ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΔΟΚΙΜΩΝ REAL-TIME PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ PDV, PNRSV, PPV, PLMVD ΚΑΙ ESFY ΙΩΑΝΝΑ Σ. ΦΩΤΙΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΔΟΚΙΜΩΝ REAL-TIME PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ PDV, PNRSV, PPV, PLMVD ΚΑΙ ESFY ΙΩΑΝΝΑ Σ. ΦΩΤΙΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Ν.Ι. Κατής Καθηγητής Εισηγητής Γ.Σ. Καραογλανίδης. Επίκουρος Καθηγητής Μέλος Β.Ι Μαλιόγκα Λέκτορας Μέλος ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

3

4 Ανάπτυξη δοκιμών Real-time PCR για την ανίχνευση των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY

5 Πίνακας Περιεχομένων Πίνακας Περιεχομένων... 1 Συντομογραφίες ιών και άλλων παθογόνων... 3 Άλλες συντομογραφίες... 5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 8 ABSTRACT Εισαγωγή Ιολογικές προσβολές πυρηνοκάρπων και συναφών παθογόνων Οικογένεια Bromoviridae Ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV) Ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV) Οικογένεια Potyviridae Ιός της ευλογιάς των πυρηνοκάρπων (Plum pox virus, PPV) Ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) Προσβολές πυρηνοκάρπων από φυτοπλάσματα Φυτόπλασμα του Ευρωπαϊκού ίκτερου των πυρηνόκαρπων (European stone fruit yellows phytoplasma, ESFY) Παθογόνων που μεταδίδονται με εμβολιασμό στα πυρηνόκαρπα Μέτρα αντιμετώπισης Μέθοδοι ανίχνευσης των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY Βιοδοκιμές Ηλεκτρονική μικροσκοπία Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) Τεχνική μοριακού υβριδισμού (Molecular hybridisation techniques) Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) Προβλήματα στη διάγνωση ιολογικών και συναφών ασθενειών στα πυρηνόκαρπα Σκοπός της εργασίας Υλικά και Μέθοδοι: Εισαγωγή Απομονώσεις των ιών PNRSV, PDV, PPV, του ιοειδούς PLMVd και του φυτοπλάσματος ESFY [1]

6 2.3. Απομόνωση ολικού RNA και DNA Σχεδιασμός εκκινητών και μοριακού ανιχνευτή TaqMan για την ανίχνευση των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY Βελτιστοποίηση δοκιμών qrt-pcr και q-pcr Παραγωγή RNA και DNA αντιγράφων για την εφαρμογή τους σε δοκιμές RT-PCR πραγματικού χρόνου Αξιολόγηση πρωτοκόλλου εκχύλισης ολικού DNA-Υπολογισμός ανάκτησης Αξιολόγηση ειδικότητας των μεθόδων-έλεγχος δειγμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Βέλτιστες συνθήκες εφαρμογής για τα πέντε παθογόνα Ανάπτυξη real-time RT-PCR για την ανίχνευση του PDV Ανάπτυξη real-time RT-PCR για την ανίχνευση του PNRSV Ανάπτυξη real-time RT-PCR για την ανίχνευση του PPV Ανάπτυξη real-time RT-PCR για την ανίχνευση του PLMVd Ανάπτυξη real-time PCR για την ανίχνευση του ESFY Ποσοτική ανίχνευση του PDV Ποσοτική ανίχνευση του PNRSV Ποσοτική ανίχνευση του PPV Ποσοτική ανίχνευση του PLMVd Ποσοτική ανίχνευση του ESFY Αξιολόγηση πρωτοκόλλου εκχύλισης ολικού RNA και DNA και υπολογισμός ανάκτησης Αξιολόγηση των μεθόδων και έλεγχος δειγμάτων Γενική συζήτηση-συμπεράσματα Συζήτηση Βιβλιογραφία Παράρτημα Α [2]

7 Συντομογραφίες ιών και άλλων παθογόνων ACLSV AlmWB APLPV ApMV Ιός της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς (Apple chlorotic leaf spot virus) Βλαστομανία της αμυγδαλιάς (Almond witches broom) Ιός του Αμερικάνικου γραμμικού μοτίβου της δαμασκηνιάς (Plum American line pattern virus) Ιός του μωσαϊκού της μηλιάς (Apple mosaic virus) APV-1 Ασιατικός ιός των πυρηνοκάρπων 1 (Asian prunus virus 1) CGRMV CLRV CMLV CMV CNRMV Ιός της πράσινης δακτυλιοειδούς ποικιλοχλώρωσης της κερασιάς (Cherry green ring mottle virus) Ιός του καρουλιάσματος των φύλλων της κερασιάς (Cherry leaf roll virus) Ιός της ποικιλοχλώρωσης των φύλλων της κερασιάς (Cherry mottle leaf virus) Ιός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber mosaic virus) Ιός της νεκρωτικής ποικιλοχλώρωσης της κερασιάς (Cherry necrotic rusty mottle virus) CVA Ιός της κερασιάς Α (Cherry virus A) EpCV ESFY Ηπειρώτικος ιός της κερασιάς (Epirus cherry virus) Φυτόπλασμα του Ευρωπαϊκού ίκτερου των πυρηνόκαρπων (European stone fruit yellows) [3]

8 HSVd PcMV PB PC PD PDV PLM PLMVd PNRSV PPV PYLRV PYMV ToRSV WX Ιοειδές του νανισμού του λυκίσκου (Hop stunt viroid) Ιός του μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach mosaic virus) Κηλιδώση της ροδακινιάς (Peach blotch) Αλφισμός των φύλλων της ροδακινιάς (Peach calico) Παρακμή της αχλαδιάς (pear decline) Ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus) Λανθάνον μωσαϊκό της ροδακινιάς (Peach latent mosaic) Ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid) Ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus) Ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus) Ιός του κίτρινου καρουλιάσματος των φύλλων της ροδακινιάς (peach yellow leaf roll virus) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach yellow mosaic virus) Ιός της δακτυλιοειδούς κηλίδωσης της τομάτας (Tomato ringspot virus) Φυτόπλασμα της ασθένειας Χ της ροδακινιάς (Western X-disease) [4]

9 Άλλες συντομογραφίες AP BHQ BSA cdna Ct DAS-ELISA DdRp DEPC DMSO DNA dntps DTT EDTA ELISA Βλαστομανία της μηλιάς (Apple proliferation) Χρωστική απορρόφησης για σήμανση μοριακών ανιχνευτών (Black hole quencher) Ορός αλβουμίνης μόσχου Συμπληρωματικό (complementary) DNA Οριακός κύκλος ανίχνευσης (Cycle threshold) Άμεση ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Double antibody sandwich ELISA) DNA εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (DNAdependent RNA polymerase). Διαίθυλοπυροανθρακικό οξύ (Diethylpyrocarbonate) Διμέθυλοσουλφοξείδιο Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (Deoxyribonucleic acid) 3 -τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (Deoxynucleotide triphosphates) Διθειοθρεϊτόλη Αιθύλενοδιάμινοτετραοξικό οξύ Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) [5]

10 FAM HC-Pro IC- PCR ISEM kda nm NTC P1-Pro PC-PCR PCR PPVP qpcr qrt-pcr rdna Χρωστική σήμανσης μοριακών ανιχνευτών Βοηθητική πρωτεϊνη (Helper componentproteinase) Ανοσοδεσμευτική αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Immuno-capture-PCR) Ανοσοπροσροφητική ηλεκτρονική μικροσκοπία (Immunosorbent electron microscopy) kilodalton Νανόμετρα Μάρτυρας ελεύθερος νουκλεικών οξέων (no template control) Πρωτεάση P1 (P1 Protease) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης αποτύπωμα-σύλληψης/δέσμευσης (printcapture PCR) Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (polymerase chain reaction) Πολυβίνιλο πολυπυρολιδόνιο (polyvinyl polypyrrolidone) Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Quantitative PCR) Ποσοτική, αντίστροφης μεταγραφής, αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Ριβοσωμικό DNA [6]

11 RNA rrna RT-PCR ssrna TaqMan probe VPg ΑΠΑ ΚΠ μl ντ ΠΔΜ ΠΟΛ Ριβονουκλεϊκό οξύ (Ribonucleic acid) Ριβοσωμικό RNA Αντίστροφη μεταγραφή Αλυσιδωτή Αντίδραση της πολυμεράσης (reverse transcription- polymerase chain reaction) Μονόκλωνο (single-stranded) RNA Μοριακός ανιχνευτής με διπλή σήμανση Ιική πρωτείνη συνδεδεμένη με το γονιδίωμα Ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (open reading frame, ORF) Καψιδιακή πρωτεΐνη (coat protein, CP) Μικρόλιτρα Νουκλεοτίδιο Πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης (Movement protein, MP) Πολυμεράση (Polymerase) [7]

12 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV), ο ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus,pnrsv), ο ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιας (Plum pox virus, PPV), το ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) και το φυτόπλασμα του Ευρωπαϊκού ίκτερου των πυρηνόκαρπων (European stone fruit yellows, ESFY) θεωρούνται εκ των σημαντικότερων παθογόνων τα οποία πλήττουν τις καλλιέργειες των πυρηνοκάρπων προκαλλώντες σοβαρές απώλειες. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπτύχθηκαν πέντε μοριακές δοκιμές, πραγματικού χρόνου PCR, ικανές να ανιχνεύουν τα παραπάνω παθογόνα με ταχύτητα, υψηλή ευαισθησία και με ταυτόχρονη δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του μολυσματικού φορτιού. Έτσι αναπτύχθηκαν για την ανίχνευση των PDV, PNRSV και PPV τρείς ποσοτικές, πραγματικού χρόνου RT-PCR (quantitative real-time RT-PCR, qrt-pcr) καθώς και μία πραγματικού χρόνου, ποσοτική PCR (quantitative real-time PCR, qpcr) για την ανίχνευση του ESFY στηριζόμενοι στην χημεία υδρόλυσης TaqMan. Η αποδοτικότητα αυτών είναι ίση με 93%, 99,8%, 95,7%, και 93,5% αντίστοιχα ενώ το δυναμικό εύρος της ποσοτικής ανίχνευσης είναι τα 40 έως 4x10 8, 10 έως 10 8, 20 έως 4x10 8 και 20 έως 2x10 8 συνθετικά αντίγραφα RNA και DNA, αντίστοιχα για κάθε παθογόνο. Ομοίως, για την ανίχνευση του ιοειδούς αναπτύχθηκε μια ποσοτική πραγματικού χρόνου RT -PCR (quantitative real-time RT -PCR, qrt-pcr) με χρήση του παρεμβολέα EvaGreen της οποίας η αποδοτικότητα είναι 94,8% και το δυναμικό εύρος της ποσοτικής ανίχνευσης είναι τα 20 έως 4x10 8 συνθετικά αντίγραφα RNA. Τέλος, αξιολογήθηκε ένα πρωτόκολλο εκχύλισης ολικού DNA βάση της ποσοτικής δοκιμής PCR (quantitative real-time PCR, qpcr) που αναπτύχθηκε για την ανίχνευση του ESFY με στόχο να μελετηθεί η ανάκτηση του μολυσματικού φορτιού καθώς και η επίδραση των συνεκχυλισθέντων ουσιών στην απόδοση της αντίδρασης. Για την μελέτη χρησιμοποιήθηκε υγιής ιστός υποκειμένου GF 305 και αξιολογήθηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις συνθετικών αντίγραφων DNA. Η επίδρασης της παρουσίας συνεκχυλισθέντων αναστολέων στην απόδοση της δοκιμής φαίνεται να μην επηρεάζεται από την συγκέντρωση των αντιγράφων ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών Ct (ο κύκλος κατά τον οποίο οι τιμές φθορισμού της PCR υπερβαίνουν την [8]

13 ουδό ανίχνευσης του προϊόντος) των ανακτώμενων αντιγράφων του μάρτυρα και των φυτικών εκχυλισμάτων. Η ανάκτηση των συνθετικών αντιγράφων DNA υπολογίσθηκε ίση με 75,78±06,25 % και θεωρείται ικανοποιητική. [9]

14 ABSTRACT Prune dwarf virus (PDV), Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), Plum pox virus, (PPV), Peach latent mosaic viroid (PLMVd) and European stone fruit yellows (ESFY) are considered among the most detrimental and important pathogens of stone fruit trees which cause serious economic and agronomic losses. In this study five real-time PCR assays were developed to detect those pathogens and quantify their titer in Prunus tissue with speed, accuracy and high sensitivity. Thus in more detail, three separate TaqMan real-time qrt-pcr assays and one TaqMan real-time qpcr assay were developed for the amplification of PDV, PNRSV, PPV and ESFY with efficiency up to 93%, 99,8%, 95,7%, and 93,5% respectively. The range of quantitivedetection of the assays was 40 to 4x10 8, 10 to 10 8, 20 to 4x10 8 and 20 to 2x10 8 control transcripts respectively. Also a quantitive EvaGreen Real-time RT-PCR developed for the detection of PLMVd. The efficiency of the assay was up to 94,8% and it s quantitation ranged from 20 up to RNA viral transcripts. Finally, a total DNA extraction protocol was evaluated using the qpcr developed for the ESFY detection in order to study the recovery rate of the synthetic transcripts and the effect of the presence of co-extracted inhibitors in the efficiency of the assay. For the evaluation, synthetic ESFY DNA transcripts of two known concentrations (A and B) were added in selected tissue from healthy GF 305 seedlings. The effect of the presence of co extracted inhibitors in the performance of the assay seems to be unaffected by the concentration of the synthetic transcripts while no significant difference revealed between Ct values (cycle at which the fluorescence of PCR values exceed the detection threshold of the product) of the recovered copies of control and the plant extract samples. The recovery rate of the synthetic DNA copies was estimated to be 75,78 ± 06,25% and it is considered sufficient. [10]

15 1. Εισαγωγή [11]

16 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 1.1. Ιολογικές προσβολές πυρηνοκάρπων και συναφών παθογόνων Τα πυρηνόκαρπα προσβάλλονται περισσότερο από ιούς, η πλειονότητα των οποίων ανήκεί σε διάφορές οικογένειες όπως οι Bromoviridae, Potyviridae, Betaflexiviridae και Comoviridae (Martelli et al., 2011) (Πίνακας 1.1). Τα σημαντικότερα ιοειδή που προσβάλλουν τα πυρηνόκαρπα ανήκουν στις οικογένειες Pospiviroidae και Avsunviroidae και στα γένη Hostuviroid και Pelamoviroid αντίστοιχα. Επίσης σοβαρά προβλήματα δημιουργούν στις καλλιέργειες πυρηνοκάρπων προσβολές από φυτοπλάσματα του είδους Candidatus phytoplasma (Πίνακας 1.1). Τα παραπάνω παθογόνα προκαλούν ποικίλα συμπτώματα, όπως ήπια ή έντονη ανάσχεση της ανάπτυξης των δένδρων, παραμορφώσεις βλαστών, και καρπών, βοθρίωση του κορμού, έλκη, νεκρώσεις βλαστών και κλάδων που τελικά οδηγούν σε εξασθένηση, παρακμή των δένδρων ή ακόμα και στο θάνατο του. Οι οικονομικές απώλειες που προκαλούνται από αυτούς τους ιούς ποικίλουν από μικρής κλίμακας έως εξαιρετικά σοβαρές όπως συμβαίνει σε προσβολές από το PPV (Uyemoto και Scott, 1992). Οι ιολογικές προσβολές δενδρωδών εκτός από τα εμφανή μορφολογικά συμπτώματα, τις περισσότερες φορές συνοδεύονται και από μία σειρά διαταραχών σε βιοχημικό επίπεδο. Οι συχνότερες διαταραχές αφορούν τη μείωση της φωτοσυνθετικής ικανότητας, αύξηση της αναπνοής, διαταραχές στο ισοζύγιο ορμονών και μεταβολή της διαπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών που καταλήγει σε αυξημένη συσσώρευση σακχάρων στα φύλλα και αμύλου στους χλωροπλάστες (Balachandran et al., 1997). Απόρροια των μεταβολών αυτών είναι η αναστολή στη σύνθεση χλωροφύλλης, που σχετίζεται είτε με μειωμένη φωτοσυνθετική ικανότητα, είτε εξ αιτίας κατεστραμμένων χλωροπλαστών λόγω της συσσωρευμένης εναπόθεσης ιικών καψιδιακών πρωτεϊνων (ΚΠ) στις μεμβράνες και στα θυλακοειδή των χλωροπλαστών των ιωμένων φυτών (Zaitlin, 1987; Reinero και Beachy, 1989; Rahoutei et al., 2000). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει πως η δράση διάφορων ενζύμων, τα όποια εμπλέκονται στην αφομοίωση του CO 2, στην σύνθεση αμύλου και την μεταφορά [12]

17 Κεφάλαιο 1 των αφομοιωμένων ουσιών της φωτοσύνθεσης, αναστέλλεται στα προσβεβλημένα από ιούς φυτά (Balachandran et al., 1994; Técsi et al., 1994). Η ορμονική διαταραχή που παρατηρείται περιλαμβάνει την αύξηση της συγκέντρωσης αμπσικικού οξέος και την παραγωγή αιθυλενίου, ενώ ταυτόχρονα σημειώνεται μείωση των αυξητικών ορμονών, γιββεριλινών και αυξίνης, με άμεσο αποτέλεσμα την ανάσχεση της ανάπτυξης (Pozsar et al., 1969; Walter, 1988). Πίνακας 1.1: Οι σημαντικότερες ασθένειες των πυρηνοκάρπων που προκαλούνται από προσβολές ιών, φυτοπλασμάτων και ιοειδών Ιος Συντ/φία Οικογένεια Γένος Κύριοι ξενιστές Ιός του Αμερικάνικου γραμμικού μοτίβου της δαμασκηνιάς APLPV Bromoviridae Ilarvirus Δαμασκηνιά Ροδακινιά Κερασιά Ιός της χλωρωτικής κηλίδωσης των φύλλων της μηλιάς ACLSV Betaflexiviridae Trichovirus Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιός του μωσαϊκού της μηλιάς ApMV Bromoviridae Ilarvirus Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ασιατικός ιός των πυρηνοκάρπων 1 APV-1 Betaflexiviridae Foveavirus Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιός της πράσινης δακτυλιοειδούς ποικιλόχρωσης της CGRMV Betaflexiviridae Μη ταξινομημένο σε γένος Κερασιά Βερικοκιά [13]

18 Κεφάλαιο 1 κερασιάς Ιός του καρουλιάσματος των φύλλων της κερασιάς Ιός της ποικιλοχλώρωσης των φύλλων της κερασιάς CLRV Comoviridae Nepovirus Κερασιά CMLV Betaflexiviridae Trichovirus Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ιός της καστανής νεκρωτικής κηλίδωσης της κερασιάς CNRMV Betaflexiviridae Μη ταξινομημένο σε γένος Ροδακινιά Δαμασκηνιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Ιός Α της κερασιάς CVA Betaflexiviridae Capillovirus Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ηπειρώτικος ιός της κερασιάς Ιός του μωσαϊκού της ροδακινιάς EpCV Αταξινόμητο Ourmiavirus Κερασιά PcMV Betaflexiviridae Trichovirus Αμυγδαλιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιóς της ευλογιάς της δαμασκηνιάς PPV Potyviridae Potyvirus Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά [14]

19 Κεφάλαιο 1 Ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων PDV Bromoviridae Ilarvirus Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων PNRSV Bromoviridae Ilarvirus Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιός της δακτυλιωτής κηλίδωσης της τομάτας. ToRSV Comoviridae Nepovirus Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά [15]

20 Κεφάλαιο 1 Ασθένεια Συν/φία Είδος Ομάδα Κύριοι ξενιστές Βλαστομανία της αμυγδαλιάς AlmWB Candidatus Phytoplasma phoenicium Αμυγδαλιά Ευρωπαϊκός ίκτερος των πυρηνόκαρπων ESFY Candidatus Phytoplasma prunorum Αμυγδαλιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ασθένεια Χ της ροδακινιάς WX Candidatus Phytoplasma pruni Αμυγδαλιά Κερασιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιοειδές Συν /φία Οικογένεια Γένος Κύριοι ξενιστές Ιοειδές του νανισμού του λυκίσκου HSVd Pospiviroidae Hostuviroid Αμυγδαλιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά Ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς PLMVd Avsunviroidae Pelamoviroid Αμυγδαλιά Κερασιά Βερικοκιά Ροδακινιά Δαμασκηνιά [16]

21 Κεφάλαιο Οικογένεια Bromoviridae Περιλαμβάνει πολλά και σημαντικά γένη φυτικών ιών σε τρία εκ των οποίων ανήκουν ιοί, οι οποίοι προσβάλουν οπωροφόρα δένδρα. Ειδικότερα στο γένος Ilarvirus ανήκουν δύο από τους σημαντοκότερους ιούς των πυρηνοκάρπων: ο ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV) και ο ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV). Οι ιοί αυτοί εμφανίζουν παγκόσμια εξάπλωση και προκαλούν σοβαρές οικονομικές απώλειες στα οπωροφόρα δένδρα (Hadidi και Barba, 2011). Το γονιδίωμά τους αποτελείται από μονόκλωνο RNA, θετικής πολικότητας, διηρημένο σε τρία ή και περισσότερα μέρη, καθένα από τα οποία καψιδιώνεται χωριστά (πολυσυστατικοί). Τα ιοσωμάτια των ιών του γένους εμφανίζονται ασύμμετρα και διαφέρουν μορφολογικά από βακιλόμορφα ως σφαιρικά. Ο κυριότερος τρόπος διάδοσης των ιών είναι το προσβεβλημένο πολλαπλασιαστικό υλικό. Η φυσική εξάπλωση των ιών του γένους Ilarvirus οφείλεται κυρίως στην ικανότητά τους να μεταδίδονται με τη γύρη και το σπόρο των φυτών, ενώ είναι δυνατή και η μετάδοσή τους με εμβολιασμό. Επίσης, υπάρχουν αναφορές για μετάδοση τους με θρίπες (Greber et al., 1991, 1992). Δεν μεταδίδονται μηχανικά (Van-Regenmortel et al., 2000; Bujarski et al., 2012;) Ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV) O ιός πήρε το όνομα του από το σύμπτωμα του νανισμού και την χαρακτηριστική παραμόρφωση των φύλλων που προκαλεί στη δαμασκηνιά (Prunus domestica), (Thomas και Hildebrand, 1936) (Εικόνα 1.2). Στην Ελλάδα ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά το 1995 (Varveri και Benn, 1995). [17]

22 Κεφάλαιο 1 Α Β Εικόνα 1.2:Συμπτώματα προσβολής PDV σε νεαρή κερασιά. Χλωρωτικοί δακτύλιοι στα φύλλα (Β) και ερυθρά στίγματα κατά την ωρίμανση των καρπών (Α). (Εικόνες από: A. Boari/Dept of Plant Protection & Applied Microbiology, University of Bari) Θεωρείται από τους οικονομικά πιο ζημιογόνους και διαδεδομένους ιούς του γένους (Martelli και Savino, 1997). Παγκοσμίως οι απώλειες της παραγωγής ανέρχονται ως και 40-50%, με τις σημαντικότερες απώλειες να παρατηρούνται σε οπωρώνες αμυγδαλιάς (Nolasco et al., 1991; Raquel, 1998), ροδακινιάς, κερασιάς και βυσσινιάς (Uyemoto και Scott 1992; Rampitsch et al., 1995) Ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV) Ο PNRSV αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε οπωρώνες ροδακινιάς στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής το 1941 (Cochran και Hutchins). Η ασθένεια της δακτυλιοειδούς κηλίδωσης (ring spot) όπως αρχικά αναφέρθηκε, είναι το χαρακτηριστικό σύμπτωμα που προκαλεί ο ιός στο έλασμα του φύλλου (Εικόνα 1.3). Στη χώρα μας, εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 1995 (Varveri και Benn, 1995). Προκαλεί μείωση της παραγωγής από 20 ως 60% (Saunier, 1972) και ποιοτική υποβάθμιση του παραγόμενου προϊόντος, ενώ τα προσβεβλημένα δένδρα καθίστανται πιο ευαίσθητα στον παγετό (Nemeth, 1986; Scott et al., 1989; Uyemoto και Scott, 1992; Mink, 1992). Ο ιός εμφανίζει πολλές γενετικές παραλλαγές που [18]

23 Κεφάλαιο 1 μεταξύ τους παρουσιάζουν έντονες διαφορές σε βιολογικό και ορολογικό επίπεδο καθώς και σε επίπεδο παθογένειας. Η δριμύτητα της προσβολής εξαρτάται από τον συνδυασμό της απομόνωσης του ιού και της ποικιλίας του ξενιστή (Nyland et al., 1976). Εικόνα 1.3: Νεκρωτικές κηλίδες με απώλεια του ενδιάμεσου ιστού. Χαρακτηριστικό σύμπτωμα προσβολής φύλλων κερασιάς προσβεβλημένων από τον PNSRV (Εικόνα από: G.P. Martelli) Οικογένεια Potyviridae Η οικογένεια Potyviridae είναι μία από τις μεγαλύτερες και οικονομικά σημαντικότερες οικογένειες των φυτικών ιών στον κόσμο εξαιτίας των σοβαρών επιπτώσεων στην γεωργική παραγωγή. Το πολυπληθέστερο γένος είναι το Potyvirus στο οποίο συγκαταλέγεται και ένας από τους σοβαρότερους και πιο ζημιογόνους ιούς των πυρηνοκάρπων, ο ιός της ευλογιάς της δαμασκηνιάς (Plum pox virus, PPV) (Shukla et al., 1994). Τα μέλη της οικογένειας φέρουν ένα πολυαδενυλιωμένο μονόκλωνο γραμμικό μόριο RNA το οποίο καψιδιώνεται σε εύκαμπτα νηματοειδή ιοσωμάτια, ενώ η μετάφραση του μορίου πραγματοποιείται μέσο μιας μεγάλης πολυπρωτεϊνης. [19]

24 Κεφάλαιο Ιός της ευλογιάς των πυρηνοκάρπων (Plum pox virus, PPV) H ιολογική φύση της ασθένειας καταγράφηκε το 1932 από τον Atanasoff (Nemeth, 1986; Kegler και Hartmann, 1998), ο οποίος της απέδωσε το όνομα Sharka. Στην Ελλάδα καταγράφηκε για πρώτη φορά το 1968, αργότερα εξαπλώθηκε σε οπωρώνες πυρηνοκάρπων σε ολόκληρη τη χώρα (Demetriadis και Catsibas, 1968; Varveri και Benn, 1995). Οι απώλειες που μπορεί να προκληθούν είναι σημαντικές και σε περιπτώσεις ευαίσθητων ποικιλιών αγγίζουν έως και το 100% της παραγωγής (Nemeth, 1986; Kegler και Hartmann, 1998; Nemchimov et al., 1998; Waterworth και Hadidi, 1998). Μεταξύ των πυρηνοκάρπων, οι ποικιλίες της δαμασκηνιάς φαίνεται να είναι αυτές που επηρεάζονται περισσότερο και παρουσιάζουν εντονότερα συμπτώματα. Τα πιο κοινά συμπτώματα είναι χλωρωτικές κηλίδες ή δακτύλιοι των καρπών ή και στους πυρήνες της βερικοκιάς (Dunez, 1987) (Εικόνα 1.4). [20]

25 Κεφάλαιο 1 A B Γ Εικόνα 1.4: Χλωρωτικοί δακτύλιοι από προσβολή PPV, σε καρπούς ροδάκινου (Α), παραμορφωμένοι καρποί δαμάσκηνου (Β) και χαρακτηριστικά συμπτώματα PPV σε καρπούς και πυρήνες Βερικοκιάς (Γ)(Εικόνα από: Biologische Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft, Bugwood.org). Μεταδίδεται με εμβολιασμό καθώς και με μη-έμμονο τρόπο με περισσότερα από 30 είδη αφίδων τα οποία διαφέρουν ως προς την ικανότητα μετάδοσης του ιού (Isac et al., 1998). Τα δύο κύρια είδη αφίδων-φορέων του ιού, είναι τα είδη Myzus persicae και Aphis spiraecola της οικογένειας Aphididae (Kunze και Krczal, 1971; Leclant, 1973). Ο ιός εμφανίζει μεγάλη γενετική παραλακτικότητα και μέχρι σημέρα [21]

26 Κεφάλαιο 1 έχουν καταγραφεί συνολικά οκτώ στελέχη, PPV-M, D, Rec, T, W, EA, C και CR (Kerlan και Dunez, 1979; Wetzel et al., 1991; Kalashyan et al., 1994; James et al., 2003; Glasa et al., 2004; James και Varga, 2005; Chirkov et al., 2013). [22]

27 Κεφάλαιο 1 Δυο ιοειδή που έχουν προσβάλλουν τα πυρηνόκαρπα ανήκουν στις οικογένειες Pospiviroidae και Avsunviroidae. Αυτά είναι: το ιοειδές του νανισμού του λυκίσκου (Hop stunt viroid, HSVd) του γένους Hostuviroid και το λανθάνον ιοειδές του μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) που ανήκει στο γένος Pelamoviroid (Hernández και Flores, 1992) Το HSVd αν και προσβάλλει πυρηνόκαρπα (Shikata, 1990; Astruc et al., 1996), εκτός από φυτά λυκίσκου, δεν αποτελεί σοβαρό παθογόνο των πυρηνοκάρπων. Αντίθετα, το PLMVd είναι το παθογόνο αίτιο της ασθένειας του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Desvignes, 1980), μια από τις σημαντικότερες και πιο ζημιογώνες ασθένειες στους οπωρώνες ροδακινιάς Ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) Το PLMVd αναφέρθηκε για πρώτη φορά στη Γαλλία πριν περίπου 40 χρόνια σε φυτά ροδάκινου τα οποία εισήχθησαν από τις Η.Π.Α και την Ιαπωνία και προορίζονταν να χρησιμοποιηθούν ως πολλαπλασιαστικό υλικό (Desvignes, 1976) και μέχρι σήμερα έχει καταγραφεί στις περισσότερες ροδάκινο-παραγωγικές περιοχές του κόσμου Στην χώρα μας το παθογόνο διαπιστώθηκε το 1998 σε οπωρώνες ροδακινιάς (Kyriakopoulou και Hadidi, 1998) ενώ αργότερα, η συχνότητα παρουσίας του PLMVd βρέθηκε ιδιαίτερα υψηλή (>75%) αγγίζοντας σε ορισμένες ποικιλίες το (>85%) (Boubourakas, 2010). Το μόριο του PLMVd έχει μήκος 335 με 351 νουκλεοτιδίων (Hernandez και Flores, 1992; Shamloul et al., 1995; Ambros et al., 1998, 1999; Pelchat et al., 2000; Malfitano et al.,2003; Fekih Hasan et al., 2007) και διακρίνεται από την δημιουργία χαρακτηριστικών δομών, ώστε να παραμένει στην χαμηλότερη δυνατή ενεργειακή κατάσταση, δημιουργώντας μια διακλαδωτή δευτεροταγή δομή η οποία σταθεροποιείται περαιτέρω με την παρουσία τουλάχιστον ενός ψευδο-κόμβου (Ambros et al., 1998; Bussiere et al., 2000; Pelchat et al., 2000). [23]

28 Κεφάλαιο 1 Το εύρος φυσικών ξενιστών του ιοειδούς περιλαμβάνει τη ροδακινιά, τη νεκταρινιά, τα υβριδιά της (Desvignes, 1982, 1986) καθώς και άλλα είδη Prunus, όπως τη δαμασκηνιά και τη κερασιά (Faggioli et al., 1997; Hadidi et al., 1997; Giunchedi et al., 1998; Osaki et al., 1999). Υπό συνθήκες αγρού συνήθως δεν προκαλεί συμπτώματα, γεγονός που ευθύνεται για την απόδοση του όρου «λανθάνων», παρόλα αυτά υπάρχουν στελέχη του ιοειδούς που προκαλούν χλωρωτικό ή κίτρινο μωσαϊκό και αλφικά ποικιλόμορφα μοτίβα που καλύπτουν την μεγαλύτερη έκταση του ελάσματος των φύλλων. Το PLMVd προκαλεί επίσης νεκρώσεις οφθαλμών, δίνοντας την εικόνα «γυμνών» κλάδων, βοθρίωση του κορμού και πρόωρη γήρανση των δένδρων. Τα ασθενή δένδρα παράγουν καρπούς πεπλατυσμένους, άχρωμους που φέρουν ρωγμές στην επιδερμίδα τους, με αποτέλεσμα να είναι μη εμπορεύσιμοι (Desvignes, 1980; Flores et al., 2005). (Εικόνα 1.8). Εικόνα 1.8: Συμπτώματα σε καρπούς ροδάκινου προσβεβλημένους από PLMVd. (Εικόνα από : R. Flores, Instituto de Agroquimica y Tecnologia de Alimentos). Η μετάδοση του ιοειδούς πραγματοποιείται με τον εμβολιασμό (Desvignes, 1986). Αν και υπάρχουν πειραματικά δεδομένα μετάδοσης του ιοειδούς με την αφίδα Myzus persicae (Aphididae) επιδεικνύουν σε χαμηλά ποσοστά, γεγονός που υποδηλώνει πως ο συγκεκριμένος τρόπος, είναι περιορισμένης επιδημιολογικής σημασίας (Desvignes, 1981; Flores et al., 1992). [24]

29 Κεφάλαιο Προσβολές πυρηνοκάρπων από φυτοπλάσματα Έχουν βρεθεί τρία είδη φυτοπλασμάτων που προσβάλλουν τα πυρηνόκαρπα. Αυτά είναι το Ca. Phytoplasma phoenicium το οποίο προκαλεί την ασθένεια της Βλαστομανίας της αμυγδαλιάς (AlmWB), το Ca. Phytoplasma prunorum υπεύθυνο για την νόσο του Ευρωπαϊκού ίκτερου των πυρηνόκαρπων (ESFY) καθώς και το Ca. Phytoplasma pruni, παθογόνο αίτιο της Ασθένειας Χ της ροδακινιάς (WX). Τα δύο τελευταία ευθύνονται για σοβαρές ασθένειες πυρηνοκάπων με το WX να απαντάται στη βόρειο Αμερική, ενώ το ESFY έχει εξαπλωθεί στις περισσότερες χώρες της νοτίου και κεντρικής Ευρώπης, καθώς και στην Μεγάλη Βρετανία (Navratil et al., 1998; Davies και Adams, 2000, Topchiiska et al., 2000, Laimer Da Camara Machado et al., 2001; Brzin et al., 2002; Myrta et al., 2003a,b; Genini και Ramel, 2004, Olivier et al., 2004; Delic et al., 2005) Φυτόπλασμα του Ευρωπαϊκού ίκτερου των πυρηνόκαρπων (European stone fruit yellows phytoplasma, ESFY) Ο ευρωπαϊκός ίκτερος των πυρηνοκάρπων είναι μια κοινή ονομασία πολλών οικονομικά σημαντικών ασθενειών παρακμής των πυρηνοκάρπων που πλήττουν την ευρύτερη περιοχή της Ευρώπης. Ιστορικά, πρώτη αναφορά εξασθένισης δένδρου εξ αιτίας αποπληξίας καταγράφεται σε δένδρο βερικοκιάς στη Γαλλία το 1924 (Chabrolin, 1924). Στην Ελλάδα, η ασθένεια καταγράφεται για πρώτη φορά το 1985 σε δένδρα δαμασκηνιάς που εμφανίζουν συμπτώματα παρακμής (Rumbos και Bosalidis, 1985). Πολύ αργότερα μοριακές μελέτες κατάφεραν να αποδόσουν την ασθένεια σε φυτοπλάσμα το οποίο ταξινομήθηκε υπό τον όρο «Candidatus» που χρησιμοποιείται για τα βακτήρια που δεν καλλιεργούνται, ως «Candidatus phytoplasma prunorum» (Ca. P. prunorum) (Seemüller και Schneider, 2004; IRPCM, 2004) το οποίο και κατατάσσεται στην ομάδα του apple proliferation (AP) phytoplasma group ή ομάδα 16SrX. (Seemüller et al., 1998b; Lee et al., 1998). Μολύνει αποκλειστικά αυτοφυή και καλλιεργούμενα πυρηνόκαρπα (Seemüller et al., 1998a),με την βερικοκιά και την ιαπωνική δαμασκηνιά να είναι τα πιο ευπαθή [25]

30 Κεφάλαιο 1 είδη. Παρουσιάζουν τυπικά συμπτώματα ίκτερου, συνοδευόμενα από πρόωρο κοκκίνισμα και έντονη συστροφή των φύλλων (Εικόνα 1.9). Εικόνα 1.9: Χλώρωση και συστροφή φύλλων σε βλαστό ροδακινιάς προσβεβλημένο με ESFY(δεξιά) σε συγκρισή με υγιή (αριστερά). (Εικόνα από: B. Schneider BBA, Germany) [26]

31 Κεφάλαιο 1 Εικόνα 1.10: Παρακμή δένδρου βερικοκιάς από προσβολή ESFY (αριστερά) σε συγκρισή με υγιές (δεξιά). Οξύ σύμπτωμα της προσβολής κατά τις ξηρές περιόδους του θέρους. (Εικόνα απο: Gérard Labonne, Institut national de la recherche agronomique -France) Τα προσβεβλημένα δένδρα είναι πιο ευπαθή στον παγετό εξ αιτίας του καθυστερημένου ή κατεσταλμένου λήθαργου στον οποίο αδυνατούν να εισέλθουν λόγω της προσβολή και παράγουν λιγότερο (Εικόνα 1.10). (Poggi Pollini et al., 1995). Το ESFY μεταδίδεται με εμβολιασμό καθώς και με την ψύλλα της δαμασκηνιάς Cacopsylla pruni (Hemiptera: Psyllidae) (Carraro et al., 1998a; Jarausch et al., 2001; Fialová et al., 2004; Ferretti et al., 2010) με έμμονο τρόπο (Carraro et al., 2001). [27]

32 Κεφάλαιο Παθογόνων που μεταδίδονται με εμβολιασμό στα πυρηνόκαρπα Παγκοσμίως, αλλά και στη χώρα μας, οι οπωρώνες των καρποφόρων δένδρων παρουσιάζουν σοβαρά ιολογικά προβλήματα. Αυτό οφείλεται στην ανεξέλεγκτη χρήση μη πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού, γεγονός που οδηγεί στην προβληματική ανάπτυξη των φυτών και απώλειες στην παραγωγή (Nemeth, 1986; Varveri, 1998; Desvignes et al., 1999; Cembali et al., 2003; Myrta et al., 2003a) Μέτρα αντιμετώπισης Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει κάποιο φυτοπροστατευτικό προϊόν το οποίο να μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα για τον έλεγχο ιολογικών και άλλων εμβολιομεταδιδόμενων ασθενειών. Η λήψη προληπτικών μέτρων όπως η χρήση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού, απαλλαγμένο ιώσεων και έτερων παθογόνων, η εκρίζωση και απομάκρυνση των ασθενών δένδρων καθώς και η καταπολέμηση των εντόμων-φορέων αποτελούν τα κυριότερα μέτρα αντιμετώπισης τους. Βασική προϋπόθεση για την πιστοποίηση του πολλαπλασιαστικού υλικού αποτελεί η ανάπτυξη ευαίσθητων και αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης. Στη συνεχεία, περιγράφονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY Μέθοδοι ανίχνευσης των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY Οι μέθοδοι για τη διάγνωση των φυτικών ιών έχουν εξελιχθεί παράλληλα με την πρόοδο της επιστήμης πάνω στην γνώση και κατανόηση των ιών. Έτσι, μέχρι το 1976, η ανίχνευση τους βασίζονταν μόνο στην οπτική παρατήρηση των συμπτωμάτων στον αγρό, τα συμπτώματα του ξενιστή (βιοδοκιμές) και λιγότερο συχνά στην παρατήρηση ιοσωματίων με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Το 1976, αρχίζει η εφαρμογή των ορολογικών δοκιμών ELISA οι οποίες για την εποχή τους αποτέλεσαν σημαντικό διαγνωστικό εργαλείο, ιδιαίτερα των ιών που προσβάλλουν τα οπωροφόρα δένδρα. Οι μέθοδοι ανίχνευσης των ιών βασίζονταν στην ανίχνευση των ιικών αντιγόνων με τη χρήση εξειδικευμένων αντισωμάτων. Η πρόοδος που [28]

33 Κεφάλαιο 1 σημειώθηκε στην έρευνα των νουκλεϊκών οξέων τα τελευταία 20 χρόνια οδήγησε στην ανάπτυξη μοριακών διαγνωστικών μεθόδων που στηρίζονται στην ανίχνευση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδιώματος των παθογόνων (Πίνακας 1.2). Πίνακας 1.2:Τεχνικές ανίχνευσης που χρησιμοποιήθηκαν κατά καιρούς για την ανίχνευση ιών και συναφών παθογόνων, βάση της μεθοδολογίας τους. Μεθοδολογίες Βιοδοκιμές Ηλεκτρονική μικροσκοπία Ορολογικές Τεχνικές ανίχνευσης Μηχανική μετάδοση σε ποώδεις ξενιστές Εμβολιασμός ξυλωδών Ανοσοπροσροφητική ηλεκτρονική μικροσκοπία (ISEM) Ανοσοδιάχυση Ανοσοενζυμικές (ΕΙΑ) τύπου ELISA Υβριδοποίηση Μοριακού υβριδισμού Υβριδοποίηση αποτύπωσης ιστού In situ υβριδισμός (ISH) Μικροσυστοιχίες ( Microarray-hybridization) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Μοριακές RT-PCR Real time-pcr RT-PCR-ELISA Βιοδοκιμές Χρησιμοποιήθηκαν ευρέως ως διαγνωστική τεχνική ιών των πυρηνόκαρπων κυρίως εξ αιτίας της απλότητας αλλά και των περιορισμένων γνώσεων που απαιτούνται για το παθογόνο. Μελέτες για την ανίχνευση του PPV έχουν δημοσιευθεί από τους (Kerlan και Dunez, 1979; Damsteegt et al., 1997; Hartmann, 1998; Michelutti et al., 2005; Gentit, 2006) καθώς και για τον PDV (Rowhani et al., [29]

34 Κεφάλαιο ) και τον PNRSV (Kryczyński et al., 1992; Zilkah et al., 1994; Rowhani et al., 2005). Επίσης, έχει μελετηθεί η ανίχνευση του PLVMd (Desvignes, 1976, 1980; Flores et al., 1991, 2005) και του φυτοπλάσματος ESFY από τους Ramel, και Gugerli, Τα βασικότερα μειονεκτήματα της τεχνικής είναι ότι είναι πολυέξοδη καθώς απαιτεί εργαστηριακές υποδομές όπως θερμοκήπια και χρονοβόρος (τα συμπτώματα στους ξυλώδεις φυτοδείκτες εμφανίζονται μήνες ή χρόνια μετά τον εμβολιασμό) κάτι που την καθιστά ακατάλληλη για μεγάλης κλίμακας ελέγχους (Cambra et al., 2011) Ηλεκτρονική μικροσκοπία Η ηλεκτρονική μικροσκοπία δίνει πληροφορίες για τη μορφολογία των ιοσωματίων και χρησιμοποιήθηκε συνήθως συμπληρωματικά με τις βιοδοκιμές για να επαληθεύσει την ιογενή φύση του παθογόνου. Βελτιώσεις της τεχνικής σε συνδυασμό με τη χρήση εξειδικευμένων αντισωμάτων οδήγησαν σε πιο ευαίσθητες τεχνικές όπως η Ανοσοπροσροφητική ηλεκτρονική µικροσκοπία. (immunosorbent electron microscopy) (Derrick, 1973). H ISEM δίνει πληροφορίες εκτός από τη μορφολογία και για ορολογικές ιδιότητες του παθογόνου και έχει εφαρμοσθεί για την ανίχνευση των PPV (Noel et al., 1978; Kerlan et al., 1981), PDV και PNRSV (Begtrup et al.,1985; Kalashjan, 1987; Kryczyński et al.,1992; Szyndel και Paduch- Cichal,1997; Boulila και Marrakch, 2001) καθώς και για το ESFY (Laimer, 2009). Αν και θεωρείται αξιόπιστη μέθοδος, δεν ενδείκνυται για μεγάλο αριθμό δειγμάτων ενώ βασικό μειονέκτημα της είναι η αδυναμία ανίχνευσης παθογόνων που στερούνται κυτταρικού τοιχώματος, όπως τα ιοειδή. Τέλος η μέθοδος Decoration η οποία επίσης χρησιμοποιεί εξειδικευμένα αντισώματα μπορεί να εφαρμοσθεί για την ανίχνευση των ιών σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων (Himmler et al., 1988) Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) Η ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA και παραλλαγές αυτής όπως DAS-ELISA (double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay).επέτρεψε για πρώτη φορά την εργαστηριακή ανάλυση πολλών δειγμάτων με απλό και οικονομικό [30]

35 Κεφάλαιο 1 τρόπο (Clark και Adams, 1976). Η τεχνική χρησιμοποιήθηκε από πολλούς ερευνητές για την ανίχνευση και χαρακτηρισμό διαφόρων ιών των οπωροφόρων δένδρων καθώς και σε εργαστηριακούς ελέγχους ρουτίνας χάριν της απλότητας της μεθόδου, της ταχύτητας, της ευαισθησίας και της ευελιξίας που επιδεικνύει (Boscia,1997; Myrta et al., 1998a). Αρχικά εφαρμόστηκε για την ανίχνευση του PPV (Voller et al., 1976; Clark και Adams, 1976; Casper, 1977; Dunez, 1977; Thresh et al., 1977; Adams, 1978; Crescenzi et al., 1997; Garcia et al., 1994; Boscia et al., 1997, 1998; Myrta et al., 1998a,b) ενώ σύντομα εφαρμόστηκε και για την ανίχνευση των PDV (Clark και Adams, 1977; McMorran et al., 1983; Mink et al., 1984; Cooper et al., 1986; Rampttsch et al., 1995) και PNRSV (Clark και Adams, 1976; McMorran et al., 1983; Stein et al., 1987; Mink et al., 1984). Επίσης, αναπτύχθηκε μια δοκιμή χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα για τη γενική ανίχνευση φυτοπλασμάτων της ομάδας AP στην οποία ανήκει και το ESFY (Loi et al., 2002). Η μέθοδος αδυνατεί να ανιχνεύσει την παρουσία ιοειδών μιας και τα εν λόγω παθογόνα στερούνται εξειδικευμένων δομικών πρωτεϊνών. Βασικό μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η αναξιοπιστία στην ανίχνευση ιών των οπωροφόρων δένδρων εξ αιτίας της χαμηλής τους συγκέντρωσης και της ανισοκατανομής στους ιστούς του ξενιστή τους καθώς και της εποχικής διακύμανσης (Fridlund, 1973; Dunez, 1977; Casper, 1979; Fuchs, 1980, 1982; Uyemoto et al, 1989) Τεχνική μοριακού υβριδισμού (Molecular hybridisation techniques) Η μέθοδος του μοριακού υβριδισμού εφαρμόσθηκε πρώτη φορά για την ανίχνευση ιοειδών (Owens και Diener, 1981) και αργότερα ιών (Maule et al., 1983; Garger et al.,1983). Βασίζεται στην εξειδικευμένη αλληλεπίδραση του νουκλεϊκού οξέος του παθογόνου με έναν συμπληρωματικό προς αυτό ανιχνευτή (probe). Έχουν αναπτυχθεί διάφορα πρωτόκολλα μοριακής υβριδοποίησης για την ανίχνευση των PPV (Varveri et al., 1987, 1988; Wetzel et al., 1990; Ion-Nagy et al,. 2004; Herranz et al., 2005), PNRSV (Scott et al., 1992; Heuss-LaRosa et al., 1995; Sánchez-Navarro et al., 1998; Pallás et al., 1998; Herranz et al., 2005; Aparicio et al., 1999b; Amari et al., 2007) και PDV (Saade et al., 2000; Matic et al., 2008). Επίσης, έχει εφαρμοσθεί για [31]

36 Κεφάλαιο 1 την ανίχνευση του ιοειδούς PLMVd (Ambros et al., 1995; Loreti et al., 1995; Turturo, et al., 1998; Kyriakopoulou et al., 2001) και για τη γενική ανίχνευση φυτοπλασμάτων της ομάδας AP στην οποία ανήκει το ESFY (Lorenz et al., 1994). Η μέθοδος του μοριακού υβριδισμού παρέχει γρήγορα αποτελέσματα και επιτρέπει το χειρισμό πολλών δειγμάτων αλλά επιδεικνύει χαμηλότερη ευαισθησία σε σχέση με άλλες μοριακές μεθόδους (PCR), ενώ τα τελευταία χρόνια, η εφαρμογή της έχει περιοριστεί αρκετά (Pallas et al., 2011) Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) αναπτύχθηκε γύρω στα από τον Kary Mullis (Mullis, 1987). Διάφορες παραλλαγές της PCR που αναπτύχθηκαν εξασφαλίζουν ταχεία και αξιόπιστη ανίχνευση των παθογόνων των οπωροφόρων δένδρων (Hadidi και Yang, 1990; Hadidi et al., 1995; Candresse et al., 1995). Εξ αιτίας της υψηλής ευαισθησίας της, η PCR προσφέρει μια ικανοποιητική εναλλακτική για τις υπόλοιπες διαγνωστικές μεθόδους, επιταχύνοντας τη διάγνωση, μειώνοντας την ποσότητα του αρχικού μολύσματος που απαιτείται για την ανίχνευση Η μέθοδος PCR βασίζεται στην ενίσχυση μιας συγκεκριμένης περιοχής του γονιδιώματος του παθογόνου η οποία πραγματοποιείται με τη βοήθεια ενζύμων πολυμερισμού. Η RT-PCR εφαρμόστηκε για την ανίχνευση ιών των πυρηνοκάρπων όπως ο PPV (Nemchinov και Hadidi, 1998; Wetzel et al., 1991; Candresse et al., 1995; Hammond et al., 1998) ο PDV (Parakh et al., 1995) και ο PNRSV (Ulubas et al., 2004). Επίσης αναπτύχθηκαν και διάφορες παραλλαγές για την ταυτόχρονη ανίχνευση περισσοτέρων του ενός παθογόνου (Lorenz et al., 1995; Shamloul et al., 2002; Yousef et al., 2002; Ragozzino et al., 2004). Δοκιμές ανοσοδεσμευτικής PCR (IC-PCR) εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση του PPV (Wetzel et al., 1992; Nolasco et al., 1993). Επίσης, περιγράφηκε μια ακόμα μέθοδος στηριζόμενη στις αρχές της PCR συνδυάζοντας την IC-PCR με την τεχνική αποτύπωσης ιστού (print-capture, PCR) και εφαρμόστηκε για την για την ανίχνευση του PPV σε ιστούς πυρηνόκαρπων (Olmos et al., 1996). Τέλος έχουν αναπτυχθεί αντιδράσεις real time PCR με τη χρήση ανιχνευτών TaqMan για την ανίχνευση του [32]

37 Κεφάλαιο 1 PPV (Olmos et al., 2005; Capote et al., 2006; Schneider et al., 2004; Varga και James 2005) και του ιοειδούς PLMVd (Luigi και Faggioli, 2011). Δοκιμές SYBR Green real time PCR έχουν εφαρμοσθεί για την ανίχνευση των PDV και PNRSV (Marbot, et al., 2003; Jarošová και Kundu,. 2010), ενώ για την ανίχνευση του ιοειδούς PLMVd αναπτύχθηκε πρωτόκολλο RT- LAMP (Boubourakas et al., 2009; Parisi et al., 2011). Τέλος αναπτύχθηκε TaqMan real-time PCR για την γενική ανίχνευση των φυτοπλασμάτων της ομάδος AP όπου ανήκει και το ESFY (Baric και Dalla-Via, 2004) Προβλήματα στη διάγνωση ιολογικών και συναφών ασθενειών στα πυρηνόκαρπα H ανίχνευση των παθογόνων σε δενδρώδεις ξενιστές μπορεί να καταστεί προβληματική. Ένας από τους λόγους που συμβαίνει αυτό είναι η χαμηλή συγκέντρωση των ιών στο φυτικό χυμό σε επίπεδα κατώτερα των ορίων ανίχνευσης της μεθόδου (Detienne et al., 1981). Πρόβλημα επίσης αποτελεί και η άνιση κατανομή του ιού στην κόμη των ασθενών δένδρων (Fridlund, 1973; Dunez, 1977; Casper, 1979) καθώς και η εποχιακή διακύμανση που παρουσιάζει στο ξενιστή (Fuchs, 1980, 1982; Uyemoto et al, 1989). Ειδικότερα στην μοριακή ανίχνευση με την PCR, ένας ακόμη παράγοντας που δυσχεραίνει την ανίχνευση διαφόρων παραγόντων είναι τα υψηλά επίπεδα πολυσακχαριτών και φαινολικών ενώσεων οι οποίες παρεμποδίζουν την δράση των ενζύμων και αναστέλλουν την αντίδραση (Demeke και Adams, 1992; Newbury και Possingham, 1977; Rowhani et al., 1993). Επίσης, η υψηλή μοριακή παραλλακτικότητα ορισμένων ιών, όπως του PPV, επηρεάzει την αξιόπιστη ανίχνευση τους (Rampitsch et al., 1995) δυσχεραίνοντας την ικανότητα ανίχνευσης του συνόλου των απομονώσεων του ιού (Rowahnih Al et al, 2004; Yaegashi et al, 2007). Συνεπώς κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη ευαίσθητων μεθόδων για την ταχεία και αξιόπιστη ανίχνευση των παθογόνων από δένδρα πυρηνοκάρπων. [33]

38 Κεφάλαιο Σκοπός της εργασίας Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη δοκιμών πραγματικού χρόνου (real time) PCR και η εφαρμογή τους στην ανίχνευση πέντε εκ των σημαντικότερων ιολογικών και συναφών παθογόνων τα οποία πλήττουν τις καλλιέργειες των πυρηνοκάρπων της χώρας μας. Τα παθογόνα αυτά είναι ο PDV, ο PNRSV, ο PPV, το ιοειδές PLMVd καθώς και το φυτόπλασμα ESFY. Οι δοκιμές αυτές θα αξιοποιηθούν ως μοριακό εργαλείο για την κάλυψη των αναγκών πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού οπωροφόρων δέντρων, σύμφωνα με τις προδιαγραφές που ορίζονται από την κοινοτική ευρωπαϊκή οδηγία 2008/90/ΕΚ του Συμβουλίου της Ευρωπαϊκής Ένωσης. [34]

39 Κεφάλαιο 2 2. Υλικά και Μέθοδοι: [35]

40 Κεφάλαιο Εισαγωγή Οι ιοί PDV, PNRSV, PPV, το ιοειδές PLMVd καθώς και το φυτόπλασμα ESFY θεωρούνται εκ των σημαντικότερων παθογόνων τα οποία πλήττουν τις καλλιέργειες των πυρηνοκάρπων προκαλώντας σοβαρές απώλειες (Saunier, 1972; Desvignes, 1980; Martelli και Savino, 1997; Waterworth και Hadidi, 1998; Flores et al., 2005). Η παραγωγή και η χρησιμοποίηση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού αποτελεί τον πιο αποτελεσματικό τρόπο αντιμετώπισης τους.για να επιτευχθεί αυτό απαιτούνται αξιοπιστες μέθοδοι ανίχνευσης ιών αυτών. Για την ανίχνευση των εν λόγω παθογόνων έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι σήμερα διάφορες τεχνικές όπως βιοδοκιμές (Di Terlizi, 2000; Bertozzi et al., 2002; Gentit, 2006), ορολογικές μέθοδοι (Cambra et al., 1994; Spiegel et al., 1998; Mekuria et al., 2003), μοριακός υβριδισμός (Palkovics et al., 1994; Saade et al., 2000) καθώς και μοριακές μέθοδοι PCR (Wetzel et al., 1991, 1992; Scott et al., 1992; Shamloul et al., 1995; Olmos et al., 1997, 2004; Rosner et al., 1998; Spiegel et al., 1999; Marbot, et al., 2003; Christensen et al., 2004; Baric και Dalla-Via, 2004; Jarausch et al., 2004; Varga και James, 2004, 2006 ;Galetto et al., 2005; Torres et al., 2005; Schneider et al., 2005; Boubourakas et al., 2009; Jarošová και Kundu,. 2010). Οι μέθοδοι αυτοί έχουν υψηλό κόστος, χαμηλή ευαισθησία και είναι αρκετά πολυπλοκές (Martin et al., 2000). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστων μοριακών δοκιμών ανίχνευσης των παραπάνω παθογόνων, που να χαρακτηρίζονται από αυξημένη ευαισθησία, απλών και ταχέων που θα εφαρμόζονταν σε μεγάλης κλίμακας ελέγχους καθώς και στην διαδικασία πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού πυρηνοκάρπων Απομονώσεις των ιών PNRSV, PDV, PPV, του ιοειδούς PLMVd και του φυτοπλάσματος ESFY Για την ανάπτυξη των μεθόδων ανίχνευσης και την αξιολόγηση του εύρους ανίχνευσης των εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν απομονώσεις των ιών PNRSV, PDV, PPV, PLMVd και του φυτοπλάσματος ESFY. Ορισμένες απομονώσεις των παραπάνω [36]

41 Κεφάλαιο 2 παθογόνων ήταν ευγενική προσφορά εργαστηρίων του εξωτερικού, του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου (ΜΦΙ), του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας του Ινστιτούτου Γεωργικών Ερευνών (ΙΓΕ) της Κύπρου, ενώ χρησιμοποιήθηκαν και απομονώσεις του ESFY από τη συλλογή του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής (Πίνακας 2.1). Πίνακας 2.1: Απομονώσεις των PNRSV, PDV, PPV, PLMVd και του φυτοπλάσματος ESFY που χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία. Κωδ. απομονωσης Παθογόνο Προέλευση Rc 1 PPV + ACLSV Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Rc 2 PPV + ACLSV» Rc 3 PPV» Rc 4 PNRSV» Rc 5 PNRSV» Rc 6 PNRSV» Rc 7 PPV» Rc8 PPV -T Σλοβακική Ακαδημία Επιστημών. Τμήμα Φυτικής Ιολογίας Μπρατισλάβα Rc9 PPV- REC» Σλοβακία Rc10 PPV- REC» Rc11 PPV + ACLSV» Rc12 PPV» Rc13 PPV-M» Rc14 PPV-D» [37]

42 Κεφάλαιο 2 Rc15 PLMVd» Rc16 PLMVd» Rc17 PNRSV Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας, Ινστιτούτου Γεωργικών Ερευνών Κύπρου Rc18 PNRSV» Rc19 PPV» Rc20 PPV» Rc21 PPV» Rc23 PNRSV+ACLSV Εργαστήριο Ιολογίας και Μοριακής Διαγνωστικής. Τμήμα Φυτοπαθολογίας Κέντρο Προστασίας των Φυτών και Βιοτεχνολογίας, Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών Rc24 PDV 3» Βαλένθια, Ισπανια Rc25 PNRSV+ACLSV» Rc26 PPV-D» Rc27 PPV-D» Rc28 PPV-M» Rc29 PPV-EA» Rc30 ESFY Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας Γεωπονικής Σχολής Rc31 ESFY» Α.Π.Θ Rc32 ESFY» Rc33 ESFY» [38]

43 Κεφάλαιο Απομόνωση ολικού RNA και DNA Για την εκχύλιση του ολικού RNA/DNA χρησιμοποιήθηκαν 0,2 gr φρέσκου φυτικού ιστού ή αντίστοιχα 0,02 gr από αποξηραμένο φυτικό ιστό σε περιπτώσεις λυοφιλοποιημένων δειγμάτων. Η μέθοδος εκχύλισης που εφαρμόστηκε πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο Α των Chatzinasiou et al., (2010), χρησιμοποιώντας στήλες διοξειδίου του πυριτίου (FT-2.0 Filter-Tube Spin-Column System, G. Kisker GbR, Steinfurt, Germany) Σχεδιασμός εκκινητών και μοριακού ανιχνευτή TaqMan για την ανίχνευση των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY Για τον σχεδιασμό των εκκινητών και ανιχνευτών τεχνολογίας TaqMan επιλέχθηκαν νουκλεοτιδικές αλληλουχίες απομονώσεων των υπό εξέταση παθογόνων: (PNRSV, PPV PDV, ESFY και PLMVd) οι οποίες ήταν κατατεθειμένες στην διεθνή βάση δεδομένων NCBI ( Η ευθυγράμμιση και πολλαπλή στοίχιση των αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε με την χρήση αλγορίθμου ClustalX2 (Larkin et al., 2007) με τη βοήθεια του προγράμματος MEGA έκδοση 5 (Tamura et al., 2011). Για κάθε παθογόνο επιλέχθηκαν τμήματα του γονιδιώματος που να παρουσιάζουν σχετικά υψηλό βαθμό συντήρησης. Με βάση αυτό το κριτήριο σχεδιάστηκαν οι εκκινητές (Πίνακας 2.2) καθώς και οι μοριακοί ανιχνευτές (Πίνακας 2.3) που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη, έτσι ώστε να είναι εφικτή η ανίχνευση όλων των απομονώσεών κάθε παθογόνου, ενώ συγχρόνως να μην ανιχνεύονται άλλα παθογόνα. Η χρήση της χημείας TaqMan, επιβάλλει το σχεδιασμό του μοριακού ανιχνευτή διπλής σήμανσης, ο οποίος πρέπει να ευθυγραμμίζεται και να υβριδοποιείται στην μεταξύ του ζεύγους εκκινητών περιοχή δέσμευσης και να παρουσιάζει θερμοκρασία τήξης τουλάχιστον 8-10 C μεγαλύτερη από αυτή των εκκινητών. Επίσης, κριτήριο για τον σχεδιασμό του μοριακού ανιχνευτή είναι η αλληλουχία του μορίου του να περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια G και C σε περιεκτικότητα που να ξεπερνά το 40%. Ένα ακόμη κριτήριο που λήφθηκε υπόψη ήταν το συνολικό μήκος της περιοχής που ορίζεται από τους εκκινητές να [39]

44 Κεφάλαιο 2 μην ξεπερνά τα 200 νουκλεοτίδια και η αλληλουχία του να μην ξεκινά από το νουκλεοτίδιο G. Τα φθοριοχρώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την σήμανση των ανιχνευτών καθώς και αντίστοιχες χρωστικές απορρόφησης (BHQ) για κάθε ένα παθογόνο αναγράφονται στους Πίνακες 2.4 και 2.5, αντίστοιχα. Τέλος, πρέπει να αναφερθεί ότι στο 3 άκρο κάθε ανιχνευτή προσδέθηκαν μόρια ZNA (Metabion GmbH, Martinsried, Germany). Τα μόρια αυτά, είναι κατιονικές μονάδες σπερμίνης που αυξάνουν την συγγένεια του ανιχνευτή με το στόχο, μειώνοντας την ηλεκτροστατική απώθηση που αναπτύσσεται μεταξύ των αρνητικά φορτισμένων (ανιονικών) μονόκλωνων νουκλεϊκών οξέων. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται βελτίωση της υβριδοποίησης του ανιχνευτή, ενισχύοντας και επιταχύνοντας τη διαδικασία αναγνώρισης του στόχου. [40]

45 Κεφάλαιο 2 Πίνακας 2.2: Αλληλουχία εκκινητών, μήκος προϊόντος που ενισχύουν καθώς και γονιδιακή περιοχή που υβριδοποιούνται Παθογόνο Εκκινητής Αλληλουχία Μήκος προϊόντος Περιοχή υβριδισμού 1 PDV PDV-F ζ.β ντ ΠΟΛ GAGRTTGGGAGTYCCTCARG -3 PDV-R 5'- TCT TCT CTG GTA ATT VAC MGA AAA TCT -3' PNRSV PNRSV2-F ζ.β ντ ΠΔΜ CATTTRGTTAACYTCCCGAAA TCCAAT-3 PNRSV1-R 5'- AAT ACW CGG CCY ACA CAT CTG TA -3 PPV PPV-F 5'- 146 ζ.β ντ ΚΠ CACAAGTGGRTATCCAATAA AGCCATTG-3' PPV-R 5 - CTGAATTCCATACCTTGGCAT GTATGC-3 PLMVd ViR1-F ζ.β CTCGCAATGARGTAAGGTGG GAC-3 ViR2-R 5'- GTA GAC GTC GTA ATC CAG TTT CTA CG -3 ESFY ESFY-F 5 - CTAAGGAAAATATCATCTTC 244 ζ.β S/23S rdna AGTTGTGAAAGAC-3 ESFY-R 5 - CATCCACTGTGCGCCCTTAAT TTC-3 Γονίδιο Αναφοράς Pru18SF1 Pru18SR1 5 - GCC TGC CTG GGC GTC AC -3 5'- GCA ACC GAG GTY TCG CAA CC -3' 161 ζ.β S rrna 1 θέση υβριδισμού υπολογισμένη από το πρώτο νουκλεοτίδιο του κωδικονίου έναρξης του ΑΠΑ του κάθε γονιδίου. 2 θέση υβριδισμού υπολογισμένη από το πρώτο νουκλεοτίδιο του μορίου PLMVd της απομόνωσης KF [41]

46 Κεφάλαιο 2 Πίνακας 2.3: Γραμμικοί ανιχνευτές υδρόλυσης χημείας TaqMan που σχεδιάστηκαν για την ανίχνευση των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV και ESFY. Παθογόνο Φθορ/μα Αλληλουχία Αποσβέστης PDV TEXAS RED 5'- TTGTAGATCTCAYATTTCTGATGCCTCTGG ZNA4-3' BHQ2 PNRSV FAM 5'-TC GGC CTG TCG CRA GAG RAA ACC-ZNA4-3' BHQ1 PPV HEX 5 - CACATTTCAGTAACGTBGCTGAAGCG- ZNA4-3' BHQ1 ESFY TEXAS RED 5'- TTGGTTAGAGCACACGCCTGATAAGCGTG ZNA4- -3' BHQ2 Πίνακας 2.4: Φθοριοχρωμάτα με τα αντίστοιχα μήκη απορρόφησης και εκπομπής με τα οποία σημάνθηκαν οι ανιχνευτές υδρόλυσης χημείας TaqMan Φθοριόχρωμα Μοριακός τύπος λ απ/σης (nm) λ εκ/πης (nm) FAM 6-Carboxyfluorescein HEX 6-Hexachlorofluorescein TEXAS RED sulforhodamine 101 acid chlorid Πίνακας 2.5: Αποσβέστες που χρησιμοποιήθηκαν για την σήμανση των ανιχνευτών υδρόλυσης χημείας TaqMan Αποσβέστης BHQ-1 Black Hole Quencher BHQ-2 Black Hole Quencher ; BHQ-3 Black Hole Quencher ; Μέγιστη απορρόφηση λmax ( nm) Εύρος απόσβεσης (nm) [42]

47 Κεφάλαιο Βελτιστοποίηση δοκιμών qrt-pcr και q-pcr Η ανάπτυξη της μεθόδου ανίχνευσης πραγματοποιήθηκε για κάθε παθογόνο βάση πρωτοκόλλου που αναπτύχθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Α.Π.Θ (Παππή, 2014). Το διάλυμα της αντίδρασης, περιελάμβανε 1X διαλύματος αντίδρασης F-517L (Optimized Detergent-freeDyNAzymeTM EXT Buffer (50 mm Tris- HCl, 1.5 mm MgCl 2, 15 mm (NH 4 ) 2 S0 4 ) (Finnzymes, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland), 0.2 mm από καθένα dntp, 4 mm DTT, 0,1 mm Trehalose (AppliChem, Darmstadt, Germany), 1 μονάδα of SuperscriptTM III Rnase H Reverse Transcriptase (RT), 1.5 mm MgSO 4 (NEW ENGLAND BioLabs), 3 μονάδες HotStartTaq DNA polymerase σε τελικό όγκο αντίδρασης 25 μl. Για την μεγιστοποίηση της απόδοσης του συστήματος πραγματοποιήθηκε τιτλοδότηση εκκινητών καθώς και μοριακών ανιχνευτών για κάθε παθογόνο ξεχωριστά και οι συγκεντρώσεις που απέδωσαν την βέλτιστη RT- PCR στην παράγραφο 3.2. Σε όλες τις αντιδράσεις συμπεριλαμβάνονταν πάντα θετικοί, αρνητικοί καθώς και τυφλοί μάρτυρες όπου αντί δείγματος προστίθενταν στο διάλυμα αντίδρασης νερό επεξεργασμένου με DEPC, (no template control, NTC). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε μικροπλάκα στον θερμοκυκλοποιητή πραγματικού χρόνου Mx3000P Real-Time PCR System (Agilent Technologies,Stratagene Products Division, California, USA), ενώ η ανάλυση των αποτελεσμάτων υπολογίστηκε με το σύστημα MxPro QPCR Software (Agilent Technologies,Stratagene Products Division, California, USA) Παραγωγή RNA και DNA αντιγράφων για την εφαρμογή τους σε δοκιμές RT-PCR πραγματικού χρόνου Για τις ανάγκες ανάπτυξης της qrt-pcr και q-pcr, δημιουργήθηκαν in vitro ιικά αντίγραφα τμήματος του γονιδιώματος των ιών PDV, PNRSV, PPV του ιοειδούς PLMVd και του φυτοπλάσματος ESFY. Τα αντίγραφα του κάθε παθογόνου δημιουργήθηκαν από την περιοχή του γονιδιώματος η οποία τοποθετείται εκατέρωθεν της περιοχής υβριδισμού των εκάστοτε εκκινητών (Πίνακας 2.2). [43]