ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΝΖΥΜΩΝ Παραγωγή και ακινητοποίηση βιοκαταλυτών

Transcript

1 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΝΖΥΜΩΝ Παραγωγή και ακινητοποίηση βιοκαταλυτών

2 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΝΖΥΜΩΝ Τα ένζυµα είναι βιοκαταλύτες πρωτεϊνικής φύσης Καταλύουν χηµικές αντιδράσεις ελαττώνοντας την ενέργεια ενεργοποίησης τους µε αποτέλεσµα σηµαντική αύξηση της ταχύτητας της αντίδρασης Χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθµό εξειδίκευσης αναφορικά το υπόστρωµα στο οποίο δρουν και µε ορισµένες ιδιότητες τους Ένα ένζυµο καταλύει την αντίδραση µόνο µιας χηµικής ένωσης ή οµάδας στενά συγγενών χηµικών ενώσεων Έχουν µηδαµινές ενεργειακές απαιτήσεις Μπορούν να επαναχρησιµοποιηθούν Ειναι βιοαποικοδοµήσιµα και δεν ρυπαίνουν το περιβάλλον Ένα ένζυµο επιφέρει στο υπόστρωµα ορισµένη µετατροπή που χαρακτηρίζεται από αυστηρή στερεοεξειδίκευση

3

4

5

6 Προέλευση Ενζύµων Αρχικά, εκτός από ορισµένα ζωικής (ρεννίνη) και φυτικής (παπαϊνη, βροµελίνη) προέλευσης η µέγιστη πλειοψηφία των ενζύµων παράγεται από µικροοργανισµούς. Οι λόγοι είναι ότι : Η παραγωγή είναι οικονοµική λόγω γρήγορων ρυθµών ανάπτυξης των µικροοργανισµών υπό ελεγχόµενες συνθήκες (βιοαντιδραστήρες) σε φθηνά θρεπτικά υποστρώµατα Με γενετικούς χειρισµούς οι αποδόσεις µπορούν να αυξηθούν από µερικές εκατοντάδες µέχρι µερικές χιλιάδες φορές Στελέχη µε επιθυµητές ιδιότητες µπορούν να επιλεγούν από µεγάλο πλήθος µικροοργανισµών µε σχετικά µεγάλη ευκολία Τα µικροβιακά ένζυµα είναι εσωκυτταρικά και εξωκυτταρικά όταν βρίσκονται µέσα ή έξω από το κύτταρο, αντίστοιχα Τα εξωκυτταρικά πλεονεκτούν των εσωκυτταρικών ενζύµων γιατί έχουν µεγαλύτερες αποδόσεις, αποµονώνονται ευκολότερα σε καθαρή µορφή, είναι πιο σταθερά και γενικά η παραγωγή τους είναι οικονοµικότερη

7

8 Κύριοι παραγωγοί βιοµηχανικών ενζύµων

9 Κορυφαίοι παραγωγοί ενζύµων και αριθµός πατέντων σε ένζυµα Κύρια βιοµηχανικά ένζυµα και αριθµός τους σε βάσεις δεδοµένων πατέντων

10 Νοµικό καθεστώς χρήσης των Ενζύµων Η χρησιµοποίηση ενζύµων στη βιοµηχανία τροφίµων και ποτών ελέγχεται από εθνικούς και διεθνείς νόµους καταλληλότητας Η εισαγωγή ενός νέου ενζύµου ή ενός ενζύµου που παράγεται από µη αποδεκτό (µη αβλαβή) οργανισµό προϋποθέτει µακροχρόνιες και δαπανηρές δοκιµές τοξικότητας, καρκινογένεσης, κλπ. Μεταξύ των αβλαβών µικροοργανισµών παραγωγής ενζύµων της βιοµηχανίας τροφίµων και ποτών θεωρούνται: ΒΑΚΤΗΡΙΑ: Bacillus subtilis (B. mesentericus, B. natto, B. amyloliquefaciens), Lactobacillus sp., Leuconostoc oemos ΖΥΜΕΣ: Kluyveromyces fragilis, K. lactis, Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis ΜΥΚΗΤΕΣ: Aspergillus niger (A. awamori, A. foetidus, A. phoenicis, A. saitoi, A. usumii), A. oryzae (A. sojae, A. effusus) Mucor japonicus, Rhizopus arrhizus, R. oligosporus, R. oryzae

11 Μέθοδοι παραγωγής ενζύµων Όλα τα µικροβιακά ένζυµα παράγονται µε ζύµωση. Η διεργασία αυτή επηρεάζεται από ορισµένους παράγοντες οι σπουδαιότεροι από τους οποίους είναι: 1. Μικροοργανισµός Είναι ίσως ο σπουδαιότερος παράγων. Το στέλεχος που θα επιλεγεί πρέπει : Να έχει τη µεγαλύτερη δυνατή απόδοση στο µικρότερο χρόνο Να µην παράγει τοξικές και άλλες ανεπιθύµητες ουσίες (χρωστικές, βλεννώδη προϊόντα, κ.α.) Να χρησιµοποιεί φθηνές οργανικές και ανόργανες πηγές θρεπτικών στοιχείων 2. Θρεπτικά στοιχεία Αποτελούνται από συνθετικές και φυσικές ουσίες που περιέχουν πηγές C, N, ενέργειας, απαραίτητα µεταλλικά στοιχεία και παράγοντες ανάπτυξης για τα αυξότροφα µικροβιακά στελέχη Οι φυσικές πηγές C περιλαµβάνουν µελάσα, υποπροϊόντα της βιοµηχανίας δηµητριακών και τροφίµων, άµυλο πατάτας, κ.ά. Οι φυσικές πηγές N περιλαµβάνουν καζεϊνη, πεπτόνη, ζελατίνη εκχύλισµα ζύµης, υγρά επεξεργασίας αραβόσιτου και φυτικά έλαια

12 Για την παραγωγή ενζύµων που επάγονται, τα θρεπτικά µέσα πρέπει να περιέχουν επαγωγείς και να είναι απαλλαγµένα από καταστολείς Τυπικά παραδείγµατα επαγωγέων είναι το άµυλο για την αµυλάση, η ουρία για την ουρεάση, η ξυλόζη για την ισοµεράση της ξυλόζης Συνένζυµα είναι δυνατόν να ενεργούν ως επαγωγείς. Π.χ. η θειαµίνη αυξάνει την παραγωγή πυροσταφυλικής καρβοξυλάσης 3. Ζύµωση Χρησιµοποιούνται δύο βασικές µέθοδοι ζυµώσεων για την παραγωγή µικροβιακών ενζύµων υπό συνθήκες διαλείποντος έργου. Αυτές είναι : α. Επιφανειακή ζύµωση ή Ζύµωση Στερεάς Κατάστασης Ο µικροοργανισµός (µύκητας) αναπτύσσεται στην επιφάνεια θρεπτικού υλικού χαµηλής υγρασίας. Η ζύµωση αυτή πλεονεκτεί της βυθισµένης ζύµωσης επειδή : Είναι απλούστερη Χρησιµοποιεί λιγότερα εξαρτήµατα Καταλαµβάνει µικρότερο όγκο και χώρο Χρησιµοποιεί λιγότερα υγρά Παράγει πυκνότερα ενζυµικά διαλύµατα Έχει χαµηλότερο κόστος λειτουργίας Μειονέκτηµα: Δυσκολία στον έλεγχό µεταφοράς µάζας-θερµότητας

13 Ζύµωση Στερεάς Κατάστασης Μέσο: Πίτυρο σίτου, υψηλή περιεκτικότητα σε θρεπτικά συστατικά περιλαµβάνοντας µέταλλα και άλατα. Εφαρµογές: παραγωγή αµυλασών, πρωτεασών, και λιπασών από τα είδη Aspergillus και Mucor, όπως και πηκτινασών και κυτταρινασών από τα είδη των Aspergillus και Penicillium. Διεργασία µε δίσκους: το υπόστρωµα είναι απλωµένο σε µια λεπτή στοιβάδα στα ζυµωτικά διαµερίσµατα του βιοαντιδραστήρα Διεργασία µε τύµπανα: Οριζόντια περιστρεφόµενα τύµπανα Μετά το πέρας της καλλιέργειας µε µυκητιακά σπόρια, τα µικκύλια εκχυλίζονται µε νερό ή διάλυµα αλάτων σε αντίστροφη λειτουργία, και το συγκεντρωµένο ενζυµικό διάλυµα στο τέλος καταβυθίζεται. Μειονεκτήµατα: Κόστος διαχείρισης, έλεγχος µολύνσεων, θερµοκρασίας, υγρασίας και αερισµού.

14 Η παραγωγή ενζύµων γίνεται από µικροοργανισµούς που αναπτύσσονται στην επιφάνεια δίσκων σε λεπτά στρώµατα (1-10 cm) ή σε οριζόντια περιστρεφόµενα τύµπανα Δίσκοι Θρεπτικό υλικό Βιοαντιδραστήρας τυµπάνου Αέρας Θρεπτικό υλικό Αέρας Κινητήρας Νερό

15 Η παραγωγή ενζύµων γίνεται από µικροοργανισµούς που αναπτύσσονται στην επιφάνεια δίσκων σε λεπτά στρώµατα (1-10 cm) ή σε οριζόντια περιστρεφόµενα τύµπανα (AgSF = agar supported solid fermentation

16 Σπόρια του µύκητα χρησιµοποιούνται για εµβολιασµό Υγρός και αποστειρωµένος αέρας διαβιβάζεται συνεχώς στο χώρο ανάπτυξης του µύκητα ενώ η καλλιέργεια ψεκάζεται τακτικά µε αποστειρωµένο νερό στο οποίο έχουν προστεθεί ειδικά θρεπτικά στοιχεία και άλατα για διατήρηση του ph στα επιθυµητά επίπεδα Έλεγχοι υγρασίας, θερµοκρασίας, ph, µόλυνσης και ενεργότητας του ενζύµου γίνονται τακτικότατα και αποτελούν σπουδαίους χειρισµούς της ζύµωσης Εξωκυτταρικές αµυλάσες και πρωτεάσες παράγονται σε σηµαντικές αποδόσεις από το µύκητα A. oryzae µ' αυτή τη µέθοδο Η σύσταση του θρεπτικού υλικού αποτελείται από πίτυρο στο οποίο προστίθενται υδατάνθρακες και άλατα µετάλλων καθώς και ρυθµιστικά διαλύµατα για τη διατήρηση του ph σε σταθερά όρια κατά την ανάπτυξη του µικροοργανισµού Η αποστείρωση του θρεπτικού υλικού γίνεται στο εσωτερικό των τύµπανων ενώ εκείνη των δίσκων σε ειδικά αυτόκλειστα

17 β. Βυθισµένη ζύµωση Είναι η περισσότερο διαδεδοµένη µέθοδος γιατί είναι ευέλικτη και εύκολη. Ο µικροοργανισµός αναπτύσσεται σε υγρή καλλιέργεια (βυθισµένη) σε βιοαντιδραστήρες Gas Supply Sampling P Thermal mass flow controllers (AIR, O 2, N 2, CO 2 ) P P Spent broth Probes (DO, ph, T) Liquid removal dip tube Feed Medium Impeller (pitched blade) Base solution Process Controller [DO, ph, Temp, Substrate] Water jacket Ring sparger Η διαδικασία παραγωγής εσωκυτταρικών ενζύµων διαφέρει από εκείνη των εξωκυτταρικών ενζύµων

18 Μικρότερος κίνδυνος µόλυνσης και µειωµένο κόστος χειρισµού και υψηλότερες αποδόσεις Μηχανικά αναδευόµενοι αντιδραστήρες σε διαλείποντος ή ηµιδιαλείποντος έργου Χωρητικότητα: Lt για ώρες Εξοπλισµός και τεχνικές οι οποίες έχουν υιοθετηθεί από τις ζυµώσεις παραγωγής αντιβιοτικών Η συνεχής λειτουργία δεν προτιµάται λόγω του κινδύνου απενεργοποίησης των ενζύµων (επιτυχώς για την παραγωγή της ισοµεράσης της γλυκόζης) Ο σχηµατισµός ενζύµου και πολλών δευτερογενών µεταβολιτών υπόκειται συχνά σε καταστολή εξαιτίας των υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης. Πέραν των επιδράσεων του θρεπτικού µέσου και του µεγέθους και της ηλικίας του εµβολίου, πρέπει να λαµβάνονται υπόψη οι λειτουργικές παράµετροι όπως το ph, ο αερισµός και η ανάδευση για τη βελτιστοποίηση της παραγωγής ενζύµων. Η προσθήκη επιφανειοδραστικών µέσων µπορεί να οδηγήσει σε αυξηµένη έκκριση εξωκυτταρικών ενζύµων. Η µίξη αποτελεί τη σηµαντικότερη παράµετρο που επηρεάζει την κατανοµή θρεπτικών συστατικών και κυρίως του οξυγόνου. Οι αναδευτήρες Rushton αντικατέστησαν τις παραδοσιακές για τις ζυµώσεις που χρησιµοποιούν µικκύλια. Η βέλτιστη κλίµακα για τη διεργασία παραγωγής εξαρτάται από τις τεχνικές και τις ιδιαιτερότητες που αφορούν το στέλεχος, αλλά και από την ισορροπία µεταξύ οικονοµίας και αξιολόγησης κινδύνου.

19 Κλιµάκωση µεγέθους και έλεγχος διεργασίας Κλιµάκωση µεγέθους

20 Εργαστηριακής κλίμακας Βιοαντιδραστήρες

21 Βιομηχανικής κλίμακας Βιοαντιδραστήρες

22 Κύτταρα ωοθήκης Κινέζικου Hamster (CHO)? 1 Βιοµηχανία δισεκατ $ 2 Για την αντιµετώπιση σοβαρών ασθενειών (καρκίνος, αυτοάνοσα νοσήµατα) 1 Βιοµηχανική παραγωγή 3 : max όγκος εργασίας βιοαντιδραστήρα: 20,000L Επιθυµητός Τύποι µορίων(rdna) τρόπος: Fed-batch; µέχρι 20 ηµέρες Στόχος: αύξηση της απόδοσης παραγωγής ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών [mabs: <60pg/cell/day max: 100pg/cell/day 3 ] rdna 1. Kyriakopoulos & Kontoravdi (2013). Eur. J. Pharm. Sci., 48(3): Evaluate Pharma (2013). 3. De Jesus & Wurm (2011). Eur. J. Pharm. Biopharm, 78(2):

23 Βιοτεχνολογική διεργασία για την παραγωγή ενζύµων Επιλογή Επιλογή ενός κατάλληλου μικροοργανισμού για το επιθυμητό ένζυμο Τροποποίηση Πιθανή εφαρμογή της γενετικής μηχανικής για τη βελτίωση του μικροβιακού στελέχους Πιλοτικής κλίµακας παραγωγή (εργαστήριο) Για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης του μικροοργανισμού Πιλοτική µονάδα Ζυμωτήρας μικρής κλίμακας για τη διευκρίνιση των βέλτιστων συνθηκών 5 Ζυµωτήρας βιοµηχανικής κλίµακας

24 Αποδοτική σε κόστος ζύµωση Υψηλή απόδοση Μικρή διάρκεια ζύµωσης Επιλογή στελεχών Μύκητες (Aspergillus & Trichoderma) Εξωκυτταρικά ένζυµα Επιλογή στελέχους Χρησιµοποιεί φθηνά υποστρώµατα Ζύµες (Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces) Βακτήρια (E. coli, Bacillus) Ασφαλή και µη τοξικά GRAS Επαναληψι- µότητα Τα ένζυμα πωλούνται βάση της ενεργότητας τους

25 Προ-βιοαντιδραστήρας

26

27 Μεταβολική Μηχανική Η κατασκευή του παράγωγου στελέχους είναι µια επίπονη διεργασία που περιλαµβάνει: Κλασσική µεταλλαξιγένεση, επιλογή βελτιωµένης παραγωγής και στοχευµένο σβήσιµο µη επιθυµητών γονιδίων Βελτίωση στελέχους µέσω κλασσικής επιλογής Προσθήκη χηµικών παραγόντων και ακτινοβολίας UV για την επιταχυνόµενη βελτίωση παραγωγών στελεχών Απώλεια ρυθµιστικών λειτουργιών που έχει ως αποτέλεσµα τη βελτιωµένη παραγωγή ενζύµων Βελτίωση στελέχους µέσω επιπρόσθετων γονιδίων έκφρασης, απώλειας παρεµποδιστικών ρυθµιστικών παραγόντων και αύξηση θετικής ρύθµισης, αυξάνοντας το ρυθµό της πρωτεϊνοσύνθεσης και της παραγωγής mrna Χρήση εξελικτικής µεταλλαξιγένεσης (gene shuffling) Σήµερα, σχεδόν όλα τα παράγωγα στελέχη είναι γενετικώς τροποποιηµένα!!! Επιλογή μυκητιακού WT στελέχους που υπερπαράγει γλυκοαμυλάση Αφαίρεση της κύριας πρωτεάσης, εισαγωγή πλασμιδίου έκφρασης Μόνο 300 mg/l ενεργής χυμοσίνης Εκτεταμένη μεταλλαξιγένεση και επιλογή μέσω ρύθμισης του υποκινητού της γλυκοαμυλάσης υποβαλλόμενη σε CCR Μείωση carbon catabolite repression με επιλογή deoxyglucose μεταλλάγματος Απόδοση παραγωγής: 1g/l Χυµοσίνη µόσχου, παραγωγό στέλεχος A.niger var. awamori

28 Βελτιστοποίηση r e = ταχύτητα ενζυμικήςσύνθεσης σε units/lt.hr q e = ειδική ταχύτητα ενζυμικής σύνθεσης units/g.hr C x =συγκέντρωση βιομάζας σε g/lt μ= ειδικός ρυθμός ανάπτυξης K s =κορεσμός σε g/lt Βελτιστοποίηση σημαίνει εύρεση υψηλότερου ποσοστού σύνθεσης (q e σε units/g βιομάζας ανά h) για ένα δεδομένο ποσό βιομάζας. Επειδή η ενζυμική σύνθεση εξαρτάται από τον πρωταρχικό μεταβολισμό, οι συνθήκες που ευνοούν τη σύνθεση ενζύμων ευνοούν και την ανάπτυξη. Έτσι, πρέπει να προσδιορίσουμε τις συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη και τη σχέση μεταξύ ρυθμού ανάπτυξης και ρυθμού σύνθεσης ενζύμων. A)Παραγωγή συζευγμένη με την ανάπτυξη B) Κορεσμένη σύνθεση C) Κορεσμένη σύνθεση με περιορισμό σακχάρων D) Κατεσταλμένη σύνθεση 1) Εάν η qe είναι ισχυρή συνάρτηση του μ: συντήρηση υψηλού μ είναι σημαντική: Περιορισμός οξυγόνου και HT: χρήση μεθόδου συνεχούς καλλιέργειας 2) Αν το ένζυμο παράγεται ως δευτερογενής μεταβολίτης χρησιμοποιούμε αντιδραστήρα ανακύκλωσης, μείωση μ 3) Αν υπάρχει περίπλοκη διεργασία: Διεργασία ημιδιαλείποντος έργου για τον έλεγχο του ρυθμού ανάπτυξης

29 1) Εµβολιασµός προβιοαντιδραστήρα 2) Διεργασία διαλείποντος έργου για την ανάπτυξη βιοµάζας Ο τύπος των σακχάρων εξαρτάται από τη φύση του µύκητα. Η µαλτόζη και µαλτοδεξτρίνη προτιµάται για υπόστρωµα της παραγωγής Χυµοσίνης (υποκινητής γλυκοαµυλάσης) 6) Κατάντη διεργασία:το φιλτράρισµα βοηθά στο διαχωρισµό της βιοµάζας και των ενζύµων (υγρό) 7) Χρωµατογραφία EBA για θολά υγρά, διαφορετικά, spray drying ή υπερδιήθηση 4) Παραµονή για πολλές ώρες 8) Φορµουλάρισµα 9) Πακετάρισµα 3) Ηµιδιαλείποντος έργου διεργασία 5) Μετά από 1 εβδοµάδα, η ζύµωση σταµατά µε οξύ. Σε ph 2, η βιοµάζα απενεργοποιείται Παραγωγή Χυµοσίνης από τον A. niger var. awamori) ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΑ

30 Παραγωγή Χυµοσίνης από τον E.coli (Pfizer, 1990) Περιορισµός C ως στρατηγική για τη µείωση παραγωγής οξικού οξέος µε παράλληλη αύξηση της βιοµάζας και της συγκέντρωσης του προϊόντος. Ο E. coli παράγει οξικο όταν ο ρυθµός παροχής C είναι µεγαλύτερος από τη δυνατότητα παραγωγής βιοµάζας και CO 2 Εσωκυτταρική παραγωγή Αναδίπλωση πρωτεϊνικών συσσωµατωµάτων, µετατροπή σε ενεργή χυµοσίνη Αυτό το προϊόν αποτέλεσε το πρώτο γενετικά τροποποιημένο ένζυμο τροφίμων στην αγορά. Ο οργανισμός παραγωγής είναι το Ε. coli Κ-12 στέλεχος που έχει το γονίδιο προχυμοζίνης υπό τον έλεγχο του προαγωγέα trp σε pbr322-φορέα έκφρασης Η χυµοσίνη συσσωρεύεται σε έγκλειστα (inclusion bodies). Τα κύτταρα διαρρηγνύονται µε οµογενοποίηση. Το υγρό συλλέγεται µε φυγοκέντρηση Μετά από πλύση σε ph 2, τα inclusion bodies διαλύονται µε την προσθήκη ουρίας (7 9 M) µε το ph να αυξάνεται µέχρι το 10. Μετά το βήµα της επαναδίπλωσης των πρωτεϊνών µε ρυθµιστικά διαλύµατα NaCl και Na 3 (PO 4 ), το ph ρυθµίζεται σταδιακά στο 5.5. Η Χυµοσίνη αποµονώνεται και συγκεντρώνεται µε χρωµατογραφία ιονικής ανταλλαγής

31 Σύγκριση διαφορετικών ζυµωτικών διεργασιών για την παραγωγή ενζύµων Μύκητες + εξωκυτταρική έκφραση +εύκολη κατάντη διεργασία + υψηλή απόδοση ανάκτησης - Μεγάλος χρόνος διεργασίας (4-6μέρες) - υψηλή κατανάλωση ενέργειας - υψηλότερο ρίσκο επιμολύνσεων - προκλήσεις στην αύξηση της κλίμακας μεγέθους και στην παραγωγικότητα - δυσκολίες στη μορφολογία και ρεολογία Βακτήρια + γρήγορη και απλή ανάπτυξη + μεταλλικά άλατα μπορούν να βελτιώσουν την παραγωγικότητα + λιγότερη από τη μισή διάρκεια σε σχέση με την καλλιέργεια μυκήτων +εξοικονόμηση κόστους στην κατανάλωση ενέργειας και σε ακριβές υποδομές ζυμώσεων - εσωκυτταρική έκφραση - πολύπλοκη κατάντη διεργασία - η μεγάλη ποσότητα χημικών δημιουργούν ένα μείζον πρόβλημα διαχείρισης αποβλήτων GM K. lactis και διάφοροι ξενιστές ετερόλογης έκφρασης του γένους Bacillus συνδυάζουν τα πλεονεκτήματα των μυκητιακών συστημάτων (πχ. υψηλά επίπεδα παραγωγής και έκκρισης στο εξωκυτταρικό μέσο) με κάποια από τα πλεονεκτήματα των συστημάτων E. coli όπως η γρήγορη αύξηση της βιομάζας. Τα πιο κοινά χρησιμοποιούμενα συστήματα έκφρασης στη βιομηχανία είναι τα είδη των Aspergillus και Bacillus.

32 Μορφοποίηση Ενζύµων Τα ένζυµα πωλούνται ως σταθεροποιηµένα υγρά ή ως λεπτόκοκκα στερεά Γιατί µορφοποίηση? Πρωταρχικός στόχος της µορφοποίησης είναι η ελαχιστοποίηση των απωλειών στην ενζυµική δραστικότητα κατά τη µεταφορά, αποθήκευση και χρήση. Οι δευτερεύοντες στόχοι περιλαµβάνουν την πρόληψη της µικροβιακής µόλυνσης, την αποφυγή της κατακρηµνίσεως ή του σχηµατισµού θολώµατος, την ελαχιστοποίηση του σχηµατισµού σκόνης ή αερολυµάτων και τη βελτίωση του χρώµατος και της οσµής Πως δουλεύει? Αποφεύγοντας τη µετουσίωση, την απενεργοποίηση του καταλυτικού κέντρου και την πρωτεόλυση πχ. Αποφυγή ξεδιπλώµατος µέσω της µεταβολής του πρωτεινικού περιβάλλοντος έτσι ώστε να επάγεται µια συµπαγής πρωτεϊνική δοµή. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να επιτευχθεί αυτό. Προσεκτική επιλογή υλικών συσκευασίας. Τα μπουκάλια πρέπει να σφραγιστούν ώστε να αποτραπεί η πρόσβαση στην υγρασία ενώ πρέπει να αποφευχθούν ίχνη βαρέων μετάλλων ή άλλων ουσιών απενεργοποίησης ενζύμων στο ενζυμικό διάλυμα ή εναιώρημα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα ένζυμα πρέπει να προστατεύονται από το φως και να συσκευάζονται σε φιάλες από καφέ γυαλί. Συσκευασία

33 Λειτουργία Τεχνικές µορφοποίησης Μέθοδος Επαγωγή συμπαγούς πρωτεϊνικής δομής Αποφυγή της απενεργοποίησης του ενεργού κέντρου Συνολική καθαρότητα και ποιότητα ενζύμου Απομάκρυνση ακαθαρσιών, προβλήματα που σχετίζονται με το χρώμα, την οσμή και την κατακρήμνιση Πρόληψη φυσικής κατακρήμνισης Πρόληψη καταβύθισης μέσω εξαλάτωσης (salting out) Αντιμετώπιση μικροβιακής μόλυνσης Επιλεκτικός αποκλεισμός του νερού από την επιφάνεια της πρωτεΐνης με την προσθήκη σακχάρων, πολυολών και λυοτροπικών αλάτων Επαρκής ποσότητα οποιοδήποτε απαιτούμενου συμπαράγοντα, αναστρέψιμοι αναστολείς και αποκλεισμός οξειδωτικών ή αντιδραστικών ειδών στη μορφοποίηση Επιλογή πρώτων υλών και διαδικασία ανάκτησης ενζύμων Κατάντη διεργασία όπως η διήθηση, η προσρόφηση, η χρωματογραφία, η κρυστάλλωση, η εκχύλιση Μορφοποίηση κοντά στο pi του ενζύμου με υδρόφιλους διαλύτες όπως γλυκερόλη ή PPG Προστίθενται μέτρια επίπεδα αλάτων διαλυτοποίησης Συνδυασμός διήθησης, οξίνισης, ελαχιστοποίησης ελεύθερου νερού, προσθήκη βιοκτόνων

34 T-κοκκοποίηση: φυσική αντοχή και ελάχιστη σκόνη. Τεχνικές κοκκοποίησης υψηλής αντοχής και τεχνικές επίστρωσης. Βιομηχανία απορρυπαντικών. BG/SG κοκκοποίηση: µικρότερο µέγεθος σωµατιδίων, εύκολη ενσωµάτωση στο αλεύρι - ασφάλεια. Ξήρανση µε ψεκασµό και ξήρανση σε ρευστή κλίνη. Βιοµηχανία αρτοποιίας. Διαφορετικές µορφοποιήσεις ανάλογα µε τις εφαρµογές Micro κοκκοποίηση: Ξήρανση για καλύτερη κατανομή μεγέθους σωματιδίων και για ασφάλεια (απουσία σκόνης) στη βιομηχανία τροφίμων CT-Granulates: (επικαλυμμένο-σκληρό) για ευαίσθητα στη θερμότητα ένζυμα για την πρόληψη της μετουσίωσης. Βιομηχανία ζωοτροφών. Ακινητοποιηµένα ένζυµα: Υψηλή παραγωγικότητα με χαμηλό κόστος. Το ένζυμο ακινητοποιείται σε ένα φορέα ή σε μια μήτρα, ενισχύοντας τη σταθερότητα και εμποδίζοντας τη διαρροή στο υπόστρωμα κατά τη διάρκεια της εφαρμογής. Βιομηχανία αμύλου, πετρελαίου και λιπαρών ουσιών. Υγρή µορφοποίηση: υγρό προϊόν και σταθεροποιημένο με πολυόλες όπως γλυκερόλη, σορβιτόλη, MPG, ζάχαρη, άλατα για μείωση της ενεργότητας του νερού

35 Διαχείριση αποβλήτων Ø Λόγω της γενικά χαμηλής συγκέντρωσης του ενζύμου στο αρχικό υλικό, ο όγκος του υλικού που πρέπει να υποβληθεί σε επεξεργασία είναι μεγάλος και επομένως συσσωρεύονται σημαντικές ποσότητες αποβλήτων. Ø Το χρησιμοποιημένο μέσο ζύμωσης μπορεί ακόμη να περιέχει μεγάλες ποσότητες αχρησιμοποίητων θρεπτικών ουσιών. Ωστόσο, η ανακύκλωση δεν είναι γενικά δυνατή λόγω της παρουσίας μεταβολιτών που δύναται να παρεμποδίζουν. Ø Μπορούν να διαχωριστούν τα στερεά κατάλοιπα τα οποία χρησιμοποιούνται ως ζωοτροφές. Τα στερεά αυτά πρέπει να ελέγχονται προσεκτικά για ανεπιθύμητους μεταβολίτες, π.χ. αντιβιοτικά πριν τροφοδοτηθούν στα ζώα. Σε διεργασίες που χρησιμοποιείται rdna, είναι αναγκαία η απόλυτη προστασία του περιβάλλοντος από τη διαφυγή γενετικού υλικού. Τα απόβλητα πρέπει να απενεργοποιούνται χημικά ή θερμικά πριν από τη διάθεσή τους, ώστε να εξασφαλιστεί η μη διαφυγή στο περιβάλλον γενετικώς τροποποιημένων οργανισμών (GMOs).

36 Ακινητοποίηση ενζύµων

37 Τα ένζυµα µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε ακατέργαστη (crude) ή καθαρή µορφή και αντίστοιχα ελεύθερα ή ακινητοποιηµένα Η ακινητοποίηση είναι η διαδικασία κατά την οποία η κίνηση των µορίων ενός ενζύµου στο χώρο παρεµποδίζεται σε µέγιστο ή απόλυτο βαθµό µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία µιας αδιάλυτης στο νερό ενζυµικής φάσης Η ακινητοποίηση ενζύµων είναι µια σπουδαία διεργασία. Πλεονεκτεί εκείνης των ελεύθερων ενζύµων κατά το ότι: Κάνει δυνατή τη συνεχή λειτουργία της ενζυµικής διεργασίας χρησιµοποιώντας την ίδια ποσότητα ενζύµου Δίνει προϊόντα απαλλαγµένα ενζύµου Εύκολα και γρήγορα µπορεί να διακοπεί η ενζυµική αντίδραση Χρησιµοποιείται σαν µοντέλο για τη µελέτη παρόµοιων ενζυµικών δράσεων βιολογικών συστηµάτων που υπάρχουν σε ορισµένα κυτταρικά οργανίδια (π.χ. µεµβράνες)

38 Εισαγωγή Ένζυµο στη διαλυτή φάση Υπόστρωµα / Κύρια φάση / Παρεµποδιστής

39 Εισαγωγή Ένζυµο στη διαλυτή φάση Υπόστρωµα / Κύρια φάση / Παρεµποδιστής

40 Εισαγωγή Ένζυµο στη διαλυτή φάση Ένζυµο στη φάση εγκλεισµού Υπόστρωµα / Κύρια φάση / Παρεµποδιστής

41 Εισαγωγή Ένζυµο στη διαλυτή φάση Ένζυµο στη φάση εγκλεισµού Υπόστρωµα / Κύρια φάση / Παρεµποδιστής

42 Εισαγωγή Ένζυµο στη διαλυτή φάση Ένζυµο στη φάση εγκλεισµού Υπόστρωµα / Κύρια φάση / Παρεµποδιστής

43 Πλεονεκτήµατα ακινητοποιηµένων ενζύµων Ανάκτηση στο τέλος της αντίδρασης και επαναχρησιµοποίηση. Τα οικονοµικά µιας αντίδρασης βελτιώνονται. Εύκολος διαχωρισµός του ενζύµου από τα προϊόντα. Βελτίωση της σταθερότητας του ακινητοποιηµένου ενζύµου. Βελτιωµένες ενζυµικές ιδιότητες. Βελτίωση της αποδοτικότητας της καταλυτικής αντίδρασης σε κάποιες περιπτώσεις. Επίτευξη καλύτερου ελέγχου της αντίδρασης. Συνεχής καταλυτική διεργασία. Δυνατότητα χρήσης πολλαπλών ενζυµικών ενεργοτήτων. Δυναµικό χρήσης των ακινητοποιηµένων βιοκαταλυτών σε βιοµηχανική κλίµακα Πρώτη εφαρµογή σε αµινο-ακυλάσες του Aspergillus oryzae για την παραγωγή L-αµινοξέων στην Ιαπωνία

44 Μειονεκτήµατα ακινητοποιηµένων ενζύµων Περιορισµένες εφαρµογές στη Βιοµηχανία Απώλεια καταλυτικών ιδιοτήτων σε µερικά ένζυµα Μερικά ένζυµα γίνονται ασταθή Θερµική απενεργοποίηση των ενζύµων κατά τη διαδικασία της ακινητοποίησης Υψηλό κόστος για την παραγωγή, αποµόνωση και ανάκτηση ενεργού κλάσµατος του ενζύµου

45 Μέθοδοι ακινητοποίησης Παράµετροι για τη διαδικασία της επιλογής: ü Συνολική καταλυτική ενεργότητα ü Χαρακτηριστικά απενεργοποίησης / ενεργοποίησης. ü Οικονοµική αποδοτικότητα. ü Αναγκαιότητα εφαρµογής του ακινητοποιηµένου ενζύµου. ü Τοξικότητα του ακινητοποιηµένου ενζύµου. ü Διαχείριση αποβλήτων (της διεργασίας ακινητοποίησης).

46 Φορέας για την ακινητοποίηση ενζύµων Ιδανικά χαρακτηριστικά του φορέα: ü Χαµηλό κόστος και βέλτιστη ποιότητα ü Αδράνεια τόσο µε το ένζυµο όσο και µε το µέσο ü Φυσική αντοχή ü Σταθερότητα ü Αναγεννησιµότητα ü Βελτίωση της ενζυµικής εξειδίκευσης ü Μείωση της παρεµπόδισης από το προϊόν ü Δυνατότητα ακινητοποίησης και ολόκληρων κυττάρων

47 Φορέας για την ακινητοποίηση Τύποι φορέων: Φυσικοί ενζύµων ü Αλγινικό: προέρχεται από τα κυτταρικά τοιχώµατα φυκών (αλγινικό ασβέστιο ή µαγνήσιο) ü Χιτίνη και χιτοζάνη: το ένζυµο δεσµεύεται στις οµάδες ΟΗ ü Κολλαγόνο: πρωτεϊνικό υποστρωµα ü Καραγεννάνη: θειικός πολυσακχαρίτης από φύκια ü Ζελατίνη: µερικώς υδρολυµένο κολλαγόνο, καλή χωρητικότητα στη δέσµευση νερού ü Κυτταρίνη: το φθηνότερο και πιο άφθονο υπόστρωµα ü Άµυλο: καλή δέσµευση νερού ü Πηκτίνη: καλή δέσµευση νερού

48 Φορέας για την ακινητοποίηση Συνθετικά πολυµερή ü Ρητίνες ιοντοανταλλαγής ü Αδιάλυτα υποστρώµατα µε πορώδη επιφάνεια Το πορώδες παγιδεύει τα ένζυµα ή τα κύτταρα Παράδειγµα: DEAE κυτταρίνη, Polyvinyl chloride (PVC), πολυαιθύλενο γλυκόλη (PEG) ενεργοποιηµένη µε UV Ανόργανα ενζύµων Κεραµικά, Ζεόλιθοι, γη διατόµων, silica, γυαλί, ενεργοποιηµένος άνθρακας, νανοσωλήνες άνθρακα

49 Τεχνικές για την ακινητοποίηση ενζύµων Πρόσδεση σε φορέα Διασταυρούµενη πρόσδεση Εγκλωβισµός Φυσική προσρόφηση Πρόσδεση συγγένειας Οµοιοπολική πρόσδεση Πηκτή ή τύπου ίνας Μικροκάψουλα Ιοντική πρόσδεση Πρόσδεση µετάλλου ή χηλική Δισουλφιδική πρόσδεση Προσρόφηση και διασταυρούµενοι δεσµοί

50 (1) Προσρόφηση Παλιότερη µέθοδος ακινητοποίησης ενζύµων Πιο απλή µέθοδος ακινητοποίησης ενζύµων Τα ένζυµα προσροφούνται στην εξωτερική επιφάνεια του υποστρώµατος Το υπόστρωµα/φορέας µπορεί να είναι: 1. Ανόργανος φορέας (οξείδιο του αργιλίου, πυλός) 2. Οργανικός φορέας (άµυλο) 3. Τροποποιηµένη sepharose και ρητίνες ιοντοανταλλαγής 4. Νανοσωµατίδια Υπόστρωµα Προσρόφηση

51 (1) Προσρόφηση Ασθενείς δεσµοί σταθεροποιούν τα ένζυµα στο φορέα/υπόστρωµα Χαµηλής ενέργειας δεσµοί όπως: ü Ιοντικής αλληλεπίδρασης ü Δεσµοί υδρογόνου ü Δυνάµεις Van der Waal Τα σωµατίδια του φορέα πρέπει να είναι µικρά (500 Α έως 1 mm διάµετρο) Τα ένζυµα ακινητοποιούνται επιφανειακά εποµένως δεν υπάρχουν περιορισµοί διάχυσης Υπόστρωµα Προσρόφηση

52 (1) Μέθοδοι προσρόφησης Στατική διεργασία: Ακινητοποίηση στο φορέα επιτρέποντας την επαφή του διαλύµατος του ενζύµου µε τον φορέα χωρίς ανάδευση Δυναµική διεργασία διαλείποντος έργου: ο φορέας τοποθετείται µέσα στο διάλυµα του ενζύµου µε ανάδευση Διεργασία φόρτωσης σε αντιδραστήρα: ο φορέας τοποθετείται στον αντιδραστήρα πριν την µεταφορά του ενζυµικού διαλύµατος σε αυτόν Διεργασία τοποθέτησης σε ηλεκτρόδιο: ο φορέας τοποθετείται κοντά σε ηλεκτρόδιο σε λουτρό ενζύµου και µε επίδραση φορτίου το ένζυµο µεταναστεύει στην επιφάνεια του φορέα

53 Πλεονεκτήµατα: ü Απλή και οικονοµική διεργασία ü Περιορισµένη απώλεια ενεργότητας ü Δε χρειάζονται αντιδραστήρια ü Μπορεί να ανακυκλωθεί, να αναγεννηθεί και να επαναχρησιµοποιηθεί (Recycled, Regenerated & Reused - R 3 ) Μειονεκτήµατα: (1) Προσρόφηση ü Σχετικά µικρή επιφάνεια για δέσµευση ü Έκθεση του ενζύµου σε µικροβιακή µόλυνση. ü Τα µικρότερα σωµατίδια προκαλούν απότοµη πτώση σε αντιδραστήρες κλίνης συνεχούς έργου. ü Οι αποδόσεις είναι συνήθως χαµηλές εξαιτίας της απενεργοποίησης και εκρόφησης.

54 (1) Προσρόφηση

55 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση Περιλαµβάνει το σχηµατισµό οµοιοπολικών δεσµών µεταξύ ενζύµου και υποστρώµατος Περισσότερο χρησιµοποιούµενη µέθοδος για ακινητοποίηση ενζύµων Οι χηµικές οµάδες των ενζύµων που δηµιουργούν οµοιοπολικούς δεσµούς µε το υπόστρωµα είναι: Ø Αµινο- και ίµινο-οµάδες Ø Υδρόξυ οµάδες Ø Καρβόξυλο οµάδες Ø Θειόλο και µεθυλοθειολο οµάδες Ø Γουανιδυλο και ιµιδαζολο οµάδες Ø Φαινολικοί δακτύλιοι Υπόστρωµα Οµοιοπολικός δεσµός µεταξύ ενζύµου και υποστρώµατος

56 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση Σηµαντικές δραστικές οµάδες ενζύµων που παρέχουν χηµικές οµάδες για το σχηµατισµό οµοιοπολικών δεσµών µε τον φορέα/υπόστρωµα είναι: 1. α-καρβοξυλο οµάδες στο C-τελικο άκρο 2. α-αµινο οµάδες στο Ν-τελικο άκρο 3. ε-αµινο οµάδες σε Λυσίνη και Αργινίνη 4. β και γ καρβοξυλο οµάδες του Ασπαρτικού και Γλουταµικού 5. Φαινολικός δακτύλιος Τυροσίνης και Κυστεϊνης 6. Υδροξυλο οµάδες Σερίνης και Θρεονίνης 7. Οµάδα ιµιδαζολίου της Ιστιδίνης 8. Δακτύλιος ινδόλης της Τρυπτοφάνης Υπόστρωµα Οµοιοπολικός δεσµός µεταξύ ενζύµου και υποστρώµατος

57 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση Φορείς/υποστρώµατα που χρησιµοποιούνται για οµοιοπολική δέσµευση: Υδατάνθρακες: πχ κυτταρίνη, DEAΕ κυτταρίνη, αγαρόζη Συνθετικά µέσα: πχ πολυακρυλαµίδιο Φορείς πρωτεϊνών: πχ κολλαγόνο, ζελατίνη Φορείς µε αµινοµάδες: πχ αµινοβενζυλο κυτταρινη Ανόργανοι φορείς: πορώδες γυαλί, silica CNBr-αγαρόζη και CNBr-Sepharose Οι υδρόξυ και αµινοµάδες δηµιουργούν ευκολότερα οµοιοπολικούς δεσµούς Υπόστρωµα Οµοιοπολικός δεσµός µεταξύ ενζύµου και υποστρώµατος

58 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση 1. Διαζώτωση: Δηµιουργία δεσµού µεταξύ αµινοµάδας του υποστρώµατος και οµάδας τυροσυλο- ή ιστιδινο- του ενζύµου 2. Πεπτιδικός δεσµός: µεταξύ αµινοµάδας και καρβοξυλοµάδας υποστρώµατος και ενζύµου

59 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση 3. Πολυδραστικά αντιδραστήρια: Χρήση ενός διλειτουργικού ή πολυλειτουργικού αντιδραστηρίου (πχ γλουταραλδεϋδης) η οποία δηµιουργεί δεσµούς µεταξύ αµινοµάδων του υποστρώµατος και του ενζύµου

60 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση Πλεονεκτήµατα: Ø Δυνατή δέσµευση ενζύµου στο φορέα Ø Καµία διαρροή ή εκρόφηση του ενζύµου από τον φορέα Ø Σχετικά εύκολη µέθοδος Ø Διαθεσιµότητα µεγάλης ποικιλίας φορέων µε διαφορετικές δραστικές οµάδες Ø Ευρεία εφαρµογή

61 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση Μειονεκτήµατα: Ø Χηµική τροποποίηση του ενζύµου οδηγώντας σε απώλεια δοµής και λειτουργίας Ø Απενεργοποίηση του ενζύµου µέσω αλλαγών της δοµής του ενζύµου όταν η αντίδραση λαµβάνει χώρα στην περιοχή του ενεργού κέντρου Ø Η απενεργοποίηση µπορεί να αποφευχθεί µε την παρουσία υποστρώµατος ή συναγωνιστικού αναστολέα κατά τη διάρκεια της ακινητοποίησης του ενζύµου

62 (2) Οµοιοπολική πρόσδεση

63 (3) Εγκλωβισµός Τα ένζυµα παγιδεύονται φυσικά µέσα σε µία µήτρα Οι δεσµοί που πραγµατοποιούνται µπορεί να είναι οµοιοπολικοί και µη οµοιοπολικοί Η µήτρα που χρησιµοποιείται πρέπει να είναι ένα υδατοδιαλυτό πολυµερές Παραδείγµατα µήτρας: Μήτρα v Γέλη πολυακρυλαµιδίου v Τριοξική κυτταρίνη v Αγαρόζη v Ζελατίνη v Καραγεννάνη v Αλγινικό

64 (3) Εγκλωβισµός Ένζυµο + αλγινικό νάτριο Διάλυµα CaCl 2 Το µίγµα προστίθεται στάγδην Σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου

65 (3) Εγκλωβισµός Η µορφή και η φύση της µήτρας ποικίλει Το µέγεθος των πόρων µεταβάλλεται για την αποφυγή απώλειας του ενζύµου Πιθανότητα διαρροής χαµηλού ΜΒ ενζύµου Το άγαρ και η καραγεννάνη έχουν µεγάλο µέγεθος πόρων Το µέγεθος των πόρων µεταβάλλεται µε τη συγκέντρωση του πολυµερούς Η παγίδευση εφαρµόζεται στην παρασκευή βιο-αισθητήρων Μικρή επιτυχία σε βιοµηχανική κλίµακα Εύκολη διεργασία σε µικρή κλίµακα

66 (3) Μέθοδοι εγκλωβισµού Ενθυλάκωση σε πηκτές: παγίδευση ενζύµων σε πηκτές Ενθυλάκωση σε ίνες: τα ένζυµα προσδένονται σε ίνες αποτελούµενες από υλικά µήτρας Ενθυλάκωση σε µικροκάψουλες: τα ένζυµα παγιδεύονται σε µικροκάψουλες που σχηµατίζονται από µίγµατα µονοµερών όπως πολυαµίνες, αλγινικό ασβέστιο.

67 (3) Ενθυλάκωση (encapsulation) Εγκλεισµός ενζύµων σε µια κάψουλα αποτελούµενη από ηµιδιαπερατή µεµβράνη Η κάψουλα κατασκευάζεται από νιτροκυτταρίνη ή nylon Η απόδοση εξαρτάται από τη σταθερότητα των ενζύµων Ηµιδιαπερατή µεµβράνη

68 (3) Ενθυλάκωση (encapsulation) Πλεονεκτήµατα Εύκολη και φθηνή µέθοδος Ακινητοποίηση µεγάλης ποσότητας ενζύµου Μειονεκτήµατα Περιορισµός στο µέγεθος των πόρων Μόνο µικρά µόρια µπορούν να διαπεράσουν τη µεµβράνη Ηµιδιαπερατή µεµβράνη

69 (3) Μέθοδοι εγκλωβισµού Πλεονεκτήµατα Γρήγορη διεργασία Φθηνή (φθηνές µήτρες) Ήπιες συνθήκες ακινητοποίησης Μικρότερες πιθανότητες δοµικών αλλαγών στα ένζυµα Μειονεκτήµατα Διαρροή ενζύµου Διάχυση υποστρώµατος και προϊόντος Μείωση προσιτότητας υποστρώµατος εξαιτίας του πολυµερισµού της γέλης µέσω ελευθέρων ριζών Απενεργοποίηση ενζύµου Δυνατότητα µικροβιακής µόλυνσης

70 (4) Διασταυρούµενη πρόσδεση Δηµιουργία οµοιοπολικών δεσµών µεταξύ διαφορετικών οµάδων των ενζύµων µέσω πολυδραστικών αντιδραστηρίων Δεν εµπλέκονται µήτρες ή φορείς Διασταυρούµενοι δεσµοί

71 (4) Διασταυρούµενη πρόσδεση Κοινά πολυδραστικά αντιδραστήρια: γλουταραλδεϋδη, διαζωνιακό άλας Η τεχνική είναι φθηνή και απλή αλλά δε χρησιµοποιείται συνήθως µε καθαρές πρωτεΐνες Ευρέως χρησιµοποιούµενη σε εµπορικά σκευάσµατα Μειονεκτηµα Τα πολυδραστικά αντιδραστήρια µπορεί να µετουσιώσουν το ένζυµο

72 (4) Διασταυρούµενη πρόσδεση

73 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ Αδιάλυτα ένζυμα Διαλυτά ένζυμα Εγκλωβισμός σε Σύνδεση με Χωρίς τροποποίηση Τροποποιημένα Πηκτή Ίνες Φορέα Διασταύρωση Μικροκάψουλες Φυσική προσρόφηση Ιοντικός δεσμός Χηλικός δεσμός Ομοιοπολικός δεσμός

74 Ε Ε Ε Ε Ε ΕΓΚΛΩΒΙΣΜΟΣ Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε ΔΙΑΣΤΑΥΡΩΣΗ Πηκτή (Ακρυλαμίδιο) (β-αμυλάση, παπαϊνη) Κάψουλα (Νάϋλον, νιτροκυτταρίνη, πολυστυρένιο) (πολλά ένζυμα) Ίνες (Οξική κυτταρίνη) (ισομεράσες) ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΦΟΡΕΑ Ε Ε Ε Ε Προσρόφηση (Ε.Α., Τανίνη) (γλυκοαμυλάση) Ιοντικός δεσμός (CM κυτταρίνη) Χηλικός δεσμός (Γυαλί) (αμιδάση πενικιλ.) Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Αδιάλυτο πλέγμα Ομοιοπολικός δεσμός (Γυαλί, κεραμικά) ΑΜΙΝΟΞΕΑ (ε-αμινο λυσίνης, ιμιδιαζόλιο ιστιδίνης, καρβοξύλιο ασπαρτικού)

75 + + Ένζυμο Υπόστρωμα Προϊόν Μεμβράνη Σύμπλοκο ενζύμουυποστρώματος

76 Ακινητοποίηση ενζύµων Αδιάλυτος φορέας Ένζυµο + Αδιάλυτος φορέας Ένζυµο Ακινητοποιηµένο ένζυµο Υπόστρωµα Προϊόν + +

77 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΑΡΑΣ- ΚΕΥΗ ΙΣΧΥΣ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤ. ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΝΑΓΕΝΝ. ΦΟΡΕΑ ΣΤΑΘΕ- ΡΟΤΗΤΑ ΕΥΡΥΤΗΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΜΙΚΡΟΒ. ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΚΟΣΤΟΣ ΕΓΚΛΩΒΙΣΜΟΣ Δύσκολη Μέτρια Χαµηλή Αδύνατη Υψηλή Ναι Ναι Μέτριο ΦΥΣΙΚΗ ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ Απλή Αδύνατη Μέση Δυνατή Χαµηλή Ναι Όχι Χαµηλό ΙΟΝΤΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ Απλή Μέτρια Υψηλή Δυνατή Μέτρια Ναι Όχι Μέτριο ΧΗΛΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ Απλή Μέτρια Υψηλή Δυνατή Μέτρια Ναι Όχι Μέτριο ΟΜΟΙΟΠΟΛ. ΔΕΣΜΟΣ Δύσκολη Ισχυρή Υψηλή Σπάνια Υψηλή Όχι Όχι Υψηλό ΔΙΑΣΤΑΥΡΩΣΗ Μέτρια Ισχυρή Χαµηλή Αδύνατη Υψηλή Όχι Ναι Μέτριο

78 Βιοτεχνολογική Παρασκευή Βιοντήζελ Η µετεστεροποίηση είναι η διαδικασία ανταλλαγής ακυλοµάδων µεταξύ εστέρων και οξέων (οξεόλυση), µεταξύ εστέρα και άλλου εστέρα, ή µεταξύ εστέρα και µίας αλκοόλης (αλκοόλυση) Μπορεί να χρησιµοποιηθεί: Μεθανόλη, αιθανόλη, προπανόλη, ισοπροπανόλη, βουτανόλη (καν. ή τριτ.), διακλ. αλκοόλες και οκτανόλη. Φθηνότερη και κοινά χρησιµοποιούµενη η Μεθανόλη Αλλά όµως η αιθανόλη είναι ανανεώσιµη αλκοόλη!!

79 Σύνθεση βιοντήζελ Χηµική Αλκοόλυση (Αλκαλικοί-όξινοι καταλύτες) Οι αλκαλικοί καταλύτες που συνήθως χρησιµοποιούνται είναι το NaOH ή KOH, κυρίως λόγω του χαµηλού τους κόστους. Επίσης χρησιµοποιούνται τα ανθρακικά και αλκοξείδια του νατρίου ή καλίου. Το µεθοξείδιο του νατρίου π.χ. είναι ένας πολύ δραστικός καταλύτης που εύκολα δίνει άλκυλ-εστέρες (>98%) σε περίπου 30 min (ξηρές συνθήκες). Οι όξινοι καταλύτες χρησιµοποιούνται σπανιότερα διότι δρουν διαβρωτικά (αναγκαίες οι υψηλότερες θερµοκρασίες και οι µοριακές αναλογίες των αντιδρώντων) -> Κατάλληλοι για λιπαρά προερχόµενα από µικροφύκη. Ενζυµική Αλκοόλυση (Λιπάσες) Περισσότερο αποτελεσµατική, µε µεγαλύτερο βαθµό εξειδίκευσης, απαιτεί λιγότερη κατανάλωση ενέργειας λόγω ήπιων συνθηκών αντίδρασης και παράγει λιγότερα παραπροϊόντα, καθιστώντας τη περιβαλλοντικά φιλική

80 Λιπάσες ως καταλύτες για την παραγωγή βιοντήζελ Όλες οι ενζυµικές αντιδράσεις είναι αµφίδροµες Παρουσία H 2 O Απουσία H 2 O

81 Διεργασία ενζυµικής µετατροπής βιοντήζελ γλυκερόλη βιοκαταλύτης