«ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ HPV ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΤΟΣ»

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ HPV ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΤΟΣ» ΜΑΡΙΑ Κ. ΚΟΥΒΟΥΣΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΘΗΝΑ ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ

2 6

3 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ HPV ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΤΟΣ» ΜΑΡΙΑ Κ. ΚΟΥΒΟΥΣΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΣ ΠΑΤΣΟΥΡΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ: ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΣ ΠΑΤΣΟΥΡΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΔΡΕΑΣ Χ. ΛΑΖΑΡΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΙΚΛΕΙΑ ΓΑΚΙΟΠΟΥΛΟΥ, ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 19/11/2014 7

4 8

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η σχέση μεταξύ του HPV και του καρκίνου Κεφαλής και του Τραχήλου έχει πρόσφατα ερευνηθεί εκτενώς. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανίχνευση HPV στελεχών, καθώς και έκφραση του mrna των Ε6 / Ε7 γονιδίων των υψηλού κινδύνου στελεχών HPV (16, 18, 31, 33 και 45) σε όγκους του στόματος (OSCCs) από 81 Έλληνες ασθενείς. Ο συνολικός επιπολασμός των HPV DNA θετικών OSCCs ήταν 11,1% (9/81), ενώ HPV DNA στελεχών υψηλού κινδύνου βρέθηκε στο 8,6% (7/81) των OSCCs. Ανίχνευση του mrna των Ε6 / Ε7 γονιδίων πραγματοποιήθηκε στο 4,9% (4/81) των δειγμάτων. Δεν βρέθηκε κάποια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ανίχνευσης του HPV και της επιβίωση των ασθενών. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχει σχέση μεταξύ των HPV θετικών καρκινωμάτων και της αποχή από τους παράγοντες κινδύνου, όπως το κάπνισμα και η κατανάλωση αλκοόλ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το στέλεχος HPV 16 ήταν αυτό με τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης μεταξύ των HPV-θετικών OSCCs, και σε σχέση με την ανίχνευση του DNA του ιού και σε σχέση με την ανίχνευση του mrna του ιού. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει την επικράτηση των λοιμώξεων με στελέχη υψηλού κινδύνου μεταξύ των ασθενών με HPV θετικά OSCCs. Μελλοντικές αναλύσεις περισσότερων OSCCs θα μας δώσει τη δυνατότητα συσχέτισης της ανίχνευση του ιού HPV και της κλινικής έκβασης. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ : Ιολογική Ογκολογία ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ : Καρκίνος του στόματος, HPV 9

6 ABSTRACT The relation between HPV and head and neck cancer has recently and extensively been investigated. The purpose of this study was to indentify HPV genotypes, as well as E6/E7 mrna expression of high-risk HPVs (16, 18, 31, 33 and 45) in oral squamous cell carcinomas (OSCCs) from 81 Greek patients. The overall prevalence of HPV DNA positive OSCCs was 11.1% (9/81), while high-risk HPV DNA was found in 8,6% (7/81) of OSCCs. E6/E7 mrna was detected in 4,9% (4/81) of the oral cavity samples. We were not able to find any statistical significant correlation between HPV detection and patient s survival. Nevertheless our results show a correlation between HPV positive carcinomas and the abstention from risk factors such as smoking and alcohol consumption. Our data indicated that HPV 16 was the commonest genotype identified in HPV-positive OSCCs by both DNA and RNA tests. This study confirms the prevalence of High-Risk HPV infections among patients with HPV-positive OSCCs. Future analysis and followup of more OSCCs will enable us to correlate HPV detection and clinical outcome. SUBJECT AREA: Viral Oncology KEY WORDS: Oral Squamous Cell Carcinomas, HPV 10

7 Στον μπαμπά μου, Κωνσταντίνο Κουβούση Η επιστήμη πάντοτε κάνει λάθη. Ποτέ δεν έλυσε ένα πρόβλημα, χωρίς να θέσει ένα άλλο «Τζορτζ Μπερναρντ Σο» 11

8 12

9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής θα ήθελα να ευχαριστήσω τη διευθύντρια του τμήματος ιολογίας του νοσοκομείου «Άγιος Σάββας», κυρία Εύη Πανοτοπούλου, όχι μόνο για τη συμβολή της στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας, αλλά και για την στήριξη και τη συμπαράστασή της τα τελευταία δέκα χρόνια. Στη συνέχεια θα ήθελα να ευχαριστήσω τις υποψήφιες διδάκτορες βιολόγους Έλενα Αργύρη και Ελπίδα Τσιμπλάκη καθώς και την ιατρό ακτινοθεραπεύτρια, επιμελήτρια του τμήματος ακτινοθεραπείας του νοσοκομείου «Άγιος Σάββας» Δήμητρα Ξεσφύγγη, για τη βοήθειά τους στη συλλογή και επεξεργασία των δειγμάτων, στην καταγραφή των ιστορικών των ασθενών, στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, στη συγγραφή του επιστημονικού άρθρου καθώς και για τα σχόλιά τους για το περιεχόμενο της εργασίας. Επίσης, είναι απαραίτητο να αναφέρω την υπομονή της οικογένειάς μου, του συζύγου μου Γαβριήλ Μαμαλίγκα, των παιδιών μου Κωνσταντίνας και Γιάννη καθώς και των γονιών μου, Κωνσταντίνου και Ουρανίας Κουβούση, για τις ώρες που έχω αφιερώσει προκειμένου να ανταπεξέλθω στις απαιτήσεις της διατριβής μου. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέπων καθηγητή κ. Ευστράτιο Πατσούρη και τα μέλη της τριμελούς επιτροπής παρακολούθησης, κ. Ανδρέα Λάζαρη και κ. Χαρίκλεια Γακιοπούλου, για τη συνεργασία τους και τις πολύτιμες συμβουλές τους. 13

10 14

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ο ιός HPV (Ιός των Ανθρώπινων Θηλωμάτων- Human Papillomavirus) Ιστορική αναδρομή του ιού HPV και καρκίνος του τραχήλου της μήτρας Η βιολογία του ιού HPV (Γονιδιωματική οργάνωση και κύκλος ζωής του ιού) Γονιδιωματική οργάνωση Καρκινικός Μετασχηματισμός Ο Κύκλος ζωής του ιού HPV Ο καρκίνος της Κεφαλής και του Τραχήλου (HNC Head and Neck Cancer) HPV και καρκίνος της Κεφαλής και του Τραχήλου Ανατομία της Στοματικής Κοιλότητας Καρκίνος του στόματος Στοματική κοιλότητα και HPV Θεραπευτικες Προσεγγίσεις στον Καρκίνο του Στόματος HPV Θετικά Καρκινώματα Στόματος και Πρόγνωση 59 ΣΚΟΠΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Υλικά Μέθοδοι Απομόνωση Νουκλεϊκών Οξέων Τυποποίηση HPV με MICROARRAYS REAL TIME NASBA Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Αποτελέσματα ανίχνευσης και τυποποίησης Κλινικά αποτελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 6. ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ-ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ-ΑΡΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 15

12 16

13 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικ. 1 Δερματικά Θηλώματα (Ανατύπωση από www. youtube.com) Εικ. 2 Τρισδιάστατο μοντέλο του ιού HPV (Ανατύπωση από Εικ. 3 Ιστορική ανανδρομή των πιο σημαντικών σταθμών της ιστορίας του ιού (Ανατύπωση από discourse.apn.af) Εικ. 4 Καρκίνος του Τραχήλου της Μήτρας (Ανατύπωση από drnikoletakis.gr) Εικ. 5 Χαρακτηριστικά κοιλοκύτταρα (Ανατύπωση από Εικ. 6 Γονιδιακές περιοχές του ιού HPV (Ανατύπωση από Εικ. 7 Παραγωγικός κύκλος μόλυνσης του ιού HPV (Ανατύπωση από Rautava J. Syrjänen S. 2012) Εικ. 8 Σχηματική παρουσίαση των γεγονότων που οδηγούν στη καρκινογένεση, μετά από τη μόλυνση από τον ιό HPV (Ανατύπωση από Rautava J. Syrjänen S. 2012). Εικ. 9 Λευκοπλακία Στόματος (Aνατύπωση από ino.sagepub.com) Εικ 10 Ερυθροπλακία Γλώσσας (Aνατύπωση από Dentalcare.com) Εικ. 11 Μικροφωτογραφίες που δείχνουν διάχυτη ανοσολογική αντίδραση p16ink4a (Α) και το ISH πυρηνικό σήμα hr- HPV (Β) σε μη κερατινοποιημένο στοματοφαρυγγικό καρκίνωμα. Απουσία της έκφρασης p16 (C) και ISH σήματος hr-hpv (D) σε κερατινοποιημένο καρκίνωμα 17

14 γλώσσας. (Ανατύπωση από Morbini P. et all 2013) Εικ. 12 Ανατομία της στοματικής κοιλότητας (Ανατύπωση από giatriko.blogspot.com) Εικ. 13 Τομή της στοματικής κοιλότητας (Ανατύπωση από giatriko.blogspot.com) Εικ. 14 Αμυγδαλές (Ανατύπωση από giatriko.blogspot.com) Εικ. 15 Καρκίνος Γλώσσας (ανατύπωση από klinikiagiosloukas.gr) Εικ. 16 Καρκίνος αριστερής παρισθμίου αμυγδαλής (Ανατύπωση από www. Iatrikionline.gr) Εικ. 17 Boom Technology (Ανατύπωση από Εικ. 18 Συσκευή απόμόνωσης νουκλεϊκών οξέων Εικ. 19 Διάταξη των σημείων κάθε κελιού στο πλακάκι του PapilloCheck Kit. (Ανατύπωση από Εικ. 20 Στάδια διεξαγωγής της μεθόδου των Microarrays (PCR, υβριδισμός και ανάλυση του πλακιδίου) (Ανατύπωση από ) Εικ. 21 Σκανάρισμα του πλακιδίου σε μήκος κύματος 532 nm (πράσινο) και 635 nm (κόκκινο) όπου φαίνονται τα σημεία ελέγχου και τα εξειδικευμένα ανά τύπο HPV ολιγομερή. (Ανατύπωση από Εικ. 22 Κυκλική και Γραμμική φάση REAL TIME NASBA (Ανατύπωση από Εικ. 23 Δομή Ανίχνευσης Προϊόντων RNA (Ανατύπωση από Εικ. 24 Δομή Ανίχνευσης Προϊόντων RNA (Ανατύπωση από Εικ. 25 Ανίχνευση πραγματικού χρόνου με μοριακό αναγνωριστικό σήμα (Ανατύπωση από Εικ. 26 Αιτίες Ψευδώς Αρνητικών HPV DNA Tests σε Περιστατικά Καρκίνου της Κεφαλής και του Τραχήλου (Ανατύπωση από Pannone G. et all 2011) 18

15 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ 1 ΠΙΝΑΚΑΣ 2 ΠΙΝΑΚΑΣ 3 ΠΙΝΑΚΑΣ 4 ΠΙΝΑΚΑΣ 5 ΠΙΝΑΚΑΣ 6 ΠΙΝΑΚΑΣ 7 ΠΙΝΑΚΑΣ 8 ΠΙΝΑΚΑΣ 9 ΠΙΝΑΚΑΣ 10 ΠΙΝΑΚΑΣ 11 ΠΙΝΑΚΑΣ 12 ΠΙΝΑΚΑΣ 13 ΠΙΝΑΚΑΣ 14 ΠΙΝΑΚΑΣ 15 ΠΙΝΑΚΑΣ 16 ΠΙΝΑΚΑΣ 17 ΠΙΝΑΚΑΣ 18 Λειτουργίες των γονιδιακών περιοχών (ΑΠΑ) του ιού HPV. Υλικά PCR Πρόγραμμα θερμικών κύκλων Αποτελέσματα τυποποίησης και ανίχνευσης HPV mrna Μέση Ηλικία Ασθενών Μέση Ηλικία Ανδρών Μέση Ηλικία Γυναικών Ποσοστό Θετικών HPV δειγμάτων Θετικά HPV Δείγματα Ποσοστό mrna θετικών δειγμάτων Ανίχνευση DNA του ιού σε σχέση με την ηλικία των ασθενών. Ανίχνευση mrna του ιού σε σχέση με την ηλικία των ασθενών. Ανίχνευση DNA του ιού σε σχέση με την περιοχή προέλευσης του δείγματος Ανίχνευση mrna του ιού σε σχέση με την περιοχή προέλευσης του δείγματος Risk Factors Συσχετισμός ανίχνευσης HPV DNA και καπνίσματος Συσχετισμός ανίχνευσης HPV DNA και κατανάλωσης αλκοόλ Συσχετισμός Ανίχνευσης HPV DNA και Risk Factors 19

16 ΠΙΝΑΚΑΣ 19 ΠΙΝΑΚΑΣ 20 ΠΙΝΑΚΑΣ 21 ΠΙΝΑΚΑΣ 22 ΠΙΝΑΚΑΣ 23 ΠΙΝΑΚΑΣ 24 ΠΙΝΑΚΑΣ 25 ΠΙΝΑΚΑΣ 26 ΠΙΝΑΚΑΣ 27 Συσχετισμός Ανίχνευσης HPV mrna και καπνίσματος Συσχετισμός Ανίχνευσης HPV mrna και κατανάλωσης αλκοόλ Συσχετισμός Ανίχνευσης HPV m RNA και Risk Factors Ανίχνευση HPV DNA σε σχέση με τα χαρακτηριστικά των ασθενών Συσχετισμός των χαρακτηριστικών των ασθενών σε σχέση με την ανίχνευση HPV mrna (Ε6/Ε7) Κλινικά Αποτελέσματα HPV θετικών όγκων Χαρακτηριστικά Θεραπείας ΠΙΝΑΚΑΣ 26. Συσχετισμός Ανίχνευσης HPV DNA και Επιβίωσης Συσχετισμός Ανίχνευσης HPV mrna και Επιβίωσης 20

17 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1 Μοντέλο της καρκινογένεσης του τραχήλου της μήτρας (Ανατύπωση από Πανοτοπούλου σημειώσεις). Σχήμα 2 Η πρωτεΐνη Rb καταστέλει την έναρξη της μεταγραφής με το να παραμένει συνδεδεμένη με τον E2F και την HDAC-1 (Α και Γ). Το κύτταρο εισέρχεται στην S φάση όταν η Rb φωσφορυλιώνεται κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου (Β). Η πρόσδεση της Ε7 με την Rb προκαλεί απελευθέρωση τόσο του E2F όσο και της HDAC-1 (Δ). (Ανατύπωση από Viral Oncology). Γράφημα 1 Γράφημα 2 Ανίχνευση DNA HPV στελεχών Ανίχνευση mrna HPV στελεχών 21

18 22

19 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Ιολογίας του Γενικού Αντικαρκινικού Νοσοκομείου Αθηνών «Άγιος Σάββας» υπό την καθοδήγηση της διευθύντριας Ιολογίας Dr. Ευσταθίας Πανοτοπούλου και με την συνεργασία του τμήματος Ακτινοθεραπείας του νοσοκομείου. Ευχαριστώ πολύ το νοσοκομείο για την χρηματοδότηση των υλικών και την παραχώρηση του τεχνολογικού εξοπλισμού. 23

20 24

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 25

22 26

23 1.1 Ο ιός HPV (Ιός των Ανθρώπινων Θηλωμάτων- Human Papillomavirus) Γένος: Papillomavirus Οικογένεια: Papillomaviridae Οι ιοί Papilloma, οι οποίοι το 2004 ταξινομήθηκαν στην οικογένεια Papillomaviridae,(1) μολύνουν τους επιθηλιακούς ιστούς και επιδεικνύουν υψηλού βαθμού εξειδίκευση στην επιλογή του ξενιστή τους ενώ πολύ σπάνια μεταδίδονται από ένα ζωικό είδος σε κάποιο άλλο. Σήμερα έχουν απομονωθεί πάνω από 220 διαφορετικά είδη ιών Papilloma σε 20 είδη θηλαστικών. (2) Ο HPV ( Human Papillomavirus) είναι ένας μικρός DNA ιός, ο οποίος αποτελείται από κυκλικό δίκλωνο και υπερελικωμένο DNA μεγέθους ~8kb με ΜΒ 5,3x10 daltons. (3) Στερείται εξωτερικού περιβλήματος, εμφανίζει εικοσαεδρική συμμετρία, το καψίδιό του αποτελείται από 72 καψομερίδια και έχει διάμετρο 55nm. Το ιικό DNA παρουσιάζει ομοιότητες με το κυτταρικό από την άποψη ότι είναι συνδεδεμένο με ιστόνες κυτταρικής προέλευσης και έχει μορφή μικρού χρωμοσώματος, όπως συμβαίνει και στα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας των ιών αυτών.(4) Υπάρχουν πάνω από 150 γενετικά διαφορετικοί τύποι του ιού αυτού που ονομάζονται «γενότυποι» ή «στελέχη» του ιού HPV (1). Κάθε στέλεχος έχει περίπου 90% ομολογία βάσεων στο DNA του με όλα τα υπόλοιπα στελέχη και η αρίθμησή τους δηλώνει τη σειρά ανακάλυψής τους (πχ. HPV 16, HPV 18, HPV 31 κτλ) (3,4). Διαφορετικά στελέχη φαίνεται να προτιμούν τα επιθήλια διαφορετικών σημείων του σώματος, όπως το ανώτερο γεννητικό σύστημα, το δέρμα, το λάρυγγα, το τραχειοβρογχικό δέντρο, τη ρινική και τις παραρρίνιες κοιλότητες, το στόμα και τον οισοφάγο. Δεν είναι γνωστό γιατί διαφορετικά στελέχη του ιού μολύνουν διαφορετικά είδη επιθηλιακών κυττάρων (4). Ο ιός HPV σχετίζεται με μια τεράστια ποικιλία παθήσεων, με πιο γνωστή τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (5,6,7,8). Επιπλέον, όλο και περισσότερες μελέτες αποδεικνύουν τη σχέση του ιού με τον καρκίνο του κόλπου, του αιδοίου, του πέους, του πρωκτού, της γλώσσας, της στοματοφαρυγγικής κοιλότητας, του λάρυγγα, του δέρματος κ.α. (6,7,8,9). 27

24 Εικ. 1 Δερματικά Θηλώματα (Ανατύπωση από www. youtube.com) Υπό διερεύνηση τα τελευταία χρόνια, βρίσκεται και η εμπλοκή του HPV στον καρκίνο του πνεύμονα και τον καρκίνο του επιπεφυκότα (8,9,10,11). Οι ήπιες μορφές δυσπλασιών που προκαλούνται από ορισμένα στελέχη του ιού είναι τα οξυτενή κονδυλώματα (συνήθως από τα στελέχη 6 και 11) καθώς και τα δερματικά θηλώματα. Στους αγκώνες, τα γόνατα και τα πέλματα εντοπίζονται σε ορισμένες περιπτώσεις δερματικά θηλώματα που σχηματίζουν σκληρές πλάκες οι οποίες αυξάνουν εσωτερικά σε μέγεθος, προκαλώντας πόνο ή δυσφορία. Σε αρκετές περιπτώσεις η λοίμωξη από τον ιό παραμένει ασυμπτωματική για πολλά χρόνια ή και για πάντα (9). Ο κύριος τρόπος μετάδοσης του ιού για τα στελέχη που μολύνουν την περιοχή του γεννητικού συστήματος είναι η σεξουαλική επαφή. Η χρήση προφυλακτικού μειώνει τον κίνδυνο μετάδοσης του ιού αλλά δεν τον εξαλείφει. Αρκετοί ερευνητές υποστηρίζουν τη δυνατότητα μετάδοσης του ιού στο νεογνό από τη μητέρα του κατά τη διαδικασία του φυσιολογικού τοκετού, προκαλώντας δυσπλασίες στο αναπνευστικό του επιθήλιο. (7,8) 28

25 Η πρωτοπαθής λοίμωξη προσβάλλει συνήθως άτομα νεαρής ηλικίας, ενώ η διάδοσή του είναι τόσο ραγδαία, ώστε η πιθανότητα για μια σεξουαλικά ενεργή γυναίκα μέχρι 30 ετών να προσβληθεί από τον ιό αγγίζει το 30% (10). Αποτελεί ίσως το πιο κοινό σεξουαλικά μεταδιδόμενο νόσημα στον κόσμο (7). Εικ. 2. Τρισδιάστατο μοντέλο του ιού HPV (Ανατύπωση από Ιστορική αναδρομή του ιού Το 460 π.χ. γίνεται η πρώτη καταγεγραμμένη αναφορά στον όρο «γεννητικά κονδυλώματα» και το 25 μ.χ. διαχωρίζονται σε τρεις διαφορετικούς τύπους. Πριν τη δεκαετία του 80, ο όρος κονδυλώματα αναφερόταν μόνο στα οξυτενή, τα οποία ήταν γνωστό από την αρχαιότητα ότι τα προκαλούσε ιός (12). Οι βασικότερες ανακαλύψεις που έχουν γίνει σχετικά με τον ιό είναι: 29

26 Γίνεται αναφορά στην «αφροδίσια φύση» του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (13). 2. Το 1907 ο Ciuffo δημοσιεύει την εργασία του για την ύπαρξη μολυσματικού παράγοντα που προκαλεί τα θηλώματα (13). 3. Το 1931 οι Buschke και Lowenstein περιγράφουν τα κονδυλώματα του πέους και τα ονομάζουν με τα ονόματά τους(14). 4. Το 1949 ο Strauss εντοπίζει στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σωματίδια του ιού σε ηλικό ανθρώπινων θηλωμάτων. Την ίδια χρονιά ο Ayre περιγράφει τις κυτταρολογικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από ιούς σε κολπικά επιχρίσματα (14,15). 5. Το 1952 οι Rigini και Stern διατυπώνουν την άποψη ότι ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας έχει χαρακτήρα λοιμώδους νοσήματος. Μέχρι τότε υπήρχε η υποψία ότι κάποιος σεξουαλικώς μεταδιδόμενος παράγοντας προκαλεί καρκινογένεση στον τράχηλο, αλλά κανένας δεν γνώριζε για τους ιούς των Ανθρώπινων Θηλωμάτων (13). 6. Το 1954 τα κονδυλώματα χαρακτηρίζονται ως αφροδίσιο νόσημα (14). 7. Το 1956, οι Koss και Durfee χρησιμοποιούν τον όρο «κοιλοκυτταρική ατυπία» περιγράφοντας τα χαρακτηριστικά κύτταρα που ανευρίσκονται σε φλεγμονές που έχουν προκληθεί από τον ιό, σε δυσπλασίες και όγκους του τραχήλου της μήτρας (14). 8. Το 1965 τα δερματικά θηλώματα συνδέονται με τον ιό HPV (12) Χαρακτηρίζεται η ομάδα των Ανθρώπινων Θηλωμάτων (12). 10. Το 1969 ο Almeida αναφέρει την ύπαρξη διαφορετικών στελεχών του ιού (14). 11. Το 1975 ο zur Hausen διατυπώνει την άποψη ότι ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας προκαλείται από HPV-φλεγμονές. (12). 12. Το 1976 οι Meisels και Fortin εντοπίζουν ότι το φαινόμενο της κοιλοκυτταρικής ατυπίας εμφανίζεται τόσο σε καλοήθεις αλλοιώσεις όσο και σε προκαρκινικές αλλοιώσεις του τραχήλου της μήτρας (13). 13. Το οι Gissman και zur Hausen ανακαλύπτουν ότι υπάρχουν περισσότερα από ένα στελέχη του ιού HPV. Την ίδια χρονιά ο zur Hausenδημοσιεύει την άποψη ότι ο ιός HPVεμπλέκεται στην πρόκληση καρκίνου του τραχήλου (13). 30

27 14. Το 1978 οι Jablonska και Gerard Orth ανιχνεύουν τον ιό HPV-5 σε καρκίνο του δέρματος (15). 15. Το 1979 δημιουργείται το σύστημα ταξινόμησης του ιού (16). 16. Το 1980 ο Shan και οι συνεργάτες του αποδεικνύουν την παρουσία του ιού στο 50% των δυσπλασιών του τραχήλου της μήτρας. Την ίδια χρονιά ο zur Hausen συλλέγει ιολογικά και επιδημιολογικά δεδομένα που συνηγορούν στην εμπλοκή του ιού HPV στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (14). 17. Το 1983 ο Darst εντοπίζει τον HPV-16 σε καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας, ενώ την επόμενη χρονιά ο Boshart εντοπίζει τον HPV-18 (13). 18. Το 1985 οι Schwartz και Yee δημοσιεύουν τις πρώτες πληροφορίες σχετικά με την ενσωμάτωση του γενετικού υλικού του ιού στα χρωμοσώματα του ξενιστή στην περίπτωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (14, 15,16). 19. Το 1987 παρατηρείται ότι τα μολυσμένα από τον HPV-16 ανθρώπινα κερατινοκύτταρα είναι αθάνατα (16). 20. Το 1989 ο Von Knebel Doeberitz και οι συνεργάτες του περιγράφουν την εμποκή των περιοχών Ε6 και Ε7 του γοωιδιώματος του ιού στην έκφραση της κακοήθειάς του (16). 21. Το 1989 ο Dyson μιλάει για την τροποποίηση της πρωτεΐνης Rb από την πρωτεΐνη Ε7 (14). 22. Το 1990 ο Werness ανακαλύπτει τη δέσμευση της πρωτεΐνης P53 από την πρωτεΐνη Ε6 του ιού (14). 23. Το 1992 παρασκευάζονται τα πρώτα VLPs (Virus-like Particles) από τις περιοχές L1 και L2 του ιού HPV (17) 24. Το 2006 εγκρίνεται το πρώτο εμβόλιο για την πρόληψη της μόλυνσης από τέσσερις τύπους του ιού (6,11,16,18) και το 2008 το εμβόλιο για την πρόληψη της μόλυνσης από δύο τύπους του ιού (17,18). 31

28 460 πχ Πρώτη αναφορά στον ορισμό «γεννητικά κονδυλώματα» 1842 καρκίνος του τραχήλου «αφροδίσια φύση» 1907 Ιϊκή φύση δερματικών κονδυλωμάτων (Ciufo) 1965 Δομικά και μοριακά χαρακτηριστικά του HPV DNA από τα δερματικά κονδυλώματα 1976 Υπόθεση ο HPV είναι πιθανή αιτία καρκίνου του τραχήλου 1 (Zur Hausen) 1979 Σύστημα ταξινόμησης του HPV 1984 HPV 18 στον καρκίνο του τραχήλου (Boshart) 1999 HPV στο 99.7% των καρκίνων του τραχήλου 3 (Walboomers) 1891 Λοιμογόνος φύση, κοινών κονδυλωμάτων /1967 Oμάδα των ανθρωπίνων θηλωμάτων 1983 HPV 16 στον καρκίνο του τραχήλου (Durst) 2006 διαθεσιμότητα HPV εμβολίων 25 μχ Καθορισμός τριών διαφορετικών τύπων κονδυλωμάτων 1949 Τμήματα του HPV σε δερματικά κονδυλώματα Ποικιλία των τύπων του HPV 1992 Παρασκευή Των VLPS από L 1 ΚΑΙ L 2 Εικ. 3 Ιστορική ανανδρομή των πιο σημαντικών σταθμών της ιστορίας του ιού (Ανατύπωση από discourse.apn.af) ) 1.3 HPV και καρκίνος του τραχήλου της μήτρας Εικ. 4 Καρκίνος του Τραχήλου της Μήτρας (Ανατύπωση από drnikoletakis.gr) 32

29 Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες παγκοσμίως και η βασικότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες των αναπτυσσόμενων χωρών (18). Η μόλυνση από τον ιό HPV αποτελεί το βασικό αίτιο της ανάπτυξης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, αφού ανιχνεύεται στο 99% των όγκων (19). Τα κύτταρα του επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας που έχουν προσβληθεί από HPV παρουσιάζουν ορισμένη μορφολογία, γνωστή ως κοιλοκυττάρωση, η οποία χαρακτηρίζεται από διαυγές πρωτόπλασμα, πυκνοχρωματικό πυρήνα και αποδιοργάνωση της δομής της χρωματίνης (10). Εικόνα 5. Χαρακτηριστικά κοιλοκύτταρα (Ανατύπωση από Στην Ελλάδα εμφανίζονται περίπου 600 νέα περιστατικά καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ετησίως, που θα οδηγήσουν σε περίπου 250 θανάτους (~40%). Τα τελευταία χρόνια δεν έχει σημειωθεί καμία μείωση των περιστατικών καρκίνου του τραχήλου στην Ελλάδα. Σε μεγάλη επιδημιολογική μελέτη που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Ιολογίας του νοσοκομείου «Άγιος Σάββας» μεταξύ των ετών , το ποσοστό εμφάνισης του ιού 33

30 σε δείγματα γυναικών ηλικίας ετών ήταν 56.3% (18). Η συνύπαρξη με άλλες σεξουαλικά μεταδιδόμενες νόσους, Clamydia, HIV, απλούς έρπητες παρατηρείται σε ποσοστό 15%-36%. Υπάρχουν πάνω από 150 τύποι του ιού HPV (στελέχη), ενώ δεν είναι σπάνια και η πολλαπλή μόλυνση, δηλαδή μόλυνση με περισσότερα του ενός στελέχη του ιού (10). Σήμερα είναι γνωστό ότι ορισμένα από τα στελέχη του ιού HPV που προσβάλουν το επιθήλιο του τραχήλου της μήτρας, είναι υπεύθυνα για τη δημιουργία δυσπλασίας και διηθητικού καρκίνου και διαφέρουν σημαντικά όσον αφορά την ογκογόνο δυναμική τους (1,5,11,18). Τα στελέχη 6/11/40/42/43/44/61/70/72/81 θεωρούνται «χαμηλού κινδύνου» (Low Risk) και προκαλούν κονδυλώματα (οξυτενή) ή ήπιες κυτταρικές αλλοιώσεις. Οι ενδιάμεσοι τύποι 26/31/33/34/35/39/45/51/52/53/54/56/58/59/66/68/73/82 είναι υπεύθυνοι για σοβαρές βλάβες στο βλεννογόνο του τραχήλου της μήτρας και μεταστρέφονται σε ελαφριά ως μέτρια ενδοθηλιακή νεοπλασία. Τέλος τα στελέχη 16 και 18 θεωρούνται «υψηλού κινδύνου» (High Risk) και ανιχνεύονται στο μεγαλύτερο ποσοστό των διηθητικών καρκίνων (1,4,5,7,11). Πολλοί ερευνητές αναγνωρίζουν μόνο δύο κατηγορίες («χαμηλού κινδύνου» και «υψηλού κινδύνου»), εντάσσοντας τους ενδιάμεσους τύπους στα High Risk στελέχη (1,7,11). Η πλειοψηφία των γυναικών που προσβάλλονται από τον ιό, αναπτύσσουν μια σαφή και αποτελεσματική απάντηση στη μόλυνση (7). Περίπου το 10% αναπτύσσουν επίμονη μόλυνση και μόνο 5 ως 10 ανά θα παρουσιάσουν προκαρκινική αλλοίωση η οποία θα εξελιχθεί σε κακοήθη νόσο του τραχήλου, σε προηγμένες χώρες. Η «επίμονη μόλυνση» συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο ενσωμάτωσης του ιού στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή. Ως επίμονη χαρακτηρίζεται η λοίμωξη που ανιχνεύται για περισσότερα από δύο χρόνια (7). Οι ίδιοι παράγοντες που παίζουν ρόλο στην εξέλιξη της λοίμωξης και στη μετατροπή μιας παροδικής μόλυνσης σε επίμονη, είναι εκείνοι που δρουν και συνεργατικά στον καρκινικό μετασχηματισμό (10). Αυτοί είναι το είδος του ιού, η έναρξη της σεξουαλικής δραστηριότητας πριν από την ηλικία των 16 ετών, η συχνή εναλλαγή ερωτικών συντρόφων, η χρήση στεροειδών ορμονών, η κύηση, η ύπαρξη σακχαρώδους διαβήτη, η ύπαρξη προβλημάτων στην άμυνα του οργανισμού λόγω ασθένειας του ανοσοποιητικού 34

31 συστήματος, ανοσοκαταστολής ή AIDS, το κάπνισμα, το είδος της διατροφής, η κατάχρηση οινοπνευματωδών ποτών καθώς και η γενετική προδιάθεση ορισμένων μειονοτήτων (10)(σχήμα 1). Στην περίπτωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, ο ρόλος του HPV DNA Testing έίναι σημαντικός στη διαχείρηση της ασθένειας. Η HPV DNA εξέταση πλεονεκτεί έναντι της κυτταρολογικής αξιολόγησης διότι εμφανίζει υψηλότερη ευαισθησία και όχι μόνο προσδιορίζει τις γυναίκες με κάποια προκαρκινική αλλοίωση, αλλά και εκέινες που έχουν αυξημένο κίνδυνο να αναπτύξουν τραχηλική δυσπλασία υψηλού βαθμού εντός 3-10 ετών (20,21).Ο εμβολιασμός (τα δυο εμβόλια που κυκλοφορούν είναι το το Gardasil, που περιέχει αντιγόνα από τους τύπους 16, 18 και 6, 11, και ένα διδύναμο, το Cervarix, που περιέχει αντιγόνα από τους τύπους 16, 18 ), παρέχει σημαντικό βαθμό προστασίας, αλλά αφήνει ανοιχτό το ενδεχόμενο μόλυνσης από άλλα στελέχη του ιού (15). 35

32 Παροδική μόλυνση Ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος στο κυτταρικό γονιδίωμα Μόλυνση με ογκογόνο στέλεχος ιού HPV Επίμονη μόλυνση Τραχηλική δυσπλασία Διηθητικός καρκίνος Ανοσοκαταστολή HIV Μεταμόσχευση Άλλη Ασθένεια Συνεργατικοί καρκινογόνοι παράγοντες Κάπνισμα Συχνή εναλλαγή συντρόφων Ορμονικά συμπληρώματα Γενετική προδιάθεση Διαβήτης Άλλοι παράγοντες Σχήμα 1 : Μοντέλο της καρκινογένεσης του τραχήλου της μήτρας (Ανατύπωση Πανοτοπούλου σημειώσεις). από 36

33 1.4 Η βιολογία του ιού HPV (Γονιδιωματική οργάνωση και κύκλος ζωής του ιού) Γονιδιωματική οργάνωση Το γονιδίωμα του ιού αποτελείται από ΑΠΑ (ΑΝΟΙΚΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΑΝΑΓΝΩΣΗΣ) ή ORFs (Open Reading Frames) τα οποία είναι αρκετά μεγάλα για την κωδικοποίηση μίας πρωτεΐνης (1). Τα ΑΠΑ οργανώνονται σε 3 περιοχές: Η πρώιμη περιοχή Ε (Early) περιλαμβάνει 7 ΑΠΑ, τα ΕΙ-Ε7 ( και Ε8), και αφορά στην κωδικοποίηση ενζύμων που παίζουν ρόλο στον αναδιπλασιασμό του DNA και ελέγχουν την έκφραση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Οι ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 επάγουν τον κυτταρικό μετασχηματισμό. (1,3,4) Η όψιμη περιοχή L (Late) περιλαμβάνει τα ΑΠΑ L1 και L2, τα οποία κωδικοποιούν για τις δομικές πρωτεΐνες του ιού. Η περιοχή των ΑΠΑ L1 και L2 έχει παραμείνει εξαιρετικά συντηρητική εξελικτικά και οι πρωτεΐνες L1 και L2 παρουσιάζουν ελάχιστες διαφορές ανάμεσα στα διάφορα στελέχη του ιού. Όλοι οι τύποι του ιού HPV διαθέτουν καψίδιο το οποίο περιέχει 360 αντίγραφα της πρωτεΐνης L1 και 12 αντίγραφα της πρωτεΐνης L2, οργανωμένα σε 72 καψομερίδια.(1,4) Τέλος η τρίτη περιοχή R (Upstream regulation region-ρυθμιστική περιοχή), ελέγχει το ρυθμό παραγωγής και μεταγραφής των περιοχών L και E. Η περιοχή R παρουσιάζει τον μεγαλύτερο βαθμό διαφοροποίησης μεταξύ των διαφορετικών στελεχών των ιών (4). Όλες οι γονιδιακές περιοχές που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, περιορίζονται στην μία αλυσίδα του DNA (1). 37

34 Εικ. 6: Γονιδιακές περιοχές του ιού HPV (Ανατύπωση από 38

35 ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Λειτουργίες των γονιδιακών περιοχών (ΑΠΑ) του ιού HPV. ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ (ΑΠΑ) Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 και Ε7 Ε8 L1 L2 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Αντιγραφή του ιικού DNA, καταστολή της αντιγραφής. Ρύθμιση της μεταγραφής, πρόσδεση στην LCR περιοχή. Άγνωστο προϊόν και λειτουργία Εκφράζεται ως όψιμο γονίδιο, ρυθμίζει την ωρίμανση και απελευθέρωση τω ιικών σωματιδίων. Μετασχηματισμός (HPV-6) Στους υψηλού κινδύνου ιούς (HPV-16 και HPV-18), παίζουν ρόλο στον κυτταρικό μετασχηματισμό. Μεταγράφονται από τον ίδιο υποκινητή (Ρ97), αποτελώντας πολυσιστρονικό mrna. Άγνωστο προϊόν και λειτουργία. Μείζονα καψιδιακή πρωτεΐνη. Ελάσσονα καψιδιακή πρωτεΐνη Καρκινικός Μετασχηματισμός Ο ρόλος του ιού στον καρκινικό μετασχηματισμό έχει μελετηθεί διεξοδικά στην περίπτωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Οι πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 των «υψηλού κινδύνου» στελεχών του ιού είναι υπεύθυνες για την αθανατοποίηση και τον κακοήθη μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων του τραχήλου (1,3). Αν και άλλοι παράγοντες, όπως το ιικό φορτίο έχουν θεωρηθεί υπεύθυνοι για την εμφάνιση δυσπλασίας στα μολυσμένα από τον ιό κερατινοκύτταρα, η επίδραση των Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών στον κυτταρικό 39

36 κύκλο αποτελεί το βασικό παράγοντα εμφάνισης της καρκινικής εξαλλαγής (5). Μετά την αρχική μόλυνση, το γονιδίωμα του HPV παραμένει σε επισωματική μορφή (1). Η ενσωμάτωση του ιικού DNA στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή αποτελεί την απαρχή του κυτταρικού μετασχηματισμού. Η ενσωμάτωση, όσον αφορά το κύτταρο ξενιστή, φαίνεται να είναι μη ειδική, και δεν είναι ακόμα γνωστό κατά πόσο η ενσωμάτωση κοντά σε ογκογονίδια παίζει σημαντικό ρόλο στην εξαλλαγή των μετασχηματισμένων κυττάρων σε καρκινικά (22,23). Αντίθετα, όσον αφορά στο ιικό DNA η ενσωμάτωση είναι πολύ εξειδικευμένη και συμβαίνει (στις περισσότερες των περιπτώσεων) μέσα στην περιοχή Ε1/2 του ιικού γονιδιώματος, με αποτέλεσμα τον περιορισμό έκφρασης της πρωτεΐνης Ε2 και την αναδιοργάνωση του υποκινητή των Ε6 και Ε7 ΑΠΑ. Η αναδιοργάνωση αυτή έχει σαν αποτέλεσμα τη συνεχή έκφραση των Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών (1,22,23). Η ενσωμάτωση του ιικού DNA μέσα στην περιοχή Ε1/2 του ιικού γονιδιώματος, δεν έχει μόνο σαν αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση του υποκινητή των Ε6 και Ε7, αλλά και την αναστολή της έκφρασης της Ε2 ιικής πρωτεΐνης. Η Ε2 πρωτεΐνη παίζει καθοριστικό ρόλο στον κύκλο ζωής του ιού, καθώς ρυθμίζει την αντιγραφή και μεταγραφή του ιικού DNA. Η Ε2 σε συνδυασμό με την Ε1 και παράγοντες αντιγραφής του κυττάρου, πυροδοτεί την έναρξη αντιγραφής του HPV DNA (1,22,23) Έχει δειχτεί ότι η Ε2 προκαλεί κυτταρική απόπτωση ενεργοποιώντας την p53 του κυττάρου και καταστέλλοντας την έκφραση των Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών. Σε κυτταρικό επίπεδο η Ε2 μπορεί να πυροδοτήσει την απόπτωση το κυττάρου, ανεξάρτητα από την δράση της p53, ακολουθώντας διαφορετικό μονοπάτι, προκαλώντας κάποιο τοξικό ερέθισμα στο κύτταρο. Η απώλεια της Ε2 πρωτεΐνης, λόγω ενσωμάτωσης του ιικού γονιδιώματος στο κυτταρικό, ευνοεί τον κυτταρικό μετασχηματισμό, οδηγώντας σε αθανατοποίηση του κυττάρου (22,23,24). Mία πιθανή γενετική διαφοροποίηση που ίσως συμβάλλει στην καρκινική εξαλλαγή των επιθηλιακών κυττάρων, είναι η ίδια η ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος. Έχει δειχτεί ότι η ιική ενσωμάτωση είναι συχνά υπεύθυνη όχι 40

37 μόνο για την αναδιοργάνωση του HPV γονιδιώματος, αλλά επίσης και για την αναδιαμόρφωση της περιοχής του ανθρώπινου γονιδιώματος που περιβάλλει το σημείο ενσωμάτωσης του ιικού DNA (23). Αν και η ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος στο ανθρώπινο είναι τυχαία, δεν αποκλείεται να προκαλεί την ενεργοποίηση ογκογονιδίων ή την απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, οδηγώντας σε τραχηλική νεοπλασία (23). Καινούριες έρευνες έχουν δείξει υπερέκφραση αρκετών ανεξάρτητων ογκογονιδίων (SCYP2, STAG3, SYNGR3, TAF7L, TCAM1) σε περιπτώσεις καρκίνου του ρινοφάρυγγα, όπου ανιχνεύεται ενσωμάτωση του HPV16 στο ανθρώπινο γονιδίωμα (24). Παρ όλα αυτά, πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι η ενσωμάτωση του HPV DNA στο γονιδίωμα των ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων είναι τόσο τυχαία, που είναι μάλλον απίθανο να συμβάλλει στον νεοπλασματικό φαινότυπο του κυττάρου (22,23). Παλαιότερες παρατηρήσεις είχαν υποστηρίξει ότι τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας ασθενών με αποδεδειγμένη μόλυνση από ιό HPV, δεν έφεραν μεταλλάξεις της πρωτεΐνης p53 ή της πρωτεΐνης Rb του ρετινοβλαστώματος. Αντίθετα, καρκινικά τραχηλικά κύτταρα χωρίς ένδειξη HPV μόλυνσης έφεραν μεταλλάξεις στην μία ή και στις δύο από αυτές τις κυτταρικές πρωτεΐνες. Έτσι αναπτύχθηκε η θεωρία ότι στα μολυσμένα με HPV κύτταρα, οι Ε6 και Ε7 πρωτεΐνες καταργούσαν τη δραστικότητα των πρωτεϊνών p53 και Rb. Μεταγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι μόνο στους πρωτογενείς όγκους εμφανιζόντουσαν οι p53 και Rb άγριου τύπου, ενώ οι μεταστάσεις έφεραν μεταλλάξεις στις p53 και Rb, υποδεικνύοντας ότι αυτό ήταν το γεγονός που συνέβαλε στην μετάσταση. Ωστόσο, οι νεώτερες έρευνες δεν υποστηρίζουν τις αρχικές υποθέσεις, αφού υπάρχουν περιπτώσεις πρωτογενών τραχηλικών όγκων με ένδειξη HPV μόλυνσης, που φέρουν μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη p53. Έτσι, είναι φανερό ότι υπάρχουν αρκετά διαφορετικά μονοπάτια που οδηγούν στην κακοήθη εξαλλαγή, που όμως έχουν σαν αφετηρία την μόλυνση από τον ιό HPV (23). Η πρωτεΐνη Ε6 προσδένεται σε αρκετές κυτταρικές πρωτεΐνες δημιουργώντας σημαντικές αλληλεπιδράσεις. Η αλληλεπίδραση της Ε6 των «υψηλού κινδύνου» ιών (HPV 16 και HPV 18) με την p53 των τραχηλικών επιθηλιακών κυττάρων προκαλεί την απενεργοποίηση της p53 μέσω του πρωτεολυτικού συστήματος της Ουβικουϊτίνης, το οποίο αποτελεί το 41

38 βασικότερο σύστημα αποικοδόμησης των πρωτεϊνών του κυττάρου (25). Η απενεργοποίηση της p53 εξαρτάται από την πρόσδεση της Ε6 με μια κυτταρική πρωτεΐνη, την Σχετιζόμενη με την Ε6 Πρωτεΐνη (E6-Associated Protein, E6AP), η οποία είναι μία λιγάση που αποτελεί τμήμα του μονοπατιού της Ουβικουϊτίνης. Το σύμπλεγμα Ε6-Ε6AP ουβικουϊτινιώνει λυσίνες της p53, οδηγώντας στην απενεργοποίηση της p53. Η Ε6 των «χαμηλού κινδύνου» στελεχών του ιού προκαλεί μικρή ή καθόλου απενεργοποίηση της p53 ακόμα και όταν παρατηρείται πρόσδεση της Ε6 με την Ε6AP, γεγονός που μάλλον έχει να κάνει με την δράση της Ε2 πρωτεΐνης η οποία δρα προστατευτικά υπέρ των αποπτωτικών μηχανισμών του κυττάρου (25). H πιο καλά μελετημένη αλληλεπίδραση είναι αυτή της Ε7 πρωτεΐνης και της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος Rb. Η Rb ρυθμίζει την μετάβαση του κυττάρου από την G φάση του κυτταρικού κύκλου στην S φάση, μέσω της φωσφορυλίωσής της. Η υπεφωσφορυλιωμένη Rb είναι ανενεργή. Αφού υποστεί φωσφορυλίωση, η Rb απελευθερώνει ρυθμιστικούς παράγοντες, όπως τον Ε2F, οι οποίοι ενεργοποιούν καταλύουν την σύνθεση DNA επιτρέποντας στο κύτταρο να εισέλθει στη φάση S (25). Η πρωτεΐνη Ε7 των «υψηλού κινδύνου» στελεχών HPV προσδένεται στην πρωτεΐνη Rb, δημιουργώντας της διαμόρφωση υπερφωσφορυλιωμένης Rb. Η αλλαγή της διαμόρφωσης της Rb προκαλει την απελευθέρωση του E2F καθώς και μίας άλλης πρωτεΐνης, της 1-Δυακευλάσης της Ιστόνης (Histone Deacetylase-1, HDAC), η οποία όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση προκαλεί την έναρξη της μεταγραφής, αλλάζοντας τη δομή της χρωματίνης και αποκαλύπτοντας γονιδιακούς υποκινητές. Η πρόσδεση λοιπόν της Ε7 στην Rb γίνεται ταυτόχρονα σε δύο περιοχές, απελευθερώνοντας συγχρόνως τον E2F και την HDAC-1 (25) ( σχήμα 2). Η πρόσδεση της Ε7 των «χαμηλού κινδύνου» στελεχών με την Rb είναι πιο ασθενής και δεν προκαλεί διαμόρφωση υπερφωσφορυλιωμένης Rb. Ακόμα όμως και σε περιπτώσεις μόλυνσης από στελέχη «χαμηλού κινδύνου», η πρόσδεση της Ε7 με την Rb γίνεται πιο ισχυρή όταν η Ε7 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα (3). 42

39 P P P HDAC-1 Rb Rb HDAC-1 P P E2F OFF E2F ON Α Β HDAC-1 E7 Rb Ε7 HDAC-1 Rb E2F OFF E2F ON Γ Δ Σχήμα 2: Η πρωτεΐνη Rb καταστέλει την έναρξη της μεταγραφής με το να παραμένει συνδεδεμένη με τον E2F και την HDAC-1 (Α και Γ). Το κύτταρο εισέρχεται στην S φάση όταν η Rb φωσφορυλιώνεται κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου (Β). Η πρόσδεση της Ε7 με την Rb προκαλεί απελευθέρωση τόσο του E2F όσο και της HDAC-1 (Δ). (Ανατύπωση από Viral Oncology). 43

40 1.4.3 Ο Κύλος ζωής του ιού HPV Στο πλακώδες επιθήλιο, ο παραγωγικός κύκλος του ιού συνδέεται με παράγοντες διαφοροποίησης που εκφράζονται σε διαφορετικές στιβάδες των επιθηλιακών κυττάρων. Ο ιός μολύνει αδιαφοροποίητα κύτταρα του πλακώδες επιθηλίου, μετά από τραυματισμό ή ασυνέχεια του επιθηλίου. Η παραγωγική φάση της μόλυνσης χαρακτηρίζεται από την αντιγραφή του ιικού DNA. Σε αυτό το στάδιο το γονιδίωμα του ιού πολλαπλασιάζεται σε περισσότερα από 1000 αντίγραφα ανά κύτταρο. Αυτό θα οδηγήσει σε έκφραση των L γονιδίων και παραγωγή ώριμων ιικών σωματιδίων που θα απελευθερωθούν από τις ανώτερες στιβάδες του διαφοροποιημένου επιθηλίου (1) (εικ 4 ). Εικ 7. Παραγωγικός κύκλος μόλυνσης του ιού HPV (Ανατύπωση από Rautava J. Syrjänen S. 2012) 44

41 Εικ 8. Σχηματική παρουσίαση των γεγονότων που οδηγούν στη καρκινογένεση, μετά από τη μόλυνση από τον ιό HPV (Ανατύπωση από Rautava J. Syrjänen S. 2012). Ο ιός HPV μπορεί να προκαλέσει επιτυχή μόλυνση μόνο μετά από σύνδεση με τη μεμβράνη του κυττάρου και τελικά είσοδο στο επιθηλιακό κύτταρο ξενιστή (1). Οι Πρωτεογλυκάνες Θειικής Ηπαράνης (Heparin Sulfate Proteoglycans - HSPGs), που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη των 45

42 επιθηλιακών κυττάρων, αναφέρονται ως υποδοχείς του ιού HPV. Από τις HSPGs, η syndecan-1 είναι ο πιο πιθανός υποδοχέας του ιού. Υπερέκφραση της syndecan-1 παρατηρείται στα βασικά και παραβασικά κύτταρα μετά από τραυματισμό. Δευτερεύοντες υποδοχείς όπως η α6β4 ιντεγκρίνη πιθανά συμβάλλουν στη διαδικασία εισόδου του ιού στο κύτταρο. Διαφορετικά στελέχη του ιού μπορεί να χρησιμοποιούν διαφορετικά μονοπάτια εισόδου στα επιθηλιακά κύτταρα (1). 1.5 Ο καρκίνος της Κεφαλής και του Τραχήλου (HNC Head and Neck Cancer) Ο καρκίνος της κεφαλής και του τραχήλου αντιπροσωπεύει την πέμπτη πιο συνηθισμένη κακοήθεια παγκοσμίως με θνητότητα κοντά στο 50%. Στους άνδρες εμφανίζεται πιο συχνά από ότι στις γυναίκες ( 15-64/ στους άνδρες έναντι >10-16/ στις γυναίκες, ανάλογα με την περιοχή του κόσμου που μελετάται) (26,27,28). Στον δυτικό κόσμο (Ευρώπη και Βόρεια Αμερική) τα ποσοστά εμφάνισης αυτού του είδους όγκων κυμαίνονται στο 5% των ετήσιων περιστατικών καρκίνου, ενώ στις χώρες του τρίτου κόσμου, στην Ασία και ορισμένες περιοχές της Λατινικής Αμερικής το αντίστοιχο ποσοστό φτάνει στο 10% ως το εντυπωσιακό 40% σε ορισμένες χώρες (25). Εμφανίζεται κυρίως σε άτομα ηλικίας μεγαλύτερα των 60 ετών με μια συνεχώς αυξανόμενη τάση εμφάνισης μετά τον δεύτερο παγκόσμιο πόλεμο. Στην Ευρώπη παρουσιάζονται ετησίως περίπου νέα κρούσματα καρκίνου της στοματικής κοιλότητας και του στοματοφάρυγγα, ενώ σημειώνονται θάνατοι εξαιτίας της νόσου (27). Ο όρος εμπεριέχει ένα ετερογενές σύνολο κακοήθων νεοπλασιών, εντοπισμένες σε διαφορετικά σημεία της ανώτερης αναπνευστικής οδού (στοματική κοιλότητα, λάρυγγας, στοματοφάρυγγας, ρινοφάρυγγας), με κοινά ιστοπαθολογικά ευρήματα (29,30). Πρόκειται κυρίως για όγκους επιθηλιακής προέλευσης (Ακανθοκυτταρικό Καρκίνωμα), προερχόμενους από το επιθήλιο που καλύπτει την ανώτερη αναπνευστική οδό (Head and Neck Squamous Cell Carcinomas- HNSCCs) (29,30). Στα αρχικά στάδια εμφανίζεται σαν ερυθρή πλάκα (Ερυθροπλακία), λευκή πλάκα (Λευκοπλακία), συνύπαρξη και 46

43 των δυο, ως διάβρωση ή και έλκωση (3). Για την εμφάνιση αυτών των όγκων ενοχοποιείται κυρίως η κατανάλωση αλκοόλ, η χρήση καπνού, η κακή στοματική υγιεινή καθώς και οι διατροφικές συνήθειες ορισμένων λαών (29,30,31). Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα αναπτύσσεται μέσω μίας πολυσταδιακής διαδικασίας, συσσώρευσης γενετικών αλλαγών σε ογκογονίδια, ογκοκατασταλτικά γονίδια και γονίδια επιδιόρθωσης του DNA, που απορρυθμίζουν την έκφρασή τους διαταράσσοντας τη λειτουργία των ρυθμιστικών οδών των κυττάρων του στοματικού βλεννογόνου με αποτέλεσμα τον ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό (29,30). Εικ 9. Λευκοπλακία Στόματος (Aνατύπωση από ino.sagepub.com) 47

44 Εικ 10. Ερυθροπλακία Γλώσσας (Aνατύπωση από Dentalcare.com) HPV και καρκίνος της Κεφαλής και του Τραχήλου Η πρώτη αναφορά του ιού HPV ως αιτιολογικού παράγοντα στον καρκίνο του στόματος και του ρινοφάρυγγα έγινε το 1983 (Syrjanen K et all) (29). Οι λόγοι που οδήγησαν τους ερευνητές στο να εξετάσουν την εμπλοκή του ιού HPV στην εμφάνιση ήταν η επιθηλιοτροπική φύση του ιού, και η ύπαρξη περιοχών στο στοματοφάρυγγα ιστολογικά παρόμοιων με τη ζώνη μετασχηματισμού του τραχήλου της μήτρας, όπου και παρατηρείται η μεγαλύτερη εμφάνιση των όγκων του τραχήλου (1,25,29,30). Άλλα στοιχεία που συμβάλλουν στην υπόθεση ύπαρξης HPV όγκων στην Κεφαλή και τον Τράχηλο είναι η μικρή ηλικία αρκετών ασθενών (< 50 έτη) καθώς και η μη χρήση αλκοόλ και καπνού που αποτελούν αιτιολογικούς παράγοντες αυτού του είδους καρκίνου (3,30,31). Επειδή ιστοπαθολογικά και κυτταρολογικά δεν υπάρχουν βασικές διαφορές διάκρισης των HPV-θετικών από τους HPV-αρνητικούς όγκους της Κεφαλής και του Τραχήλου, έχουν γίνει πολλές προσπάθειες προσδιορισμού μίας μεθόδου που θα μπορεί να αποδώσει την αιτιολόγηση της καρκινογένεσης στον ιό (32). Η προσπάθεια υιοθέτησης μιας μεθόδου παρόμοιας με το τεστ ΠΑΠ στον τράχηλο, δεν είχε επιτυχία, καθώς δεν είναι δυνατή η οπτικοποίηση των διαφορών δύο ειδών καρκινωμάτων (32). Επίσης δεν είναι δυνατή η ανίχνευση προκαρκινικών αλλοιώσεων, κάτι που γίνεται 48

45 πολύ συχνά στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Έτσι ο μόνος τρόπος διάκρισης των HPV-θετικών από τους HPV-αρνητικούς όγκους της Κεφαλής και του Τραχήλου είναι οι μοριακές ενδείξεις, οι οποίες συχνά αποτελούν αντικείμενο αμφισβήτησης από πολλούς ερευνητές (30,31,32). Έχει αναφερθεί ότι η μόλυνση από τον ιό HPV αποτελεί ένα πρώιμο γεγονός στην περίπτωση των HNSCCs (1). Ο μηχανισμός δράσης του ιού σε αυτούς τους όγκους παρουσιάζει το πρότυπο επίθεσης-αποχώρησης (hit-andrun-mechanism) (1,33). Σύμφωνα με αυτό το πρότυπο, η μόλυνση από τον ιό είναι το γεγονός που σημαίνει την έναρξη των ογκογεννητικών διαδικασιών, αλλά δεν είναι αναγκαία στη συνέχεια του κακοήθους μετασχηματισμού, έτσι ο ιός απορρίπτεται από το κύτταρο. Αυτό έχει παρατηρηθεί και σε καλλιέργειες κυττάρων από αρχικά στάδια όγκων της Κεφαλής και του Τραχήλου, όπου ο ιός χάνεται στην πορεία της καλλιέργειας(1,33). Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι οι θετικοί για τον ιό HNSCCs φέρουν το p53 άγριου τύπου, ενώ οι όγκοι που προέρχονται από χρήση αλκοόλ ή καπνού φέρουν το μεταλλαγμένο p53 (30,34). Υπάρχουν μελέτες που αναφέρουν την ύπαρξη του μεταλλαγμένου p53 και σε θετικούς για τον ιό όγκους, αλλά σε μικρά ποσοστά (34). Κάποιοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι η μόλυνση από τον ιό ατόμων που ήδη φέρουν γενετικές μεταλλάξεις στο p53 αυξάνει τις πιθανότητες εμφάνισης καρκίνου στην Κεφαλή και τον Τράχηλο (28,29). Τα αντίγραφα του ιού που ανιχνεύονται σε όγκους του ρινοφάρυγγα είναι συχνά λιγότερα από αυτά που ανιχνεύονται σε όγκους του τραχήλου της μήτρας. Το χαρακτηριστικό των χρόνιων μολύνσεων σε αυτούς τους όγκους είναι η περιοδική αυξομείωση του ιικού πολλαπλασιασμού. Αυτό ίσως και να αποτελεί την αιτία του μεγάλου εύρους ποσοστών HPV-θετικών όγκων που αναφέρονται στις διάφορες μελέτες (0-90%) (1,27). Ένα ακόμα γονίδιο που εμπλέκεται στη διαδικασία καρκινογένεσης στους όγκους της Κεφαλής και του Τραχήλου είναι το CDKN2A (35,36). Το προϊόν του η πρωτεΐνη p16, είναι ένας εξαρτώμενος από κυκλίνη αναστολέας κινάσης που εμποδίζει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Rb και έτσι εμποδίζει τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλοι από τη G1 φάση στην S φάση. Η απώλεια της p16 INK4a μέσω εξάλειψης, μετάλλαξης ή υπερμεθυλίωσης είναι ένα συνηθισμένο γεγονός στους HNSCCs, και 49

46 σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση και μικρότερα ποσοστά επιβίωσης. Αντίθετα, η υπερέκφραση της p16 σχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση και απόκριση στις επιλεγμένες θεραπείες (35,36). Υπερέκφραση της p16 συμβαίνει στο κύτταρο σαν αποτέλεσμα της απενεργοποίησης της prb από την Ε7 πρωτεΐνη του ιού HPV. Η αδρανοποίηση της prb οδηγεί σε ενεργοποίηση του CDKN2A και συνεχή παραγωγή της p16 (35,36). Έτσι, αφού η Ε7 πρωτεΐνη είναι απαραίτητη για την αύξηση της έκφρασης της p16, έχει προταθεί ότι η ανίχνευσή της σε μεγάλες συγκεντρώσεις στα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζει την εμπλοκή του ιού HPV στην διαδικασία της καρκινογένεσης (37). Πολλά εργαστήρια χρησιμοποιούν την έκφραση της p16 για να καθορίσουν τους HPV-θετικούς όγκους (37). Εικ. 11 Μικροφωτογραφίες που δείχνουν διάχυτη ανοσολογική αντίδραση p16ink4a (Α) και το ISH πυρηνικό σήμα hr-hpv (Β) σε μη κερατινοποιημένο στοματοφαρυγγικό καρκίνωμα. Απουσία της έκφρασης p16 (C) και ISH σήματος hr-hpv (D) σε κερατινοποιημένο καρκίνωμα γλώσσας. (Ανατύπωση από Morbini P. et all 2013) 50

47 Το πιο αντικειμενικό κριτήριο για τη θετικότητα ενός όγκου στον ιό HPV ίσως είναι η έκφραση των mrna των γονιδίων Ε6 και Ε7 που σηματοδοτεί την ενσωμάτωση του ιικού στο κυτταρικό DNA (24,37). Παρ όλα αυτά, μόνο ένα μικρό ποσοστό όγκων της κεφαλής και του τραχήλου, όπου ανιχνεύεται το γονιδίωμα του ιού, εκφράζουν ιικά Ε6 και Ε7 αντίγραφα. Έχει προταθεί ότι η ανίχνευση των Ε6 και Ε7 mrnas μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος επιλογής των HPV-θετικών καρκινωμάτων της Κεφαλής και του Τραχήλου, αλλά κάτι τέτοιο δεν έχει παγιωθεί ακόμα (24,28,38,39). Τα στελέχη του ιού που ανιχνεύονται στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου είναι κυρίως το HPV16 (ανιχνεύεται στο 85-95% των HPV-θετικών όγκων της κεφαλής και του τραχήλου, ενώ στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ανιχνεύεται στο 50-60% των περιπτώσεων), ακολουθούμενο από το HPV18 (26,28,29,38,39,40). Άλλα στελέχη που ανιχνεύονται στον καρκίνο του στόματος και του ρινοφάρυγγα είναι τα HPV31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68 αλλά και τα χαμηλής ογκογεννητικότητας (low risk) 6,11,40,42,44,61 και 73 (26,28,34,40 ). 1.6 Ανατομία της Στοματικής Κοιλότητας Η στοματική κοιλότητα χωρίζεται με τον οδοντικό φραγμό και τα ούλα σε δύο μέρη: το εξωτερικό και μικρότερο, που είναι το προστόμιο, και το εσωτερικό και μεγαλύτερο μέρος, που είναι το ιδίως κοίλο του στόματος. Το προστόμιο είναι ο χώρος ανάμεσα στα χείλη και την παρειά (μάγουλο), από τη μια πλευρά, και τα δόντια από την άλλη, και επικοινωνεί μέσω της στοματικής σχισμής με το εξωτερικό περιβάλλον. Όταν τα άνω και τα κάτω δόντια εφάπτονται, το προστόμιο επικοινωνεί με το ιδίως κοίλο του στόματος, πίσω από τον τρίτο γομφίο (φρονιμίτη) (41). 51

48 Εικ. 12 Ανατομία της στοματικής κοιλότητας (Ανατύπωση από giatriko.blogspot.com) Το ιδίως κοίλο του στόματος καταλαμβάνεται από τη γλώσσα. Η γλώσσα είναι ένα ευκίνητο, μυώδες όργανο, που εξωτερικά καλύπτεται από βλεννογόνο. Τα δύο πρόσθια τριτημόρια της ανήκουν στη στοματική κοιλότητα, ενώ το οπίσθιο τριτημόριο της γλώσσας (ρίζα της γλώσσας) ανήκει στο φάρυγγα (41). Όριο μεταξύ τους είναι μια αύλακα σε σχήμα V που ονομάζεται τελική αύλακα. Το σημείο συμβολής των σκελών του V χαρακτηρίζεται ως τυφλό τρήμα. Η γλώσσα προσφύεται στο έδαφος του στόματος μέσω μιας πτυχής, που ονομάζεται χαλινός της γλώσσας (41). Δεξιά και αριστερά του χαλινού της γλώσσας εντοπίζεται μια άλλη πτυχή, το υπόστρωμα της οποίας είναι ο υπογλώσσιος σιελογόνος αδένας. Επίσης 52

49 διακρίνονται και τα εκφορητικά στόμια του υπογλωσσίου και υπογναθίου σιελογόνων αδένων (41). Ένα ινώδες διάφραγμα, το διάφραγμα της γλώσσας, χωρίζει τη γλώσσα σε δεξιό και αριστερό ημιμόριο και χρησιμεύει για την πρόσφυση των μυών (41). Εικ. 13 Τομή της στοματικής κοιλότητας (Ανατύπωση από giatriko.blogspot.com) Η υπερώα (ουρανίσκος) αποτελεί την οροφή της στοματικής κοιλότητας και ταυτόχρονα το έδαφος της ρινικής κοιλότητας. Μόνο το μπροστινό τμήμα της υπερώας έχει οστική στήριξη και χαρακτηρίζεται ως σκληρή υπερώα. Στο σχηματισμό της συμμετέχουν τα δυο υπερώια οστά και οι δύο άνω γνάθοι (41). Ο βλεννογόνος της σκληρής υπερώας προσφύεται στέρεα στο οστό και εμφανίζει πολυάριθμες πτυχώσεις. Η σκληρή υπερώα προς τα πίσω συνεχίζεται με τη μαλθακή υπερώα, ένα όργανο με ινομυώδη σύσταση. Η μαλθακή υπερώα αποφράσσει το ρινοφάρυγγα κατά τη διαδικασία της κατάποσης, προκειμένου να αποφευχθεί η ανάρροια της τροφής από τη μύτη. Η μαλθακή υπερώα καταλήγει σε ένα κωνικό έπαρμα, τη σταφυλή (41). 53

50 Οι αμυγδαλές συμπαγή όργανα του λεμφικού ιστού που βρίσκονται στο πλάγιο τοίχωμα του στοματοφάρυγγα. Η αμυγδαλές καλύπτονται από κάψα και εμφανίζουν πάνω στην επιφάνειά τους μικρά στόμια που οδηγούν στις αμυγδαλικές κρύπτες (42). Εικ 14. Αμυγδαλές (Ανατύπωση από giatriko.blogspot.com) 1.7 Καρκίνος του στόματος Τα τελευταία χρόνια, παρά τις εκστρατείες κατά του καπνίσματος, έχει σημειωθεί αύξηση της εμφάνισης του καρκίνου του στόματος, σε άνδρες και γυναίκες, με τα δύο τρίτα των ασθενών να είναι άνδρες (1,34,40,43,44). Πάνω από το 50% των ασθενών παρουσιάζουν τοπικά προχωρημένη νόσο με μεταστάσεις κατά τη διάγνωση (28,45). Η πενταετής επιβίωση των ασθενών βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα, παρά τις προσπάθειες που έχουν σημειωθεί για έγκαιρη διάγνωση και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις(34,37,40,45). Το κάπνισμα κυρίως και η κατανάλωση οινοπνεύματος αποτελούν τους 54

51 σπουδαιότερους προδιαθεσικούς παράγοντες (28,37,46). Ειδικά στην περίπτωση του καρκίνου του κάτω χείλους, κυρίως υπεύθυνη είναι η χρόνια έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία(47,48). Η πρόγνωση για τον καρκίνο του στόματος είναι πολύ δύσκολη ενώ το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι 30-55%, εκτός από τον καρκίνο του χείλους του οποίου το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης φτάνει το 95% (37,46,48). Η κλινική εικόνα του καρκίνου του στόματος ποικίλλει. Στην πλειοψηφία των καρκίνων του στόματος δεν παρατηρούνται κλινικά προκαρκινικές βλάβες (24). Προκαρκινική βλάβη μορφολογικά είναι ο τροποποιημένος ιστός στον οποίο αναπτύσσεται ευκολότερα καρκίνος συγκριτικά με το φυσιολογικό ιστό (1,34,46). Συνήθως παρατηρούνται ελκώσεις που δεν επουλώνονται και διογκώσεις με ανώμαλη ή ελκωμένη επιφάνεια (24,48,49). Στα αρχικά στάδια ανάπτυξης, ο καρκίνος του στόματος δεν προκαλεί πόνο ή άλλα συμπτώματα. Ως αποτέλεσμα, οι ασθενείς συχνά αγνοούν την ύπαρξη του προβλήματος. Προοδευτικά μπορούν να εμφανιστούν πόνος, αιμορραγία, δυσφαγία, οδυνοφαγία, αιμορραγία, βράγχος φωνής, δυσκολία στην αναπνοή, πόνος στο αυτί, απώλεια βάρους, περιορισμένη κινητικότητα της γλώσσας ή των γνάθων, και διογκώσεις των λεμφαδένων του τραχήλου (49). Μεταστάσεις εμφανίζονται συχνά στους επιχώριους λεμφαδένες και συχνότερα στους υπογνάθιους και τραχηλικούς λεμφαδένες (49). Οι μεταστάσεις σε μακρινές περιοχές είναι σπανιότερες και παρατηρούνται στους πνεύμονες και στο ήπαρ (1). Ο καρκίνος του στόματος μπορεί να αναπτυχθεί οπουδήποτε στο στόμα, όμως πιο συχνά εμφανίζεται στη γλώσσα, στη βάση της γλώσσας, στις αμυγδαλές, στο έδαφος του στόματος, στις παρειές, τις γνάθους και το κάτω χείλος (1,28,34,44,50). 55

52 Εικ. 15 Καρκίνος Γλώσσας (ανατύπωση από klinikiagiosloukas.gr) Στοματική κοιλότητα και HPV Η ανίχνευση του ιού στο στοματικό επιθήλιο υγειών ατόμων αναφέρεται σε ποσοστά από 0 ως 25% (51). Αν και οι περισσότερες μελέτες αναφέρουν πολύ χαμηλά ποσοστά εμφάνισης του ιού σε απόλυτα υγιείς ενήλικες, ορισμένες μελέτες παρουσιάζουν αρκετά σημαντικά ποσοστά ανίχνευσης του ιού στο στοματικό επιθήλιο ατόμων που δεν έφεραν προκαρκινικές αλλοιώσεις. Υπάρχουν ερευνητές που αναφέρουν την εμφάνιση του ιού στο στόμα ως τυχαίο γεγονός (51) Σε όγκους της στοματικής κοιλότητας ο ιός HPV μπορεί να ανιχνευτεί σε ποσοστά που κυμαίνονται από 0 ως 74% (24,29,44). Οι διαφορές στα ποσοστά οφείλονται στη γεωγραφική κατανομή, στη γενική υγεία των εθελοντών και στις μεθόδους ανίχνευσης και τυποποίησης του ιού που χρησιμοποιεί το κάθε εργαστήριο (29,37). Επιπλέον, η εμφάνιση του ιού στο στόμα μπορεί να σχετίζεται με διάφορες ασθένειες και ανοσοποιητικές ανεπάρκειες (52). Αρκετοί ερευνητές μάλιστα θεωρούν την ανίχνευση του ιού στο στοματικό επιθήλιο ασθενών με καρκίνο του στόματος αποτέλεσμα δευτερογενούς μόλυνσης, λόγω της αδυναμίας του ανοσοποιητικού συστήματος να αντιμετωπίσει την εισβολή του ιού μετά την ανάπτυξη καρκινώματος στην περιοχή (51). Επιπλέον, η ασυνέχεια στο στοματικό 56

53 επιθήλιο που προκαλούν οι στοματικοί όγκοι (έλκη και διογκώσεις) μπορεί να ευνοούν την μόλυνση από τον ιό (3,51). Η εμφάνιση στοματικών όγκων σε ασθενείς χωρίς ιστορικό κατανάλωσης καπνού ή και αλκοόλ, καθώς και εμφάνιση αυτού του είδους καρκίνου σε άτομα ηλικίας κάτω των 50 ετών, έχει οδηγήσει σε διαχωρισμό από τους ερευνητές αυτών των καρκίνων ως μια ξεχωριστή υποενότητα (27,28,29,38,44). Ειδικά για τον καρκίνο των αμυγδαλών, της γλώσσας και της βάσης της γλώσσας, η διεθνής βιβλιογραφία αποδίδει την καρκινογένεση στην μόλυνση από τον ιό HPV σε ποσοστά που αγγίζουν το 90% (43,44). Κάποιοι συγγραφείς μιλούν για «Επιδημία HPV στο στόμα» που οδηγεί σε μεγάλη αύξηση των περιστατικών καρκίνου της γλώσσας και των αμυγδαλών (40,42,43,44). Ορισμένοι μάλιστα ερευνητές υποστηρίζουν ότι ειδικά για τον καρκίνο των αμυγδαλών, η ανίχνευση του ιού HPV αποτελεί σημαντική ένδειξη πιθανής εμφάνισης καρκίνου, αφού ο ιός ανιχνεύεται και μέχρι δέκα χρόνια πριν από την διάγνωση του καρκίνου (42). Εικ. 16 Καρκίνος αριστερής παρισθμίου αμυγδαλής (Ανατύπωση από www. Iatrikionline.gr) Όπως και στους όγκους των υπόλοιπων περιοχών της Κεφαλής και του Τραχήλου, στους όγκους του στόματος (Head and Neck Squamous Cell 57

54 Carcinomas s Oral Squamous Cell Carcinomas) παρατηρείται μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης και καλύτερη πρόγνωση (27,28,29,34,38,40,45). Ειδικά στους παιδικούς καρκίνους, το ποσοστό επιβίωσης ασθενών με HPV-θετικούς όγκους στόματος φτάνει το 98% (53). Αν και τα HPV-θετικά OSCCs φτάνουν στη διάγνωση σε μικρότερη Τ- κατηγορία, δείχνουν μια τάση για μεγαλύτερη Ν-κατηγορία (29,45). Με αυτή τη λογική, ένα μεγάλο τμήμα των στοματικών HPV-θετικών όγκων αποτελούν μετάσταση από πρωτοπαθή όγκο μάλλον άλλης περιοχής του στοματοφάρυγγα (29,33). Η ετερογένεια στη βιολογική και κλινική συμπεριφορά τους έχει απασχολήσει πολλούς ερευνητές που την αποδίδουν στις διαφοροποιήσεις στο ιικό φορτίο και/η στην έκφραση του ιικού γονιδιώματος(33). Πολλές χώρες έχουν στρέψει τις ελπίδες τους για περιορισμό της εμφάνισης του καρκίνου του στόματος στον εμβολιασμό ενάντια στον ιό HPV, χορηγώντας το εμβόλιο και σε νεαρά αγόρια (27,28,40). Καθώς στα περιστατικά HPV-θετικών OSCCs ανιχνεύεται κατά 90% το στέλεχος HPV16, υπάρχει βιολογική βάση για την πιθανή αποτελεσματικότητα των εμβολίων που προστατεύουν από το συγκεκριμένο στέλεχος στην πρόληψη του καρκίνου του στόματος-στοματοφάρυγγα, θα απαιτηθούν όμως μακροχρόνιες προοπτικές μελέτες για να επιβεβαιωθεί αυτό το ενδεχόμενο (29,40,45). 1.8 Θεραπευτικες Προσεγγίσεις στον Καρκίνο του Στόματος Η αντιμετώπιση του καρκίνου του στόματος αποτελεί παράδειγμα συνεργασίας πολλών και διαφορετικών ειδικοτήτων όπως γναθοπροσωπικών χειρουργών, ακτινοθεραπευτών, χημειοθεραπευτών, πλαστικών χειρουργών, παθολόγων, οδοντιάτρων, καθώς και άλλων επιστημόνων όπως διαιτολόγων, ψυχολόγων, λογοθεραπευτών (54). Οι θεραπευτικές επιλογές εξαρτώνται από το μέγεθος και την εντόπιση του πρωτοπαθούς όγκου, το ιστολογικό στάδιο της βλάβης, την κατάσταση των επιχώριων λεμφαδένων, την ύπαρξη ή όχι απομακρυσμένων μεταστάσεων, την ανοχή του ασθενή στη θεραπεία και τις επιθυμίες του. Τα διαθέσιμα θεραπευτικά σχήματα περιλαμβάνουν: 58

55 1) Χειρουργική, 2) Ακτινοθεραπεία, 3) Χημειοθεραπεία, 4) Συνδυασμό θεραπευτικών σχημάτων, και 5) Προληπτικές στρατηγικές που περιλαμβάνουν αλλαγή του τρόπου ζωής και χημειοπροφύλαξη (54). Η χειρουργική θεραπεία και/η ακτινοθεραπεία παραμένουν ο χρυσός κανόνας στη θεραπεία του καρκίνου του στόματος ιδίως σε ασθενείς των σταδίων III και IV, ενώ η χημειοθεραπεία προστίθεται για να μειωθεί η πιθανότητα μετάστασης, να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα στην ακτινοβολία ή για εκείνους τους ασθενείς που έχουν αποδεδειγμένα απομακρυσμένη μετάσταση (55,56). Σημαντική εξέλιξη αποτελεί η χρήση των χημειοπροφυλακτικών φαρμάκων. Τα χημειοπροφυλακτικά είναι χημικές ουσίες φυσικής ή συνθετικής προέλευσης που μειώνουν τη συχνότητα εκδήλωσης νόσων όπως ο καρκίνος πριν εμφανιστούν τα κλινικά συμπτώματα δηλαδή στη φάση πρώιμου μετασχηματισμού του βλεννογόνου. Τα χημειοπροφυλακτικά μπορούν να καταστείλουν την προαγωγή του καρκίνου και να αποτρέψουν το μετασχηματισμό των προκαρκινικών κυττάρων με μεταβολή της διαφοροποίησης(54,55,56). Το πιο κοινό χαρακτηριστικό τους είναι η ικανότητά τους να πυροδοτούν απόπτωση σε μετασχηματισμένα κύτταρα. Παραδείγματα ομάδων χημειοπροφυλακτικών είναι τα καριτενοειδή, τα ρετινοειδή και οι τοκοφερόλες. Κλινικά υπάρχει πλεονέκτημα στο συνδυασμό χημειοπροφυλακτικών με τα χημειοθεραπευτικά, ειδικά με τους αλκυλιωτικούς παράγοντες. Ανεξάρτητα από το είδος της χρησιμοποιούμενης θεραπείας, ο σημαντικότερος παράγοντας που επηρεάζει τα μακροπρόθεσμα αποτελέσματα της είναι το στάδιο της νόσου κατά το χρόνο της αναγνώρισης (54). 1.9 HPV Θετικά Καρκινώματα Στόματος και Πρόγνωση Ο καρκίνος του στόματος θεωρείται επιθετικός, με γρήγορη μετάσταση στους λεμφαδένες της τραχηλικής χώρας (56). Εμφανίζει πολύ υψηλά ποσοστά θνησιμότητας, συνήθως λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης 59

56 (28,45). Άν όμως διαγνωστεί έγκαιρα και αντιμετωπιστεί πριν προχωρήσει στους βαθύτερους ιστούς και πριν προλάβει να κάνει μετάσταση στους λεμφαδένες, η πιθανότητα επιβίωσης φθάνει στο 80-90% (28). Τα καρκινώματα που σχετίζονται με HPV λοίμωξη εμφανίζουν καλύτερη πρόγνωση και απόκριση στις προτεινόμενες θεραπείες (28,33,34,40). Αυτό μπορεί να σχετίζεται με λόγους που δεν έχουν σχέση με τη βιολογία του ιού. Πράγματι, οι ασθενείς με θετικούς HPV όγκους του στόματος έχουν συνήθως μικρότερη ηλικία (δηλαδή καλύτερη γενική υγεία) και συνήθως απέχουν από επιβαρυντικές για τον οργανισμό συνήθειες όπως κάπνισμα και κατανάλωση αλκοόλ (24,28,33,38). Στους θετικούς για τον ιό HPV όγκους δεν ανιχνεύονται οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες (μετατόπιση, ανευπλοιδεία, ελλείψεις) όπως στα καρκινώματα του στόματος που προκαλούνται από το κάπνισμα ή την χρόνια κατανάλωση αλκοόλ (24,28). Ακόμα τα θετικά HPV καρκινώματα παρουσιάζουν καλύτερη απόκριση στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία, ίσως λόγω της μη κερατινοποιημένης ιστολογία τους (28,33, 34,38). Επίσης σημαντικό ρόλο παίζει η μη ύπαρξη μεταλλάξεων στο p53 και η διατήρηση του γονιδίουp16ink4a (33,34,37). Ειδικά το προϊόν του P16INK4a, η πρωτεΐνη p16 οδηγείται σε υπερέκφραση μετά την αδρανοποίηση της prb από την Ε7 του ιού, έτσι εμποδίζεται η μετάβαση του κυτταρικού κύκλοι από τη G1 φάση στην S φάση (33,34,37). Επιδημιολογικά δεδομένα από πολλές εργασίες, αναφέρουν ότι η πενταετής επιβίωση των ασθενών με θετικούς για τον ιό HPV όγκους του στόματος είναι σταθερά μεγαλύτερη από τους ασθενείς με HPV αρνητικούς όγκους, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι αυτού του είδους τα καρκινώματα ακολουθούν διαφορετικά μονοπάτια καρκινογένεσης (28.31,32,33,34,42). Όμως δεν είναι ακόμα εφικτό κλινικά να χρησιμοποιηθεί η θετικότητα στον ιό ως προγνωστικός παράγοντας ή ως παράγοντας σχεδιασμού θεραπείας (28,34,42). 60

57 ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανίχνευση HPV στελεχών, καθώς και έκφραση του mrna των Ε6 / Ε7 γονιδίων των υψηλού κινδύνου στελεχών HPV (16, 18, 31, 33 και 45) σε όγκους του στόματος (OSCCs). Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το ακτινοθεραπευτικό τμήμα του Γενικού Αντικαρκινικού Νοσοκομείου «Άγιος Σάββας» με στόχο την αξιολόγηση της ανίχνευσης του ιού HPV ως έγκυρου μοριακού δείκτη για την πρόγνωση και την επιλογή θεραπείας σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος. Η επιτακτική ανάγκη μιας καθολικής μεθόδου διάκρισης των μορφών καρκίνου του στόματος και η στοχευμένη θεραπεία, ανάλογα με την ανίχνευση ή όχι του ιού HPV στους όγκους, επιβάλει την εφαρμογή μιας μεθόδου ανίχνευσης που μπορεί να αναπαραχθεί με ακρίβεια και με δυνατότητα πρακτικής στην κλινική έρευνα. 61

58 62

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 63

60 64

61 2.1 Υλικά Α. Κυτταρολογικό υλικό Φιαλίδια Thin Prep που περιέχουν κύτταρα στοματικού επιθηλίου. Β. Διαλύματα και Υλικά Απομόνωση Νουκλεικών Οξέων από τα φιαλίδια Thin Prep NucliSENS Lysis Buffer 2 ml (biomérieux) NucliSENS easymag Magnetic Silica (biomérieux) NucliSENS Premix Diluent Αραιωτικό προμίγματος, περιέχει νερό χωρίς RNάσες/DNάσες και proclin. (biomérieux) EasyMag Buffer 1,2,3 (biomérieux) QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen (USA) PCR Buffer (10x) (Qiagen kit) (USA) MgCl 2 (Qiagen kit) (USA) Taq Polymerase (Qiagen kit) (USA) QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen (USA) ATL tissue lysis Buffer Proteinase K Spin Columns and collection tubes AL lysis Buffer AW1 wash Buffer AW2 wash Buffer AE emultion Buffer 65

62 Ανίχνευση και ταυτοποίηση των στελεχών του ιού με την μέθοδο των Μικροσυστοιχιών (Microarrays) PapilloCheck Kit (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany): Πλακάκια τα οποία περιέχουν 12 κελιά με μικροσυστοιχίες (A1-A6, B1- B6). MasterMix, το οποίο περιέχει όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR (εκκινητές, buffer, νουκλεοτίδια, PCR control DNA), εκτός της DNA πολυμεράσης. Διάλυμα υβριδισμού, το οποίο περιέχει όλα τα συστατικά που απαιτούνται για τον υβριδισμό. Διάλυμα A (concentrate) Διάλυμα B (concentrate) HotStarTaq DNA Polymerase 5u/μl (Qiagen) Nuclease free water (biomérieux) Ανίχνευση και προσδιορισμός των ογκοπρωτεινών Ε6 και Ε7 των στελεχών HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV45 με τη μέθοδο real time NASBA. NucliSENS EasyQ HPV v1.1 kit (biomérieux) Σφαιρίδιο αντιδραστηρίου: Τρία λυοφιλοποιημένα σφαιρίδια ανά σωληνάριο που περιέχουν νουκλεοτίδια, διθειοθρεϊτόλη και MgCl2 Αραιωτικό αντιδραστηρίου: TRIS/HCl, 45 % DMSO. Αποθεματικό διάλυμα KCl Μίγμα εκκινητών-ανιχνευτών U1A/HPV16 : Διάλυμα που περιέχει συνθετικούς εκκινητές και συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές (molecular beacon) για U1A και HPV16. 66

63 Μίγμα εκκινητών-ανιχνευτών HPV18/HPV31: Διάλυμα που περιέχει συνθετικούς εκκινητές και συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές (molecular beacon) για HPV18 και HPV31. Μίγμα εκκινητών-ανιχνευτών HPV33/HPV45: Διάλυμα που περιέχει συνθετικούς εκκινητές και συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές (molecular beacon) για HPV33 και HPV45. Σφαιρίδιο ενζύμων: Τρία λυοφιλοποιημένα σφαιρίδια ανά σωληνάριο που περιέχουν AMV-RT, RNase H, T7 RNA πολυμεράση και BSA. Αραιωτικό ενζύμων: Σορβιτόλη σε υδατικό διάλυμα. Θετικός μάρτυρας για U1A/HPV16/HPV18/HPV31/HPV33/HPV45: Λυοφιλοποιημένο σφαιρίδιο που περιέχει συνθετικό RNA του γονιδίου U1A και των τύπων του ιού HPV16/18/31/33/45. Νερό NASBA (Αρνητικός μάρτυρας και αραιωτικό): Περιέχει νερό χωρίς RNάσες/DNάσες. * U1A: U1 small nuclear ribonucleoprotein-specific A protein 2.2 Μέθοδοι Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 81 κυτταρολογικά δείγματα ασθενών με καρκίνο της στοματικής κοιλότητας που προσήλθαν στο Ακτινοθεραπευτικό Τμήμα του Νοσοκομείου «Άγιος Σάββας» από το Νοέμβριο του 2008 ως και το Νοέμβριο του Οι ασθενείς συμπλήρωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των δειγμάτων από το τμήμα Ιολογίας του Νοσοκομείου «Άγιος Σάββας» για ερευνητικούς σκοπούς. Στα κύτταρα του στοματικού επιθηλίου πραγματοποιήθηκε απομόνωση νουκλεικών οξέων με σκοπό την ανίχνευση του DNA και την τυποποίηση του ιού HPV. Ακολουθούσε η διαδικασία ανίχνευσης των ογκοπρωτεινών Ε6 και Ε7 με την μέθοδο NASBA πραγματικού χρόνου. Τα δείγματα προσέρχονται στο εργαστήριο σε ειδικά φιαλίδια Thin Prep και χωρίζονται σε ομάδες (τυχαίος διαχωρισμός) ώστε να πραγματοποιηθεί η διαδικασία απομόνωσης DNA. Η 67

64 ανίχνευση του DNA του ιού, η τυποποίηση των HPV γονότυπων και ο προσδιορισμός των ογκοπρωτεινών απαιτούσε διαδικασία σταδίων: Στάδιο 1: Απομόνωση νουκλεικών οξέων από τα στοματικά κύτταρα Στάδιο 2: Προετοιμασία και PCR του DNA των δειγμάτων με χρήση εκκινητών της περιοχής του Ε1 γονιδίου Στάδιο 3: Υβριδοποίηση του προϊόντος PCR σε ακινητοποιημένες μικροσυστοιχίες DNA (Microarrays) χαρακτηριστικές για τον κάθε τύπο HPV, χρήση ειδικού scanner για την ανίχνευση φθορισμού στις αλληλουχίες που υβριδοποιήθηκαν και κατάλληλο λογισμικό για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Στάδιο 4: Προετοιμασία των αντιδραστηρίων για την μέθοδο real time NASBA, μοίρασμα των αντιδραστηρίων και των νουκλεικών οξέων και προσθήκη των ενζύμων. Παρακολούθηση των αποτελεσμάτων (καμπυλών) σε πραγματικό χρόνο. Μετά το πέρας της διαδικασίας, τα αποτελέσματά μας συσχετίζονται με τα αποτελέσματα των κυτταρολογικών διαγνώσεων, ώστε να ακολουθήσει η στατιστική επεξεργασία. Για την στατιστική επεξεργασία χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι Fischer s Exact Test και Chi-Square. Τα φιαλίδια Thin Prep φυλάσσονται στους 40C και τα νουκλεικά οξέα στους -200C ώστε να είναι δυνατή η επανάληψη της διαδικασίας ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Η απομόνωση των DNA/RNA έγινε σύμφωνα με την μέθοδο απομόνωσης Boom χρησιμοποιώντας τον Nuclisens Extractor (biomérieux) και το πρωτόκολλο για την αυτοματοποιημένη απομόνωση. Τα νουκλεικά οξέα DNA και RNA απομονώθηκαν από 1 ml ιζήματος κυττάρων (που προέκυψε με φυγοκέντριση από 5 ml διαλύματος κυττάρων) και στη συνέχεια 68

65 τοποθετήθηκε σε lysis buffer. Τα νουκλεικά οξέα εκλούονται σε 55μl διαλύματος έκλουσης. [1 mmol/l Tris-HCl (ph 8.5)] και αποθηκεύονται στους C. Η μέθοδος που ακολουθείται βασίζεται στο Silica). μαγνητικό πυρίτιο (Magnetic Εικ. 17 Boom Technology (Ανατύπωση από Τα δείγματα λύονται στο buffer λύσης που περιέχει τον χαοτροπικό παράγοντα θειοκυανικό άλας γουανιδίνης (GuSCN). Τα κύτταρα, τα βακτήρια, και οι ιοί παρόντες στα δείγματα λύονται και οι πρωτεΐνες όπως οι νουκλεάσες μετουσιώνονται και αδρανοποιούνται. Τα νουκλεικά οξέα (RNA and DNA) απελευθερώνονται και προσδένονται σε μόρια πυριτίου. Ακολουθούν πολλά πλυσίματα με wash buffers Τελικά τα νουκλεικά οξέα εκχυλίζονται από τα μόρια του πυριτίου. Το εκχύλισμα είναι υψηλής καθαρότητας και πυκνότητας για ακολουθούμενες ενισχύσεις, αλληλουχίσεις και άλλες μοριακές διαγνωστικές μεθόδους. 69

66 Πρωτόκολο Απομόνωσης Νουκλεϊκών Οξέων 1. Καλή ανάδευση δειγμάτων στο διάλυμα ThinPrep 2. Μεταφορά 5mL ή και παραπάνω ανάλογα με την επάρκεια των κυττάρων στο διάλυμα σε καθαρό falcon 15 ml 3. Φυγοκέντριση δειγμάτων για 10 λεπτά στις 2000 rpm 4. Απομάκρυνση υπερκείμενου ώστε να παραμείνει 1 ml διαλύματος κυττάρων στο συντηρητικό μέσο ThinPrep 5. Επαναδιαλυτοποίηση ιζήματος 6. Μεταφορά διαλύματος κυττάρων στο lysis buffer και σφράγισμα του tube 7. Καλή ανάδευση 8. Τα δείγματα μένουν σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 10 λεπτά 9. Προετοιμασία οργάνου απομόνωσης 10. Μεταφορά λυμένων δειγμάτων στα δοχεία του οργάνου (vessel) 11. Προετοιμασία προμίγματος: προσθήκη 550 μl αραιωτικoύ προμίγματος και 550μl Magnetic Silica. 12. Καλή ανάδευση 13. Μεταφορά 100 μl από το παραπάνω διάλυμα σε κάθε ένα δείγμα που βρίσκεται στα vessel 14. Με την ολοκλήρωση της διαδικασίας απομονώνονται περίπου 55-60μl νουκλεικά οξέα 70

67 Εικ. 18 Συσκευή απόμόνωσης νουκλεϊκών οξέων Για τη διαδικασία ελέγχου, καθώς και για ορισμένα δείγματα στα οποία αντιμετωπίσαμε αδυναμία απομόνωσης Νουκλεϊκών Οξέων, λόγω της προηγούμενης θεραπείας των ασθενών, χρησιμοποιήθηκε το QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen (USA) απομόνωσης DNA. Απομόνωση DNA με χρήση QIAamp DNA Mini Kit 1. 3 ml δείγματος από υλικό thin prep φυγοκεντρούνται για 5 λεπτά στις 3000 rpm σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (4 ο C) για την απομόνωση των κυττάρων. 2. Αφαιρείται το υπερκείμενο και στο ίζημα προστίθεται 1 ml αιθανόλης 70%. 3. Το διάλυμα μεταφέρεται σε eppendorf και φυγοκεντρείται για 5 λεπτά στις rpm σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Το υπερκείμενο αφαιρείται και το ίζημα αφήνεται για 15 λεπτά στους 37 ο C για να στεγνώσει. 5. Ακολουθεί προσθήκη 180 μl διαλύματος ATL και ήπια ανάδευση για λύση των κυττάρων. 6. Προστίθενται 20 μl πρωτεϊνάσης Κ και ανάδευση με vortex. 71

68 7. Το διάλυμα μεταφέρεται σε κλίβανο στους 56 ο C όπου παραμένει για 40 λεπτά. 8. Με το πέρας των 40 λεπτών, το διάλυμα φυγοκεντρείται στιγμιαία στις 12000rpm (brief centrifuge) και προστίθενται 200μl διαλύματος AL. 9. Το διάλυμα αναδεύεται σε vortex για 15 sec και τοποθετείται σε κλίβανο στους 70 ο C για 10 λεπτά. 10. Ακολουθεί σύντομη φυγοκέντρηση στις rpm, προσθήκη 200μl απόλυτης αιθανόλης (96-100%), ανάδευση σε vortex για 15 sec και σύντομη φυγοκέντρηση. 11. Μετά τη φυγοκέντρηση, το διάλυμα μεταφέρεται σε spin column (κατακόρυφα και πολύ προσεκτικά) και φυγοκεντρείται στις 12000rpm για ένα λεπτό. 12. Το επάνω τμήμα του spin column μεταφέρεται σε νέο tube και προστίθενται 500μl διαλύματος AW Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 12000rpm και μεταφορά του επάνω τμήματος του spin column σε νέο tube. 14. Προσθήκη 500μl διαλύματος AW2 και φυγοκέντρηση για 3 λεπτά. 15. Το επάνω τμήμα του spin column μεταφέρεται σε νέο tube με καπάκι (eppendorf) και προστίθενται 140 μl διαλύματος ΑΕ. 16. Το δείγμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5λεπτά, φυγοκεντρείται για 1 λεπτό στις 12000rpm και απομακρύνεται το spin column, ενώ στο eppendorf παραμένει το απομονωμένο DNA ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ HPV ΜΕ MICROARRAYS Το PapilloCheck HPV-Screening Test (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) είναι ένα DNA σύστημα μικροσυστοιχιών (microarray) βασισμένο στην μέθοδο PCR για την ανίχνευση και ταυτοποίηση 24 γενοτύπων HPV, συμπεριλαμβανομένων 15 τύπων υψηλού κινδύνου (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82), 2 πιθανώς υψηλού κινδύνου (HPV 53, 66) και 7 τύπων χαμηλού κινδύνου ( HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 70). Κάθε πλακάκι περιλαμβάνει 12 υπερυψωμένα κελιά όπου περιέχεται μια μικροσυστοιχία με 28 πρόδρομα μόρια σε 5 αντίγραφα σημεία 72

69 (κηλίδες). Αυτά τα 140 σημεία είναι τοποθετημένα σε διάταξη 10x14 σε μια περιοχή περίπου 10 mm 2 (57). Διάταξη των σημείων κάθε κελιού στο πλακάκι του PapilloCheck Kit. Εικ. 19 Διάταξη των σημείων κάθε κελιού στο πλακάκι του PapilloCheck Kit. (Ανατύπωση από Η αρχή της δοκιμασίας βασίζεται στην ανίχνευση ενός θραύσματος του γονιδίου Ε1 του HPV. Ιικό και ανθρώπινο DNA απομονώνονται από ένα δείγμα τραχηλικού επιχρίσματος. Στη συνέχεια ένα θραύσμα DNA 350 περίπου νουκλεοτιδίων του γονιδίου Ε1 πολλαπλασιάζεται με την παρουσία συγκεκριμένων εκκινητών (primers) με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Οι ίδιοι εκκινητές παράγουν επίσης ένα προϊόν PCR από το πρότυπο ελέγχου PCR, το οποίο βρίσκεται στο PapilloCheck MasterMix. Επιπρόσθετα, ένα θραύσμα από το ανθρώπινο γονίδιο ADAT1 πολλαπλασιάζεται και σημαίνεται με τη φθορίζουσα χρωστική ουσία Cy5 στην ίδια αντίδραση.(ι) Έπειτα τα προϊόντα της αντιγραφής υβριδοποιούνται με συγκεκριμένους ανιχνευτές που βρίσκονται ακινητοποιημένοι στο DNA chip. Κάθε τύπος HPV ανιχνεύεται από έναν συγκεκριμένο DNA ανιχνευτή, ο οποίος βρίσκεται σε 5 μικροσκοπικά σημεία σε κάθε συστοιχία. Κατά τη διάρκεια των επακόλουθων 73

70 σταδίων πλυσίματος μη ειδικά προσδεμένα προϊόντα ή προϊόντα σε περίσσεια απομακρύνονται. (ΙΙ) Η σήμανση με φθορίζουσα ουσία λαμβάνει μέρος κατά τη διάρκεια της PCR και το στάδιο του υβριδισμού. Μετά τον υβριδισμό και την επακόλουθη έκλπυση, το PapilloCheck DNA chip σαρώνεται με το CheckScanner σε μήκη κύματος 532 και 635nm. Το φως του φθορισμού από τα προσδεμένα και σημασμένα προϊόντα ανιχνεύεται ύστερα από διέγερση με μονοχρωματικό φως. Με το λογισμικό ανάλυσης CheckReport γίνεται η σάρωση, η αξιολόγηση και η ανάλυση των αποτελεσμάτων.(ιιι) Εικ. 20 Στάδια διεξαγωγής της μεθόδου των Microarrays (PCR, υβριδισμός και ανάλυση του πλακιδίου) (Ανατύπωση από ) 74

71 Σημεία ελέγχου σε κάθε πλακάκι Σε κάθε πηγάδι υπάρχουν επίσης σε 5 αντίγραφα διαφορετικά σημεία (controls) που ελέγχουν τα διάφορα στάδια της όλης διαδικασίας (απομόνωση, ενίσχυση, υβριδισμός και προσανατολισμός του δείγματος). Αυτά τα σημεία ελέγχου πρέπει να δίνουν θετικό σήμα και τα πέντε τόσο στο μήκος κύματος των 532 nm όσο και των 635 nm. Αποτέλεσμα παίρνουμε μόνο εφόσον όλα τα control είναι έγκυρα. Σήματα σε μήκος κύματος 532nm (πράσινο) Έλεγχος εκτύπωσης Κάθε κηλίδα της μικροσυστοιχίας δίνει ένα σήμα στα 532nm. Ένας Cy3- σημασμένος ανιχνευτής στο διάλυμα του υβριδισμού αντιδρά με κάθε σημείο μέτρησης, επομένως ελέγχει την παρουσία και την ομοιογένεια όλων των DNA σημείων ελέγχου. Έλεγχος υβριδισμού Επιπρόσθετα, ο Cy3- σημασμένος ανιχνευτής στο διάλυμα υβριδισμού θα αντιδράσει με μια συμπληρωματική αλυσίδα DNA, η οποία βρίσκεται σε 5 από τα DNA σημεία μέτρησης. Αυτό ελέγχει την απόδοση της αντίδρασης του υβριδισμού. Έλεγχος προσανατολισμού 5 DNA σημεία ελέγχου δίνουν ένα σήμα στα 532nm ανεξάρτητα από την απόδοση του υβριδισμού. Αυτά ελέγχουν τον προσανατολισμό των πλεγμάτων ανάλυσης στη συστοιχία. Σήματα σε μήκος κύματος 635nm (κόκκινο) 75

72 Έλεγχος δειγμάτων (ανιχνευτής για το ανθρώπινο γονίδιο ADAT1) Ο εκκινητής για το θραύσμα του γονιδίου ADAT1 στο PapilloCheck MasterMix οδηγεί στην παραγωγή ενός προϊόντος PCR το οποίο στη συνέχεια δίνει ένα σήμα στις κηλίδες ελέγχου δείγματος, αν το ανθρώπινο DNA υπήρχε στο δείγμα. Σε περιπτώσεις όπου υπάρχει περίσσεια HPV DNA στο δείγμα, η ισχύς του σήματος από τα σημεία ελέγχου δείγματος μπορεί να μειωθεί. Αυτό αποτελεί άμεσο αποτέλεσμα του ανταγωνισμού κατά τη διάρκεια της PCR. Σε αυτή την περίπτωση, τουλάχιστον ένας συγκεκριμένος HPV ανιχνευτής πρέπει να υπερβεί ένα ορισμένο κατώφλι για να είναι η δοκιμασία έγκυρη. Έλεγχος PCR Κατά τη διάρκεια της PCR ένα επίσης θραύσμα μάρτυρα που υπάρχει στο MasterMix αντιγράφεται. Η ποιότητα της αντίδρασης πολυμεράσης εκτιμάται από το σήμα των 5 μικροσκοπικών σημείων ελέγχου PCR στη συστοιχία. Η πρόσδεση του προϊόντος της PCR σε αυτές τις κηλίδες εξασφαλίζει την αξιολόγηση της ποιότητας της PCR. Σε περιπτώσεις όπου υπάρχει περίσσεια HPV DNA στο δείγμα, η ισχύς του σήματος από τα σημεία ελέγχου PCR μπορεί να μειωθεί ή και να εξαφανιστεί. Αυτό είναι άμεσο αποτέλεσμα του ανταγωνισμού των εκκινητών κατά τη διάρκεια της PCR. Σε αυτή την περίπτωση, τουλάχιστον ένας συγκεκριμένος HPV ανιχνευτής πρέπει να υπερβεί ένα ορισμένο κατώφλι για να είναι η δοκιμασία έγκυρη. Ανίχνευση HPV Τo DNA του HPV ανιχνεύεται με τον υβριδισμό των ενισχυμένων PCR προϊόντων με ανιχνευτές ακινητοποιημένους στη μικροσυστοιχία. Κάθε DNA ανιχνευτής βρίσκεται σε 5 κηλίδες για να εξασφαλίζουν την ευρωστία της συστοιχίας. Συγκεκριμένοι ανιχνευτές για τους 24 τύπους HPV επιτρέπουν την ανίχνευση των 24 τύπων. Η διαφοροποίηση μεταξύ των HPV44 και HPV55 δεν είναι δυνατή, επειδή το ολιγομερές του HPV55 αλληλεπιδρά με αυτό του HPV44 και το τεστ δεν μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ των 2 τύπων και έτσι το αποτέλεσμα παρουσιάζεται ως HPV44/55. 76

73 Εικ. 21 Σκανάρισμα του πλακιδίου σε μήκος κύματος 532 nm (πράσινο) και 635 nm (κόκκινο) όπου φαίνονται τα σημεία ελέγχου και τα εξειδικευμένα ανά τύπο HPV ολιγομερή. (Ανατύπωση από 1. με κόκκινο περίγραμμα: έλεγχος προσανατολισμού 2. με κίτρινο περίγραμμα α)διακεκομμένη γραμμή: έλεγχος εκτύπωσης και ομοιογένειας του DNA β)συνεχής γραμμή: έλεγχος υβριδισμού 3. με μπλε περίγραμμα: έλεγχος PCR 4. με πορτοκαλί: έλεγχος δείγματος 5. και με φούξια περίγραμμα: ολιγομερή ταυτοποίησης HPV 77

74 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Σε αυτή τη φάση γίνεται αντιγραφή ενός θραύσματος DNA 350 περίπου νουκλεοτιδίων του γονιδίου Ε1 το οποίο πολλαπλασιάζεται με την παρουσία συγκεκριμένων εκκινητών (primers) με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Με εξαίρεση την θερμοανθεκτική πολυμεράση, (HotStar Taq polymerase), το PapilloCheck MasterMix περιέχει όλα τα συστατικά που απαιτούνται για την διεξαγωγή της PCR (ρυθμιστικά διαλύματα, Mgcl 2, dntps, DNase-free water, και σημασμένους εκκινητές.) Η PCR διεξάγεται σε ολικό όγκο 25μl χρησιμοποιώντας 0.2ml σωληνάκια αντίδρασης PCR με λεπτά τοιχώματα. Για κάθε αντίδραση τα συστατικά αναμειγνύονται όπως δείχνει ο παρακάτω πίνακας. ΠΙΝΑΚΑΣ 2. Υλικά PCR 1 αντίδραση 13 αντιδράσεις (1 chip) PapilloCheck MasterMix 19.8μl 257.4μl HotStar Taq polymerase (5U/μl) 0.2μl 2.6μl Συνολικός όγκος πριν την προσθήκη του δείγματος DNA από δείγματα Συνολικός όγκος ανά αντίδραση 20μl 5μl 25μl 260μl 78

75 Αν πρέπει να αναλυθούν πολλά δείγματα, το μείγμα της αντίδρασης (αποτελούμενο από PapilloCheck MasterMix και Ταq πολυμεράση) πρέπει να παρασκευαστεί στην ποσότητα που απαιτείται για όλες τις αναλύσεις. Όταν αναλύουμε πολλά δείγματα αυξάνουμε τον αριθμό αντιδράσεων από n σε n+1. Για παράδειγμα, αν πρέπει να αναλυθούν 12 δείγματα, θα γίνει η παρασκευή του όγκου του μείγματος της αντίδρασης για 13 αντιδράσεις πολλαπλασιασμού. ΠΙΝΑΚΑΣ 3. Πρόγραμμα θερμικών κύκλων Χρόνος Θερμοκρασία Αριθμός κύκλων 15min 95 0 C 1 30sec 25sec 45sec 95 0 C 55 0 C 72 0 C 40 30sec 95 0 C 45sec 72 0 C 15 Συντήρηση 4 0 C Ο όγκος της αντίδρασης πρέπει να είναι στα 25μl, η ταχύτητα ramp στα 9600 και η θερμοκρασία στο καπάκι στους C. Όταν ολοκληρωθεί η PCR, τα πολλαπλασιασμένα προϊόντα πρέπει να αποθηκεύονται στο σκοτάδι στους C ή να υβριδοποιούνται αμέσως. Υβριδισμός και πλυσίματα Τα προϊόντα της PCR του Ε1 γονιδίου υβριδίζονται με ειδικά HPV ολιγομερή τα οποία βρίσκονται ακινητοποιημένα πάνω στο πλακάκι. Η ανίχνευση αυτών των υβριδοποιημένων PCR προϊόντων πραγματοποιείται προσθέτοντας ένα 79

76 buffer υβριδισμού το οποίο περιλαμβάνει ένα ολιγομερές σημασμένο με 5- κυανίνη (Cy5-dUTP). Παρασκευή των διαλυμάτων πλυσίματος 1,2,3 Για την παρασκευή των διαλυμάτων αυτών αναμιγνύονται 140ml δις απεσταγμένο νερό με 14ml PapilloCheck διάλυμα Α και 1.75ml PapilloCheck διάλυμα Β. Έπειτα ακολουθεί διαχωρισμός του μείγματος σε 3 ίσα μέρη σε σωλήνες αντίδρασης (50ml) οι οποίοι ονομάζονται 1,2 και 3. Το διάλυμα 2 προθερμαίνεται στους 50 0 C πριν τη χρήση για τουλάχιστον 20 λεπτά. Τα διαλύματα πλυσίματος αλλάζονται για κάθε chip για την αποφυγή της μεταφοράς προϊόντων απομάκρυνσης. Υβριδισμός Αναμειγνύουμε 30μl από το PapilloCheck διάλυμα υβριδισμού σε ένα σωληνάκι αντίδρασης με 5μl από το προϊόν της PCR σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί μια γρήγορη φυγοκέντρηση, και κατόπιν μεταφέρονται 25μl από το μείγμα υβριδισμού σε κάθε πηγαδάκι στο πλακάκι. Επωάζουμε το πλακάκι για ακριβώς 15 min σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 Ο C) και σε υγρή ατμόσφαιρα. Ο υβριδισμός σε άλλες θερμοκρασίες μπορεί να προκαλέσει μια απώλεια στην ένταση του σήματος ή αύξηση του μη ειδικού φθορισμού. Επιπλέον, εφόσον ο όγκος του μείγματος υβριδισμού (διάλυμα υβριδισμού και προϊόν PCR), είναι πολύ μικρός και το στέγνωμα του στο chip πρέπει οπωσδήποτε να αποφεύγεται, είναι απαραίτητο να γίνεται ο υβριδισμός σε υγρή ατμόσφαιρα. Πλυσίματα Ξεπλένουμε το πλακάκι σε θερμοκρασία δωματίου στο διάλυμα πλυσίματος 1 μετακινώντας το γρήγορα πάνω-κάτω για 10sec. Οι συστοιχίες συνέχεια παραμένουν καλυμμένες με το διάλυμα. Στη συνέχεια ακολουθεί έκπλυση του πλακιδίου για 60sec στο διάλυμα πλυσίματος 2 στους 50 0 C μετακινώντας το 80

77 γρήγορα πάνω-κάτω. Και τέλος, έχουμε έκπλυση του chip σε θερμοκρασία δωματίου στο διάλυμα πλυσίματος 3 για 10sec. Πραγματοποιείται άμεση απομάκρυνση της υγρασίας από την επιφάνεια του chip με φυγοκέντρηση σε θερμοκρασία δωματίου για 3min στις 5000 στροφές. Το PapilloCheck chip είναι τώρα έτοιμο να σαρωθεί, αλλά μπορεί επίσης να φυλαχθεί για μια μόνο ημέρα προστατευμένο από σκόνη και φως σε θερμοκρασία δωματίου (58) REAL TIME NASBA To NucliSENS EasyQ HPV v1.1 είναι μια ανάλυση ενίσχυσης και ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων πραγματικού χρόνου για τον ποιοτικό προσδιορισμό του mrna των γονιδίων E6/E7 από πέντε καρκινογόνους τύπους HPV 16, 18, 31, 33 και 45 σε δείγματα απόξεσης στοματικού επιθηλίου. Η ενίσχυση βασίζεται σε δύο φάσεις-μία γραμμική και μία κυκλική. Απαιτείται η ενσωμάτωση του υποκινητή Τ7 ώστε να επιτραπεί η μεταγραφή από την T7 RNA πολυμεράση και να συντεθεί RNA. Τα απαραίτητα συστατικά της αντίδρασης αυτής είναι: ένα πρότυπο (RNA ή DNA) εκκινητής 1 που περιέχει τον υποκινητή Τ7 εκκινητής 2 νουκλεοτίδια για τη σύνθεση RNA και cdna και τα ένζυμα RNaseH (αποδομεί το RNA στα ετεροδίκλωνα RNA- DNA), Avian Myeloblastosis Virus (AMV*) αντίστροφη μεταγραφάση για σύνθεση cdna και T7 RNA πολυμεράση. Η διαδικασία διενεργείται στους 41 o C, τα συνήθη επίπεδα της ενίσχυσης είναι τουλάχιστον στην τάξη του

78 Συνοπτικά στις δύο φάσεις συμβαίνουν τα ακόλουθα: Γραμμική φάση: αντίστροφη μεταγραφή και εισαγωγή ενός T7 υποκινητή Κυκλική φάση: η σύνθεση RNA καταλύεται από την T7 πολυμεράση από τον αντίστοιχο υποκινητή Και οι δύο φάσεις γίνονται στους 41 o C, η διαδικασία δηλαδή είναι ισοθερμική. 82

79 Εικ. 22 Κυκλική και Γραμμική φάση REAL TIME NASBA (Ανατύπωση από 83

80 Τα προϊόντα RNA ανιχνεύονται με ειδικά μοριακά αναγνωριστικά σήματα (molecular beacons). Η αλληλουχία που υβριδοποιείται με την αλληλουχία στόχο είναι νουκλεοτίδια σε μορφή θηλιάς. Για κάθε στόχο η σήμανση είναι διαφορετική. Η διαδικασία αναλυτικά είναι η εξής: Προετοιμασία αντιδραστηρίων Θετικός Μάρτυρας (Λυοφιλοποιημένο σφαιρίδιο που περιέχει συνθετικό RNA του γονιδίου U1A και των τύπων του ιού HPV16/18/31/33/45) Στο λυοφυλιωμένο σφαιρίδιο θετικού μάρτυρα προσθέτω 220 μl NW και σε ένα eppendorf προσθέτω 195μl NW και 5μl από το παραπάνω διάλυμα. Ένζυμο (Τρία λυοφιλοποιημένα σφαιρίδια ανά σωληνάριο που περιέχουν AMV-RT, RNase H, T7 RNA πολυμεράση και BSA). Στο tube* με τα τρία λυοφυλιωμένα σφαιρίδια μεταφέρω 170 μl αραιωτικό ενζύμου και χτυπώ ελαφρά με το δάκτυλο *Κάθε tube χρησιμοποιείται για 8 αντιδράσεις Αντιδραστήριο-Reagent (Τρία λυοφιλοποιημένα σφαιρίδια ανά σωληνάριο που περιέχουν νουκλεοτίδια, διθειοθρεϊτόλη και MgCl2) Στο tube με τα τρία λυοφυλιωμένα σφαιρίδια μεταφέρω 240 μl αραιωτικό αντιδραστηρίου,48 μl KCl και 42 μl NW και αναδεύω αρκετά στο vortex. Παίρνω ένα tube ροζ χρώματος για τις αντιδράσεις U1A και 16 και προσθέτω 110 μl reagent mix και 10 μl διάλυμα εκκινητών-ανιχνευτών U1A/HPV16. Ομοίως και για τις αντιδράσεις 18,31 (μπλε tube) και 33,45 (κόκκινο tube) 84

81 Διανομή αντιδραστηρίων Οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε strips. Το stateau περιέχει 12 σειρές strips με 8 tube το καθένα (8Χ12=96 κελιά) Διανέμω 10 μl reagent-primers mix από το tube U1A/16 στα κελιά Α1-Η1 Διανέμω 10 μl reagent-primers mix από το tube 18/31 στα κελιά Α5-Η5 Διανέμω 10 μl reagent-primers mix από το tube 33/45 στα κελιά Α9-Η9 Διανομή δειγμάτων Μοιράζω 5μl ΝW-αρνητικός μάρτυρας (νερό χωρίς RNάσες/DNάσες) στα κελιά G4, G8, G12 Διανέμω τα δείγματα ως εξής: 1 ο δείγμα: Α1-Α5-Α9 2 ο δείγμα: Β1-Β5-Β9, κ.ο.κ. Προσθήκη ενζύμου Τα δείγματα βρίσκονται στον επωαστή σε 41 ο C Εν τω μεταξύ σε διάστημα 8 λεπτών πρέπει να έχω προσθέσει το ένζυμο σε κάθε κελί Σε κάθε καπάκι διανέμω 5 μl από το ένζυμο και τοποθετώ τα καπάκια στα κελιά 85

82 Ακολουθεί spin-vortex-spin στα κελιά με τα καπάκια και τέλος τα τοποθετώ στο μηχάνημα ώστε να ξεκινήσει η αντίδραση. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης είναι 20 μl. Η αντίδραση αρχίζει με την προσθήκη των ενζύμων και μετράται σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας τον Lambda FL 600 fluorescence reader 86

83 Ανίχνευση Τα προϊόντα RNA ανιχνεύονται με συγκεκριμένα αναγνωριστικά σήματα Η δομή αυτή αποτελείται από: Ανιχνευτές DNA με δομή στέλεχος-θηλιά και δύο τροποποιημένα άκρα νουκλεοτίδια είναι η θηλιά, συμπληρωματική με την αλληλουχία στόχο για υβριδισμό 6-7 νουκλεοτίδια το στέλεχος Διαφορετικά χρώματα για διαφορετικό στόχο Εικ. 23 Δομή Ανίχνευσης Προϊόντων RNA (Ανατύπωση από Όταν το αναγνωριστικό σήμα (beacon) είναι κλειστό στη μορφή στέλεχος-θηλιά φθορισμός δεν εκπέμπεται και δεν έχουμε σήμα. Όταν υπάρχει αλληλουχία-στόχος στο δείγμα το μόριο αρχίζει να υβριδίζεται στην αλληλουχία αυτή. Το μόριο αρχίζει να ανοίγει κ αρχίζει να εμφανίζεται φθορισμός, το σήμα ακόμα είναι χαμηλό. Όταν ταυτιστεί απόλυτα το μόριο με την αλληλουχία στόχο ανοίγει και εκπέμπεται δυνατός φθορισμός. 87

84 Εικ. 24 Δομή Ανίχνευσης Προϊόντων RNA (Ανατύπωση από Ο φθορισμός ανιχνεύεται σε πραγματικό χρόνο. Υπάρχει αναλογία μεταξύ της έντασης φθορισμού, την ποσότητα RNA που είχε το δείγμα και τα μόρια του σήματος που υβριδοποιήθηκαν. Εκθετική κινητική εμφανίζεται σε πραγματικό χρόνο. 88

85 Εικ. 25 Ανίχνευση πραγματικού χρόνου με μοριακό αναγνωριστικό σήμα (Ανατύπωση από Έλεγχος αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα τα ελέγχουμε σε τρία επίπεδα για να αποφασίσουμε για την εγκυρότητά τους: Α) Εγκυρότητα πειράματος Ελέγχω τα αποτελέσματα των αρνητικών και θετικών μαρτύρων και για τους τρεις τομείς U1A-16, 18-31, Αν δεν είναι έγκυρα το πείραμα πρέπει να επαναληφθεί Β) Εγκυρότητα δειγμάτων Εάν ο εσωτερικός μάρτυρας U1A φυσικό γονίδιο ανιχνευθεί (θετικό) το δείγμα είναι έγκυρο 89