ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΜΥΓΔΑΛΙΑΣ ΣΕ ΕΛΛΑΔΑ ΚΑΙ ΚΥΠΡΟ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΛΛΑΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ PDV ΚΑΙ ACLSV ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ Θ. ΧΑΡΟΥ Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΜΥΓΔΑΛΙΑΣ ΣΕ ΕΛΛΑΔΑ ΚΑΙ ΚΥΠΡΟ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΛΛΑΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ PDV ΚΑΙ ACLSV ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ Θ. ΧΑΡΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡIΒΗ Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Ν. Κατής Καθηγητής Εισηγητής Μ. Βασιλακάκης Καθηγητής Μέλος Γ. Καραογλανίδης Λέκτορας Μέλος Θεσσαλονίκη,

3 Κάποτε μια βασιλοπούλα, η Φυλλίδα, ερωτεύτηκε το γιό του Θυσέα, το Δημοφώντα. Αφού παντρεύτηκαν, ο πατέρας της νύφης του έδωσε ένα κομμάτι του βασιλείου του για να το κυβερνά. Ο Δημοφών, όμως, νοστάλγησε την πατρίδα του την Αθήνα και ζήτησε να πάει εκεί για λίγο, με την υπόσχεση ότι σύντομα θα ξαναγύριζε. Άργησε, όμως, πάρα πολύ και τα χρόνια πέρασαν. Η Φυλλίς μαράζωσε και πήγε και κρεμάστηκε σε ένα δέντρο. Οι θεοί τη λυπήθηκαν και τη μεταμόρφωσαν σε δέντρο, σε αμυγδαλιά. Το δέντρο κράτησε την ψυχή της και από τότε δεν ξανάβγαλε φύλλα ούτε άνθισε πια. Κάποτε με τα χιόνια του Γενάρη ο Δημοφών γύρισε και σαν έμαθε τον τραγικό χαμό της αγαπημένης του πήγε, αγκάλιασε το δέντρο και αυτό άρχισε να βγάζει τρυφερά φύλλα και άνθη. Η ψυχή της βασιλοπούλας ένιωσε χαρά με το γυρισμό του Δημοφώντα, μα δεν ξαναπήρε την ανθρώπινη μορφή της. Έμεινε δέντρο και κάθε χρόνο το Γενάρη, στολίζεται με κάτασπρα λουλούδια. Έτσι, η αμυγδαλιά, έγινε σύμβολο της ελπίδας, δείχνοντας ότι η αγάπη δε μπορεί να νικηθεί από το θάνατο. (Ελληνική Μυθολογία) Ρώτησαν την αμυγδαλιά αν υπάρχει Θεός, κι εκείνη άνθησε! (Ν. Καζαντζάκης) 2

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε κατά τη διάρκεια των ετών στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού προγράμματος Σπουδών του Τομέα Αειφορικής Γεωργικής Ανάπτυξης της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Η διατριβή αυτή δε θα μπορούσε να ολοκληρωθεί αν δεν υπήρχε η καθοδήγηση και η συμπαράσταση κάποιων ανθρώπων. Έτσι, πρώτα απ όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Νικόλαο Ι. Κατή για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε στην ανάθεση του θέματος, τη συμπαράσταση, καθοδήγηση και άριστη συνεργασία που είχαμε κατά τη διάρκεια των δύο αυτών ετών, αλλά και κατά τα προπτυχιακά μου χρόνια. Θα ήθελα να εκφράσω, επίσης, τις ευχαριστίες μου στον καθηγητή κ. Μιλτιάδη Βασιλακάκη και στον λέκτορα κ. Γεώργιο Καραογλανίδη, μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και τη βοήθεια στη μελέτη και διόρθωση του κειμένου. Μέσα από την καρδιά μου ευχαριστώ την διδάκτορα κ. Βαρβάρα Μαλιόγκα καθώς και τον τεχνικό του εργαστηρίου κ. Κωνσταντίνο Ευθυμίου για την ακατάπαυτη βοήθεια και συμπαράστασή τους που χωρίς αυτή η παρούσα εργασία θα ήταν δύσκολο να πραγματοποιηθεί. Επίσης, θα ήταν παράληψή μου να μην αναφέρω τους μεταπτυχιακούς φοιτητές και φίλους μου Λεωνίδα Λώτο, Χριστίνα Καλογήρου και Μένια Κατσιάνη τόσο για τη βοήθεια και συμπαράστασή τους όσο και για την ανάπτυξη ενός φιλικού και πολύ ευχάριστου κλίματος στο χώρο του εργαστηρίου που έκανε τις δύσκολες στιγμές πιο ανάλαφρες. Τέλος ως ελάχιστο δείγμα ευγνωμοσύνης προς τους ανθρώπους που με μεγάλωσαν και έδωσαν τις γερές βάσεις για τη διαμόρφωση του χαρακτήρα μου ως σήμερα, για την υπομονή τους, τη συμπαράστασή τους και την αστείρευτη αγάπη τους θέλω να αφιερώσω το παρόν πόνημα στους λατρευτούς γονείς μου Θεοφάνη και Ζωή, καθώς και στην αδελφή μου Αντιγόνη, που είναι η μόνη και παντοτινή πραγματική μου φίλη. 3

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ...3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Εισαγωγή 1.1 Η καλλιέργεια της αμυγδαλιάς Βοτανικά χαρακτηριστικά Υποκείμενα Η καλλιέργεια της αμυγδαλιάς στην Ελλάδα Η καλλιέργεια της αμυγδαλιάς στην Κύπρο Εχθροί και ασθένειες που προσβάλουν την αμυγδαλιά Ιολογικές ασθένειες της αμυγδαλιάς Ιοί του γένους Ilarvirus Ιός της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων Ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων Ιός του μωσαϊκού της μηλιάς Τρόποι διάγνωσης και αντιμετώπισης των ιών του γένους Ilarvirus Ιοί του γένους Trichovirus Ιός της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς Ιός του μωσαϊκού της ροδακινιάς Ιοί του γένους Nepovirus Ιός της δακτυλιωτής κηλίδωσης της ντομάτας Ιός της μαύρης κηλίδας της ντομάτας Ιός της δακτυλιωτής κηλίδωσης της βατομουριάς Ιός του μωσαϊκού ροζέτας της ροδακινιάς Τρόποι διάγνωσης και αντιμετώπισης των ιών του γένους Nepovirus Ιοί του γένους Potyvirus Ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς Ιοί του γένους Foveavirus Λανθάνον ιός της βερικοκιάς Σκοπός της εργασίας...25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες αμυγδαλιάς σε Ελλάδα και Κύπρο. 2.1 Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Δειγματοληψία Φυτικό υλικό Δοκιμή DAS-ELISA Εστιασμένη δοκιμή PCR για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV

6 Σχεδιασμός καθοδικών εκκινητών Ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV Ανίχνευση του ACLSV Ανίχνευση ιών των γενών Foveavirus και Nepovirus Ανίχνευση του ApLV Αποτελέσματα Ανίχνευση ιών του γένους Ilarvirus Ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV Ανίχνευση ιών του γένους Trichovirus Ανίχνευση του ACLSV Ανίχνευση ιών του γένους Foveavirus Ανίχνευση του ApLV Ανίχνευση ιών του γένους Nepovirus Συζήτηση...38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας του γονιδίου της RdRp του PDV σε αμυγδαλιά. 3.1 Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό Εφαρμογή εστιασμένης PCR για την ανίχνευση του PDV Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου της RdRp Αποτελέσματα Επιλογή των απομονώσεων Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και γενετική παραλλακτικότητα του γονιδίου της RdRp Συζήτηση...49 Κεφάλαιο 4. Μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης του ACLSV σε αμυγδαλιά. 4.1 Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό Εφαρμογή γενικής (RT-) και εστιασμένης (nested) PCR και επιλογή των απομονώσεων Φυλογενετική ανάλυση

7 4.3 Αποτελέσματα Εφαρμογή της PCR και επιλογή των απομονώσεων Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και γενετική παραλλακτικότητα του γονιδίου της ΚΠ Συζήτηση...59 Κεφάλαιο 5. Γενική συζήτηση και συμπεράσματα...62 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...67 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες αμυγδαλιάς στην Ελλάδα και την Κύπρο. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν καθοδικοί εκκινητές, μετά από στοίχιση ομόλογων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων απομονώσεων Ilar-ιών, για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV που πολλαπλασιάζουν μέρος του γονιδίου της RdRp. Η ανίχνευση των υπολοίπων ιών βασίστηκε σε παλαιότερες γνωστές μεθόδους. Επίσης, μελετήθηκε η γενετική παραλλακτικότητα του γονιδίου της RdRp του PDV και της ΚΠ του ACLSV στην αμυγδαλιά. Χρησιμοποιήθηκε φυτικό υλικό από διάφορα γεωγραφικά διαμερίσματα της Ελλάδας και της Κύπρου. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν την ευρεία διάδοση των PNRSV, PDV και ACLSV και είναι η πρώτη εκτενής έρευνα μετά την πρώτη αναφορά τους στην Ελλάδα και στην Κύπρο. Σε κανένα από τα δείγματα δεν ανιχνεύτηκε ο ApMV ή ιοί του γένους Nepovirus, ενώ η παρουσία του ApLV δεν επιβεβαιώθηκε, αν και υπήρχε η υποψία της ύπαρξής του σε ένα μικρό αριθμό δειγμάτων. Η στοίχιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών 11 απομονώσεων του PDV από αμυγδαλιά και 2 απομονώσεων από κερασιά ανέδειξε τη μικρή παραλλακτικότητα του γονιδίου της RdRp που ανέρχεται στο 4%. Επίσης η φυλογενετική ανάλυση δε διαχώρισε τις απομονώσεις με βάση την ποικιλία ή/και την γεωγραφική τους προέλευση. Αντίθετα στην περίπτωση του ACLSV, η στοίχιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών 18 απομονώσεων από αμυγδαλιά και 11 απομονώσεων από γιγαρτόκαρπα και άλλα πυρηνόκαρπα είδη, έδειξε τη μεγάλη παραλλακτικότητα του γονιδίου της ΚΠ που ανέρχεται στο 22%. Στη φυλογενετική ανάλυση γίνεται ένας ασαφής διαχωρισμός μεταξύ γιγαρτόκαρπων και πυρηνόκαρπων ειδών, αλλά και σε αυτή την περίπτωση δεν είναι ξεκάθαρος ο διαχωρισμός των απομονώσεων με βάση την ποικιλία ή/και τη γεωγραφική τους προέλευση. 7

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Η καλλιέργεια της αμυγδαλιάς Τα οπωροφόρα δέντρα ανεξάρτητα από τον τόπο καταγωγής τους, έχουν διαδοθεί και καλλιεργούνται σε διάφορες περιοχές του κόσμου εκεί όπου οι εδαφοκλιματικές συνθήκες τα ευνοούν. Ξεχωριστή θέση στην παραγωγή καρπών κατέχουν τα ακρόδυα που η παραγωγή τους καταναλώνεται σε μορφή ξηρών καρπών. Τα πιο διαδεδομένα είδη ξηρών καρπών στην εύκρατη ζώνη είναι η αμυγδαλιά, η φουντουκιά, η καρυδιά, και η φιστικιά, με μεγαλύτερη διάδοση αυτή της αμυγδαλιάς (914 χιλ. τόνοι) που παράγονται κυρίως στην Ευρώπη. Η αμυγδαλιά κατάγεται από τη Δυτική Ασία όπου καλλιεργείται τουλάχιστον από το 3000πΧ, ίσως και νωρίτερα, καθώς καρποί από ξένα είδη αμυγδαλιάς που βρέθηκαν σε αρχαιολογικούς χώρους της Ελλάδας, χρονολογούνται από το 8000πΧ. Οι αμυγδαλιές καλλιεργούνται εμπορικά σε 44 χώρες και η παραγωγή τους έχει αυξηθεί την τελευταία 10ετία. Οι 10 μεγαλύτερες χώρες σε παραγωγή είναι οι ΗΠΑ, Ισπανία, Συρία, Ιταλία, Ιράν, Μαρόκο, Ελλάδα, Τουρκία, Λιβύη και Πακιστάν (Galanopoulos κ.ά., 1999, Sekliziotis, 2005) Βοτανικά χαρακτηριστικά Η αμυγδαλιά είναι μέλος της οικογένειας Rosaceae μαζί με άλλα καρποφόρα δέντρα όπως ροδακινιά, μηλιά, αχλαδιά, δαμασκηνιά, κερασιά και βερικοκιά. Στο γένος Prunus η αμυγδαλιά σχετίζεται πιο στενά με τη ροδακινιά, και τα δύο είδη ανήκουν στο υπογένος Amygdalus. Αρχικά η αμυγδαλιά ονομάστηκε από το Ληναίο το 1750 Amygdalus communis, όμως από το 1960 δόθηκε το όνομα Prunus dulcis (Miller) D.A. Webb το οποίο και επικράτησε. Έχει προσαρμοστεί και καλλιεργείται σε ζεστές περιοχές της Νότιας Ευρώπης και κυρίως στις παραμεσόγειες χώρες. Από βοτανικής πλευράς το δέντρο της αμυγδαλιάς είναι μέσου μεγέθους, συνήθως 4-10 μέτρα σε εμπορικούς οπωρώνες. Τα φύλλα του είναι μακριά και λεπτά και τα άνθη χρώματος ανοιχτό ροζ ή άσπρο, μοιάζουν με αυτά της ροδακινιάς και άλλων οπωροφόρων του γένους Prunus. Είναι ένα καθαρά Μεσογειακό δέντρο, απαιτεί μέτριους ανέμους, ζεστά καλοκαίρια με χαμηλή υγρασία και αναπτύσσεται καλύτερα σε βαθειά αργιλώδη και καλά στραγγιζόμενα εδάφη. 9

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υποκείμενα Τα υποκείμενα αμυγδαλιάς προσαρμόζονται καλά σε βαθιά, ελαφρά, καλοστραγγιζόμενα εδάφη. Αντέχουν σε ασβεστώδη εδάφη και στη περίσσεια βορίου αλλά προσβάλλονται όπως και η ροδακινιά από νηματώδεις. Αξιόλογα υποκείμενα είναι τα υβρίδια αμυγδαλοροδακινιάς (πχ GF 677, GF 557) που συνδυάζουν αντοχή σε νηματώδεις, περίσσεια ασβεστίου και καταλληλότητα για επαναφυτεύσεις. Το σημαντικότερο υποκείμενο είναι το Prunus amygdalus x Prunus persicae (Kester και Grasselly, 1987) Η καλλιέργεια της αμυγδαλιάς στην Ελλάδα Στην Ελλάδα η αμυγδαλιά είναι μια παραδοσιακή καλλιέργεια που καλλιεργείται εδώ και πολλές δεκαετίες κυρίως λόγω των κατάλληλων καιρικών και εδαφικών συνθηκών που επικρατούν στη χώρα. Καλλιέργειες αμυγδαλιάς εντοπίζονται σε μεγάλη έκταση στη Θεσσαλία (40%) και κεντρική Μακεδονία (17%). Η Ελλάδα είναι η τρίτη μεγαλύτερη χώρα σε παραγωγή στην Ευρωπαϊκή Ένωση, μετά την Ισπανία και την Ιταλία, όπου παράγεται περίπου το 10% της συνολικής παραγωγής στην ΕΕ (Galanopoulos κ.ά., 1999, Sekliziotis, 2005). Η παραγωγή αμυγδάλων στην Ελλάδα τα τελευταία χρόνια ανέρχεται περίπου στους τόνους με μέγιστη παραγωγή το 1999 που έφτασε στους τόνους (FAO, 2006, Πίνακας 1 ). Κύριο πρόβλημα στην παραγωγή αμυγδάλων στην Ελλάδα είναι η πρόωρη άνθηση των περισσότερων ποικιλιών, η οποία εξαιτίας των χαμηλών θερμοκρασιών που επικρατούν νωρίς την άνοιξη, κυρίως στη νότια Ελλάδα, μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της παραγωγής. Τα τελευταία χρόνια, έχουν δημιουργηθεί νέες ποικιλίες αμυγδαλιάς που καθυστερούν να μπουν στην ανθοφορία, όπως οι Texas-Mission και Ferragnes, μειώνοντας τον κίνδυνο ζημιάς από τους ανοιξιάτικους παγετούς. Οι πιο κοινές ποικιλίες που καλλιεργούνται στην Ελλάδα είναι κυρίως εδώδιμες ποικιλίες αλλά και άγριες όπως οι Truoito, Ferragnes, Al, Ferraduel, οι οποίες είναι και οι πιο εμπορεύσιμες, αλλά και άλλες όπως η Texas και τοπικές ποικιλίες όπως οι Afrata Chiou και Retsou (Galanopoulos κ.ά., 1999, Sekliziotis, 2005). Η ποιότητα των Ελληνικών αμυγδάλων είναι άριστη και χρησιμοποιείται ως τροφή και/ή για εξαγωγή στην Ανατολική Ευρώπη, ενώ δεύτερης ποιότητας αμύγδαλα χρησιμοποιούνται στη ζαχαροπλαστική. Οι κυριότερες περιοχές στις 10

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ οποίες καλλιεργούνται αμυγδαλιές είναι η περιοχή Μαγνησίας, Λάρισας, Σερρών, Πιερίας και Καβάλας, όλες στην κεντρική και βόρεια Ελλάδα. Πίνακας 1. Παραγωγή και εκτάσεις αμυγδαλιάς σε Ελλάδα και Κύπρο (FAO, 2006) ΕΤΟΣ ΕΚΤΑΣΗ (εκτάρια) ΕΛΛΑΔΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ (τόνοι) ΕΚΤΑΣΗ (εκτάρια) ΚΥΠΡΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ (τόνοι) Η καλλιέργεια της αμυγδαλιάς στην Κύπρο Η αμυγδαλιά είναι δέντρο αυτοφυές σε πολλές περιοχές της Κύπρου και ιδιαίτερα της Πάφου και Λεμεσού. Είναι απόλυτα εγκλιματισμένο στο περιβάλλον της Κύπρου, αφού καλλιεργείται από τα πολύ παλιά χρόνια και αναπτύχθηκαν πολλές ντόπιες ποικιλίες. Καλλιεργείται σε πολλές περιοχές ιδιαίτερα της Πάφου, της Πιτσιλιάς, της Μαραθάσας και της Τηλλυρίας. Οι ντόπιες ποικιλίες σπάνια έχουν καλά εμπορικά χαρακτηριστικά (ποιότητα ψίχας, καλή αναλογία ψίχας κλπ) και όταν καλλιεργούνται σε διαφορετικές συνθήκες δεν είναι παραγωγικές. Αυτό σε αντίθεση με τις εισαχθείσες ποικιλίες όπως η Poteta, Ferrannes, Markona κ.ά. που έχουν μεγάλη προσαρμοστικότητα στο περιβάλλον. Η σημασία τους έγκειται κυρίως στην ανθεκτικότητά τους στην ξηρασία. Άλλες ποικιλίες που εισήχθησαν στην Κύπρο μετά το 1930 είναι οι Kamaleta, Mesogi, Truoito, Texas και Retsou (Αργύρου, 1998). Όπως προκύπτει από την ανάλυση των διαθέσιμων στοιχείων του τμήματος Στατιστικής και Ερευνών, υπάρχει μεγάλη διακύμανση στην παραγωγή των αμυγδάλων, αποτέλεσμα των καιρικών συνθηκών και κυρίως του ύψους βροχόπτωσης. Για παράδειγμα, το 1995 η παραγωγή έφτασε τους τόνους ενώ το 2001 μόλις τους 500 τόνους (FAO, 2006, Πίνακας 1). 11

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εχθροί και ασθένειες που προσβάλουν την αμυγδαλιά Την αμυγδαλιά προσβάλουν διάφοροι μύκητες και βακτήρια προκαλώντας σημαντικές οικονομικές ζημιές. Οι σημαντικότερες μυκητολογικές ασθένειες της αμυγδαλιάς είναι η φαιά σήψη (Monilinia laxa), το φουζικλάδιο (Fusicladium amygdale) και η πολυστιγμάτωση (Polystigma ochraceum), (Θανασουλόπουλος, 1996). Από τις βακτηριολογικές ασθένειες η πιο σημαντική είναι το βακτηριακό έλκος της αμυγδαλιάς οφειλόμενο στο βακτήριο Pseudomonas amygdali. Τέλος η αμυγδαλιά προσβάλλεται από έναν αριθμό εντόμων-εχθρών με σημαντικότερο το ευρύτομο της αμυγδαλιάς (Eurytoma amygdali), αλλά και άλλα όπως η αλευρώδης αφίδα των πυρηνοκάρπων (Hyalopterous pruni), το κοκκοειδές Sphaerolecanium prunastri και το κολεόπτερο Scolytus amygdale (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). 1.2 Ιολογικές ασθένειες της αμυγδαλιάς. Το δέντρο της αμυγδαλιάς προσβάλλεται από τουλάχιστον 11 ιούς που ανήκουν σε 5 γένη και προκαλούν σημαντικές ή λιγότερο σημαντικές οικονομικές ζημιές στην καλλιέργεια (Nemeth, 1986), (Πίνακας 2). 12

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 2. Ιοί που προσβάλλουν την αμυγδαλιά Γένος Ιός Διάδοση Ilarvirus Trichovirus Nepovirus Potyvirus Foveavirus ιός της νεκρωτικής δακτηλιωτής κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ring spot virus, PNRSV) ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV) ιός του μωσαϊκού της μηλιάς (Apple mosaic virus, ApMV) ιός της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) ιός του μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach mosaic virus, PcMV) ιός της δακτυλιωειδούς κηλίδωσης της ντομάτας (Tomato ringspot virus, ToRSV) ιός της μαύρης κηλίδας της ντομάτας (Tomato black ring virus, TBRV) ιός της δακτηλιωτής κηλίδωσης της βατομουριάς (Raspberry ringspot virus, RRV) ιός του μωσαϊκού ροζέτας της ροδακινιάς (Peach rosette mosaic virus, PRMV) ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus, PPV) λανθάνων ιός της βερικοκιάς (Apricot latent virus, ApLV) ευρεία Τουρκία, Πορτογαλία, Τυνησία, Συρία ευρεία ευρεία Βιβλιογραφική Πηγή Nemeth, 1986, Bem, 1985, Varveri, 1992 Nemeth, 1986, Boulila, 2001 Nemeth, 1986, Boulila, 2001 Nemeth, 1986, Digiaro, 1993 Boulila, 2001, Ismaeil, 2002 ευρεία Nemeth, 1986 ευρεία Nemeth, 1986 ευρεία Nemeth, 1986 ευρεία ΗΠΑ, Τουρκία Azery,1997 Azery,1997 ευρεία Nemeth, 1986 Μολδαβία, Ιταλία, Γαλλία Gentit, Ιοί του γένους Ilarvirus Οι ιοί που ανήκουν στο γένος Ilarvirus, της οικογένειας Bromoviridae, έχουν τριμερές μονόκλωνο RNA γονιδίωμα με μήκος που κυμαίνεται από 7,71-12,22kb. Η διάμετρος των ιοσωματίων ποικίλει από 26-35nm (Jaspars, 1999). Περιέχουν 12-24% νουκλεϊκό οξύ και 76-88% πρωτεΐνη και παρατηρούνται στο κυτόπλασμα των φυτικών κυττάρων. Τα μέλη του γένους έχουν εκτεταμένο εύρος ξενιστών και μεταδίδονται μηχανικά στο εργαστήριο. Τα περισσότερα από αυτά μεταδίδονται με το σπόρο, ενώ μικρότερος αριθμός με τη γύρη. Μέλη του γένους Ilarvirus που προσβάλουν την αμυγδαλιά είναι ο ιός της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των φύλλων (Prunus necrotic ringspot virus, 13

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ PNRSV), ο ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV) και ο ιός του μωσαϊκού της μηλιάς (Apple mosaic virus, ApMV) Ο ιός της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV) Ο ιός της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων, (PNRSV) προκαλεί μεγάλες οικονομικές καταστροφές σε καλλιέργειες πυρηνοκάρπων ανά τον κόσμο (Uyemoto και Scott, 1992). Ο ιός αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε φυτείες ροδακινιάς (Prunus persica) από τους Cochran και Hutchins το 1941, ενώ αργότερα βρέθηκε και σε άλλα καρποφόρα δέντρα (Nemeth, 1986). Έχουν αναφερθεί αρκετά στελέχη του ιού που παρουσιάζουν γενετική παραλλακτικότητα (Barbara κ.ά., 1978, Crosslin και Mink, 1992, Howell και Mink, 1988). Κάποια στελέχη δεν προκαλούν συμπτώματα, ενώ άλλα προκαλούν χαρακτηριστικές νεκρωτικές κηλίδες. Δομή του γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Ο PNRSV είναι ένας θετικής πολικότητας φυτικός ιός με τριμερές γονιδίωμα που ανήκει στο γένος Ilarvirus και στην οικογένεια Bromoviridae. Τα ιοσωμάτιά του είναι ισομετρικά, 23, 25 και 27nm σε διάμετρο και αποτελούνται από 16% νουκλεϊκό οξύ και 84% πρωτεϊνη. Το συνολικό μέγεθος του γονιδιώματος φτάνει τις 8.056kb. Το Σ.Θ.Α. είναι ο C, ενώ η διάρκεια ζωής in vitro δεν ξεπερνά τις 18 ώρες (Fulton, 1970b). Συμπτώματα Προκαλεί διάφορα συμπτώματα ανάλογα με τα στελέχη του ιού και τον ξενιστή. Έτσι μπορεί να προκαλέσει καστανές νεκρωτικές γραμμές και κηλιδώσεις σε είδη Prunus cerasus, σκούρο μωσαϊκό σε φύλλα αμυγδαλιάς, ενώ δεν προκαλεί συμπτώματα σε είδη Humulus sp. Ξενιστές του ιού αποτελούν διάφορα είδη του γένους Prunus sp. και άλλα της οικογένειας Rosaceae, καθώς και άλλα ποώδη φυτά όπως Chenopodium album, Gomphrena globosa κ.ά. Ο ιός σχετίζεται με αρκετές ασθένειες της αμυγδαλιάς όπως πτώση οφθαλμών, γραμμωτό μωσαϊκό, έντονο μωσαϊκό και νεκρωτική κηλίδωση (Nemeth, 1986, Nyland, 1976, Topchiiska και Topchiiski, 1976, Topchiiska, 1977, Nyland και Lowe, 1964, Thomas και Rawlins, 1939, Scaramuzzi, 1956), (Πίνακας 3). 14

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τρόπος μετάδοσης Η μετάδοση του ιού γίνεται με τον εμβολιασμό, τη γύρη και το σπόρο, ενώ στο εργαστήριο μεταδίδεται και μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα. Πίνακας 3 Aσθένειες αμυγδαλιάς που σχετίζονται με ιούς του γένους Ilarvirus Ασθένεια Παθογόνο αίτιο Βιβλιογραφική αναφορά Πτώση οφθαλμών PNRSV Nyland, 1976 Γραμμωτό μωσαϊκό PNRSV και ApMV Topchiiska and Topchiiski, 1976 Topchiiska, 1977 Έντονο μωασϊκό PNRSV Nyland and Lowe, 1964 Νεκρωτική κηλίδωση PNRSV Thomas and Rawlins, 1939 Scaramuzzi, Ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV) Ο ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (PDV) αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Thomas και Hildebrand το 1936 σε φυτείες δαμασκηνιάς και αργότερα και σε άλλους ξενιστές (Nemeth, 1986). Προκαλεί μεγάλες οικονομικές ζημιές σε καλλιέργειες πυρηνοκάρπων. Η έκταση των απωλειών που προκαλεί εξαρτάται από το είδος του ξενιστή, την ποικιλία και το στέλεχος του ιού. Δομή του γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Πρόκειται για έναν ιό με τριμερές θετικής πολικότητας μονόκλωνο RNA γονιδίωμα. Το RNA-1 και RNA-2 κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αντιγραφή και τη μετάφραση του γονιδιώματος. Το RNA-3 κωδικοποιεί την πρωτεΐνη μετακίνησης (ΠΜ) και την καψιδιακή πρωτεΐνη (ΚΠ) στο 3-αμινοτελικό άκρο. Παρόλα αυτά, η ΚΠ εκφράζεται από ένα υπογενωμικό RNA (RNA-4) προερχόμενο από μετάφραση από το RNA-3. Τα ιοσωμάτια, είναι βακιλλόφορφα, 19-20nm σε διάμετρο και περιλαμβάνουν 14% νουκλεϊκό οξύ και 86% πρωτεΐνη. Συμπτώματα Στη φύση ο PDV προσβάλει περισσότερα από 122 είδη του γένους Prunus (Gilmer, 1955). Το εύρος των ποωδών ξενιστών είναι επίσης μεγάλο και περιλαμβάνει περισσότερα από 80 είδη 15 οικογενειών (Fulton, 1957b, 1970a). Τα συμπτώματα που προκαλεί ο PDV διαφέρουν ανάλογα με το είδος και την ποικιλία του ξενιστή, το 15

16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στέλεχος του ιού αλλά και από τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Τυπικά συμπτώματα είναι χλώρωση, νέκρωση, παραμόρφωση φύλλων, νανισμός και εκροή κόμμεως. Έχει βρεθεί ότι μικτή μόλυνση με άλλους ιούς μπορεί να προκαλέσει πιο έντονα χλωρωτικά συμπτώματα απ ότι ο PDV μόνος του (Fulton, 1957a, Cropley κ.ά., 1964, Nyland και Lowe, 1966). Τρόπος μετάδοσης Η μετάδοση του PDV μπορεί να γίνει με τον εμβολιασμό, το σπόρο και τη γύρη. Μετάδοση με το σπόρο έχει αποδειχθεί σε βυσσινιά (Gilmer και Way, 1960) και κερασιά (Gilmer και Kamalsky, 1962), σε Prunus mahaleb (Cation, 1949, George και Davidson, 1963) και σε βερικοκιά (Fridlund, 1966). Αποδείχθηκε, επίσης, μετάδοση του ιού από μολυσμένο δέντρο κερασιάς με τη γύρη (Gilmer και Way, 1961) καθώς και με τη γύρη μέσω του θρίπα Frankliniella occidentalis (Greber κ.ά., 1992) Ιός του μωσαϊκού της μηλιάς (Apple mosaic virus, ApMV) O ιός του μωσαϊκού της μηλιάς ApMV αναφέρθηκε πρώτη φορά σε είδη Rosa spp. και Malus domestica από τους Bradford και Joly (1933), ενώ αργότερα αναφέρθηκε και σε άλλους ξενιστές (Nemeth, 1986). Δομή του γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Πρόκειται για έναν ιό με τριμερές θετικής πολικότητας μονόκλωνο RNA γονιδίωμα. Τα ιοσωμάτια περιλαμβάνουν 16% νουκλεϊκό οξύ και 84% πρωτεΐνη. Το Σ.Θ.Α. είναι 54 ο C, ενώ η διάρκεια ζωής in vitro δεν ξεπερνά τις 2-4 ώρες. Συμπτώματα Τα συμπτώματα που προκαλούνται από τον ιό διαφέρουν ανάλογα με τον ξενιστή και τα στελέχη του ιού (Posnette και Cropley, 1952, 1956, Luckwill, 1954, Hamdorf, 1961, Kristensen και Thomsen, 1962, Thomsen, 1975). Σε ευπαθείς ξενιστές τα παθογόνα στελέχη προκαλούν κιτρίνισμα των νεύρων, χλώρωση, χλωρωτικές κηλίδες. Τα φύλλα που αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού που επικρατούν υψηλές θερμοκρασίες, συνήθως δεν παρουσιάζουν συμπτώματα. Τρόπος μετάδοσης Μεταδίδεται με τον εμβολιασμό και πιθανώς με το σπόρο (Cameron και Thompson, 1986). Η μηχανική μετάδοση του ιού στο εργαστήριο είναι δύσκολη, για το λόγο αυτό συνιστάται η χρησιμοποίηση ανθέων. 16

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τρόποι διάγνωσης και αντιμετώπισης των ιών του γένους Ilarvirus Διάγνωση α. Φυτοδείκτες: αν και η μέθοδος είναι αρκετά χρονοβόρα και δύσκολη, η διάγνωση μπορεί να γίνει με μηχανική μετάδοση σε ποώδεις ξενιστές των οικογενειών Cucubritaceae (C. sativus, C. maxima), Leguminosaceae (Vigna unguiculata), Chenopodiaceae (Chenopodium foetidum και Chenopodium murale) και Solanaceae (Nicotiana tabacum, N. clevelanti, N. rustica κ.ά.) (Boulila και Marrakchi, 2001). β. Ηλεκτρονική μικροσκοπία (Η.Μ.): παρατήρηση ιοσωματίων στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Boulila και Marrakchi, 2001). γ. Ορολογικώς: τα τελευταία χρόνια έχουν παραχθεί αντισώματα για την ορολογική ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV με DAS-ELISA (Barbara κ.ά., 1978, Mink, 1980, McMorran και Cameron, 1983, Mink και Aichele, 1984a, 1984b, Torrance και Dolby, 1984, Luhn και Uyemoto, 1988, Βαρβέρη, 1994, Sala-Rejczak, 2005, Cooper κ.ά., 1986, Kanaan-Atallah, 2000, Boulila., 2001, Ismaeil, 2002, Barbara, 1980). Όμως, ο χαμηλός τίτλος των ιών κατά τη διάρκεια του θέρους περιορίζει την εφαρμογή των ορολογικών δοκιμών κατά την περίοδο της βλαστικής ανάπτυξης (Varveri κ.ά., 1997, Salem κ.ά., 2003b). δ. Μοριακές μεθόδους: ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του γονιδιώματος των PNRSV, PDV και ApMV επέτρεψε την ανάπτυξη μεθόδων αντίστροφης μεταγραφήςαλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), με χρήση εκκινητών που στοχεύουν στο γονίδιο της καψιδιακής πρωτεΐνης ή στο γονίδιο της RNA-εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης (Saade, 2000, Sanchez-Navarro, 2005, Malioga κ.ά., 2007, ). Αντιμετώπιση Ο μοναδικός τρόπος για την αντιμετώπιση των παραπάνω ιών είναι η χρήση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού και σπόρου. 17

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιοί του γένους Trichovirus Το γένος Trichovirus, που ανήκει στην οικογένεια Flexiviridae, περιλαμβάνει τον ιό της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV), τον ιό της ποικιλοχλώρωσης των φύλλων της κερασιάς (Cherry mottle leaf virus, CMLV), τον ιό της εσωτερικής νέκρωσης των ραγών της αμπέλου (Grapevine berry inner necrosis virus, GINV) και τον ιό του μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach mosaic virus, PcMV). Το γονιδίωμα των μελών του γένους είναι μονομερές θετικής πολικότητας μονόκλωνο RNA μεγέθους 7,5kb που βρίσκεται σε εύκαμπτα νηματοειδή ιοσωμάτια μήκους nm και πάχους 10-12nm. Περιέχουν 95% νουκλεϊκό οξύ και 5% πρωτεΐνη. Η μετάδοσή τους γίνεται με το πολλαπλασιαστικό υλικό και τον εμβολιασμό. Οι GINV, CMLV και PcMV πιθανώς μεταδίδονται με ακάρεα των γενών Colomerus και Eriophyes (Adams κ.ά., 2004) Ιός της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) Η πρώτη αναφορά του ιού της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς (ACLSV) έγινε από τον Lister και τους συνεργάτες του το Έχει μεγάλη οικονομική σημασία κυρίως στα πυρηνόκαρπα είδη και η έκταση των συμπτωμάτων του εξαρτάται από το στέλεχος του ιού και τον ξενιστή. Δομή γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Πρόκειται για έναν ιό του γένους Trichovirus (Martelli κ.ά., 1994) με μονομερές θετικής πολικότητας RNA μεγέθους kb (German κ.ά., 1990, Sato κ.ά., 1993, Jelkmann, 1996, German κ.ά., 1997). Τα ιοσωμάτιά του είναι νηματοειδή με μήκος nm και πλάτος 12nm. Το Σ.Θ.Α είναι ο C, η διάρκεια ζωής in vitro 1 μέρα στους 20 ο C ή 10 μέρες στους 4 ο C και το Σ.Ο.Α Συμπτώματα O ACLSV προσβάλει αρκετά καρποφόρα δέντρα όπου προκαλεί ποικιλία συμπτωμάτων. Έτσι στην μηλιά προκαλεί, σε συνδυασμό με τον ιό της βοθρίωσης του ξύλου της μηλιάς (ASPV), κηλίδες στους καρπούς. Στην αχλαδιά δακτυλιοειδή σχέδια στα φύλλα, και στην κυδωνιά ένα στέλεχος του ιού μπορεί να προκαλέσει νανισμό. Φαίνεται, όμως, πως στα πυρηνόκαρπα προκαλεί τις σοβαρότερες οικονομικές ζημιές (Dunez και Delbos, 1988, Hansen, 1995, Desvignes 1999). 18

19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τρόπος μετάδοσης Η μετάδοση του ιού γίνεται με τον εμβολιασμό και μηχανικά με φυτικό εχύλισμα στο εργαστήριο (Gilmer κ.ά., 1971). Δεν μεταδίδεται με το σπόρο, αναφέρθηκε όμως, η μετάδοσή του με νηματώδεις που ωστόσο δεν επιβεβαιώθηκε (Fritzsche και Kegler, 1968). Διάγνωση Η διάγνωση του ιού μπορεί να γίνει α. με τη χρήση φυτοδεικτών και μηχανική μετάδοση σε ποώδεις φυτοδείκτες όπως τα Chenopodiun quinoa, C. amaranticolor και Phaseolus vulgaris, β. με ηλεκτρονική μικροσκοπία γ. Oρολογικώς: έχουν παραχθεί μονοκλωνικά και πολυκλωνικά αντισώματα κατάλληλα για τη χρήση τους σε ανοσοενζυμικές δοκιμές ELISA (Karesova και Paprstein, 2001). Η μέθοδος είναι πιο αξιόπιστη κατά τη βλαστική περίοδο λόγω του μεγαλύτερου τίτλου του ιού (Varveri κ.ά., 1997), και δ.mοριακές μέθοδοι: η ανίχνευση του ιού καθ όλη τη διάρκεια του έτους μπορεί να γίνει αξιόπιστα και με μεγαλύτερη ευαισθησία μετά την ανάπτυξη της RT-PCR (Candresse et al., 1995, Kinard et al., 1996, Menzel et al., 2002, Foissac et al., 2005). Αντιμετώπιση Για την αντιμετώπιση του ACLSV συνιστάται η χρησιμοποίηση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού καθώς η εξάπλωσή του γίνεται με τη διακίνηση μολυσμένου πολλαπλασιαστικού υλικού Ιός του μωσαϊκού της ροδακινιάς. (Peach mosaic, PcMV) Ο ιός του μωσαϊκού της ροδακινιάς (PcMV), αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε δέντρα ροδακινιάς και αργότερα σε αμυγδαλιά από τον Hutchins το Σχετίζεται με την ασθένεια του μωσαϊκού της αμυγδαλιάς προκαλώντας μικρές χλωρωτικές κηλίδες στα φύλλα, παραμόρφωση της εξωτερικής πράσινης επιφάνειας των καρπών, που όμως δεν επηρεάζει την ποιότητά τους. Μεταδίδεται με τον εμβολιασμό και μέσω του ακάρεως Eriophyes insidiosus (Wilson κ.ά., 1955), ενώ για την αντιμετώπισή του συνιστάται η χρησιμοποίηση υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού, η απομάκρυνση των ασθενών δέντρων και η αντιμετώπιση των ακάρεων. 19

20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιοί του γένους Nepovirus Οι ιοί που ανήκουν στο γένος Nepovirus, της οικογένειας Comoviridae, έχουν διμερές RNA γονιδίωμα με σφαιρικά ιοσωμάτια διαμέτρου 28nm. Τα περισσότερα μέλη του γένους προσβάλλουν μεγάλο αριθμό φυτικών ειδών, στα οποία προκαλούν την εμφάνιση δακτυλιοειδών κηλίδων και ποικιλοχλωρώσεων. Η μετάδοσή τους στον αγρό γίνεται με νηματώδεις των γενών Xiphinema, Longidorus και Paralongidorus, ενώ στο εργαστήριο μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα. Μετάδοση των ιών με το σπόρο όπως και με τη γύρη αναφέρεται για αρκετά μέλη του γένους Ιός της δακτυλιωειδούς κηλίδωσης της ντομάτας (Tomato ringspot virus, ToRSV) Ο ιός της δακτυλιωειδούς κηλίδωσης της ντομάτας (ToRSV) αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε φυτά καπνού από τον Price (1936) και αργότερα σε αμυγδαλιά και ροδακινιά από τους Thomas και Rawlins το Δομή γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Το γονιδίωμά του είναι ένα δίκλωνο RNA με ισομετρικά ιοσωμάτια διαμέτρου 25nm. Το Σ.Θ.Α. είναι στους 58 ο C, το Σ.Ο.Α και η διάρκεια ζωής in vitro αγγίζει τις 21 μέρες. Συμπτώματα Τα συμπτώματα διαφέρουν ανάλογα με τον ξενιστή. Τα κυριότερα είναι μωσαϊκό, κιτρίνισμα των νεύρων, χλώρωση και δακτυλιωειδείς κηλίδες. Στην αμυγδαλιά προκαλεί κιτρίνισμα των φύλλων και ανώμαλη ανάπτυξη των καρπών και σχετίζεται με την ασθένεια του κίτρινου μωσαϊκού των μπουμπουκιών της αμυγδαλιάς (Almond yellow bud mosaic). Τρόπος μετάδοσης Ο ιός μεταδίδεται με το νηματώδη Xiphinema americanum (Dorylamidae) (Forer, 1982). Επίσης μεταδίδεται με τη γύρη και το σπόρο των Rubus idaeus, Nicotiana tabacum, Glycine max και Fragaria x ananassa, και στο εργαστήριο μηχανικά. 20

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιός της μαύρης κηλίδας της ντομάτας (Tomato black ring virus, TBRV) Ο ιός της μαύρης κηλίδας της ντομάτας (TBRV) είναι διαδεδομένος σ όλο τον κόσμο και αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τον Smith το 1946 σε Lycopersicon esculentum. Στην Ελλάδα έχει αναφερθεί σε καλλιέργεια ζαχαρότευτλων (Avgelis και Katis, 1997). Δομή γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Αποτελείται από διμερές γονιδίωμα, με ιοσωμάτια διαμέτρου 28nm. Η διάρκεια ζωής in vitro κυμαίνεται από μέρες, Σ.Θ.Α.: ο C, και Σ.Ο.Α.: Συμπτώματα Τα συμπτώματα που προκαλεί είναι νεκρωτικές και χλωρωτικές κηλίδες, νανισμός, παραμόρφωση των φύλλων και κιτρίνισμα των νεύρων. Τρόπος μετάδοσης Μεταδίδεται μέσω των νηματωδών φορέων Longidorus elongatus και L. attenuatus (Taylor, 1969), καθώς επίσης με εμβολιασμό, γύρη αλλά και μηχανικά. Η μετάδοσή του με το σπόρο κυμαίνεται από % ανάλογα με τον ξενιστή Ιός της δακτυλιωειδόυς κηλίδωσης της βατομουριάς (Raspberry ringspot virus, RRV) Ο ιός της δακτυλιωειδούς κηλίδωσης της βατομουριάς, RRV, αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε καλλιέργειες βατομουριάς και αργότερα σε φράουλα και κερασιά. Είναι αρκετά διαδεδομένος σε όλο τον κόσμο. Σε φυτείες αμυγδαλιάς έχει αναφερθεί η παρουσία του στην Τουρκία (Azery,1997). Δομή γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Αποτελείται από διμερές γονιδίωμα, με ιοσωμάτια διαμέτρου 30nm. Η διάρκεια ζωής in vitro είναι 21 μέρες, Σ.Θ.Α.: 70 ο C. Συμπτώματα Τα προσβεβλημένα φυτά παρουσιάζουν νανισμό, καρούλιασμα των φύλλων, χλωρωτικές κηλίδες στα φύλλα. 21

22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τρόπος μετάδοσης Ο ιός μεταδίδεται με το νηματώδη Longidorus elongatus της οικογένειας Dorylamidae (Taylor, 1969). Επίσης μεταδίδεται με το σπόρο και στο εργαστήριο μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα Ιός του μωσαϊκού ροζέτας της ροδακινιάς (Peach rosette mosaic virus, PRMV) Κύριος ξενιστής του ιού του μωσαϊκού ροζέτας της ροδακινιάς είναι η άμπελος, έχει αναφερθεί, όμως, στις ΗΠΑ σε καλλιέργειες ροδακινιάς προκαλώντας σοβαρές ζημιές. Σε καλλιέργειες αμυγδαλιάς έχει παρουσιαστεί στην Τουρκία (Azery, 1997). Δομή γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Αποτελείται από διμερές γονιδίωμα, με ιοσωμάτια διαμέτρου 28nm. Η διάρκεια ζωής in vitro είναι μέρες, Σ.Θ.Α.: ο C. Συμπτώματα Ο ιός προκαλεί παραμόρφωση και μωσαϊκό στα φύλλα των προσβεβλημένων φυτών και στην άμπελο νανισμό. Τρόπος μετάδοσης Η μετάδοση του ιού γίνεται με νηματώδεις των γενών Xiphinema και Longidorus (Allen και Ebsary, 1988), με εμβολιασμό, με το σπόρο και στο εργαστήριο μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα Τρόποι διάγνωσης και αντιμετώπισης των ιών του γένους Nepovirus Διάγνωση α. με φυτοδείκτες: χρήση ποωδών ξενιστών όπως Chenopodium amaradicolor, C. quinoa, Cucumis sativus, Nicotiana rustica, Phaseolus vulgaris. β. Ορολογικώς με ELISA (OEPP/EPPO, 2005) γ. Μοριακώς με εφαρμογή της δοκιμής PCR (Griesbach, 1995, Malioga κ.ά., 2004) Αντιμετώπιση Για την αντιμετώπισή τους συνιστάται η χρήση υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού και η καταπολέμηση των νηματωδών φορέων. 22

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιοί του γένους Potyvirus Τα μέλη του γένους προκαλούν σοβαρές ασθένειες. Τα περισσότερα μέλη έχουν περιορισμένο εύρος ξενιστών. Το γονιδίωμά του αποτελείται από ένα μονόκλωνο RNA μήκους nm. Από τους ιούς που ανήκουν στο γένος Potyvirus μόνο ο ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus, PPV) προσβάλει πυρηνόκαρπα είδη Ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus, PPV) Ο ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς είναι ένας από τους πιο σημαντικούς ιούς που προσβάλει πυρηνόκαρπα είδη προκαλώντας σοβαρές οικονομικές απώλειες σε φυτείες ροδακινιάς, βερικοκιάς και δαμασκηνιάς (Nemeth, 1986). Ακόμα προσβάλει καλλιέργειες νεκταρινιάς, αμυγδαλιάς, κερασιάς αλλά και άγρια είδη του γένους Prunus. Αρχικά ο ιός ανιχνεύτηκε στη Βουλγαρία το 1915, αλλά μέσω του προσβεβλημένου πολλαπλασιαστικού υλικού διαδόθηκε γρήγορα και στην υπόλοιπη Ευρώπη. Έχουν χαρακτηριστεί 4 στελέχη του ιού με βάση τη συμπτωματολογία, των βιολογικών και επιδημιολογικών χαρακτηριστικών. Στελέχη του ιού είναι ικανά να προσβάλουν την αμυγδαλιά, η παρουσία όμως του ιού στην καλλιέργεια δεν έχει επιβεβαιωθεί. Δομή γονιδιώματος και βιοχημικές ιδιότητες Αποτελείται από ένα θετικής πολικότητας μονόκλωνο RNA. Η διάρκεια ζωής in vitro είναι 3-4 μέρες, Σ.Θ.Α.: ο C. Συμπτώματα Τα συμπτώματα διαφέρουν ανάλογα με τον ξενιστή, την ποικιλία και την ηλικία του ξενιστή. Προκαλεί χλωρωτικές κηλίδες και μωσαϊκό στα φύλλα. Τρόπος μετάδοσης Η μετάδοση του ιού γίνεται με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο, με το σπόρο και τη γύρη σε ορισμένους ξενιστές, με μολυσμένο πολλαπλασιαστικό υλικό και στο εργαστήριο μηχανικά με φυτικό χυμό. Διάγνωση Για τη διάγνωση του ιού χρησιμοποιούνται: α. Φυτοδείκτες (Chenopodium foetidum, είδη Prunus) β. Ορολογικές μέθοδοι όπως η ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Wetzel κ.ά., 1991) γ. Μοριακές μέθοδοι όπως η PCR (Cambra κ.ά., 1994) 23

24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αντιμετώπιση Λόγω του μη-έμμονου τρόπου μετάδοσης του ιού ο αποτελεσματικότερος τρόπος αντιμετώπισής του είναι η χρήση υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού και η απομάκρυνση των ασθενών φυτών. Συνιστάται επίσης η καταπολέμηση των αφίδωνφορέων χωρίς ωστόσο να αναστέλλεται η εξάπλωση του ιού Ιοί του γένους Foveavirus Το γένος Foveavirus ανήκει στην οικογένεια Flexiviridae και περιλαμβάνει ιούς με εύκαμπτα νηματοειδή ιοσωμάτια μήκους 800nm. Το γονιδίωμά του είναι μονομερές θετικής πολικότητας RNA. Τα συμπτώματα που προκαλούν στους ξενιστές τους είναι κυρίως βοθρίωση του ξύλου. Μέχρι στιγμής δεν είναι γνωστοί φορείς των Fovea-ιών, ενώ η ευρεία εξάπλωσή τους οφείλεται στη μετάδοσή τους με τον εμβολιασμό και τον αγενή πολλαπλασιασμό. Τυπικό μέλος του γένους είναι ο ιός της βοθρίωσης της μηλιάς (Apple stem pitting virus, ASPV). Άλλα μέλη του γένους είναι ο ιός της πράσινης δακτυλίωσης με ποικιλοχλώρωση της κερασιάς (Cherry green mottle virus, CGRMV), ο ιός του ίκτερου των νεύρων της αχλαδιάς (Pear vein yellows virus, PVYV), ο λανθάνων ιός της βερικοκιάς (Apricot latent virus, ApLV) και ο ιός της αμπέλου σχετιζόμενος με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (Grapevine rupestris stem pitting virus, GRSPaV) Λανθάνων ιός της βερικοκιάς (Apricot latent virus, ApLV) Ο λανθάνων ιός της βερικοκιάς αναφέρθηκε για πρώτη φορά στη Μολδαβία σε καλλιέργεια βερικοκιάς και αργότερα στην Ιταλία και τη Γαλλία (Gentit κ.ά., 2001). Προκαλεί χλωρωτικές κηλίδες σε φυτά ροδακινιάς ενώ δεν υπάρχουν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την μετάδοσή του ή το εύρος των ξενιστών. Ο ApLV είναι ένας νέος ιός που σχετίζεται πολύ στενά με τον ASPV. Η υψηλή ομολογία στο γονιδίωμα των δύο ιών οδηγούσε στο συμπέρασμα ότι πρόκειται για δύο στελέχη του ίδιου ιού, όμως, το γεγονός ότι ο ApLV προσβάλει μόνο 24

25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πυρηνόκαρπα ενώ ο ASPV μόνο γιγαρτόκαρπα οδηγεί στο συμπέρασμα ότι πρόκειται για δύο διαφορετικούς ιούς (Nemchinov κ.ά., 2000). 1.3 Σκοπός της εργασίας Η κατάσταση των φυτειών αμυγδαλιάς της χώρας μας από πλευράς ιολογικών προσβολών δεν έχει αποτελέσει μέχρι σήμερα αντικείμενο εκτενών ερευνών. Παλαιότερες έρευνες απέδειξαν την παρουσία του PNRSV σε φυτείες ροδακινιάς, νεκταρινιάς, δαμασκηνιάς και αμυγδαλιάς. Αντίθετα, ο ACLSV αν και ευρέως διαδεδομένος σε γιγαρτόκαρπα και διάφορα πυρηνόκαρπα, δεν αναφέρεται στην αμυγδαλιά (Varveri, 1992, Varveri και Bem, 1995, Bem, 1985, Syrgianidis, 1989). Όσο αφορά την κατάσταση στην Κύπρο και εδώ οι πληροφορίες για τους ιούς της αμυγδαλιάς είναι περιορισμένες. Έχουν αναφερθεί σε καλλιέργειες αμυγδαλιάς μόνο οι PNRSV και PDV (Myrta κ.ά, 2002). Στόχος, λοιπόν, της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί και να εκτιμηθεί εκτενέστερα η συχνότητα εμφάνισης των ιών της αμυγδαλιάς στην Ελλάδα και την Κύπρο. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν δείγματα από διάφορες περιοχές της Ελλάδας και της Κύπρου και ελέχθηκαν για ιούς των γενών Ilarvirus, Trichovirus, Nepovirus, και Foveavirus με τη μέθοδο της PCR. Σχεδιάστηκαν καθοδικοί εκκινητές που πολλαπλασιάζουν μέρος του γονιδίου της RdRp για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV. Τέλος, έγινε μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας του γονιδίου της RdRp του PDV και του γονιδίου της ΚΠ του ACLSV. 25

26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Συχνότητα εμφάνισης ιών σε καλλιέργειες αμυγδαλιάς σε Ελλάδα και Κύπρο. 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η αμυγδαλιά αποτελεί μια παραδοσιακή καλλιέργεια στην Ελλάδα με κυριότερα κέντρα παραγωγής τη Θεσσαλία και την Κεντρική Μακεδονία. Η χώρα μας είναι η τρίτη μεγαλύτερη χώρα σε παραγωγή στην ΕΕ με την παραγωγή να ανέρχεται στους χιλιάδες τόνους (Fao, 2006). Η αμυγδαλιά είναι ιδιαίτερα ευπαθής σε σημαντικό αριθμό ιών (Nemeth, 1986). Eργασίες σχετικά με την ανίχνευση ιών, τόσο σε καλλιέργειες αμυγδαλιάς όσο και σε άλλα είδη Prunus, έχουν γίνει από διάφορους ερευνητές ανά τον κόσμο (Kanaan- Atallah κ.ά., 2000, Boulila και Marrakchi, 2001, Ismaeil κ.ά., 2002, Salem κ.ά., 2003a), επιβεβαιώνοντας την ευρεία διάδοσή τους. Στην Ελλάδα εντοπίστηκε η παρουσία μόνο του PNRSV ενώ μέχρι και σήμερα δεν υπάρχουν πληροφορίες για τους υπόλοιπους ιούς (Varveri, 1992). Όσο αφορά την Κύπρο αναφέρεται η παρουσία του PNRSV και PDV (Myrta, 2002). Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η συχνότητα εμφάνισης ιών στην καλλιέργεια της αμυγδαλιάς στην Ελλάδα και την Κύπρο. Σχεδιάστηκαν καθοδικοί εκκινητές που στοχεύουν στο γονίδιο της πολυμεράσης (RdRp) για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV, ενώ για την ανίχνευση του ACLSV και ιών των γενών Nepovirous και Foveavirus χρησιμοποιήθηκαν προηγούμενες μέθοδοι ανίχνευσης (Dovas και Katis, 2003, Maliogka κ.ά., 2004). 2.2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δειγματοληψία Κατά τη διάρκεια των μηνών Μάρτιο- Μάϊο του 2006 και 2007 συλλέχθηκαν συνολικά 265 δείγματα από την Ελλάδα, από τους νομούς Λάρισας, Θεσσαλονίκης, Μαγνησίας, Ιωαννίνων, Πιερίας, Καβάλας, Σερρών και Έβρου. Από την Κύπρο συλλέχθηκαν συνολικά 191 δείγματα από τις περιοχές Αναλιώντας, Πέρα, 27

27 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ Παρεκκλησιά, Κάτω Μονή, Ορούπα, Αγ. Μαρίνα και Πλατανιστάσα (Πίνακας 4). Τα δείγματα δεν εμφάνιζαν συμπτώματα και η δειγματοληψία έγινε με τυχαίο τρόπο. Πίνακας 4 Αριθμός δειγμάτων ανά περιοχή ΠΕΡΙΟΧΗ/ΝΟΜΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΕΛΛΑΔΑ Λάρισας 75 Θεσ/κης 22 Μαγνησίας 42 Ιωαννίνων 10 Πιερίας 38 Καβάλας 19 Σερρών 37 Έβρου 19 Σύνολο 265 ΚΥΠΡΟΣ Αναλιώντας Πέρα Παρεκκλησιά Κάτω Μονή Ορούπα Αγ. Μαρίνα Πλατανιστάσα Σύνολο Φυτικό υλικό Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε πλαστικές σακούλες και αποθηκεύτηκαν στους - 80 ο C για δύο εβδομάδες μέχρι να γίνει ο έλεγχος. Για την εκχύλιση ολικού RNA (Rott και Jelkmann 2001, Παράρτημα, 2) χρησιμοποιήθηκε ιστός φύλλων, μίσχου, πετάλων και περικάρπιου (Varveri κ. ά., 1997, Salem κ.ά., 2003b) Δοκιμή DAS-ELISA Εφαρμόστηκε η δοκιμή DAS-ELISA (Clark and Adams, 1977) με τη χρησιμοποίηση πολυκλωνικών αντισωμάτων για την ανίχνευση των PNRSV και PDV και μονοκλωνικών αντισωμάτων (Mab 8.20 και Mab 29.13, ευγενής χορηγία του κ. Candresse) για την ανίχνευση του ACLSV (Παράρτημα, 1). Ως θετικά λαμβάνονταν τα δείγματα που η οπτική πυκνότητά τους ήταν διπλάσια της οπτικής πυκνότητας του υγιούς μάρτυρα. 28

28 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ Εστιασμένη δοκιμή PCR για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV Σχεδιασμός καθοδικών εκκινητών Για το σχεδιασμό των εξειδικευμένων καθοδικών εκκινητών επιλέχθηκαν συντηρημένες περιοχές στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων από το γονίδιο της RdRp, των PNRSV, PDV, ApMV και άλλων ιών που ανήκουν στο γένος Ilarvirus (Πίνακας 5). Πίνακας 5. Απομονώσεις ιών του γένους Ilarvirus και κωδικοί πρόσβασής τους στην EMBL- EBI που χρησιμοποιήθηκαν για την πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων. Ιός Συντόμευση Κωδικός πρόσβασης στην EMBL-EBI Spinach latent virus SpLV AM U93193 Elm mottle virus EMoV U34050 SL34050 Citrus variegation virus CVV U93605 Citrus leaf rugose virus CiLRV U17726 Tulare apple mosaic virus TAMV AF Prune dwarf virus PDV AM AF Damaskino Apple mosaic virus ApMV AM AF Prunus necrotic ringspot virus PNRSV AM AF Parietaria mottle virus PMoV AM AY Tobacco streak virus TSV AM U75538 Grapevine angular mosaic virus GAMV AY American plum line pattern virus APLPV AF Fragaria chiloensis latent virus FClLV AY Alfalfa mosaic virus AlMV X01572 Peanut stunt virus PSV D11127 * Η απομόνωση damaskino έχει προσδιοριστεί στο εργαστήριο. 29

29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ Εικόνα 1. Πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων 23 ιών που ανήκουν στο γένος Ilarvirus. Οι αλληλουχίες είναι διαθέσιμες στη βάση δεδομένων EMBL και η στοίχισή τους έγινε με τον αλγόριθμο clustalx (Thompson et. al., 1997). Οι περιοχές στο πράσινο, μοβ και κόκκινο πλαίσιο υποδεικνύουν την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων που επιλέχθηκε για τον σχηματισμό των καθοδικών εκκινητών για τους PDV, PNRSV και ApMV, αντίστοιχα. Για το σχεδιασμό των εκκινητών και την επιλογή των συντηρημένων περιοχών του γονιδίου της RdRp έγινε στοίχιση ομόλογων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων της RdRp 23 απομονώσεων Ilar-ιών. Από αυτές 2 ανήκουν στον SpLV, 2 στον EMoV, 3 στον PDV, 2 στον PNRSV, 2 στον ApMV, 2 στον PMoV, 2 στον TSV και από μία απομόνωση στους CVV, CiLRV, TAMV, GAMV, APLPV, FClLV, AMV και PSV. Από αυτές τις απομονώσεις αυτή με τον κωδικό damaskino έχει προσδιοριστεί στο εργαστήριο ΑΠΘ, ενώ οι υπόλοιπες βρίσκονται δημοσιευμένες στη βάση δεδομένων 30

30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ του European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI (Εικόνα 1). Οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν για τους PNRSV, PDV και ApMV πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα 263ζβ, 317ζβ και 347ζβ, αντίστοιχα, του γονιδίου της RdRp (Πίνακας 7, Εικόνα 2). Ilarvirus RdRp ApMV 347 bp PDV 317 bp PNRSV 263 bp 5 -AACAAAGTTGTGAATTTAAACTCGTCGT CCTTCTGTCCAATTCGGAATAACTC AAACGTCACGTTCGGATCCAGC-3 Εικόνα 2. Σχηματική απεικόνιση της θέσης των καθοδικών εκκινητών και του προϊόντος της εστιασμένης PCR για την εξειδικευμένη ανίχνευση των ApMV, PDV και PNRSV Ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV Τα δείγματα στα οποία δεν έδωσαν θετική αντίδραση στις ορολογικές δοκιμές (ELISA) οι PNRSV και PDV ελέγχθηκαν και με τη μέθοδο της γενικής RT-PCR με τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών (Πίνακας 6), για την ανίχνευση ιών του γένους Ilarvirus, (Malioga κ.ά, 2007) ακολουθούμενη από τρεις εστιασμένες δοκιμές PCR με τη χρήση των εξειδικευμένων καθοδικών εκκινητών για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV (Πίνακας 7, Παράρτημα 3). Η ανίχνευση των τελικών προϊόντων της εστιασμένης PCR έγινε με ηλεκτοφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Παράρτημα, 8). 31

31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ Πίνακας 6. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην γενική RT-PCR για την ανίχνευση ιών του γένους Ilarvirus (Malioga κ.ά, 2007). Όνομα εκκινητή Ilar pol up2 Ilar pol do4 Αλληλουχία 5 -Y TCI AMR TTY GAY AAR TC-3 5 -GGY TGR TTR TGI GGR AA-3 Μέθοδος/ Μέγεθος προϊόντος RT- PCR/381 bp Ilar polnes up3 Ilar polnest d5 5 -TCG AMR TTY GAY AAR TCI CA-3 5 -TGG GGR AAY TTI GYY TCR A-3 Nested PCR/ 371 bp (R=A+G; Y=C+T; M=Α+C ; I=Ινοσίνη) Πίνακας 7. Εξειδικευμένοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην εστιασμένη PCR για την ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV. Μέγεθος Εκκινητές Αλληλουχία προϊόντος Ilar pol seq up PNRSV do Ilar pol seq up ApMV do 5 -TCGAMRTTYGAYAARTCGCA-3 5 -AAACGTCACGTTCGGATCCAGC-3 5 -TCGAMRTTYGAYAARTCGCA-3 5 -AACAAAGTTGTGAATTTAAACTCGTCGT-3 263bp 347bp Ilar pol seq up 5 -TCGAMRTTYGAYAARTCGCA-3 PDV do 5 - CCTTCTGTCCAATTCGGAATAACTC -3 Ανοδικός εκκινητής: Ιlar pol seq up (Malioga κ.ά, 2007) 317bp 32

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ Ανίχνευση του ACLSV Για την ανίχνευση του ACLSV πραγματοποιήθηκε μια δοκιμή RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα με τη χρησιμοποίηση εξειδικευμένων εκκινητών (Μαθιουδάκης, 2006) (Πίνακας 8) που πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα 380ζβ του γονιδίου της ΚΠ (Παράρτημα, 4). Η ανίχνευση των τελικών προϊόντων έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Παράρτημα, 8). Πίνακας 8. Εξειδικευμένοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του ACLSV (Μαθιουδάκης, 2006). Eκκινητές Αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος ACLS up ACLS do 5'-CTG GAA CAG ATA CTG GAG TC-3' 5'-GCC TTG TTC ATG ATR AAC AT-3' 380ζβ Ανίχνευση ιών των γενών Foveavirus και Nepovirus Για την ανίχνευση ιών του γένους Foveavirus χρησιμοποιήθηκε η ήδη γνωστή μέθοδος της δοκιμής RT-PCR (Dovas και Katis, 2003, Πίνακας 9, Παράρτημα 5). Αντίθετα, η ανίχνευση ιών του γένους Nepovirus πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια: α) δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cdna), β) PCR με χρήση εκκινητών για την ανίχνευση ιών της οικογένειας Comoviridae και γ) εστιασμένη PCR με χρήση εκκινητών για την ανίχνευση ιών του γένους Nepovirus (Maliogka κ.ά., 2004, Πίνακας 9, Παράρτημα 7). Η ανίχνευση των τελικών προϊόντων έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Παράρτημα, 8). Πίνακας 9. Εξειδικευμένοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ιών των γενών Fovea (Dovas και Katis, 2003) και Nepovirus (Malioga κ.ά., 2004) Εκκινητές Αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος Fovea drw up1 Fovea drw do2 ComF1 ComR2 ComNeF3 ComNeR4 ComNeR5 5 -WGCIAARGCIGGICARAC-3 5 -GCCGSWRAAGCKCAT ACIWSIGARGGIITWYCC AVRTTRTCRTCICCRTA TACGWSGGARGGGTWYCC ARRTTRTCRTCGCCRTAIAC AVRTTRTCRTCGCCRTAIGT-3 (W=A+T, R=A+G, S=G+C, K=G+T, I=Ινοσίνη) 363ζβ 800ζβ 33

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΙΩΝ Ανίχνευση του ApLV Για την ανίχνευση του ApLV πραγματοποιήθηκαν δύο δοκιμές RT-PCR με τη χρήση δύο ζευγών εκκινητών για την ανίχνευση του ApLV (Nemchinov, 2000, Sanchez-Navarro, 2005 Παράρτημα 6, Πίνακας 10). Η ανίχνευση των τελικών προϊόντων έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Παράρτημα, 8). Πίνακας 10. Εξειδικευμένοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του ApLV Εκκινητές Αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος Βιβλιογραφική πηγή H-ALV2 5 -TGATTCCCAAACTGCTTCTAC-3 242ζβ Nemchinov, 2000 C-ALV2 5 -TGAGACCCTCGCTAAAACC-3 ApLV up ApLV do 5 -GGGAATAGAGCCCCAAGAAG-3 5 -TGCCGTCCCGATTAGGTTG-3 717ζβ Sanchez-Navarro, ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανίχνευση ιών του γένους Ilarvirus Ανίχνευση των PNRSV, PDV και ApMV Η χρησιμοποίηση εκκινητών που στοχεύουν στη συντηρημένη περιοχή του γονιδίου της RdRp διεύρυνε το εύρος ανίχνευσης των PNRSV και PDV με αποτέλεσμα την ανίχνευση περισσότερων απομονώσεων των δύο ιών. Για την ανίχνευση του ApMV έγινε μοριακός έλεγχος σε ορισμένο αριθμό δειγμάτων (100) που όμως δεν ανέδειξε την παρουσία του ιού. Ο μοριακός έλεγχος των δειγμάτων στα οποία δεν είχαν ανιχνευτεί οι PNRSV και PDV με τη μέθοδο της ELISA, ανέδειξε την παρουσία των ιών σε ορισμένα από αυτά, κάτι που αναμενόταν λόγω της μεγαλύτερης ευαισθησίας της μεθόδου. Το αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος ήταν για τους PNRSV και PDV 263 και 317ζβ, αντίστοιχα (Εικόνα 3). Στην Ελλάδα τα αποτελέσματα και από τις δύο μεθόδους ανίχνευσης έδειξαν σχεδόν καθολική μόλυνση των δειγμάτων με τον PNRSV, ενώ η παρουσία του PDV ήταν μικρότερη. Ο PNRSV ανιχνεύτηκε σε ποσοστό που κυμαινόταν από 100% (Ν.Καβάλας) ως 10,53% (Ν. Έβρου), ενώ δεν ανιχνεύτηκε στο νομό Θεσσαλονίκης (Πίνακας 11, Σχήμα 1). Ο PDV δεν ανιχνεύτηκε στους νομούς Θεσσαλονίκης και 34