένο Eppendorf και αφού έγινε σύνθλιψη αυτών με αποστειρωμένο μικρογουδοχέρι, το Eppendorf πληρώθηκε με 1,5 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού. Ακολούθησε έντονη ανάδευση με vortex και 100μl από το παραπάνω μίγμα μεταφέρθηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλίο TGY Στατιστική ανάλυση Οι επεμβάσεις στα πειράματα in planta οι οποίες αξιολογήθηκαν με βάση τους δείκτες ασθένειας που ορίστηκαν, συγκρίθηκαν ως εξής: σε περίπτωση αποτελέσματος που διέφερε στατιστικά σημαντικά με βάση το τεστ Kruskal Wallis (μη παραμετρική ανάλυση παραλλακτικότητας, ANalysis Of Variance, ANOVA), οι διαφορές ανά ζεύγη ελέγχθηκαν με βάση τα τεστ των Mann Whitney. Σε μη παραμετρικές διαδικασίες ελέγχου υποθέσεων, το επίπεδο σημαντικότητας (τιμή P) υπολογίστηκε με τη μέθοδο προσομοίωσης Monte Carlo, χρησιμοποιώντας κύκλους δειγμάτων (Mehta & Patel, 1999). Τα δεδομένα που προέκυψαν από την μελέτη της γονιδιακής έκφρασης τόσο των μεταφορέων ABC όσο και των γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα, αναλύθηκαν μέσω της ANOVA. Οι αναλύσεις βασίστηκαν στο πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο πειραματισμού (Completely Randomized Design, CRD) και οι μέσοι όροι προέκυψαν από 5 επαναλήψεις σε κάθε επέμβαση, όσον αφορά το πείραμα με τους μεταφορείς ABC και, 6 επαναλήψεις ανά επέμβαση για το πείραμα και τα γονίδια αντοχής της τομάτας. Σύμφωνα με το F τεστ της ANOVA, οι διαφορές μεταξύ των μέσων όρων συγκρίθηκαν με βάση τη δοκιμή του Tukey. Το επίπεδο σημαντικότητας για όλες τις υποθέσεις και διαδικασίες στατιστικού ελέγχου, ορίστηκε εκ των προτέρων ως το P 0,05. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πρόγραμμα SPSS v 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Τα αναλυτικότερα αποτελέσματα της ANOVA (τιμές F, df και P) και του τεστ Kruskal Wallis (τιμές χ 2, df και P), παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ Αποτελέσματα In vitro μελέτη της επίδρασης των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 επί της ανάπτυξης των Clonostachys rosea IK726 και Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Βιοδοκιμές μυκηλιακής ανάπτυξης, βλάστησης σπορίων και παραγωγής βιομάζας Στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήθηκε μια σειρά in vitro βιοδοκιμών ώστε να διαπιστωθεί η αντοχή του C. rosea ΙΚ726, σε σύγκριση με εκείνη του Forl, στα ριζοβακτήρια P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55. Η βιοδοκιμή της μυκηλιακής ανάπτυξης σε διπλές καλλιέργειες έδειξε ότι το S. rubidaea S55 προκάλεσε έντονη αναστολή στον Forl (40,53%), ενώ φάνηκε να συνδυάζεται επιτυχώς με τον C. rosea 112

119 ΙΚ726, καθώς σε αυτόν το ποσοστό αναστολής ήταν αρκετά χαμηλό (17,43 %). Αντιθέτως, το P. chlororaphis ToZa7, σε σύγκριση με το S. rubidaea S55, προκάλεσε σχεδόν τη διπλάσια αναστολή στον ωφέλιμο μύκητα (33,15 %) που ήταν παρόμοια με την αναστολή στην μυκηλιακή ανάπτυξη του Forl (39,85%) (Εικ. 4.3). Η βλάστηση των κονιδίων και των δύο μυκήτων (Forl και C. rosea), αναστάλθηκε εντονότερα από το P. chlororaphis ToZa7 σε σύγκριση με το S. rubidaea S55. Η πιο έντονη αναστολή μετρήθηκε κατά την αλληλεπίδραση των C. rosea IK726 και P. chlororaphis ToZa7 (32,44 %), ακολουθούμενη με μεγάλη διαφορά από εκείνη των Forl και P. chlororaphis ToZa7 (12,11%). Το S. rubidaea S55 επέδειξε παρόμοια επίδραση στη βλάστηση των κονιδίων τόσο του Forl (7,77%) όσο και του C. rosea (6,56 %) (Εικ. 4.4). Εικόνα 4.3. Επίδραση των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 στη μυκηλιακή ανάπτυξη των Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici και Clonostachys rosea IK726 σε βιοδοκιμή διπλών καλλιεργειών. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 5 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές σύμφωνα με το Tukey s test (P<0,05) (επιπλέον στατιστικά δεδομένα παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ). 113

120 Εικόνα 4.4. Επίδραση των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 στην ικανότητα βλάστησης των κονιδίων και τη μυκηλιακή ανάπτυξη των Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici και Clonostachys rosea IK726. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 5 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές σύμφωνα με το Tukey s test (P<0,05) (επιπλέον στατιστικά δεδομένα παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ). Η παραγωγή μυκηλιακής βιομάζας μετρήθηκε ύστερα από ανάπτυξη 4 ημερών, σε διηθήματα υπερκειμένων καλλιεργειών 24 h και 48 h, των P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, αντίστοιχα, ώστε να ελεγχθεί η ανοχή των C. rosea και Forl στους εκκρινόμενους από τα βακτήρια μεταβολίτες. Η βιομάζα του Forl ήταν εμφανώς πιο μικρή στα διηθήματα των 24 και 48 ωρών και των δύο βακτηριακών στελεχών. Η μείωση κυμάνθηκε σε παραπλήσια επίπεδα μεταξύ των επεμβάσεων, από 83,09%, για το υπερκείμενο των 24 ωρών του S. rubidaea S55, έως και 90,38%, για το διήθημα των 48 ωρών του P. chlororaphis ToZa7, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (Εικ. 4.5). Η μείωση παραγωγής βιομάζας του C. rosea, συγκριτικά με τον μάρτυρα, ήταν λιγότερο έντονη, καθώς η υψηλότερη αναστολή (77,27 %) μετρήθηκε στο υπερκείμενο των 48 ωρών του P. chlororaphis ενώ κυμάνθηκε επίσης σε παραπλήσια επίπεδα μεταξύ των επεμβάσεων (Εικ. 4.6). 114

121 Εικόνα 4.5. Επίδραση διηθημάτων από υπερκείμενα υγρών καλλιεργειών των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55, 24 και 48 ωρών, στο ξηρό βάρος της βιομάζας του Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl). Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 3 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές σύμφωνα με το Tukey s test (P<0,05) (επιπλέον στατιστικά δεδομένα παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ). Εικόνα 4.6. Επίδραση διηθημάτων από υπερκείμενα υγρών καλλιεργειών των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55, 24 και 48 ωρών, στο ξηρό βάρος της βιομάζας του C. rosea IK726. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 3 επαναλήψεων. 115

122 Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές σύμφωνα με το Tukey s test (P<0.05) (επιπλέον στατιστικά δεδομένα παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ) Έλεγχος της σήψης ριζών και λαιμού της τομάτας με συνδυασμό παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Τα αποτελέσματα της εν λόγω δοκιμής έδειξαν πως η επέμβαση όπου ο C. rosea IK726 συνδυάζεται με το P. chlororaphis ToZa7 μειώνει σημαντικά την ένταση της ασθένειας (56,25 %), ακριβώς στο ίδιο επίπεδο με την επέμβαση του C. rosea IK726 μεμονωμένα (56,25 %), ή σε συνδυασμό με το S. rubidaea S55 (56,25 %) (Εικ. 4.7). Εικόνα 4.7. Επίδραση των Clonostachys rosea IK726, Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 στην ένταση της ασθένειας που προκαλεί ο Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici στην τομάτα, σε φυτοδοχεία σε ελεγχόμενες συνθήκες. Τα φυτά του μάρτυρα τομάτας δεν εμβολιάστηκαν με κανέναν μικροοργανισμό. Τα φυτά του μάρτυρα Forl εμβολιάστηκαν μόνο με το παθογόνο. Η ασθένεια αξιολογήθηκε μετά από 6 εβδομάδες. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 18 βιολογικών επαναλήψεων και απουσιάζουν από τις πρώτες 4 επεμβάσεις καθώς όλες οι μετρήσεις ήταν ίσες με 1. Τα διαφορετικά γράμματα δηλώνουν τις επεμβάσεις που διέφεραν στατιστικώς 116

123 σημαντικά, σύμφωνα με το τεστ Mann Whitney σε επίπεδο σημαντικότητας P 0,05 (επιπλέον στατιστικά δεδομένα παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ) Διερεύνηση του μηχανισμού αντοχής του Clonostachys rosea IK726 στα Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 μέσω επαγωγής γονιδίων μεταφορέων ABC Τα δεδομένα που προέκυψαν από την ανάλυση της RT qpcr έδειξαν ότι αυξήθηκε η μεταγραφή 7 διαφορετικών γονιδίων που κωδικοποιούν μεταφορείς ABC, στον C. rosea IK726, όταν αυτός εμβολιάστηκε στα διηθήματα υπερκειμένων καλλιεργειών, 24 και 72 ωρών των δύο βακτηρίων. Πιο συγκεκριμένα, σημειώθηκε επαγωγή των γονιδίων abcb1, abcb26 και abcb20 της υποοικογένειας B, abcc14 και abcc12 της υποοικογένειας C και abcg8 και abcg25 της υποοικογένειας G, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Το γονίδιο abcb1, ένας πιθανός μεταφορέας φερομονών, φάνηκε να επάγεται υπό την επίδραση των υπερκειμένων καλλιεργειών των 24 και των 72 ωρών του S. rubidaea S55. Αναλυτικότερα, σημειώθηκε μια αύξηση 12,9 φορές (P < 0,001), 4 ώρες μετά τον εμβολιασμό (εφεξής hpi, hours post inoculation) στο υπερκείμενο καλλιέργειας 72 ωρών, συγκριτικά με τον μάρτυρα (Εικόνα 4.8). Η έκφραση του γονιδίου abcb26 (πιθανού μεταφορέα μιτοχονδριακών πεπτιδίων) αυξήθηκε 8.4 φορές (P < 0,001) στις 4 hpi υπό την επίδραση του υπερκειμένου καλλιέργειας 72 ωρών του S. rubidaea S55, σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Επιπλέον, η έκφραση του ίδιου γονιδίου, αυξήθηκε 11,21 και 8,3 φορές στη 1 και στις 4 hpi, αντίστοιχα στο υπερκείμενο των 72 ωρών του P. chlororaphis ToZa7, συγκριτικά με τον μάρτυρα (P < 0,001) (Εικόνα 4.8). Το υπερκείμενο καλλιέργειας 24 ωρών του S. rubidaea S55 διπλασίασε την έκφραση του ίδιου γονιδίου στη 1 hpi (P = 0,017) (Εικόνα 4.8). 117

124 Εικόνα 4.8. Ανάλυση έκφρασης 3 γονιδίων μεταφορέων ABC της υποοικογένειας Β του Clonostachys rosea IK726 (abcb1, abcb26 και abcb20) μετά από έκθεση σε διηθήματα υπερκειμένων καλλιεργειών, 24 και 72 ωρών, των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55, για 1 και 4 ώρες. Λευκό: Επέμβαση με διηθήματα 24 ωρών, 1 ώρα μετά τον εμβολιασμό (hour post-inoculation, hpi). Πράσινο: Επέμβαση με διηθήματα 24 ωρών, 4 hpi. Πορτοκαλί: Επέμβαση με διηθήματα 72 ωρών, 1 hpi. Ιώδες: Επέμβαση με διηθήματα 72 ωρών, 4 hpi. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη μέθοδο 2 ΔΔCT. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 5 βιολογικών επαναλήψεων. Ο αστερίσκος δηλώνει τις επεμβάσεις που διέφεραν στατιστικώς σημαντικά, σύμφωνα με τη δοκιμή Tukey (οι τιμές Ρ παρουσιάζονται αναλυτικά στο Παράρτημα ΙΙΙ). Η έκφραση του πιθανού γονιδίου MDR abcb20 (υποοικογένειας B) αυξήθηκε 1 hpi στο υπερκείμενο καλλιέργειας 72 ωρών του P. chlororaphis ΤοΖα7 (P < 0,001), αλλά δεν σημειώθηκε καθόλου επαγωγή στις 4 hpi, συγκριτικά με τον μάρτυρα. Η έκθεση στο υπερκείμενο 72 ωρών του S. rubidaea S55 προκάλεσε μια αύξηση στην έκφραση του abcb20 κατά 4,8 φορές, στις 4 hpi, συγκριτικά με τον μάρτυρα (P = 0,027) (Εικόνα 4.8). Η έκφραση των γονιδίων abcc14 και abcc12 (υποοικογένειας C), που είναι πιθανοί μεταφορείς δευτερογενών μεταβολιτών, αυξήθηκε απότομα μετά την έκθεση στα υπερκείμενα καλλιεργειών 72 ωρών των S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7. Ειδικότερα, μετά την έκθεση για 4 ώρες στο υπερκείμενο καλλιέργειας 72 ωρών του S. rubidaea S55, το γονίδιο abcc14 έδειξε μια επαγωγή επί 5,9 φορές σε σχέση με τον μάρτυρα (P < 0,001) (Εικόνα 4.9). Το υπερκείμενο καλλιέργειας 72 ωρών του P. chlororaphis ToZa7 προκάλεσε αύξηση στην έκφραση του abcc12 κατά 7,5 φορές (P < 0,001) 1 hpi ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε μείωση στα επίπεδα του μάρτυρα. Η έκφραση του abcc12 παρουσίασε αύξηση κατά 21,8 και 15,6 φορές (P < 0,001), μετά από επώαση 1 και 4 ωρών στα υπερκείμενα καλλιεργειών 72 ωρών του S. rubidaea S55, αντίστοιχα (Εικόνα 4.9). 118

125 Εικόνα 4.9. Ανάλυση έκφρασης 2 γονιδίων μεταφορέων ABC της υποοικογένειας C του Clonostachys rosea IK726 (abcc14 και abcc12) μετά από έκθεση σε διηθήματα υπερκειμένων καλλιεργειών, 24 και 72 ωρών, των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 για 1 και 4 ώρες. Λευκό: Επέμβαση με διηθήματα 24 ωρών, 1 ώρα μετά τον εμβολιασμό (hour post-inoculation, hpi). Πράσινο: Επέμβαση με διηθήματα 24 ωρών, 4 hpi. Πορτοκαλί: Επέμβαση με διηθήματα 72 ωρών, 1 hpi. Ιώδες: Επέμβαση με διηθήματα 72 ωρών, 4 hpi. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη μέθοδο 2 ΔΔCT. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 5 βιολογικών επαναλήψεων. Ο αστερίσκος δηλώνει τις επεμβάσεις που διέφεραν στατιστικώς σημαντικά σύμφωνα με το Tukey s τεστ (οι τιμές Ρ παρουσιάζονται αναλυτικά στο Παράρτημα ΙΙΙ). Τα γονίδια abcg8 και abcg25 (της υποοικογένειας G) που σχετίζονται πιθανώς με την PDR, παρουσίασαν μια αύξηση στην έκφρασή τους μετά την έκθεση του C. rosea στο υπερκείμενο καλλιέργειας 24 ωρών του S. rubidaea S55. Μετά την 4ωρη έκθεση στο προαναφερθέν υπερκείμενο, το γονίδιο abcg8 εκφράστηκε 1,7 φορές περισσότερο (P = 0,052), συγκριτικά με τον μάρτυρα. Το abcg25 έδειξε μια επαγωγή 4 φορές (P = 0,004) και 8 φορές περισσότερο (P = 0,002) μετά από 1 ώρα και 4 ώρες έκθεσης στο ίδιο υπερκείμενο, αντίστοιχα, (Εικόνα 4.10). 119

126 Εικόνα Ανάλυση έκφρασης 2 γονιδίων μεταφορέων ABC της υποοικογένειας G του Clonostachys rosea IK726 (abcg8 και abcg25) μετά από έκθεση σε διηθήματα υπερκειμένων καλλιεργειών, 24 και 72 ωρών, των Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 για 1 και 4 ώρες. Λευκό: Επέμβαση με διηθήματα 24 ωρών, 1 ώρα μετά τον εμβολιασμό (hour post-inoculation, hpi). Πράσινο: Επέμβαση με διηθήματα 24 ωρών, 4 hpi. Πορτοκαλί: Επέμβαση με διηθήματα 72 ωρών, 1 hpi. Ιώδες: Επέμβαση με διηθήματα 72 ωρών, 4 hpi. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη μέθοδο 2 ΔΔCT. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 5 βιολογικών επαναλήψεων. Ο αστερίσκος δηλώνει τις επεμβάσεις που διέφεραν στατιστικώς σημαντικά σύμφωνα με το Tukey s τεστ (οι τιμές Ρ παρουσιάζονται αναλυτικά στο Παράρτημα ΙΙΙ) Επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με αμυντικούς μηχανισμούς της τομάτας, παρουσία των παραγόντων βιολογικής καταπολέμησης Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου PR-1a που σχετίζεται με το μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος, ήταν υψηλότερα στην τομάτα κατά 67,8 φορές, όταν εφαρμόστηκε εμβολιασμός επαγωγής με C. rosea IK726 και 48 ώρες αργότερα ακολούθησε μόλυνση πρόκλησης με Forl. Το ίδιο παρατηρήθηκε και ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με συνδυασμό του C. rosea IK726 με το P. chlororaphis ToZa7, με 94,5 φορές αυξημένη έκφραση, παρουσία του παθογόνου (Εικόνα 4.11). Οι προαναφερθείσες επεμβάσεις προκάλεσαν μια σημαντική επαγωγή του γονιδίου PR-1a (P < 0,05) συγκριτικά με την επαγωγή που προκάλεσε το παθογόνο μόνο του. Το γονίδιο αυτό έδειξε να εκφράζεται εντονότερα (69,8 φορές περισσότερο), όταν η μόλυνση πρόκλησης με Forl έγινε 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με το S. rubidaea S55 (P < 0,05). 120

127 Εικόνα Ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου PR-1a στην τομάτα, ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK726, Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 και των συνδυασμών τους και μόλυνση πρόκλησης με Forl 48 και 72 ώρες αργότερα. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 6 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν τις στατικώς σημαντικές διαφορές με βάση το τεστ Tukey s (P < 0,05). Το γονίδιο CHI3 το οποίο σχετίζεται με τη βιοχημική οδό ιασμονικού οξέος/ αιθυλενίου, εκφράστηκε στην τομάτα 16,3 φορές περισσότερο (P < 0,05) όταν 48 ώρες μετά την επέμβαση με C. rosea, ακολούθησε μόλυνση πρόκλησης με Forl, συγκριτικά με τον μάρτυρα (Εικόνα 4.12). Εικόνα Ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου CHI3 στην τομάτα, ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK726, Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 και των συνδυασμών τους και μόλυνση πρόκλησης με Forl 48 και 72 ώρες αργότερα. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπικά απόκλιση 6 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν τις στατικώς σημαντικές διαφορές με βάση το Tukey s τεστ (P < 0,05). 121

128 Όσον αφορά στο γονίδιο GLUA το οποίο σχετίζεται με τη βιοχημική οδό του σαλικυλικού οξέος, τα επίπεδα έκφρασής του στην τομάτα αυξήθηκαν ελάχιστα (1,89 φορές) όταν μετά την επέμβαση με S. rubidaea S55 ακολούθησε μόλυνση πρόκλησης με Forl (P < 0,05) (Εικόνα 4.13). Επιπλέον σημειώθηκε αύξηση της έκφρασης του ίδιου γονιδίου κατά 2,09 και 2,14 φορές, όταν η μόλυνση πρόκλησης με Forl έγινε 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με C. rosea ΙΚ726 και C. rosea ΙΚ726 + S. rubidaea S55, αντίστοιχα (P < 0,001) (Εικόνα 4.13). Εικόνα Ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου GLUA στην τομάτα, ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με τους παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης Clonostachys rosea IK726, Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 και των συνδυασμών τους και μόλυνση πρόκλησης με Forl 48 και 72 ώρες αργότερα. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπικά απόκλιση 6 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν τις στατικώς σημαντικές διαφορές με βάση το Tukey s τεστ (P < 0.05). Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PR-1a και GLUA αυξήθηκαν σημαντικά στην τομάτα, μετά από έκθεση στο στέλεχος P. chlororaphis ToZa7, για 120 ώρες χωρίς να ακολουθήσει μόλυνση με παθογόνο. Εμβολιασμός με το ριζοβακτήριο P. chlororaphis ToZa7, προκάλεσε αύξηση 13,55 και 23,08 φορές για τα PR-1a και GLUA, αντίστοιχα, συγκριτικά με τον μάρτυρα (Εικόνα 4.14). 122

129 Εικόνα Ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων PR-1a και GLUA στην τομάτα, 120 ώρες από τον εμβολιασμό τους με τα ωφέλιμα ριζοβακτήρια Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και Serratia rubidaea S55 χωρίς επακόλουθη μόλυνση πρόκλησης με παθογόνο. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση 6 επαναλήψεων. Τα διαφορετικά γράμματα εκφράζουν τις στατιστικώς σημαντικές διαφορές με βάση το Tukey s τεστ (P < 0,05) Μελέτη του αποικισμού των ριζών της τομάτας από τον Clonostachys rosea IK726 και της αλληλεπίδρασής του με τον Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, με συνεστιακή μικροσκοπία Ο αποικισμός των ριζών φυταρίων τομάτας από τον C. rosea IK726, υπό αξενικές συνθήκες, παρατηρήθηκε μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με ακτίνες laser, χρησιμοποιώντας ένα μετασχηματισμένο στέλεχος του μύκητα που εξέφραζε την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Οι παρατηρήσεις έδειξαν την ικανότητα του C. rosea να αποικίζει αποτελεσματικά και ταχύτατα τα μεσοκυττάρια διαστήματα των επιδερμικών κυττάρων της ρίζας της τομάτας. Η βλάστηση των σπορίων στην επιφάνεια των επιδερμικών κυττάρων της ρίζας ήταν εμφανής τις πρώτες 24 ώρες από τον εμβολιασμό ενώ η επιφάνεια της κύρια ρίζας καλύφθηκε μετά το πέρας μόνο 48 ωρών (Εικόνα 4.15). Εικόνα Ρίζες που αποικίζονται από τον μετασχηματισμένο μύκητα Clonostachys rosea IK726, ο οποίος εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (green fluorescent protein, GFP). 123

130 Παρατηρείται η προσκόλληση των υφών στην επιφάνεια της ρίζας και η ανάπτυξη στα μεσοκυττάρια διαστήματα των επιδερμικών κυττάρων, 2 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Οι υφές του C. rosea παρατηρήθηκαν κάθε 24 ώρες, για 12 ημέρες και εμφάνισαν επανειλημμένως περιελίξεις και πλέγματα γύρω από τα ριζικά τριχίδια καθώς και χαρακτηριστικές παχύνσεις των υφών (υφοπόδια) πάνω στα κύτταρα της επιδερμίδας, οι οποίες είναι ενδεικτικές σημείων εισχώρησης εντός των κυττάρων (Εικόνα 4.16). Έξι ημέρες μετά τον εμβολιασμό του προβλαστημένου σπόρου τομάτας, ο ωφέλιμος μύκητας είχε σχηματίσει ένα δίκτυο υφών γύρω από την κεντρική ρίζα, είχε πλούσια ανάπτυξη ανάμεσα στα ριζικά τριχίδια και είχε ήδη παραγάγει κονιδιοφόρους και κονίδια (Εικόνα 4.16). Αξίζει να σημειωθεί ότι παρά την εισχώρηση στα επιδερμικά κύτταρα που παρατηρήθηκε σχεδόν σε όλα τα παρασκευάσματα που εξετάστηκαν, κανένα φυτάριο δεν εμφάνισε κάποιο σύμπτωμα ενδεικτικό ασθένειας, επιβεβαιώνοντας τη θετική επίδραση του C. rosea στα φυτά τομάτας, με ενδείξεις για ενδοφυτική ανάπτυξη, οι οποίες, ωστόσο, δεν διερευνήθηκαν περεταίρω. Εικόνα Υφές του μετασχηματισμένου C. rosea IK726 με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (green fluorescent protein, GFP) σε επαφή με τα ριζικά τριχίδια της τομάτας (αριστερή φωτογραφία, κάτω δεξιά) και εμφάνιση κονιδιοφόρων (σε λευκούς κύκλους), 6 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Προχωρημένος αποικισμός της ρίζας της τομάτας από τον C. rosea IK726 (δεξιά) κατά μήκος των μεσοκυττάριων διαστημάτων των επιδερμικών κυττάρων και σχηματισμός δικτύου υφών γύρω από την κεντρική ρίζα, 6 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Οι παχύνσεις των υφών (υφοπόδια-υποδεικνύονται από τα βέλη) υποδηλώνουν σημεία εισχώρησης, στα κύτταρα της ρίζας. Σε συνδυασμένο εμβολιασμό των ριζών με C. rosea και Forl και οι δύο μύκητες αποίκισαν τα επιφανειακά κύτταρα της ρίζας και η πολύ στενή επαφή των υφών τους (Εικόνα 4.17) οδήγησε στην υπόθεση ότι ο C. rosea αναστέλλει τον φυτοπαθογόνο μύκητα μέσω μυκοπαρασιτισμού. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η υπόθεση αυτή, οι δύο μύκητες παρατηρήθηκαν σε κοίλη αντικειμενοφόρο πλάκα (θάλαμος van Tieghem) όπου επιβεβαιώθηκε η υπερπαρασιτική δράση του C. rosea επί του Forl. Συγκεκριμένα, ο ωφέλιμος μύκητας παρατηρήθηκε να περιελίσσεται γύρω από τις υφές του Forl (Εικόνα 4.18). 124

131 Εικόνα Αποικισμός της ρίζας της τομάτας από τον μετασχηματισμένο μύκητα Clonostachys rosea IK726, ο οποίος εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (green fluorescent protein, GFP) και του Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici που εκφράζει την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (red fluorescent protein, RFP), 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Παρατηρείται στενή επαφή των υφών (στα σημεία που υποδεικνύουν τα βέλη). Εικόνα Υφές του Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici που εκφράζει την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (red fluorescent protein, RFP) οι οποίες περιτυλίσσονται στενά από υφές του Clonostachys rosea IK726, ο οποίος εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (green fluorescent protein, GFP). Είναι εμφανή τα κονίδια του C. rosea IK Παρατήρηση του αποικισμού ρίζας τομάτας από το ωφέλιμο ριζοβακτήριο P. chlororaphis ToZa7, με συνεστιακή μικροσκοπία Ο αποικισμός του ριζικού συστήματος της τομάτας από το P. chlororaphis ΤοΖα7, υπό αξενικές συνθήκες, παρατηρήθηκε μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με ακτίνες laser, αφού αυτό μετασχηματίστηκε ώστε να εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. Οι παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν την ικανότητα του στελέχους αυτού να αποικίζει αποτελεσματικά τα μεσοκυττάρια διαστήματα των επιδερμικών κυττάρων της ρίζας της τομάτας. Η παρουσία των βακτηριακών κυττάρων σε μικροαποικίες ήταν εμφανής μετά το πέρας 4 ημερών από τον εμβολιασμό (Εικόνα 4.19). 125

132 Εικόνα Βακτηριακά κύτταρα του ωφέλιμου ριζοβακτηρίου Pseudomonas chlororaphis ToZa7 το οποίο εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, 4 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Οι μικροαποικίες είναι εμφανείς στους μεσοκυττάριους χώρους των επιδερμικών κυττάρων της κεντρικής ρίζας της τομάτας (στα σημεία που υποδεικνύουν τα βέλη). Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι αποίκισε τα ριζικά τριχίδια και τα επιφανειακά κύτταρα της τομάτας, εμφανίζοντας ενδοφυτική συμπεριφορά, την έκτη ημέρα μετά τον εμβολιασμό (Εικόνα 4.20). 126