ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Απομόνωση ριζοβακτηρίων και αξιολόγησή τους ως παραγόντων αντιμετώπισης της σήψης ριζών και λαιμού της τομάτας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ναταλί-Νεφέλη Κάμου Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Αναστασία Λαγοπόδη ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Απομόνωση ριζοβακτηρίων και αξιολόγησή τους ως παραγόντων αντιμετώπισης της σήψης ριζών και λαιμού της τομάτας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ναταλί-Νεφέλη Κάμου Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Αναστασία Λαγοπόδη ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Απομόνωση ριζοβακτηρίων και αξιολόγησή τους ως παραγόντων αντιμετώπισης της σήψης ριζών και λαιμού της τομάτας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ναταλί-Νεφέλη Κάμου Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Αναστασία Λαγοπόδη ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Αναστασία Λαγοπόδη, Επίκ. Καθηγήτρια Φυτοπαθολογίας, Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. (Επιβλέπουσα) 2. Γεωργακόπουλος Δημήτριος, Επίκ. Καθηγητής Μικροβιολογίας Τμ. Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών (μέλος) 3. Γεώργιος Καραογλανίδης, Λέκτορας Φυτοπαθολογίας-Μυκητολογίας, Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. (μέλος) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

4 Πρόλογος Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του τομέα Φυτοπροστασίας κατά τα έτη , στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου, κυρία Αναστασία Λαγοπόδη για την ουσιαστική στήριξή της, την άριστη συνεργασία και την καθοδήγησή της καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Ακόμη, εκφράζω τις θερμές ευχαριστίες μου στα άλλα δύο μέλη της τριμελούς επιτροπής, κ. Δημήτρη Γεωργακόπουλο, επίκουρο καθηγητή Μικροβιολογίας του τμήματος Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας του Γ.Π.Α. και τον κ. Γεώργιο Καραογλανίδη, Λέκτορα του τομέα Φυτοπροστασίας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. για την κριτική ανάγνωση της διατριβής μου και τις ουσιαστικές παρατηρήσεις και υποδείξεις τους. Ευχαριστώ επίσης τον καθηγητή κ. Νικόλαο Κατή, διευθυντή του εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας για τις πολύτιμες συμβουλές του κατά τη διάρκεια της φοίτησής μου στη σχολή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλες και όλους όσους συνέβαλαν στην πραγματοποίηση της εργασίας αυτής τόσο με τη στήριξή τους, όσο και με την ουσιαστική και πρακτική βοήθειά τους. Αυτό περιλαμβάνει όλο το εργαστήριο Φυτοπαθολογίας και τους: Μένια, Ξένια, Γιούλα, Μάρτζι Κώστα, Λεώ, Θωμά και Γιώργο, για την υποστήριξή τους και τις ωραίες στιγμές που μου χάρισαν αυτά τα τρία χρόνια. Θερμές ευχαριστίες εκφράζονται επίσης στους: Κυρία Ευθυμία Παπαδοπούλου Μουρκίδου και το προσωπικό του εργαστηρίου Γεωργικών Φαρμάκων στο Αγρόκτημα για τη βοήθειά τους και την παραχώρηση εργαστηριακού εξοπλισμού και σκευών για την εκχύλιση υπερκειμένων φυγοκέντρησης βακτηριακών καλλιεργειών και τη συμπύκνωσή τους. Κυρία Ουρανία Μενκίσογλου Σπυρούδη και την υπό την επίβλεψή της υποψήφια διδάκτορα, κυρία Ευαγγελία Παπαδοπούλου, για την πολύτιμη βοήθειά 4

5 τους και την παραχώρηση εργαστηριακού εξοπλισμού για την εκτέλεση συμπυκνώσεων εκχυλισμάτων. Dr. Marie Claude Bon (USDA ARS, Baillarguet, France) για τη συμβολή της στην ταυτοποίηση των βακτηρίων και τις πολύτιμες συμβουλές της για το ίδιο θέμα. Κ. Λεωνίδα Λώτο για τη βοήθειά του στην ταυτοποίηση των βακτηρίων. Κ. Βάιο Πολυμέρου, Γεωπόνο Περιφερειακού Κέντρου Προστασίας Φυτών και Ποιοτικού Ελέγχου για την υπόδειξη αγρών δειγματοληψίας στο Νομό Χαλκιδικής. Κ. Γεώργιο Μενεξέ, λέκτορα του τομέα Φ.Μ.Κ.Ο. για τις ουσιαστικές παρατηρήσεις και υποδείξεις του σχετικά με τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της μεταπτυχιακής διατριβής μου. Τέλος, θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στα μέλη της οικογένειάς μου, Γιώργο, Μαντλέν και Φρανσουάζ για την παρουσία τους δίπλα μου τόσα χρόνια, τη βοήθειά τους για αυτή τη διατριβή και για τη στήριξή τους σε όλα. Κάμου Ναταλί Νεφέλη Φεβρουάριος

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Πρόλογος Ευχαριστίες... 4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 6 Περίληψη Abstract ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η βιολογική καταπολέμηση ως μέθοδος αντιμετώπισης των ασθενειών των φυτών Μικροβιακές αλληλεπιδράσεις στη ριζόσφαιρα Μηχανισμοί βιολογικής δράσης Τα βακτήρια του γένους Serratia ως βιολογικοί παράγοντες Τα βακτήρια του γένους Bacillus ως βιολογικοί παράγοντες Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas ως βιολογικοί παράγοντες Στρατηγικές επιλογής βιοπαραγόντων Βιολογία του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Η βιολογική καταπολέμηση του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Σκοπός της εργασίας Πειραματικό μέρος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Απομόνωση ριζοβακτηρίων και επιλογή των πιο αποτελεσματικών έναντι του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε in vitro δοκιμές Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Απομόνωση ριζοβακτηρίων, λήψη και επιλογή μεμονωμένων αποικιών

7 Έλεγχος αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici από νεοαπομονωμένα βακτηριακά στελέχη της ριζόσφαιρας σε πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες σε τρυβλίο Διερεύνηση της ικανότητας των επιλεγμένων πιθανών βιοπαραγόντων να λύουν τις μυκηλιακές υφές του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- Βιοδοκιμή λύσης υφών Αποτελέσματα Απομόνωση ριζοβακτηρίων, λήψη και επιλογή μεμονωμένων αποικιών Έλεγχος αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici από νεοαπομονωμένα βακτηριακά στελέχη της ριζόσφαιρας σε πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες σε τρυβλίο Διερεύνηση της ικανότητας των επιλεγμένων πιθανών βιοπαραγόντων να λύουν τις μυκηλιακές υφές του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- Βιοδοκιμή λύσης υφών Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Ταυτοποίηση των αποτελεσματικότερων ριζοβακτηρίων μέσω της ανίχνευσης χαρακτηριστικών αλληλουχιών βάσεων στο γενετικό υλικό τους, με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης του γονιδίου 16S rrνα Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης της περιοχής ανάμεσα στο 16S rrna και 23S rrna Αποτελέσματα Συζήτηση Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης του γονιδίου 16S rrna Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης της περιοχής ανάμεσα στο 16S rrna και 23S rrna ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Μελέτη της επίδρασης των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε δοκιμές in planta

8 3.1. Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε κλειστό σύστημα ελεγχόμενων συνθηκών (gnotobiotic) Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε γλάστρες Μελέτη της επίδρασης των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της ασθένειας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici στον αγρό Αποτελέσματα Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε κλειστό σύστημα ελεγχόμενων συνθηκών (gnotobiotic) Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε γλάστρες Μελέτη της επίδρασης των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της ασθένειας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici στον αγρό Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Απομόνωση και διαχωρισμός αντιμυκητιακών μεταβολιτών από τους νέους βιοπαράγοντες Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- από οργανικά εκχυλίσματα καλλιεργειών των νέων βιοπαραγόντων- Βιοδοκιμή του διηθητικού χαρτιού

9 Διαχωρισμός δραστικών συστατικών οργανικών εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βιοπαραγόντων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας-βιοδοκιμή TLC Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- από ακατέργαστα υπερκείμενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων και από οργανικά εκχυλίσματά τους - Βιοδοκιμή microtiter Αποτελέσματα Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- από οργανικά εκχυλίσματα καλλιεργειών των νέων βιοπαραγόντων- Βιοδοκιμή του διηθητικού χαρτιού Διαχωρισμός δραστικών συστατικών οργανικών εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βιοπαραγόντων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας-βιοδοκιμή TLC Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από οργανικά εκχυλίσματα υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων, και από τα ακατέργαστα διηθημάτων τους-βιοδοκιμή microtiter Συζήτηση Συμπεράσματα και προοπτικές Βιβλιογραφικές πηγές Παράρτημα

10 Περίληψη Η ανάγκη για περιορισμό της αλόγιστης χρήσης των συμβατικών μεθόδων καταπολέμησης και ειδικότερα των χημικών σκευασμάτων, οδήγησε στη στροφή της φυτοπροστασίας προς τη βιολογική καταπολέμηση. Στα πλαίσια αυτής, στην παρούσα εργασία, ελέγχθηκαν 383 ριζοβακτήρια που απομονώθηκαν από καλλιεργούμενα φυτά από διάφορες περιοχές της Ελλάδας. Ο έλεγχος έγινε για τη δράση τους κατά του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxusporum f.sp. radicis lycopersici (Forl), ο οποίος προκαλεί την ασθένεια της σήψης του λαιμού και των ριζών της τομάτας. Η ανασταλτική δράση των ριζοβακτηρίων ελέγχθηκε μέσω πειραμάτων in vitro και in planta. Στο πλαίσιο των in vitro πειραμάτων έγιναν βιοδοκιμές λύσης υφών και έλεγχος παρουσίας ζώνης αναστολής της μυκηλιακής ανάπτυξης, σε πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες των βακτηρίων με το μύκητα, σε τρυβλία Petri. Τα αποτελεσματικότερα βακτήρια ταυτοποιήθηκαν μέσω της αλληλούχισης του 16S rrna ή, μέσω της αλληλούχισης της περιοχής ανάμεσα στο 16S και το 23S rrna. Οι δοκιμές in planta συμπεριέλαβαν πειράματα σε σύστημα gnotobiotic, σε γλάστρες, και ένα ενδεικτικό πείραμα στον αγρό, όπου η ασθένεια από τεχνητές μολύνσεις φυτών τομάτας με το μύκητα, αντιμετωπίστηκε με τη χρήση των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων. Επίσης, ελέγχθηκε σε γλάστρες, η ικανότητα προαγωγής της ανάπτυξης του φυτού της τομάτας από τα επιλεγμένα ριζοβακτήρια. Τέλος, πραγματοποιήθηκε έλεγχος παρουσίας αντιμυκητιακών μεταβολιτών στα διηθήματα και οργανικά εκχυλίσματα υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων. Η δράση των ουσιών επί της ανάπτυξης του φυτοπαθογόνου μύκητα ελέγχθηκε μέσω βιοδοκιμής διηθητικού χαρτιού, βιοδοκιμής TLC και βιοδοκιμής σε microtiter. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τα στελέχη Bacillus cereus Σ76 και Σ79, Serratia rubidaea Σ55 και Σ49, Serratia marcescens ΠιΧα5ΙΙ, Σ52 και Σ47 και το Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, ως αποτελεσματικούς βιοπαράγοντες που αναστέλλουν επιτυχώς την ανάπτυξη του μύκητα Forl και την ένταση της ασθένειας που αυτός προκαλεί στην τομάτα. Επίσης, τα στελέχη Serratia marcescens Σ47, 10

11 Bacillus cereus Σ76 και Σ79 και Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 έδειξαν να προάγουν στατιστικώς σημαντικά την ανάπτυξη των φυτών της τομάτας σε γλάστρες αλλά και στον αγρό. 11

12 Abstract The need to limit the irrational use of conventional methods and especially chemical fungicidesin plant protection, has led to a turn towards the use of biological control. In the present research, 383 rhizobacteria, isolated from cultivated plants from different regions of Greece, were studied. The bacteria were screened based upon their ability to control the plant pathogenic fungus Fusarium oxusporum f.sp. radicis lycopersici (Forl), which causes the disease crown and root rot of tomato. The inhibitory activity of the bacteria on the fungus, was tested in in vitro and in planta experiments. In the in vitro experiments, a lysis bioassay was performed and the presence of a potential zone of inhibition of fungal growth was examined in multiple and dual cultures of the fungus and the bacteria, in Petri dishes. The most effective bacteria were identified by sequencing the 16S rrna gene, or by sequencing the inter spacer region between 16S and 23S rrna. The in planta tests included laboratory experiments in a gnotobiotic system and in pots, and one indicative field experiment, in which the disease caused by artificial inoculations of tomato plants with the fungus, was encountered with the selected rhizobacteria. Moreover, the ability of these rhizobacteria to promote the growth of tomato was studied in pot experiments. Finally, tests were performed in order to invastigate the presence of antifugal metabolites in the biocontrol agents liquid culture filtrates and their organic extracts. The effect of these metabolites on the growth of the fungus was studied by filter paper, TLC, and microtiter bioassays. The results demonstrated that the strains Bacillus cereus S76 and S79, Serratia rubidaea S55 and S49, Serratia marcescens PiHa5II, S52 and S47 and Pseudomonas chlororaphis ΤοZa7 are effective biocontrol agents that inhibit successfully the growth of Forl, and the disease intensity caused by this fungus on tomato. In addition, the strains S. marcescens S47, B. cereus S76 and S79 and P. chlororaphis ToZa7, showed a statistically important promotion of tomato plants growth in pots and in the field. 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η βιολογική καταπολέμηση ως μέθοδος αντιμετώπισης των ασθενειών των φυτών Η προστασία της φυτικής παραγωγής από μυκητολογικές ασθένειες γίνεται κατά κανόνα με συμβατικά μέσα, δηλαδή με τη χρήση συνθετικών μυκητοκτόνων. Η αλόγιστη χρήση αυτών των τελευταίων οδήγησε στην ανάγκη η φυτοπροστασία να στραφεί σε πιο φιλικά προς το χρήστη, τον καταναλωτή και το περιβάλλον μέσα καταπολέμησης, που να μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνα τους, ή στα πλαίσια της ολοκληρωμένης διαχείρισης να συνδυάζονται με μειωμένες δόσεις χημικών. Τέτοιο μέσο είναι η βιολογική καταπολέμηση η οποία ορίζεται ως η πρακτική αντιμετώπισης των ασθενειών με μη παθογόνους μικροοργανισμούς, που είναι ικανοί να καταστείλουν ή και να εξουδετερώσουν τους φυτοπαθογόνους με δράση άμεση ή έμμεση. Ο οργανισμός που πετυχαίνει κάτι τέτοιο καλείται βιολογικός παράγοντας ή βιοπαράγοντας (biological control agent, BCA) (Pal & McSpadden, 2006). Οι βιοπαράγοντες μπορεί να είναι ιοί, μύκητες ή βακτήρια. Αυτοί μέσω του ανταγωνισμού, του παρασιτισμού, της έκκρισης ουσιών, ή της πρόκλησης διασυστηματικής αντοχής, αναστέλλουν την εξέλιξη μιας ασθένειας. Η βιολογική καταπολέμηση αφορά επεμβάσεις, που γίνονται τόσο στη ριζόσφαιρα όσο και στη φυλλόσφαιρα. Ως ριζόσφαιρα ορίζεται η περιοχή που περιλαμβάνει την επιφάνεια της ρίζας και μερικά χιλιοστά γύρω της (Hiltner, 1904). Αποτελεί μια οικοθέση (niche) πλούσια σε θρεπτικά στοιχεία, όπου οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται και αναπτύσσουν σχέσεις μεταξύ τους αλλά και με το φυτό. Ως φυλλόσφαιρα ορίζεται το υπέργειο τμήμα του φυτού, δηλαδή τα φύλλα και τα στελέχη (Andrews, 1992). Υπάρχουν δύο τρόποι εφαρμογής της βιολογικής καταπολέμησης στην πράξη: η μία στρατηγική συνάδει με τις αρχές της οικολογίας και καλείται κλασσική ή βιολογική καταπολέμηση (Hokkanen & Lynch, 1995), ή βιολογική καταπολέμηση με μία μόνο εφαρμογή (Cook, 1993). Σε αυτήν ο βιοπαράγοντας εισάγεται μόνο μία φορά σε ένα περιβάλλον, στο οποίο αναμένεται να εγκατασταθεί και να 13

14 προσαρμοστεί διασφαλίζοντας έτσι τη φυσική του αναπαραγωγή. Η άλλη στρατηγική βασίζεται στη χρήση των μικροοργανισμών ως βιολογικών γεωργικών φαρμάκων και καλείται αυξητική βιολογική καταπολέμηση καθώς βασίζεται στις πολλές εφαρμογές σε αντιστοιχία με τη χημική καταπολέμηση (Hokkanen & Lynch, 1995) Μικροβιακές αλληλεπιδράσεις στη ριζόσφαιρα Οι μικροοργανισμοί είναι άρρηκτα συνδεδεμένοι με το οικοσύστημα της ριζόσφαιρας. Κάποιοι από αυτούς είναι παθογόνα των φυτών, αλλά οι περισσότεροι σχετίζονται με τη συμβίωση με τα φυτά, την προαγωγή της ανάπτυξής τους και την αυξημένη αντοχή τους στα παθογόνα (Graham & Vance, 2000; Glick et al., 2007; Adesemoye & Kloepper, 2009). Οι μικροοργανισμοί που ανταγωνίζονται τη δράση των παθογόνων ως βιοπαράγοντες, προστατεύουν το φυτό είτε μέσω της άμεσης αλληλεπιδρασής τους με το παθογόνο, είτε μέσω της επαγωγής Διασυστηματικής Αντοχής (Induced Systemic Resistance, ISR) (Baker, 1968; Compant et al., 2005; Shoresh et al., 2010). Επιπλέον τα ωφέλιμα ριζοβακτήρια εμποδίζουν την ικανότητα των παθογόνων μικροοργανισμών να εκφράζουν γονίδια vir (virulance genes γονίδια μολυσματικότητας), και αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αποδόμησης των μορίων, που σηματοδοτούν κάθε φορά την έναρξη της παραγωγής προϊόντων των γονιδίων avr (Lutenberg et al., 2001; Compant et al., 2005; Weller, 2007; Mavrodi et al., 2011). Οι ρίζες των φυτών εκκρίνουν ένα εύρος οργανικών ουσιών, όπως: αμινοξέα, λιπαρά οξέα, νουκλεοτίδια, οργανικά οξέα, φαινολικές ουσίες, ρυθμιστές ανάπτυξης, πουτρεσίνη, στερόλες, σάκχαρα και βιταμίνες (Lugtenberg & Kamilova, 2009). Ως εκ τούτου, η επιφάνεια της ριζόσφαιρας αποτελεί ένα πολύ καλό υπόστρωμα για τη μικροβιακή ανάπτυξη. Κατ επέκταση, η δομή της μικροβιακής κοινότητας εξαρτάται από το γενότυπο του φυτού, καθώς αυτός καθορίζει ποιες ουσίες θα εκκριθούν από το ριζικό σύστημα και άρα από ποιους μικροργανισμούς αυτό θα αποικιστεί (Manter et al., 2010). Η επιτυχία του βιοπαράγοντα εξαρτάται από την ικανότητά του να αποικίσει αποτελεσματικά τη ρίζα, δηλαδή να προσκολληθεί, να πολλαπλασιαστεί και να επιβιώσει σε αυτήν (Ahmad & Baker, 1987). Το αρχικό στάδιο του αποικισμού είναι η αναγνώριση των φυτών από τους μικροοργανισμούς. Αυτή συντελείται μέσω της χημειόταξης, η οποία ορίζεται ως η 14

15 κίνηση σε σχέση με κάποια πηγή χημικού ερεθίσματος (εδώ οι ριζικές εκκρίσεις), κίνηση που είναι αυτόνομη και οφείλεται σε διάφορα όργανα (μαστίγια, τριχίδια, κ.α.). Η χημειόταξη μπορεί να έχει διάφορες μορφές, όπως είναι η κατεύθυνση προς και η απομάκρυνση από την πηγή του ερεθίσματος, καθώς και η αλλαγή ταχύτητας όταν πλησιάζεται η πηγή (Lutenberg & Kamilova, 2009). Το δεύτερο στάδιο είναι αυτό της προσκόλλησης στη ριζική επιφάνεια, η οποία συχνά συνοδεύεται από την παραγωγή βιοφίλμ (biofilm), μικροαποικιών (microcolonies) ή συμπλασμάτων (symplasmata), δηλαδή συναθροίσεων χωρίς κανονική κατανομή, που βρίσκονται κατά κανόνα κατά μήκος των αυλακιών μεταξύ των επιδερμικών κυττάρων (Parke, 1991). Στο στάδιο αυτό συμμετέχουν οι βλεφαρίδες (fimbriae, pilli) και τα ινίδια (fibrils), ειδικές προσφυτικές πρωτεΐνες που καλούνται αδεσίνες (adhesins), το «τύπου ΙΙΙ σύστημα έκκρισης πρωτεϊνών», οι λιποπολυσακχαρίτες (Lipopolysaccharides, LPS), καθώς και η πλευρική αντιγονική αλυσίδας Ο της εξωτερικής μεμβράνης ή επιφανειακής λιποπρωτεΐνης των Gram- βακτηρίων (Mavrodi et al., 2011). Αναλυτικότερα, οι αδεσίνες είναι συστατικά της επιφάνειας των βακτηριακών κυττάρων, που διευκολύνουν την προσκόλληση του μικροοργανισμού στις επιφάνειες. Στα Gram- βακτήρια ως αδεσίνες λειτουργούν οι βλεφαρίδες, ενώ στα Gram+ το ρόλο αυτό έχει ένα στρώμα πρωτεϊνικής ή πολυσακχαρικής φύσεως στην επιφάνεια των βακτηρίων. Ως αδεσίνες ουσιαστικά ορίζονται οι πρωτεϊνικής φύσεως κατασκευές, οι οποίες βοηθούν στην προσκόλληση του μικροοργανισμού. Το «τύπου ΙΙΙ σύστημα έκκρισης πρωτεϊνών» είναι ένα σύστημα μεταφοράς πρωτεϊνών στον ξενιστή, που γίνεται με μια διαδικασία «ένεσης» με τη βοήθεια βλεφαρίδων. Αυτή έγκειται στο να εκκρίνονται μέσω αυτού του συστήματος κάποια προσαρτήματα (appendages) διαμέτρου 50nm, τα οποία λειτουργούν ως γέφυρα μεταξύ των βακτηρίων και των κυττάρων του ξενιστή (Galan, 1999), για τη μεταφορά μορίων από τα πρώτα στα δεύτερα. Το σύστημα κωδικοποιείται από τα hrp γονίδια (γονίδια που κωδικοποιούν τις χαρπίνες hypersensitive response proteins) και χρησιμοποιείται κατά κανόνα από παθογόνα βακτήρια, για να εισαχθούν παράγοντες παθογένεσης στα κύτταρα των φυτών. Έτσι, ο μηχανισμός αυτός αξιοποιείται τόσο από φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς προκαλώντας είτε ασθένεια, είτε αντίδραση υπερευαισθησίας (Hypersensitive Response, HR), αλλά και από τους βιοπαράγοντες οι οποίοι μέσω αυτού ολοκληρώνουν το στάδιο της προσκόλλησης στο ριζικό 15

16 σύστημα (Cytryn & Kolton, 2011). Η συμμετοχή του συστήματος έκκρισης τύπου ΙΙΙ στη διαδικασία προσκόλλησης, έχει μελετηθεί κατά κύριο λόγο σε φυτοπαθογόνα γένη βακτηρίων. Επομένως ο ρόλος του σε σχέση με τη δράση των βιοπαραγόντων αποτελεί ελκυστικό πεδίο μελέτης. Αφού η ρίζα αποικιστεί επιτυχώς από τους μικροοργανισμούς, ακολουθεί η δράση αυτών ως βιοπαραγόντων, μέσω άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης με τους παθογόνους μικροοργανισμούς Μηχανισμοί βιολογικής δράσης Άμεση επίδραση του βιοπαράγοντα στον παθογόνο μικροοργανισμό Πολλοί βιοπαράγοντες έχουν βρεθεί να αναστέλλουν τις φυτικές ασθένειες. Οι τρόποι δράσης τους είναι ποικίλοι. Παρακάτω αναφέρονται οι πιο γνωστοί. Ανταγωνισμός για θρεπτικά στοιχεία και θέσεις αποικισμού (οικοφωλιές) Μικροσκοπικές αναλύσεις των ριζών γενικά δείχνουν, πως οι περιοχές αποικισμού τους είναι διάσπαρτες και αυτό υποδεικνύει, πως ο ανταγωνισμός για οικοφωλεές περιορίζεται σε σημεία με μεγάλη συγκέντρωση σε οργανικές ουσίες και άλλα θρεπτικά στοιχεία. Αυτά τα σημεία καλούνται organic hotpots (Weller, 1988). Χαρακτηριστικό τέτοιο σημείο αποικισμού από τους βακτηριακούς βιοπαράγοντες είναι τα μεσοκυττάρια χάσματα των επιδερμικών κυττάρων (Bolwerk et al., 2003). Συνεπώς ανταγωνισμός για θέση αποικισμού σημαίνει αναπόφευκτα και ανταγωνισμό για θρεπτικά στοιχεία, καθιστώντας έτσι δυσχερή την ολοκλήρωση μόλυνσης από το παθογόνο. Τέτοιες μορφές ανταγωνισμού είναι ο ανταγωνισμός για πηγές άνθρακα και αζώτου, αλλά και για πηγές σιδήρου (Barea et al., 2005). Ο ανταγωνισμός για σίδηρο καθίσταται δυνατός μέσω της παραγωγής σιδηροφόρων. 16

17 Οι σιδηροφόροι είναι βιογενείς χηλικές 1 ενώσεις υψηλής συγγένειας με το σίδηρο, οι οποίες είναι ικανές να σχηματίζουν πολύ σταθερά σύμπλοκα με αυτόν (Neilands, 1957). Ο σχηματισμός τους προάγεται σε συνθήκες περιορισμένης διαθεσιμότητας σιδήρου, γι αυτό και επιτυγχάνεται ανταγωνισμός. Παρασιτισμός και αρπακτικότητα μέσω παραγωγής ενζύμων που λύουν κυτταρικά τοιχώματα Ο παρασιτισμός κάποιου φυτοπαθογόνου μύκητα από έναν βιοπαράγοντα καλείται υπερπαρασιτισμός ή μυκοπαρασιτισμός. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει την περιέλιξη των υφών ενός υπερπαράσιτου μύκητα γύρω από αυτές του παθογόνου, ή τη διάβρωση των υφών του παθογόνου (διάτρηση και είσοδο) και την κατανάλωση πρωτοπλάσματος. Παρασιτισμός υφών παθογόνων μυκήτων έχει παρατηρηθεί και από ριζοβακτήρια, αλλά δεν έχει εξηγηθεί η σημασία του φαινομένου αυτού, ούτε έχει μελετηθεί η πιθανή παρασιτικά δράση επί του μύκητα (Bolwerk et al., 2003). Πολλοί βιοπαράγοντες παράγουν εξωκυτταρικά λυτικά ένζυμα τα οποία μπορεί να είναι χιτινάσες, πρωτεάσες και άλλες ουσίες όπως το υδροκυάνιο (Ko et al., 2009; Neeraja et al., 2010). Αξίζει να αναφερθεί πως τα μονομερή της χητίνης που παράγονται κατά τη διάσπασή της από τις χιτινάσες, χρησιμοποιούνται για να διεγερθεί η ISR σε φυτά, πράγμα που δείχνει πως οι βιοπαράγοντες σε κάποιες περιπτώσεις αναστέλλουν τα παθογόνα με παραπάνω από ένα μηχανισμό. Επίσης, τα παραπάνω ένζυμα δρουν συνεργιστικά και με άλλους αντιμυκητιακούς μεταβολίτες (Antifungal Metabolites, AFM s) (Cytryn & Kolton, 2011). Αντιβίωση και Αντιμυκητιακοί Μεταβολίτες (AFM s) Υπάρχουν πολυάριθμες έρευνες, που αναφέρονται στην παραγωγή των αντιμυκητιακών μεταβολιτών (Anti Fungal Metabolites, AFM s) (εξαιρούνται οι χηλικές ενώσεις και τα ένζυμα) από κάποια βακτηριακά στελέχη in vitro. Σε αυτές τις 1 Η σημασία των χηλικών ενώσεων για τη γεωργία οφείλεται στο γεγονός ότι το μεταλλοϊόν που περιέχουν δεσμεύεται ελάχιστα έως καθόλου από το έδαφος. Οι χηλικές ενώσεις είναι σύμπλοκες οργανικές ενώσεις που σχηματίζονται (1) από ένα μεταβατικό στοιχείο του οποίου τα d τροχιακά είναι μερικά συμπληρωμένα και (2) από μία οργανική ένωση που φέρει πυρηνόφιλες ομάδες (-NH 2, -SH). Η δομή τους είναι τέτοια ώστε να μπορεί να σχηματιστεί δακτύλιος από πέντε ή έξι άτομα μαζί με το μέταλλο. Η δομή των μορίων των ενώσεων θυμίζει την χηλή (δαγκάνα) του αστακού και γι' αυτό ονομάστηκαν χηλικές ενώσεις (Bouthalfa & Crumbliss, 2002; Kraemer, 2003; Crowley, 2006). 17

18 ενώσεις ανήκουν και τα αντιβιοτικά, τα οποία ορίζονται ως ενώσεις μικρού ΜΒ, προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού, που παράγονται από βιοπαράγοντες και σε μικρές συγκεντρώσεις δρουν ανασταλτικά επί των παθογόνων. Στους AFM s ανήκουν η αμμωνία, το υδροκυάνιο, οι βουτυρολακτόνες, η 2,4 δι ακετυλοφλωρογλουκινόλη (Acetylfluoroglucinole, Ph1), η κανοζαμίνη, η ολιγομυκίνη Α, η ωομυκίνη Α, η φεναζίνη 1 καρβοξυλικό οξύ (Phenazine 1 carboxylic acid, PCA), η πυολουτεορίνη (Pyoluteorin, Plt), η πυρρολνιτρίνη (Pyrrolnitrin, Pln), το βισκοσιναμίδιο, η ξανθοβακίνη, η σβιτερμυκίνη Α και η τενσίνη (Whipps, 1997; Thrane et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Nair et al., 2004). Στον παρακάτω πίνακα 1 φαίνονται συγκεντρωτικά αντιβιοτικά που έχουν καταγραφεί μέχρι πρόσφατα. Για να αποδειχτεί ο ρόλος αυτών των ουσιών ή η δράση Πιν. 1. Αντιβιοτικές ουσίες και βιοπαράγοντες που τις παράγουν (Pliego et al., 2011) Αντιβιοτική ουσία Προέλευση Παθογόνο στόχος Ασθένεια Βιβλιογραφική αναφορά 2,4 diacetylphloroglucinol Pseudomonas fluorescens F113 Pythium spp. Τήξη φυταρίων Shanahan et al., 1992 Agrocin 84 Agrobacterium radiobacter Agrobacterium tumefaciens Καρκίνος των φυτών Kerr, 1980 Bacillomycin D Bacillus subtilis AU195 Aspergillus flavus Μόλυνση από αφλατοξίνες Moyne et al., 2001 Bacillomycin, fengicin Bacillus amyloliquefaciens FZB42 Fusarium oxysporum Μάρανση Koumoutsi et al., 2004 Xanthobaccin Α Lysobacter sp. strain SB K88 Aphanomyces cochlioides Τήξη φυταρίων Islam et al., 2005 Gliotoxin Trichoderma virens Rhizoctonia solani Σήψη ριζών Wilhite et al., 2001 Herbicolin Pantoea agglomeransc9 1 Erwinia amylovora Βακτηριακό κάψιμο Sandra et al., 2001 Iturin A B. subtilis QST713 Botrytis cinerea και R. solani Mycosubtilin B. subtilis BBG100 Pythium aphanidermatum Τήξη φυταρίων Τήξη φυταρίων Paulitz και Belanger, 2001; Kloepper et al., 2004 Leclere et al., 2005 Phenazines P. fluorescens 2 79 και Gaeumannomyces graminis var. tritici Ασθένεια λευκών Thomashow et al.,

19 σταχύων Pyoluterin, Pyrrolnitrin P. fluorescens Pf 5 Pythium ultimum και R.solani Τήξη φυταρίων Howell και stipanovic, 1980 Pyrrolnitrin, pseudane Burkholderia cepacia R. solani και Pyricularia oryzae Τήξη φυταρίων και σήψη ριζιού Homma et al., 1989 Zwittermycin A Bacillus cereus UW85 Phytophthora medicaginis και P. aphanidermatum Τήξη φυταρίων Smith et al., 1993 Phenazine 1 carboxamide (PCN) Pseudomonas chlororaphis PCL1391 Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici Σήψη λαιμού και ριζών Chin A Woeng et al., 1998 τους επί των παθογόνων, χρησιμοποιούνται μεταλλαγμένα άτομα, τα οποία στερούνται της ικανότητας παραγωγής αυτών των ουσιών, ή μεταλλαγμένα άτομα τα οποία τις υπερπαράγουν (Bonsall et al., 1997; Chin A Woeng et al., 1998; Whipps, 2001). Άλλος τρόπος να αποδειχτεί η παραγωγή αντιβιοτικών είναι η χρήση γονιδίων ανταποκριτών (reporter genes) ή ανιχνευτών DNA (DNA probes) (Kraus & Loper, 1995). Η παραγωγή αντιβιοτικών από τα βακτήρια, ειδικά του γένους Pseudomonas, σχετίζεται άμεσα και με το φυτό ξενιστή. Η ποσότητα και το είδος των αντιβιοτικών που θα παραχθούν, φαίνεται να ελέγχονται από ένα διττό σύστημα, που περιλαμβάνει έναν περιβαλλοντικό δέκτη, πιθανώς μια μεμβρανική πρωτεΐνη, στα κύτταρα του φυτού ξενιστή και έναν παράγοντα στο κυττόπλασμα του βιοπαράγοντα, που αποκρίνεται σε αυτόν (Keel & Défago, 1997). Η επίδραση του παθογόνου έγκειται στο ότι διεγείρει την παραγωγή ριζικών εκκρίσεων κι έτσι έμμεσα ενεργοποιεί αυτό το διττό σύστημα (Whipps et al., 2001). Η ποσότητα των αντιβιοτικών που θα παραχθούν, αφού ληφθεί το σήμα και αποκριθεί ο δέκτης, καθορίζεται από έναν συνδυασμό μηχανισμών που σχετίζονται με την πυκνότητα του βακτηριακού πληθυσμού. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται quorum sensing και ορίζεται ως ο μηχανισμός διακυτταρικής επικοινωνίας, με τον οποίο ο βακτηριακός πληθυσμός αυξομειώνεται και αποκτά την τελική πυκνότητά του, η οποία απαιτείται για την εκτέλεση κάποιας μεταβολικής λειτουργίας, στην προκείμενη περίπτωση την παραγωγή του αντιβιοτικού (Miller & Bassler, 2001). 19

20 Χαρακτηριστικό παράδειγμα δράσης αντιβιοτικού είναι η δράση της φεναζίνης 1 καρβοξυαμίδης (PCN) του Pseudomonas chlororaphis PCL 1391, εναντίον του παθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis - lycopersici (Forl), η οποία συνίσταται στην επίσπευση της γήρανσης του μυκηλίου με αύξηση του αριθμού των χυμοτοπίων, στη διόγκωση των υφών, στη διαταραχή του Spitzenkorper και στην αύξηση των διακλαδώσεων των υφών (Bolwerk et al., 2003). Διάσπαση τοξινών και αποδόμηση των μολυσματικών παραγόντων Ένας ακόμη μηχανισμός βιολογικής καταπολέμησης είναι μέσω της απενεργοποίησης της τοξικής δράσης των παθογόνων. Για παράδειγμα, κάποιοι βιοπαράγοντες έχουν την ικανότητα να απενεργοποιούν την τοξίνη αλμπικιδίνη, που παράγεται από το βακτήριο Xanthomonas albilineans (Walker et al., 1988; Zhang et al., 1996; Zhang et al., 1997). Οι μηχανισμοί αποδόμησης των τοξινών περιλαμβάνουν τόσο την παραγωγή πρωτεϊνών, οι οποίες αναστρέψιμα προσδένονται στην τοξίνη των παθογόνων (Walker et al., 1988), όσο και τη μη αναστρέψιμη απενεργοποίηση της αλμπικιδίνης, η οποία βασίζεται στην παρέμβαση μιας εστεράσης (Zhang et al., 1996). Άλλο παράδειγμα είναι η υδρόλυση του φουζαρικού οξέος, της παθοτοξίνης που παράγουν τα διάφορα είδη του γένους Fusarium από μικροοργανισμούς των γενών Cladosporium και Pseudomonas (Toyoda et al., 1988; Toyoda & Utsumi, 1991) Έμμεση επίδραση του βιοπαράγοντα στο παθογόνο Σε αυτήν την κατηγορία δράσης των βιοπαραγόντων περιλαμβάνεται η επαγωγή της ISR με άμεση επίδραση στο φυτό-ξενιστή και αποτέλεσμα την αύξηση της αντοχής του. Γενικά η επαγωγή της ISR προκαλείται από τα αποκαλούμενα «ριζοβακτήρια που προάγουν την ανάπτυξη του φυτού» (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR). 20

21 Προαγωγή της ανάπτυξης του φυτού Η ριζόσφαιρα ως όρος πρωτοεμφανίστηκε το 1904 και η έννοια περιγράφηκε τότε από τους Lorenz και Hiltner (Compant et al., 2010). Ακόμη και τότε ήταν φανερό, ότι επρόκειτο για μία περιοχή έντονης δραστηριότητας, που οφειλόταν κυρίως στους προαναφερθέντες μικροοργανισμούς. Είναι πλέον γνωστό, ότι η παρουσία των εκκρίσεων της ρίζας καθώς και εναποθέσεων αυτής (rhizodeposits) καθιστά την περιοχή ιδανική για την ανάπτυξη μικροοργανισμών (Compant et al., 2010). Οι μικροοργανισμοί αυτοί μπορεί να είναι ουδέτεροι ή επιβλαβείς και φυσικά κάποιοι από αυτούς υποστηρίζουν και ενισχύουν τον ξενιστή τους με ποικίλους τρόπους (Bashan and Holguin, 1998). Ανάμεσα στους ωφέλιμους μικροοργανισμούς είναι και τα PGPR. Τα PGPR που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών άμεσα, χωρίζονται σε 4 κατηγορίες: Αυτά που προκαλούν βιολίπανση (biofertilizers), αυτά που θεραπεύουν τη ρίζα (rhizoremediators), τα βακτήρια που ρυθμίζουν την ανάπτυξη (phytostimulators, ή plant growth regulators) και αυτά που ελέγχουν τις καταπονήσεις (stress controllers) (Pliego et al., 2011). Περιληπτικά, τα βακτήρια που ανήκουν στην πρώτη ομάδα, είναι αυτά που έχουν την ικανότητα, να παρέχουν στο ριζικό σύστημα του φυτού θρεπτικά στοιχεία όπως το άζωτο, ο φώσφορος και ο σίδηρος. Για τη δέσμευση του τελευταίου χρησιμοποιούνται οι σιδηροφόροι που παράγουν κάποια είδη ψευδομονάδων (Neilands, 1995, Leong, 1986) και οι οποίοι μπορούν να προσληφθούν και από τα φυτά. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα ριζοβακτήρια, που αποδομούν διάφορες ουσίες, οι οποίες θεωρούνται ρυπαντές του οικοσυστήματος, βοηθώντας τα φυτά να αναπτυχθούν απομακρύνοντας ουσίες δηλητηριώδεις για αυτά (Khan et al., 2009). Οι ρυθμιστές ανάπτυξης παράγονται από τα ριζοβακτήρια και είναι ουσίες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυτών, δηλαδή φυτορμόνες. Τα ριζοβακτήρια βιοσυνθέτουν αυξίνη (ΙΑΑ) η οποία σε μεγάλες ποσότητες προάγει την ανάπτυξη του ριζικού συστήματος (Kamilova, 2006). Άλλες ορμόνες που βιοσυνθέτουν είναι οι κυτοκινίνες, οι οποίες έχει αποδειχθεί ότι παράγονται από πολλά γένη ριζοβακτηρίων, όπως Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Erwinia, Pantoea 21

22 agglomerans, Pseudomonas, Rhodospirillum rubrum, Serratia και Xanthomonas (Garcia de Salome et al., 2001). Η δομή αυτών των κυτοκινινών είναι παρόμοια με αυτήν των κυτοκινινών που παράγονται από τα φυτά (Barea et al., 1976; Garcia de Salome et al., 2001). Τα βακτήρια ρυθμιστές ανάπτυξης παράγουν επίσης γιββεριλίνες (GA s) οι οποίες σχετίζονται με την επιμήκυνση και τη διαίρεση των κυττάρων. Οι μηχανισμοί δράσης αυτών δεν έχουν ακόμη μελετηθεί, αν και αρκετά γένη βακτηρίων παράγουν και εκκρίνουν γιββεριλίνες στη ριζόσφαιρα (Pliego et al., 2011). Τα βακτήρια που ανήκουν στην τέταρτη κατηγορία εκκρίνουν και αυτά ορμόνες, οι οποίες όμως συμβάλλουν στο να προστατεύεται το φυτό από ποικίλες καταπονήσεις (ξηρασία, αλατότητα, τοξικά μέταλλα). Τέτοια δράση έχει και το αμπσισικό οξύ (ΑΒΑ), το οποίο δρα αυξάνοντας την αναλογία ρίζα/βλαστός (Boiero et al., 2007). Τέλος, το αιθυλένιο (ΕΤΗ) έχει και αυτό πολύ σημαντικό ρόλο στην προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών, καθώς παράγεται σε μεγάλες ποσότητες, τόσο κατά την προσβολή από παθογόνους μικροοργανισμούς, όσο και κατά την καταπόνηση του φυτού από την ξηρασία, δρα δηλαδή και ως παράγοντας μολυσματικότητας (virulence factor), σηματοδοτώντας την προσβολή από κάποιο παθογόνο (Boiero et al., 2007). Πρόκληση διασυστηματικής αντοχής Η επαγωγή της ISR γίνεται τόσο από PGPR, όσο και από μύκητες και ιούς. Η πρώτη παρατήρηση διεγειρόμενης αντοχής από PGPR έγινε σε γαριφαλιά (Dianthus caryophillus), όπου αποικισμός των φυτών από το Pseudomonas fluorescens WCS417 είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των φυτών που προσβάλλονται από το παθογόνο Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (van Peer et al., 1991) και στην αγγουριά (Cucumis sativus), όπου προκλήθηκε αυξημένη αντοχή στο παθογόνο Colletotrichum orbiculare (Wei et al., 1991). Τα στοιχεία των PGPR που καθορίζουν την ικανότητα πρόκλησης ISR είναι οι λιποπολυσακχαρίτες (LPS) της εξωτερικής μεμβράνης, και ειδικότερα η πλευρική αντιγονική αλυσίδα Ο που φέρουν, οι σιδηροφόροι και η ικανότητα παραγωγής σαλικυλικού οξέος. Επίσης η επαγωγή ISR αλλά και η διασυστηματική μεταφορά του σήματός της εξαρτώνται εκτός από τα παραπάνω και από την ικανότητα παραγωγής αιθυλενίου, αμπσισικού οξέος και ιασμονικού οξέος (van der Ent et al., 2009). 22

23 Η επαγωγή της ISR σημαίνει δυνατότερα κυτταρικά τοιχώματα, αλλαγές στη φυσιολογία του ξενιστή και μεταβολικές αποκρίσεις, που οδηγούν σε εντονότερη παραγωγή χημικών ουσιών, που καταστέλλουν τα παθογόνα. Αυτές οι βιοχημικές και βιολογικές αλλαγές περιλαμβάνουν την παραγωγή χιτινασών, περοξυδασών και φυτοαλεξινών (Ramamoorthy, 2001). Η ISR εξαπλώνεται διασυστηματικά, ως απόκριση στον αποικισμό του φυτού από βακτήρια των γενών Pseudomonas και Bacillus κυρίως (van Loon et al., 1998; Suresh et al., 2010). Οι βακτηριακοί διεγέρτες είναι πολλοί, με σημαντικότερους τη φλατζελίνη (flagellin), τους LPS, τις λιποπρωτεΐνες (van Loon, 2008) αλλά και τις φεναζίνες (Baker et al., 2007). Άλλοι σημαντικοί βακτηριακοί διεγέρτες είναι τα εξωκυτταρικά ένζυμα των βακτηρίων, τα προϊόντα της δράσης αυτών των ενζύμων και οι βακτηριακοί σιδηροφόροι (Ongena et al., 2005; van Loon et al., 2008). Ενδεικτικά φαίνονται οι παραπάνω ουσίες στον πίνακα 2. Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε, πως σε αρκετές περιπτώσεις οι ίδιες ουσίες που δρουν άμεσα καταστέλλοντας το παθογόνο, δρουν και έμμεσα ως διεγέρτες ενισχύοντας την άμυνα του φυτού. Οι περισσότερες βιβλιογραφικές πηγές αναφέρουν πάντως πως στον αγρό ο συνηθέστερος τρόπος δράσης είναι ο συνδυαστικός. Η μικροχλωρίδα του εδάφους χρησιμοποιεί όλα τα προαναφερθέντα μέσα και όχι κάποιο συγκεκριμένο, προκειμένου να επιτευχθεί αποτελεσματική προστασία του φυτού (Cytryn & Kolton, 2011) Τα βακτήρια του γένους Serratia ως βιολογικοί παράγοντες Τα βακτήρια του γένους Serratia είναι Gram-, προαιρετικά αναερόβια ραβδόμορφα βακτήρια, που ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae. Τα μέλη του γένους αυτού παράγουν μία χαρακτηριστική κόκκινη χρωστική ουσία, την προντιτζιοσίνη (prodigiosin) και μπορούν να διαφοροποιηθούν από τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας Enterobacteriaceae λόγω της παραγωγής τριών ενζύμων: της DNAσης (DNAse), της λιπάσης (lipase) και τις τζελατινάσης (gelatinase) (Bergey s manual, 2005). Η έρευνα πάνω στη δράση τους ως βιοπαραγόντων είναι σε αρχικό στάδιο και λίγες είναι οι μελέτες, που αναλύουν την ικανότητα των βακτηρίων του γένους αυτού, να αναστείλουν κάποια ασθένεια των φυτών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η 23

24 μελέτη της επίδρασης του στελέχους S. plymuthica HRO C48 σε ασθένειες της φράουλας (Kurze et al., 2001). Το βακτήριο S. plymuthica είναι χιτινολυτικό ριζοβακτήριο, το οποίο στην εν λόγω εργασία ελέγχθηκε για την επίδρασή του ως PGPR και για την αναστολή των παθογόνων Verticillium dahliae και Phytophthora cactorum. Αποδείχτηκε αποτελεσματικός βιοπαράγοντας με επιδράσεις στις ασθένειες, που προκαλούν τα παραπάνω παθογόνα, ανάλογες της συγκέντρωσής του. Μια αντίστοιχη μελέτη είναι και αυτή που έγινε με το βακτήριο S. liquefaciens, με σκοπό να διαπιστωθεί η δράση του ως βιοπαράγοντα στην αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Sneh et al., 1984). Το βακτήριο S. marcescens αναφέρεται ως επιτυχημένος βιοπαράγοντας εδώ και αρκετά χρόνια (Ordentlich, 1988). Στελέχη του S. marcescens βρέθηκαν να είναι αποτελεσματικοί βιοπαράγοντες κατά των μυκήτων Sclerotium rolfsii και Rhizoctonia solani. Τα στελέχη μείωσαν την ασθένεια κατά 75% και 50% αντίστοιχα, προκαλώντας αναστολή της ανάπτυξης του S. rolfsii κατά 36%. Στην ίδια μελέτη αναφέρεται η δοκιμή δράσης αυτών των στελεχών σε θερμοκήπιο. Πιν. 2: Βακτηριακοί διεγέρτες και τύποι αντοχής που προκαλούν στον ξενιστή (Pliego et al., 2011). Βακτηριακό στέλεχος Φυτικό είδος Βακτηριακός μεταβολίτης Τύπος άμυνας Βιβλιογραφική αναφορά Bacillus mycoides (Bac J) Ζαχαρότευτλο Περοξυδάση, χιτινάση και β 1,3 γλουκανάση ISR Bargabus et al., 2002 Bacillus pumilus Ζαχαρότευτλο Περοξυδάση, χιτινάση και β 1,3 γλουκανάση ISR Bargabus et al., 2004 Bacillus subtilis GB03 και ΙΝ937a Pseudomonas fluorescens CHA0 Arabidopsis 2,3 βουτανεδιόλη ISR Ryu et al., 2004 Καπνός Σιδηροφόροι SAR Maurhofer et al., 1994 Arabidopsis Αντιβιοτικό (DAPG) ISR Iavicoli et al., 2003 Pseudomonas fluorescens WCS374 Ραπανάκι Λιποπολυσακχαρίτες ISR Leeman et al., 1995 Σιδηροφόροι και σιδηροεξαρτώμενοι παράγοντες Leeman et al., 1995 Pseudomonas Γαρίφαλλο Λιποπολυσακχαρίτες ISR Van Peer and 24

25 fluorescens WCS417 Ραπανάκι Λιποπολυσακχαρίτες σιδηροεξαρτώμενοι παράγοντες ISR Schipper, 1992 Leeman et al., 1995 Arabidopsis Λιποπολυσακχαρίτες ISR Van Wees et al., 1997 Τομάτα Λιποπολυσακχαρίτες ISR Duijff et al., 1997 Pseudomonas putida WCS358 Pseudomonas putida BTP1 Serratia marcescens Arabidopsis Λιποπολυσακχαρίτες ISR Meziane et al., 2005 Φασολιά Ζ,3 hexenal ISR Ongena et al., 2004 Αγγουριά Σιδηροφόροι ISR Press et al., 2001 Εκεί παρατηρήθηκε μείωση της δράσης των δύο φυτοπαθογόνων μυκήτων κατά 45% και 40% αντίστοιχα. Αυτό αποδεικνύει την ικανότητα του βακτηρίου αυτού, να δρα ως βιοπαράγοντας ακόμη και σε πιο ρεαλιστικές συνθήκες από αυτές του εργαστηρίου. Η δράση του ριζοβακτηρίου αυτού βασίζεται στην ικανότητά του να παράγει το ένζυμο χιτινάση το οποίο αποδομεί τα κυταρικά τοιχώματα φυτοπαθογόνων μυκήτων (Ordentlich et al., 1988). Νεότερες δημοσιεύσεις αποδεικνύουν την ικανότητα του βακτηρίου αυτού να παράγει αντιβιοτικές ουσίες κόκκινου χρώματος με δράση κατά του ωομύκητα Phytophthora capsici σε φυτά Salvia splendens (Okamoto et al., 1998). Αυτές οι μελέτες μαρτυρούν πως οι τρόποι δράσης των βιοπαραγόντων μπορεί να είναι πολλοί και σίγουρα η έρευνα σε αυτό το αντικείμενο εξελίσσεται με γρήγορους ρυθμούς. Ένα άλλο βακτήριο το οποίο παράγει κόκκινου χρώματος ουσίες οι οποίες δεν έχουν συσχετιστεί με την παραγωγή αντιβιοτικών, είναι το Serratia rubidaea. Το βακτήριο αυτό έχει αναφερθεί να αναστέλλει την ανάπτυξη φυτοπαθογόνων μυκήτων in vitro (Kalbe et al., 1996), αλλά δεν έχει αναφερθεί ως βιοπαράγοντας σε πειράματα in planta. 25

26 Αξιοσημείωτο είναι το ότι τα είδη S. marcescens και S. rubidaea είναι περιστασιακά παθογόνα του ανθρώπου. Τα υγιή άτομα δεν κινδυνεύουν να προσβληθούν, καθώς η μόλυνση του αναπνευστικού συστήματος και οι λοιμώξεις εκδηλώνονται σε άτομα με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα. Το βακτήριο S. marcescens είναι το μόνο γνωστό νοσοκομειακό παθογόνο του γένους Serratia αλλά έχουν βρεθεί σε κλινικά δείγματα και τα S. liquefaciens και S. rubidaea (Kersters et al., 2006) Τα βακτήρια του γένους Bacillus ως βιολογικοί παράγοντες Στο γένος Bacillus ανήκουν Gram+ ραβδόμορφα βακτήρια, τα οποία είναι προαιρετικά ή υποχρεωτικά αερόβια. Σε συνθήκες καταπόνησης παράγουν ενδοσπόρια, με τα οποία επιβιώνουν για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Ως ενδοσπόρια ορίζονται οι ανθεκτικές και προσωρινά μη αναπαραγωγικές κατασκευές που παράγουν τα βακτήρια του φύλου Firmicute. Αν και χρησιμοποιείται ο όρος σπόριο, δεν πρόκειται για πραγματικό όργανο αναπαραγωγής αλλά για μια διαφοροποιημένη δομή του κυττάρου, που επιτρέπει στα βακτήρια να είναι σε λήθαργο, ώστε να ξεπεραστούν αντίξοες συνθήκες (Bergey s manual, 2005). Οι βιβλιογραφικές αναφορές για έρευνες, που σχετίζονται με τη δράση των βακτηρίων του γένους Bacillus είναι πολυάριθμες και με την πάροδο των ετών ολοένα και αυξάνονται. Ο καλύτερος βιολογικός παράγοντας του γένους, που αποτελεί και την πρώτη επιτυχημένη προσπάθεια σύνθεσης βιοεντομοκτόνου, είναι το βακτήριο B. thurigiensis (Bt). Αποτελεί την πρώτη ύλη για το 90% των εμπορεύσιμων βιοεντομοκτόνων και εκπροσωπεί μια αγορά της τάξης των 110 εκατομυρρίων ευρώ ετησίως (Powell & Jutsum, 1993). Εκτός από τον επιτυχημένο αυτό βιοπράγοντα, στο γένος Bacillus υπάρχουν και άλλα σημαντικά είδη, αναγνωρισμένα για τη δράση τους ως βιοπαραγόντων, όπως το B. subtilis και το B. cereus, το οποίο δρα εκκρίνοντας δύο αντιβιοτικά, τη σβιτερμυκίνη Α (zwittermycin A) και την κανοσαμίνη (kanosamine) (Milner et al., 1996). Επιπρόσθετα, το B. cereus έχει την ικανότητα να αλλάζει την ιονική σύσταση του μέσου στο οποίο αναπτύσσεται, να αυξάνει το ph, να διασπά το ασβέστιο και τέλος, να εκκρίνει αμμωνία (Emmert et al., 1999). Αυτός ο συνδυασμός αποδεικνύεται πολύ τοξικός στα 26

27 ζωοσπόρια των ωομυκήτων και συγκεκριμένα προκαλείται λύση των μεμβρανών τους (Gilbert et al., 1990). Η πρώτη επιτυχημένη εφαρμογή και εμπορική παραγωγή PGPR ήταν ένα στέλεχος του B. subtilis, το Α13, λόγω της αναστολής της ανάπτυξης 9 παθογόνων που προκαλούσε και της θετικής του επίδρασης στην ανάπτυξη των φυτών (Kim et al., 1997). Απομονώθηκε 25 χρόνια πριν στην Αυστραλία. Από το 1990, πολλά βακτήρια του γένους Bacillus χρησιμοποιήθηκαν ευρέως ως βιοπαράγοντες. Στελέχη των B. megaterium, B. cereus και B. subtilis χρησιμοποιήθηκαν αποτελεσματικά για αυτούς τους σκοπούς (Idris et al., 2008; Kildea et al., 2008) με τα εμπορικά ονόματα Serenade, EcoGuard, Kodiak, Yield Shield και BioYield (Quan et al., 2010). Γενικά τα είδη του γένους αυτού παράγουν πολλά αντιβιοτικά καθώς και ένζυμα, που λύουν τα κυτταρικά τοιχώματα όπως χιτινάσες, κυτταρινάσες, αμυλάσες, γλουκανάσες, κ.α.. Τα αντιβιοτικά που παράγουν τα μέλη του γένους Bacillus είναι πολυπεπτίδια, τα οποία είναι γνωστά για τη σταθερή δομή τους και τη δράση τους εναντίον Gram+ και Gram- βακτηρίων αλλά και μυκηλιακών μυκήτων. Τα πεπτίδια αυτά χωρίζονται σε τρεις ομάδες, τα κυκλικά λιποπεπτίδια (cyclic lipopeptides, CLP), τα φωσφο ολιγοπεπτίδια (phospho oligopeptides) και τα διπεπτίδια (dipeptides) (Ongena & Jacques, 2007). Κυκλικά λιποπεπτίδια είναι και οι ιτουρίνες (iturins) και φενγκισίνες (fengicines), οι οποίες παρουσιάζουν ισχυρή αντιμυκητιακή δράση και αναστέλλουν πολλά παθογόνα (Hsieh et al., 2008) Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas ως βιολογικοί παράγοντες Το γένος Pseudomonas περιέχει 191 αναγνωρισμένα είδη. Είναι ραβδόμορφα, υποχρεωτικά αερόβια, Gram- βακτήρια, με ένα ή περισσότερα μαστίγια, τα οποία τους προσδίδουν ικανότητα κίνησης. Δεν παράγουν σπόρια και ανήκουν στο φύλο των Πρωτεοβακτηρίων και στην οικογένεια Pseudomonadaceae (Bergey, 2005). Από τα μέσα της δεκαετίας του 1980, κάποια μέλη του γένους Pseudomonas εφαρμόστηκαν σε καλλιέργειες ως βιοπαράγοντες με πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Δεν είναι ξεκάθαρος ο τρόπος με τον οποίο αυτά τα βακτήρια προστατεύουν το φυτό και προάγουν την ανάπτυξή του. Ωστόσο υπάρχουν αρκετές μελέτες, που εξηγούν τη δράση τους, ως επαγωγή της ISR, ή ανταγωνισμό και 27

28 αποκλεισμό άλλων παθογόνων, ή συνδυασμό των παραπάνω. Οι τρόποι με τους οποίους συντελείται ο ανταγωνισμός, είναι η έκκριση σιδηροφόρων, που παρέχει ένα πλεονέκτημα λόγω της δέσμευσης του υπάρχοντος σιδήρου, η έκκριση ενώσεων που καταστέλλουν την ανάπτυξη άλλων οργανισμών, όπως είναι οι φεναζίνες και άλλα αντιβιοτικά, ή άλλες ουσίες όπως το υδροκυάνιο (Haas & Defago, 2005). Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas είναι τα πιο γνωστά PGPR και κάποια είδη έχουν χρησιμοποιηθεί στην πράξη ως βιοπαράγοντες κατά των παθογόνων Gaeumannomyces graminis var. tritici, Rhizoctonia solani, Erwinia carotovora var. carotovora, Pythium ultimum και Fusarium oxysporum (Quan et al., 2010). Σε αυτές τις μελέτες οι μηχανισμοί που προτάθηκαν για τη δράση των ψευδομονάδων ως βιοπαραγόντων, συνάδουν με τους προαναφερθέντες, με επιπλέον τη διαπίστωση παραγωγής βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών και υδρολυτικών ενζύμων, αλλά και τη δράση των ψευδομονάδων ως βακτηρίων που βοηθούν στο σχηματισμό μυκόρριζας (Mycorrhization Helper Bacteria, MHB ) (Quan et al., 2010) Εκτός από το ευρέως διαδεδομένο είδος P. fluorescens, άλλα γνωστά είδη που δρουν ως βιοπαράγοντες είναι τα P. chlororaphis και P. aurantiaca. Το P. chlororaphis παράγει το αντιβιοτικό φεναζίνη 1 καρβοξυαμίδη (PCN) (Chin A Woeng et al., 2000) και το συγγενικό του είδος P. aurantiaca παράγει δι - 2,4 - δι - ακέτυλο - φθοριογλουκολομεθάνιο, μια ένωση που δρα ως αντιβιοτικό κατά των Gram- βακτηρίων (Esipov et al., 1975). Ένας ακόμη πολύ γνωστός βιοπαράγοντας είναι το βακτήριο P. putida, το οποίο εδώ και αρκετά χρόνια έχει αποδειχτεί ότι μειώνει την ένταση εδαφογενών ασθενειών, όπως είναι και η σήψη που οφείλεται σε μύκητες του γένους Fusarium sp. (Scher & Baker, 1982). Έχει επίσης από πολύ νωρίς δοκιμαστεί σε συνδυασμό με άλλους βιοπαράγοντες, όπως για παράδειγμα με κάποια μη παθογόνα στελέχη Fusarium oxysporum σε αγγουριά. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ύπαρξη συνεργιστικής δράσης και επιπλέον φάνηκε, πως ο κάθε βιοπαράγοντας δε δρα απουσία του άλλου (Park et al., 1987). Οι πιο πρόσφατες μελέτες αφορούν στο να προσδιοριστεί ο τρόπος δράσης αυτού του ριζοβακτηρίου και αρκετές έρευνες έχουν διεξαχθεί με το στέλεχος P. putida WCS358 και το σιδηροφόρο που αυτό παράγει, την ψευδοβακτίνη 358 (pseudobactin 358) (Neilands, 1981; Crosa, 1989; Venturi et al., 1993). 28

29 Ένα άλλο σύνηθες φαινόμενο είναι η τάση αυτών των βακτηρίων να δρουν συνεργιστικά, τόσο με άλλα ριζοβακτήρια, όσο και με βακτήρια του ίδιου γένους. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η συνεργιστική δράση του στελέχους P. fluorescens WCS365 με το P. chlororaphis PCL1391, κατά την αναστολή της σήψης από Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε φυτά τομάτας (Dekkers et al., 2000), του Colletotrichum lindemuthianum (Bardas et al., 2009) σε φασολιά και του Fusarium oxysporum f. sp. niveum σε καρπουζιά (Tziros et al., 2007). 2. Στρατηγικές επιλογής βιοπαραγόντων Πολύ σημαντικό βήμα στη διαδικασία της επιλογής των βιοπαραγόντων είναι αυτό της επιλογής της κατάλληλης μεθόδου ελέγχου (screening method) της μικροβιακής κοινότητας, ώστε να ξεχωρίσουν τα αποτελεσματικότερα ριζοβακτήρια. Είναι σύνηθες φαινόμενο, στις μελέτες που αφορούν στην εύρεση βιοπαραγόντων, να προκύπτουν αποτελέσματα, τα οποία εμφανίζουν ανομοιογένεια. Αυτό συμβαίνει συχνά, γιατί τα αρχικά πειράματα ελέγχου γίνονται σε πλήρως ελεγχόμενες συνθήκες, εντός του εργαστηρίου και πρόκειται συνήθως για in vitro δοκιμές. Αυτό κατ επέκταση ίσως αποδώσει εσφαλμένα θετικά αποτελέσματα, τα οποία σε κάποιο πείραμα αγρού, που θα διεξαχθεί σε φυσικές συνθήκες, να είναι τελείως διαφορετικά. (Knudsen et al., 1997). Οι δοκιμές in vitro είναι σίγουρα ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο στη διαδικασία της επιλογής των ριζοβακτηρίων, αλλά θα πρέπει να συνδυάζονται και με πειράματα in planta. Όπως προαναφέρθηκε, η ριζόσφαιρα και οι συνθήκες που επικρατούν σε αυτήν, επηρεάζουν τα είδη των βακτηρίων που θα την αποικίσουν, αλλά και τον τρόπο με τον οποίο θα γίνει ο αποικισμός. Στη βιβλιογραφία, τα πειράματα γίνονται κατά κανόνα σε εργαστηριακές συνθήκες, με αποτέλεσμα το στάδιο του αγρού να παραλείπεται και να ολοκληρώνεται το εκάστοτε πείραμα από την εταιρία, που ίσως αγοράσει τον αποτελεσματικό βιοπαράγοντα (Pliego et al., 2011). 29

30 Σημαντικό είναι το να τονιστεί, πως συνήθως, στόχος αυτών των πειραμάτων είναι η αναγωγή στην πρακτική εφαρμογή και αυτό σίγουρα προϋποθέτει τη διεξαγωγή πειραμάτων σε όσο πιο φυσικές συνθήκες γίνεται, και σε ποικίλα περιβάλλοντα. Επίσης, για να εκπονηθεί μια ολοκληρωμένη μελέτη, θα πρέπει οι βιοπαράγοντες να συνδυάζονται και να δοκιμάζονται, τόσο για τη δράση τους απέναντι σε ποικίλα παθογόνα, όσο και πάνω σε διάφορους ξενιστές. Αυτή η προσέγγιση πιθανώς να δίνει λιγότερο εντυπωσιακά ή ξεκάθαρα αποτελέσματα, αλλά προσφέρει μια πιο πραγματική μελέτη, καθώς το σύστημα που μελετάται πλησιάζει περισσότερο τις πραγματικές συνθήκες (Knudsen et al., 1997). 3. Βιολογία του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl ) (Jarvis & Shoemaker, 1978) είναι αυτός που προκαλεί τη σήψη του λαιμού και της ρίζας της τομάτας (Lycopersicon esculentum) και η πρώτη αναφορά της ασθένειας έγινε στην Ιαπωνία το 1969 από τους Sato και Araki (Menzies & Jarvis, 1994). Η γεωγραφική εξάπλωση του παθογόνου έκτοτε είναι τεράστια σε Ευρώπη, Ασία και Αμερική (Koike et al., 2007, Βακαλουνάκης και Φραγκιαδάκης, 2003). Η πρώτη δημοσίευση της ασθένειας και κατάθεση του μύκητα σε διεθνείς συλλογές έγινε το 1978 από τους Jarvis και Shoemaker και το παθογόνο απομονώθηκε από καλλιέργεια θερμοκηπιακής τομάτας στο Οντάριο του Καναδά (Jarvis et al., 1975). Ορίστηκε ως μια νέα ειδική μορφή (forma specialis) του Fusarium oxysporum, το οποίο είχε οριστεί το 1940 από τους Snyder και Hansen. Ο λόγος της διαφοροποίησής του από το Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici είναι ότι δεν πρόκειται για μια τυπική αδροφουζαρίωση, καθώς τα αγγεία της τομάτας, όπως γίνεται λόγος παρακάτω, δεν αποικίζονται διασυστηματικά. Στην Ελλάδα η πρώτη αναφορά έγινε το 1985 στην Κρήτη από τον Malathrakis (1985). Ο μύκητας συναντάται στο έδαφος και μολύνει τις ρίζες μέσω της διάτρησης της επιδερμίδας ή μέσω πληγών, που δημιουργούνται κατά την έκπτυξη των 30

31 δευτερευουσών ριζών (Lagopodi et al., 2002). Αποικίζει τον ιστό του φλοιού και δημιουργεί καστανούς μεταχρωματισμούς, οι οποίοι εξαπλώνονται στο αγωγό σύστημα και διασπείρονται ανοδικά στο στέλεχος του φυτού, για 5 έως 10 εκατοστά και όχι παραπάνω από 25 εκατοστά (Brayford, 1996). Ο Forl εντοπίζεται και απομονώνεται μόνο τοπικά γύρω από την περιοχή του αποχρωματισμού (1 2 εκατοστά) και δε διασπείρεται διασυστηματικά σε όλο το φυτό, γεγονός που τον διαφοροποιεί από τον Fol όπως προαναφέρθηκε (Jarvis & Shoemaker, 1978). Οι διαφορές τους εντοπίζονται τόσο στην επιδημιολογία και τη συμπτωματολογία, όσο και στο εύρος ξενιστών (Attitalla et al., 2004). Η διασπορά σε απομακρυσμένες μεταξύ τους περιοχές γίνεται μέσω μολυσμένων μοσχευμάτων, μολυσμένου εδάφους και μέσω των καλλιεργητικών εργασιών (υποδήματα, μηχανήματα, εργαλεία). Γενικά ο μύκητας επιβιώνει για μεγάλα χρονικά διαστήματα στο έδαφος και η ασθένεια ευνοείται από χαμηλές θερμοκρασίες (20 o C 24 o C), χαμηλό εδαφικό ph, συνεκτικά εδάφη και από την παρουσία αμμωνιακού αζώτου. Η διασπορά εντός του αγρού ή εντός του θερμοκηπίου γίνεται με τα κονίδια του μύκητα, μέσω του νερού άρδευσης και των υδροπονικών συστημάτων. Επίσης γίνεται διασπορά μικροκονιδίων, που προέρχονται από σποροποίηση σε υπολείμματα και τινάγματα αυτών, εντός του θερμοκηπίου (Rowe et al., 1977). Τέλος έχει αναφερθεί και διασπορά του παθογόνου μηχανικά μέσω της δραστηριότητας εντόμων (Jarvis & Shoemaker, 1978). Τα συμπτώματα της ασθένειας στην τομάτα εμφανίζονται στο στάδιο της ωριμότητας των καρπών, ως περιθωριακό κιτρίνισμα των παλαιότερων φύλλων και προοδευτική νέκρωσή τους. Επίσης χαρακτηριστική είναι και η εμφάνιση φυτών με νανισμό. Κατά τις θερμές ώρες της ημέρας, τα φυτά εμφανίζουν μαρασμό (μεσημέριασμα) με ανάκαμψη της εικόνας τις βραδινές ώρες (Εικ. 1). Προοδευτικά τα φυτά μαραίνονται και νεκρώνονται ή, σε ελάχιστες περιπτώσεις, διατηρούνται στον αγρό σε μια αποδυναμωμένη κατάσταση και δεν είναι παραγωγικά (Koike et al., 2007, Βακαλουνάκης και Φραγκιαδάκης, 2003). Ένα άλλο χαρακτηριστικό σύμπτωμα που συμπληρώνει την εικόνα στον αγρό, είναι η παρουσία μεγάλου αριθμού δευτερευουσών και πλάγιων ριζών, τόσο πλευρικά της κεντρικής, όσο και στην περιοχή άνω του σημείου μόλυνσης, όπωςφαίνεται στην εικόνα 2. Επίσης το ριζικό σύστημα και ο λαιμός όταν κοπούν εγκάρσια, εμφανίζουν 31

32 το μεταχρωματισμό και στο εσωτερικό τους. Συχνά παρατηρούνται έλκη στην περιοχή του λαιμού, τα οποία μπορεί να καλύπτονται από το μυκήλιο του μύκητα, χρώματος κίτρινου, ερυθρωπού ή πορτοκαλιού, ανάλογα με την υγρασία που επικρατεί στον εκάστοτε αγρό (Brayford, 1996). Ο μύκητας κατά τη διάρκεια του βιολογικού του κύκλου παράγει τρία είδη σπορίων, τα μικροκονίδια, μακροκονίδια και χλαμυδοσπόρια. Τα μακροκονίδια αποτελούνται από τρία έως πέντε κύτταρα, και έχουν καμπυλωτές άκρες. Αυτά τα σπόρια εντοπίζονται στην επιφάνεια των ξενιστών που έχουν νεκρωθεί. Τα μικροκονίδια αποτελούνται από 1 3 κύτταρα, είναι ο τύπος ο πιο συχνά παραγόμενος από το παθογόνο και εντοπίζονται στο σημείο της μόλυνσης και στον αέρα του θερμοκηπίου. Τα χλαμυδοσπόρια είναι στρογγυλά και πολυκύτταρα και έχουν παχιά τοιχώματα. Αποτελούν την πηγή μολύσματος και το μέσο διατήρησης στο έδαφος (Groenewald, 2005). Για την καταπολέμηση του μύκητα προτείνονται καλλιεργητικά μέτρα αλλά και η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών, καθώς η απαγόρευση της χρήσης καπνιστικών μυκητοκτόνων καθιστά αδύνατη τη χημική καταπολέμηση (Koike et al., 2007, Βακαλουνάκης και Φραγκιαδάκης, 2003). Στα καλλιεργητικά μέτρα ανήκουν τόσο η διατήρηση του ph σε τιμές μεγαλύτερες του 6, όσο και η αποφυγή χρήσης μολυσμένου εδάφους ή εργαλείων, η απολύμανση των μηχανημάτων και εργαλείων και η εναλλαγή καλλιέργειας με ένα ανθεκτικό φυτό (Roberts et al., 1992). 32

33 Εικ. 1. Φυτά τομάτας προσβεβλημένα από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici στα οποία φαίνεται το σύμπτωμα του μαρασμού (Pamela Roberts, University of Florida, IFAS extension) Εικ. 2. Φυτό τομάτας προσβεβλημένο από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici όπου φαίνεται η ανάπτυξη δευτερευουσών πλάγιων ριζών (Pamela Roberts, University of Florida, IFAS extension) 33

34 Τελευταία χρησιμοποιείται και η μέθοδος του εμβολιασμού σε ανθεκτικά υποκείμενα (Μπλέτσος, 2009). Λόγω της βιολογίας αυτού του μύκητα, της εντοπισμένης δράσης του, αλλά και της αδυναμίας αντιμετώπισής του με χημικά και συμβατικά μέσα, εύκολα συμπεραίνει κανείς, πως αποτελεί ένα παθογόνο, που μπορεί και πρέπει να αντιμετωπιστεί με τη βοήθεια βιοπαραγόντων. Αποτελεί μεγάλο πρόβλημα για τη θερμοκηπιακή και υπαίθρια καλλιέργεια της τομάτας παγκοσμίως και η ανάγκη εύρεσης του κατάλληλου βιοπαράγοντα ή του κατάλληλου συνδυασμού βιοπαραγόντων είναι επιτακτική Η βιολογική καταπολέμηση του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Όπως προαναφέρθηκε ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici καταπολεμάται δύσκολα με τη χρήση αγροχημικών, κυρίως μετά την απαγόρευση χρήσης του βρωμιούχου μεθυλίου. Ο αριθμός των ανθεκτικών ποικιλιών που παρουσιάζουν ικανοποιητική ανθεκτικότητα είναι μικρός και η χρήση μεθόδων όπως η ηλιοαπολύμανση, ή η απολύμανση με ατμό έχουν υψηλό κόστος. Επομένως, η σήψη του λαιμού και της ρίζας της τομάτας είναι μια ασθένεια, για την οποία η χρήση βιοπαραγόντων φαίνεται ελκυστική. Δημοσιευμένοι και αποτελεσματικοί βιοπαράγοντες, ως προς την επαρκή αναστολή της ανάπτυξης του παθογόνου είναι τα βακτήρια Pseudomonas fluorescens WCS365 (Dekkers et al., 2000), P. chlororaphis PCL1391 (Chin A Woeng et al., 1998) και P. chlororaphis PCL1751 (Kamilova et al., 2005), αλλά και οι μύκητες Fusarium oxysporum Fo47 (Alabouvette & Couteaudier, 1992; Bolwerk et al., 2005), Trichoderma harzianum (Sivan, 1987; Bolwerk, 2005), Penicillium funiculosum και Aspergillus ochraceus (Marrois et al., 1981) και Clonostachys rosea ΙΚ721 (Tzelepis & Lagopodi, 2011). Ενθαρρυντικά αποτελέσματα, αλλά όχι επιβεβαιωμένη δράση, έδωσαν και τρία στελέχη του βακτηρίου Pseudomonas putida, καθώς και ένα στέλεχος κάθε φορά από τα Deftia tsuruhatensis, Pseudomonas rhodesiae και Paenibacillus amylolyticus (Validov et al., 2006). Οι μηχανισμοί δράσης των παραπάνω βακτηρίων γενικότερα πάνω στους φυτοπαθογόνους μύκητες, σχετίζονται κυρίως με την παραγωγή αντιβιοτικών (Chin A Woeng et al., 2003; Kamilova et al., 2005), τον ανταγωνισμό (Thomashow & 34

35 Weller, 1995; Bolwerk et al., 2003; Chin A Woeng et al., 2003) και την επαγωγή ISR (Pieterse et al., 1996; van Loon et al., 1998, Hartmann et al., 2004). Οι μύκητες ως βιοπαράγοντες δρουν μέσω της επαγωγής ISR (Duijff et al., 1998), του υπερπαρασιτισμού και της αρπακτικότητας (Bolwerk et al., 2005) και μέσω του ανταγωνισμού για οικοφωλιές και θρεπτικά στοιχεία (Lemanceau & Alabouvette, 1990; Bolwerk et al., 2005). 35

36 Σκοπός της εργασίας Η εργασία που παρουσιάζεται στη συνέχεια είχε τους παρακάτω στόχους: 1. να εντοπιστούν σε ελληνικά αγροσυστήματα πιθανές θέσεις ύπαρξης βιοπαραγόντων και να απομονωθούν ωφέλιμα ριζοβακτήρια 2. να επιλεγούν τα πιο αποτελεσματικά ριζοβακτήρια και να ελεγχθούν σε δοκιμές in vitro και in planta για τη δράση τους εναντίον τον μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici, όπως και για την επίδρασή τους στην ανάπτυξη της τομάτας 3. να ταυτοποιηθούν οι πιο αποτελεσματικοί βιοπαράγοντες και 4. να διερευνηθεί η παραγωγή ανασταλτικών ουσιών για την ανάπτυξη του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici από τους βιοπαράγοντες. 36

37 Πειραματικό μέρος 37

38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Απομόνωση ριζοβακτηρίων και επιλογή των πιο αποτελεσματικών έναντι του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicislycopersici σε in vitro δοκιμές Εισαγωγή Τα βακτήρια που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), καθώς και κάποια από τα υπόλοιπα βακτήρια της ριζόσφαιρας, που ζουν εκτός της ρίζας, καλούνται ελεύθερα ζώντα βακτήρια και έχουν θετική επίδραση στα φυτά. Οι τρόποι ενίσχυσης της ανάπτυξης των φυτών είναι η επαγωγή των αμυντικών αποκρίσεων και ο αποικισμός της ρίζας με την παράλληλη παροχή θρεπτικών στοιχείων στο φυτό. Βακτήρια εντοπίζονται επίσης πάνω στην επιφάνεια της ρίζας (rhizoplane), αλλά και στο εσωτερικό της ρίζας. Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται εντός της ριζόσφαιρας, είναι ιδανικοί για χρήση ως βιολογικά εμβόλια (bioinoculants), καθώς η ριζόσφαιρα αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας των ριζών κατά των εδαφογενών παθογόνων (Nautiyal & Das Gupta, 2007). Για τον έλεγχο και εντοπισμό των κατάλληλων ριζοβακτηρίων, έχουν προταθεί πολλές μέθοδοι. Η πιο ευρέος φάσματος μέθοδος θεωρείται αυτή της πλύσης των ριζών (root washing technique) και στη συνέχεια η συλλογή των μικροοργανισμών σε εκλεκτικά ή μη θρεπτικά υποστρώματα (Campbell et al., 1986). Το πιο σημαντικό λοιπόν σε αυτήν τη διαδικασία απομόνωσης είναι το να πετυχαίνει ο ερευνητής τη συλλογή του μεγαλύτερου δυνατού αριθμού αποικιών. Στην παρούσα εργασία δεδομένου ότι επρόκειτο για απομόνωση και καταγραφή άγνωστων βακτηρίων χρησιμοποιήθηκε η κλασσική μέθοδος επιλογής, που ονομάζεται «άμεση επιλογή από τη ριζόσφαιρα» (Direct screening from the rhizosphere) (Nautiyal & Das Gupta, 2007). Για τη διερεύνηση της ανταγωνιστικής ικανότητας των ριζοβακτηρίων και της πιθανής επωφελούς επίδρασής τους σε φυτά, η στρατηγική είναι, να επιλέγεται ένα φυτοπαθογόνο στόχος για δοκιμές in vitro. Στην εργασία αυτή επιλέχτηκε ως 38

39 μικροοργανισμός στόχος ο μύκητας Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl), που προκαλεί σήψη λαιμού και ριζών στην τομάτα, μία ασθένεια σημαντική σε παγκόσμιο επίπεδο, της οποίας η αντιμετώπιση παρουσιάζει δυσκολίες και περιορισμούς, σύμφωνα με όσα αναφέρθηκαν στην εισαγωγή της διατριβής. Σημαντικό ωστόσο είναι, να τονιστεί το ότι τα πειράματα in vitro αδυνατούν να αναδείξουν το σύνολο των ωφέλιμων μικροοργανισμών της ριζόσφαιρας, καθώς όλα τα θρεπτικά μέσα είναι κατά βάση εκλεκτικά. Επίσης σε αυτές τις δοκιμές μπορούν να μελετηθούν μόνο βιοπαράγοντες με αντιβιοτική ή παρασιτική δράση και όχι εν δυνάμει βιοπαράγοντες που ανταγωνίζονται για θρεπτικά στοιχεία ή οικοφωλιές ή προκαλούν ISR (Knudsen et al., 1997). Επίσης οι δοκιμές in vitro δεν εξασφαλίζουν επιτυχημένη δράση σε φυσικές συνθήκες. Επομένως οι δοκιμές αυτές πρέπει να συνοδεύονται απαραίτητα από δοκιμές in planta ύστερα από επιλογή και του κατάλληλου ξενιστή Υλικά και μέθοδοι Απομόνωση ριζοβακτηρίων, λήψη και επιλογή μεμονωμένων αποικιών Τα βακτήρια απομονώθηκαν από ρίζες μπάμιας, πιπεριάς, τομάτας, πεπονιού και σιταριού, από φυτά που συλλέχθηκαν από περιοχές των νομών Θεσσαλονίκης, Χαλκιδικής, Σερρών και Ζακύνθου. Σε κάθε περίπτωση, η συλλογή γινόταν είτε από αγρούς χωρίς ιστορικό εδαφογενών ασθενειών, είτε από αγρούς στους οποίους εντοπίστηκαν αδρομυκώσεις ή σήψεις λαιμού, αλλά είχαν υγιή φυτά σε κάποια σημεία του αγρού από τα οποία έγινε η δειγματοληψία. Σε όλες τις περιπτώσεις συλλέχθηκαν φαινομενικά υγιή φυτά με ολόκληρο το ριζικό σύστημα. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: Αφού το φυτό ξεριζωνόταν, μεταφερόταν εντός 12 ωρών στο εργαστήριο, όπου και κοβόταν η ρίζα σε τεμάχια. Η ρίζα έπειτα τιναζόταν απαλά, ώστε να απομακρυνθεί το πλεονάζον έδαφος. Στη συνέχεια, 25 gr ριζικού συστήματος από το κάθε φυτό, τοποθετούνταν σε κωνική 39

40 φιάλη, που περιείχε 200ml απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό και ανακινούνταν για μια ώρα στις 125 στροφές/λεπτό, πάνω σε αναδευόμενο επωαστήρα. Από κάθε κωνική φιάλη λαμβάνονταν 4 φορές, 100μl διαλύματος και τοποθετούνταν αντίστοιχα σε 4 τρυβλία Petri, που περιείχαν Tryptone Glucose Yeast Agar (TGY, Pit & Hocking, 1997). Το θρεπτικό υπόστρωμα TGY περιέχει ανά λίτρο απεσταγμένου νερού τα εξής: Tryptone Yeast extract Glucose K 2 HPO 4 Agar Το ph ρυθμίζεται στην τιμή 7 5gr 5gr 1gr 1gr 20gr Από τη διαδικασία αυτή προέκυπταν τρυβλία, τα οποία αποτελούσαν τα αρχικά τρυβλία επώασης, καθώς περιείχαν μια αδιαφοροποίητη μάζα βακτηρίων και σε αυτό το στάδιο δε μπορούσαν να απομονωθούν μεμονωμένες αποικίες. Ακολουθούσε επομένως η αραίωση των αρχικών αποικιών, ώστε να ληφθούν μεμονωμένες αποικίες, είτε με τη βοήθεια της μεθόδου της επίστρωσης (streaking), είτε μέσω της διαδικασίας των διαδοχικών αραιώσεων. Πιο αναλυτικά, ο πρώτος τρόπος περιλαμβάνει τη χρήση βακτηριακής βελόνας (μεταλλική θηλιά σύρματος νικελίου μικροβιολογικός κρίκος), η οποία «σαρώνει» το αρχικό τρυβλίο τυχαία και στη συνέχεια, απλώνει τα βακτηριακά κύτταρα με τον τρόπο που φαίνεται στην εικόνα 3. Η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων περιελάμβανε την εξής διαδικασία: Αποστειρώνονταν 100ml απεσταγμένου νερού καθώς και 6 σωλήνες eppendorf. Σε κάθε σωλήνα μεταφερόταν υπό ασηπτικές συνθήκες, 1ml από το νερό που αποστειρώθηκε. Στη συνέχεια, με τον μικροβιολογικό κρίκο μεταφερόταν τυχαία, από τα αρχικά τρυβλία επώασης, ποσότητα βακτηριακών κυττάρων στον πρώτο σωλήνα και από εκεί αφού γινόταν ανάδευση, μεταφέρονταν 100μl στον επόμενο σωλήνα και η διαδικασία επαναλαμβανόταν μέχρι τον τελευταίο σωλήνα. Έτσι επερχόταν αραίωση του αρχικού πληθυσμού βακτηρίων. Από τους δύο τελευταίους σωλήνες λαμβάνονταν 100μl και επιστρώνονταν σε τρυβλίο όπως φαίνεται στην εικόνα 4. 40

41 Εικ. 3. Απεικόνιση της διαδικασίας σάρωσης του τρυβλίου ώστε να ληφθούν μεμονωμένες αποικίες βακτηρίων (Τάσος Οικονόμου, τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, 2007) Εικ. 4. Απεικόνιση επίστρωσης του τρυβλίου με βακτηριακό εναιώρημα (Τάσος Οικονόμου, τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, 2007) Από την παραπάνω διαδικασία προέκυψαν τρυβλία με πολλές μονές αποικίες που διέφεραν ως προς την εμφάνιση, το σχήμα, το χρώμα αλλά και το φθορισμό τους. Επόμενο βήμα ήταν η μεταφορά μονών αποικιών σε ένα νέο τρυβλίο ώστε να διατηρηθούν, μέχρι να δοκιμαστούν ως προς τη δράση τους κατά του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl. 41

42 Εικ. 5. Διατήρηση βακτηρίων με τη μορφή μονών αποικιών που προήλθαν από τη διαδικασία των διαδοχικών αραιώσεων Για να επιτευχθεί αυτό χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένες μύκητα Forl. Για να επιτευχθεί αυτό χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένες οδοντογλυφίδες, με την άκρη των οποίων συλλέγονταν οι μονές αποικίες, με προσοχή και μεταφέρονταν στο τελικό τρυβλίο όπου συγκεντρώνονταν ανά (Εικ. 5). Στο στάδιο αυτό οι μονές αποικίες θεωρήθηκαν διαφορετικά στελέχη και το καθένα ονομάστηκε με το αρχικό του ονόματος του ξενιστή μόνο, ή σε συνδυασμό με το αρχικό του τόπου προέλευσης και έναν αριθμό, ανάλογα με τη σειρά λήψης της αποικίας. Για να διατηρηθούν αυτές οι μονές αποικίες για μικρό χρονικό διάστημα, χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο τόσο το TGY - agar όσο και το LC - agar σε τρυβλία Petri. Η σύσταση του LC- agar (Pledger & Polatnick, 1961, Smit et al., 1987), ανά λίτρο απεσταγμένου νερού, είναι η ακόλουθη: Tryptone Yeast extract NaCl MgSO 4 7 H 2 O Tris - HCl Agar 10gr 5gr 8gr 12.5gr 5ml 20gr 42

43 Στο στάδιο αυτό, μία δεύτερη εκτίμηση των διαφορών των μεμονωμένων αποικιών που επιλέχτηκαν, έγινε με βάση τη γενική κλείδα οπτικής αναγνώρισης των βακτηριακών αποικιών η οποία φαίνεται στην εικόνα 6. Αυτή περιγράφει την τελική μορφή που λαμβάνει μια βακτηριακή αποικία, η οποία ξεκινά από ένα μόνο βακτήριο στο τρυβλίο και στην οποία γίνονται διαδοχικές, απλές διχοτομήσεις για περίπου 24 ώρες. Οι αποικίες χαρακτηρίστηκαν από τη μορφολογία και το σχήμα τους, όπως αυτό φαίνεται από όλες τις οπτικές γωνίες. Σημαντικά στοιχεία ήταν επίσης το χρώμα και η όψη τους (ξηρή ή ενυδατωμένη). Κατατάχθηκαν λοιπόν σε κατηγορίες και διαφοροποιήθηκαν με βάση τα παραπάνω στοιχεία. Εικ. 6. Απεικόνιση κλείδας οπτικής διαφοροποίησης βακτηριακών αποικιών Ανανέωση των καλλιεργειών στα τρυβλία γινόταν κάθε δέκα μέρες περίπου και για τη διατήρηση των ριζοβακτηρίων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (μέχρι και ένα χρόνο), χρησιμοποιήθηκε κατάψυξη των -80 ο C. Πιο αναλυτικά, τα ριζοβακτήρια τοποθετήθηκαν σε σωληνάρια eppendorf, σε διάλυμα πεπτόνης γλυκερόλης (15% v:v γλυκερόλη και 0,5% w:v πρωτεόζη πεπτόνη) και τοποθετήθηκαν απευθείας στον καταψύκτη. 43

44 Έλεγχος αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici από νεοαπομονωμένα βακτηριακά στελέχη της ριζόσφαιρας σε πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες σε τρυβλίο Η διαδικασία που ακολουθήθηκε, για να διαπιστωθεί αν τα βακτήρια που απομονώθηκαν είναι πιθανοί βιοπαράγοντες, ήταν αρχικά αυτή των πολλαπλών καλλιεργειών και στη συνέχεια αυτή των διπλών καλλιεργειών. Οι διπλές καλλιέργειες ήρθαν σε μία δεύτερη φάση, ώστε να έχει προηγηθεί μία αρχική διάκριση μεταξύ του μεγάλου αριθμού των απομονώσεων. Αναλυτικότερα, στις πολλαπλές καλλιέργειες τα βακτήρια που απομονώθηκαν και επιλέχτηκαν από την προηγούμενη διαδικασία, δοκιμάστηκαν ανά εξάδες, εναντίον του μύκητα Forl, ώστε να μελετηθεί η πιθανή αναστολή στην ανάπτυξή του υπό την παρουσία τους. Ανάλογα με το αν δεν υπήρχε αλληλεπίδραση, ή σχηματιζόταν κάποια ζώνη αναστολής, ή κάποια κατασταλτική δράση στη ζώνη συνάντησης, ή υπήρχε η υποψία δράσης πτητικών ουσιών, το βακτήριο κατατασσόταν σε δραστικό ή μη. Στη συνέχεια, ακολουθούσαν πειράματα με διπλές καλλιέργειες, στο ίδιο τρυβλίο, για να επιβεβαιωθεί η ανασταλτική δράση, ή σε αντικριστά τρυβλία, για να διερευνηθεί η πιθανότητα δράσης πτητικών ουσιών των βακτηρίων. Προέλευση, καλλιέργεια και διατήρηση των μικροοργανισμών Ο φυτοπαθογόνος μύκητας Forl, παραχωρήθηκε από τον Prof. Ben Lugtenberg, Institute of Biology, Leiden University, Ολλανδία. Καλλιεργήθηκε σε υπόστρωμα Potato Dextrose Agar (PDA, LB Bury, Lancashire, United Kingdom), σε πλαστικά τρυβλία Petri, στους 25 ο C. Η διατήρησή του για μικρά χρονικά διαστήματα γινόταν στο ψυγείο, στα τρυβλία ανάπτυξής του και για μεγάλα χρονικά διαστήματα σε κατάψυξη στους -80 ο C. Αναλυτικότερα, για να διατηρηθεί για έναν χρόνο, χωρίς την ανάγκη ανανέωσης της καλλιέργειας, τοποθετήθηκε σε σωληνάρια eppendorf σε διάλυμα πεπτόνης γλυκερόλης (15% v:v γλυκερόλη και 0,5% w:v πρωτεόζη πεπτόνη). Η προέλευση και ο τρόπος διατήρησης των νέων ριζοβακτηρίων που δοκιμάστηκαν σε αυτό το στάδιο αναλύονται παραπάνω στην παράγραφο

45 Επιπλέον σε κάποιες δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες οι γνωστοί από τη βιβλιογραφία βιοπαράγοντες Pseudomonas fluorescens F113 και Pseudomonas chlororaphis PCL1391. Το στέλεχος P. chlororaphis PCL1391 παραχωρήθηκε από τον Prof. Ben Lugtenberg, ενώ το P. fluorescens F113 από τον Prof. Fergal O Gara, National University of Ireland, Ιρλανδία. Μεταχειρίσεις Πειραματικός σχεδιασμός Το γεγονός ότι οι πιθανοί βιοπαράγοντες ήταν σε αυτό το στάδιο άγνωστοι μικροοργανισμοί, οδήγησε στο να προτιμηθεί για τις πολλαπλές καλλιέργειες ένα θρεπτικό μέσο γενικής χρήσης όπως το TGY - agar αρχικά και στη συνέχεια και το LC - agar, αφού ελέγχθηκε η ικανότητα του μύκητα να αναπτύσσεται σε αυτά. Πολλαπλές καλλιέργειες Στο κέντρο κάθε τρυβλίου τοποθετήθηκε ένα εμβόλιο του Forl, το οποίο λήφθηκε από κάποιο περιφερειακό σημείο προηγούμενης νεαρής καλλιέργειας, καθώς εκεί εντοπίζεται ενεργά αναπτυσσόμενο μυκήλιο. Το εμβόλιο λαμβανόταν υπό άσηπτες συνθήκες, με μυκητολογικό κρίκο, ώστε να επιτυγχάνεται το ίδιο αρχικό μέγεθος εμβολίου για όλες τις καλλιέργειες (διαμέτρου περίπου 3mm). Ταυτόχρονα, γύρω από το εμβόλιο του μύκητα, στις νοητές γωνίες ενός εξαγώνου, και σε απόσταση 1 cm από την περιφέρεια του τρυβλίου, εμβολιάζονταν μέχρι 6 βακτηριακά στελέχη κάθε φορά, που προέρχονταν από μεμονωμένες καλλιέργειες σε TGY agar (Εικ. 7). Τα βακτήρια εμβολιάζονταν το καθένα επί νοητής γραμμής μήκους 0,5 cm. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε δύο φορές. Συνοπτικά υπήρχαν οι εξής μεταχειρίσεις: 1. Καλλιέργεια σε τρυβλίο με TGY - agar όπου αναπτύχθηκε μόνο ο Forl (μάρτυρας Forl) στο κέντρο του τρυβλίου 2. Πολλαπλές καλλιέργειες με τα βακτήρια σε νοητό εξάγωνο γύρω από το μύκητα Forl Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 25 o C. Μετά τον εμβολιασμό των τρυβλίων πραγματοποιούνταν καθημερινές μακροσκοπικές παρατηρήσεις, μέχρι και το πέρας δύο εβδομάδων, προκειμένου να διαπιστωθεί η ύπαρξη αναστολής ή 45

46 οποιασδήποτε μορφής αλλοίωση της ανάπτυξης του Forl, από την παρουσία των ριζοβακτηρίων. Εικ. 7. Πολλαπλή καλλιέργεια 3 πιθανών βιοπαραγόντων και του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε LC agar, όπου φαίνεται η αναστολή της ανάπτυξής του σε σύγκριση με το μάρτυρα Διπλές καλλιέργειες Αφού έγινε η παραπάνω αρχική διάκριση σε δραστικά βακτήρια και μη, με βάση τη δράση in vitro σε πολλαπλές καλλιέργειες, τα αποτελεσματικά στελέχη τοποθετήθηκαν σε διπλές καλλιέργειες, ενός βακτηρίου κάθε φορά με το φυτοπαθογόνο μύκητα, ώστε να γίνουν πιο ξεκάθαρες παρατηρήσεις και να επιβεβαιωθεί το προηγούμενο αποτέλεσμα. Αναλυτικότερα, στις διπλές καλλιέργειες εμβολιάστηκε απέναντι από το μύκητα το κάθε βακτηριακό στέλεχος, επί νοητής γραμμής μήκους περίπου 2 cm. Οι δύο οργανισμοί τοποθετήθηκαν σε απόσταση 6 cm μεταξύ τους και 1 cm από τα τοιχώματα του τρυβλίου. Οι δοκιμές έγιναν με τα βακτηριακά στελέχη που ξεχώρισαν από τις πολλαπλές καλλιέργειες. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν οι άγριοι τύποι των ήδη γνωστών βιοπαραγόντων Pseudomonas fluorescens F113 (Εικ. 8) και Pseudomonas chlororaphis PCL1391. Το πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές. Συνοπτικά υπήρχαν οι εξής μεταχειρίσεις: 46

47 1. Καλλιέργεια όπου αναπτύχθηκε μόνο ο Forl (μάρτυρας Forl) στη μία πλευρά του τρυβλίου 2. Διπλές καλλιέργειες με ένα βακτήριο κάθε φορά, απέναντι από το μύκητα Εικ. 8. Καλλιέργεια του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici με το στέλεχος ΤοΖα7 όπου απεικονίζεται η αναστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με τον γνωστό βιοπαράγοντα Pseudomonas fluorescens F113 Η δοκιμή για πιθανή δράση πτητικών ουσιών έγινε με διπλές καλλιέργειες, όπου σε τρυβλία Petri των 6cm εμβολιάστηκαν χωριστά ο φυτοπαθογόνος μύκητας και το βακτήριο και στη συνέχεια, χωρίς πώματα τα τρυβλία συγκολλήθηκαν το ένα απέναντι στο άλλο, ώστε οι δύο μικροοργανισμοί να μην έρχονται σε επαφή. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αντίστοιχο μάρτυρα Forl. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 25 o C. Μετά τον εμβολιασμό των τρυβλίων πραγματοποιούνταν καθημερινές μακροσκοπικές παρατηρήσεις, μέχρι και το πέρας δύο εβδομάδων, προκειμένου να διαπιστωθεί η ύπαρξη αναστολής, ή οποιασδήποτε μορφής αλλοίωσης της ανάπτυξης του Forl από την παρουσία των ριζοβακτηρίων. 47

48 Διερεύνηση της ικανότητας των επιλεγμένων πιθανών βιοπαραγόντων να λύουν τις μυκηλιακές υφές του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- Βιοδοκιμή λύσης υφών Αφού διαπιστώθηκε η ικανότητα των ριζοβακτηρίων να δημιουργούν μια ζώνη αναστολής, ή να αλλοιώνουν την κανονική ανάπτυξη του μύκητα Forl, ή να σταματούν την ανάπτυξη του με αποικισμό των υφών, το επόμενο βήμα ήταν να ελεγχθεί το ποια από τα βακτήρια, που επιλέχθηκαν στις πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες, προκαλούν λύση των υφών, όταν αυτά εμβολιάζονται σε τρυβλίο το οποίο έχει στρωθεί με κονίδια του μύκητα. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η δοκιμή αυτή πραγματοποιήθηκε σε συνδυασμό με πειράματα in planta (τα οποία περιγράφονται στο τρίτο κεφάλαιο), ώστε από τα αποτελέσματα και των δύο να επιλεγούν τα πιο αποτελεσματικά βακτήρια. Στην παρούσα δοκιμή ο έλεγχος αυτός έγινε με δύο τρόπους: αρχικά σε τρυβλία που περιείχαν ενσωματωμένα κονίδια του μύκητα, εμβολιάστηκαν όλα τα βακτήρια, σε μεμονωμένες θέσεις και στη συνέχεια έγινε έλεγχος για ύπαρξη ζώνης αναστολής στην ανάπτυξη του μύκητα, γύρω από τα βακτήρια. Στη δεύτερη δοκιμή, στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου που είχε εμβολιαστεί με κονίδια, ανοίχτηκαν πηγαδάκια στα οποία προστέθηκαν διηθήματα των βακτηριακών καλλιεργειών και στη συνέχεια έγιναν παρατηρήσεις, για το σχηματισμό ζώνης αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα γύρω από τα πηγαδάκια. Παραγωγή και μέτρηση μολύσματος του μύκητα και λήψη βακτηριακού διηθήματος Για παραγωγή μεγάλου αριθμού κονιδίων του Forl χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό υλικό το Czapek Dox Broth (Duchefa, Haarlem The Netherlands). Το θρεπτικό υλικό περιέχει ανά λίτρο απεσταγμένου νερού τα εξής συστατικά: FeSO 4 x 7H 2 O MgSO 4 x 7H 2 O KCl NaNO 3 K 2 HPO 4 0.1gr 0.5gr 0.5gr 3gr 1gr 48

49 Sucrose 30gr Για την παραγωγή του μολύσματος παρασκευάστηκαν 250ml υλικού και τοποθετήθηκαν σε κωνική φιάλη των 500ml. Αφού αποστειρώθηκε σε πίεση 1,5 bar, στους 120 o C, για 20 λεπτά, το υλικό εμβολιάστηκε με 3 εμβόλια, τα οποία είχαν ληφθεί από την περιφέρεια αναπτυσσόμενης καλλιέργειας του μύκητα, σε PDA. Στη συνέχεια, οι φιάλες επωάστηκαν σε αναδευόμενο επωαστήρα, στις 150 στροφές/λεπτό και σε θερμοκρασία 25 o C, για τρεις ημέρες. Η μέτρηση της συγκέντρωσης των κονιδίων του μύκητα ανά ml υγρής καλλιέργειας έγινε σε μικροσκόπιο, με τη βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου τύπου Thoma Zeiss, ύστερα από διήθηση της παραπάνω υγρής καλλιέργειας με ειδικό αποστειρωμένο τουλουπάνι (miracloth, Calbiochem, USA). Τα βακτήρια αναπτύχθηκαν για 48 ώρες, σε δοκιμαστικούς σωλήνες, σε 7ml LC (εκτελέστηκε η συνταγή όπως προαναφέρθηκε στην παράγραφο , χωρίς να προστεθεί άγαρ). Στη συνέχεια οι σωλήνες τοποθετήθηκαν σε αναδευόμενο επωαστήρα, στις 150 στροφές/λεπτό και σε θερμοκρασία 25 o C. Με το πέρας των 48 ωρών, οι υγρές καλλιέργειες μεταφέρθηκαν σε σωλήνες Falcon και φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 rpm, στους 25 o C, για 20 λεπτά, ώστε να απομακρυνθούν τα βακτηριακά κύτταρα. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε σε αποστειρωμένους σωλήνες Falcon, με τη βοήθεια σιφωνίου και στη συνέχεια μικρή ποσότητα αυτού διηθήθηκε σε φίλτρα πόρων 0,20μm (Polyethersulfone membrane, Whatman, USA). Μεταχειρίσεις Πειραματικός σχεδιασμός Σε κάθε τρυβλίο στρώθηκαν αρχικά 10ml PDA, ώστε να λειτουργούν ως βάση και ως θρεπτική πηγή για το μύκητα. Στη συνέχεια σε αποστειρωμένο υλικό LC agar, θερμοκρασίας 45 o C προστέθηκε αιώρημα κονιδίων από υγρή καλλιέργεια του μύκητα, ώστε η τελική συγκέντρωση των κονιδίων στο μέσο να είναι 1,5 x 10 4 σπόρια/ml. Μετά την προσθήκη των κονιδίων, το υλικό αναδεύτηκε και στρώθηκε γρήγορα στα τρυβλία που περιείχαν ήδη PDA (επιφανειακά, περίπου 5 10ml του LC με κονίδια, σε κάθε τρυβλίο) και αφέθηκε να στερεοποιηθεί. Μετά τη στερεοποίηση του μέσου εμβολιάστηκαν επιφανειακά, με τη βοήθεια αποστειρωμένων οδοντογλυφίδων τα βακτήρια (Εικ.9). Εμβολιάστηκαν 5 ή 6 βακτήρια σε κάθε τρυβλίο κάθε φορά και το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Όλοι οι 49

50 χειρισμοί γίνονταν σε θάλαμο νηματικής ροής, ώστε να επιτυγχάνονται αποστειρωμένες συνθήκες. Συνοπτικά προέκυψαν οι εξής μεταχειρίσεις: 1. Καλλιέργεια με κονίδια του μύκητα Forl (μάρτυρας Forl) 2. Καλλιέργειες με κονίδια του μύκητα Forl, στις οποίες εμβολιάστηκαν επιφανειακά τα βακτήρια Εικ. 9. Καλλιέργεια με κονίδια του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici, επί των οποίων εμβολιάστηκαν βακτήρια Παράλληλα, η ικανότητα των βακτηρίων, να λύουν τις υφές του μύκητα ελέγχθηκε και με την έγχυση διηθήματος καλλιεργειών αυτών σε τετράγωνα πηγαδάκια, μήκους πλευράς 7mm, που είχαν ανοιχτεί ασηπτικά, με τη βοήθεια νυστεριού, στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου, που περιείχε τα κονίδια. Σε κάθε τρυβλίο έγιναν περιμετρικά 4 πηγαδάκια, στα οποία εγχύθηκαν με αποστειρωμένη σύριγγα, 100μl του διηθήματος κάθε βακτηρίου χωριστά. Έγινε μία επανάληψη αυτού του πειράματος. Άρα προέκυψαν και οι εξής μεταχειρίσεις: 1. Τρυβλία με κονίδια του μύκητα Forl (μάρτυρας Forl) 2. Τρυβλία όπου υπήρχαν πηγαδάκια με βακτηριακά διηθήματα σε θρεπτικό μέσο με ενσωματωμένα κονίδια του Forl Κατά τις επόμενες ημέρες και μέχρι το πέρας των δύο εβδομάδων, γίνονταν καθημερινοί έλεγχοι, για λυτική δραστηριότητα γύρω από τα πηγαδάκια και γύρω από τις βακτηριακές αποικίες. 50

51 1.3. Αποτελέσματα Απομόνωση ριζοβακτηρίων, λήψη και επιλογή μεμονωμένων αποικιών Από τα αρχικά τρυβλία επώασης λήφθηκαν συνολικά 383 βακτηριακά στελέχη που αναγράφονται στον πίνακα 3. Πιν. 3. Βακτηριακά στελέχη που απομονώθηκαν από τη ριζόσφαιρα διαφόρων καλλιεργούμενων ή μη ξενιστών από διάφορες περιοχές της Ελλάδας Ημερομηνία Τοποθεσία Φυτό Απομονώσεις (συνολικός αριθμός) 23/9/2009 Άγιος Παύλος Χαλκιδικής Μπάμια Μ1έως Μ55 (55) 23/9/2009 Άγιος Παύλος Χαλκιδικής Πιπεριά Π1 έως Π74, ΠιΛα10, ΠιΧα2ΙΙ έως ΠιΧα5ΙΙ (79) 23/9/2009 Άγιος Παύλος Χαλκιδικής Τομάτα Τ1 έως Τ70 (70) 16/11/2009 Σέρρες Τομάτα TΣε1 έως TΣε20 (20) 16/11/2009 Σέρρες Ζιζάνιο Ζ1 έως Ζ8 (8) 16/11/2009 Σέρρες Πιπεριά ΠΣε1 έως ΠΣε15 (15) 23/4/2010 Θέρμη Θεσσαλονίκης Σιτάρι Σ1 έως Σ24, Σ48 (25) 28/4/2010 Πυλαία Θεσσαλονίκης Σιτάρι Σ25 έως Σ36, Σ37 έως Σ47 (23) 5/5/2010 Θέρμη, Αγρόκτημα Α.Π.Θ. Σιτάρι Σ49 έως Σ60 (12) 12/5/2010 Άγιος Παύλος Χαλκιδικής Σιτάρι Σ61 έως Σ73, Σ80 έως Σ84, Σ89, Σ90 (20) 12/5/2010 Καλλικράτεια Χαλκιδικής Σιτάρι Σ74 έως Σ79, Σ85 έως Σ88 (10) 30/8/2010 Ζάκυνθος Τομάτα Τοζα1 έως Τοζα12, Τοζα1' έως Τοζα 12' (24) 31/8/2010 Ζάκυνθος Πεπόνι Πεζα1 έως Πεζα10, Πεζα1' έως Πεζα12' (22) Έλεγχος αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici από νεοαπομονωμένα βακτηριακά στελέχη της ριζόσφαιρας σε πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες σε τρυβλίο Μετά το πέρας 15 ημερών σε θερμοκρασία 25 ο C, στα τρυβλία με τις πολλαπλές καλλιέργειες παρατηρήθηκαν τα εξής: 1. Στα τρυβλία όπου αναπτυσσόταν ο μύκητας Forl μόνος του, κάλυπτε με τις υφές του όλη την επιφάνεια του τρυβλίου 51

52 2. Στα τρυβλία όπου αναπτύσσονταν τα ριζοβακτήρια, αυτά κάλυπταν το χώρο που οριζόταν από το βακτηριακό κρίκο κατά τον εμβολιασμό και μερικά χιλιοστά γύρω από αυτόν 3. Στα τρυβλία των πολλαπλών καλλιεργειών, όπου αναπτυσσόταν ο μύκητας με τα βακτήρια, παρατηρήθηκαν πολλά βακτήρια να προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα. Αυτά επιλέχθηκαν για να καλλιεργηθούν σε διπλές καλλιέργειες με το μύκητα, ώστε να είναι πιο εύκολη η μακροσκοπική παρατήρηση της επίδρασής τους. 4. Στα τρυβλία όπου αναπτύχθηκαν οι προαναφερθείσες διπλές καλλιέργειες, παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα, τόσο λόγω ύπαρξης ζώνης αναστολής, αλλά και σε κάποιες περιπτώσεις, λόγω κάλυψης των μυκηλιακών υφών από το βακτήριο. 5. Στις δοκιμές για δράση πτητικών ουσιών δε βρέθηκαν βακτήρια που να δίνουν την εντύπωση της παραγωγής δραστικών πτητικών ουσιών, δηλαδή κάποια αραίωση του μυκηλίου. Το πείραμα αυτό επαναλήφθηκε και αργότερα με τα βακτήρια που ξεχώρισαν στη διάρκεια αυτής της εργασίας. Έτσι από τα αρχικά 383 ριζοβακτήρια, που απομονώθηκαν και στη συνέχεια δοκιμάστηκαν για τη δράση τους ως αναστολείς ανάπτυξης του Forl σε πολλαπλές καλλιέργειες in vitro, ξεχώρισαν και τοποθετήθηκαν σε διπλές καλλιέργειες τα εξής 64: Τ12, Τ13, Τ14, Τ15, Μ12, Μ13, Τ9, Τ3, Τ6, Π29, Π58, Π10, Μ10, Π37, Π44, Π20, Π74, Π48, Π2, Π3, Ζ7, Ζ8, Π20, Τ70, Μ55, Τ39, Τ14, ΤΣε17, ΠΣε13, ΠΣε8, ΠΣε11, ΠΣε10, ΠΣε7, ΠΣε12, Π23, Σ42, Σ35, Σ20, Σ8, Σ16, Σ47, Σ69, Σ61, Σ55, Σ60, Σ75, Σ76, Σ79, Σ51, Σ52, ΠιΧα1ΙΙ, ΠιΧα5ΙΙ, Σ56, Σ57, Σ77, ΠεΖα10, Σ49, ΤοΖα4-8, ΤοΖα7, ΤοΖα11, ΤοΖα2-6, ΤοΖα12, ΤοΖα3, ΤοΖα9. Από τα παραπάνω 64 βακτήρια, ικανοποιητική αναστολή του μύκητα και στις δύο επαναλήψεις της δοκιμής των διπλών καλλιεργειών, έδειξαν τα παρακάτω 38: Π29, Π58, Π44, Τ3, Τ6, Τ39, Μ55, Π10, Μ13, Π2, Π3, Ζ7, ΤΣε17, Π20, Τ9, Τ14, Μ10, Μ12, ΠΣε13, ΠΣε12, ΠΣε11, ΠΣε10, Π23, ΠιΧα5ΙΙ, Σ55, Σ57, Σ47, Σ52, Σ79,, Σ76, Σ49, ΤοΖα4-8, ΤοΖα7, ΤοΖα11, ΤοΖα2-6, ΤοΖα1-5, ΤοΖα3, ΤοΖα9. 52

53 Διερεύνηση της ικανότητας των επιλεγμένων πιθανών βιοπαραγόντων να λύουν τις μυκηλιακές υφές του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- Βιοδοκιμή λύσης υφών Τα αποτελέσματα ήταν εντυπωσιακά κυρίως στις καλλιέργειες όπου εμβολιάστηκαν τα βακτήρια απ ευθείας πάνω στα κονίδια του μύκητα (Εικ.10). Τα παρακάτω 8 στελέχη και συγκεκριμένα τα Σ76, Σ79, Σ52, Σ47, Σ55, Σ49, ΤοΖα7 και ΠιΧα5ΙΙ, έδωσαν πολύ έντονες ζώνες λύσης των υφών μετά την πάροδο 2 ημερών. Όπως προαναφέρθηκε η δοκιμή της λύσης των υφών πραγματοποιήθηκε σε συνδυασμό με πειράματα in planta, τα οποία παρουσιάζονται στο Κεφ. 3. Έτσι ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων οδήγησε στην τελική επιλογή των επικρατέστερων πιθανών βιοπαραγόντων. Σημαντικό είναι το γεγονός ότι τα Σ76 και Σ79, ενώ προκάλεσαν έντονη λύση των υφών, δεν επιβίωναν πάνω στα κονίδια του μύκητα ούτε για 24 ώρες, σε αντιδιαστολή με τα υπόλοιπα, τα οποία παρέμεναν ενεργά για αρκετές ημέρες και μάλιστα με αυξανόμενη δράση (Εικ. 11). Επίσης αξιοσημείωτη ήταν η αλλαγή του χρώματος των υφών από λευκό σε πορτοκαλί ανοιχτό, που προκαλούσε το στέλεχος ΤοΖα7 στο χρονικό διάστημα πριν αρχίσει να γίνεται αντιληπτή η λύση των υφών. Εικ. 10. Λύση των υφών του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από βακτηριακά στελέχη 53

54 Εικ. 11. Λύση των υφών του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από τα βακτηριακά στελέχη Σ76, Σ52 και Σ79 (ξεκινώντας από αριστερά και πηγαίνοντας κυκλικά προς τα κάτω) Οι δοκιμές με τα πηγαδάκια δεν είχαν τα ίδια θεαματικά αποτελέσματα. Παρατηρήθηκε πως η ανάπτυξη του μύκητα δεν επηρεάστηκε καθώς τα κονίδια βλάστησαν κανονικά ακόμη και στην περιοχή δίπλα στα πηγαδάκια Συζήτηση Όπως προαναφέρθηκε, τα στάδια αποικισμού της ριζόσφαιρας από βακτήρια είναι: μετακίνηση προς τη ρίζα, προσκόλληση, κάλυψη της ρίζας σε όλο της το μήκος και τέλος, πολλαπλασιασμός και εγκατάσταση του πληθυσμού. Το στάδιο που μελετήθηκε περισσότερο είναι αυτό της προσκόλλησης, καθώς αυτό καθορίζει και ποια στελέχη θα αποικίσουν επιτυχώς τη ρίζα (Dazzo, 1980). Η ανομοιομορφία στα αποτελέσματα πειραμάτων ελέγχου και καταγραφής (screening) πληθυσμών της ριζόσφαιρας, πιθανώς να οφείλεται στη διαφορετική ικανότητα του κάθε στελέχους να ολοκληρώσει κάποιο από τα παραπάνω βήματα της διαδικασίας αποικισμού. Η πλύση των ριζών και η συλλογή των μικροοργανισμών σε εκλεκτικά ή μη θρεπτικά υποστρώματα, είναι μια ευρέος διαδεδομένη μέθοδος απομόνωσης 54

55 ριζοβακτηρίων (Campbell et al., 1986). Σημαντικό είναι να αναφερθεί πως πριν από τη μέθοδο αυτή, όπως παρουσιάζεται στην προαναφερθείσα δημοσίευση, δοκιμάστηκαν και πάρα πολλές παραλλαγές αυτής και επίσης με την πάροδο των ετών αυτή ενισχύθηκε και βελτιώθηκε. Η παραπάνω μέθοδος που εφαρμόστηκε στην παρούσα εργασία, είχε ως αποτέλεσμα τη λήψη ενός μεγάλου αριθμού αποικιών, ο χειρισμός του οποίου ήταν εξαιρετικά δυσχερής, ενώ ήταν πρακτικά αδύνατη η αξιοποίηση του συνόλου των απομονωμένων βακτηρίων. Έτσι κατά τη λήψη μεμονωμένων αποικιών, η οποία έγινε σύμφωνα με τα μακροσκοπικά τους χαρακτηριστικά, είναι πολύ πιθανό να διέφυγαν ωφέλιμα βακτήρια, τα οποία δεν ξεχώρισαν ως μεμονωμένες αποικίες, ή ακόμη κάποια να λήφθηκαν πάνω από μία φορά επειδή θεωρήθηκαν ως διαφορετικά. Λύση σε αυτό το ζήτημα θα μπορούσε να αποτελεί η μεταφορά ύστερα από την πρώτη απομόνωση, σε μία ποικιλία εκλεκτικών μέσων, τα οποία ενδεχομένως θα ευνοούσαν περισσότερο συγκεκριμένα γένη κάθε φορά, π.χ. King s B medium για τις φθορίζουσες ψευδομονάδες ή άλλα εκλεκτικά μέσα για τους βάκιλλους, ή τους στρεπτομύκητες. Εξάλλου, οι μέθοδοι ελέγχου ριζοβακτηρίων για ωφέλιμη δραστηριότητα, μπορούν να διακριθούν ανάλογα με τον αριθμό των αποικιών που λαμβάνει στο τέλος ο ερευνητής. Για παράδειγμα, για να εντοπίσει κανείς τα ριζοβακτήρια που βρίσκονται σε αφθονία στη ριζόσφαιρα, μπορεί να καλλιεργήσει απ ευθείας δείγματα της ριζόσφαιρας σε θρεπτικό μέσο σε τρυβλία Petri (Nautiyal, 1997). Αν όμως στόχος είναι ο εντοπισμός βακτηρίων τα οποία είναι πιο σπάνια, ο έλεγχος και η καταγραφή γίνονται με τη βοήθεια φθορίζουσας χρώσης ή με τη χρήση τυχαίων ή εξειδικευμένων εκκινητών (μοριακές μέθοδοι). Οι μοριακές μέθοδοι χρησιμοποιούνται για τα βακτήρια που δεν μπορούν να καλλιεργηθούν (Nautiyal & Das Gupta, 2007). Αυτά τα βακτήρια καλούνται βιώσιμα αλλά όχι καλλιεργήσιμα βακτήρια (Viable But Nonculturable, VBNC) (Xu et al., 1982) και πολλοί από τους γνωστούς βιοπαράγοντες ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία. Πρόκειται για βακτήρια τα οποία για κάποιο στάδιο του βιολογικού τους κύκλου, περνούν μια φάση ληθάργου και δεν διχοτομούνται με ρυθμούς επαρκείς ώστε να αναπτυχθεί αποικία που εντοπίζεται στο τρυβλίo (Alexander et al., 1999). 55

56 Ένα πολύ σημαντικό βήμα κατά τη διαδικασία απομόνωσης είναι το να πετυχαίνει ο ερευνητής τη συλλογή του μεγαλύτερου δυνατού αριθμού αποικιών από κάθε αποτελεσματικό βακτήριο. Στην παρούσα εργασία η προσπάθεια απομόνωσης άγνωστων βακτηρίων εμπεριείχε και το ρίσκο της ακόλουθης επιλογής μη ωφέλιμων βακτηρίων ανάμεσα σε έναν τεράστιο αριθμό αποικιών. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε στην αρχή ένας μεγάλος αριθμός μεμονωμένων αποικιών από τα αρχικά τρυβλία επώασης, ώστε να υπάρχουν αυξημένες πιθανότητες να ληφθούν και βακτήρια με αποτελεσματική δράση πάνω σε φυτοπαθογόνα των φυτών. Μία άλλη επιδίωξη ήταν να επιλεγούν βακτήρια, που να ανήκουν σε παραπάνω από ένα είδη, δεδομένου ότι οι μέχρι σήμερα γνωστοί βιοπαράγοντες ανήκουν σε μία ευρεία ομάδα ειδών. Τελικά από τα αρχικά 383 βακτήρια που απομονώθηκαν σταδιακά ο αριθμός που επιλέχθηκε να δοκιμαστεί σε περεταίρω δοκιμές in planta περιορίστηκε στα 8. Η δοκιμή των διπλών καλλιεργειών ανέδειξε τα βακτήρια με ισχυρή ανταγωνιστική δράση in vitro. Οι δοκιμές με τα πηγαδάκια δεν είχαν τα ίδια θεαματικά αποτελέσματα, ενδεχομένως επειδή τα διηθήματα ήταν σε πολύ μικρές ποσότητες και δεν συμπυκνώθηκαν πριν τη χρήση τους και έτσι οι ουσίες που περιείχαν στα 100μl δεν ήταν ικανές να δράσουν. Καθοριστική τέλος δοκιμή ήταν αυτή της λύσης των υφών, που είχε ως αποτέλεσμα την επιλογή ενός αριθμού βακτηρίων, που θα ήταν διαχειρίσιμος σε δοκιμές στις οποίες θα συμπεριλαμβάνονταν φυτά. Σημαντικό είναι να επισημανθεί ο περιορισμός των δοκιμών in vitro ως προς τη δυνατότητα αξιολόγησης των μηχανισμών ανταγωνισμού εκτενέστερα, καθώς στο σύστημα συμμετέχουν μόνο δύο παράγοντες, το παθογόνο και το εκάστοτε ριζοβακτήριο. Επομένως πρόκειται για μια μέθοδο που επιτρέπει μεν την αξιολόγηση της αλληλεπίδρασης αυτών των δύο μικροοργανισμών, αλλά σε επίπεδο εργαστηριακών συνθηκών μόνο. Μια προσέγγιση η οποία συνάδει περισσότερο με τις πραγματικές συνθήκες (όπως τα πειράματα in planta) περιλαμβάνει παθοσυστήματα με περισσότερους παράγοντες, αλλά από την άλλη παρέχει αποτελέσματα τα οποία είναι πιο γενικευμένα και αόριστα ως προς τους μηχανισμούς δράσης του βιοπαράγοντα (Knudsen, 1997). Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα που επιβεβαιώνει τα παραπάνω είναι αυτό της παραγωγής αντιβιοτικών από βακτήρια του γένους Streptomyces σε τεχνητό υπόστρωμα, σε σύγκριση με την παραγωγή αυτών in vivo (Fravel, 1988; Renwick et al., 1991). Σε αυτές τις μελέτες παρατηρήθηκε πως οι διπλές καλλιέργειες του εκάστοτε παθογόνου με τα βακτήρια του γένους 56

57 Streptomyces δεν ήταν αξιόπιστες. Αυτό συνέβαινε, γιατί αποδείχτηκε, πως η ποσότητα του αντιβιοτικού που παράγεται από τα βακτήρια in vitro, είναι αισθητά λιγότερη από την ποσότητα που παράγεται in vivo. Συμπεραίνει κανείς εύκολα πως σε αυτή τη μελέτη η in vitro μέθοδος αποδείχτηκε ακατάλληλη για τον σωστό έλεγχο βακτηρίων του γένους Streptomyces, ως προς τη δράση τους ως βιοπαραγόντων (Knudsen, 1997). Μια πιθανή εξήγηση για αυτό το φαινόμενο είναι, πως τα τεχνητά θρεπτικά υποστρώματα διεγείρουν την παραγωγή αντιβιοτικών σε διαφορετικές ποσότητες, ή ακόμα και την παραγωγή διαφορετικών αντιβιοτικών ουσιών. Πολλές μελέτες επιβεβαίωσαν αυτήν την υπόθεση και αφορούσαν βακτήρια του γένους Pseudomonas κυρίως (Dickie and Bell, 1995; Kloepper et al., 1987; Whipps, 1987; Whipps and Magan, 1987). Σε όλες αυτές τις μεταχειρίσεις, οι συνθήκες ήταν σταθερές, οι μικροοργανισμοί ήταν γνωστοί και αυτό που άλλαζε ήταν το θρεπτικό υπόστρωμα, ώστε να αποδειχτεί ότι επηρεάζει την παραγωγή των αντιβιοτικών. Ένας άλλος λόγος πιθανής αναξιοπιστίας των μεθόδων in vitro είναι το ότι στο έδαφος, οι αντιβιοτικές ενώσεις μπορούν εύκολα να προσροφηθούν στα κολλοειδή της αργίλου (Williams, 1982) και ως εκ τούτου, να μειωθεί γρήγορα η συγκέντρωσή τους, στο εδαφικό διάλυμα. Συνεπώς, οι in vitro μέθοδοι πιθανώς να δώσουν υπερ-εκτιμημένα αποτελέσματα. Για όλους τους παραπάνω λόγους, τα πειράματα αξιολόγησης πιθανών ή εν δυνάμει βιοπαραγόντων, ολοκληρώνονται μόνο αν συμπεριληφθούν πειράματα in planta στο σύστημα ελέγχου (screening). 57

58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Ταυτοποίηση των αποτελεσματικότερων ριζοβακτηρίων μέσω της ανίχνευσης χαρακτηριστικών αλληλουχιών βάσεων στο γενετικό υλικό τους, με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) 2.1. Εισαγωγή Για να ταυτοποιηθούν τα αποτελεσματικότερα ριζοβακτήρια, χρησιμοποιήθηκαν δύο βασικές μέθοδοι. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αλληλούχισης του γονιδίου 16S rrna, μέθοδος που συνιστάται, ως μία πρώτη προσέγγιση όταν πρόκειται να ταυτοποιηθούν πλήρως άγνωστα στελέχη (Garrity et al., 2004). Είναι μια μέθοδος που επιτρέπει μια αρχική ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους, κυρίως λόγω της πληθώρας των κατατεθημένων αλληλουχιών που υπάρχουν στο διαδίκτυο. Για να γίνει διαφοροποίηση σε επίπεδο είδους, στην περίπτωση που τα αποτελέσματα της αρχικής μεθόδου δεν είναι αξιόπιστα, αλληλουχείται σε ένα δεύτερο επίπεδο η περιοχή που βρίσκεται ανάμεσα στο 16S και το 23S rrna. Αυτή η διαδικασία ακολουθήθηκε και στην παρούσα εργασία. Η χρήση της τελευταίας μεθόδου ταυτοποίησης ενδείκνυται για τη διαφοροποίηση σε επίπεδο είδους βακτηρίων, τα οποία βρίσκονται ακόμα και στην ίδια ταξονομική ενδοειδική ομάδα (Candelon et al., 2004) Υλικά και μέθοδοι Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης του γονιδίου 16S rrνα Η αρχική ταυτοποίηση έλαβε χώρα στη Γαλλία στα εργαστήρια του USDA ARS, (Baillarguet, France), υπό την επίβλεψη της Dr. Marie Claude Bon. Η διαδικασία περιγράφεται παρακάτω περιληπτικά. 58

59 Για να ταυτοποιηθούν τα 8 βακτηριακά στελέχη, αρχικά χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αλληλούχησης όλου του γονιδίου, που κωδικοποιεί το 16S rrna. Ο πολλαπλασιασμός του γονιδίου έγινε με τη διαδικασία της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), αφού προηγήθηκε η λύση των βακτηριακών κυττάρων και η εξαγωγή του γενετικού υλικού από αυτά με τη χρήση του QiAamp mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Όλες οι PCR έγιναν σε έναν θερμοκυκλοποιητή Perkin Elmer Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, ήταν οι καθολικοί εκκινητές 27F (5 - GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 ) και 1495R (5 - CTACGGCTACCTTGTTACGA -3 ). Χρησιμοποιήθηκαν αρνητικοί μάρτυρες στους οποίους δεν προστέθηκε DNA. Μετά τη διαδικασία της PCR, τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτές αγαρόζης 1%, για 15min, στα 100V και η χρώση έγινε με SYBr Safe αραιωμένο 0,5Χ, υπό υπεριώδες φως. Τα προϊόντα που παραλήφθηκαν καθαρίστηκαν με τη χρήση του πακέτου Qiaquick PCR Purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany) και οι δύο κλώνοι των προϊόντων της PCR αλληλουχήθηκαν από την εταιρεία Millegen (Labege, France), με τους παραπάνω εκκινητές. Οι δύο κλώνοι ευθυγραμμίστηκαν με το πρόγραμμα BioEdit v και η συστοιχία έγινε με το ClustalX version H σύγκριση και ομολογία με υπάρχουσες αλληλουχίες, στη βάση δεδομένων NCBI, έγινε με τη χρήση του αλγόρυθμου BLASTN και επιβεβαιώθηκε με τη χρήση της βάσης δεδομένων BIBI Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης της περιοχής ανάμεσα στο 16S rrna και 23S rrna Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι L1 (5 - CAAGGCATCCACCGT -3 ) και G1 (5 - GAAGTCGTAACAAGG -3 ) οι οποίοι καλύπτουν την περιοχή από το τέλος του 16S rrna μέχρι την αρχή του 23S rrna. Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιήθηκε όταν η αλληλούχηση της 16S rrna περιοχής των βακτηρίων δεν ήταν αρκετή για να διαφοροποιηθούν αυτά σε επίπεδο είδους. Συμπληρωματικά, για την επιβεβαίωση του αποτελέσματος στην περίπτωση της διάκρισης του S. marcescens από το P. fluorescens, τα βακτήρια 59

60 καλλιεργήθηκαν σε εκλεκτικό μέσο, King s B-agar (King et al., 1954). Σε αυτό το υπόστρωμα, το βακτήριο P. fluorescens φθορίζει έντονα καθώς αναπτύσσεται, ενώ το S. marcescens όχι. Εξαγωγή του DNA Η διαδικασία εξαγωγής του DNA από τα βακτηριακά κύτταρα ήταν αυτή που περιγράφηκε από τους Psifidi et al., (2010) στη μέθοδο 6 με κάποιες τροποποιήσεις. Για να εξαχθεί το DNA από τα κύτταρα, αρχικά τα βακτήρια καλλιεργήθηκαν σε 50ml LC medium και επωάστηκαν σε αναδευτήρα, για 24 ώρες. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν από κάθε καλλιέργεια 5ml σε μικροσωλήνες eppendorf και αφού φυγοκεντρήθηκαν στις rpm, για 5min, απορρίφθηκαν τα υπερκείμενα και 700μl από τα ιζήματα μεταφέρθηκαν σε ένα μικροσωλήνα και θερμάνθηκαν στους 65 o C, για 10min. Στη συνέχεια, έγινε μια ακόμη φυγοκέντρηση στα rcf, για 10min και σε νέο μικροσωλήνα προστέθηκαν 625 μl αιθανόλης 100% και 500μl από το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης. Αυτό το μίγμα μεταφέρθηκε σε αυτοσχέδια στήλη (μέσα σε μικροσωλήνα) η οποία δεσμεύει το DNA και αφού έγινε φυγοκέντρηση στις rcf, για 3 λεπτά, απομακρύνθηκε ο μικροσωλήνας και αντικαταστάθηκε από καινούριο. Στη συνέχεια προστέθηκαν στη στήλη 700μl Wash1 και ακολούθησε μια ακόμη φυγοκέντρηση του 1min, στις 8.000rcf. Το ίδιο επαναλήφθηκε με την προσθήκη 700μl Wash2. Στη συνέχεια προστέθηκαν 400μl Wash3 και η στήλη φυγοκεντρήθηκε στις rcf για 2min. Οι μικροσωλήνες στη συνέχεια αφέθηκαν ανοιχτοί, έως ότου να εξατμιστεί όλη η αιθανόλη. Κατά τη διάρκεια της αναμονής θερμάνθηκαν 10ml TE(1x), για 10min, στους 95 o C και προστέθηκαν σε κάθε μικροσωλήνα 80μl από αυτό. Αφού αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5min, φυγοκεντρήθηκαν για 2min στις 8.000rcf και το συνολικό DNA μεταφέρθηκε σε μικροσωλήνα των 1,5ml για αποθήκευση. Ανάπτυξη αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) Αφού έγινε η εξαγωγή του DNA, πραγματοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης, με μεταφορά 1μl του κάθε δείγματος σε νέο μικροσωλήνα των 0,2ml, ο οποίος είχε τελικό όγκο διαλύματος 20μl. Ο μικροσωλήνας περιείχε 0,2mM από κάθε dntp, 4μl 5Χ Buffer, 1μM από τον εκκινητή L1 (5-60

61 CAAGGCATCCACCGT -3 ) και 1μM από τον εκκινητή G1 (5 - GAAGTCGTAACAAGG -3 ). Επιπλέον στον μικροσωλήνα προστέθηκε 1 μονάδα Phire DNA πολυμεράση και στη συνέχεια ο μικροσωλήνας συμπληρώθηκε μέχρι τα 19μl με νερό, που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC. Στη συνέχεια, οι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν στο θερμοκυκλοποιητή για επώαση όπου ακολουθήθηκαν τα παρακάτω στάδια: 1. Αποδιάταξη του αρχικού εκμαγείου του DNA: 98 o C, για 30 δευτερόλεπτα 2. Αποδιάταξη του εκμαγείου του DNA: 98 o C, για 10 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση των εκκινητών με τα άκρα του DNA στόχου: 55 o C, για 20 δευτερόλεπτα 4. Επέκταση των συμπληρωματικών αλυσίδων: 72 o C, για 30 δευτερόλεπτα Τα στάδια 2, 3, 4 επαναλήφθηκαν 40 φορές 5. Συμπλήρωση των αλυσίδων που δεν ολοκληρώθηκαν: 72 o C για 5 λεπτά Διαδικασία ηλεκτροφόρησης αγαρόζης Η πηκτή αγαρόζης παρασκευάστηκε σε συγκέντρωση 1,5%, στο διάλυμα της ηλεκτροφόρησης ΤΑΕ 1Χ (Tris Acetate EDTA: 0,04M Tris Acetate, 0,001M EDTA). Αφού διαλύθηκε η αγαρόζη με θέρμανση μέχρι το σημείο βρασμού, στρώθηκε σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης, η οποία αφού έπηξε η αγαρόζη, πληρώθηκε με διάλυμα ΤΑΕ 1Χ. Εκτός από τα δείγματα με το βακτηριακό DNA, στην πηκτή προστέθηκαν και 5μl ενός δείκτη μοριακών βαρών (LADDER). Στα δείγματα προστέθηκε περίπου 1μl από διάλυμα της χρωστικής ουσίας κυανούν της βρωμοφαινόλης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε τάση 110V, για μια ώρα και στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίστηκε σε υδατικό διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (0,5mg/ml), για 20 λεπτά. Το βρωμιούχο αιθίδιο έχει την ιδιότητα να παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων των νουκλεϊκών οξέων και να φθορίζει παρουσία υπεριώδους 61

62 φωτός. Η θέση του DNA έγινε ορατή με τοποθέτηση της πηκτής σε τράπεζα φθορισμού (UV transilluminator). Εξαγωγή του προϊόντος της PCR από την πηκτή αγαρόζης Αρχικά πραγματοποιήθηκε μια PCR συνολικού όγκου 100μl για κάθε δείγμα, το προϊόν της οποίας απομακρύνθηκε από την πηκτή αγαρόζης με νυστέρι και αποστειρωμένη λεπίδα. Η ζώνη DNA που παραλήφθηκε, μεταφέρθηκε σε μικροσωλήνα eppendorf του 1,5ml. Η εξαγωγή του DNA έγινε με το kit καθαρισμού NucleoTrap purification kit (Macherey Nagel, Duren, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή και το καθαρό πλέον DNA στάλθηκε για αλληλούχιση στο Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, στην Ιατρική Σχολή, στον τομέα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας. Συστοιχία και σύγκριση των αλληλουχιών Αφού παραλήφθηκαν τα αποτελέσματα της αλληλούχησης, έγινε η συστοιχία των βάσεων μέσω του προγράμματος ChromasPro version 1.5. Με αυτό το πρόγραμμα και μέσω της σύγκρισης των ξεκάθαρων κορυφών του χρωματογραφήματος συμπληρώθηκαν οι βάσεις, που ήταν ασαφείς. Επίσης απομακρύνθηκαν από τα άκρα των αλυσίδων οι εκκινητές, ώστε να μην αναγνωρίζονται εσφαλμένα από τον αλγόριθμο κατά τη σύγκριση των αλληλουχιών με αυτές της βάσης δεδομένων. Η συστοιχία των βάσεων έγινε με το πρόγραμμα ClustalX version 2.1. Το σύνολο του προϊόντος της PCR για το κάθε βακτήριο συγκρίθηκε με υπάρχουσες αλληλουχίες, στη βάση δεδομένων NCBI, μέσω της χρήσης του αλγόρυθμου BLASTN. 62

63 2.3. Αποτελέσματα Συζήτηση Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης του γονιδίου 16S rrna Όπως προαναφέρθηκε, για την ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους αγνώστων εν δυνάμει βιοπαραγόντων, είναι αναγκαίο να χρησιμοποιηθούν παραπάνω από μια μέθοδοι ταυτοποίησης. Αυτό συμβαίνει λόγω της ομοιότητας που παρουσιάζουν πολλά γένη βακτηρίων, ίδιων οικογενειών και η αλληλούχιση ενός μόνο γονιδίου, ή σημείου του DNA δίνει συχνά ασαφή αποτελέσματα. Η πρώτη προσέγγιση για τα εν λόγω στελέχη αφορούσε την αλληλούχιση του 16S rrna, που θεωρείται ακόμη η πιο αξιόπιστη μέθοδος για μια αρχική προσπάθεια κατάταξης των μικροοργανισμών (Bergey, 2005). Προτιμάται από άλλες μεθόδους ταυτοποίησης κυρίως για τελείως άγνωστα στελέχη, καθώς είναι μία περιοχή για την οποία υπάρχει ο μεγαλύτερος αριθμός αλληλουχιών στις βάσεις δεδομένων του διαδικτύου. Επομένως, με τη χρήση κατάλληλων προγραμμάτων, η αλληλούχιση αυτού του γονιδίου επιτρέπει μια πρώτη διαφοροποίηση. Τα αρχικά αποτελέσματα από την αλληλούχηση ήταν τα εξής: Η αλληλουχία του16s rrna του στελέχους Σ79 ήταν πανομοιότυπη με αυτήν του στελέχους Σ76 (ομοιότητα 100%) και αυτές οι δύο ταυτίζονταν τόσο με ένα στέλεχος του Bacillus thuringiensis (GU391524), όσο και με τον B. cereus Τα στελέχη Σ55 και Σ49 ήταν πανομοιότυπα και ταυτίζονταν 100% με το βακτήριο S. rubidaea (AB004751) Τα στελέχη ΠιΧα5ΙΙ, Σ52 και Σ47 ήταν απολύτως όμοια μεταξύ τους και εμφάνιζαν 100% ταύτιση με τα βακτήρια S. marcescens και Pseudomonas fluorescens Η αλληλουχία του 16S rrna του στελέχους ΤοΖα7 ήταν μοναδική και εμφάνιζε 100% ταύτιση με το Pseudomonas chlororaphis 63

64 Συνεπώς με βάση τα αποτελέσματα, ταυτοποιήθηκαν τα στελέχη Σ49, Σ55 και ΤοΖα7, τα οποία ανήκουν στο είδος Serratia rubidaea (τα δύο πρώτα) και Pseudomonas chlororaphis (το τρίτο). Για τα στελέχη Σ79, Σ76, Σ52, Σ47 και ΠιΧα5ΙΙ όπως φαίνεται από τα παραπάνω αποτελέσματα, χρειάστηκε να διερευνηθεί περαιτέρω το γονιδίωμά τους. Η αλληλούχιση της 16S rrna περιοχής αυτών των βακτηρίων δεν ήταν αρκετή για να διαφοροποιηθούν σε επίπεδο είδους τα βακτήρια. Με τον τρόπο αυτό τα παραπάνω βακτήρια φαινόταν να ανήκουν σε παραπάνω από ένα είδος. Για να επιτευχθεί η διάκρισή τους σε επίπεδο είδους, αλληλουχήθηκε μια ακόμα περιοχή για αυτά τα 5 στελέχη. Όπως αναφέρεται στο Bergey s Manual of Systematic Bacteriology (2005), η διάκριση μεταξύ του B. thurigiensis και B. cereus, καθώς και μεταξύ των S. marcescens και P. fluorescens μπορεί να γίνει μέσω της αλληλούχισης της περιοχής ανάμεσα στο 16S rrna και το 23S rrna. Ανάλογα με το είδος, η περιοχή αυτή κωδικοποιεί ένα ή περισσότερα γονίδια trna, τα οποία συμμεταφράζονται. Για παράδειγμα, το βακτήριο Escherichia coli έχει σε εκείνη την περιοχή 7 γονίδια trna (Madigan et al., 2009) Ταυτοποίηση μέσω της αλληλούχισης της περιοχής ανάμεσα στο 16S rrna και 23S rrna Διάκριση μεταξύ των Bacillus thurigiensis και Bacillus cereus Τα βακτήρια B. thurigiensis και B. cereus ανήκουν στην ίδια ταξονομική ομάδα, γεγονός που καθιστά τη διαφοροποίησή τους μόνο με τη χρήση της αλληλούχισης του γονιδίου του 16s rrna, αρκετά δύσκολη. Ωστόσο, με την αλληλούχιση της ενδιάμεσης περιοχής μεταξύ του 16S rrna και του 23S rrna, η διάκριση είναι ασφαλής και ξεκάθαρη (Candelon et al., 2004), καθώς το μέγεθος του οπερονίου της περιοχής αυτής, διαφοροποιείται έντονα σε επίπεδο είδους, ακόμα και εντός της ίδιας ομάδας. Για να συγκριθεί το μέγεθος του προϊόντος που λήφθηκε, με αυτό των αλληλουχιών της βάσης δεδομένων NCBI, χρησιμοποιήθηκαν καταχωρημένα στελέχη του B. thurigiensis, των οποίων τα γονιδιώματα είχαν αλληλουχηθεί πλήρως. 64

65 Το μέγεθος του οπερονίου αυτού του τελευταίου αγγίζει τις 800 βάσεις στην ενδιάμεση περιοχή των 16S 23S rrna. Τα αποτελέσματα των διαβασμάτων όμως των στελεχών που μελετήθηκαν, συμπίπτουν με τον αριθμό των βάσεων που έχει ο B. cereus στην ίδια περιοχή (περίπου 200 βάσεις). Επομένως, εφόσον εντοπίστηκαν και αφαιρέθηκαν οι εκκινητές από τα αποτελέσματα της αλληλούχισης, και πρόκειται για εκκινητές που καλύπτουν όλη εκείνη την περιοχή, βγήκε το συμπέρασμα πως πρόκειται για στελέχη του B. cereus τα οποία εμφάνισαν 100% ομολογία με το στέλεχος B4264 (Acc. Number: CPO1176), σύμφωνα με τη βάση δεδομένων του NCBI. Συνεπώς τα στελέχη Σ76 και Σ79 ανήκουν στο είδος B. cereus. Διάκριση μεταξύ των Pseudomonas fluorescens και Serratia marcescens Όπως προαναφέρθηκε, τα στελέχη Σ47, Σ52 και ΠιΧα5ΙΙ, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της πρώτης μεθόδου ταυτοποίησης, είναι πανομοιότυπα (Εικ. 12). Η αλληλούχηση του 16S rrna γονιδίου όμως πολλές φορές δεν ήταν αρκετή για να διαφοροποιήσει το αποτέλεσμα σε επίπεδο γένους. Αυτό οφείλεται στην ομοιότητα που παρουσιάζει αυτή η περιοχή του γονιδιώματος σε βακτήρια όπως τα S. marcescens και P. fluorescens, τα οποία ανήκουν στην ίδια κλάση (Gammaproteobacteria). Η διάκριση αυτή επιτεύχθηκε αρχικά με τη χρήση μιας βιοχημικής μεθόδου. Τα στελέχη ΠιΧα5ΙΙ, Σ52 και Σ47 καλλιεργήθηκαν σε εκλεκτικό μέσο King s B-agar, για να ελεγχθεί ο πιθανός φθορισμός των αποικιών. Το θρεπτικό υπόστρωμα King s B είναι ένα υπόστρωμα, το οποίο διεγείρει την παραγωγή της φθορίζουσας ουσίας φλουορεσίνης (flyorescein) και της πυοκυανίνης (pyocyanine). Τόσο υπό το φυσικό φως, όσο και υπό το υπεριώδες, σε θερμοκρασία ανάπτυξης που δεν ξεπερνά τους 35 o C, το είδος P. fluorescens φθορίζει καθώς αναπτύσσεται (King et al., 1954). Με τη χρήση αυτού του μέσου αμέσως διαφοροποιήθηκαν τα στελέχη που μελετήθηκαν, καθώς οι αποικίες που αναπτύχθηκαν στο εκλεκτικό μέσο δεν φθόριζαν. Έτσι βγήκε το συμπέρασμα ότι πρόκειται για στελέχη του S. marcescens και αυτό επιβεβαιώθηκε και με τη δεύτερη μέθοδο ταυτοποίησης όπως αναφέρεται παραπάνω. 65

66 Εικ. 12. Ηλεκτροφόρημα στο οποίο φαίνονται ο δείκτης μοριακού βάρους (1), καθώς και τα στελέχη όλων των ριζοβακτηρίων που ταυτοποιήθηκαν, 2: Σ47, 3: Σ79, 4: ΠιΧα5II, 6: Σ76, 7: Σ55, 8: Σ49, 9: Σ52, 10: ToZa7, 11 και 12: στελέχη που δε μετρήθηκαν. Στη συνέχεια το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε μεσω της διεξαγωγής της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης,στοχεύοντας όπως προαναφέρθηκε στην ενδιάμεση περιοχή μεταξύ 16S rrna και 23S rrna. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των διαβασμάτων, τη συστοιχία των βάσεων και τη σύγκριση των αλληλουχιών με τη βάση δεδομένων NCBI, τα αποτελέσματα ήταν τα εξής: marcescens. το στέλεχος ΠιΧα5ΙΙ εμφάνισε 99% ομολογία με το στέλεχος S. marcescens PCH5 (Acc. Number: FN600648) το στέλεχος Σ52 εμφάνισε 99% ομολογία με το στέλεχος S. marcescens PCH5 (Acc. Number: FN600648) το στέλεχος Σ47 εμφάνησε 99% ομολογία τόσο με το στέλεχος S. marcescens PCH5 (Acc. Number: FN600648), όσο και με το S. marcescens subsp. marcescens ATCC13880 (Acc. Number: GQ332578) Συνεπώς και τα τρία στελέχη ΠιΧα5ΙΙ, Σ47 και Σ52 ανήκουν στο είδος S. 66

67 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Μελέτη της επίδρασης των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε δοκιμές in planta 3.1. Εισαγωγή Στα πλαίσια της απόκτησης μιας πιο ολοκληρωμένης εικόνας της δράσης των νεοαπομονωμένων βακτηριακών στελεχών, ως βιοπαραγόντων εναντίον του παθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl), αλλά και της γενικότερης επίδρασής τους στην ανάπτυξη της τομάτας ως PGPR, μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις τους με το παθογόνο και τον ξενιστή, σε ένα πιο σύνθετο παθοσύστημα. Με αυτόν τον τρόπο έγινε εφικτό, το να διαπιστωθεί η αποτελεσματικότητά των νέων πιθανών βιοπαραγόντων, σε συνθήκες που προσομοιάζουν ή ισοδυναμούν με τις πραγματικές. Τα πειράματα in planta μπορούν να δείξουν, εκτός από την επίδραση στην ένταση της ασθένειας και την ικανότητα του βιοπαράγοντα, να προάγει την ανάπτυξη του φυτού, δίνοντάς του έτσι ένα οικολογικό πλεονέκτημα απέναντι στο παθογόνο (Glick, 1995). Γίνεται επομένως αντιληπτό, πως το να αξιολογηθεί η δράση νέων βιοπαραγόντων παρουσία του φυτού ξενιστή, είναι πολύ σημαντικό, γιατί πέρα από τις άμεσες ανασταλτικές επιδράσεις επί του παθογόνου, λαμβάνει χώρα η διαδικασία του αποικισμού της ρίζας και ως εκ τούτου, φαινόμενα ανταγωνισμού, αλλά και πιθανόν άλλοι μηχανισμοί δράσης των βιοπαραγόντων, που σχετίζονται άμεσα με το φυτό. Στα πειράματα όπου συμμετέχει και φυτό ξενιστής μία συνηθισμένη πρακτική είναι, να προηγούνται δοκιμές σε ελεγχόμενες συνθήκες, σε σύστημα gnotobiotic. Σύστημα gnotobiotic καλείται το κλειστό σύστημα μελέτης οργανισμών, στο οποίο αναπτύσσονται μόνο οι οργανισμοί που ενδιαφέρουν τον ερευνητή. Οι συνθήκες ανάπτυξης είναι απολύτως ελεγχόμενες. Επιπλέον, με κατάλληλους χειρισμούς ένα σύστημα gnotobiotic μπορεί να κάνει δυνατή την αποκάλυψη πολλών φαινομένων, όπως είναι τα στάδια αποικισμού της ριζόσφαιρας, και ο ανταγωνισμός για οικοθέσεις επί του ριζικού συστήματος (Lagopodi et al., 2002; Bolwerk et al., 2003; Bolwerk et al., 2005). Ένα σύστημα gnotobiotic ευρείας απήχησης είναι αυτό που 67

68 περιγράφηκε από τους Simons et al., (1996). Στην παρούσα εργασία μελετώνται με αυτό το σύστημα το παθογόνο Forl και οι πιθανοί βιοπαράγοντες, επί της τομάτας, σε συνθήκες που ορίζονται εκ των προτέρων, χωρίς την επίδραση κανενός άλλου βιοτικού ή αβιοτικού παράγοντα. Εντούτοις, οι δοκιμές σε σύστημα gnotobiotic, παρόλο που είναι ένας αρκετά ικανοποιητικός τρόπος για επιλογή μεταξύ βιοπαραγόντων, δεν αρκούν για να στοιχειοθετήσουν δράση in planta, εξαιτίας των τεχνητών συνθηκών που επικρατούν σε αυτό. Έτσι κρίθηκαν απαραίτητες και οι δοκιμές με φυτά σε γλάστρες. Σε αυτές τις δοκιμές, οι συνθήκες είναι ένα βήμα πιο κοντά στις πραγματικές συνθήκες ανάπτυξης φυτών, ως προς το ότι δεν απολυμαίνονται οι σπόροι και το υπόστρωμα ανάπτυξης δεν αποστειρώνεται, δημιουργώντας έτσι ένα πιο ανταγωνιστικό περιβάλλον στο οποίο εμπλέκονται και άλλοι βιοτικοί κυρίως παράγοντες, όπως λ.χ. άλλοι μικροοργανισμοί που διαβιούν στο υπόστρωμα, ή επί του σπόρου. Έτσι οι αντιδράσεις, τόσο του φυτού όσο και των μικροοργανισμών (παθογόνου και ωφέλιμων), είναι περισσότερο συγκρίσιμες με τις πραγματικές. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι δοκιμές σε γλάστρες είναι το στάδιο που προηγείται εκείνου του αγρού, γίνεται αντιληπτό γιατί τα πειράματα αυτά είναι καίρια στην τελική ευθεία για την αξιολόγηση πιθανών βιοπαραγόντων. Η ανάγκη να παρουσιαστεί μία πιο ολοκληρωμένη αξιολόγηση των βιοπαραγόντων, οδήγησε στο να δοκιμαστούν σε συνθήκες αγρού, δύο αντιπροσωπευτικά στελέχη, μεταξύ των πιο αποτελεσματικών σε όλες τις προηγούμενες δοκιμές. Η ανάπτυξη των ριζοβακτηρίων, του παθογόνου μύκητα, αλλά και του φυτού στον αγρό, επιτρέπει την παρατήρηση και τη μέτρηση των χαρακτηριστικών των φυτών, σε πραγματικές συνθήκες. Στον αγρό, τα στελέχη αλληλεπιδρούν και με άλλους μικροοργανισμούς, αλλά δέχονται και τις επιδράσεις του περιβάλλοντος (κατακρημνίσεις, θερμοκρασιακές μεταβολές) τόσο άμεσα, όσο και έμμεσα σε σχέση με το φυτό που αποικίζουν. Συνοπτικά επομένως, στο κεφάλαιο αυτό περιγράφονται πειράματα in planta που πραγματοποιήθηκαν (i) σε σύστημα gnotobiotic, (ii) σε γλάστρες σε εσωτερικό χώρο και (iii) στον αγρό. Σκοπός των πειραμάτων in planta ήταν να διαπιστωθεί: α) ποια από τα νεοαπομονωμένα βακτηριακά στελέχη μειώνουν την ένταση της 68

69 ασθένειας από Forl στην τομάτα, και β) ποια από αυτά προάγουν την ανάπτυξη της τομάτας Υλικά και μέθοδοι Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε κλειστό σύστημα ελεγχόμενων συνθηκών (gnotobiotic) Σύστημα gnotobiotic με άμμο σε σωλήνες Το σύστημα gnotobiotic που χρησιμοποιήθηκε ήταν μία παραλλαγή εκείνου που περιγράφηκε από τους Simons et al (1996). Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε γυάλινους κυλινδρικούς σωλήνες, ύψους 95mm και εσωτερικής διαμέτρου 40mm. Οι σωλήνες πληρώθηκαν με περλίτη, σε ύψος 2,5cm και στη συνέχεια, αφού κλείστηκαν με ανυδρόφιλο βαμβάκι και καλύφθηκαν με αλουμινόχαρτο, τοποθετήθηκαν στην αποστείρωση στους 120 o C, για 60min. Μετά το πέρας της αποστείρωσης, οι σωλήνες πληρώθηκαν σε άσηπτες συνθήκες, με αποστειρωμένη άμμο (quartz sand, Sea sand pure, Applichem, Darmstdt, Germany), με περίπου 30gr ο καθένας. Η άμμος είχε διάμετρο κόκκων από 0,1mm 0,3mm και προηγουμένως είχε αναμειχθεί με 10% (v:w) αποστειρωμένο θρεπτικό διάλυμα PNS (Plant Nutrition Solution, Hoffland, 1992). Για την παρασκευή ενός λίτρου PNS απαιτούνται τα εξής: 5,0 mm Ca(NO 3 ) 2 1,8 gr 5,0 mm KNO 3 0,5 gr 2,0 mm MgSO 4 x 7 H 2 O 0,48 gr 100 mm KHPO 4 1% Διάλυμα ιχνοστοιχείων 1,0 ml 1 lt απεσταγμένο νερό Το ph προσαρμόστηκε στο 5,8 Για την παρασκευή διαλύματος ιχνοστοιχείων χρησιμοποιήθηκαν τα εξής: 69

70 4,5 μm Kl 0,75 mg/lt 5,0 μm H 3 BO 4 3,0 mg/lt 60 μm MnSO 4 H 2 O 10,0 mg/lt 7,0 μm ZnSO 4 5 H 2 O 2,0 mg/lt 1,0 μm NaMoO 4 2 H 2 O 0,25 mg/lt 0,1 μm CuSO 4 5 H 2 O 0,025 mg/lt 0,1 μm CoCl 2 6 H 2 O 0,025 mg/lt Προβλαστημένοι σπόροι τομάτας τοποθετήθηκαν, ένας σε κάθε σωλήνα, υπό ασηπτικές συνθήκες, σε βάθος περίπου 1cm, μέσα στη στήλη της άμμου. Τα φυτά στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε αυτό το απομονωμένο σύστημα, για 15 ημέρες, σε θάλαμο ανάπτυξης, με σταθερή θερμοκρασία 24 ο C και φωτοπερίοδο 16 ώρες. Φυτικό υλικό Σε όλες τις δοκιμές σε σύστημα gnotobiotic χρησιμοποιήθηκαν σπόροι τομάτας ποικιλίας ACE55. Οι προβλαστημένοι σπόροι τομάτας προέκυψαν από την εξής διαδικασία: σε τρυβλίο Petri προστέθηκαν περίπου 20ml PNS-agar, το οποίο παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και στερεοποιήθηκε ύστερα από προσθήκη 1,8% άγαρ. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν στην επιφάνεια του μέσου οι σπόροι της τομάτας, οι οποίοι νωρίτερα είχαν απολυμανθεί με NaClO. Η διαδικασία της απολύμανσης περιελάμβανε την ανάδευση των σπόρων σε NaClO 5% για 3 min. Μετά το πέρας των 3 λεπτών, οι σπόροι ξεπλένονταν με απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό, ανά 30 λεπτά, για τις επόμενες 2 ώρες. Στη συνέχεια οι απολυμασμένοι σπόροι τοποθετούνταν στα τρυβλία και αυτά τυλίγονταν με αλουμινόχαρτο, ώστε να μην διαπερνώνται από φως και να προστατεύονται οι ρίζες από ενδεχόμενη αλλοίωση (φωτοοξείδωση). Τα τρυβλία διατηρούνταν ανεστραμμένα στους 4 ο C, για 48 ώρες, ώστε να επιτευχθεί ομοιόμορφη βλάστηση των σπόρων και μετά το πέρας των πρώτων 48 ωρών, μεταφέρονταν στους 25 ο C, για ακόμα ώρες, ώστε αυτοί να βλαστήσουν. Μικροοργανισμοί Ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl) διατηρήθηκε και καλλιεργήθηκε όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , ενώ ο τρόπος διατήρησης των βακτηριακών αποικιών περιγράφηκε εκτενώς στην παράγραφο

71 Στο σύστημα gnotobiotic δοκιμάστηκαν συνολικά 19 βακτηριακά στελέχη, που είχαν επιλεγεί κατά τις διαδικασίες που προηγήθηκαν και περιγράφονται στο Κεφ. 1. Από αυτά τα 19, ξεχώρισαν 8 που δοκιμάστηκαν στη συνέχεια στο σύστημα gnotobiotic, σε πείραμα με επαναλήψεις. Συγκεκριμένα, σε προκαταρκτικό πείραμα 3 φάσεων στο σύστημα gnotobiotic, αρχικά δοκιμάστηκαν 15 στελέχη (Π58, Ζ7, ΠΣε13, Π29, ΤΣε70, Μ55, Π10, ΠΣε12, Τ39, Τ14, Σ49, Σ55, Σ47, Σ52 και Π3), τα οποία ανήκαν στα 38, που ξεχώρισαν κατά τη δοκιμή των διπλών καλλιεργειών (Κεφ. 1.). Με βάση τα αποτελέσματα του προκαταρκτικού αυτού πειράματος, απορρίφθηκαν τα 11 και ξεχώρισαν 4 (Σ49, Σ55, Σ47, Σ52). Τα τελευταία 4 μαζί με άλλα 3 (ΠιΧα5-ΙΙ, Σ76, Σ79), που διακρίθηκαν στη δοκιμή λύσης υφών (Κεφ. 1.), επιλέχτηκαν για να δοκιμαστούν σε ένα πείραμα με επαναλήψεις στο σύστημα gnotobiotic. Τέλος στις δοκιμές στο σύστημα gnotobiotic προστέθηκε το 8 ο στέλεχος ΤοΖα7, που απομονώθηκε με χρονική καθυστέρηση. Παραγωγή, μέτρηση και εφαρμογή του βακτηριακού μολύσματος Για την παραγωγή πυκνού αιωρήματος βακτηρίων, κάθε βακτηριακό στέλεχος καλλιεργήθηκε για 24 ώρες, σε κωνικές φιάλες των 250ml, σε 100ml LC. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε αναδευόμενο επωαστήρα, στις 150 στροφές/λεπτό και σε θερμοκρασία 25 o C. Με το πέρας των 24 ωρών, οι υγρές καλλιέργειες μεταφέρθηκαν σε σωλήνες Falcon των 50ml και φυγοκεντρήθηκαν στα 6000 rpm, στους 25 o C, για 20 λεπτά, ώστε να απομακρυνθεί το υπερκείμενο. Το σχηματιζόμενο ίζημα των βακτηριακών κυττάρων, επαναδιαλύθηκε σε αποστειρωμένο Phosphate Buffered Saline (PBS, Leeman et al., 1995). Για την παρασκευή του PBS χρησιμοποιήθηκαν: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O K 2 HPO 4 1 lt απεσταγμένο νερό 8,0 gr/lt 0,2 gr/lt 1,44 gr/lt 0,24 gr/lt Πριν την αποστείρωση του διαλύματος το ph ρυθμίστηκε στο 7,4 με την προσθήκη NaOH. 71

72 Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης των βακτηριακών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο (JENWAY 6405). Η συγκέντρωση που καθορίστηκε, ήταν εκείνη που αντιστοιχούσε σε οπτική πυκνότητα OD 620 = 0,7. Προκειμένου να επιτευχθεί η παραπάνω συγκέντρωση, τα ήδη διαλυμένα σε PBS βακτηριακά κύτταρα αραιώθηκαν σταδιακά με το ίδιο διάλυμα. Η εφαρμογή των βακτηρίων έγινε με εμβάπτιση προβλαστημένων σπόρων τομάτας, σε αιώρημα βακτηριακών κυττάρων της παραπάνω συγκέντρωσης, για 20min. Παραγωγή, μέτρηση και εφαρμογή μολύσματος του φυτοπαθογόνου μύκητα Υγρή καλλιέργεια 3 ημερών, του μύκητα Forl, σε Czapek Dox Broth, διηθήθηκε μέσω αποστειρωμένου miracloth, ώστε να ληφθούν τα σπόρια και να απομακρυνθεί το μυκήλιο. Η καλλιέργεια στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 6000 rpm, στους 25 o C, για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα των σπορίων επαναδιαλύθηκε σε απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό, ενώ στη συνέχεια υπολογίστηκε η συγκέντρωσή τους, με τη βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου. Κατάλληλη ποσότητα αυτού του αιωρήματος σπορίων, μεταφέρθηκε με μηχανικό σιφώνιο, σε κωνική φιάλη που περιείχε αποστειρωμένο PNS, ώστε η τελική συγκέντρωση κονιδίων στο PNS να είναι 5 x 10 2 κονίδια/ml. Αυτό το αιώρημα με τον παθογόνο μύκητα αναμείχθηκε με αποστειρωμένη άμμο σε αναλογία 1:10 v:w, έτσι ώστε τελικά να υπάρχουν 50 κονίδια/gr άμμου, μέσα σε κάθε σωλήνα. Όλες οι διαδικασίες που περιγράφηκαν μέχρι στιγμής έγιναν σε ασηπτικές συνθήκες, σε θάλαμο νηματικής ροής. Μεταχειρίσεις Πειραματικός σχεδιασμός Πραγματοποιήθηκε ένα προκαταρκτικό πείραμα, σε τρεις φάσεις, στο οποίο δοκιμάστηκαν συνολικά 15 ριζοβακτήρια, με σκοπό να εντοπιστούν τα πιο αποτελεσματικά. Το πείραμα αυτό έγιναν σε συνδυασμό με την in vitro δοκιμή των διπλών καλλιεργειών που περιγράφεται στο Κεφ.1., έτσι ώστε ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων να οδηγήσει στην τελική επιλογή των επικρατέστερων βιοπαραγόντων, που δοκιμάστηκαν περαιτέρω. Τα βακτήρια που δεν έδωσαν σημαντικά αποτελέσματα στο δοκιμαστικό πείραμα απορρίφθηκαν. Στη συνέχεια, 72

73 έγινε ένα πείραμα σε 3 χρονικές επαναλήψεις, με συνολικά 7 βακτήρια, από τα οποία τα 4 προήλθαν από την επιλογή στο προκαταρκτικό πειράματα, στο gnotobiotic σύστημα και τα 3 από την επιλογή κατά τη βιοδοκιμή λύσης υφών, που περιγράφεται στο Κεφ. 1. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι ένα μόνο βακτηριακό στέλεχος (το ΤοΖα7) δοκιμάστηκε χωρίς προκαταρκτικό πείραμα, σε 2 χρονικές επαναλήψεις και ξεχωριστά από τα υπόλοιπα, δεδομένου ότι είχε απομονωθεί με μεγάλη χρονική καθυστέρηση, σε σχέση με τα πρώτα 7 και δοκιμάστηκε τελευταίο. Κάθε επανάληψη συμπεριλάμβανε τις εξής επεμβάσεις: 1. Πέντε (5) προβλαστημένοι σπόροι αναπτύχθηκαν σε άμμο, που περιείχε μόνο το θρεπτικό υπόστρωμα PNS (Τομάτα μάρτυραςαρνητικός μάρτυρας) (Εικ. 13) 2. Δέκα (10) προβλαστημένοι σπόροι αναπτύχθηκαν σε άμμο μολυσμένη με κονίδια του φυτοπαθογόνου μύκητα (Forl-θετικός μάρτυρας) (Εικ. 13) 3. Δέκα (10) προβλαστημένοι σπόροι εμβαπτίστηκαν σε αιώρημα βακτηριακών κυττάρων καθενός στελέχους και στη συνέχεια φυτεύτηκαν σε μολυσμένη με κονίδια άμμο (Forl + βακτήριο) 4. Δύο (2) προβλαστημένοι σπόροι εμβαπτίστηκαν σε αιώρημα των βακτηρίων και φυτεύτηκαν σε άμμο που περιείχε μόνο το θρεπτικό υπόστρωμα PNS (βακτήριο-μάρτυρας) Μέτρηση της έντασης της ασθένειας και χαρακτηριστικών ανάπτυξης των φυτών Μετά την ανάπτυξη των φυτών για 15 ημέρες, αυτά αφαιρέθηκαν από τους σωλήνες και εξετάστηκαν χωριστά, ώστε να εκτιμηθεί η ένταση της ασθένειας σε κάθε φυτό. Τα συμπτώματα ανάλογα με την έντασής τους, αποτέλεσαν τη βάση για τη δημιουργία μίας κλίμακας δείκτη ασθένειας (Δ. Α.) 5 τιμών. Αναλυτικότερα, οι δείκτες ασθένειας ορίστηκαν ως εξής: Δ.Α.1: φυτό υγιές χωρίς συμπτώματα Δ.Α.2: πολύ ελαφρά συμπτώματα στη ρίζα, με 1-2 κηλίδες μεταχρωματισμού στο λαιμό ή σε διάφορα σημεία του ριζικού συστήματος 73

74 Δ.Α.3: έντονα συμπτώματα στη ρίζα, με εκτεταμένο καστανό μεταχρωματισμό στο λαιμό και καστανές κηλίδες σε διάφορα σημεία του ριζικού συστήματος, χωρίς συμπτώματα στο υπέργειο Δ.Α.4: προχωρημένη σήψη στη ρίζα και συμπτώματα μαρασμού στο υπέργειο Δ.Α.5: Σχεδόν νεκρό ή νεκρό Εικ. 13. Φυτά τομάτας σε σύστημα gnotobiotic. Αριστερά οι σπόροι αναπτύχθηκαν σε άμμο που περιείχε μόνο το θρεπτικό υπόστρωμα PNS (αρνητικός μάρτυρας). Δεξιά οι σπόροι αναπτύχθηκαν σε άμμο μολυσμένη με κονίδια του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (θετικός μάρτυρας) Για επιβεβαίωση της παρουσίας και κυρίως της απουσίας του παθογόνου μύκητα, γίνονταν δειγματοληπτικά απομονώσεις, μετά από επιφανειακή απολύμανση τμημάτων του λαιμού και του ριζικού συστήματος με NaOCl. Στο προκαταρκτικό πείραμα, το οποίο ουσιαστικά λειτούργησε ως ενδεικτικό, για να ξεχωρίσουν οι πιο αποτελεσματικοί βιοπαράγοντες μεταξύ των 15, μετρήθηκε μόνο ο δείκτης ασθένειας. Στις 3 επαναλήψεις του πειράματος που έγινε στη συνέχεια με τους 7 βιοπαράγοντες, καθώς και στο πείραμα με το στέλεχος ΤοΖα7, μετρήθηκαν επιπλέον τα παρακάτω χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών. 1. το μήκος του βλαστού, 2. ο αριθμός των πραγματικών φύλλων και 3. το βάρος του υπεργείου τμήματος. 74

75 Ανάλυση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του πακέτου SPSS 19.0 (SPSS Inc. Chicago, USA) και βασίστηκε στην ανάλυση παραλλακτικότητας (One-Way ANOVA), σύμφωνα με το πειραματικό σχέδιο που καλείται πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο σε ομάδες (RCBD, Randomized Complete Block Design) με δείγματα άνισα. Στα πειράματα με μία χρονική επανάληψη η ανάλυση παραλλακτικότητας έγινε σύμφωνα με το πειραματικό σχέδιο που καλείται πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο (CRD, Complete Randomized Design) με δείγματα άνισα. Οι διαφορές μεταξύ των επεμβάσεων αξιολογήθηκαν με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p = 0, Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε γλάστρες Φυτικό υλικό, υπόστρωμα και συνθήκες ανάπτυξης των φυτών Σε όλες τις δοκιμές χρησιμοποιήθηκε τομάτα ποικιλίας ACE55. Οι σπόροι σπάρθηκαν χωρίς απολύμανση, απευθείας στο μίγμα του υποστρώματος (τύρφη : περλίτης 3:1, v:v), σε γλάστρες, που η καθεμία περιείχε περίπου 100gr υποστρώματος. Ανάλογα με το αν επρόκειτο για επέμβαση κάποιου μάρτυρα ή όχι, το υπόστρωμα ήταν αναμεμιγμένο με νερό, ή με αιώρημα κονιδίων συγκέντρωσης 5 x 10 4 κονίδια/ ml. Σε κάθε γλάστρα σπάρθηκαν 2 σπόροι τομάτας και τα φυτά αναπτύχθηκαν στον πάγκο του εργαστηρίου, σε συνθήκες φυσικού και τεχνητού φωτισμού, στους ο C περίπου, για 4 εβδομάδες. Τα ποτίσματα ανάλογα με την εποχή κυμαίνονταν από 2 έως 3 την εβδομάδα. Η ποσότητα νερού που χρησιμοποιήθηκε κάθε φορά ήταν περίπου 70 ml, για να μην υπερβαίνει το σημείο υδατοικανότητας του υποστρώματος. 75

76 Μικροοργανισμοί Ο μύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl) διατηρήθηκε και καλλιεργήθηκε, όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , ενώ ο τρόπος διατήρησης των βακτηριακών αποικιών περιγράφηκε εκτενώς στην παράγραφο Στα πειράματα σε γλάστρες δοκιμάστηκαν συνολικά τα παρακάτω 12 βακτηριακά στελέχη: ΠιΛα10, ΠΧ5, ΠιΧα5ΙΙ, Σ51, Σ76, Σ57, Σ47, Σ79, Σ49, Σ55, Σ52 και ΤοΖα7. Συγκεκριμένα σε προκαταρκτικό πείραμα σε γλάστρες αρχικά δοκιμάστηκαν 9 στελέχη (ΠιΛα10, ΠΧ5, ΠιΧα5ΙΙ, Σ51, Σ76, Σ57, Σ47, Σ79, Σ49), από τα οποία ορισμένα είχαν επιλεγεί κατά in vitro δοκιμή των διπλών καλλιεργειών, που περιγράφεται στο Κεφ.1. και άλλα από τα πειράματα στο σύστημα gnotobiotic. Με βάση τα αποτελέσματα του προκαταρκτικού αυτού πειράματος, απορρίφθηκαν 4 στελέχη και επιλέχτηκαν 5 (Σ79, Σ76, Σ47, Σ49, ΠιΧα5ΙΙ). Αυτά τα 5 μαζί με άλλα 2 (Σ55 και Σ52) που διακρίθηκαν στη δοκιμή λύσης υφών (Κεφ. 1.), και τις δοκιμές στο σύστημα gnotobiotic, επιλέχτηκαν για να δοκιμαστούν σε ένα πείραμα με επαναλήψεις, σε γλάστρες. Τέλος στις δοκιμές στις γλάστρες προστέθηκε το 8 ο στέλεχος ΤοΖα7, που απομονώθηκε με χρονική καθυστέρηση. Παραγωγή, μέτρηση και εφαρμογή του βακτηριακού μολύσματος Η παραγωγή και η μέτρηση της τελικής πυκνότητας του βακτηριακού μολύσματος έγινε όπως περιγράφεται στην παράγραφο αυτού του κεφαλαίου. Η εφαρμογή κάθε βακτηρίου χωριστά έγινε με επικάλυψη των σπόρων της τομάτας, με μίγμα που προέκυψε ύστερα από σφοδρή ανάδευση αιωρήματος βακτηριακών κυττάρων σε PBS, σε συγκέντρωση που αντιστοιχούσε σε οπτική πυκνότητα OD 620 = 0,7 και μεθυλικής σελουλόζης 4% (Viscosity 4,000 Cp, SIGMA- ALDRICH, USA). Η αναλογία των όγκων αιωρήματος και μεθυλικής σελουλόζης ήταν 1:1 (v:v). Οι σπόροι της τομάτας εμβαπτίστηκαν για 20 λεπτά στο παχύρευστο αυτό αιώρημα και στη συνέχεια, αφού αφέθηκαν να στεγνώσουν στο θάλαμο νηματικής ροής, σπάρθηκαν στις γλάστρες. 76

77 Παραγωγή, μέτρηση και εφαρμογή μολύσματος του φυτοπαθογόνου μύκητα Η παραγωγή μολύσματος του Forl έγινε με τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο αυτού του κεφαλαίου. Η εφαρμογή μολύσματος του μύκητα έγινε με ανάμειξη κατάλληλου όγκου αιωρήματος κονιδίων με το υπόστρωμα. Αρχικά υπολογίστηκε η ποσότητα υποστρώματος που χρειαζόταν σε κάθε πείραμα, ανάλογα με τον αριθμό των γλαστρών κάθε φορά και υπολογίστηκε κατ επέκταση και ο απαραίτητος όγκος διαλύματος. Συγκεκριμένα, ίση ποσότητα υποστρώματος αναμειγνυόταν με ίσο όγκο αιωρήματος κονιδίων (w:v), στο οποίο η συγκέντρωση ήταν τόση ώστε τελικά να υπάρχουν 5 x 10 4 κονίδια/ γραμμάριο υποστρώματος. Για τις αραιώσεις που ίσως ήταν απαραίτητες να γίνουν, χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο και απεσταγμένο νερό. Μεταχειρίσεις Πειραματικός σχεδιασμός Πραγματοποιήθηκε ένα προκαταρκτικό πείραμα, σε δύο φάσεις, στο οποίο δοκιμάστηκαν συνολικά 9 ριζοβακτήρια, με σκοπό να εντοπιστούν τα πιο αποτελεσματικά. Το πείραμα αυτό έγινε σε συνδυασμό με την in vitro δοκιμή των διπλών καλλιεργειών, που περιγράφεται στο Κεφ.1. και τα πειράματα στο σύστημα gnotobiotic, έτσι ώστε τα αποτελέσματα των παραπάνω να οδηγήσουν από κοινού στην τελική επιλογή των επικρατέστερων βιοπαραγόντων, που δοκιμάστηκαν περαιτέρω, σε γλάστρες. Τα βακτήρια που δεν έδωσαν σημαντικά αποτελέσματα στο δοκιμαστικό πείραμα απορρίφθηκαν. Στη συνέχεια, έγινε ένα πείραμα σε 3 χρονικές επαναλήψεις, με συνολικά 7 βακτήρια, που ορισμένα προήλθαν από την επιλογή στο προκαταρκτικό πειράματα, στις γλάστρες και άλλα από την επιλογή κατά τη βιοδοκιμή λύσης υφών, που περιγράφεται στο Κεφ. 1, και από τα πειράματα στο σύστημα gnotobiotic. Ο όγδοος βιοπαράγοντας (ΤοΖα7) καθώς απομονώθηκε έναν χρόνο μετά από τους υπόλοιπους δοκιμάστηκε χωριστά σε 3 χρονικές επαναλήψεις. Τέλος μαζί με το στέλεχος ΤοΖα7 σε όλες τις επαναλήψεις, δοκιμάστηκε ως ξεχωριστή επέμβαση ο συνδυασμός όλων των προαναφερθέντων 8 πιο αποτελεσματικών ριζοβακτηρίων σε ίση αναλογία. Οι επεμβάσεις ήταν οι εξής (Εικ. 14) : 77

78 1. 12 σπόροι σπάρθηκαν σε μίγμα υποστρώματος, που αναμείχθηκε μόνο με νερό (Τομάτα μάρτυρας-αρνητικός μάρτυρας) σπόροι σπάρθηκαν σε μίγμα υποστρώματος, που περιείχε 5 x 10 4 κονίδια/ gr (Forl-θετικός μάρτυρας) σπόροι επικαλυμμένοι με το κάθε ριζοβακτήριο σπάρθηκαν σε μίγμα υποστρώματος, που περιείχε 5 x 10 4 κονίδια/ gr (Forl + βακτήριο) σπόροι επικαλυμμένοι με το κάθε ριζοβακτήριο, σπάρθηκαν σε μίγμα υποστρώματος, που αναμίχθηκε μόνο με νερό (βακτήριομάρτυρας) Εικ. 14. Επίδραση στα χαρακτηριστικά ανάπτυξης φυτών τομάτας που δέχτηκαν (από τα αριστερά προς τα δεξιά) 1. μόλυνση με Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, 2. καμία επέμβαση, 3. μόλυνση με το στέλεχος Serratia marcescens ΠιΧα5ΙΙ και 4. το συνδυασμό των δύο οργανισμών Δοκιμή PGPR δράσης Σχετικά με τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών της τομάτας, ύστερα από τις ενδείξεις των μαρτύρων των βακτηρίων σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα 78

79 στο παραπάνω πείραμα, όπως και στα πειράματα στο σύστημα gnotobiotic, εκτελέστηκε ένα επιπλέον πείραμα σε 1 χρονική επανάληψη, στο οποίο δοκιμάστηκαν τα στελέχη ΠιΧα5ΙΙ, Σ76, Σ79, Σ55, Σ49, Σ52 και ΤοΖα7, για τα οποία μετρήθηκαν μόνο χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών. Οι επεμβάσεις ήταν οι εξής: σπόροι τομάτας σπάρθηκαν σε μίγμα υποστρώματος, που περιείχε μόνο νερό (Τομάτα-μάρτυρας) σπόροι επικαλυμένοι με το κάθε ριζοβακτήριο σπάρθηκαν σε μίγμα υποστρώματος, που είχε αναμειχθεί μόνο με νερό (βακτήριο) Μέτρηση της έντασης της ασθένειας και χαρακτηριστικών ανάπτυξης των φυτών Μετά το πέρας τεσσάρων εβδομάδων τα φυτά αφαιρέθηκαν από τα γλαστράκια, ώστε να μετρηθούν τα χαρακτηριστικά της ανάπτυξης και να εκτιμηθεί η ένταση της ασθένειας. Το ριζικό σύστημα ξεπλύθηκε σε λεκάνη με νερό βρύσης, ώστε να είναι ευκολότερη η διαπίστωση μεταχρωματισμών, τόσο στο λαιμό, όσο και στη ρίζα. Η ένταση της ασθένειας εκφράστηκε με τη βοήθεια του δείκτη ασθένειας (Δ.Α), όπως ορίστηκε στην παράγραφο του παρόντος Κεφαλαίου. Για επιβεβαίωση της παρουσίας και κυρίως της απουσίας του παθογόνου μύκητα, γίνονταν δειγματοληπτικά απομονώσεις, μετά από επιφανειακή απολύμανση τμημάτων του λαιμού και του ριζικού συστήματος με NaOCl. Παράλληλα με τον Δ.Α., μετρήθηκαν και τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών, δηλ. το μήκος του βλαστού, ο αριθμός των φύλλων και το βάρος του υπεργείου τμήματος. Όσο για τη μελέτη της επίδρασης στην ανάπτυξη των φυτών (δοκιμή PGPR δράσης), τα χαρακτηριστικά που μετρήθηκαν ήταν τα παραπάνω και επιπλέον το πάχος του βλαστού. Ανάλυση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε όπως περιγράφηκε στην παράγραφο του παρόντος Κεφαλαίου. 79

80 Μελέτη της επίδρασης των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της ασθένειας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici στον αγρό Φυτικό υλικό και συνθήκες ανάπτυξης των φυτών Χρησιμοποιήθηκε τομάτα ποικιλίας ACE55. Τα φυτά αρχικά αναπτύχθηκαν από ένα σε κάθε γλαστράκι, όπως περιγράφεται στην παράγραφο του παρόντος Κεφαλαίου. Μετά τις πρώτες 7 εβδομάδες ανάπτυξης στα γλαστράκια, τα φυτά μεταφυτεύθηκαν σε ανοιχτό αγρό. Το μήκος του πειραματικού αγρού ήταν 4,3m και το πλάτος 2,54m. Επίσης υπήρχαν διάκενα ανάμεσα σε κάθε επέμβαση, που είχαν πλάτος 50cm. Το πείραμα εγκαταστάθηκε στην περιοχή Κάτω Δερβένι Θεσσαλονίκης, τους μήνες Σεπτέμβριο και Οκτώβριο του Ο καιρός που επικράτησε ήταν αίθριος, με κατώτερη θερμοκρασία αυτή των 5 o C, ενώ σημαντικές βροχοπτώσεις παρατηρήθηκαν στις 3/10, 15/10 και 16/10. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε αυτές τις συνθήκες για έξι εβδομάδες μετά τη μεταφύτευσή τους. Τα ποτίσματα γίνονταν ανά δύο ημέρες. Καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος δεν έγινε καταπολέμηση για κανέναν εχθρό, ούτε άλλη ασθένεια. Μικροοργανισμοί Ο μύκητας Forl διατηρήθηκε και καλλιεργήθηκε, όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , ενώ ο τρόπος διατήρησης των βακτηριακών αποικιών περιγράφηκε εκτενώς στην παράγραφο Στον αγρό δοκιμάστηκαν τα στελέχη Bacillus cereus Σ76 και Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, τα οποία θεωρήθηκαν αντιπροσωπευτικά όλων των προηγούμενων δοκιμών in vitro και in planta. Παραγωγή, μέτρηση και εφαρμογή του βακτηριακού μολύσματος Η παραγωγή και η μέτρηση της τελικής πυκνότητας του βακτηριακού μολύσματος έγινε όπως περιγράφεται στην παράγραφο αυτού του Κεφαλαίου. Εφαρμογή των βακτηρίων έγινε αρχικά στο σπόρο, όπως περιγράφεται στην παράγραφο του παρόντος Κεφαλαίου. Στη συνέχεια έγινε δεύτερη εφαρμογή των βιοπαραγόντων κατά τη μεταφύτευση. Αφού προετοιμάστηκαν αιωρήματα των 80

81 δύο στελεχών, συγκεκριμένα 1200ml του κάθε ριζοβακτηρίου (για συνολικά 24 φυτά), προστέθηκε σε καθένα ίσος όγκος διαλύματος μεθυλικής σελουλόζης 1%, σε νερό. Από αυτό το μίγμα προστέθηκαν σε κάθε γλαστράκι 100 ml, ακριβώς πριν τη μεταφύτευση, μέχρι του σημείου υδατοϊκανότητας του υποστρώματος. Παραγωγή, μέτρηση και εφαρμογή μολύσματος του φυτοπαθογόνου μύκητα Η παραγωγή μολύσματος του Forl έγινε με τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο αυτού του Κεφαλαίου. Η μόλυνση με το μύκητα έγινε με ανάμειξη αιωρήματος κονιδίων με το έδαφος. Αφού παράχθηκε αρκετή ποσότητα κονιδίων, υπολογίστηκε η ποσότητα αιωρήματος, που χρειάστηκε ανάλογα με τον αριθμό των φυτών. Το τελικό αιώρημα του Forl ήταν 1,8 lit, συγκέντρωσης περίπου 2 x 10 6 σπόρια/ml, για μόλυνση 36 φυτών. Στο αιώρημα αυτό λίγο πριν γίνει εφαρμογή του στο ριζικό σύστημα, προστέθηκε ίσος όγκος διαλύματος μεθυλικής σελουλόζης 1%, σε νερό. Έτσι κατά τη μεταφύτευση, τα φυτά ποτίστηκαν με 100ml του παραπάνω αιωρήματος. Μεταχειρίσεις Πειραματικός σχεδιασμός Πραγματοποιήθηκε μια χρονική επανάληψη του πειράματος που περιελάμβανε τις εξής μεταχειρίσεις: 1. Σπόροι σπάρθηκαν σε μίγμα τύρφης : περλίτη, που αναμίχθηκε μόνο με νερό. Κατά τη μεταφύτευση 12 φυτά δεν δέχτηκαν κανένα μόλυσμα (Μάρτυρας τομάτας-αρνητικός μάρτυρας) και άλλα 12 δέχτηκαν μόλυσμα Forl (Forl-θετικός μάρτυρας). 2. Σπόροι επικαλυμμένοι με το βακτηριακό στέλεχος B. cereus Σ76 σπάρθηκαν σε μίγμα τύρφης: περλίτη, που αναμείχθηκε μόνο με νερό. Κατά τη μεταφύτευση 12 φυτά δέχτηκαν δεύτερη εφαρμογή του βακτηρίου (Σ76-μάρτυρας) και άλλα 12 δέχτηκαν δεύτερη εφαρμογή του βακτηρίου και μόλυσμα Forl (Σ76+Forl). 3. Σπόροι επικαλυμμένοι με το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7 σπάρθηκαν σε μίγμα τύρφης: περλίτη, που αναμείχθηκε μόνο με νερό. Κατά τη μεταφύτευση 12 φυτά δέχτηκαν δεύτερη εφαρμογή 81

82 του βακτηρίου (ΤοΖα7-μάρτυρας) και άλλα 12 δέχτηκαν δεύτερη εφαρμογή του βακτηρίου και μόλυσμα Forl (ΤοΖα7+Forl). Η διάταξη των πειραματικών τεμαχίων φαίνεται στην εικόνα 15. Εικ. 15. Διάταξη των πειραματικών τεμαχίων του πειράματος στον αγρό στο Κάτω Δερβένι Θεσσαλονίκης. Μέτρηση της έντασης της ασθένειας και χαρακτηριστικών ανάπτυξης των φυτών Μετά το πέρας των έξι εβδομάδων, τα φυτά αφαιρέθηκαν από το έδαφος και εξετάστηκαν, ώστε να εκτιμηθεί ο δείκτης ασθένειας του κάθε φυτού και να μετρηθούν ορισμένα χαρακτηριστικά ανάπτυξής τους. Για να διευκολυνθεί η παρατήρηση των συμπτωμάτων, το ριζικό σύστημα ξεπλύθηκε σε λεκάνη με νερό βρύσης. Τα συμπτώματα κατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με την έντασής τους σε μια κλίμακα με τρεις τιμές, που αποτέλεσε το δείκτη ασθένειας (Δ.Α.). Αναλυτικότερα, οι δείκτες ασθένειας ορίστηκαν ως εξής: Δ.Α.1: υγιές φυτό Κανένα σύμπτωμα στο ριζικό σύστημα ή στο λαιμό Δ.Α.2: καστανές κηλίδες στα ριζικά τριχίδια 82

83 Δ.Α.3: καστανές κηλίδες στη ρίζα και το λαιμό και μάρανση του υπεργείου τμήματος Στο τέλος για επιβεβαίωση της μόλυνσης από το μύκητα έγιναν δειγματοληπτικές απομονώσεις. Παράλληλα με τη μέτρηση των δεικτών ασθένειας, μετρήθηκαν και τα παρακάτω χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών: 1. το μήκος των βλαστών, 2. ο αριθμός των φύλλων, 3. το βάρος του υπεργείου τμήματος, 4. το βάρος του ριζικού συστήματος και 5. ο αριθμός των ανθέων και καρπιδίων Ανάλυση και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε όπως περιγράφηκε στην παράγραφο του παρόντος Κεφαλαίου Αποτελέσματα Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε κλειστό σύστημα ελεγχόμενων συνθηκών (gnotobiotic) Οι τεχνητές μολύνσεις μέσω της διαβροχής της άμμου με τα κονίδια του παθογόνου ήταν επιτυχείς, καθώς η ανάπτυξη της ασθένειας της σήψης του λαιμού και των ριζών από τον Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici ήταν εμφανής, όπως φαίνεται και στους παρακάτω πίνακες (Πιν.4 και 5) με τα αποτελέσματα. 83

84 Τα 3 προκαταρκτικά πειράματα στο σύστημα gnotobiotic είχαν ως αποτέλεσμα να αποκλειστούν τα στελέχη ΠΣε13, Ζ7, Π58, ΤΣε70, Π29, ΠΣε12, Π10, Μ55, Τ39, Τ14 και Π3, ενώ αναδείχτηκαν τέσσερις σημαντικοί βιοπαράγοντες, τα στελέχη Σ49, Σ55, Σ47 και Σ52. Με βάση τα αποτελέσματα του προκαταρκτικού πειράματος που παρουσιάζονται στους Πίνακες Π1, Π2 και Π3 του Παραρτήματος και σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα των in vitro δοκιμών, επιλέχτηκαν τα στελέχη Σ47, Σ49, Σ52, Σ55, Σ79, Σ76, και ΠιΧα5ΙΙ για δοκιμαστούν στη συνέχεια. Τα αποτελέσματα του πειράματος, που εκτελέστηκε σε τρεις επαναλήψεις, με τους αποτελεσματικότερους εν δυνάμει βιοπαράγοντες, τα ριζοβακτήρια Bacillus cereus Σ76, B. cereus Σ79, Serratia marscescens Σ47, S. marscescens Σ52, S. marscescens ΠιΧα5ΙΙ, S. rubidaea Σ49 και S. rubidaea Σ55, καθώς και το Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, φαίνονται στους παρακάτω πίνακες (Πιν. 4 και Πιν. 5). Αναλυτικότερα, από τα 7 βακτηριακά στελέχη που δοκιμάστηκαν μαζί στο σύστημα gnotobiotic, στις τρεις χρονικές επαναλήψεις του πειράματος, εναντίον του μύκητα Forl τα 5 και συγκεκριμένα τα στελέχη Σ49 και Σ55 του S. rubidaea, Σ47, Σ52 και, ΠιΧα5-ΙΙ του S. marscescens, μείωσαν στατιστικά σημαντικά την ένταση της ασθένειας στην τομάτα, χωρίς να παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Το στέλεχος ΤοΖα7 του P. chlororaphis, που δοκιμάστηκε ξεχωριστά, φαίνεται ότι είναι ίδιας αποτελεσματικότητας με τα παραπάνω 5 αφού μείωσε το δείκτη ασθένειας κατά 27%, ακριβώς όσο και τα Σ47 και Σ49, τα οποία παρουσίασαν το μικρότερο δείκτη ασθένειας ανάμεσα στα 5 που δοκιμάστηκαν μαζί. Στο σύστημα gnotobiotic τα στελέχη Σ76 και Σ79 του B. cereus δεν αποδείχτηκαν αποτελεσματικά. Επίσης κανένα από τα 7 στελέχη που δοκιμάστηκαν ταυτόχρονα δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική βελτίωση των παραμέτρων ανάπτυξης όπως του μήκους του βλαστού, του αριθμού των φύλλων και το βάρους του υπεργείου τμήματος. Αντίθετα το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση του μήκους βλαστού και του βάρους του υπεργείου τμήματος, ενώ δεν επηρέασε τον αριθμό των φύλλων. 84

85 Πίν. 4. Επίδραση ριζοβακτηρίων στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε σύστημα gnotobiotic Επεμβάσεις Δ.Α. Μήκος Βλαστού (cm) Αριθμός φύλλων Βάρος Υπεργείου (gr) Τομάτα (αρνητικός μάρτυρας) 1.00a x 5.527a 0.8a 0.083a Forl + Serratia marscescens Σ47 3.3b 4.372b 0.4ab 0.054b Forl + Serratia rubidaea Σ49 3.3b 4.163b 0.44ab 0.051b Forl + Serratia marscescens ΠιΧα5-3.47b 4.204b 0.29b 0.048b ΙΙ Forl + Serratia rubidaea Σ b 3.678b 0.52ab 0.044b Forl + Serratia marscescens Σ b 4.257b 0.43ab 0.055b Forl + Bacillus cereus Σ bc 3.483b 0.09b 0.039b Forl + Bacillus cereus Σ bc 4.015b 0.35ab 0.047b Forl (θετικός μάρτυρας) 4.53c 3.814b 0.14b 0.041b x Οι τιμές εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σύμφωνα με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p=0.05 Πίν. 5. Επίδραση του ριζοβακτηρίου Pseudomonas chlororaphis ToZa7 στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε σύστημα gnotobiotic Επεμβάσεις Δ.Α. Μήκος Βλαστού (cm) Αριθμός φύλλων Βάρος Υπεργείου (gr) Τομάτα (αρνητικός μάρτυρας) 1.00a x 5.52a 0.2a 0.074a Forl + Pseudomonas chlororaphis 3.3b 3.88b 0.06a 0.044b ToZa7 Forl (θετικός μάρτυρας) 4.5c 2.84c 0.00a 0.026c x Οι τιμές εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σύμφωνα με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p=

86 Επίδραση των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της σήψης λαιμού και ριζών από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε γλάστρες Οι τεχνητές μολύνσεις μέσω της διαβροχής του υποστρώματος ανάπτυξης με τον φυτοπαθογόνο μύκητα ήταν επιτυχείς καθώς τα φυτά εμφάνισαν και στο λαιμό και στη ρίζα τυπικά συμπτώματα σήψης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πρώτων ενδεικτικών πειραμάτων (Πίν. Π4. και Π5 του Παραρτήματος) αποκλείστηκαν τα 4 από τα 12 στελέχη που δοκιμάστηκαν, εξαιτίας της αναποτελεσματικότητάς τους στη μείωση της έντασης της ασθένειας. Τα αποτελέσματα του πειράματος που πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια σε τρεις επαναλήψεις, με τα 8 καλύτερα ριζοβακτήρια Bacillus cereus Σ76, B. cereus Σ79, Serratia marscescens Σ47, S. marscescens Σ52, S. marscescens ΠιΧα5ΙΙ, S. rubidaea Σ49 και S. rubidaea Σ55, καθώς και το Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και το συνδυασμό όλων, παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες (Πιν. 6 και Πιν. 7). Σύμφωνα με τους πίνακες 6 και 7, από τα 7 βακτηριακά στελέχη που δοκιμάστηκαν μαζί σε γλάστρες, στις τρεις χρονικές επαναλήψεις του πειράματος, εναντίον του μύκητα Fοrl, όλα μείωσαν στατιστικά σημαντικά την ένταση της ασθένειας στην τομάτα, χωρίς να παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Αντίθετα με ότι συνέβη στο σύστημα gnotobiotic, τα στελέχη Σ76 και Σ79 του B. cereus ήταν αποτελεσματικά και μάλιστα το Σ79 παρουσίασε το μικρότερο δείκτη ασθένειας ανάμεσα στα 5 που δοκιμάστηκαν μαζί. Το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7 που δοκιμάστηκε ξεχωριστά, φαίνεται ότι είναι ίδιας αποτελεσματικότητας με τα παραπάνω 5 αφού μείωσε το δείκτη ασθένειας κατά 45%, ακριβώς όσο και το Σ79. Το ίδιο ακριβώς συνέβη και με το συνδυασμό όλων των στελεχών που δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά από το P. chlororaphis ΤοΖα7. Όσον αφορά στα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών, το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7, όπως και ο συνδυασμός των στελεχών, δεν επηρέασαν τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών, που είχαν μολυνθεί με το μύκητα, έναντι του θετικού μάρτυρα Fοrl. Ομοίως, βελτίωση στα χαρακτηριστικά ανάπτυξης της τομάτας δεν παρατηρήθηκε παρουσία του παθογόνου και κανένα από τα 8 βακτηριακά στελέχη, που δοκιμάστηκαν μαζί στις τρεις χρονικές επαναλήψεις δεν 86

87 Πιν. 6. Επίδραση ριζοβακτηρίων στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε γλάστρες Επεμβάσεις Δ.Α. Μήκος Βάρος Αριθμός Βλαστού Υπεργείου φύλλων (cm) (gr) Τομάτα (αρνητικός μάρτυρας) 1.06a x defg 2.11c 0.428ef Bacillus cereus Σ76 μάρτυρας 1.00a a 2.81a 0.795a Serratia marscescens Σ a abcd 2.57ab 0.674abc μάρτυρας Serratia rubidaea Σ55 μάρτυρας 1.03a bcdefg 2.26bc 0.481cdef Serratia rubidaea Σ49 μάρτυρας 1.09a abcde 2.53abc 0.571bcde Serratia marscescens Σ a abcdef 2.53abc 0.565bcde μάρτυρας Bacillus cereus Σ79 μάρτυρας 1.17a abc 2.40abc 0.641abcd S. marscescens ΠιΧα5-ΙΙ 1.26a ab 2.53abc 0.699ab μάρτυρας Forl + Bacillus cereus Σ b cdefg 2.54abc 0.527bcdef Forl + Serratia marscescens Σ b efg 2.41abc 0.471def Forl + S. marscescens ΠιΧα5-ΙΙ 2.24b efg 2.33bc 0.446def Forl + Serratia rubidaea Σ b cdefg 2.36abc 0.466def Forl + Serratia rubidaea Σ b g 2.10c 0.345f Forl + Bacillus cereus Σ b fg 2.24bc 0.433ef Forl + Serratia marscescens Σ b cdefg 2.66ab 0.482cdef Forl (θετικός μάρτυρας) 3.96c g 2.08c 0.364f x Οι τιμές εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σύμφωνα με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p=0.05 αύξησαν στατιστικά σημαντικά το μήκος του βλαστού, τον αριθμό των φύλλων και το βάρος του υπεργείου τμήματος, εκτός από το S. marscescens Σ47 που προκάλεσε μικρή αύξηση στον αριθμό των φύλλων. 87

88 Εντούτοις αξίζει να σημειωθεί ότι τα στελέχη του B. cereus Σ76, Σ79 και το στέλεχος ΠιΧα 5-ΙΙ του S. marscescens, στους αμόλυντους μάρτυρες προκάλεσαν στατιστικά σημαντική αύξηση στο μήκος του βλαστού έναντι της αμόλυντης τομάτας. Τα ίδια στελέχη και επιπλέον το S. marscescens Σ52 προκάλεσαν στατιστικά σημαντική αύξηση στο βάρος του υπεργείου. Τέλος μόνο το B. cereus Σ76 και το S. marscescens Σ52 αύξησαν στατιστικά σημαντικά τον αριθμό των φύλλων. Το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7 δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική βελτίωση των χαρακτηριστικών ανάπτυξης των φυτών. Πιν. 7. Επίδραση του ριζοβακτηρίου Pseudomonas chlororaphis ToZa7 και του συνδυασμού 8 ριζοβακτηρίων στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici σε γλάστρες Επεμβάσεις Δ.Α. Μήκος Βλαστού (cm) Αριθμός φύλλων Βάρος Υπεργείου (gr) Τομάτα (αρνητικός μάρτυρας) 1.00a x 17.09ab 2.90a 1.56a P. chlororaphis ToZa7 μάρτυρας 1.00a a 3.07a 1.60a Συνδυασμός 8 βακτηρίων 1.00a cd 3.00a 1.19b μάρτυρας Forl + P. chlororaphis ToZa7 1.91b bc 3.02a 1.27ab Forl + Συνδυασμός 8 βακτηρίων 1.96b 12.7c 3.07a 1.12b Forl (θετικός μάρτυρας) 3.46c bc 2.78a 1.05b x Οι τιμές εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σύμφωνα με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p=0.05 Από το επιπλέον πείραμα όπου δοκιμάστηκε η επίδραση των βακτηρίων στην ανάπτυξη της τομάτας λήφθηκαν τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον πίνακα 8. Σύμφωνα με τον Πιν. 8, μόνο τα στελέχη S. marscescens Σ47 και B. cereus Σ79 προκάλεσαν στατιστικά σημαντική αύξηση στο μήκος του βλαστού της τομάτας, ενώ δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους. Μόνο το S. marscescens Σ47 88

89 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση του βάρους του υπεργείου και μόνο το B. cereus Σ79 αύξησε στατιστικά σημαντικά τον αριθμό των φύλλων. Πιν. 8. Επίδραση ριζοβακτηρίων στην ανάπτυξη της τομάτας σε γλάστρες Επεμβάσεις Μήκος Βλαστού (cm) Βάρος Υπεργείου (gr) Αριθμός φύλλων Τομάτα (αρνητικός μάρτυρας) 14.75a x 2.09a 4.82a Pseudomonas chlororaphis ToZa a 2.07a 5.06ab Serratia marscescens Σ a 2.03a 4.8a Bacillus cereus Σ ab 2.39a 4.71a Serratia rubidaea Σ ab 2.04a 5.18ab Serratia rubidaea Σ ab 2.26a 5.14ab S. marscescens ΠιΧα5-ΙΙ 17.35ab 2.65ab 4.87a Bacillus cereus Σ b 2.73ab 5.6b Serratia marscescens Σ b 3.33b 5.2ab x Οι τιμές εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σύμφωνα με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p= Μελέτη της επίδρασης των νέων πιθανών βιοπαραγόντων στην ανάπτυξη της τομάτας και στην ένταση της ασθένειας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici στον αγρό Σύμφωνα με τα στοιχεία του πίνακα 9, η τεχνητή μόλυνση με το Forl είχε μικρό βαθμό επιτυχίας στον αγρό. Τόσο στο θετικό μάρτυρα όσο και στις επεμβάσεις με τους βιοπαράγοντες η ένταση της ασθένειας που σημειώθηκε ήταν πολύ χαμηλή. Επιπλέον δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο δείκτη ασθένειας μεταξύ του θετικού μάρτυρα και των επεμβάσεων. 89

90 Πιν. 9. Επίδραση ριζοβακτηρίων στην ανάπτυξη της τομάτας και στη σήψη λαιμού και ριζών από Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici στον αγρό Επεμβάσεις Δ.Α. Μήκος Βλαστού (cm) Αριθμός φύλλων Βάρος Υπεργείου (gr) Βάρος Ρίζας (gr) Άνθ η Καρπίδια Τομάτα (αρνητικός μάρτυρας) 1.00a x 67.43a 13.25a a 13.85b 6.33a 0.17b Pseudomonas 1.00a 61.22ab 12.73a a 14.96a 5.09a 1.6a chlororaphis ToZa7 μάρτυρας b b Bacillus cereus Σ a 60.85ab 12.00a a 19.41a ab μάρτυρας bc Forl + Pseudomonas chlororaphis ToZa ab 59.35b 12.00a a 12.9b 2.36 bc 0.8ab Forl + Bacillus cereus Σ ab 57.35b 12.58a a 11.67b 1.17c 0.6ab Forl (θετικός μάρτυρας) 1.727b 55.61b 11.82a a 11.15b 0.5c 0.0b x Οι τιμές εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους σύμφωνα με το κριτήριο Tukey σε επίπεδο σημαντικότητας p=0.05 Σχετικά με τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών μεταξύ των μολυσμένων φυτών δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε κανένα χαρακτηριστικό ανάπτυξης. Όμως μεταξύ των αμόλυντων φυτών παρουσιάστηκαν σε ορισμένα χαρακτηριστικά στατιστικά σημαντικές διαφορές. Η σημαντικότερη βελτίωση σημειώθηκε στο βάρος της ρίζας από το βακτήριο B. cereus Σ76, το οποίο διέφερε στατιστικά σημαντικά από τον αμόλυντο μάρτυρα. Το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7, επίσης προκάλεσε αύξηση του βάρους της ρίζας, δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά από το B. cereus Σ76, όμως δεν διέφερε από τον αρνητικό μάρτυρα ούτε και από το θετικό μάρτυρα Forl. Το B. cereus Σ76 ταυτόχρονα προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση στον αριθμό των ανθέων σε σχέση με τον 90

91 αμόλυντο αρνητικό μάρτυρα. Στατιστικά σημαντική αύξηση στον αριθμό των καρπιδίων προκάλεσε το P. chlororaphis ΤοΖα7, σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα. Το μήκος του βλαστού δεν επηρεάστηκε από τους βιοπαράγοντες ούτε ανάμεσα στα φυτά που μολύνθηκαν με Forl, ούτε ανάμεσα στα μη μολυσμένα. Εντούτοις, σημειώθηκε μείωση του μήκους του βλαστού στις επεμβάσεις όπου υπήρχε ο μύκητας σε σχέση με τον αμόλυντο μάρτυρα. Η παρουσία των βακτηρίων σε μολυσμένα με το μύκητα φυτά, δεν βελτίωσε το μήκος του βλαστού στατιστικά σημαντικά σε σχέση με το θετικό μάρτυρα Forl. Επίσης σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα, το χαρακτηριστικό αυτό δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά μεταξύ των φυτών που δέχτηκαν μόνο την επέμβαση βακτηρίου χωρίς παθογόνο μύκητα. Τέλος, από τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης δεν επηρεάστηκαν καθόλου ο αριθμός των φύλλων και το βάρος του υπεργείου, άσχετα από την παρουσία ή όχι του παθογόνου μύκητα Forl Συζήτηση Παρ όλο που ο αριθμός των βακτηριακών στελεχών που έχουν χαρακτηριστεί ως βιοπαράγοντες είναι μεγάλος, το μεγαλύτερο πρόβλημα της βιολογικής καταπολέμησης, για την εδραίωσή της ως μεθόδου καταπολέμησης των ασθενειών των φυτών, είναι η λεγόμενη «ασυνέπεια» (inconsistency) (Lughtenberg et al., 1999). Είναι εξάλλου γνωστό από τη βιβλιογραφία, ότι ανάλογα με τα εργαστηριακά πρωτόκολλα (συγκεντρώσεις παθογόνου και βιοπαράγοντα), τις συνθήκες ανάπτυξης (θερμοκρασία, υγρασία) και φυσικά ανάλογα με το θρεπτικό υπόστρωμα (ph, αναλογία C:N), οι βιοπαράγοντες είναι περισσότερο ή λιγότερο ανταγωνιστικοί (Kloepper et al., 1987; Whipps, 1987; Borowicz & Omer, 2000). Οι δοκιμές in planta στην παρούσα εργασία, ανέδειξαν 8 νέα βακτηριακά στελέχη τα οποία περιορίζουν σε διάφορους βαθμούς το καθένα, την ασθένεια της σήψης λαιμού και ριζών της τομάτας που προκαλείται από το μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici. Είναι πιθανό τα στελέχη Σ76 και Σ79 να είναι το ίδιο, δεδομένου ότι απομονώθηκαν από τον ίδιο ξενιστή και παρουσίασαν παρόμοια 91

92 συμπεριφορά και ιδιότητες. Σε γενικές γραμμές τα αποτελέσματα ανάμεσα στα πειράματα σε διαφορετικές συνθήκες (σύστημα gnotobiotic και γλάστρες) ήταν παρόμοια, ως προς το ότι επιβεβαίωσαν την ικανότητα των 8 στελεχών να μειώνουν το δείκτη της ασθένειας. Υπήρχαν βέβαια και περιπτώσεις, όπως το στέλεχος Bacillus cereus Σ79, που στη μία περίπτωση (γλάστρες) ήταν τα πιο αποτελεσματικό ως προς τη μείωση της έντασης της ασθένειας και στην άλλη όχι (σύστημα gnotobiotic) και αυτό εξηγείται σύμφωνα με την παραπάνω επισήμανση, περί της επίδρασης των διαφορετικών συνθηκών των πειραμάτων στα αποτελέσματα. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η πίεση του μολύσματος στα πειράματα στις γλάστρες ήταν ιδιαίτερα υψηλή, πράγμα που είχε ως αποτέλεσμα τους υψηλούς δείκτες ασθένειας, όπως φαίνεται στο θετικό μάρτυρα. Ενδεχομένως σε φυσικές μολύνσεις η επίδραση στη μείωση της ασθένειας να ήταν διαφορετική. Για το λόγο αυτό επιχειρήθηκε η δοκιμή στον αγρό. Από τη δοκιμή αυτή δεν μπορούν να βγουν για την ώρα ασφαλή συμπεράσματα. Η δοκιμή στον αγρό απαιτεί επανάληψη περισσότερες από μία φορές και βελτίωση ως προς τα εξής σημεία: θα πρέπει η διάρκεια του πειράματος να είναι μεγαλύτερη, ώστε να μελετηθεί η επίδραση των βιοπαραγόντων σε βάθος χρόνου και επίσης, να βελτιωθεί ο τρόπος εφαρμογής του μολύσματος, δεδομένου ότι η ασθένεια κυμάνθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα, ακόμα και στους θετικούς μάρτυρες. Είναι πιθανό η εφαρμογή του μολύσματος του παθογόνου μύκητα στον αγρό με μορφή κονιδίων, να μην επιτρέπει την επιβίωσή του και τη μόλυνση των φυτών της τομάτας. Ενδεχομένως η χρήση πιο δυνατών πολλαπλασιαστικών μονάδων, όπως τμήματα υφών να είχε το επιθυμητό αποτέλεσμα. Από τα 8 νέα βακτηριακά στελέχη που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη, τα 6 ανήκουν σε είδη βακτηρίων γνωστών στη βιβλιογραφία για τη δράση τους ως βιοπαραγόντων. Πρόκειται για τα στελέχη Bacillus cereus Σ76 και Σ79, Serratia marscescens Σ47, Σ52 και ΠιΧα5ΙΙ και το Pseudomonas chlororaphis ToZa7. Παράλληλα παρουσιάστηκε και η δράση ενός νέου στελέχους, του Serratia rubidaea Σ49 και του πανομοιότυπου Σ55, εναντίον του μύκητα, για το οποίο απ όσο μας είναι γνωστό δεν έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα στη βιβλιογραφία ως βιοπαράγοντας. Τα γένη Pseudomonas, και Bacillus ανήκουν στα πιο συχνά απαντώμενα ριζοβακτήρια τα οποία έχουν αναγνωριστεί ως αποτελεσματικοί βιοπαράγοντες, σε 92

93 διάφορους βαθμούς το καθένα. Για παράδειγμα, ανταγωνιστές του γένους Pseudomonas ήταν πιο αποτελεσματικοί σε σχέση με του γένους Bacillus εναντίον του Pythium ultimum, in vitro, αλλά μόνο τα είδη Pseudomonas κατέστειλαν την ασθένεια σε αγγουριά και τεύτλο (Georgakopoulos et al., 2002). Οι αναφορές στη βιβλιογραφία είναι πολυάριθμες και ορισμένες συζητήθηκαν στην εισαγωγή της διατριβής. Χαρακτηριστικός αντιπρόσωπος του B. cereus είναι το στέλεχος UW85 (ATCC53522), το οποίο είναι πολύ αποτελεσματικό στην καταστολή του φυτοπαθογόνου ωομύκητα Phytophthora medicaginis σε φυτά μηδικής (Milner et al., 1996). Η δράση του παραπάνω βακτηρίου έχει αποδοθεί στην παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών. Το ίδιο στέλεχος ελέγχθηκε επαρκώς από το Γραφείο Περιβαλλοντικής Προστασίας των ΗΠΑ (US Environmental Protection Agency) ώστε να προταθεί ως σκεύασμα για την κάλυψη σπόρων σόγιας (Emert et al., 1999). Επίσης είναι γνωστό ότι τα στελέχη του B. cereus παράγουν ένζυμα όπως χιτινάσες, αμυλάσες, γλουκανάσες και κυτταρινάσες, που λύουν τα κυτταρικά τοιχώματα των μυκήτων (Quan et al., 2010). Χιτινολυτικά ένζυμα παράγονται και από τα στελέχη του S. marcescens (Jones et al., 1986). Στελέχη του βακτηρίου έχουν αναφερθεί ως πολύ αποτελεσματικά ως προς τον έλεγχο φυτοπαθογόνων μυκήτων, όπως του Sclerotium rolfsii σε φυτά φασολιάς, φιστικιάς και ρεβυθιάς (Ordentlich, 1987) και του Fomes lamaoensis, σε φυτά τσαγιού (Camellia sinensis) (Chakraborty, 2010). Το βακτήριο P. chlororaphis είναι γνωστό για την ικανότητα παραγωγής, τόσο ενζύμων, όσο και αντιβιοτικών (Chin-A-Woeng et al., 1998). To στέλεχος P. chororaphis 1391 είναι γνωστό ότι μειώνει την ασθένεια της σήψης λαιμού και ριζών της τομάτας, που προκαλείται από το μύκητα Forl και η δράση του έχει αποδωθεί κυρίως στην παραγωγή του αντιβιοτικού φεναζίνη-1-καρβοξυαμίδη. Θεωρούμε ότι τα αποτελέσματα της δράσης των 8 βακτηριακών στελεχών επί του φυτοπαθογόνου μύκητα Forl πάνω σε φυτά τομάτας, σε συνδυασμό με τη δράση τους in vitro, όπως παρουσιάστηκαν στην παρούσα διατριβή, στοιχειοθετούν το χαρακτηρισμό τους ως βιοπαραγόντων. Ακόμα και με το επίπεδο δράσης που επέδειξαν στα πειράματα in planta, ενδεχομένως θα μπορούσαν να συνδυαστούν με περιορισμένες δόσεις χημικών σε προγράμματα ολοκληρωμένης καταπολέμησης. Ο στόχος όμως είναι να βελτιωθούν οι συνθήκες εφαρμογής των βιοπαραγόντων, ώστε 93

94 να σταθούν αυτόνομα ως φυτοπροσατευτικά μέσα, διότι είναι σημαντικό το ότι με τη χρήση αυτών επιτυγχάνεται μείωση της έντασης κάποιων ασθενειών, χωρίς παράλληλα να παρατηρείται κάποια αλλοίωση του οικοσυστήματος ή της υπάρχουσας βιοκοινότητας (Emmert et al., 1999). Ως προς τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης της τομάτας, θα πρέπει να διατυπωθεί ένας προβληματισμός, για το ποια από αυτά θεωρούνται αξιόπιστα ως δείκτες επίδρασης των βιοπαραγόντων. Όπως φάνηκε στην παρούσα εργασία, ο αριθμός των φύλλων δεν φαίνεται να είναι ένα αξιόπιστο κριτήριο, όπως επίσης και το πάχος βλαστού, με την επιφύλαξη της μικρής ηλικίας των φυτών, που σαφώς επηρεάζει την έκφραση διαφορών στα χαρακτηριστικά ανάπτυξης. Ο αριθμός των φύλλων και το βάρος του υπεργείου φάνηκαν περισσότερο αξιόπιστα, αλλά όχι σε όλες τις περιπτώσεις. Όλα τα παραπάνω χαρακτηριστικά έχουν ξεκάθαρα φανεί ότι επηρεάζονται από την παρουσία βιοπαραγόντων σε άλλες περιπτώσεις, όπως των P. chlororaphis PCL1391 και P. fluorescens WCS365 σε φασολιά (Bardas et al., 2009). Ενδεχομένως σε ένα φυτό με ταχεία αύξηση όπως η φασολιά, τα παραπάνω χαρακτηριστικά να είναι πιο αξιόπιστα. Με βάση τις μακροσκοπικές παρατηρήσεις (μη καταγεγραμμένα δεδομένα) θα πρέπει να αποφασιστεί αν στις μελλοντικές δοκιμές με τους νέους βιοπαράγοντες, θα πρέπει να συμπεριληφθεί το χαρακτηριστικό του βάρους της ρίζας, το οποίο φάνηκε να επηρεάζεται αισθητά. Στη ριζόσφαιρα, οι πιο συχνά απαντώμενοι μικροοργανισμοί είναι τα βακτήρια. Ως ριζοβακτήρια ορίζονται στη βιβλιογραφία τα βακτήρια της ριζόσφαιρας, τα οποία αποικίζουν επιθετικά το ριζικό σύστημα και τα οποία είναι ανταγωνιστικά, καθώς αναπαράγονται έντονα και καλύπτουν όλες τις οικοφωλεές που βρίσκονται στη ρίζα (Antoun and Kloepper, 2001). Απαραίτητο συμπλήρωμα στην εργασία αυτή θεωρείται η μελέτη του αποικισμό της ρίζας από τους νέους βιοπαράγοντες και η διεξαγωγή μικροσκοπικών μελετών. 94

95 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Απομόνωση και διαχωρισμός αντιμυκητιακών μεταβολιτών από τους νέους βιοπαράγοντες 4.1. Εισαγωγή Από τις δοκιμές in planta έγινε φανερό ότι τα 8 επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη είναι όλα αποτελεσματικά ως προς τη μείωση της ασθένειας της σήψης λαιμού και ριζών που προκαλείται στην τομάτα από το μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. Για το λόγο αυτό προτάθηκε να τους αποδοθεί ο χαρακτηρισμός «βιοπαράγοντες». Όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω, οι πιθανοί μηχανισμοί δράσης των βιοπαραγόντων σε ένα παθοσύστημα, είναι ο ανταγωνισμός, ο μυκοπαρασιτισμός, η αντιβίωση και η πρόκληση αντοχής στο φυτό-ξενιστή. Για τη διαπίστωση των δύο πρώτων μηχανισμών μεταξύ άλλων μεθόδων κύριο λόγο έχουν οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις. Η μελέτη της πρόκλησης αντοχής στον ξενιστή, στο παθοσύστημα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία, εξαιτίας του ότι το παθογόνο και ο βιοπαράγοντας δεν διαχωρίζονται ως προς το σημείο εφαρμογής, που είναι η ρίζα, απαιτεί σύνθετες μεθόδους ανάλυσης για να αποδειχθεί. Εντούτοις, υπήρχαν πολλές ενδείξεις ιδιαίτερα στις in vitro μελέτες ότι οι 8 επιλεγμένοι βιοπαράγοντες δρουν μέσω της αντιβίωσης και εν μέρει του μυκοπαρασιτισμού. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτή η υπόθεση, πραγματοποιήθηκαν 3 βιοδοκιμές, στις οποίες δοκιμάστηκαν επί του φυτοπαθογόνου μύκητα ουσίες, που παράγονται από τα επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη, τόσο στο ακατέργαστο υπερκείμενο φυγοκέντρησης υγρής καλλιέργειας, όσο και στο εκχύλισμα αυτού με οργανικό διαλύτη. Στην πρώτη βιοδοκιμή, ελέγχθηκε η ικανότητα εκχυλισμάτων από υπερκείμενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των στελεχών Bacillus cereus Σ76 και Σ79, Serratia rubidaea Σ49 και Σ55, Serratia marcescens Σ57, Σ52 και ΠιΧα5ΙΙ και Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, να αναστέλλουν τη βλάστηση των κονιδίων 95

96 και τη μυκηλιακή ανάπτυξη του Forl, όταν διαχέονται στο μέσο στο οποίο αναπτύσσεται ο μύκητας. Αφού διαπιστώθηκε στην πρώτη δοκιμή ότι από τα υπερκείμενα φυγοκέντρησης των υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων εκχυλίζονται ουσίες με ανασταλτική δράση επί της ανάπτυξης του μύκητα, στη συνέχεια επιχειρήθηκε διαχωρισμός αυτών σε πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας και μελέτη της ανασταλτικής δράσης των ουσιών που προέκυψαν από αυτόν το διαχωρισμό, στη βλάστηση των κονιδίων και στην περαιτέρω ανάπτυξη του μύκητα. Τέλος στην τρίτη βιοδοκιμή ελέχθηκε η αναστολή βλάστησης των κονιδίων και της ανάπτυξης του παθογόνου μύκητα, σε υγρό μέσο, παρουσία ακατέργαστων υπερκειμένων φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων καθώς και εκχυλισμάτων τους Υλικά και Μέθοδοι Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- από οργανικά εκχυλίσματα καλλιεργειών των νέων βιοπαραγόντων- Βιοδοκιμή του διηθητικού χαρτιού Παραγωγή βακτηριακού διηθήματος και εκχύλισή του Τα βακτηριακά στελέχη Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Serratia rubidaea Σ49, S. rubidaea Σ55, S. marscescens Σ47, S. marscescens Σ52, S. marscescens ΠιΧα5ΙΙ και Bacillus cereus Σ79, αναπτύχθηκαν το καθένα σε δοκιμαστικό σωλήνα, σε 3ml LC medium, για 24 ώρες (Α), σε 3ml LC για 72 ώρες (Β) και σε κωνική φιάλη με 50ml LC για 48 ώρες (Γ), σε αναδευόμενο επωαστήρα στις 150 στροφές/λεπτό και σε θερμοκρασία 25 o C. Με το πέρας του χρόνου επώασης, οι υγρές καλλιέργειες μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες και φυγοκεντρήθηκαν. Για τις περιπτώσεις (Α) και (Β) η φυγοκέντρηση έγινε σε σηλήνες eppendorf, στα rpm για 1 min. Ακολούθησε εκχύλιση 2 ml των υπερκείμενων με ίσους όγκους οξικού αιθυλεστέρα 96

97 και στη συνέχεια συμπύκνωση μέχρι ξηρού, κάτω από ροή αέριου Ν 2. Τα τελικά ιζήματα επαναδιαλύθηκαν σε 500μl οξικού αιθυλεστέρα. Στη περίπτωση (Γ), η φυγοκέντρηση έγινε σε σωλήνες Falcon, στα 6000 rpm, στους 25 o C, για 20 λεπτά ώστε να απομακρυνθούν τα βακτηριακά κύτταρα. Στη συνέχεια, περίπου 40ml από το κάθε υπερκείμενο, λήφθηκαν με προσοχή με τη βοήθεια σιφωνίου και μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες Falcon. Ακολούθησε εκχύλισή τους με ίσους όγκους οξικού αιθυλεστέρα και στη συνέχεια συμπύκνωση μέχρι ξηρού κάτω από ροή αέριου Ν 2. Για την περίπτωση (Γ) η συμπύκνωση έγινε αρχικά σε περιστρεφόμενο συμπυκνωτή υπό κενό και στη συνέχεια κάτω από ροή αέριου αζώτου. Το τελικό ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 500μl οξικού αιθυλεστέρα. Βιοδοκιμή του διηθητικού χαρτιού Διηθητικό χαρτί Whatman Νο 1 (Whatman International, Maidstone, England), κόπηκε σε μικρούς δίσκους διαμέτρου 4mm και αποστειρώθηκε στους 120 ο C, για 20min. Σε κάθε δίσκο διηθητικού χαρτιού μεταφέρθηκαν με μηχανικό σιφώνιο 100μl βακτηριακού εκχυλίσματος και ακολούθως οι δίσκοι αφέθηκαν να στεγνώσουν τελείως, για 30 min, στο θάλαμο νηματικής ροής. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε οξικός αιθυλεστέρας, ίσου όγκου, ο οποίος είχε υποστεί τις ίδιες ακριβώς μεταχειρίσεις με τα υπόλοιπα εκχυλίσματα, ώστε να αποκλειστεί η πιθανή ανασταλτική δράση του διαλύτη επί του Forl. Ως μέτρο σύγκρισης της δράσης των εκχυλισμάτων χρησιμοποιήθηκε ανάλογο εκχύλισμα του γνωστού βιοπαράγοντα Pseudomonas fluorescens F113, το οποίο είναι γνωστό ότι δρα δια της παραγωγής του αντιβιοτικού 2,4 διακετυλοφλορογλουκινόλη (DAPG, 2,4 diacetylphloroglucinol) (Shanahan, 1992). Τρυβλία με LC-agar εμβολιάστηκαν με κονίδια του μύκητα Forl, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο (στη βιοδοκιμή λύσης υφών), με τελική συγκέντρωση κονιδίων στο θρεπτικό μέσο 4 x 10 4 κονίδια/ ml. Στη συνέχεια 4-5 δίσκοι διηθητικού χαρτιού που έφεραν βακτηριακό εκχύλισμα, τοποθετήθηκαν στην επιφάνεια κάθε τρυβλίου στις νοητές γωνίες ενός τετραγώνου ή πεντάγωνου (Εικ. 16). Κάθε εκχύλισμα δοκιμάστηκε σε 3 επαναλήψεις-διηθητικά χαρτιά. Το πείραμα εκτελέστηκε μία φορά για κάθε περίπτωση (Α), (Β) και (Γ). 97

98 Εικ. 16. Δίσκοι διηθητικού χαρτιού που φέρουν εκχυλίσματα καλλιεργειών των βιοπαραγόντων επί LC - agar που φέρει κονίδια του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Παρατηρήσεις Τις επόμενες δέκα ημέρες καθώς και μέχρι τη συμπλήρωση ενός μήνα, τα τρυβλία ελέγχονταν μακροσκοπικά, για το σχηματισμό ζωνών αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα Forl γύρω από τα διηθητικά χαρτιά, που περιείχαν εκχυλίσματα των στελεχών P. chlororaphis ΤοΖα7, S. rubidaea Σ49, S. rubidaea Σ55, S. marscescens Σ47, S. marscescens Σ52, S. marscescens ΠιΧα5ΙΙ, B. cereus Σ79, και το μάρτυρα Διαχωρισμός δραστικών συστατικών οργανικών εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βιοπαραγόντων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας- Βιοδοκιμή TLC Παραγωγή βακτηριακού διηθήματος και εκχύλισή του Σε αυτή τη δοκιμή χρησιμοποιήθηκαν 6 βακτηριακά στελέχη, τα Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 Serratia rubidaea Σ49, S. rubidaea Σ55, S. marscescens Σ47, S. marscescens ΠιΧα5ΙΙ και Bacillus cereus. Δεν συμπεριλήφθηκαν τα B. cereus Σ79 και S. marscescens Σ52, λόγω του ότι θεωρήθηκαν ίδια στελέχη με τα Σ76 και Σ47 αντίστοιχα. Τα βακτήρια αναπτύχθηκαν σε 500ml LC μοιρασμένα σε δύο κωνικές φιάλες των 500ml, από 250ml στην καθεμία. Η επώαση έγινε σε αναδευόμενο επωαστήρα στις 150 στροφές/ λεπτό και σε θερμοκρασία 25 o C, για τρεις ημέρες. Με το πέρας του χρόνου επώασης, οι 98

99 καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν στα 6000rpm, για 20min και το υπερκείμενο συλλέχθηκε με προσοχή και εκχυλίστηκε με οξικό αιθυλεστέρα. Αναλυτικά, το υπερκείμενο αναμείχθηκε με ίσο όγκο οργανικού διαλύτη, σε διαχωριστικό χωνί. Ακολούθησε ισχυρή ανάδευση και αφού συλλέχθηκε η οργανική φάση, συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού, σε περιστρεφόμενο συμπυκνωτή, υπό κενό. Η τελική συμπύκνωση έγινε μέχρι ξηρού κάτω από ροή αέριου Ν 2 και το τελικό ίζημα αναδιαλύθηκε σε 1ml οξικού αιθυλεστέρα. Αντίστοιχα, 500ml οξικού αιθυλεστέρα συμπυκνώθηκαν με την ίδια διαδικασία μέχρι το 1ml ώστε να αποτελέσουν το μάρτυρα στη βιοδοκιμή που ακολούθησε. Διαχωρισμός ουσιών με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και βιοδοκιμή Για να διαχωριστούν οι διάφορες ουσίες, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στο ότι οι διάφορες ουσίες που περιέχονται στο υπό εξέταση δείγμα μετακινούνται επί της πλάκας με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με την πολικότητα τους και εμφανίζονται με τη μορφή διακριτών κηλίδων. Για το διαχωρισμό των ουσιών που εκχυλίστηκαν και τη βιοδοκιμή που ακολούθησε, χρησιμοποιήθηκαν αλουμινένιες πλάκες χρωματογραφίας, επιστρωμένες με μια λεπτή στοιβάδα γέλης οξειδίου του πυριτίου (Silica gel 60 F 254, C 18 normal phase, Merck, Darmstadt, Germany). Στη δοκιμή αυτή χρησιμοποιήθηκαν 2 πλάκες, όπου σε κάθε μία τοποθετήθηκαν τα εκχυλίσματα από καλλιέργειες τριών βακτηρίων και ο μάρτυρας. Τα τέσσερα συνολικά δείγματα, τοποθετήθηκαν το καθένα υπό τη μορφή κηλίδας, στο κάτω μέρος της πλάκας, σε απόσταση 1cm από τις περιφέρειες και 2cm μεταξύ τους. Με τη βοήθεια μηχανικού σιφωνίου έγινε σε κάθε θέση ενστάλαξη 120μl βακτηριακού εκχυλίσματος ή μάρτυρα. Κατ εξαίρεση για το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7, έγινε ενστάλλαξη 75μl εκχυλίσματος. Στη συνέχεια η πλάκα τοποθετήθηκε όρθια εντός γυάλινου θαλάμου, στον οποίο είχε ήδη εισαχθεί μίγμα μεθανόλης : νερού σε αναλογία 60:40, έτσι ώστε η στάθμη του διαλύτη να βρίσκεται σε ύψος κάτω από αυτό των κηλίδων. Οι διαλύτες είχαν τοποθετηθεί εντός του θαλάμου τουλάχιστον 10 min πριν την τοποθέτηση της πλάκας, ώστε να έχει κορεσθεί ο υπερκείμενος χώρος από τους ατμούς των διαλυτών. Ακολούθως, έγινε η έκλουση και ο διαλύτης αφέθηκε να 99

100 ανέλθει με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων, μέχρι το μέτωπό του να φτάσει ένα εκατοστό πριν το άνω άκρο της πλάκας. Μετά την έκλουση, οι πλάκες αφού εξετάστηκαν μακροσκοπικά για την παρουσία διακριτών κηλίδων στην επιφάνεια του υλικού τους, αφέθηκαν να στεγνώσουν τελείως σε ρεύμα αέρα, υπό ασηπτικές συνθήκες στο θάλαμο νηματικής ροής, για περίπου μία ώρα μέσα σε τετράγωνα τρυβλία. Στη συνέχεια, οι πλάκες τοποθετήθηκαν καλύφθηκαν με θρεπτικό υπόστρωμα LC, που περιείχε κονίδια του φυτοπαθογόνου μύκητα σε συγκέντρωση 4 x 10 4 κονίδια/ml. Τα τρυβλία τοποθετήθηκαν για επώαση στους 25 ο C, για τρεις ημέρες. Σε κάθε δοκιμή κάθε εκχύλισμα δοκιμάστηκε μία φορά και η δοκιμή επαναλήφθηκε στο χρόνο 3 φορές. Παρατηρήσεις Για 10 ημέρες μετά την επώαση καθώς και μέχρι τη συμπλήρωση ενός μήνα, τα τρυβλία ελέγχονταν μακροσκοπικά για αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα, επί του υλικού της χρωματογραφικής πλάκας και επί της γραμμής έκλουσης των εκχυλισμάτων των στελεχών Serratia marcescens Πιχα5ΙΙ, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Serratia marcescens Σ47, Serratia rubidaea Σ55 και Σ49, και Bacillus cereus Σ76 και του μάρτυρα. Στα σημεία όπου παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα υπολογίστηκαν οι τιμές Rf Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- από ακατέργαστα υπερκείμενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων και από οργανικά εκχυλίσματά τους - Βιοδοκιμή microtiter Παραγωγή και μέτρηση του μολύσματος Forl, λήψη διηθήματος και παραγωγή εκχυλίσματος καλλιέργειας βακτηρίων Η παραγωγή μολύσματος έγινε όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Η τελική συγκέντρωση του μολύσματος του μύκητα ήταν 1,5 x 10 4 σπόρια/ml. 100

101 Τα 6 στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη δοκιμή ήταν τα ίδια με εκείνα στη δοκιμή TLC, δηλαδή, τα Serratia marcescens Πιχα5ΙΙ και Σ47, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Serratia rubidaea Σ55 και Σ49, και Bacillus cereus Σ76. Τα βακτήρια αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε 7 ml LC. Μετά το πέρας των 24 ωρών, φυγοκεντρήθηκαν στα 6000rpm, για 20min, και 75μl από το υπερκείμενο κάθε καλλιέργειας διηθήθηκε σε αποστειρωμένα φίλτρα 0,45μm πριν τη χρήση του, ώστε να αποκλειστεί η παρουσία βακτηριακών κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκαν τα εκχυλίσματα που παραλήφθηκαν όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Συγκεκριμένα, 75μl κάθε εκχυλίσματος συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού, κάτω από ροή αερίου Ν 2 και το ίζημα αναδιαλύθηκε σε 75μl νερό απεσταγμένο και αποστειρωμένο. Μεταχειρίσεις Πειραματικός σχεδιασμός Η δοκιμή έγινε σε μικροπλάκα πολυστυρενίου (microtiter) των 96 πηγαδιών. Η ανάπτυξη του μύκητα μετρήθηκε δια της οπτικής πυκνότητας, σε μήκος κύματος 620nm. Συγκεκριμένα, στη βιοδοκιμή των εκχυλισμάτων ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε αιώρημα κονιδίων του Forl σε 2ΧCzapek - Dox και νερό σε αναλογία 50:50 (v:v). Στη βιοδοκιμή των διηθημάτων ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε αιώρημα κονιδίων του Forl σε 2ΧCzapek - Dox και LC 50:50 (v:v). Τέλος ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα τα εκχυλίσματα των βιοπαραγόντων, όπως και τα διηθημάτων των καλλιεργειών τους χωρίς το μύκητα. Συμπερασματικά, οι μεταχειρίσεις ήταν οι εξής: 1. Αιώρημα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox:νερό, 50:50 (v:v) (τελικός όγκος 150μl) (Forl σε 2ΧCD: νερό, θετικός μάρτυρας εκχυλισμάτων) 2. Εκχυλίσματα των Σ47, Σ49, Σ55, Σ76, ΠιΧα5ΙΙ και ΤοΖα7 (75μl) μαζί με αιώρημα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox (75μl), 50:50 (v:v) (τελικός όγκος 150μl) (Forl σε 2ΧCD: Εκχύλισμα βακτηρίου) 3. Εκχυλίσματα των Σ47, Σ49, Σ55, Σ76, ΠιΧα5ΙΙ και ΤοΖα7 (75μl) + 2ΧCzapek Dox (75μl), 50:50 (v:v) (τελικός όγκος 150μl) (αρνητικός μάρτυρας εκχυλισμάτων) 101

102 4. Αιώρημα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox: LC, 50:50 (v:v) (τελικός όγκος 150μl) (Forl σε 2ΧCDox: LC,θετικός μάρτυρας υπερκειμένων) 5. Υπερκείμενα των Σ47, Σ49, Σ55, Σ76, ΠιΧα5ΙΙ και ΤοΖα7 (75μl) μαζί με αιώρημα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox (75μl) 50:50 (v:v) (τελικός όγκος 150μl) (Forl σε 2ΧCD : υπερκείμενο βακτηρίου) 6. Υπερκείμενα των Σ47, Σ49, Σ55, Σ76, ΠιΧα5ΙΙ και ΤοΖα7 (75μl) + 2ΧCzapek Dox 50:50 (v:v) (τελικός όγκος 150μl) (αρνητικός μάρτυρας υπερκειμένων) Κάθε μεταχείριση επαναλήφθηκε τρεις φορές, συμπληρώθηκαν δηλαδή τρία πηγαδάκια στη μικροπλάκα. Σε όλα τα πηγαδάκια ο όγκος του υλικού πλήρωσης ήταν 150μl. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν για επώαση στους 25 o C και ανά 6 ώρες, για 96 ώρες, μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα σε μήκος κύματος 620nm, σε φασματοφωτόμετρο (JENWAY 6405). Μετά τις 96 ώρες, η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας συνεχίστηκε ανά 12 ώρες, για ακόμα 3 μετρήσεις μέχρι να σταθεροποιηθεί η τιμή της οπτικής πυκνότητας. Το πείραμα εκτελέστηκε 2 φορές. Μετρήσεις και στατιστική επεξεργασία των δεδομένων Με τα δεδομένα της οπτικής πυκνότητας των εκχυλισμάτων έγιναν οι εξής υπολογισμοί: Έστω Α: ο θετικός μάρτυρας Forl σε 2ΧCzapek Dox:νερό, Β: τα εκχυλίσματα των διηθημάτων των βακτηρίων σε νερό μαζί με αιώρημα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox και Γ: τα εκχυλίσματα των διηθημάτων των βακτηρίων σε νερό και Czapek. Για τη σύγκριση του Α με το Β, υπολογίστηκε ο μέσος όρος των τριών τιμών του Γ και αφαιρέθηκε από κάθε τιμή του Β. Από αυτές τις τιμές προέκυψε ένας μέσος όρος ο οποίος στη συνέχεια συγκρίθηκε με το μέσο όρο των τιμών του Α. Το αντίστοιχο έγινε και με τα δεδομένα της οπτικής πυκνότητας των διηθημάτων. Έστω Α : ο μάρτυρας Forl σε 2ΧCzapek Dox:LC, Β : τα διηθήματα των βακτηρίων σε νερό μαζί με αιώρημα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox και Γ : τα διηθήματα των βακτηρίων και 2ΧCzapek Dox. Για τη σύγκριση του Α με το Β υπολογίστηκε ο μέσος όρος των τριών τιμών του Γ και αφαιρέθηκε από κάθε τιμή 102

103 του Β. Από αυτές τις τιμές προέκυψε ένας μέσος όρος ο οποίος στη συνέχεια συγκρίθηκε με το μέσο όρο των τιμών του Α. Η στατιστική επεξεργασία των δεδομένων έγινε στο πρόγραμμα EXCEL και οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν μεταξύ τους με το κριτήριο LSD Αποτελέσματα Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici- από οργανικά εκχυλίσματα καλλιεργειών των νέων βιοπαραγόντων- Βιοδοκιμή του διηθητικού χαρτιού Κατά τις μακροσκοπικές παρατηρήσεις συγκρίθηκε η ανάπτυξη του μύκητα στα τρυβλία, που περιείχαν μόνο κονίδια του μύκητα, με αυτά που είχαν τα εκχυλίσματα των βακτηρίων πάνω σε δίσκους διηθητικού χαρτιού. Επίσης ελέγχθηκαν τα διηθητικά χαρτιά που περιείχαν μόνο τον μάρτυρα για ανασταλτική δράση. Τέλος συγκρίθηκαν μεταξύ τους οι πειραματικές συνθήκες Α, Β και Γ ως προς τη διαφορά της δράσης των εκχυλισμάτων που λήφθηκαν σε κάθε περίπτωση. Σε καμία επανάληψη δεν παρατηρήθηκε ανασταλτική δράση του μάρτυρα οξικού αιθυλεστέρα, ενώ όλα τα εκχυλίσματα έδειξαν να αναστέλλουν τη μυκηλιακή ανάπτυξη. Σημαντική παρατήρηση είναι το ότι τα στελέχη B. cereus Σ76 και Σ79, ενώ στη βιοδοκιμή λύσης υφών (Κεφ. 1) είχαν την ισχυρότερη δράση, στην παρούσα ήταν αυτά με τα λιγότερο έντονα αποτελέσματα. Αντίθετα, τα S. marcescens ΠιΧα5ΙΙ και Σ52 στη βιοδοκιμή λύσης υφών παρουσίασαν μέτρια δράση ενώ στην παρούσα, ειδικά στην επέμβαση Γ, εμφάνισαν πολύ έντονα αποτελέσματα (Εικ. 17). 103

104 Εικ. 17. Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από οργανικά εκχυλίσματα καλλιεργειών των νέων βιοπαραγόντων. Βιοδοκιμή του διηθητικού χαρτιού Τέλος, αξιοσημείωτο είναι και το ότι δε παρατηρήθηκαν έντονες διαφορές ως προς τη μακροσκοπική εικόνα των επεμβάσεων Α και Β αλλά αυτές οι δύο συγκριτικά με την επέμβαση Γ είχαν λιγότερο έντονα αποτελέσματα. Αυτή η παρατήρηση ήταν αναμενόμενη καθώς, η επέμβαση Γ περιελάμβανε εκχυλίσματα τα οποία αναμένονταν να έχουν μεγαλύτερη συγκέντρωση δραστικών ουσιών, καθώς προέρχονταν από υγρές καλλιέργειες 15 φορές μεγαλύτερες σε όγκο (50ml LC έναντι 3ml LC) και δεδομένου ότι οι συμπυκνώσεις έγιναν στον ίδιο τελικό όγκο Διαχωρισμός δραστικών συστατικών οργανικών εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βιοπαραγόντων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας- Βιοδοκιμή TLC Μετά το πέρας τριών ημερών άρχισαν να φαίνονται λιγότερο ή περισσότερο έντονα, ανάλογα με το βακτηριακό στέλεχος, κηλίδες όπου σημειώθηκε απουσία βλάστησης κονιδίων και ανάπτυξης μυκηλιακών υφών του Forl. Οι μεταβολίτες όλων των βακτηρίων εμπόδισαν σε διάφορους βαθμούς την ανάπτυξη του μύκητα, ενώ καμία αναστολή δεν παρατηρήθηκε στη θέση του μάρτυρα. Από 6 βακτηριακά στελέχη που δοκιμάστηκαν εντονότερη δράση παρουσίασε το στέλεχος P. chlororaphis ΤοΖα7. Σε κάθε στέλεχος παρατηρήθηκε μία κηλίδα αναστολής (Εικ. 18). Τα Rf που υπολογίστηκαν για τις κηλίδες αναστολής που προκάλεσαν τα εκχυλίσματα των στελεχών P. chlororaphis ΤοΖα7, S. rubidaea Σ55 και Σ49 και B. cereus Σ76, ήταν 104

105 αντίστοιχα 0,69, 0,77, 0,85 και 0,81. Ο μάρτυρας του οξικού αιθυλεστέρα, όπως ήταν αναμενόμενο, δεν παρουσίασε καμία κηλίδα αναστολής. ομοίως, στη δεύτερη και τρίτη επανάληψη της βιοδοκιμής, φάνηκε και η αναστολή της ανάπτυξης του Forl που προκαλούν και τα S. marcescens ΠιΧα5ΙΙ και Σ47 (Εικ. 19). Τα Rf που υπολογίστηκαν για τις κηλίδες αναστολής που προκάλεσαν τα εκχυλίσματα των στελεχών S. marcescens ΠιΧα5ΙΙ και Σ47, ήταν αντίστοιχα 0,75 και 0,68. Εικ. 18. Κηλίδες όπου σημειώθηκε απουσία βλάστησης κονιδίων και ανάπτυξης μυκηλιακών υφών του Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici λόγω της παρουσίας μεταβολιτών των στελεχών P. chlororaphis ΤοΖα7, S. rubidaea Σ55 και Σ49 και B. cereus Σ76 Εικ. 19. Κηλίδες όπου σημειώθηκε απουσία βλάστησης κονιδίων και ανάπτυξης μυκηλιακών υφών του Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici λόγω της παρουσίας μεταβολιτών των στελεχών S. marcescens ΠιΧα5ΙΙ και Σ47 105

106 Αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από οργανικά εκχυλίσματα υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων, και από τα ακατέργαστα διηθημάτων τους-βιοδοκιμή microtiter Τα αποτελέσματα των μετρήσεων της ανάπτυξης του μύκητα παρουσία διηθημάτων και εκχυλισμάτων των βιοπαραγόντων Bacillus cereus Σ76, Serratia marscescens Σ47 και ΠιΧα5ΙΙ, S. rubidaea Σ49 και Σ55 και Pseudomonas chlororaphis ToZa7 παρουσιάζονται στις εικόνες 20 και 21. Τα υπερκείμενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών όλων των βακτηριακών στελεχών προκάλεσαν στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης του παθογόνου, όπως φάνηκε από τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (Εικ. 20). Αντίθετα, από τα εκχυλίσματα (Εικ. 21) μόνο εκείνα των στελεχών B. cereus Σ76, S. marscescens ΠιΧα5ΙΙ, και Pseudomonas chlororaphis ToZa7 προκάλεσαν στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης του μύκητα. Τα εκχυλίσματα των στελεχών S. marcescens Σ47, S. rubidaea Σ49 και Σ55, αντίθετα προκάλεσαν στατιστικά σημαντική αύξηση της ανάπτυξης του Forl σε σχέση με το μάρτυρα. LSD0.05= Εικ. 20. Ανάπτυξη του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici παρουσία υπερκείμενων υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων Bacillus cereus Σ76, Serratia marscescens Σ47 και ΠιΧα5ΙΙ, S. rubidaea Σ49 και Σ55 και Pseudomonas chlororaphis ToZa7 106

107 LSD 0.05 = Εικ. 21. Ανάπτυξη του μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici παρουσία εκχυλισμάτων υγρών καλλιεργειών των βιοπαραγόντων Bacillus cereus Σ76, Serratia marscescens Σ47 και ΠιΧα5ΙΙ, S. rubidaea Σ49 και Σ55 και Pseudomonas chlororaphis ToZa7 107