ΓΡΥΠΑΡΗΣ Α. Χ.ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΓΡΥΠΑΡΗΣ Α. Χ.ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΤΡΑ 2006

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΓΡΥΠΑΡΗΣ Α. Χ.ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επικ. Καθηγητής Επικ. Καθηγητής Αναπλ. Καθηγητής Κ. Αυγουστάκης Π. Κλεπετσάνης Χ. Κοντογιάννης

3 Αιτία η ζωή του πατέρα μου, Αφορμή τα λόγια της μητέρας μου. Αφιερώνεται στους γονείς μου

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε κατά τα έτη στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή Φαρμακευτικής Τεχνολογίας κ. Κωνσταντίνου Αυγουστάκη, τον οποίο θα ήθελα να ευχαριστήσω για το άψογο κλίμα συνεργασίας που αναπτύχθηκε μεταξύ μας, για την ουσιαστική του καθοδήγηση,για την συμπαράστασή του και τις γνώσεις που μου μετέδωσε και γιατί χωρίς την πολύτιμη βοήθειά του τόσο κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων όσο και κατά την συγγραφή της εργασίας η μελέτη αυτή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής μου: Τον κ. Παύλο Κλεπετσάνη Επίκουρο Καθηγητή Φυσικοφαρμακευτικής του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών για την προθυμία του του και την πολύτιμη βοήθειά του στην τεχνική υποστήριξη κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων και τον χαρακτηρισμό των προϊόντων καθώς και τις χρήσιμες συμβουλές του. Τον κ. Χρήστο Κοντογιάννη Αναπληρωτή Καθηγητή Ενόργανης Φαρμακευτικής Αναλύσεως του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών για τις πολύ εύστοχες παρατηρήσεις του κατά την συγγραφή της παρούσας μελέτης. Ευχαριστώ την εταιρία Pharmathen και τον Δρ.Ευάγγελο Καραβά για την οικονομική υποστήριξη που μου παρείχαν κατά την διάρκεια εκπόνησησης της παρούσας εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τους αγαπητούς συναδέλφους κ.γ.κατσικόγιαννη, κ. Ν. Στιβακτάκη, κ. Μ.Χατζηαποστόλου,για την φιλία, τη συμπαράστασή τους και τις χρήσιμες συμβουλές τους. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου, για την ηθική και υλική υποστήριξη που μου παρείχαν καθώς και για την διαρκή ενθάρρυνσή τους χωρίς την οποία δεν θα ήταν δυνατή η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας.

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ένας από τους πιο σημαντικούς στόχους της φαρμακοθεραπείας είναι η ανάπτυξη φορέων φαρμάκου που θα μεταφέρουν και θα παραδίδουν κατά το δυνατόν εκλεκτικά το φάρμακο στις θέσεις φαρμακολογικής δράσης του με έναν ελεγχόμενο ρυθμό, κατάλληλα προσαρμοσμένο στις ανάγκες της συγκεκριμένης ασθένειας ή κατάστασης. Για την ελεγχόμενη χορήγηση και στόχευση βιοδραστικών ουσιών έχουν αναπτυχθεί πολλοί φορείς όπως τα πολυμερικά νανοσωματίδια και τα λιποσώματα. Μεταξύ των πολυμερών που έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή των σωματιδίων αυτών ιδιαίτερη προσοχή συγκεντρώνουν τα βιοδιασπώμενα και βιοσυμβατά πολυμερή του πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA). Τα συμβατικά νανοσωματίδια που παρασκευάζονται από τα συμπολυμερή αυτά απομακρύνονται ταχύτατα από τη συστηματική κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, κυρίως μέσω της πρόσληψης τους από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα. Για το λόγο αυτό η επικάλυψή τους με υδρόφιλα, μη-ιονικά πολυμερή, όπως η πολυ(αιθυλενογλυκόλη), οδήγησε στην παράταση του χρόνου παραμονής των νανοσωματιδίων στην συστηματική κυκλοφορία λόγω της στερεοχημικής σταθεροποίησης των νανοσωματιδίων και της παρεμπόδισης της διαδικασίας οψωνίωσης η οποία οδηγεί στην φαγοκυττάρωση τους. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε περαιτέρω η δυνατότητα ανάπτυξης νανοσωματιδίων ελεγχόμενης χορήγησης και (παθητικής) στόχευσης σισπλατίνας με βάση τα PLGAmPEG συμπολυμερή. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών παρασκευής στο μέγεθος των λαμβανομένων νανοσωματιδίων και στην φόρτωση και την ενκαψακίωση της σισπλατίνας σε PLGA(40)mPEG(5) νανοσωματίδια. Στη συνέχεια έγινε μελέτη της αντικαρκινικής δραστικότητας νανοσωματιδίων φορτωμένων με σισπλατίνη, τριών διαφορετικών πολυμερικών συστάσεων PLGA(7)mPEG(5) PLGA(31)mPEG(5) και PLGA(57)mPEG(5), έναντι LNCaP καρκινικών κυττάρων προστάτη και σύγκριση αυτής με την δραστικότητα του ελεύθερου φαρμάκου απέναντι στην ίδια καρκινική σειρά..

6 Η φόρτωση και η ενκαψακίωση της σισπλατίνης στα PLGAmPEG νανοσωματίδια, φαίνεται να εξαρτώνται από την αναλογία της μάζας του πολυμερούς προς την μάζα του φαρμάκου στην οργανική φάση, από την αναλογία διμεθυλοφορμαμιδίου και νερού στην εσωτερική υδατική φάση όπου βρίσκεται διαλυμένο το φάρμακο και από το είδος της εσωτερικής υδατικής φάσης του φαρμάκου, ο οποίος σχετίζεται και με την αρχική ποσότητα φαρμάκου, που επιτυγχάνεται στα νανοσωματίδια (drug input). Έτσι, αύξηση της φόρτωσης και ενκαψακίωσης παρατηρείται με αύξηση της αναλογίας μάζας φαρμάκου προς μάζα του πολυμερούς στην εσωτερική υδατική φάση και με αύξηση της αναλογίας νερού προς διμεθυλοφορμαμίδιο στην εσωτερική υδατική φάση. Το μέγεθος των νανοσωματιδίων δεν επηρεάζεται σημαντικά από την αναλογία νερού προς διμεθυλοφορμαμίδιο στην εσωτερική υδατική φάση, ενώ η ελάττωση της ποσότητας του πολυμερούς στη σύνθεση των νανοσωματιδίων προκαλεί ελάττωση του μεγέθους των λαμβανομένων νανοσωματιδίων. Όταν ως εσωτερική υδατική φάση χρησιμοποιήθηκε μόνο διμεθυλοφορμαμίδιο, η μεταβολή του όγκου της εσωτερικής υδατικής φάσης δεν επηρέασε σημαντκά τις ιδιότητες των νανοσωματιδίων (φόρτωση, ενκαψακίωση και μέγεθος). Η αύξηση του χρόνου της εφαρμογής των υπερήχων (probe sonication) κατά την παρασκευή των νανοσωματιδίων είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική ελάττωση του μεγέθους των νανοσωματιδίων, χωρίς να επηρεάζεται η φόρτωση και η ενκαψακίωση των νανοσωματιδίων. Η λυοφιλοποίηση των νανοσωματιδίων είναι απαραίτητη για την αποθήκευση τους για μεγάλο χρονικό διάστημα καθώς μακρόχρονη διατήρηση των νανοσωματιδίων σε διασπορά σε νερό θα οδηγούσε σε απώλεια (διαρροή) του περιεχομένου φαρμάκου και σε υδρόλυση της πολυμερικής μήτρας των νανοσωματιδίων. Μετά από σχετικά πειράματα, βρέθηκε ότι για την επιτυχή ανασύσταση των νανοσωματιδίων μετά από την λυοφιλοποίηση απαιτείται η προσθήκη λυοπροστατευτικού παράγοντα (lyoprotectant) στα νανοσωματίδια πριν την λυοφιλοποίηση. Μεταξύ της γλυκόζης, τρεαλόζης, μαννιτόλης και λακτόζης που δοκιμάσθηκαν, επιτυχή ανασύσταση επιτεύχθηκε με την χρήση της μαννιτόλης και λακτόζης ενώ με τα άλλα λυοπροστατευτικά παρατηρήθηκε σχηματισμός μεγάλων και αδιάλυτων συσσωματωμάτων των νανοσωματιδίων και αδυναμία επανασύστασης των νανοσωματιδίων. Επιπλέον η χρήση μαννιτόλης σε σύγκριση με την λακτόζη,

7 εξασφάλισε μικρότερο μέγεθος των ανασυσταμένων νανοσωματιδίων τόσο χωρίς διήθηση όσο και μετά από διήθηση. Η λυοπροστατευτική ικανότητα της μαννιτόλης και της λακτόζης αυξάνονταν με αύξησης της αναλογίας μάζας λυοπροστατευτικού προς μάζα νανοσωματιδίων, με αποτέλεσμα το μέγεθος των νανοσωματιδίων μετά την ανασύσταση να ελαττώνεται με αύξηση της αναλογίας λυοπροστατευτικό προς νανοσωματίδια. Μελετήθηκε τέλος, η επαναληψιμότητα της διαδικασίας παρασκευής των νανοσωματιδίων που εφαρμόστηκε όσων αφορά τα βασικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων, δηλαδή το μέγεθος, την φόρτωση και την ενκαψακίωση. Με βάση τα ποτελέσματα που λήφθησαν, η μέθοδος παρουσιάζει ικανοποιητική επαναληψιμότητα τόσο κατά την παραγωγή νανοσωματιδίων την ίδια μέρα (intraday reproducibility), όσο και κατά την παρασκευή παρτίδων νανοσωματιδίων σε διαφορετικές ημέρες (interday reproducibility). Στη συνέχεια μελετήθηκε η τοξικότητα κενών νανοσωματιδίων και η αντικαρκινική δραστικότητα νανοσωματιδίων φορτωμένων με σισπλατίνα σε LNCaP καρκινικά κύτταρα προστάτη. Βρέθηκε ότι τα κενά νανοσωματίδια είχαν μικρή τοξικότητα έναντι των LNCaP κυττάρων σε σύγκριση με τα φορτωμένα με σισπλατίνη νανοσωματίδια. Η τοξικότητα των κενών νανοσωματιδίων βρέθηκε να εξαρτάται από την σύσταση του πολυμερούς από το οποίο παρασκευάζονται τα νανοσωματίδια. Έτσι τα νανοσωματίδια με υψηλή περιεκτικότητα σε πολύ(αιθυλενογλυκόλη), δηλαδή αυτά που παρασκευάστηκαν από το πολυμερές PLGA(7)mPEG(5) εμφάνισαν μικρότερη τοξικότητα από τα PLGA(31)mPEG(5) και PLGA(57)mPEG(5) νανοσωματίδια τα οποία έχουν μικρότερη περιεκτικότητα σε πολυ(αιθυλενογλυκόλη). Τα νανοσωματίδια φορτωμένα με σισπλατίνα εμφάνισαν αντικαρκινική δραστικότητα η οποία αυξάνονταν με αύξηση της συγκέντρωσης των νανοσωματιδίων (συνεπώς και της σισπλατίνας) και του χρόνου επώασης με τα LNCaP κύτταρα χωρίς να υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην αντικαρκινική δραστικότητα των νανοσωματδίων σισπλατίνας διαφορετικής πολυμερικής σύνθεσης. Η αντικαρκινική δραστικότητα των νανοσωματιδίων σισπλατίνας ανεξάρτητα από την σύνθεσή τους ήταν παρόμοια με αυτή της σισπλατίνας αποδεικνύοντας ότι η

8 σισπλατίνα διατηρεί την δραστικότητά της μετά από τον εγκλεισμό της στα νανοσωματίδια. Η αντικαρκινική δράση των νανοσωματιδίων σισπλατίνας θα οφείλεται αφενός στην πρόσληψη των νανοσωματιδίων από τα LNCaP κύτταρα και στην ενδοκυτταρική απελευθέρωση της σισπλατίνας και την διάχυσή της στη θέση δράσης (πυρήνας του κυττάρου) μετά από την υδρόλυση των νανοσωματιδίων εντός των κυττάρων και αφετέρου στην είσοδο μορίων σισπλατίνας στα κύτταρα μετά την απελευθέρωση τους από τα νανοσωματίδια πριν τα τελευταία υποστούν φαγοκυττάρωση. Η αύξηση της περιεκτικότητας πολυ(αιθυλενογλυκόλης) στην σύνθεση των νανοσωματιδίων οδηγεί σε μείωση της πρόσληψης τους από τα LNCaP κύτταρα. Αντίθετα, ο ρυθμός αποδέσμευσης της σισπλατίνας στο μέσο επώασης των κυττάρων βρέθηκε να αυξάνει με αύξηση της αναλογίας της πολυ(αιθυλενογλυκόλης) στην σύνθεση των νανοσωματιδίων. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, τα νανοσωματίδια που εμφανίζουν ταχεία πρόσληψη από τα κύτταρα εμφανίζουν ταυτόχρονα και μικρό βαθμό απελευθέρωσης της σισπλατίνας και αντίστροφα. Αυτό έχει σαν συνέπεια να αντισταθμίζεται η επίδραση της ταχύτητας της πρόσληψης των νανοσωματιδίων από τα κύτταρα από την επίδραση του ρυθμού απελευθέρωσης της σισπλατίνας από τα νανοσωματίδια και διάχυσης της προς τα κύτταρα ώστε τελικά η σύνθεση των νανοσωματιδίων να μην έχει σημαντική επίδραση στην αντικαρκινική δραστικότητά τους έναντι των LNCaP καρκινικών κυττάρων. Μικροσκοπική παρατήρηση των νανοσωματιδίων παρείχε περαιτέρω απόδειξη της εισόδου (φαγοκυττάρωσης) των νανοσωματιδίων από τα LNCaP κύτταρα και μάλιστα τα νανοσωματίδια φαίνεται να έχουν την τάση να συσσωρεύονται στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων, γεγονός ιδιαίτερα σημαντικό όσων αφορά την αντικαρκινική τους δράση, το οποίο δεν έχει αναφερθεί μέχρι τώρα στην βιβλιογραφία. Με βάση τα αποτελέσματα που λήφθησαν φαίνεται ότι τα PLGAmPEG νανοσωματίδια σισπλατίνας θα μπορούσαν να αποτελέσουν ικανοποιητική μορφή ελεγχόμενης χορήγησης και στόχευσης σισπλατίνας σε καρκινικούς όγκους. Μετά την μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν το μέγεθος και την φόρτωση των νανοσωματιδίων, είναι δυνατή η ρύθμιση των συνθηκών παραγωγής των νανοσωματιδίων ώστε να λαμβάνονται νανοσωματίδια με σχετικά υψηλή φόρτωση

9 σε σισπλατίνα και μικρό μέγεθος, δηλαδή κατάλληλα για ενδοφλέβια χορήγηση. Επίσης τα πειράματα με την καρκινική σειρά των LNCaP έδειξαν ότι το PLGAmPEG συμπολυμερές έχει από μόνο του μικρή τοξικότητα και υποδεικνύει την ασφάλεια χρήσης του σε φαρμακευτικές εφαρμογές. Τα PLGAmPEG νανοσωματίδια σισπλατίνας αποδείχτηκε ότι έχουν παρόμοια αντικαρκινική δραστικότητα με το ελέυθερο φάρμακο έναντι των LNCaP κυττάρων. Τα PLGAmPEG νανοσωματίδια σισπλατίνας αναμένεται να είναι περισσότερο δραστικά και λιγότερο τοξικά από το ελεύθερο φάρμακο in vivo λόγω της εκλεκτικής συσσώρευσης τους (εξειδικευμένης εντόπισης) στους όγκους με βάση το φαινόμενο αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης (EPR). Με βάση τα παραπάνω, δικαιολογείται η περαιτέρω μελέτη της αντικαρκινικής δράσης των PLGAmPEG νανοσωματιδίων in vivo.

10 ABSTRACT The rapid removal of conventional polymeric nanoparticles from the bloodstream limits their potentional in controlled drug delivery and targeting. Surface engineering, however, may lead to nanoparticles capable of evading their uptake from the mononuclear phagocyte system (MPS), which exhibit prolonged residence in blood. Thus, coating the nanoparticle surface with a hydrophilic polymer such as poly(ethylene glycol) (PEG) has been shown to confer long circulation properties to PLGA (poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles. Although the basic physicochemical and biological properties of these nanoparticles have been studied, there is currently a luck of studies dealing in a systematic way with their drug incorporation and release properties. In the present work was investigated further the possibility of growth of nanoparticles with PLGAmPEG copolymers. Initially it was studied the effect of preparation conditions in the size of the nanoparticles and in the loading and the encapsulation of cisplatin in PLGA(40)mPEG(5) nanoparticles. Afterwards we studied the anticancer efficacy of cisplatin loaded nanoparticles, of three different polymeric constitution PLGA(7)mPEG (5), PLGA(31)mPEG(5) and PLGA(57)mPEG(5), opposite of LNCaP cancer cells and comparison of this with the efficacy of the free medicine towards the same cancer cells. The loading and the encapsulation of cisplatin in PLGAmPEG nanoparticles, appear to depend from the proportion of mass of polymer to the mass of medicine on the organic phase, from the proportion DMF and water on the internal aqueous phase where is found dissolved the medicine and from the type of internal aqueous phase of medicine, who is also related with the initial quantity of medicine, that is achieved in nanoparticles(drug input). Thus, increase of loading and encapsulation is observed with increase of proportion of mass of medicine to mass of polymer in the internal aqueous phase and with increase of proportion of water to DMF in the internal aqueous phase. The size of the nanoparticles is not influenced considerably by the proportion of water to DMF in the internal aqueous phase, while the alleviation of quantity of polymer in the composition of the nanoparticles causes alleviation in the

11 size of the received nanoparticles. When as internal aqueous'' phase was only used dimethylformamide, the change of volume of internal aqueous phase did not significanly influenced the loading, encapsulation and size of the nanoparticles. The increase of time of application of ultrasounds (probe sonication) at the preparation of nanoparticles had as resulting the significant alleviation of their size. The lyophilization of nanoparticles is essential for their storage for big time interval as long-lasting maintenance in dissemination in water would lead to loss (escape) the content of medicine and to hydrolysis of the nanoparticles. After relative experiments, it was found that for the successful reconstitution [nanosomatidion] after the [lyofilopoiisi] is required the addition of lyoprotectant factor in nanoparticles before the lyophilization. Between glucose, trehaloze, mannitol and lactose that were used as lyoprotectans, successful reconstitution it was achieved with the use of mannitol and lactose while with the other lyoprotectants were observed shaping big and insoluble incorporations of nanoparticles. Moreover the use of mannitol compared to lactose, ensured smaller size of the reconstituted nanoparticles so before filtering such as after filtering. The lyoprotetant faculty the mannitol and lactose they were increased with increase of proportion of mass lyoprotectant to mass of the nanoparticles, with result the size of the nanoparticles after the reconstitution to be decreased with the increase of proportion of the lyoprotectant to nanoparticles. Afterwards we studied the toxicity of empty nanoparticles and the anticancer efficacy of cisplatin loaded nanoparticles in LNCaP cancer cells. It was found that empty nanoparticles had small toxicity against LNCaP cells compared to charged with cisplatin nanoparticles. The toxicity of empty nanoparticles was found to depend from the constitution of polymer by which they are prepared. Thus nanoparticles with high content in poly(ethylene glycol), PLGA(7)mPEG(5) presented smaller toxicity than PLGA(31) mpeg(5) and PLGA(57)mPEG(5) nanoparticles. The cisplatin loaded nanoparticles presented anticancer efficacy that was increased with increase of nanoparticles concentration (consequently and cisplatin) and time of incubation with LNCaP cells without exist important differences in anticancer efficacy of cisplatin loaded nanoparticles of different polymeric composition. The anticancer efficacy of

12 cisplatin loaded nanoparticles was similar with this of the cisplatin proving that cisplatin maintains its efficacy after the incarceration in nanoparticles. The anticancer action of cisplatin loaded nanoparticles will be owed on one side in the engagement of nanoparticles by LNCaP cells and in the intracellular release of the cisplatin and its diffusion in the place of action (core of cell) after the hydrolysis of the nanoparticles inside the cells. The increase of poly(ethylene glycol) content in the composition of the nanoparticles leads to reduction of their engagement from LNCaP cells. On the contrary, the rythm of disengagement of cisplatin in the means of incubation of cells found to increase with increase of proportion of poly(ethylene glycol) in the composition of the nanoparticles. With base this results, nanoparticles that present rapid engagement from the cells present simultaneously also small degree of drug release and reversely. Further microscopic observation of the nanoparticles provided further proof of their phagocyttarosis from LNCaP cells and in particular the nanoparticles appear to have the tendency to be accumulated in the cores of the cells, make particularly important that it concerns their anticancer action, which has not been reported up to now in the bibliography. With base the results that were received appear that cisplatin PLGAmPEG nanoparticles could constitute satisfactory form of checked issuing and aiming of cisplatin in cancer cells. Afterwards the study of factors that influences the size and the loading of the nanoparticles, is possible the regulation of conditions of production so that we can receive nanoparticles with relatively high loading in cisplatin and small size, that is to say suitably for intravenus issuing. Also the experiments with the LNCaP cancer cells showed that PLGAmPEG copolymers has from only small toxicity and indicates his safety of use in pharmaceutical applications. PLGAmPEG nanoparticles of cisplatin it was proved that they have similar anticancer efficacy with the free medicine against LNCaP of cells. PLGAmPEG cisplatin loaded nanoparticles is expected is more drastically and more toxic from the free medicine in vivo because the eclectic accumulation of their (specialized localization) in volumes with base the phenomenon of EPR. With base more, is justified the further study of anticancer efficasy of PLGAmPEG nanoparticles in vivo.

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΔΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΠΟΛΥΜΕΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Μηχανισμοί διάσπασης πολυμερών in vivo Αποδέσμευση του φαρμάκου από βιοδιασπώμενα συστήματα χορήγησης ΒΙΟΔΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΗ ΓΑΛΑΚΤΙΚΟΥ- ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ Πολυ(γαλακτικό γλυκολικό) οξύ Σύνθεση συμπολυμερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος(plga) Χαρακτηριστικά των PLGA συμπολυμερών Εφαρμογές PLGA -Συστήματα χορήγησης βιοδραστικών ουσιών με βάση τα PLGA συμπολυμερή Συμπολυμερή πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού)οξέος με πολύ(αιθυλενογλυκόλη) Εισαγωγή Σύνθεση συμπολυμερών πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος με πολυ(αιθυλενογλυκόλη) Χαρακτηριστικά των συμπολυμερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος με πολυ(αιθυλενογλυκόλη) Εφαρμογές PLGA-PEG - Συστήματα χορήγησης βιοδραστικών ουσιών με βάση τα PLGA-PEG συμπολυμερή... 50

14 1.4 PLA-PEG ΚΑΙ PLGA-PEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΣΤΗΝ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων Παρασκευή νανοσωματιδίων με in situ πολυμερισμό Παρασκευή νανοσωματιδίων από προσχηματισμένα πολυμερή Φυσικοχημικές ιδιότητες PLA-PEG και PLGA-PEG νανοσωματιδίων Δομή Μέγεθος και ζ-δυναμικό Τεχνικές μέτρησης μεγέθους των νανοσωματιδίων Προσδιορισμός υδροφιλικότητας/υδροφοβικότητας της επιφάνειας των νανοσωματιδίων Κολλοειδής σταθερότητα των PLA-PEG και PLGA-PEG νανοσωματιδίων In vitro αποικοδόμηση νανοσωματιδίων Προσρόφηση πρωτεϊνών και αλληλεπίδραση με κύτταρα in vitro Φόρτωση και απελευθέρωση φαρμάκων Ιδιότητες βιοκατανομής Ασφάλεια Πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές νανοοσωματιδίων Αντιμετώπιση μολυσματικών ασθενειών Αντιμετώπιση καρκίνου Χορήγηση πρωτεϊνών Χορήγηση ολιγονουκλεοτιδίων και γονιδίων ΣΙΣΠΛΑΤΙΝΗ.. 95

15 1.6 LNCaP ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΡΟΣΤΑΤΗ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Σύνθεση και χαρακτηρισμός των συμπολυμερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού)οξέος με πολυαιθυλενογλυκόλη (PLGAmPEG) Σύνθεση και χαρακτηρισμός των συμπολυμερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού)οξέος με pyrene-butanol Παρασκευή νανοσωματίδιων Παρασκευή νανοσωματίδίων σισπλατίνης Παρασκευή κενών νανοσωματιδίων Παρασκευή νανοσωματιδίων με συμπολυμερές PLGA-δ-πυρενβουτανόλη Χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων Καλλιέργεια κυττάρων Καθαρισμός της καλλιέργειας από τα νεκρά κύτταρα και ανακαλλιέργεια Μέτρηση του αριθμού των κυττάρων με αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Προσδιορισμός τοξικότητας κενών νανοσωματιδίων και δραστικότητας νανοσωματιδίων φορτωμένων με σισπλατίνα Πειράματα υπολογισμού της πρόσληψης των νανοσωματιδίων από τα LNCaP καρκινικά κύτταρα.. 110

16 2.3.8 Μελέτη αποδέσμευσης σισπλατίνης από βιοδιασπώμενα PLGAmPEG νανοσωματίδια σε πλήρες θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των LNCaP καρκινικών κυττάρων Μελέτη της πρόσληψης των νανοσωματίδιων από τα LNCaP κύτταρα με μικροσκόπιο φθορισμού ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΦΟΡΤΩΣΗ-ΕΝΚΑΨΑΚΙΩΣΗ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΣΤΑ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΚΑΙ ΤΟ ΜΕΓΕΘΟΣ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΟΓΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΠΟΛΥΜΕΡΟΥΣ ΠΡΟΣ ΤΗΝ ΜΑΖΑ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΟΓΙΑΣ ΟΓΚΟΥ ΝΕΡΟΥ ΠΡΟΣ ΤΟΝ ΟΓΚΟ ΔΙΜΕΘΥΛΟΦΟΡΜΑΜΙΔΙΟΥ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΟΓΚΟΥ ΔΙΜΕΘΥΛΟΦΟΡΜΑΜΙΔΙΟΥ ΩΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΥΔΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΥΠΕΡΗΧΗΣΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΤΟΥ ΠΡΩΤΟΥ ΚΑΙ ΔΕΥΤΕΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΣΑΚΧΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΤΟ ΜΕΓΕΘΟΣ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΒΛΗΤΌΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΚΑΙ ΕΝΚΑΨΑΚΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΚΑΙ ΦΟΡΤΙΟΥ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΕΝΩΝ PLGAmPEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΣΕ LNCaP ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΡΟΣΤΑΤΗ...128

17 3.7 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΉΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ PLGAmPEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΣΙΣΠΛΑΤΙΝΑΣ ΣΕ LNCaP ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΡΟΣΤΑΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΣΕ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΕΡΟΥΣ ΑΠΟ LNCaP ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΡΟΣΤΑΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗΣ ΣΙΣΠΛΑΤΙΝΑΣ ΑΠΟ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ LNCaP ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΟΣΤΑΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΤΩΝ PLGA-mPEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΠΟ LNCaP ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΡΟΣΤΑΤΗ ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 2: ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 3: ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 4: ΣΥΝΤΗΜΕΙΣ

18 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 18

19 1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η συμβατική μέθοδος χορήγησης φαρμακευτικών ουσιών περιλαμβάνει την εισαγωγή της ουσίας σε ένα κεντρικό διαμέρισμα Δ 2 (συστηματική κυκλοφορία του αίματος ), είτε άμεσα (οδός 2 ), είτε έμμεσα μετά από μια διαδικασία απορρόφησης (οδός 1). Η είσοδος της κάθε ουσίας στο κεντρικό διαμέρισμα ακολουθείται από την κατανομή της στα άλλα διαμερίσματα που είναι οι διάφοροι ιστοί ή τα όργανα του σώματος (Εικ. 1). Όταν το φάρμακο χορηγείται μέσω των συμβατικών αυτών οδών η συγκέντρωση και ο χρόνος διάθεσης του φαρμάκου στη θέση δράσης (στόχος ) δεν μπορούν να καθοριστούν ανεξάρτητα. Απλώς επιλέγεται κατάλληλα η δόση ή και η συχνότητα χορήγησης ώστε να επιτευχθούν θεραπευτικά επίπεδα του φαρμάκου στο στόχο για συγκεκριμένη χρονική περίοδο. Ο κλασικός αυτός τρόπος χορήγησης φαρμακευτικών ουσιών εμφανίζει μειονεκτήματα στα οποία περιλαμβάνονται η επαγωγή παρενεργειών από την δράση του φαρμάκου στους υγιείς ιστούς και η δυσκολία συμμόρφωσης των ασθενών στην φαρμακευτική αγωγή. Έτσι στις Η.Π.Α, όπου υπάρχουν σχετικές μελέτες υπολογίζεται ότι το 15% των ασθενών που εισάγονται στα νοσοκομεία και περίπου θάνατοι ετησίως οφείλονται στις παρενέργειες των φαρμάκων, ενώ το 10% των εισαγωγών στα νοσοκομεία οφείλεται στην μη συμμόρφωση των ασθενών στην φαρμακευτική αγωγή (Classen και συνεργάτες, 1997 και Cramer και συνεργάτες, 1994 ). Η ελεγχόμενη χορήγηση των φαρμακευτικών ουσιών (Εικ. 2) μπορεί να επιτευχθεί είτε με την διάθεση του φαρμάκου στο κεντρικό διαμέρισμα με προκαθορισμένο ρυθμό K id (οδός 1), είτε με την εφαρμογή της φαρμακομορφής στην περιοχή του οργάνου στόχου όπου το φάρμακο αποδεσμεύεται με συγκεκριμένο και προκαθορισμένο ρυθμό K id (οδός 2 ) ή τέλος με την εισαγωγή του φαρμάκου στην συστηματική κυκλοφορία του αίματος και την εκλεκτική μεταφορά του στον στόχο (οδός 3 ). Η εκλεκτική μεταφορά του φαρμάκου με τη βοήθεια κατάλληλου φορέα στο όργανο / ιστό στόχο (στόχευση του φαρμάκου ) επιτυγχάνεται με τη σύνδεση / εγκλεισμό του φαρμάκου σε κατάλληλο φορέα ( φαρμακομορφή ) ο οποίος με τη βοήθεια ενεργητικού ή παθητικού μηχανισμού συσσωρεύεται εκλεκτικά στην περιοχή δράσης του φαρμάκου. 19

20 Εικόνα 1 Συμβατική χορήγηση φαρμακευτικών ουσιών. Εικόνα 2 Ελεγχόμενη χορήγηση φαρμακευτικών ουσιών. 20

21 Με την ελεγχόμενη χορήγηση, με την οποία μπορεί να καθοριστεί ανεξάρτητα και επακριβώς η ποσότητα και ο χρόνος διάθεσης της δραστικής ουσίας στη θέση δράσης αυτής, παρέχεται η δυνατότητα για: 1. Σταθεροποίηση των επιπέδων της δραστικής ουσίας πάνω από τα θεραπευτικά επίπεδα για όσο χρόνο διαρκεί η θεραπεία και μικρότερες διακυμάνσεις της συγκέντρωσης. 2. Ελάττωση των παρενεργειών. 3. Ελάττωση της ποσότητας του φαρμάκου που απαιτείται για τη θεραπεία. 4. Ελάττωση της συχνότητας χορήγησης των δόσεων και πιθανώς και της δυσκολίας χορήγησης, με αποτέλεσμα και τη βελτίωση της συμμόρφωσης του ασθενούς. 5. Αποτελεσματική χορήγηση βιοδραστικών ουσιών με μικρή βιολογική ημιπερίοδο ζωής, όπως τα πεπτίδια και οι πρωτεΐνες. Τα συστήματα ελεγχόμενης χορήγησης είναι δυνατό να εμφανίσουν και κάποια μειονεκτήματα τα κυριότερα από τα οποία είναι: 1. Aυξημένο κόστος παρασκευής σε σύγκριση με τις συμβατικές φαρμακομορφές 2. Tοξικότητα λόγω των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή αυτών ή λόγω των προϊόντων βιοδιάσπασης αυτών 3. Kίνδυνος υπέρβασης των τοξικών επιπέδων του φαρμάκου από την (μη αναμενόμενη ) απότομη απελευθέρωση του εγκλεισμένου φαρμάκου (dose dumping effect), 4. Ενόχληση του ασθενούς από τη φαρμακομορφή αλλά και από τον τρόπο χορήγησης αυτής. 5. Ανάπτυξη ανοχής από τη συνεχή παρουσία της δραστικής ουσίας στη θέση δράσης, φαινόμενο που έχει παρατηρηθεί για παράδειγμα στην περίπτωση των νιτρωδών (Noak και Born, 1987). 6. Ελάττωση της βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου, όπως στην περίπτωση συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης της προπανολόλης και της 21

22 θεοφυλλίνης (Gundert Remy και Hildebrandt, 1984, και συνεργάτες, 1978 ). McAinsh και Τα συστήματα ελεγχόμενης χορήγησης μπορούν να καταταχθούν ανάλογα με την πολυπλοκότητα που παρουσιάζουν στην τεχνολογία τους σε τέσσερις κατηγορίες, (Εικ. 3 ) (Chien, 1992 ): 1. Συστήματα προκαθορισμένου ρυθμού αποδέσμευσης (Εικ. 3,Α) Πρόκειται για συστήματα των οποίων ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου καθορίζεται από την κατασκευή του συστήματος. Ο έλεγχος αυτός επιτυγχάνεται με την εισαγωγή στο σύστημα φραγμού (barrier ) μέσω του οποίου ελέγχεται ο ρυθμός διάχυσης των μορίων του φαρμάκου από το σύστημα στο περιβάλλον υγρό. Ο φραγμός αυτός περιλαμβάνει δύο τύπους:1) Τα λεγόμενα συστήματα μεμβράνης (membrane ή reservoir systems), στα οποία ο φραγμός είναι μια πολυμερική μεμβράνη που περιβάλλει το σύστημα, και 2) τα συστήματα τύπου μήτρας (matrix systems ) όπου το φάρμακο βρίσκεται διαλυμένο ή διεσπαρμένο εντός πολυμερικής ή κηρώδους μήτρας. Οι δύο αυτές μορφές συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης είναι οι απλούστερες μορφές που μπορούμε να συναντήσουμε και πολλά συστήματα αυτού του τύπου χρησιμοποιούνται σήμερα στη θεραπευτική. 2. Συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης (activation modulated systems ) (Εικ.3,Β ) Στα συστήματα αυτά μέσω παρέμβασης κάποιας φυσικής, χημικής ή βιοχημικής διεργασίας ή ακόμα και με την παροχή κάποιας εξωτερικώς προερχόμενης ενέργειας επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση της αποδέσμευσης του φαρμάκου. Στους φυσικούς τρόπους ενεργοποίησης τέτοιων συστημάτων περιλαμβάνονται μεταξύ άλλων η ωσμωτική πίεση, η οποία βρίσκει εφαρμογή στα γνωστά συστήματα σταθερού ρυθμού αποδέσμευσης τύπου ωσμωτικής αντλίας (Alza Corporation ) (Theeuwes, 1983), η εφαρμογή ηλεκτρομαγνητικού πεδίου για την επιτάχυνση της αποδέσμευσης από συστήματα στα οποία έχουν εγκλεισθεί μαγνητικά σωματίδια (Hsieh και Langer, 1983), η εφαρμογή ασθενούς ηλεκτρικού 22

23 πεδίου (ιοντοφόρηση) σε διαδερμικά συστήματα με σκοπό την διευκόλυνση διόδου των φαρμάκων μέσω του δέρματος (Bertolucci, 1982) και η ενυδάτωση υδρόφιλης πολυμερικής μήτρας που προκαλεί διόγκωση επιτρέποντας την αποδέσμευση του φαρμάκου με ρυθμό χρήσιμο θεραπευτικά (Peppas, 1987 ). Στους χημικούς τρόπους ενεργοποίησης της αποδέσμευσης περιλαμβάνονται η υδρόλυση, η οποία προκαλεί την σταδιακή in vivo διάσπαση του φραγμού (μήτρας ή μεμβράνης) ο οποίος περιορίζει την αποδέσμευση του φαρμάκου (Heller,1984), καθώς επίσης και η ρh-εξαρτώμενη υδρόλυση, η οποία οδηγεί στην εκλεκτική διάλυση του φραγμού όταν βρίσκεται σε περιβάλλον με συγκεκριμένο ρη και η οποία βρίσκει ευρεία εφαρμογή στην παρασκευή εντεροδιαλυτών μορφών (Chien, 1983). 3. Συστήματα στα οποία η αποδέσμευση ελέγχεται από μηχανισμό ανάδρασης (feed back regulated systems) (Εικ.3,Γ ) Η αποδέσμευση της δραστικής ουσίας από τα συστήματα αυτά επάγεται από την ενεργοποίηση ενός βιοχημικού παράγοντα in vivo. Ο ρυθμός αποδέσμευσης εξαρτάται από την συγκέντρωση του βιοχημικού παράγοντα μέσω μηχανισμού ανάδρασης. Η πιο εξελιγμένη μορφή τέτοιων συστημάτων ελεγχόμενης είναι τα συστήματα αυτορρυθμιζόμενης αποδέσμευσης (self-regulated systems), τα οποία βρίσκονται ακόμη σε πειραματικό στάδιο. Σε ένα τέτοιο σύστημα (Jeong και συνεργάτες, 1984) σύμπλοκα γλυκοσυλιωμένης ινσουλίνης με κονκαναβαλλίνη Α (glycosylated insulin concanavalin A complex), περιβάλλονται από ημιπερατή πολυμερική μεμβράνη. Η γλυκόζη του αίματος εισέρχεται στο σύστημα μέσω της ημιπερατής μεμβράνης και εκτοπίζει την γλυκοσυλιωμένη ινσουλίνη από το σύμπλοκο με την κονκαναβαλλίνη Α, ενεργοποιώντας την αποδέσμευση της γλυκοσυλιωμένης ινσουλίνης από το σύστημα. Η απελευθέρωση της ινσουλίνης προκαλεί πτώση και επαναφορά των επιπέδων της γλυκόζης στο αίμα σε φυσιολογικά επίπεδα. Η πτώση των επιπέδων της γλυκόζης προκαλεί με τη σειρά της ελάττωση της ποσότητας ινσουλίνης που αποδεσμεύεται από το σύστημα (Εικ.4) 23

24 4. Συστήματα στόχευσης (drug targeting systems) (Εικ. 3, Δ) Τα συστήματα αυτά επιχειρούν την εκλεκτική αποστολή της δραστικής ουσίας στην θέση δράση αυτής. Η εκλεκτική αποστολή στα κύτταρα στόχο έχει ως αποτέλεσμα την βελτίωση του θεραπευτικού δείκτη του φαρμάκου και είναι ιδιαίτερα σημαντική σε ισχυρά φάρμακα με αυξημένη τοξικότητα, όπως είναι τα αντικαρκινικά φάρμακα. Το ιδανικό σύστημα στόχευσης κατά τον Ringsdorf (1978) περιλαμβάνει τα εξής: μία μη-ανοσογονική βιοδιασπώμενη πολυμερική αλυσίδα στην οποία έχει προσδεθεί μια κατευθυντήρια ομάδα (targeting moiety), η οποία θα οδηγήσει το σύστημα στον στόχο και ένας διαλυτοποιητής (solubiliser) αν χρειάζεται, για την διάλυση του συστήματος στα βιολογικά υγρά (π.χ. αίμα). Τα μόρια του φαρμάκου συνδέονται στο σύστημα μέσω ενός βραχίονα (spacer) ο οποίος φέρει χημικούς δεσμούς που μπορούν να διασπασθούν μόνο από ένζυμα που βρίσκονται στην περιοχή του κυττάρου στόχου, ελευθερώνοντας το φάρμακο (Εικ.5). Το παραπάνω σύστημα παραμένει εν πολλοίς ακόμη θεωρητική σύλληψη. Παρ όλα αυτά τα τελευταία χρόνια έχει επιτευχθεί σημαντική πρόοδος στο σχεδιασμό συστημάτων στόχευσης, η οποία βασίζεται στην καλύτερη κατανόηση του βιολογικού συστήματος αλλά και στην τεράστια ανάπτυξη που έχει συντελεσθεί στους τομείς της μοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας, με αποτέλεσμα αρκετά τέτοια συστήματα να βρίσκονται σήμερα στο στάδιο των κλινικών δοκιμών. Για την ανάπτυξη αυτών των συστημάτων γίνεται εκμετάλλευση τόσο των φυσιολογικών όσο και των παθοφυσιολογικών ιδιαιτεροτήτων του στόχου (κυρίως σε κυτταρικό επίπεδο). Η εκλεκτική συσσώρευση του συστήματος στον στόχο συμβαίνει παθητικά (passive targeting ) ή ενεργητικά (active targeting). Δραστικές ουσίες μικρού μοριακού βάρους, όπως είναι τα αντικαρκινικά φάρμακα, μπορούν να διαπεράσουν εύκολα τις κυτταρικές μεμβράνες των περισσοτέρων ιστών, οπότε το φάρμακο κατανέμεται ταχέως σε όλο το σώμα και όχι εκλεκτικά στον πάσχοντα ιστό. Εάν λοιπόν το φάρμακο προσδεθεί με κάποιο τρόπο σε μεγαλομοριακή ουσία όπως για παράδειγμα ένα βιοσυμβατό πολυμερές και οι δεσμοί αυτοί είναι αρκετά σταθεροί ώστε να επιτρέπουν την παρατεταμένη κυκλοφορία του φαρμάκου στο αίμα, η είσοδος του συμπλέγματος στα κύτταρα λόγω του μεγάλου μοριακού βάρους μπορεί να γίνει μόνο με ενδοκύττωση. Οι καρκινικοί όγκοι εμφανίζουν περισσότερο διαπερατά τριχοειδή αγγεία σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς οπότε το σύμπλεγμα 24

25 φορέα φαρμάκου, το οποίο εμφανίζει ιδιότητες μακράς παραμονής στην γενική κυκλοφορία, μπορεί να εξέλθει από τα αγγεία μόνο στην περιοχή του όγκου και συσσωρεύεται σε αυτούς. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η παθητική στόχευση. Η ενεργητική στόχευση μπορεί να γίνει με τη σύνδεση του συμπλέγματος φορέα-φαρμάκου με ένα μόριο που ονομάζεται κατευθυντήρια ομάδα (targeting moiety) και αναγνωρίζεται από συγκεκριμένους υποδοχείς των κυττάρων στόχων. Η ομάδα αυτή μπορεί να είναι κάποιο αντίσωμα, υδατάνθρακας, πεπτίδιο ή ολιγονουκλεοτίδιο. Την μεγαλύτερη δυσκολία αυτής της προσέγγισης για την χορήγηση φαρμάκων αποτελεί η εύρεση μη ανοσογονικών και εξαιρετικά εξειδικευμένων κατευθυντήριων ομάδων. Παρ όλα αυτά τα τελευταία χρόνια έχει επιτευχθεί κάποια πρόοδος. Έτσι, έχει επιτευχθεί η ικανοποιητική στόχευση του ηπατικού παρεγχύματος από το σύμπλεγμα συμπολυμερούς HPMA και φαρμάκου προσδένοντας σ αυτό γαλακτόζη η οποία αναγνωρίζεται από τον υποδοχέα της ασιαλογλυκοπρωτεϊνης που βρίσκεται στα ηπατοκύτταρα (Dunkan και συνεργάτες 1996). Επίσης, η πρόσδεση του fab τμήματος μονοκλωνικού αντισώματος έναντι του HER2/new σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα στα οποία είχε εγκλωβιστεί η αντικαρκινική ουσία δοξορουμπικίνη (doxorubicin), οδήγησε σε αποτελεσματικότερη παρεμπόδιση της in vivo ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων μαστού που υπερεκφράζουν την HER2/new σε σύγκριση με τα λιποσώματα που δεν φέρουν το αντίσωμα (Park και συνεργάτες, 1996, Kiprotin και συνεργάτες, 1997). 25

26 Εικόνα 3. Κατηγορίες συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης βιοδραστικών ουσιών Εικόνα 4. Αυτορρυθμιζόμενο σύστημα χορήγησης ινσουλίνης 26

27 Εικόνα 5. Ιδανικό σύστημα ελεγχόμενης αποδέσμευσης και στόχευσης φαρμακευτικών ουσιών, σύμφωνα με τον Ringsdorf (1978) 27

28 1.2 ΒΙΟΔΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΠΟΛΥΜΕΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Η εφαρμογή βιοδιασπώμενων συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης βιοδραστικών ουσιών, καθιστά περιττή την χειρουργική επέμβαση για την απομάκρυνση των κενών φορέων μετά την αποδέσμευση του φαρμάκου. Επιπλέον, στην περίπτωση που οι ιδιότητες του συστήματος επιτρέπουν τον έλεγχο του ρυθμού βιοδιάσπασης, είναι δυνατός ο έλεγχος (επιλογή) της κινητικής της αποδέσμευσης του φαρμάκου με κατάλληλη ρύθμιση του ρυθμού βιοδιάσπασης. Για την παρασκευή βιοδιασπώμενων συστημάτων χορήγησης φαρμάκων χρησιμοποιούνται πολυμερικά υλικά τα οποία υφίστανται την αποικοδομητική δράση του βιολογικού μέσου η οποία οδηγεί στην μεταβολή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του συστήματος ή και στην πλήρη μετατροπή του σε διαλυτά προϊόντα που απομακρύνονται από την θέση εφαρμογής του συστήματος. Για την περιγραφή της in vivo αποικοδόμησης των βιοδιασπώμενων φορέων χρησιμοποιούνται τρεις κυρίως όροι: βιοδιάσπαση (biodegradation), βιοδιάβρωση (bioerosion) και βιοαπορρόφηση (bioabsorption). Ο τελευταίος όρος χρησιμοποιείται κυρίως στην ιατρική για να περιγράψει την απορρόφηση εμφυτευμάτων από το σώμα. Ένα τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η εξαφάνιση από την περιοχή εφαρμογής τους των βιοαπορροφούμενων ιατρικών ραμμάτων όταν εισαχθούν στο ανθρώπινο σώμα. Οι όροι βιοδιάσπαση και βιοδιάβρωση χρησιμοποιήθηκαν από τους Graham και Wood (1982) και από τον Heler (1985) για την περιγραφή πολυμερών που υφίστανται διάσπαση in vivo και εξαφανίζονται εντελώς από το σημείο εμφύτευσής τους. O όρος βιοδιάσπαση όμως χρησιμοποιήθηκε κυρίως για την περιγραφή φαινομένων υδρολυτικής, ενζυμικής ή βακτηριακής διάσπασης του πολυμερούς in vivo η οποία δεν καταλήγει απαραίτητα σε μεταβολή της φυσικής του κατάστασης (Holland και συνεργάτες, 1986). Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν τον όρο βιοδιάβρωση για τις περιπτώσεις καταστροφής του πολυμερούς μετά από in vivo φυσικές ή χημικές διαδικασίες πολλές φορές μη πλήρως διευκρινισμένες. Σύμφωνα με άλλους ερευνητές ο όρος βιοδιάσπαση (biodegradation) πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο όταν στη διάσπαση του πολυμερούς συμμετέχει ενεργά και το βιολογικό σύστημα, όπως για 28

29 παράδειγμα στην περίπτωση της συμμετοχής ενζύμων του οργανισμού στην διάσπαση του πολυμερούς. Στις άλλες περιπτώσεις θα πρέπει να χρησιμοποιείται απλά ο όρος διάσπαση (degradation) (Williams,1982) Μηχανισμοί διάσπασης πολυμερών in vivo Οι τρεις βασικοί μηχανισμοί διάσπασης των πολυμερών φαίνονται στην Εικ.6 (I, II και III). Στην περίπτωση των πολυμερών που φέρουν σταυρωτούς ομοιοπολικούς δεσμούς (cross links) η διάσπαση προς διαλυτές πολυμερικές αλυσίδες επέρχεται μετά από υδρόλυση των ασταθών δεσμών οι οποίοι μπορούν να είναι (τύπος IA) ή να μην είναι (τύπος IB) οι σταυρωτοί δεσμοί. Στην περίπτωση που τα πολυμερή φέρουν ομάδες που μπορούν να υδρολυθούν, ιονιστούν ή πρωτονιωθούν in vivo, η μετατροπή των αρχικά αδιάλυτων πολυμερικών αλυσίδων σε διαλυτές μπορεί να βασίζεται στις μεταβολές αυτές (τύπος II). Ο τρίτος μηχανισμός βιοδιάσπασης περιλαμβάνει την υδρόλυση ευαίσθητων δεσμών των πολυμερικών αλυσίδων οδηγώντας σταδιακά στην αποικοδόμηση του πολυμερούς σε διαλυτά προϊόντα μικρού μοριακού βάρους (τύπος III, Εικ. 6). Οι τύποι διάσπασης I και II αφορούν πολυμερή αρχικώς αδιάλυτα στα βιολογικά υγρά (π.χ. υγρά γαστρεντερικού σωλήνα, αίμα) ενώ ο τύπος III αφορά τόσο τα πολυμερή που διαλύονται από τα βιολογικά υγρά όσο και αυτά που δεν διαλύονται και παραμένουν στην στερεή κατάσταση μέχρι τη διάσπασή τους προς διαλυτά στα βιολογικά υγρά προϊόντα. Στην πράξη, η βιοδιάσπαση ενός πολυμερούς μπορεί να είναι περισσότερο πολύπλοκη περιλαμβάνοντας συνδυασμό των παραπάνω μηχανισμών. 29

30 Eικόνα 6. Μηχανισμοί διάσπασης πολυμερών in vivo Αποδέσμευση του φαρμάκου από βιοδιασπώμενα συστήματα χορήγησης. Η αποδέσμευση της δραστικής ουσίας από τα βιοδιασπώμενα συστήματα χορήγησης επιτυγχάνεται με έκλουση της ουσίας από το υγρό διάλυσης μετά την διάσπαση του πολυμερούς, με διάχυση της ουσίας διαμέσου του πολυμερούς ή με συνδυασμό των δύο παραπάνω μηχανισμών. Ο αργός ρυθμός αποδέσμευσης εξαρτάται κυρίως από τη διάχυση της ουσίας στην πολυμερική μήτρα. Στην περίπτωση που ο ρυθμός διάσπασης του πολυμερούς είναι αργός, τότε η κινητική της αποδέσμευσης περιγράφεται από το πρότυπο Higuchi (1963): M t /M = Kt 1/2 Εξίσωση 1 όπου M t /M είναι το ποσοστό του φαρμάκου που αποδεσμεύεται σε χρόνο t και K η σταθερά που εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του πολυμερούς και του φαρμάκου καθώς και από την κατασκευή του συστήματος. Στην αντίθετη περίπτωση κατά την οποία η διάσπαση του πολυμερούς εξελίσσεται με μεγαλύτερο ρυθμό από τη διάχυση της ουσίας, τότε η κινητική αποδέσμευσης καθορίζεται από τη διάσπαση του πολυμερούς. 30

31 Η διάσπαση του πολυμερούς μπορεί να συμβαίνει σε όλη τη μάζα του (ομοιογενής διάσπαση ), διαδικασία που οδηγεί στην κατάρρευση της δομής του πολυμερούς. Στην περίπτωση που το πολυμερές είναι υδρόφοβο αλλά υδρολύεται προς υδρόφιλα προϊόντα η διάσπαση περιορίζεται στη επιφάνεια του συστήματος (ετερογενής διάσπαση). Πολυμερή που υφίστανται ομοιογενή διάσπαση αποτελούν πολύπλοκα συστήματα όσον αφορά την κατανόησή τους. Πράγματι, η διάσπαση προκαλεί μεταβολή της κατάστασης του πολυμερούς με τον χρόνο η οποία δεν μπορεί να περιγραφεί εύκολα και ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου από τέτοια συστήματα δεν είναι ούτε σταθερός ούτε προβλέψιμος. Σε συστήματα στα οποία το πολυμερές υφίσταται ετερογενή διάσπαση μπορεί να επιτευχθεί κινητική μηδενικής τάξεως (σταθερός ρυθμός αποδέσμευσης) εάν η αποδέσμευση του φαρμάκου λόγω διάχυσης είναι ελάχιστη και η επιφάνεια του συστήματος που εκτίθεται στο περιβάλλον υγρό παραμένει σταθερή όσο χρόνο διαρκεί η αποδέσμευση. Στην περίπτωση ετερογενούς διάσπασης ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου μπορεί να περιγραφεί από την παρακάτω εξίσωση (Hophenberg, 1976): M t /M =1- [1- (K o t/c o a) n ] Εξίσωση 2 όπου ο λόγος M t /M αποτελεί το ποσοστό του φαρμάκου που ελευθερώνεται σε χρόνο t, K o είναι η σταθερά ρυθμού διάσπασης του πολυμερούς και C α ο είναι το αρχικό ποσό του φαρμάκου στο σύστημα. Τα n και α είναι σταθερές που εξαρτώνται από τη γεωμετρία του συστήματος. Για παράδειγμα στην περίπτωση πλακιδίου, n=1 και το α ισούται με το μισό πάχος του πλακιδίου, για τον κύλινδρο n=2 και το α ισούται με την ακτίνα του, ενώ για σφαίρα n=3 και το α ισούται πάλι με την ακτίνα του. Σύμφωνα και με την παραπάνω εξίσωση, σταθερό ρυθμό αποδέσμευσης έχουμε μόνο στην περίπτωση που το σύστημα έχει τη μορφή πλακιδίου, ενώ για τα άλλα συστήματα ο ρυθμός αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας μειώνεται με το χρόνο. Τα πλέον μελετημένα πολυμερή που υφίστανται διάσπαση τύπου IA είναι τα συμπολυμερή βινυλ-πυρολιδόνης ή ακρυλαμιδίου με N,N -μεθυλενοδισακρυλαμιδίο, όμως ο ρυθμός διάσπασής τους είναι εξαιρετικά αργός. Τα συμπολυμερή ακρυλαμιδίου με Ν,Ν - μεθυλενοδισακρυλαμιδίο έχουν μελετηθεί για την χορήγηση της προσταγλαδίνης F 2 α και αιθυνυλοοιστραδιόλης σε μύες με τη μορφή υποδερμικών εμφυτευμάτων 31

32 (Davis και Chang, 1972, Davis και συνεργάτες, 1972). Τα αποτελέσματα ήταν αυτά που περιμένουμε για την αποδέσμευση δραστικών ουσιών μικρού μοριακού βάρους από υλικό το οποίο διογκώνεται με το νερό αλλά ουσιαστικά δεν συμβαίνει σημαντική διάβρωσή του κατά τη διάρκεια χρήσης του συστήματος. Επομένως η προσταγλαδίνη F 2 α, που είναι ελάχιστα διαλυτή στο νερό, απελευθερώνεται μέσα σε 24h, ενώ η αιθυνυλοοιστραδιόλη που είναι λιγότερο διαλυτή στο νερό αποδεσμεύεται με αργότερο ρυθμό, και στις δύο περιπτώσεις όμως ακολουθείται κινητική αποδέσμευσης πρώτης τάξεως. Ένα παράδειγμα συστήματος που διασπάται με τύπου IB διάσπαση είναι μοκροσωματίδια παρασκευασμένα από δεξτράνη που έχει αλληλεπιδράσει με ακρυλικό οξύ, γλυκιδικό εστέρα και Ν,Ν - μεθυλενοδισακρυλαμίδιο (Edman P., και συνεργάτες,1980). Τα τεμαχίδια αυτά ήταν σταθερά σε ph από 2 μέχρι 7 και ο ρυθμός υδρόλυσής τους αυξανόταν με αύξηση του ph. Μακρομόρια όπως καρβονική ανυδράση, ανθρώπινη αλβουμίνη ορού, ανοσοσφαιρίνη και καταλάση ενσωματώθηκαν στα σωματίδια χωρίς να παρατηρηθεί απώλεια της δραστικότητάς τους. Η αποδέσμευση αυτών των ουσιών βρέθηκε να καθορίζεται από τη διάχυση. Έχουν αναπτυχθεί δύο τάξεις συστημάτων που χρησιμοποιούν διάσπαση τύπου II ή συνδυασμό διάσπασης τύπου II και III για την ελεγχόμενη αποδέσμευση δραστικών ουσιών. Στη μία τάξη η ουσία διασπείρεται μέσα στην πολυμερική μήτρα και ελευθερώνεται όταν λαμβάνει χώρα η διαλυτοποίησή της. Σε αυτή περιλαμβάνονται συστήματα που φέρουν εντερική επικάλυψη. Αυτά τα συστήματα σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να είναι αδιάλυτα σε κάποιο συγκεκριμένο ph, συνήθως του στομάχου, αλλά διαλύονται με την αλλαγή του ph, για παράδειγμα στον εντερικό αυλό. Συνήθως τα πολυμερή αυτά χρησιμεύουν ως προστατευτικά των δισκίων και όχι για την ελεγχόμενη αποδέσμευση ουσιών. Όμως είναι δυνατόν με τη χρήση διαφόρων μιγμάτων και επικαλύψεων, τα οποία έχουν διαφορετικό ρυθμό διάσπασης, να επιτευχθεί παρατεταμένη αποδέσμευση των δραστικών ουσιών (Robinson, 1976). Η διάλυση αυτών των πολυμερών μπορεί να γίνει με τρεις κυρίως τρόπους: (α) διάλυση με υδρόλυση πλευρικών αλυσίδων π.χ. συμπολυμερή αλκυλβινυλ-εστέρων με ανυδρίτη του μηλεϊνικού οξέος, (β) διάλυση με ιονισμό καρβοξυλικών ομάδων, π.χ. στην περίπτωση της οξικής φθαλικής κυτταρίνης, (γ) διάλυση με πρωτονίωση αμινομάδων, π.χ. Ν,Ν διαιθυλαμινοοξική κυτταρίνη (cellulose acetate N,N diethylaminoacetate). 32

33 Στη δεύτερη τάξη η δραστική ουσία συνδέεται ομοιοπολικά με την πολυμερική αλυσίδα και η ουσία αποδεσμεύεται στο περιβάλλον όταν ο δεσμός αυτός διασπαστεί. Υπάρχουν και σε αυτή την κατηγορία δύο πολυμερικά συστήματα, στο ένα η δραστική ουσία είναι υδατοδιαλυτή και το πολυμερές παίζει το ρόλο φορέα και στο άλλο η δραστική ουσία είναι αδιάλυτη και το πολυμερές δρα ως δεξαμενή από την οποία αποδεσμεύεται σταδιακά. Τέλος ο τύπος διάσπασης III περιλαμβάνει πολυμερή στα οποία η πολυμερική τους αλυσίδα μπορεί να διασπαστεί υδρολυτικά. Το πολυ(γαλακτικό) οξύ ήταν ένα από τα πρώτα πολυμερή που χρησιμοποιήθηκαν με τη μορφή βιοδιασπώμενων εμφυτευμάτων, και σήμερα πολυμερή βασισμένα στο γαλακτικό, γλυκολικό οξύ και τα συμπολυμερή τους χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην ανάπτυξη φαρμακευτικών συστημάτων. 1.3 ΒΙΟΔΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΗ ΓΑΛΑΚΤΙΚΟΥ- ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ Πολυ(γαλακτικό γλυκολικό) οξύ Το γλυκολικό και το γαλακτικό οξύ είναι τα κοινά ονόματα των δύο πρώτων α- υδροξυκαρβοξυλικών οξέων, δηλαδή του α-υδροξυοξικού και του α-υδροξυπροπιονικού οξέος αντίστοιχα. OH CH 2 COOH OH CH COOH CH 3 ΓΛΥΚΟΛΙΚΟ ΟΞΥ ΓΑΛΑΚΤΙΚΟ ΟΞΥ Το γαλακτικό οξύ περιέχει ένα ασύμμετρο άτομο άνθρακα και επομένως έχει δύο οπτικά ισομερή : COOH HO - C - H COOH H C - OH CH 3 CH 3 L (+) D (-) 33

34 Κυκλικά διμερή του γαλακτικού και γλυκολικού οξέος συντίθενται με αφυδάτωση των μονομερών και ονομάζονται γαλακτίδιο (lactide, LE) και γλυκολίδιο (glycolide, GE). Η κυκλοποίηση γίνεται στην αέρια φάση (Wise και συνεργάτες,1979). Τα κυκλικά διμερή είναι λευκά υγροσκοπικά υλικά τα οποία υδρολύονται παρουσία υγρασίας. Το γαλακτίδιο περιέχει ασύμμετρο άτομο άνθρακα και διαθέτει τέσσερις διαστερεοϊσομερείς μορφές, τις L και D που είναι οπτικοί αντίποδες (L (-) και D (+) γαλακτίδιο αντίστοιχα), τη μεσομορφή DL και το ρακεμικό μίγμα των L (-) και D (+). Το σημείο τήξεως του ρακεμικού μίγματος είναι υψηλότερο από αυτό των συστατικών του (Chabot και συνεργάτες, 1983). Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά διαστερεοϊσομερών γαλακτιδίου Ισομερή L-Γαλακτίδιο D-Γαλακτίδιο DL-Γαλακτίδιο Μέσο-Γαλακτίδιο Σημείο τήξης( o C) Το γλυκολίδιο (με σημείο τήξης 82 ο C) υπάρχει σε δύο ισομερείς κρυσταλλικές μορφές α και β. Ο α κρύσταλλος είναι θερμοδυναμικά σταθερότερος εάν η κρυσταλοποίηση γίνει πάνω από τους 42 ο C, ενώ η β-μορφή ευνοείται όταν η κρυσταλοποίηση γίνει κάτω από αυτή τη θερμοκρασία. Η α μορφή επειδή είναι και η θερμοδυναμικά σταθερότερη οπότε και προτιμάται για τη σύνθεση πολυμερών υψηλού μοριακού βάρους, όμως σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μετατρέπεται αργά στο β- ισομερές (Frazza και Schmitt, 1971) Σύνθεση συμπολυμερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA). Χαμηλού μοριακού βάρους πολυ(γαλακτικό) οξύ, πολυ(γλυκολικό) οξύ και πολυ(γαλακτικό γλυκολικό) οξύ μπορούν να παρασκευαστούν με απευθείας εστεροποίηση του γαλακτικού οξέος, του γλυκολικού οξέος ή μίγματος αυτών αντίστοιχα (Filachione E.M. και Fischer C.H., 1944). 34

35 H O O CH 3 H - ( O - C - CH- O- C - CH ) x - ( O C CH O C CH ) y OH O H CH 3 Εικόνα 7. Χημικός τύπος του συμολυμερούς γαλακτικού- γλυκολικού οξέος (PLGA) Αντίθετα για τη σύνθεση πολυμερών μεγάλου μοριακού βάρους τα μονομερή που πρέπει να χρησιμοποιηθούν είναι οι κυκλικοί διεστέρες του γαλακτικού και του γλυκολικού οξέος, δηλαδή το γαλακτίδιο (lactide) και γλυκολίδιο (glycolide) αντίστοιχα. Η αντίδραση πολυμερισμού μπορεί να λάβει χώρα με την παρουσία μονομερών είτε σε τήγμα (melt polymerization), είτε σε διάλυμα (solution polymerization). Ο πολυμερισμός σε διάλυμα γίνεται με τη διάλυση των μονομερών σε κατάλληλο οργανικό διαλύτη, όπως χλωροφόρμιο, τολουόλιο ή διοξάνιο, όμως για την παρασκευή πολυμερών μεγάλου μοριακού βάρους απαιτούνται μεγάλοι χρόνοι πολυμερισμού και γι αυτό δεν προτιμάται. Ο πολυμερισμός τήγματος των μονομερών γίνεται υπό κενό ή σε ατμόσφαιρα αζώτου σε υψηλή θερμοκρασία που κυμαίνεται από 130 έως 220 ο C. Το μεγάλο μοριακό βάρος των προϊόντων της αντίδρασης εξασφαλίζεται από την υψηλή καθαρότητα, την χαμηλή οξύτητα των μονομερών και την απουσία υγρασίας υγρασίας στο περιβάλλον που λαμβάνει χώρα η αντίδραση (Lowe, 1954). Η απόδοση της αντίδρασης αλλά και το μοριακό βάρος των προϊόντων της αντίδρασης επηρεάζονται τόσο από τη συγκέντρωση όσο και από το είδος του καταλύτη, καθώς και το χρόνο και τη θερμοκρασία πολυμερισμού (Avgoustakis και Nixon, 1991) Καταλύτες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν και να δώσουν συμπολυμερή μεγάλου μοριακού βάρους είναι τα οξέα κατά Lewis, όπως το χλωριούχο αργίλιο, ο διχλωριούχος ψευδάργυρος και το τριφθοριούχο αντιμόνιο, και οι οργανομεταλλικές ενώσεις, όπως ο 2 (2 αίθυλ- εξανοϊκός) κασσίτερος (Tsuruta και συνεργάτες, 1964, Gilding και Reede, 1979). Ο 2 (2-αιθυλ-εξανοϊκός) κασσίτερος, Sn(oct) 2 είναι ο συχνότερα χρησιμοποιούμενος καταλύτης αφ ενός διότι συμβάλλει στη λήψη προϊόντων υψηλού μοριακού βάρους με μεγάλη απόδοση και αφ ετέρου διότι η χρήση του σε φαρμακευτικά προϊόντα θεωρείται ασφαλής καθώς έχει επιτραπεί η χρήση του ως σταθεροποιητής τροφίμων από την Διοίκηση Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ. Παρουσία του 2-(2-αιθυλ-εξανοϊκού)κασσίτερου η αντίδραση πολυμερισμού φαίνεται να προχωράει σύμφωνα με το μηχανισμό που δίνεται στην εικόνα 8. 35