ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 Ε Θ Ν Ι Κ Ο Μ Ε Τ Σ Ο Β Ι Ο Π Ο Λ Υ Τ Ε Χ Ν Ε Ι Ο ΣΧΟΛΗ Χ Η Μ Ι Κ Ω Ν Μ Η Χ Α Ν Ι Κ Ω Ν, Τομέας I V Ε ρ γ α σ τ ή ρ ι ο Β ι ο τ ε χ ν ο λ ο γ ί α ς ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Βασικές Οδηγίες Χρήσης PyMOL Ευάγγελος Τόπακας Χημικός, PhD Παύλος Χριστακόπουλος Αναπλ. Καθηγητής ΕΜΠ

2

3 Εισαγωγή Το παρόν εγχειρίδιο έχει ως σκοπό την υποστήριξη των εργαστηριακών ασκήσεων που πραγματοποιούνται στο πλαίσιο του μαθήματος Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία του 9 ου εξαμήνου του προγράμματος σπουδών της Σχολής Χημικών Μηχανικών του Ε.Μ.Π. Πρόκειται για βασικές οδηγίες χρήσης του λογισμικού απεικόνισης μοριακών δομών PyMOL v0.99 της εταιρείας DeLano Scientific LLC. Το πρόγραμμα αυτό αξιοποιεί πλήρως τις υπολογιστικές δυνατότητες ενός προσωπικού υπολογιστή παρέχοντας την απεικόνιση πρωτεϊνικών αλλά και γενικότερα οργανικών μορίων σε τρεις διαστάσεις καθιστώντας το εργαλείο απαραίτητο στη σύγχρονη βιοτεχνολογία και δομική βιολογία. Στα πλαίσια των εργαστηριακών μαθημάτων οι φοιτητές θα μάθουν τις βασικές λειτουργίες του λογισμικού εστιάζοντας περισσότερο στην κατανόηση της δομής των πρωτεϊνών και ειδικότερα των ενζύμων τα οποία αποτελούν και βασικό κομμάτι της εφαρμοσμένης βιοτεχνολογίας. Το σύγγραμμα αυτό παρέχεται και σε ηλεκτρονική μορφή στην ιστοσελίδα του μαθήματος Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία υπό τη μορφή αρχείου Acrobat (*.pdf) για να είναι δυνατή η κατανόηση σχημάτων με χρώμα. Για την ανάγνωση του ηλεκτρονικού συγγράμματος είναι απαραίτητη η εγκατάσταση του λογισμικού Acrobat Reader το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιμο στην ιστοσελίδα Κάθε παρατήρηση σχετικά με το περιεχόμενο του οδηγού αυτού είναι ευπρόσδεκτη, έτσι ώστε να προσφέρουμε ένα συνεχώς βελτιωμένο σύγγραμμα που θα ανταποκρίνεται στις ανάγκες των σπουδαστών της Σχολής.

4

5 1. Εισαγωγή Το PyMOL αποτελεί ένα σύστημα απεικόνισης μοριακών γραφικών σε πραγματικό χρόνο για τη δημιουργία τόσο εικόνων υψηλής ποιότητας όσο και κινουμένων σχεδίων (animation). Επίσης, είναι δυνατή η τροποποίηση υπαρχόντων αρχείων PDB (Protein Data Bank), βοηθώντας έτσι αποτελεσματικά την δομική μελέτη πρωτεϊνικών μορίων. Πρόκειται για ένα πρόγραμμα ανοικτού λογισμικού το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιμο (μέχρι την έκδοση v0.99) μέσω του διαδικτύου στον παρακάτω σύνδεσμο: Οι εκδόσεις του PyMOL πέρα της v0.99 απαιτούν πληρωμή ενώ αντίθετα εξακολουθεί ο κώδικας να είναι ανοικτός (open-source access). Για τον λόγο αυτό, δεν συνίσταται το κατέβασμα της τελευταίας έκδοσης v1.0 η οποία λόγο κόστους είναι αντίθετη στη διδασκαλία του εργαστηριακού μαθήματος. Στην ιστοσελίδα PyMolWiki υπάρχουν χρήσιμες πληροφορίες και σύνδεσμοι (links) για το PyMOL οι οποίες ανανεώνονται συχνά: 2. Δυνατότητες προγράμματος Συμβατότητα: Το PyMOL υποστηρίζει συστήματα Unix, Macintosh όπως και Windows. Χειρισμός μέσω γραφικού περιβάλλοντος (Graphical User Interface, GUI) και μέσω εντολών (command line): Ο ταυτόχρονος χειρισμός δίνει στο χρήστη τη δυνατότητα τόσο απλής όσο και εξειδικευμένης χρήσης του προγράμματος. Επιλογή ατόμων, διαίρεση και ένωση μοριακών δομών: Πρωτεϊνικά μόρια μπορεί να κοπούν, να μοιραστούν και τελικά να ενωθούν πολύ σύντομα, παράγοντας καινούργια αρχεία PDB. 1

6 Ταινίες: Δυνατότητα δημιουργίας animation και εξαγωγή αυτών σε διάφορα πρωτόκολλα όπως GIF ή mpeg χρησιμοποιώντας εξειδικευμένες εντολές. Απεικόνιση των πρωτεϊνών με διάφορους τρόπους όπως π.χ. σε επιφάνειες (surface), cartoon ή ribbons: Η δυνατότητα απεικόνισης των πρωτεϊνών με τους τρεις αυτούς τρόπους γίνεται αρκετά εύκολα και σε ποιότητα ίδια με εκείνη άλλων εξειδικευμένων προγραμμάτων γνωστών στο χώρο της Δομικής Βιολογίας όπως το Molscript. Φωτοσκίαση: Ένα πανίσχυρο ενσωματωμένο πρόγραμμα (Ray-tracer) δίνει τη δυνατότητα στο PyMOL δημιουργίας σκιάσεων και βάθους σε κάθε εικόνα, παράγοντας έτσι εικόνες εντυπωσιακών γραφικών. Εξαγωγή: Οι εικόνες του PyMOL μπορούν να εξαχθούν σε αρχεία PNG τα οποία μεταφέρονται απευθείας στο MS Powerpoint. Δυνατότητα προσθήκης συμπληρωματικών χαρακτηριστικών (plugins) εμπλουτίζοντας τις δυνατότητες ή απλοποιώντας δύσκολες τεχνικές όπως για παράδειγμα την κατασκευή μοριακών βίντεο. Χρήσιμα plugins: Colorama (αύξηση δυνατοτήτων χρωματισμού) o ProMOL (εύρεση καταλυτικών κέντρων) o Emovie (ευκολότερη δημιουργία μοριακών βίντεο) o Ez-Viz (ευκολότερη διαχείριση μοριακών δομών) o 2

7 3. Εγκατάσταση σε Περιβάλλον MS Windows Προτιμώμενη εγκατάσταση: Windows 2000 ή XP. Σχετικά σύγχρονο μοντέλο κάρτας γραφικών με επιταχυντή γραφικών συμβατό με 3D OpenGL της nvidia, ATI, 3Dlabs ή παρόμοια αυτών. 512 ΜΒ RAM (προτιμότερα 768 ΜΒ ή 1 GB). Επεξεργαστής στα 3 GHz Pentium 4 ή παρόμοιος. Ελάχιστες απαιτήσεις: Windows 98 και ME, ή νεότερες εκδόσεις αυτών. Το PyMOL δεν είναι συμβατό με τα Windows 95 και NT. Κάρτα γραφικών με επιταχυντή γραφικών συμβατό με 3D OpenGL. 256 MB RAM. Επεξεργαστής 500 MHz Pentium Διαδικασία Εγκατάστασης 1. Κατεβάζουμε από το σύνδεσμο το συμπιεσμένο αρχείο *.zip όπως για παράδειγμα το παρακάτω: pymol-0_99-bin-win32.zip 2. Αποσυμπίεση του αρχείου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα WinZip. Οι χρήστες Windows XP ανοίγουν το αρχείο αυτό (*.zip) απευθείας. 3. Διπλό κλικ στο εικονίδιο Setup ή Setup.exe. 4. Ακολουθούμε τη διαδικασία μέσω του οδηγού εγκατάστασης των Windows. Μετά την επιτυχή εγκατάσταση του PyMOL, η εφαρμογή μπορεί να τρέξει από το Start Menu των Windows. 3

8 3.2 Φορτώνοντας αρχεία PDB Χρησιμοποιώντας τον εξωτερικό GUI Ο εξωτερικός GUI παρέχει την κλασσική επιλογή <Open> από το μενού <File> η οποία μας δίνει τη δυνατότητα να επιλέξουμε (Browse) το αρχείο PDB που θέλουμε να ανοίξουμε. Χρησιμοποιώντας εντολές Load <όνομα αρχείου> παράδειγμα load test/dat/pept.pdb Εικόνα από το PyMOL μετά τη φόρτωση ενός αρχείου PDB. 4

9 4. Τα παράθυρα του PyMOL Το PyMOL ανοίγει δυο παράθυρα: Το εσωτερικό και εξωτερικό παράθυρο του GUI. Τα δύο παράθυρα του PyMOL Το GUI είναι η συντομογραφία του Graphical User Interface, το οποίο αποτελείται συνήθως από μενού, κουμπιά, κείμενα και άλλα γνωστά στους χρήστες Windows χαρακτηριστικά. Το PyMOL διαθέτει δύο τέτοια GUI: Ένα εσωτερικό το οποίο βρίσκεται μέσα στο παράθυρο που βλέπουμε μια πρωτεΐνη (Viewer) και ένα εξωτερικό το οποίο βρίσκεται ακριβώς πάνω από το παράθυρο του Viewer. Οι λόγοι για τους οποίους υπάρχουν δυο GUI είναι καθαρά τεχνικοί αλλά σύντομα, σε μελλοντική έκδοση, τα δυο ξεχωριστά GUI θα ενωθούν σε ένα κύριο. 5

10 4.1 Το παράθυρο του Viewer Ο Viewer του PyMOL αποτελεί την καρδιά του συστήματος. Είναι ένα OpenGL παράθυρο όπου όλα τα 3D γραφικά απεικονίζονται ενώ παράλληλα λαμβάνουν χώρα όλες οι αλληλεπιδράσεις του χρήστη με το τρισδιάστατο πρωτεϊνικό μόριο. O Viewer του PyMOL με τον εσωτερικό GUI Ο εσωτερικός GUI ο οποίος περιέχεται στο παράθυρο αυτό (δεξιά) μας επιτρέπει να εκτελούμε ενέργειες σε συγκεκριμένα αντικείμενα και επιλεγμένα άτομα. Από πάνω προς τα κάτω, περιέχονται ένας κατάλογος ονομάτων, ένας πίνακας διάταξης των λειτουργιών των πλήκτρων του ποντικιού, ένας δείκτης frame/sec και μια ομάδα από κουμπιά βίντεο για τη λειτουργία animation. Ο Viewer περιέχει επίσης γραμμή εντολών για το τρέξιμο εντολών του PyMOL. Πατώντας το ESC μπορούμε να αλλάζουμε μεταξύ γραφικού περιβάλλοντος και γραμμής εντολών σε όλη την επιφάνεια του Viewer. 6

11 4.2 Το παράθυρο του εξωτερικού GUI Το PyMOL διαθέτει και ένα εξωτερικό GUI παράθυρο το οποίο παρέχει μία μπάρα επιλογών, τη γραμμή εντολών και μία μικρή περιοχή εμφάνισης των εντολών που εκτελούνται (output). Το εξωτερικό GUI παράθυρο του PyMOL Βασικό πλεονέκτημα του εξωτερικού GUI έναντι του εσωτερικού είναι ότι υποστηρίζει λειτουργίες αποκοπής και επικόλλησης (cut and paste) εντολών ή και γενικά μικρών προγραμμάτων (scripts) στη γραμμή εντολών του. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούμε τις συντομεύσεις Ctrl-X, Ctrl-C και Ctrl-V για αποκοπή (Cut) αντιγραφή (Copy) και επικόλληση (Paste) αντίστοιχα, αφού το κλασσικό Edit menu των Windows δεν έχει ακόμη προστεθεί. 5. Χειρισμός της εικόνας Το ποντίκι αποτελεί το βασικό εργαλείο κίνησης και χειρισμού της εικόνας του PyMOL ενώ τα πλήκτρα (SHIFT, CTRL, SHIFT+CTRL) χρησιμοποιούνται βοηθητικά για να τροποποιούν τις βασικές λειτουργίες του ποντικιού. Για την αποτελεσματικότερη χρήση του PyMOL είναι αναγκαία η χρήση ποντικιού με τρία πλήκτρα ή ποντίκι δύο πλήκτρων με ροδέλα στη μεσαία θέση. 7

12 5.1 Βασικές λειτουργίες ποντικιού Γενικά τα ποντίκια τα οποία διαθέτουν αντί μεσαίου πλήκτρου μία ροδέλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ακριβώς το ίδιο απλά με το πάτημα της προς τα κάτω. Βασικές λειτουργίες ποντικιού Ο παρακάτω πίνακας συνοψίζει τις λειτουργίες των πλήκτρων του ποντικιού οι οποίες αναγράφονται στον εσωτερικό GUI μαζί με τους συνδυασμούς των βοηθητικών πλήκτρων. Βοηθητικά πλήκτρα Πλήκτρο SHIFT Πλήκτρο CTRL Πλήκτρο SHIFT+CTRL Αριστερό πλήκτρο Μεσαίο πλήκτρο Δεξί πλήκτρο Περιστροφή (Trackball) Μετακίνηση στο επίπεδο ΧΥ Μετακίνηση στον άξονα Ζ Επιλογή επιφανειακών τομών Επιλογή διαφορετικού συστήματος συντ/νων περιστροφής Στον εσωτερικό GUI υπάρχει η συντομογραφία του παραπάνω πίνακα θυμίζοντας στο χρήστη τις δυνατότητες που παρέχονται χρησιμοποιώντας το ποντίκι ως έχει ή σε συνδυασμό με τα βοηθητικά πλήκτρα: 8

13 L M R Rota Move MovZ Shft Ctrl CtSh Orig Clip 5.2 Περιστροφή Trackball Η περιστροφή αυτή γίνεται σαν να υπάρχει μια αόρατη μπάλα στο κέντρο του μορίου/πρωτεΐνης που μελετάμε. Όταν κρατάμε το αριστερό πλήκτρο του ποντικιού πατημένο και κινούμε το ποντίκι είναι σαν να κινούμε την αόρατη αυτή μπάλα με το χέρι μας σε οποιαδήποτε κατεύθυνση εμείς θέλουμε. Στην περίπτωση που κάνουμε κλικ έξω από τη νοητή σφαίρα, εκτελούμε περιστροφή μόνο στον άξονα Ζ. Γενικά, ο χειρισμός της εικόνας είναι ευκολότερος όταν κάνουμε αριστερό κλικ στο κέντρο της εικόνας και κινούμε το δείκτη του ποντικιού προς τα έξω (κυρίως περιστροφή στο επίπεδο ΧΥ) ή με κλικ γύρω από τα άκρα της εικόνας και κίνηση σε κυκλική τροχιά (περιστροφή στον άξονα Ζ). Εικονικό Trackball του PyMOL 9

14 5.3 Επιλογή επιφανειακών τομών (clip) Γενικά, ο χειρισμός επιλογής των επιφανειακών τομών είναι κάτι ασυνήθιστο και χρειάζεται εξάσκηση για να καταλάβουμε πως ακριβώς χρησιμοποιείται. Αντί να υπάρχουν ξεχωριστοί χειρισμοί για την επιλογή τομών πίσω και μπροστά από τη μελετώμενη πρωτεΐνη, όλοι οι χειρισμοί συνδυάζονται σε έναν όπου η κίνηση του ποντικιού πάνω-κάτω επιλέγει μπροστινά επίπεδα της πρωτεΐνης (κοντινά πλάνα) ενώ η κίνηση δεξιάαριστερά του ποντικιού επιλέγει τα πίσω επίπεδα της πρωτεΐνης (απομακρυσμένα πλάνα). Επιλογή επιφανειακών τομών Η επιλογή επιφανειακών τομών είναι επίσης δυνατή με τη χρήση της εντολής clip από την γραμμή εντολών. 5.4 Επιλογή διαφορετικού συστήματος συντεταγμένων περιστροφής Κατά τη μελέτη μίας πρωτεΐνης, είναι αναγκαία η επιλογή διαφορετικής αρχής συντεταγμένων της περιστροφής του συστήματος με σκοπό την επιθεώρηση της γειτονικής ως προς ένα άτομο περιοχής. Ο γρηγορότερος τρόπος στο PyMOL είναι η επιλογή ενός ατόμου πατώντας ταυτόχρονα Control + Shift + Μεσαίο κλικ ποντικιού. Όπως θα δούμε παρακάτω (παρ. 6.1), η 10

15 επιλογή αυτή μπορεί να γίνει και από τις εντολές του μενού Action του εσωτερικού GUI. Επιλογή αρχής συντεταγμένων περιστροφής με τη χρήση ποντικιού 6. Χειρισμός βασικών λειτουργιών του PyMOL μέσω εσωτερικού GUI Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω (παρ. 4.1), η χρήση του εσωτερικού GUI διευκολύνει την εφαρμογή πολύπλοκων εντολών και προγραμμάτων script σε ένα βιομόριο χρησιμοποιώντας απλά το ποντίκι. Μετά την φόρτωση ενός αρχείου PDB, εμφανίζονται δύο μπάρες στα δεξιά του viewer, η μία με το όνομα <all> ενώ η άλλη με το όνομα του PDB αρχείου (π.χ. <1YPQ>). Κάθε μία απο τις μπάρες στο δεξί της μέρος έχει τα αρχικά A (Action), S (Show), H (Hide), L (Label) και C (Color). Πλευρικές μπάρες εσωτερικού GUI 11

16 Κάθε ένα από τα παραπάνω στοιχεία διαθέτει ένα υπομενού από εντολές οι οποίες πραγματοποιούνται στο αντικείμενο που εκπροσωπεί η μπάρα στην οποία αναγράφονται. Το συγκεκριμένο χαρακτηριστικό είναι πολύ χρήσιμο όταν κάνουμε επιλογές ατόμων, μορίων, αμινοξέων ή και ακόμη ολόκληρων μεγαλομοριακών τμημάτων όπου εμφανίζεται μία νέα μπάρα με το όνομα <(sele)> (selection) στην οποία μπορούμε να εφαρμόσουμε τις συγκεκριμένες εντολές για να αναδείξουμε έτσι ενδιαφέροντα στοιχεία στη δομή του βιομορίου που μελετάμε. Για τις ανάγκες του εργαστηριακού μαθήματος θα προβούμε μόνο στα βασικά στοιχεία των εντολών αυτών τα οποία θα μας δώσουν την δυνατότητα της λεπτομερούς επισκόπησης πρωτεϊνικών δομών για την κατανόηση των βασικών εννοιών όπως η πρωτοταγής, δευτεροταγής, τριτοταγής και τεταρτοταγής δομή αλλά και της πολύ σημαντικής περιοχής για την καταλυτική ενεργότητα ενός ενζύμου που είναι το ενεργό κέντρο. 6.1 Εντολές του μενού Action Από το υπομενού αυτό θα ασχοληθούμε με τις παρακάτω εντολές: <zoom>: Μεγεθύνει/μικραίνει την περιοχή που έχουμε επιλέξει (ή και όλο το μόριο στην περίπτωση της μπάρας <all>) ώστε να καλύπτει όλο το παράθυρο του viewer. <orient>: Περιστρέφει το βιομόριο/επιλογή και το τοποθετεί στις αρχικές συντεταγμένες που ορίζει το αρχείο PDB. <centre>: Κεντράρει το βιομόριο/επιλογή στην περίπτωση που το έχουμε μετακινήσει στο επίπεδο ΧΥ. <preset>: Υπομενού με προεπιλεγμένες παραμέτρους απεικόνισης όπως o <simple>: απεικόνιση σε γραμμική μορφή της πεπτιδικής αλυσίδας (ribbon) παρουσία των ετεροατόμων και των μορίων διαλύτη (H 2 O). 12

17 o <simple (no solvent)>: όπως το <simple> αλλά χωρίς τα μόρια διαλύτη (H 2 O). o <ball and stick>: απεικόνιση σε μορφή ball and stick. o <b factor putty>: απεικόνιση σχετικά με την κινητικότητα που εμφανίζει η πεπτιδική αλυσίδα ενός βιομορίου. Το παραγόμενο σχήμα έχει μεταβλητές εξαρτώμενες της κινητικότητας, τόσο στο μέγεθος όσο και στο χρώμα της πεπτιδικής αλυσίδας. 13

18 o <technical>: απεικόνιση κατάλληλη για δημιουργία/τροποποίηση τρισδιάστατων μοντέλων (κρυσταλογραφία/δομική βιολογία). o <ligands>: εστίαση σε ενώσεις συναρμογής (ligands) οι οποίες π.χ. μπορεί να αποτελούν υποστρώματα στα ενεργά κέντρα των βιομορίων. o <ligand sites>: εστίαση στις περιοχές όπου αλληλοεπιδρούν οι ενώσεις συναρμογής με τα βιομόρια (ενεργά κέντρα, περιοχές δέσμευσης υδατανθράκων (CBMs), κτλ). Οι περιοχές αυτές μπορεί 14

19 να απεικονιστούν υπό τη μορφή cartoon (i), χωροπληρωτικά (solid surface) (ii), διαφανή χωροπληρωτικά (transparent surface) (iii), όπως και χωροπληρωτικά μοντέλα dot surface (iv) και mesh surface (v). (i) (ii) (iii) (iv) (v) o <pretty>: απεικόνιση cartoon μαζί με τα υποστρώματα/ligands έχοντας επιπλέον λεπτομέρειες που βελτιστοποιούν την εμφάνιση. o <pretty (with solvent)>: η απεικόνιση pretty παρουσία μορίων διαλύτη. o <publication>: απεικόνιση υψηλής ποιότητας κατάλληλης για δημοσίευση σε έγκριτα διεθνή επιστημονικά περιοδικά. 15

20 o <publication (with solvent)> η απεικόνιση publication παρουσία μορίων διαλύτη. <find><polar contacts>: Υπομενού για την εύρεση σημαντικών πληροφοριών όπως οι αλληλοεπιδράσεις μεταξύ ligands ή υποστρωμάτων με τις πλευρικές ομάδες αμινοξέων ενεργών κέντρων ή γενικότερα με αμινοξέα περιοχών δέσμευσης ligands πρωτεϊνών. o <within selection>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ ομάδων που έχουν επιλεγεί. o <involving side chains>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων μεταξύ τους ή με άλλα παρεβρίσκοντα μόρια όπως μόρια H 2 O. o <involving solvent>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων διαλύτη με τις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων ή με ετεροάτομα/υποστρώματα. o <excluding solvent>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων της πρωτεΐνης μεταξύ τους ή σε συνδυασμό με ετεροάτομα/υποστρώματα. o <excluding main chain>, <excluding intra-main chain>, <just intra-side chain>, <just intra-main chain>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων με άλλα μόρια εκτός της κύριας πεπτιδικής αλυσίδας ή μόνο μεταξύ των ενδο-πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων ή αντίστροφα μόνο μεταξύ των ενδο-πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων ή μεταξύ των ενδο-κυρίων πεπτιδικών 16

21 αλυσίδων, αντίστοιχα. Οι διάφοροι παραπάνω συνδυασμοί δίνουν αποτελέσματα βασιζόμενα στο αρχείο PDB το οποίο μελετάμε μέσω του PyMOL. o <to other atoms in object>, <to others excluding solvent>, <to any atoms>, <to any excluding solvent>: οι εντολές αυτές εφαρμόζονται σε επιλεγμένα μέρη του συνολικού βιομορίου (μπάρα <sele>) όπου μπορόυμε να μελετήσουμε για παράδειγμα i) τις αλληλοεπιδράσεις ατόμων ή ετεροατόμων/υποστρωμάτων με άλλα άτομα, ii) άτομα εκτός μορίων διαλύτη, iii) οποιαδήποτε άτομα συμπεριλαμβανομένων των ετεροατόμων/υποστρωμάτων, iv) οποιαδήποτε άτομα συμπεριλαμβανομένων των ετεροατόμων εκτός μορίων διαλύτη, αντίστοιχα. Οι παραπάνω εντολές είναι πολύ σημαντικές αφού βοηθούν στην αποκάλυψη περιοχών δέσμευσης όπως είναι το ενεργό κέντρο ή διαφόρων περιοχών δέσμευσης υδατανθράκων (Carbohydrate Binding modules, CBMs) ενός ενζύμου. <hydrogens><add, remove>: Στο PyMOL για λόγους απλότητας, ως προεπιλογή, τα άτομα υδρογόνου παραλείπονται από μόριο το οποίο μελετάμε. Με την εντολή <add> προσθέτουμε τα υδρογόνα που υπολείπονται ενώ με την εντολή <remove> αφαιρούνται. <remove waters>: Απομάκρυνση όλων των μορίων H 2 O από το μοντέλο που μελετάμε. <sequence><include, exclude>: Επιλέγοντας την εντολή <include> ή <exclude> στο πάνω μέρος του viewer εμφανίζεται ή εξαφανίζεται, αντίστοιχα, η πρωτοταγής ακολουθία των αμινοξέων της πεπτιδικής αλυσίδας όπως και τυχόν ετεροάτομα/υποστρώματα της μελετώμενης πρωτεΐνης. Το ίδιο μπορεί να συμβεί πατώντας το κουμπί <S> (sequence) από το κάτω δεξί μέρος του Viewer. 6.2 Εντολές του μενού Show Οι εντολές Show επικεντρώνονται αποκλειστικά στην παρουσίαση του μορίου που μελετάμε χρησιμοποιώντας διαφορετικά στυλ (lines, sticks, 17

22 ribbon, cartoon, dots, spheres, mesh, surface) τα οποία αναδεικνύουν διαφορετικά χαρακτηριστικά και πληροφορίες ανά περίπτωση. Τα παραπάνω στυλ απεικόνισης μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την περίπτωση ολόκληρου ή μέρους του μορίου που μελετάμε, αντίστοιχα. Εδώ πρέπει να εστιάσουμε την προσοχή μας στο μονοπάτι εντολών <Show><as><X> και <Show><X> όπου Χ είναι ένα από τα στυλ που μόλις αναφέραμε (π.χ. cartoon). Στην πρώτη περίπτωση επιλέγουμε ένα στυλ εμφάνισης για το μελετούμενο μόριο (ή μέρος αυτού από τη μπάρα <sele>) ενώ στη δεύτερη περίπτωση προσθετικά μπορούμε να έχουμε παραπάνω από ένα στυλ εμφάνισης ταυτόχρονα. Στην περίπτωση των πολλαπλών στυλ εμφάνισης είναι απαραίτητος ο συνδυασμός εντολών Show και Hide για την προσθήκη και αφαίρεση διαφόρων στυλ εμφάνισης, αντίστοιχα. Από το υπομενού Show θα ασχοληθούμε με τις παρακάτω εντολές: <as><lines, sticks, ribbon, cartoon, dots, spheres, mesh, surface>: Επιλέγουμε ένα μόνο στυλ για όλο ή μέρος (επιλογή <sele>) του μορίου που μελετάμε. Τα άτομα άνθρακα συμβολίζονται με πράσινο, τα άτομα οξυγόνου με κόκκινο και τα άτομα αζώτου με μπλέ χρώμα. Τα στυλ που μπορούμε να επιλέξουμε είναι: o <lines>: απεικόνιση του μορίου ως απλές γραμμές. Πολύ χρήσιμο όταν έχουμε ένα μεγάλο μόριο και θέλουμε να επιλέξουμε ένα συγκεκριμένο αμινοξύ. o <sticks>: παρόμοιο στυλ με το lines με την διαφορά ότι οι γραμμές είναι τρισδιάστατες. 18

23 o <ribbon>: απεικόνιση μόνο της κύριας πεπτιδικής αλυσίδας μίας πρωτεΐνης. Παρέχεται το σχήμα που παίρνει μία πρωτεΐνη στον χώρο χωρίς κανένα επιπλέον μοριακό δεδομένο. o <cartoon>: απεικόνιση της τριτοταγούς δομής μίας πρωτεΐνης τονίζοντας τα δυο κύρια στοιχεία της δευτεροταγούς δομής που είναι οι α-έλικες και τα β-πτυχωτά φύλλα. 19

24 o <dots>: απεικόνιση των ηλεκτρονικών νεφών των ατόμων του μορίου που μελετάμε υπό τη μορφή τελειών. o <spheres>: παρόμοια με την απεικόνιση dots με τη διαφορά ότι έχουμε εμφάνιση σφαιρών στην ακτίνα των ατομικών ηλεκτρονικών νεφών. o <mesh>: η επιφάνεια του μορίου υπολογίζεται με βάση τα ηλεκτρονικά νέφη των ατόμων που αποτελούν την πρωτεΐνη δημιουργώντας έτσι ένα χωροπληρωτικό μοντέλο το οποίο καλύπτεται με ένα ηλεκτρονικό «δίχτυ». Με τον τρόπο αυτό μας δίνεται μία αντιπροσωπευτική απεικόνιση του σχήματος ενός μορίου στο χώρο. 20

25 o <surface>: παρόμοιο χωροπληρωτικό μοντέλο με το mesh με την διαφορά ότι η επιφάνεια είναι αδιαφανής. o <organic><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres για τα οργανικά μόρια εκτός πρωτεΐνης τα οποία μπορούν συνήθως να παίζουν ρόλο υποστρώματος. o <main chain><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres της κεντρικής πεπτιδικής αλυσίδας. o <side chain><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων της πεπτιδικής αλυσίδας. o <disulfides><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres των δισουλφιδικών δεσμών που πραγματοποιούνται μεταξύ δυο πλευρικών ομάδων αμινοξέων κυστεΐνης γειτνιαζόντων τμημάτων της πεπτιδικής αλυσίδας. 21

26 Γενικότερα η εντολή αυτή είναι πολύ χρήσιμη για την σύντομη εύρεση δισουλφιδικών δεσμών, οι οποίοι εντοπίζονται εύκολα από το χρυσαφί τους χρώμα. 6.3 Εντολές του μενού Hide Οι εντολές του υπομενού Hide ενεργούν ακριβώς αντίθετα από τις αντίστοιχες που βρίσκονται στο υπομενού Show. Γενικότερα, ο συνδυασμός Show-Hide σε επιλεγμένα τμήματα (sele) ενός πρωτεϊνικού μορίου είναι ουσιαστικής σημασίας για την ανάδειξη σημαντικών περιοχών μίας πρωτεΐνης (π.χ. ενεργό κέντρο) και άλλων στοιχείων όπως η δευτεροταγής, τριτοταγής και σε κάποιες περιπτώσεις η τεταρτοταγής δομή η οποία ευθύνεται για τον καταλυτικό χαρακτήρα και ιδιότητες του υπό μελέτη βιομορίου. Οι εντολές Hide είναι περισσότερες σε αριθμό συγκριτικά με τις εντολές Show λόγω δύο επιπλέον εντολών που βρίσκονται στο μενού του πρώτου: <hydrogens>: Απομάκρυνση των ατόμων υδρογόνου στην περίπτωση που απεικονίζονται αρχικά μετά την φόρτωση ενός αρχείου PDB ή κατά επιλογή από την εφαρμογή της εντολής <Action><hydrogens><add>. Η απομάκρυνση των ατόμων υδρογόνου γίνεται επίσης από την εντολή <Action><hydrogens> <remove> (παρ. 6.1). <unselected>: Απεικόνιση μόνο του τμήματος που έχουμε επιλέξει (μπάρα sele), σβήνοντας το υπόλοιπο μόριο, διευκολύνοντας έτσι την μελέτη συγκεκριμένων περιοχών. 6.4 Εντολές του μενού Color Ο χρωματισμός του πρωτεϊνικού μοντέλου που μελετάμε στο PyMOL είναι σημαντικό στοιχείο του προγράμματος διότι εκτός από το αισθητικό αποτέλεσμα που προσφέρει το χρώμα, έχει και την ιδιότητα να επισημαίνει σημαντικά δομικά χαρακτηριστικά διευκολύνοντας έτσι τη μελέτη. Με τις εντολές του μενού Color, μπορούμε να διαλέξουμε ένα χρώμα (reds, greens, blues, yellows, magentas, cyans, oranges, tints, grays και αποχρώσεις αυτών) σε όλο το μόριο (μπάρα all ή μπάρα PDB αρχείου) ή τμήμα μορίου (μπάρα sele). 22

27 Ο χρωματισμός με βάση δομικά χαρακτηριστικά ενός μορίου μπορεί να επιτευχθεί με τις παρακάτω εντολές: <by element>: Χρωματισμός με βάση τα άτομα των στοιχείων άνθρακα (C), υδρογόνου (Η), αζώτου (Ν), οξυγόνου (Ο) και θείου (S). Οι διαφορετικές επιλογές που μπορούμε να κάνουμε σε χρώματα εστιάζονται μόνο για τα άτομα του άνθρακα. Η εντολή αυτή εφαρμόζεται μόνο στην περίπτωση απεικόνισης μίας πρωτεΐνης σε lines ή sticks. <by chain><by chain (e. c), by chain (*/ca), by chain, chainbows>: Χρωματισμός με βάση τις διαφορετικές πεπτιδικές αλυσίδες (περίπτωση πρωτεΐνης που εμφανίζει τεταρτοταγή δομή). o <by chain (e. c)>: η εντολή αυτή εφαρμόζεται σωστά στην περίπτωση απεικόνισης μίας πρωτεΐνης σε lines ή sticks όπου ο χρωματισμός των ατόμων των στοιχείων άνθρακα, (τα υπόλοιπα στοιχεία παραμένουν σταθερά στο χρώμα που είχαμε αρχικά) διαφέρει ανά πεπτιδική αλυσίδα έτσι ώστε να ξεχωρίζουν αυτές μεταξύ τους. 23

28 o <by chain (*/ca)>: όμοια με την προηγούμενη εντολή με την διαφορά ότι χρωματίζονται διαφορετικά μόνο τα άτομα άνθρακα και όχι οι ομοιοπολικοί δεσμοί μεταξύ τους, οι οποίοι παραμένουν στο χρώμα που είχαν αρχικά ή από προηγούμενη εντολή χρωματισμού. o <by chain>: ο χρωματισμός στην περίπτωση αυτή συμβαίνει πολύ απλά ανά πεπτιδική αλυσίδα όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, με την διαφορά ότι δεν δίνεται διαφορετικό χρώμα στα άτομα άλλων στοιχείων εκτός από την περίπτωση ετεροατόμων ή γενικότερα άλλων οργανικών μορίων εκτός της πρωτεΐνης. o <chainbows>: στην περίπτωση της εντολής <chainbow> οι διαφορετικές πεπτιδικές αλυσίδες χρωματίζονται βαθμιδωτά από το μπλε χρώμα (αμινο-τελικό άκρο) ως το κόκκινο (καρβοξυλοτελικό άκρο) κάθε αλυσίδας. Στην περίπτωση που έχουμε πρωτεΐνες που αποτελούνται από μία μόνο πεπτιδική αλυσίδα 24

29 (απουσία τεταρτοταγούς δομής) η εντολή αυτή δίνει το ίδιο αποτέλεσμα με την εντολή <spectrum><rainbow> που θα δούμε παρακάτω. <by ss>: Ο χρωματισμός στην περίπτωση αυτή γίνεται με βάση στοιχεία δευτεροταγούς δομής (ss: secondary structure) που εμφανίζει μία πρωτεΐνη όπως είναι οι α-έλικες (Helix) και τα β-πτυχωτά φύλλα (Sheet). Τα κομμάτια της πεπτιδικής αλυσίδας τα οποία δεν εμφανίζουν κάποιο από τα δύο αυτά δομικά στοιχεία, εμφανίζονται σαν απλές γραμμές οι οποίες ονομάζονται loop. Οι επιλογές χρωματισμού για την εντολή αυτή είναι δύο. <spectrum><rainbow (e. c), rainbow (*/ca), rainbow>: Η εντολή αυτή χρωματίζει ολόκληρη την πρωτεΐνη βαθμιδωτά από το μπλε χρώμα (αμινο-τελικό άκρο) ως το κόκκινο (καρβοξυλο-τελικό άκρο) με τη σειρά που είναι γραμμένα τα αμινοξέα στο αρχείο PDB. Στην περίπτωση που η πρωτεΐνη αποτελείται από παραπάνω από μία πεπτιδικές αλυσίδες δεν γίνεται χρωματισμός ανά αλυσίδα όπως γίνεται στην εντολή <by chain>. 25

30 o <rainbow (e. c)>: χρωματισμός των ατόμων άνθρακα και των ομοιοπολικών τους δεσμών βαθμιδωτά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα. Η εντολή αυτή έχει εφαρμογή σε απεικόνιση line και stick. o <rainbow (*/ca)>: χρωματισμός μόνο των ατόμων άνθρακα (όχι οι ομοιοπολικοί δεσμοί) βαθμιδωτά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα. Η εντολή αυτή έχει εφαρμογή σε απεικόνιση line και stick. o <rainbow>: χρωματισμός όλης της πεπτιδικής αλυσίδας βαθμιδωτά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα. 26

31 o <b-factors>: χρωματισμός της πεπτιδικής αλυσίδας με βάση την κινητικότητα των επιμέρους πεπτιδικών αλυσίδων. Η βαθμίδωση του χρώματος ξεκινά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα για την περίπτωση των λιγότερο ευκίνητων προς τις περισσότερο ευκίνητες αλληλουχίες αμινοξέων, αντίστοιχα. 7. Χρήσιμες εντολές εξωτερικού GUI 7.1 Μενού Display Οι εντολές του μενού Display έχουν σαν σκοπό να προσθέσουν στοιχεία στο μοριακό μοντέλο που μελετάμε αυξάνοντας είτε το αισθητικό αποτέλεσμα είτε την παροχή σημαντικών πληροφοριών. Οι σημαντικότερες εντολές είναι: <Sequence>: Εμφάνιση της πρωτοταγούς ακολουθίας στο πάνω μέρος του παραθύρου Viewer. Η εντολή αυτή εκτελείται και από το υπομενού <Action><Sequence><include> ή από το κουμπί <S> στο κάτω δεξί μέρος του Viewer (παρ. 6.1). Επιπλέον, ο εξωτερικός GUI παρέχει και την δυνατότητα εμφάνισης διαφορετικών μορφών της πρωτοταγούς ακολουθίας όπως π.χ. χρήση κωδικών των αμινοξέων κατά IUPAC (1 γράμμα, προεπιλογή), χρήση των συντομογραφιών των αμινοξέων (3 γράμματα), ταξινόμηση ανά πεπτιδική αλυσίδα κτλ. <stereo>: Με την επιλογή αυτή παράγεται εικόνα κατάλληλη για τη χρήση ειδικών γυαλιών τα οποία δίνουν στο χρήστη τρισδιάστατη απεικόνιση του μελετώμενου μοριακού μοντέλου. <zoom>: Επιλογή θέασης σε συγκεκριμένες αποστάσεις (8, 12, 16, 20, 30 Angstroms) από το κέντρο του μορίου. 27

32 <clip>: Επιλογή επιφανειακών τομών σε συγκεκριμένες αποστάσεις (4, 6, 8, 12, 20 Angstrom) από το κέντρο του μορίου. <background>: Επιλογή διαφορετικού φόντου προβολής του μοριακού μοντέλου. <Color space>: Επιλογή συστήματος χρωμάτων για την απεικόνιση των γραφικών από το PyMOL. <Quality>: Επιλογή τρόπου επεξεργασίας των γραφικών αυξάνοντας ή μειώνοντας τις απαιτήσεις σε υπολογιστική ισχύ, βελτιστοποιώντας το παραγόμενο αποτέλεσμα ανάλογα με το ηλεκτρονικό υπολογιστή που χρησιμοποιούμε. <Orthoscopic view>: Αυξάνει το ρεαλισμό των τρισδιάστατων γραφικών. <Smooth lines>: Εφαρμόζεται στην περίπτωση απεικόνισης με line ή stick δίνοντας στο μοριακό μοντέλο απαλές γραμμές. <Depth cue>: Δίνει βάθος στην απεικόνιση του μορίου σκιάζοντας τα απομακρυσμένα μέρη. <Two sided lighting>: Φωτισμός από δύο αντίθετες πλευρές (αριστερά και δεξιά). <Specular reflections>: Αντανακλάσεις φωτός στην επιφάνεια του μοντέλου από την τεχνητή πηγή φωτισμού ώστε τα γραφικά να δείχνουν ποιό ρεαλιστικά. 7.2 Μενού Settings Το μενού Settings μπορεί να μεταβάλει πολλές παραμέτρους σχετικά με τα γραφικά του PyMOL και τον τρόπο επεξεργασίας τους. Λόγω της πολυπλοκότητας των επιλογών που μας παρέχει το μενού αυτό, θα εστιάσουμε την προσοχή μας μόνο στις επιλογές εκείνες που τροποποιούν το μελετούμενο μοντέλο προσδίδοντας επιπλέον χαρακτηριστικά και δυνατότητες: <cartoon> 28

33 o <Round Helices, Fancy Helices, Cylindrical Helices>: επιλογή διαφορετικού τρόπου παρουσίασης των α-ελικών σε ένα πρωτεϊνικό μόριο. <Round Helices> <Fancy Helices> <Cylindrical Helices> o <Flat Sheets, Fancy Sheets>: επιλογή διαφορετικού τρόπου παρουσίασης των β-πτυχωτών φύλλων σε ένα πρωτεϊνικό μόριο. <Χωρίς επιλογή> <Flat Sheets> <Flat + Fancy Sheets> o <Smooth Loops>: επιλογή παρουσίασης των πεπτιδικών αλυσίδων οι οποίες δεν εμφανίζουν κάποιο στοιχείο δευτεροταγούς δομής σε ένα πρωτεϊνικό μόριο με ομαλές καμπύλες. <Χωρίς επιλογή> <Smooth Loops> 29

34 <Transparency><Cartoon, Surface, Stick, Sphere>: Η εντολή αυτή είναι πολύ χρήσιμη στην περίπτωση που θέλουμε ένα ή περισσότερα στυλ απεικόνισης να είναι διαφανή με διαφορετικό ποσοστό (0%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%) διαφάνειας, με σκοπό την παρατήρηση μονάδων αμινοξέων τα οποία βρίσκονται π.χ. στο κέντρο μίας πρωτεΐνης. <cartoon + surface transparent> <lines + sticks + surface transparent> 7.3 Μενού Wizard Το μενού Wizard προσφέρει εξειδικευμένους υπολογισμούς και διεργασίες από τις οποίες θα αναφέρουμε ενδεικτικά μόνο τις παρακάτω: <Appearance>: Με την επιλογή αυτή μας δίνεται η δυνατότητα να δίνουμε συγκεκριμένα στυλ απεικόνισης επιλέγοντας απλά με το ποντίκι κάθε άτομο/αμινοξύ/αλυσίδα/αντικείμενο κτλ. <Measurement>: Υπολογισμοί αποστάσεων, γωνιών, πολικών αλληλεπιδράσεων με γειτονικά μόρια και αποστάσεις αυτών μεταξύ τους είναι κάποια από τα στοιχεία που υπολογίζονται και εμφανίζονται στο μοριακό μοντέλο κατά την εφαρμογή της εντολής αυτής. <Mutagenesis>: Πολύ χρήσιμη εντολή για την μελέτη της μετάλλαξης σημείου όπου πολύ εύκολα ο χρήστης του προγράμματος μπορεί να παρατηρήσει τυχόν δομικές αλλαγές που πραγματοποιούνται στο βιομόριο κατά την αντικατάσταση ενός αμινοξέος από κάποιο άλλο. 30

35 8. Παραγωγή και αποθήκευση υψηλής ποιότητας εικονών 8.1 Ray-Tracing Ο Ray-Tracing είναι ένας αλγόριθμος για την παραγωγή υψηλής ποιότητας γραφικών από τα μελετώμενα στο PyMOL μόρια. Με την τεχνική αυτή παράγονται σκιάσεις από μία εικονική φωτεινή πηγή, δίνοντας έτσι ρεαλιστικές 3D εικόνες κατάλληλες για παρουσιάσεις ή δημοσιεύσεις σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά. Το PyMOL αποτελεί το πρώτο πρόγραμμα απεικόνισης μοριακών δομών το οποίο διαθέτει υψηλής ταχύτητας ray-tracer. Επεξεργασία OpenGL (χειρισμός Real-time) Επεξεργασία Ray-traced (sec ή min ανά frame) Για να κάνουμε ray-tracing σε μία επιλεγμένη σκηνή της πρωτεΐνης απλά κάνουμε κλικ στο Ray Trace κουμπί στον εξωτερικό GUI ή χρησιμοποιώντας την εντολή ray στη γραμμή εντολών. Με τον ray tracer του PyMOL είναι δυνατή η δημιουργία υψηλής ποιότητας ταινιών (animation) με τη συναρμολόγηση επιμέρους ray traced εικόνων. 8.2 Αποθήκευση εικόνων (png) Όλες οι εικόνες (ray-traced ή όχι) μπορούν να αποθηκευτούν σε πρωτόκολλο PNG χρησιμοποιώντας την png εντολή. Οι εικόνες png είναι συμβατές με το πρόγραμμα παρουσιάσεων MS PowerPoint, οι οποίες μπορούν εύκολα να μετατραπούν σε διαφορετικού τύπου αρχεία (π.χ. jpeg) 31

36 χρησιμοποιώντας ελεύθερα πακέτα λογισμικού όπως το ImageMagick ( Οι εικόνες επίσης μπορούν να αποθηκευτούν χρησιμοποιώντας την εντολή <File><Save Image>. Οι εικόνες πάντα αποθηκεύονται στην ίδια ανάλυση με την οποία παρατηρούμε ένα μόριο στο παράθυρο του Viewer. Επομένως, αν θέλουμε υψηλής ανάλυσης εικόνες *.png, θα πρέπει να κάνουμε το παράθυρο του viewer μεγέθυνση σε πλήρη έκταση της οθόνης μας (maximize) και από τον εξωτερικό GUI εκτέλεση της εντολής <File><Save Image>. 32