ΔΙΑΤΡΙΒΗ. για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Φαρμακογονιδιωματική και λειτουργική μελέτη συσχέτισης μικροδορυφορικών αλληλουχιών στον υποκινητή του γονιδίου MAP3K5 με τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου Παΐζη Αρσινόη Βιολόγος Επιβλέπων καθηγητής Πάτρα 2013 Γεώργιος Π. Πατρινός - 0 -

2 Επιβλέπων Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακογονιδιωματικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακογονιδιωματικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Κωνσταντίνος Πουλάς Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών - 1 -

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης, για την ολοκλήρωση του κύκλου σπουδών του Μεταπτυχιακού Προγράμματος στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και τη Τεχνολογία, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Το πειραματικό μέρος πραγματοποιήθηκε εξ ολοκλήρου στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας, του τμήματος Φαρμακευτικής, υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιου Πατρινού. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Πατρινό που με δέχτηκε στην εργαστηριακή του ομάδα, πίστεψε σε εμένα, με ενθάρρυνε, με καθοδήγησε και στήριξε τις προσπάθειες μου, ανοίγοντας μου νέους ορίζοντες και επιτρέποντάς μου να ασχοληθώ με ένα τόσο ερευνητικά ενδιαφέρον θέμα. Ακόμη, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στη Δρ. Μαριάννα Γεωργίτση για την πολύτιμη βοήθειά της, για τις γνώσεις και την εμπειρία που απέκτησα κοντά της, η συμβολή της υπήρξε καθοριστική στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Επίσης, ευχαριστώ τη Μαρίνα και τη Χριστίνα που με βοήθησαν να κάνω τα πρώτα μου βήματα στο εργαστήριο, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη του Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας για το ευχάριστο, φιλικό και εποικοδομητικό κλίμα συνεργασίας που είχαμε. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στους γονείς μου, κυρίως στον πατέρα μου, για την ενθάρρυνση, την υποστήριξη, την εμπιστοσύνη και την υπομονή τους προς εμένα όλα αυτά τα χρόνια και διότι χωρίς αυτούς δεν θα είχα τη δυνατότητα να ξεκινήσω και να ολοκληρώσω αυτή τη μελέτη. Τέλος, ευχαριστώ απεριόριστα τον Ηλία που ήταν συνεχώς δίπλα μου τα τελευταία χρόνια και με ενθάρρυνε να ξεκινήσω αυτή τη μελέτη. Τον ευχαριστώ για την αγάπη και την εμπιστοσύνη του, τη συνεχή υποστήριξη, βοήθεια και υπομονή του

4 Περιεχόμενα ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ερυθροποίηση Δομή και λειτουργία αιμοσφαιρίνης Τύποι αιμοσφαιρινών και μεταβολές στη βιοσύνθεση σφαιρινικών αλυσίδων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης Γονίδια σφαιρινών και οργάνωσή τους Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στο γενετικό τόπο της β-σφαιρίνης Cis-δραστικά στοιχεία Trans-δραστικά στοιχεία QTL στo χρωμόσωμα Xp QTL στo χρωμόσωμα 2p QTL στo χρωμόσωμα 8q QTL στo χρωμόσωμα 6q Τα γονίδια HBS1L και ΜΥΒ και η διαγονιδιακή τους περιοχή Το γονίδιο AHI Το γονίδιο ALDH8A Το γονίδιο MAP Το γονίδιο PEX Το γονίδιο PDE7B Το γονίδιο MAP3K Αιμοσφαιρινοπάθειες β-μεσογειακή αναιμία Είδη μεταλλάξεων που οδηγούν στη β-μεσογειακή αναιμία Διάγνωση και θεραπεία της β-μεσογειακής αναιμίας και άλλων αιμοσφαιρινοπαθειών ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Απομόνωση ολικού γονιδιωματικού DNA Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA στα δείγματα Πολυμορφισμός-στόχος της παρούσας μελέτης Σχεδιασμός εκκινητών (primers) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR)

5 3.7 Πρωτόκολλο PCR-αντίδρασης Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Καθαρισμός των PCR-προϊόντων Αλληλούχιση: προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας μορίων DNA (DNA Sequencing) Ανάλυση ετεροδιμερών (heteroduplex analysis) Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συσχέτιση της STR του υποκινητή του MAP3K5 με υψηλά επίπεδα της HbF Σύνδεση της STR με τα SNP του γονιδίου MAP3K5 rs και rs ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΙΣΤΟΣΕΛΙΔΕΣ

6 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ Active Chromatin Hub (ACH): Ενεργό κέντρο χρωματίνης Adult hemoglobin (HbA): Αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων Fetal hemoglobin (HbF): Εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH): Κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης Hydroxyurea (HU): Υδροξυουρία Hypersensitive Site (HS): Υπερευαίσθητη περιοχή LCR: Locus control region Quantitative trait loci (QTL): Γονιδιακοί τόποι ποσοτικών γνωρισμάτων Short tandem repeat (STR): Σύντομη διαδοχική επανάληψη Single nucleotide polymorphism (SNP): Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός Variable number tandem repeat (VNTR): Ποικίλου αριθμού διαδοχικές επαναλήψεις - 5 -

7 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ερυθροποίηση Η ερυθροποίηση είναι η οντογενετική εξελικτική διαδικασία με την οποία παράγονται τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Διεγείρεται από τα μειωμένα επίπεδα οξυγόνου (Ο 2 ) στην κυκλοφορία, τα οποία ανιχνεύονται από τους νεφρούς, οι οποίοι εκκρίνουν στη συνέχεια την ορμόνη ερυθροποιητίνη. H ορμόνη αυτή διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων ερυθρών κυττάρων, ενεργοποιώντας την αυξημένη ερυθροποίηση στους αιμοποιητικούς ιστούς και παράγοντας τελικά τα ερυθρά αιμοσφαίρια (Sherwood et al., 2005). Στα θηλαστικά (συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου) μετά τη γέννηση, η ερυθροποίηση λαμβάνει χώρα εντός του ερυθρού μυελού των οστών. Η εμβρυονική ερυθροποίηση στον άνθρωπο αρχίζει κατά τη δεύτερη με τρίτη εβδομάδα της ενδομήτριας ζωής στα μεσοδερμικά κύτταρα του λεκιθικού ασκού με τον σχηματισμό των εμβρυονικών αιμοποιητικών νησίδων (σύνθεση α-, ζ- και ε- σφαιρίνης) (Peschle et al., 1985). Έπειτα, κατά το τρίτο μήνα, η παραγωγή των πρώτων απύρηνων ερυθροκυττάρων αρχίζει από βλαστοκύτταρα και προγονικά κύτταρα στο εμβρυϊκό ήπαρ (σύνθεση α- και γ- σφαιρίνης) (McGrath and Palis, 2008). Μετά από επτά μήνες περίπου, τα αιμοποιητικά κύτταρα εγκαθίστανται σταδιακά στο σπλήνα και στο μυελό των οστών. Ο μυελός των οστών, και εν μέρει ο σπλήνας, παραμένουν ως κύρια ερυθροποιητικά όργανα και μετά την κύηση (Palis and Segel, 1998). Ο μυελός όλων των οστών ουσιαστικά παράγει ερυθρά αιμοσφαίρια μέχρι την ηλικία των πέντε ετών. Η κνήμη και το μηριαίο οστό παύουν να είναι σημαντικές αιμοποιητικές περιοχές μετά την ηλικία των 25 ετών, ενώ οι σπόνδυλοι, το στέρνο, η λεκάνη, οι πλευρές και τα οστά του κρανίου συνεχίζουν να παράγουν ερυθρά αιμοσφαίρια σε όλη τη ζωή του ανθρώπου (Εικόνα 1.5β) (Patrinos and Antonarakis, 2010). Όλοι οι τύποι κυττάρων του αίματος προέρχονται από τα πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (multipotent stem cells). Καθώς τα κύτταρα αυτά έχουν την ικανότητα αυτοανανέωσης και πολλαπλασιασμού, διαφοροποιούνται σε πολυδύναμα μυελοειδή αρχέγονα κύτταρα (myeloid progenitor) και σε πολυδύναμα λεμφικά αρχέγονα κύτταρα ( aimopiisi/aimopiisi/arxegono/ index.htm#). Από την κυτταρική σειρά του - 6 -

8 μυελοειδούς αρχέγονου κυττάρου προέρχεται και η ερυθρά σειρά ( Από το πολυδύναμο μυελοειδές αρχέγονο κύτταρο, υπό την επίδραση της ερυθροποιητίνης, παράγεται η προερυθροβλάστη. Έχει ένα μεγάλο πυρήνα με ελεύθερα ριβοσώματα στο κυτταρόπλασμα, δίνοντας μια βασεόφιλη χρώση. Από την προερυθροβλάστη προέρχεται η βασεόφιλη ερυθροβλάστη, η οποία είναι μικρότερη από την προερυθροβλάστη με ένα μικρότερο πυρήνα, αλλά ένα πιο βασεόφιλο κυτταρόπλασμα που οφείλεται στην αύξηση του αριθμού των ριβοσωμάτων. Αυτά τα ριβοσώματα εμπλέκονται στην παραγωγή της αιμοσφαιρίνης. Ακολουθεί το στάδιο της πολυχρωματόφιλης ερυθροβλάστης, που είναι το τελευταίο πρόδρομο κύτταρο ικανό για μίτωση και είναι μικρότερο από τη βασεόφιλη ερυθροβλάστη. Το κυτταρόπλασμά του φαίνεται πιο γκρι λόγω της αυξημένης οξεοφιλίας που προκαλείται από την παρουσία της αιμοσφαιρίνης. Από την πολυχρωματόφιλη ερυθροβλάστη παράγεται η ορθοχρωματική ερυθροβλάστη ή νορμοβλάστη, ανίκανη για κυτταρική διαίρεση και ελαφρώς μεγαλύτερη από ένα ώριμο ερυθροκύτταρο, περιέχει ένα μικρό πυκνό πυρήνα. Όταν ο πυρήνας εξωθείται, σχηματίζεται το δικτυοερυθροκύτταρο (reticulocyte), το οποίο περιέχει ακόμα μερικά ριβοσώματα και συνεπώς διατηρεί μια ελαφρά βασεόφιλη χρώση, ενώ διατηρεί την ικανότητά του να παράγει αιμοσφαιρίνη. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος, να μεταφέρουν οξυγόνο και βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις φυσιολογικά στο αίμα (1%). Τέλος, από το δικτυοερυθροκύτταρο διαφοροποιείται το ερυθροκύτταρο, το τελικό προϊόν της ερυθροποίησης, το οποίο απελευθερώνεται από το μυελό των οστών στην κυκλοφορία (Εικόνα 1.1) ( htm#). Αυτά τα στάδια αντιστοιχούν σε συγκεκριμένη μορφολογία των κυττάρων όταν χρωματίζονται με την χρωστική Wright s και εξετάζονται κάτω από οπτικό μικροσκόπιο. Η κάθε μορφολογία είναι ανάλογη των βιοχημικών αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα κατά τα διάφορα στάδια διαφοροποίησης (

9 Εικόνα 1.1: Σχηματική αναπαράσταση της πορεία της ερυθροποίησης στα ενήλικα άτομα ( Η παραγωγή των ερυθροκυττάρων, όπως προαναφέρθηκε, ρυθμίζεται από την ορμόνη ερυθροποιητίνη, ανάλογα με τις ανάγκες του οργανισμού σε οξυγόνο. Πιο συγκεκριμένα, εάν η συγκέντρωση οξυγόνου στο αίμα μειώνεται, η απελευθέρωση ερυθροποιητίνης αυξάνεται. Επίσης, ορισμένοι άλλοι παράγοντες είναι απαραίτητοι για το σχηματισμό των ερυθροκυττάρων, όπως ο σίδηρος, που βρίσκεται στο κέντρο κάθε δακτυλίου της αίμης της αιμοσφαιρίνης και δεσμεύει το οξυγόνο, το φυλλικό οξύ και η βιταμίνη Β 12, που είναι απαραίτητα για την ωρίμανση των ερυθροκυττάρων ( htm#). Κατά το ενήλικο αναπτυξιακό στάδιο του ανθρώπου, τα ώριμα ερυθροκύτταρα παράγουν κυρίως την αιμοσφαιρίνη HbA (α 2 β 2 ). Παρόλα αυτά, υπάρχει ένας μικρός πληθυσμός ερυθροκυττάρων, τα F-κύτταρα, στα οποία δεν ολοκληρώνεται η μετάβαση από την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη, HbF (α 2 γ 2 ), σε εκείνη των ενηλίκων, HbA. Τα συγκεκριμένα κύτταρα βρίσκονται κυρίως στους ενήλικες σε ποσοστό 0,3% έως 4,4% των ερυθροκυττάρων. Τα επίπεδα της HbF και των F- κυττάρων μπορεί να ποικίλουν σημαντικά (περισσότερο από 10 φορές) σε φυσιολογικούς ενήλικες, αλλά και μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών (Rochette et - 8 -

10 al., 1994). Επίσης, τα επίπεδα των F-κυττάρων και της HbF καθορίστηκαν από μία πολύ ισχυρή γενετική συνιστώσα, η οποία υπολογίζεται ότι συμβάλλει στη φαινοτυπική εκδήλωση του χαρακτηριστικού κατά 89% (Garner et al., 2000). Αυτή η γενετική συνιστώσα προσδιορίστηκε με βάση μία μελέτη σε μονοζυγωτικά και διζυγωτικά δίδυμα όπου υποβλήθηκαν σε δοκιμές επίδρασης του γονότυπου των πολυμορφισμών XmnI- G γ και A γ 4-bp ως προς τα επίπεδα των F-κυττάρων και της HbF. 1.2 Δομή και λειτουργία αιμοσφαιρίνης Η αιμοσφαιρίνη (Hb) ανακαλύφθηκε από τον Hünefeld το 1840 ( ü, 1840), ενώ ο Max Perutz, το 1959, αποκάλυψε τη δομή του μορίου με τη χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ (Perutz, 1960). Η αιμοσφαιρίνη είναι μια τετραμερής πρωτεΐνη με μοριακό βάρος Da. Η γενική περιγραφή ενός μορίου αιμοσφαιρίνης είναι α 2 β 2, δηλαδή οι τέσσερις σφαιρινικές αλυσίδες περιλαμβάνουν δύο ζεύγη όμοιων πολυπεπτιδίων. Η αμινοξική αλληλουχία των αλυσίδων σφαιρίνης προσδιορίσθηκε στη δεκαετία του 1960 και βρέθηκε ότι οι τύπου-α πεπτιδικές αλυσίδες σφαιρίνης αποτελούνται από 141 αμινοξέα, ενώ οι τύπου-β σφαιρινικές αλυσίδες από 146 αμινοξέα. Οι αλυσίδες, κατά τη δευτεροταγή δομή τους, αποτελούνται κατά 75% από α-έλικες, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με μικρού μήκους μη ελικοειδή τμήματα. Οι δεσμοί υδρογόνου ευθύνονται για τη τριτοταγή δομή των σφαιρινικών αλυσίδων, ενώ η τεταρτοταγής δομή αναφέρεται στη σύνδεση των τεσσάρων υπομονάδων της αιμοσφαιρίνης μεταξύ τους. Κάθε αλυσίδα σφαιρίνης φέρει μία ομάδα αίμης, ένα μη πρωτεϊνικό μόριο που συνδέεται σε μία συγκεκριμένη θέση του μορίου της σφαιρίνης. Ο σίδηρος της αίμης είναι δισθενής και οξειδώνεται σε τρισθενή με αντιστρεπτή αντίδραση ειδικά στο μόριο της αιμοσφαιρίνης. Η αίμη συνδέεται με την πεπτιδική αλυσίδα με δεσμό που αναπτύσσεται ανάμεσα στο ιμιδαζόλιο μιας ιστιδίνης της αλυσίδας, που βρίσκεται στη θέση 87 της α και 92 της β αλυσίδα σφαιρίνης, και σε έναν από τους έξι δεσμούς συναρμογής του σιδήρου. Τέσσερις από τους υπόλοιπους δεσμούς του σιδήρου δεσμεύουν τα τέσσερα άζωτα των πυρρολικών δακτυλίων της αίμης και ο έκτος το οξυγόνο (Ο 2 ) (Εικόνα 1.2) (Marengo-Rowe, 2006)

11 Εικόνα 1.2: Αίμη ( Οι τέσσερις αλυσίδες σφαιρίνης με τις αντίστοιχες ομάδες αίμης συνιστούν το μόριο της λειτουργικής αιμοσφαιρίνης που μεταφέρει οξυγόνο από τους πνεύμονες προς τους ιστούς. Το τετραμερές της αιμοσφαιρίνης, όπως προσδιορίστηκε με ακτίνες X, είναι σφαιροειδές, πεπλατυσμένο στους πόλους, με έναν άξονα συμμετρίας και διάμετρο 55Å (Perutz, 1960). Επίσης, οι τέσσερις ομάδες αίμης απέχουν μεταξύ τους με ίσες αποστάσεις, ενώ δεν υπάρχει επαφή μεταξύ των δύο όμοιων αλυσίδων, δηλαδή κάθε αλυσίδα α εφάπτεται μόνο με τις δύο αλυσίδες β (Εικόνα 1.3). Η τεταρτοταγής δομή της αιμοσφαιρίνης αλλάζει σημαντικά με την πρόσδεση του οξυγόνου στο σίδηρο της αίμης και αυτό ευνοεί την πρόσδεση οξυγόνου και στις υπόλοιπες ομάδες αίμης του μορίου της αιμοσφαιρίνης (Chou, 1989). Εικόνα 1.3: Μόριο αιμοσφαιρίνης (

12 Η λειτουργία της αιμοσφαιρίνης συνίσταται στη μεταφορά οξυγόνου από τους πνεύμονες στους ιστούς. Είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι περισσότερο από το 98% του οξυγόνου του συστημικού αρτηριακού αίματος είναι συνδεδεμένο με την αιμοσφαιρίνη. Ο βαθμός κορεσμού της αιμοσφαιρίνης με το οξυγόνο καθορίζεται κατά κύριο λόγο από τη μερική πίεση του οξυγόνου (P O2 ) στο αίμα. Όμως, η συγγένεια της αιμοσφαιρίνης με το οξυγόνο μειώνεται όταν αυξάνεται η μερική πίεση του διοξειδίου του άνθρακα (CO 2 ), η συγκέντρωση ιόντων υδρογόνου (δηλαδή μείωση του ph), η θερμοκρασία ή με δέσμευση του 2,3-διφωσφογλυκερινικού (DPG). Όπως προαναφέρθηκε, όταν ένα μόριο οξυγόνου δεσμευτεί από μία αίμη ευνοείται η πρόσδεση οξυγόνου και στις υπόλοιπες ομάδες αίμης του μορίου της αιμοσφαιρίνης. Σε αυτή την αλληλεπίδραση οφείλεται το γεγονός ότι η καμπύλη κορεσμού της αιμοσφαιρίνης με το οξυγόνο (Εικόνα 1.4) είναι μια σιγμοειδής καμπύλη (Vander et al., 2001). Εικόνα 1.4: Σιγμοειδής καμπύλη κορεσμού της αιμοσφαιρίνης με το οξυγόνο ( Σημειώνεται ότι η καμπύλη αποτελείται από ένα τμήμα με απότομη κλίση, μεταξύ 10 και 60 mmhg, και ένα σχετικά επίπεδο τμήμα, μεταξύ 60 και 100 mmhg. Έτσι, το πρώτο τμήμα της καμπύλης δείχνει ότι μεγάλα ποσά οξυγόνου μπορούν να δεσμευθούν ή να απελευθερωθούν με μικρή αύξηση ή ελάττωση της μερικής πίεσης οξυγόνου. Αυτό διευκολύνει την αιμοσφαιρίνη να λαμβάνει οξυγόνο από τους

13 πνεύμονες και να το ελευθερώνει στους ιστούς. Ενώ η σημασία του επίπεδου τμήματος της καμπύλης αποτελεί σημαντικό παράγοντα ασφάλειας για την παροχή οξυγόνου στους ιστούς όταν σημειώνεται μέτρια μείωση της κυψελιδικής και αρτηριακής μερικής πίεσης οξυγόνου. Ακόμη και εάν η μερική πίεση οξυγόνου μειωθεί στα 60 mmhg, η συνολική ποσότητα οξυγόνου που μεταφέρεται από την αιμοσφαιρίνη μειώνεται μόνο κατά 10%, καθώς η αιμοσφαιρίνη είναι κατά 90% κορεσμένη (Vander et al., 2001). 1.3 Τύποι αιμοσφαιρινών και μεταβολές στη βιοσύνθεση σφαιρινικών αλυσίδων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης Οι αλυσίδες σφαιρίνης που συντίθενται κατά τα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια του ανθρώπου, καθώς και ο αιμοποιητικός ιστός από τον οποίο παράγονται οι μορφές αυτές, διαφοροποιούνται κατά το εμβρυονικό, εμβρυικό και ενήλικο στάδιο της ανάπτυξης. Στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες τύπου-α συμπεριλαμβάνονται οι σφαιρίνες ζ και α, ενώ τύπου-β είναι οι σφαιρίνες ε, γ, δ και β (Patrinos and Antonarakis, 2010). Όπως παρουσιάζεται στην εικόνα 1.5, κατά το εμβρυονικό στάδιο παράγονται οι σφαιρίνες α, ζ και ε από το λεκιθικό ασκό. Έτσι, οι πρώτες αιμοσφαιρίνες του ανθρώπου είναι η Hb Gower 1 (ζ 2 ε 2 ), η Hb Gower 2 (α 2 ε 2 ) και η Hb Portland (ζ 2 γ 2 ), οι οποίες αντικαθίστανται σταδιακά από την HbF (α 2 γ 2 ), την εμβρυική αιμοσφαιρίνη, που παράγεται στο εμβρυϊκό ήπαρ. Οι σφαιρινικές αλυσίδες ζ και ε εξαφανίζονται μετά από 8 με 10 εβδομάδες της εμβρυϊκής ζωής (Wood, 1976). Η HbF από την όγδοη εβδομάδα της κύησης γίνεται κυρίαρχη και φθάνει σε ποσοστό 90% της ολικής αιμοσφαιρίνης, αλλά από τη δέκατη έκτη εβδομάδα σταδιακά μειώνεται έτσι ώστε μετά τη γέννηση και κατά την ενήλικο ζωή να είναι παρούσα σε ποσοστό περίπου 1% (Patrinos and Grosveld, 2008). Υπάρχουν δύο τύποι της αλυσίδας της γ-σφαιρίνης με παρόμοιες ιδιότητες, με αλανίνη στη θέση 136 ( Α γ) και με γλυκίνη στην ίδια αμινοξική θέση ( G γ), καθένας από τους δύο τύπους κωδικοποιείται από ένα διαφορετικό γονίδιο γ-σφαιρίνης που βρίσκονται εντός του συμπλέγματος γονιδίων σφαιρίνης τύπου-β (αναλύεται παρακάτω λεπτομερώς) (Schroeder and Huisman, 1978, Sankaran and Orkin, 2013). Τα ποσοστά βιοσύνθεσης των αλυσίδων G γ και Α γ κατά τον τοκετό είναι 70% και 30%, αντίστοιχα, ενώ λίγους μήνες αργότερα φθάνουν το 40% και 60%, αντίστοιχα. Υπάρχει και ένα επιπλέον είδος γ-σφαιρινικής αλυσίδας, με θρεονίνη (γ Τ ) αντί της

14 ισολευκίνης (γ Ι ) στην θέση 75 στην αλυσίδα της γ-σφαιρίνης, και συγκεκριμένα στη Α γ-σφαιρίνη, αυτό συμβαίνει με μία συχνότητα που κυμαίνεται έως 40% και ποικίλει στους ανθρώπινους πληθυσμούς (Schroeder and Huisman, 1978). Εικόνα 1.5: (α) Τετραμερή αιμοσφαιρίνης κατά τη διάρκεια του εμβρυονικού, εμβρυικού και ενήλικου αναπτυξιακού σταδίου (Patrinos and Antonarakis, 2010). (β) Σύνθεση β-τύπου αλυσίδας σφαιρίνης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και οι ιστοί που συμβάλλουν στην αιμοποίηση στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια (Sankaran and Orkin, 2013). Λίγο μετά τη γέννηση, υπάρχει μία μετάβαση από την κυριαρχία της έκφρασης της HbF σε εκείνη της αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων (HbA), η οποία μεσολαβείται από τη μεταγραφική αλλαγή από τη γ- προς τη β-σφαιρίνη, στα ερυθροειδή προγονικά κυττάρα (Sankaran and Orkin, 2013). Η αιμοσφαιρίνη των

15 ενηλίκων, η HbΑ (α 2 β 2 ) μπορεί να εντοπίζεται ήδη σε έμβρυα κατά το στάδιο της έκτης με όγδοης εβδομάδας και κυριαρχεί κατά την ενήλικο ζωή με ποσοστό 92% περίπου (Wood, 1976). Η ερυθροποίηση μετατοπίζεται πλέον στο μυελό των οστών και εν μέρει στο σπλήνα (Sankaran and Orkin, 2013). Επιπλέον, όλοι οι ενήλικες φέρουν ένα μικρό ποσό (2,5%) της HbΑ 2 (α 2 δ 2 ), η οποία αρχίζει να συντίθεται λίγο πριν τη γέννηση. Μία μικρή ποσότητα της HbF, της τάξης του 1%, είναι επίσης παρούσα σε όλα τα άτομα μετά τη γέννηση (Patrinos and Grosveld, 2008). 1.4 Γονίδια σφαιρινών και οργάνωσή τους Η αλληλουχία αμινοξέων των αλυσίδων των σφαιρινών καθορίζεται από τα αντίστοιχα γονίδια σφαιρίνης. Τα ανθρώπινα γονίδια σφαιρίνης οργανώνονται σε πολυγονιδιακά συμπλέγματα, δηλαδή συμπλέγματα α-σφαιρινικών γονιδίων και β- σφαιρινικών γονιδίων (Patrinos and Antonarakis, 2010). Το σύμπλεγμα α-σφαιρινικών γονιδίων εντοπίζεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 16 (16p13.3) και περιλαμβάνει τα δύο γονίδια της α-σφαιρίνης, δηλαδή το α2 (HBA2) και το α1 (HBA1) γονίδιο σφαιρίνης, που αποδίδουν ένα πανομοιότυπο πρωτεϊνικό προϊόν, καθώς και το γονίδιο της ζ-σφαιρίνης (HBZ). Πιο αναλυτικά, όπως παρουσιάζεται στην εικόνα 1.6α, το σύμπλεγμα γονιδίων τύπου-α (με κατεύθυνση 5 προς το 3 ) περιλαμβάνει: το εμβρυονικό γονίδιο HBZ, ένα ψευδογονίδιο HBZP, δύο ψευδογονίδια α-σφαιρίνης, HBAP2 και HBAP1, δύο πανομοιότυπα λειτουργικά γονίδια α-σφαιρίνης, HBA2 και HBA1, και το γονίδιο της θ-σφαιρίνης με άγνωστη λειτουργία, HBQ (Lauer et al., 1980, Marks et al., 1986). Όσον αφορά το σύμπλεγμα β-σφαιρινικών γονιδίων, το οποίο βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 11 (11p15.5), περιλαμβάνει με κατεύθυνση 5 προς 3 : το εμβρυονικό γονίδιο ε-σφαιρίνης (ΗΒΕ), δύο εμβρυϊκά γονίδια γ- σφαιρίνης, G γ-(hbg2) και Α γ-(hbg1), το ψευδογονίδιο ψβ-σφαιρίνης (HBBP), το γονίδιο της δ-σφαιρίνης (HBD) και το γονίδιο της β-σφαιρίνης (ΗΒΒ) (Εικόνα 1.6β) (Fritsch et al., 1980). Παρουσιάζει ενδιαφέρον το γεγονός ότι η διάταξη 5' προς 3' των γονιδίων και στα δύο συμπλέγματα είναι με τη σειρά της οντογενετικής τους έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Yagi et al., 1986, Fritsch et al., 1980). Εκτενής ανάλυση της αλληλουχίας του DNA έχει διενεργηθεί σε όλα τα σφαιρινικά γονίδια, και οι πρωτογενείς τους αλληλουχίες έχουν χαρακτηριστεί

16 πλήρως. Έτσι, έχει δειχθεί ότι όλα τα γονίδια σφαιρίνης έχουν πολλές λειτουργικές ομοιότητες στην οργάνωσή τους. Πιο συγκεκριμένα, τρία εξώνια κωδικοποιούν τη αλληλουχία αμινοξέων της κάθε αλυσίδας σφαιρίνης, ενώ μεταξύ των εξωνίων 1 και 2 και μεταξύ των εξωνίων 2 και 3 παρεμβάλλονται τα εσώνια 1 και 2, αντίστοιχα (Εικόνα 1.6α,β) (Patrinos and Antonarakis, 2010). Εικόνα 1.6: (α) Το σύμπλεγμα γονιδίων σφαιρίνης τύπου-α βρίσκεται στο χρωμόσωμα 16. (β) Το σύμπλεγμα γονιδίων σφαιρίνης τύπου-β βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11 (Patrinos and Antonarakis, 2010). 1.5 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Η μεταγραφική ρύθμιση των συμπλεγμάτων των ανθρώπινων γονιδίων σφαιρίνης εξαρτάται από τη δομή της χρωματίνης (προαγωγή της μεταγραφής όταν η χρωματίνη βρίσκεται σε ανοιχτή διαμόρφωση, οι ιστόνες είναι ακετυλιωμένες και οι νησίδες CpG απομεθυλιωμένες) και επιτυγχάνεται με γειτονικά και απομακρυσμένα cis-ρυθμιστικά στοιχεία, δηλαδή ρυθμιστικές περιοχές στο DNA, ή trans-παράγοντες, δηλαδή ρυθμιστικές πρωτεΐνες που προσδένονται στα ρυθμιστικά στοιχεία (Lewin, 2004, Sawado et al., 2003). Τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία, όπως στοιχεία σε υποκινητές (promoters), ενισχυτές (enhancers), αποσιωπητές (silencers) και μονωτές (insulators), διέπουν την ορθή αναπτυξιακή έκφραση των επιμέρους γονίδιων σφαιρίνης. Κάθε γειτονικό ρυθμιστικό στοιχείο φέρει θέσεις δέσμευσης για ερυθροειδικούς και γενικούς (όπως οι TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE και οι πρωτεΐνες κυτταρικής οικονομίας CP1, SP1, AP1 και ΥΥ1) μεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι αλληλεπιδρούν με

17 συμπαράγοντες για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (Patrinos and Antonarakis, 2010). Ρυθμιστικά στοιχεία που απέχουν πολύ από τα σφαιρινικά γονίδια που ρυθμίζουν, όπως η υπερευαίσθητη περιοχή (Hypersensitive Site) HS-40 που βρίσκεται στο 5 άκρο του συμπλέγματος γονιδίων α-σφαιρίνης (Εικόνα 1.6α), καθώς και η περιοχή LCR (Locus Control Region) στο 5 άκρο του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης (Εικόνα 1.6β), συμβάλλουν σε υψηλό επίπεδο στην ελεγχόμενη ιστοειδική και αναπτυξιακή έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών. Πιο αναλυτικά, η περιοχή LCR του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης του ανθρώπου βρίσκεται 6-20 kb ανοδικά του γονιδίου ΗΒΕ (Εικόνα 1.6β), και αποτελείται από πέντε ερυθροειδικές υπερευαίσθητες περιοχές για τη DNάσηI (HS1-5) (Tuan et al., 1985, Forrester et al., 1986). Η σημαντικότερη ιδιότητα της LCR, που οφείλεται κυρίως στην περιοχή HS2 και λιγότερο στις HS3-4, είναι η ισχυρή ενεργότητα ενίσχυσης της μεταγραφής (Ney et al., 1990, Talbot and Grosveld, 1991). Επίσης, η HS3 της LCR συμμετέχει στη δημιουργία ανοιχτής δομής χρωματίνης (Ellis et al., 1996). Ακόμη, η LCR ελέγχει την έναρξη του χρόνου αντιγραφής των γονιδίων της β-σφαιρίνης (Simon et al., 2001, Dhar et al., 1989). Επιπλέον, κάθε γονίδιο σφαιρίνης πλαισιώνεται από ένα χαρακτηριστικό πρότυπο θέσεων που δεσμεύονται οι μεταγραφικοί παράγοντες, δηλαδή από το πλαίσιο ΤΑΤΑ, το πλαίσιο CCAAT και το πλαίσιο CACCC, τα οποία αποτελούν τα γειτονικά cis-ρυθμιστικά στοιχεία (Εικόνα 1.7). Οι αλληλουχίες των υποκινητών των γονιδίων HBG2 και HBG1 περιέχουν (σε φορά 5 >3 ) ένα πλαίσιο CACCC, δύο πλαίσια CCAAT και το πλαίσιο ΤΑΤΑ (Εικόνα 1.7). Σε ένα μικρό ποσοστό ενηλίκων ατόμων οι υποκινητές των γονιδίων γ- σφαιρίνης φέρουν πολλές μεταλλάξεις που οδηγούν στην διατήρηση υψηλών επιπέδων εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε ενήλικες, μία κληρονομική κατάσταση που είναι γνωστή ως κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin - HPFH). Αυτές οι μεταλλάξεις έχουν συμβάλει στην ενίσχυση της κατανόησης των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη μείωση της έκφρασης των γονιδίων γ-σφαιρίνης σε ενήλικες. Ο υποκινητής του γονιδίου HBB περιέχει (σε φορά 5 >3 ) δύο πλαίσια CACCC, ένα πλαίσιο CCAAT και ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ (Εικόνα 1.7). Είναι γνωστό ότι μεταλλάξεις στο πλησιέστερο στη θέση έναρξης της μεταγραφής από τα δύο πλαίσια CACCC προκαλούν β-μεσογειακή αναιμία (Orkin et al., 1982, Orkin et al.,

18 1984). Επίσης, μεταλλάξεις στο πλαίσιο ΤΑΤΑ προκαλούν ήπια β-μεσογειακή αναιμία. Εικόνα 1.7: Οι υποκινητές των γονιδίων HBE, HBG2, HBG1 και HBB περιέχουν τουλάχιστον ένα αντίγραφο των πλαισίων CACCC, CCAAT και TATA με προσανατολισμό 5 προς 3 (Patrinos and Antonarakis, 2010). Τα γειτονικά ρυθμιστικά στοιχεία πιστεύεται ότι αλληλεπιδρούν με την LCR για την επίτευξη του ελέγχου της έκφρασης των επιμέρους γονιδίων στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια σε ένα καλά οργανωμένο ενεργό κέντρο χρωματίνης (Active Chromatin Hub - ACH) (Tolhuis et al., 2002, Palstra et al., 2003, Patrinos et al., 2004). Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την έκφραση των γονίδιων της β-σφαιρίνης του ανθρώπου θα ανοίξει νέες προοπτικές που θα οδηγήσουν προς νέες θεραπευτικές στρατηγικές για ασθενείς με β- αιμοσφαιρινοπάθειες. Το σύμπλεγμα γονιδίων β-σφαιρίνης του ανθρώπου έχει δύο αναπτυξιακές μεταγωγές ή μεταστροφές, μία από το εμβρυονικό στο εμβρυϊκό στάδιο και μία από το εμβρυϊκό στο ενήλικο στάδιο. Έχει διαπιστωθεί ότι η ρύθμιση των γονιδίων β-σφαιρίνης ελέγχεται από ένα διπλό ρυθμιστικό μηχανισμό που εμπλέκει τη γονιδιακή αποσιώπηση των γονίδιων τα οποία είναι δραστικά κατά το προηγούμενο αναπτυξιακό στάδιο (Chen et al., 2008, Luo et al., 2004, Stamatoyannopoulos et al., 1993, Dillon and Grosveld, 1991) και το γονιδιακό ανταγωνισμό για την ενεργοποίηση από την LCR (Enver et al., 1990) (Εικόνα 1.8)

19 Εικόνα 1.8: Σχηματικό διάγραμμα του διπλού ρυθμιστικού μηχανισμού, που διέπει τη μεταγραφή των γονιδίων σφαιρίνης του ανθρώπου. Το εμβρυονικό γονίδιο HBE εκφράζεται κατά τη διάρκεια της πρωτογενούς αιμοποίησης. Από τη μετάβαση από την πρωτογενή στις αρχές της οριστικής αιμοποίησης, το HBE αποσιωπάται αυτόνομα και τα γονίδια HBG1 και HBG2 ενεργοποιούνται. Τέλος, η αποσιώπηση των εμβρυϊκών γονιδίων σφαιρίνης συμβαίνει κατά τη μετάβαση της αιμοποίησης από τις αρχές έως τα τέλη του οριστικού ερυθροειδούς ιστού, όπου μεταγράφονται τα γονίδια HBD και το ΗΒΒ σε υψηλό επίπεδο. Σε αυτό το στάδιο, τα γονίδια HBG1 και HBG2 εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα (υποδηλώνεται με την διακεκομμένη γραμμή) (Patrinos and Antonarakis, 2010). 1.6 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στο γενετικό τόπο της β-σφαιρίνης Στην έκφραση των γονιδίων της β-σφαιρίνης, έχει αποδειχτεί πως επιδρούν γονιδιακοί τόποι που βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα με το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης (in cis) στο χρωμόσωμα 11 αλλά και άλλοι γενετικοί τόποι που βρίσκονται εκτός του χρωμοσώματος 11 και αλληλεπιδρούν με το σύμπλεγμα της β- σφαιρίνης in trans Cis-δραστικά στοιχεία Στις παραλλαγές που βρίσκονται εντός (cis) του συμπλέγματος των ανθρώπινων β- σφαιρινικών γονιδίων και αυξάνουν τα επίπεδα της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης συμπεριλαμβάνεται ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) rs (C>Τ) στη θέση -158 ζεύγη βάσεων (base pairs

20 bp) από τη θέση Cap του γονιδίου XmnI-Gγ (HBG2). Η μετάλλαξη αυτή φαίνεται να σηματοδοτεί παρά να συνδέεται με την αυξημένη παραγωγή των G γ αλυσίδων σε άτομα με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-μεσογειακή αναιμία, καθώς και με τα επίπεδα της bf. Ωστόσο, ορισμένες μελέτες δείχνουν ότι είναι ασυμβίβαστη με την αυξημένη έκφραση της bf και προκαλεί μέτρια αύξηση του πλήθους των F- κυττάρων σε υγιή άτομα (Gilman and Huisman, 1985, Merghoub et al., 1997, Lettre et al., 2008). Επιπροσθέτως, μια μετάλλαξη (C>G) στη θέση -202 bp ανοδικά της θέσης Cap του HBG2 ενδεχομένως να είναι υπεύθυνη για τα υψηλά επίπεδα της HbF σε άτομα με G γ-β + -HPFH που διαθέτουν υψηλά επίπεδα HbF (Collins et al., 1984). Επίσης, η μετάλλαξη (C>G) στη θέση -369 bp και η απουσία της απαλοιφής των νουκλεοτιδίων -396 bp ως -391 bp στο ίδιο γονίδιο συσχετίστηκε με υψηλότερα επίπεδα HbF (Shen et al., 1981, Barbosa et al., 2010). Ακόμη, στην ίδια κατηγορία ανήκει η απαλοιφή τεσσάρων ζευγών βάσεων (AGCA) μεταξύ των θέσεων -222 bp και -225 bp από το HBG1 που έχει δειχθεί ότι προκαλεί μειωμένη έκφραση του HBG1 σε ενήλικες (Gilman et al., 1988), καθώς και το SNP στη θέση -271 bp του γονιδίου HBG1 που συσχετίστηκε με τα επίπεδα της HbF (Barbosa et al., 2010). Επίσης, παραλλαγές στην υπερευαίσθητη στη DNάση I θέση 2 της περιοχής ελέγχου του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης (LCR-HS2) συσχετίζονται με το υψηλό επίπεδο έκφρασης της HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-μεσογειακή αναιμία, και προκαλούν μεγαλύτερη αύξηση του πλήθους των F-κυττάρων από την αντίστοιχη που προκαλεί ο πολυμορφισμός XmnI-Gγ (Merghoub et al., 1997, Oner et al., 1992) Trans-δραστικά στοιχεία Τα cis-δραστικά στοιχεία στο γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης εξηγούν σε ποσοστό μικρότερο του 25% τη μεταβλητότητα στα επίπεδα της HbF, ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό της διακύμανσης οφείλεται σε παράγοντες που δεν είναι συνδεδεμένοι με το γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης (Thein et al., 2007, Steinberg, 2009). Έτσι, οι μεταλλάξεις στην περιοχή του υποκινητή, που είναι σπάνιες, δεν μπορούν να εξηγήσουν την ευρεία διακύμανση που υπάρχει στο γενικό πληθυσμό με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Μελέτες που στοχεύουν στη ταυτοποίηση ρυθμιστών της παραγωγής της HbF που διεξήχθησαν σε άτομα με ετεροκυτταρική κληρονομική παραμονή της HbF (HPFH), δηλαδή άτομα με αυξημένα επίπεδα HbF άνισα

21 κατανεμημένα μεταξύ των F-κυττάρων, πρότειναν την απουσία σύνδεσης μεταξύ του καθοριστικού παράγοντα των επιπέδων της HbF και του συμπλέγματος γονιδίων β- σφαιρίνης (Gianni et al., 1983, Dover et al., 1992). Αργότερα, αναζητώντας γενετικά στοιχεία που συνδέονται με αυξημένα επίπεδα HbF σε υγιείς ενήλικες, αρκετές cisδραστικές παραλλαγές επί του συμπλέγματος των γονιδίων της β-σφαιρίνης θεωρήθηκαν λιγότερο σημαντικές, ενώ έγιναν γνωστές περιοχές μη συνδεδεμένες προς το γενετικό τόπο της β-σφαιρίνης (trans-δραστικά στοιχεία), όπως «γονιδιακοί τόποι ποσοτικών γνωρισμάτων» (Quantitative Trait Loci - QTL) στα χρωμοσώματα Xp22, 6q23, 8q και 2p16.1. Στο γεγονός αυτό συνέβαλε τόσο η βελτιωμένη γνώση για το ανθρώπινο γονιδίωμα, όσο και η ανάπτυξη νέων εργαλείων γονιδιωματικής. Γονιδιακοί τόποι ποσοτικών γνωρισμάτων (QTL) Οι γονιδιακοί τόποι ποσοτικών γνωρισμάτων είναι τμήματα του DNA που περιέχουν ή συνδέονται με γονίδια που ελέγχουν ένα ποσοτικό χαρακτηριστικό ή, αλλιώς, που συσχετίζονται με ένα συγκεκριμένο φαινοτυπικό χαρακτηριστικό. Ένα συγκεκριμένο φαινοτυπικό χαρακτηριστικό, που προσδιορίζεται συνήθως από πολλά γονίδια έτσι, πολλά QTL μπορούν να συνδεθούν με ένα μοναδικό γνώρισμα, όπως, στην προκειμένη περίπτωση, η συγκέντρωση της HbF στους ενήλικες. Επιπλέον, τα QTL που αφορούν ένα συγκεκριμένο φαινοτυπικό χαρακτηριστικό βρίσκονται συχνά σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Η έννοια των QTL και η σύνδεσή τους με γονίδια που καθορίζουν ένα δεδομένο γνώρισμα, εντάσσεται στο φαινόμενο της επίστασης, στο οποίο οι επιδράσεις ενός γονιδίου τροποποιούνται από ορισμένα άλλα γονίδια, που ονομάζονται και γονίδια-τροποποιητές. Γνωρίζοντας τον αριθμό των QTL που προκαλούν μια παραλλαγή σε ένα φαινοτυπικό γνώρισμα, γίνεται κατανοητό εάν ένα γνώρισμα καθορίζεται από πολλά γονίδια μικρής επίδρασης ή από λίγα γονίδια, που το καθένα ασκεί μεγάλη επίδραση στο γνώρισμα αυτό. Από την άλλη, η γνώση ότι μια περιοχή του γονιδιώματος αποτελεί QTL, συντελεί στο να εντοπιστούν υποψήφια γονίδια που επιδρούν σε ένα γνώρισμα. Μόλις μια περιοχή του DNA έχει διαπιστωθεί ότι συμβάλλει σε φαινότυπο, μπορεί να προσδιοριστεί η αλληλουχία της. Η αλληλουχία του DNA των γονιδίων στην περιοχή αυτή μπορεί στη συνέχεια να συγκριθεί με μια βάση δεδομένων DNA για τα γονίδια των οποίων η λειτουργία είναι ήδη γνωστή

22 Η χαρτογράφηση περιοχών του γονιδιώματος που περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται σε ένα ποσοτικό γνώρισμα, όπως τα επίπεδα της HbF, επιτελείται με τη χρήση «μοριακών δεικτών» (molecular tags), όπως οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP). Αυτό αποτελεί ένα πρώτο βήμα στην ταυτοποίηση και αλληλούχιση των γονιδίων που διέπουν την παραλλαγή ενός γνωρίσματος. Ο προσδιορισμός των QTL, αλλά και η ταυτοποίηση των γονιδίων τους, μπορεί να προσφέρει γνώσεις για trans-δραστικά στοιχεία που εμπλέκονται στη μεταστροφή από την εμβρυική αιμοσφαιρίνη σε εκείνη των ενηλίκων και, ενδεχομένως, να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για την φαρμακολογική επανενεργοποίηση της HbF, δεδομένου ότι τα υψηλά επίπεδα της HbF είναι ευεργετικά για τους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β- μεσογειακή αναιμία QTL στo χρωμόσωμα Xp22 Ο Dover και οι συνεργάτες του χρησιμοποιώντας δοκιμασίες μικροσκοπίας ακτινωτής ανοσοδιάχυσης (microscopic ra ia immu o i usio ) και ανοσοφθορίζουσας κυτταρομετρίας ροής για τον προσδιορισμό του ποσοστού των F- δικτυοκυττάρων και των F-κυττάρων σε άτομα με δρεπανοκυτταρική αναιμία και σε μη-αναιμικά άτομα, παρατήρησαν ότι τα επίπεδα των F-κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερα στις μη-αναιμικές γυναίκες από ότι στους άνδρες. Επίσης, η παραγωγή των F-κυττάρων, όπως προσδιορίζεται από τα επίπεδα των F-δικτυοκυττάρων σε γυναίκες με δρεπανοκυτταρική αναιμία, ήταν επίσης υψηλότερη από ότι στους αντίστοιχους άνδρες. Έλεγξαν την υπόθεση ότι η παραγωγή των F-κυττάρων, τόσο σε φυσιολογικά άτομα όσο και σε άτομα με δρεπανοκυτταρική αναιμία, ελέγχεται από έναν τόπο στο χρωμόσωμα Χ. Με ανάλυση σύνδεσης (linkage analysis), χρησιμοποιώντας πολυμορφικές θέσεις περιορισμού κατά μήκος του Χ χρωμοσώματος σε οκτώ οικογένειες με δρεπανοκυτταρική αναιμία και σε μία οικογένεια υγιών ατόμων εντοπίστηκε ο τόπος παραγωγής F-κυττάρου (F-cell production, FCP) στο χρωμόσωμα Xp22.2. Τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι τα φυλοσύνδετα αλληλόμορφα FCP συνεπικρατούν και δεν υπόκεινται σε X- αδρανοποίηση. Προηγούμενα στοιχεία δείχνουν ότι το 70% της διακύμανση των επιπέδων της HbF στη δρεπανοκυτταρική αναιμία οφείλεται στη διακύμανση του

23 ποσοστού επί τοις εκατό των δικτυοκυττάρων, και το ποσοστό αυτό ελέγχεται τουλάχιστον μερικώς από τον FCP τόπο στο χρωμόσωμα X (Dover et al., 1992). Ο μηχανισμός με τον οποίο ο FCP τόπος επιδρά στην παραγωγή των F- κυττάρων είναι άγνωστος. Trans-δραστικές πρωτεΐνες προσδένονται σε περιοχές ενισχυτή ή υποκινητή του β-σφαιρινικού συμπλέγματος, τροποποιώντας, έτσι, την έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών (Dover et al., 1992). Ένας από τους κυριότερους ρυθμιστικούς παράγοντες της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών, ο GATA-1, κωδικοποιείται από ένα γονίδιο εντοπισμένο στο χρωμόσωμα Χ, στη περιοχή Xp21.1 (Zon et al., 1990). Κι άλλος ένας παράγοντας που επηρεάζει την διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων in vitro, έχει εντοπιστεί στο Xp (Huebner et al., 1986). Εφόσον εξετάστηκαν καλά καθορισμένες οικογένειες στις οποίες δεν παρουσιάζεται καμιά σύνδεση του FCP τόπου με τη κεντρομερική περιοχή του Xp21.1, τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο FCP τόπος αντιπροσωπεύει ένα αυτοτελές γονίδιο στο Χ χρωμόσωμα, το οποίο δεν αντιστοιχεί σε κανένα από τα δύο προαναφερθέντα γονίδια (Dover et al., 1992). Σε μία πρόσφατη μελέτη πραγματοποιήθηκε γονοτυπικός προσδιορισμός SNP σε QTL που έχουν συνδεθεί με τη συγκέντρωση της HbF στο χρωμόσωμα Xp22.2, και σε υποψήφια γονίδια που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα επίπεδα της HbF σε άτομα με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Αρχικά, έλεγξαν τη σύνδεση των SNP με την HbF σε μια ομάδα, και επικύρωσαν τα αποτελέσματα σε μια δεύτερη ανεξάρτητη ομάδα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δύο SNP στο QTL του χρωμοσώματος Xp22.2, και συγκεκριμένα στο γονίδιο GPM6B που εκφράζει τη μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη νευρώνων Μ6Β στους νευρώνες και στη νευρογλοία, συσχετίσθηκαν με την HbF στην πρώτη ομάδα. Επίσης, αυτό επιβεβαιώθηκε από τη δεύτερη ομάδα. Οι μελέτες αυτές επιβεβαιώνουν προηγούμενες αναλύσεις που δείχνουν ότι SNP στο γονίδιο GPM6B συσχετίζονται με τα επίπεδα της HbF (Sebastiani et al., 2008) QTL στo χρωμόσωμα 2p16.1 Ο Menzel και οι συνεργάτες του, το 2007, εφάρμοσαν μία στρατηγική γονιδιωματικής χαρτογράφησης μέσω γενετικής σύνδεσης τόπων σε άτομα με αντίθετα ακραίες τιμές αριθμού F-κυττάρων και χαρτογράφησαν ένα νέο τόπο ποσοτικού γνωρίσματος F-κυττάρων στο γονίδιο BCL11A, το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη τύπου-c2h2 με δακτύλιο ψευδαργύρου, στο χρωμόσωμα 2p16.1 (Menzel

24 et al., 2007). Κοινά SNP στο τόπο του BCL11A έχουν συσχετισθεί, στο παρελθόν, με το επίπεδο διακύμανσης της HbF σε μη-αναιμικούς ευρωπαϊκούς πληθυσμούς. Ο U a και οι συνεργάτες του (2008) κατέδειξαν μια σχέση μεταξύ ενός SNP στο BCL11A και των επιπέδων της HbF σε μία ομάδα ατόμων με δρεπανοκυτταρική αναιμία, ενώ λίγο αργότερα η ίδια ερευνητική ομάδα προσδιόρισε και άλλα SNP (rs , rs , rs ) σε Αφροαμερικανούς και Βραζιλιάνους με δρεπανοκυτταρική αναιμία (Lettre et al., 2008). Το γονίδιο BCL11A εμπλέκεται στη μυελογενή λευχαιμία και στην παθογένεση του λεμφώματος. Μελέτες σε ποντίκια έχουν δείξει ότι το γονίδιο Bcl11a είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των Τ και Β κυττάρων. Η BCL11A έχει επίσης εμπλακεί στην απακετυλίωση ιστόνης και στη μεταγραφική καταστολή σε κύτταρα θηλαστικών (Senawong et al., 2005). Εικάζεται ότι η απορύθμιση της έκφρασης του BCL11A μπορεί να επηρεάσει την παραγωγή των F-κυττάρων επηρεάζοντας την κινητική και την ερυθροποίηση (Bank, 2006). Η ποικιλομορφία στην ποσότητα των F-κυττάρων, και κατά επέκταση στα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, που αποδόθηκε στο BCL11A ανέρχεται στο 15,1% στους Ευρωπαίους (Menzel et al., 2007). Αντίθετα, στους Κινέζους ετεροζυγώτες με β-μεσογειακή αναιμία η διακύμανση της HbF που προκύπτει από τον πολυμορφισμό στο BCL11A είναι στο 6,4% (Farrell et al., 2011) QTL στo χρωμόσωμα 8q Ο Garner και οι συνεργάτες του (2002) προσδιόρισαν, μέσω ανάλυσης δεδομένων δεικτών γονιδιωματικής κλίμακας (g om wi mark rs), σε μία μεγάλη οικογένεια Ινδών, ένα QTL στο χρωμόσωμα 8q, το οποίο αλληλεπιδρά με την περιοχή XmnI-Gγ. Επίσης, έδειξαν ότι αλληλεπίδραση μεταξύ της περιοχής XmnI-Gγ και ενός QTL στο 8q επηρεάζει την παραγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (Garner et al., 2002). Δύο χρόνια αργότερα, οι ίδιοι ανέφεραν τη σύνδεση της περιοχής XmnI- Gγ με το 8q σε δείγματα διδύμων από την Ευρώπη, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι στο χρωμόσωμα 8q υπάρχει ένα QTL, το οποίο επηρεάζει την αναπτυξιακή μετάβαση από την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη στην αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων (Garner et al., 2004). Ακόμη, πέντε SNP στο γονίδιο TOX που βρίσκεται στο QTL της χρωμοσωματικής περιοχής 8q12.1 έχουν συνδεθεί με την HbF (Steinberg, 2009)

25 Πρόσφατα δεδομένα από την ομάδα μας (Borg, Phy acti s, Bartsakou ia και συνεργάτες) δείχνουν ότι η έκφραση του γονιδίου KLF10 που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8q22.3 συνδέεται με τα υψηλά επίπεδα εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, καθώς και με την απόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία σε ασθενείς με β- αιμοσφαιρινοπάθεια. Πιο συγκεκριμένα, συσχέτισαν το SNP rs (c.*141c>t) που βρίσκεται στην 3 αμετάφραστη περιοχή (3'-UTR) του γονιδίου KLF10, με τη βαρύτητα της νόσου της β-μεσογειακής αναιμίας, αναλύοντας μια μεγάλη ομάδα ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (χαμηλά επίπεδα HbF), με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία (υψηλά επίπεδα HbF) και με μη-θαλασσαιμικά άτομα. Το σπάνιο αλληλόμορφο (Τ) βρέθηκε λιγότερο συχνά στα δείγματα με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία, σε σχέση με τα δείγματα με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, και μόνο στην ετερόζυγη κατάσταση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρουσία του Τ αλληλόμορφου μπορεί να συσχετίζεται με χαμηλά επίπεδα της bf στο πλαίσιο της β-μεσογειακής αναιμίας (Borg et al., 2012) QTL στo χρωμόσωμα 6q23 Ο Craig και οι συνεργάτες του, το 1996, μελέτησαν μία μεγάλη οικογένεια Ινδών, που περιλαμβάνει άτομα με ετεροκυτταρική HPFH, χρησιμοποιώντας μια στρατηγική γενετικής χαρτογράφησης και στατιστικές μεθόδους που υπολογίζουν ταυτόχρονα τις επιδράσεις αρκετών γενετικών παραγόντων. Τελικά δύο δείκτες (D6S262 και D6S314) οριοθέτησαν την περιοχή 6q22.3-q24. Έτσι, απέδειξαν ότι υπάρχει ένας σημαντικός γενετικός παράγοντας για την παραγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6q, δηλαδή ένα QTL στο χρωμόσωμα 6q (Craig et al., 1996). Αργότερα, μελετώντας και άλλα μέλη της οικογένειας με ετεροκυτταρική HPFH, β-μεσογειακή αναιμία και α-μεσογειακή αναιμία, για περισσότερους δείκτες, η ανάλυση έδειξε στενή σύνδεση του QTL με δύο από αυτούς τους δείκτες (D6S976 και D6S270). Επίσης, σημαντικά γεγονότα ανασυνδυασμού τοποθέτησαν το συγκεκριμένο QTL εντός ενός διαστήματος 1-2 cm (centimorgan, μονάδα μέτρησης της γενετικής απόστασης), το οποίο βρίσκεται σε μία περιοχή περίπου 1,5 Mb μεταξύ των δύο δεικτών. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν σημαντικές ενδείξεις για την παρουσία, στο χρωμόσωμα 6q23, ενός QTL που διαμορφώνει την παραγωγή της HbF και των F-κυττάρων (Garner et al., 1998). Σε συνεργασία με το Sanger Centre, στο Cambridge, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση

26 ενός γενετικά ολοκληρωμένου χάρτη επικάλυψης βακτηριακών τεχνητών χρωμοσωμάτων (BAC) και Ρ1 τεχνητών χρωμοσωμάτων (PAC) που εκτείνονται σε 3 Mb του 6q23 και συμπεριλαμβάνει το γνωστό γονίδιο MAP3K5 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5), που εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα, και μία περιοχή 800 kb, η οποία προσδιορίστηκε με ανάλυση απλότυπου, και περιέχει το πρωτοογκογονίδιο MYB και το γονίδιο HBS1L (Game et al., 2000). Η παραπάνω αλληλουχία διευκρινίστηκε πλήρως, στη συνέχεια, από τη χαρτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος, που ολοκληρώθηκε το Η ίδια ερευνητική ομάδα περιέγραψε με μεγαλύτερη λεπτομέρεια την υποψήφια περιοχή που εδράζεται στη κυτταρογενετική ζώνη 6q23.2, η οποία έχει φυσικό μήκος bp (~ 1,5 Mb) και ορίζεται από τους δείκτες D6S270 και DbAD6 (αυτός ο δείκτης βρίσκεται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου PDE7B). Η εν λόγω περιοχή αποδείχθηκε ότι περιέχει πέντε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και τέσσερα RNA γονίδια (Εικόνα 1.9). Πιο συγκεκριμένα, τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες είναι τα AHI1, ΜΥΒ, ALDH8A1, HBS1L και PDE7B. Σε κανένα από τα γονίδια αυτά δεν εντοπίζονται μη συνώνυμες μεταλλάξεις, ενώ τρία από αυτά (HBS1L, ΜΥΒ και AHI1) εκφράζονται στα ερυθροειδή προγονικά κύτταρα (Close et al., 2004). Εικόνα 1.9: Η κυτταρογενετική ζώνη 6q23.2, έκτασης ~ 1,5 Mb, ορίζεται από τους δείκτες D6S270 και DbAD6, και περιέχει πέντε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (μαύρα βέλη) και τέσσερα RNA γονίδια (πράσινα βέλη). Με βέλη κόκκινου χρώματος απεικονίζονται τα ψευδογονίδια. Η κατεύθυνση των βελών υποδεικνύει τη μεταγραφική κατεύθυνση (5' 3') των γονιδίων (Carter et al., 2002). Επίσης, ο Wyszynski και οι συνεργάτες του, το 2004, προσδιόρισαν το γονότυπο περισσότερων από 180 SNP που εδράζονταν σε 38 γονίδια από δείγματα 280 ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Ο σκοπός ήταν να διαλευκανθεί η έντονη διακύμανση που παρατηρείται στα επίπεδα της bf σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Η ισχυρότερη συσχέτιση με τα επίπεδα της HbF βρέθηκε

27 να είναι με SNP κοντά στο QTL της περιοχής 6q22.3-q23.2. Αρχικά, δύο SNP προσδιορίστηκαν σε διαγονιδιακά τμήματα αυτού του QTL και συσχετίσθηκαν με μεταβολή περίπου 20% στην HbF. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε γονοτυπική ανάλυση σε 44 επιπλέον SNP στη γονιδιωματική περιοχή μεταξύ 136,1 Mb και 137,5 Mb στο χρωμόσωμα 6q. Δώδεκα SNP, που συσχετίζονται με μια διαφορά 20-30% στις συγκεντρώσεις της HbF, βρίσκονται στα εσώνια των γονιδίων PDE7B, MAP7, MAP3K5 και PEX7. Ακόμη, γενετικά στοιχεία πλησίον του 6q22.3-q23.2 QTL, ενδεχομένως να υποκρύπτουν trans-δρώντα στοιχεία, τα οποία συμβάλλουν στη διαμόρφωση του βασικού επιπέδου της HbF στη δρεπανοκυτταρική αναιμία (Wyszynski et al., 2004). Επιπλέον, τα γονίδια εντός της περιοχής 6q22-23 δείχθηκε να σχετίζονται με την απόκριση στην θεραπεία με υδροξυουρία (hydroxyurea - HU), η οποία επιφέρει αύξηση των επιπέδων της bf, σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο αυτό το QTL στη χρωμοσωμική περιοχή 6q22-23 επηρεάζει τα επίπεδα της bf στο πλαίσιο της θεραπείας με υδροξυουρία παραμένει άγνωστος (Ma et al., 2007). Τα γονίδια HBS1L και ΜΥΒ και η διαγονιδιακή τους περιοχή Από τα παραπάνω, προκύπτει ότι το συγκεκριμένο QTL περιλαμβάνει αρκετά γονίδια συμπεριλαμβανομένου του HBS1L, ενός μέλους της οικογένειας πρωτεϊνών δέσμευσης του GTP. Το HBS1L εκφράζεται σε προγονικά κύτταρα των ερυθροκυττάρων. Σε μία μελέτη σύνδεσης υψηλής ανάλυσης, προσδιορίστηκαν πολλαπλές γενετικές παραλλαγές που συνδέονται έντονα με τα επίπεδα των F- κυττάρων σε ζεύγη μη-θαλασσαιμικών διδύμων με καταγωγή από τη Βόρεια Ευρώπη (P=10-75 ). Αυτές οι γενετικές παραλλαγές εδράζονται σε τρεις περιοχές ανισορροπίας σύνδεσης (linkage disequilibrium - LD): 1) εντός του HBS1L, 2) στην αμετάφραστη 5 περιοχή του γονιδίου HBS1L, καθώς και 3) στην περιοχή του ΜΥΒ, δηλαδή στη διαγονιδιακή περιοχή που αναφέρεται ως «HBS1L-MYB Intergenic Polymorphism (HMIP) blocks 1, 2, 3», η οποία εκτείνεται σε ένα τμήμα μήκους 79 kb, ξεκινώντας από 188 bp ανοδικά του εξωνίου 1 του HBS1L και καταλήγοντας 45 kb ανοδικά του MYB, στο 6q23. Για την οριοθέτηση της λειτουργικής σημασίας αυτών των γενετικών παραλλαγών, εξετάστηκε η μεταβολή της έκφρασης των γονιδίων HBS1L και ΜΥΒ κατά τη διάρκεια της ερυθροποίησης, όπου παρατηρήθηκε μια εντυπωσιακή

28 συσχέτιση αυξημένης έκφρασης του HBS1L σε ερυθροειδή προγονικά κύτταρα με την παρουσία των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP) που συνδέονται με υψηλές τιμές γνωρίσματος (high trait va u s) στις τρεις περιοχές LD. Με βάση την ανάλυση απλοτύπου, το 17,6% της διακύμανσης των F-κυττάρων στους βόρειους Ευρωπαίους αποδίδεται στην περιοχή HBS1L-ΜΥΒ, ενώ το ποσοστό για τους ετερόζυγους ως προς τη β-μεσογειακή αναιμία Κινέζους είναι 13,5% (Thein et al., 2007, Farrell et al., 2002). Ακολούθως, διεξήχθη γονοτυπικός προσδιορισμός ορισμένων SNP, εντός της διαγονιδιακής περιοχής HBS1L-ΜΥΒ, προκειμένου να μελετηθεί η συσχέτιση των εν λόγω SNP με τα επίπεδα της HbF σε Αφροαμερικανούς και Βραζιλιάνους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Πράγματι, αποδείχθηκε η συσχέτιση μεταξύ των rs , rs , rs και rs στους Αφρο-αμερικανούς και των rs , rs , rs στους Βραζιλιάνους με τα επίπεδα της HbF. Ακόμη, φάνηκε ότι οι γενετικές παραλλαγές στη διαγονιδιακή περιοχή HBS1L-ΜΥΒ εξηγούν ένα 3-7% της διακύμανσης των επιπέδων της HbF σε Αφρο-αμερικανούς και Βραζιλιάνους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (Lettre et al., 2008). Η διαγονιδιακή περιοχή HBS1L-ΜΥΒ περιέχει μία ρυθμιστική απομακρυσμένη περιοχή, η οποία ενδεχομένως να είναι σημαντική στην αιμοποίηση ελέγχοντας την έκφραση του ΜΥΒ, καθώς και αρκετές θέσεις σύνδεσης για το θεμελιώδη μεταγραφικό παράγοντα των ερυθροκυττάρων, τον GATA-1 (Wahlberg et al., 2009). Επίσης φέρει και ένα ενισχυτικό στοιχείο, το οποίο μπορεί να ρυθμίζει τα επίπεδα της HbF μέσω της σύνδεση του GATA-1. Πιο συγκεκριμένα, με αναλύσεις ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP) αποκαλύφθηκε δέσμευση μεταγραφικών παραγόντων που συνδέονται με την ερυθροποίηση κοντά σε έναν πολυμορφισμό απαλοιφής 3 bp, που βρίσκεται μεταξύ των βάσεων και στη χρωμοσωματική περιοχή 6q23. Η αλληλουχία που περιβάλλει τον πολυμορφισμό απαλοιφής των 3 bp έχει δραστικότητα ενισχυτή. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι αυτός ο πολυμορφισμός πιθανότατα ρυθμίζει τα επίπεδα της HbF τόσο στους Κινέζους, όσο και στους Ευρωπαίους και Αφρικανούς. Όπως έχει επίσης προταθεί, η λειτουργία αυτού του QTL δεν πραγματοποιείται απαραίτητα μέσω της άμεσης μεταγραφικής ρύθμισης του ΜΥΒ (Farrell et al., 2002). Επιπλέον, μη συνώνυμες μεταλλάξεις στο HBS1L-ΜΥΒ, που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, αύξησαν το ποσοστό των επιπέδων της HbF το οποίο οφείλεται σε γενετικούς παράγοντες (Galarneau et al., 2010)

29 Το γονίδιο AHI1 Το γονίδιο AHI1 ταυτοποιήθηκε από τον C os και τους συνεργάτες του, το 2004, εντός του τμήματος 1,5 Mb της χρωμοσωματικής περιοχής 6q23.2. Αρχικά, αποκάλυφθηκε η ύπαρξη επτά μεταγράφων, ενώ σήμερα, και σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Ensembl ( υπάρχουν συνολικά 17 μετάγραφα, με το κύριο μετάγραφο να αντιστοιχεί σε ένα cdna μήκους bp, το οποίο φέρει 28 εξώνια. Μία νησίδα CpG καλύπτει το εξώνιο 1 του γονιδίου. Το πολυπεπτίδιο που κωδικοποιείται από το γονίδιο αποτελείται από αμινοξέα με μοριακό βάρος περίπου 136 kda. Επίσης, στην περιοχή των εξωνίων 13 ως 18 βρίσκονται έξι επαναλήψεις της λειτουργικής περιοχής WD40 και στην περιοχή των εξωνίων 23 και 24 βρίσκεται η λειτουργική περιοχή SH3 (Src-homology 3). Οι επαναλήψεις WD40 και η λειτουργική περιοχή SH3 πιστεύεται ότι αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες, σχηματίζοντας μεγάλα πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα (Close et al., 2004). Πρόσφατα, βρέθηκε ότι AHI1 είναι συστατικό ενός πρωτεϊνικού συμπλόκου στο βασικό σωμάτιο των βλεφαρίδων. Αυτό το σύμπλοκο δρα ως εμπόδιο για τον περιορισμό της διάχυσης πρωτεϊνών μεταξύ κυτταροπλάσματος και των μεμβρανών των βλεφαρίδων (Chih et al., 2012). Το γονίδιο ALDH8A1 Το ALDH8A1 αρχικά αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας μία λειτουργική προσέγγιση για τον εντοπισμό γονιδίων που είναι υπεύθυνα για το μεταβολισμό του αμφιβληστροειδούς. Το γονίδιο, σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Ensembl ( παράγει έξι μετάγραφα. Το κύριο μετάγραφο αντιπροσωπεύεται από ένα cdna bp, το οποίο αποτελείται από επτά εξώνια που εξαπλώνονται σε περίπου 30 kb στη χρωμοσωματική περιοχή 6q23.2 και μεταφράζεται σε πρωτεΐνη με 487 αμινοξέα. Το γονίδιο ALDH8A1 εκφράζεται σε μια ποικιλία ιστών, συμπεριλαμβανομένων των ερυθροκυττάρων και του μυελού των οστών (Close et al., 2004). Το γονίδιο MAP7 Από το γονίδιο MAP7 προκύπτουν πέντε μετάγραφα, εκ των οποίων το κύριο έχει μήκος bp, αποτελείται από πέντε εξώνια που βρίσκονται στη

30 χρωμοσωμική περιοχή 6q23 σε περίπου 200 kb και μεταφράζεται σε πρωτεΐνη με 749 αμινοξέα [δεδομένα από Ensembl: ( Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο MAP7 είναι η πρωτεΐνη 7 που συσχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους (Microtubule-Associated Protein 7) και εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης. Τέτοιου είδους πρωτεΐνες θεωρείται ότι εμπλέκονται στη δυναμική των μικροσωληνίσκων, κάτι απαραίτητο για την κυτταρική πόλωση και διαφοροποίηση. Αποδείχτηκε πως αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να σταθεροποιήσει τους μικροσωληνίσκους, και μπορεί να τροποποιήσει τις λειτουργίες τους. Επίσης, εμπλέκεται σε λειτουργίες των μικροσωληνίσκων που απαιτούνται για τη σπερματογένεση (Wyszynski et al., 2004, Komada et al., 2000). Τα SNP εντός του MAP7 που έχουν συσχετιστεί με σημαντική μεταβολή του εκατοστιαίου ποσοστού της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης είναι τα rs , rs , rs997139, rs Από αυτά με σημαντική μεταβολή της ποσότητας της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε γραμμάρια έχουν συσχετιστεί τα rs και rs Ο απλότυπος C-T-T-T για τα SNP στo γονίδιο της MAP7 συσχετίστηκε σημαντικά με την αύξηση των συγκεντρώσεων της HbF (Wyszynski et al., 2004). Το γονίδιο PEX7 Το 1997, ο Braverman και οι συνεργάτες του χαρτογράφησαν το γονίδιο PEX7 στη χρωμοσωμική περιοχή 6q22-q24 (Braverman et al., 1997). Από το γονίδιο PEX7 προκύπτουν τρία μετάγραφα, εκ των οποίων το κύριο μετάγραφο έχει μήκος bp, αποτελείται από 10 εξώνια που βρίσκονται στη χρωμοσωματική περιοχή 6q23 σε έκταση 91,56 kb (δεδομένα από Ensembl: Το γονίδιο PEX7 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 323 αμινοξέων (peroxisomal biogenesis factor 7) που ανήκει στην ομάδα των PEX πρωτεϊνών [peroxisomal assembly (PEX) proteins]. Μέσα στα κύτταρα αυτές οι πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για την εισαγωγή συγκεκριμένων ενζύμων μέσα στα υπεροξειδιοσώματα (peroxisomes). Τα ένζυμα αυτά διασπούν πολλές διαφορετικές ουσίες, όπως λιπαρά οξέα και ορισμένα τοξικά σύμπλοκα. Στο γονίδιο της PEX7, τα SNP που έχουν συσχετιστεί με σημαντική μεταβολή του ποσοστού της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, αλλά και με μεταβολή της ποσότητας της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε γραμμάρια είναι τα rs , rs και rs Ο απλότυπος T-C-C

31 όσον αφορά στα SNP του PEX7 συσχετίστηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης της HbF (Wyszynski et al., 2004). Το γονίδιο PDE7B Το γονίδιο PDE7B, που βρίσκεται στη χρωμοσωματική περιοχή 6q (Εικόνα 1.10), παράγει δύο μετάγραφα, όπου το κύριο μετάγραφο κωδικοποιεί τη φωσφοδιεστεράση 7Β (PDE7B), η οποία στον άνθρωπο αποτελείται από 450 αμινοξέα. Το ενεργό κέντρο της PDE7B εντοπίζεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων 667 και 1413 και το mrna του PDE7B είναι bp, το οποίο αποτελείται από 13 εξώνια που εξαπλώνονται σε περίπου 343,88 kb στο γονιδίωμα, σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Ensembl ( Εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στο πάγκρεας και, ακολούθως, στον εγκέφαλο, στην καρδιά, στο θυρεοειδή αδένα, στους σκελετικούς μύες, στα μάτια, στις ωοθήκες, στον υπογνάθιο αδένα, στην επιδιδυμίδα, στο ήπαρ και στα προγονικά κύτταρα των ερυθροκυττάρων (Hetman et al., 2000). Το PDE7B, όπως αναφέρεται προηγουμένως, συνδέεται με τα επίπεδα της συγκέντρωσης της HbF (Wyszynski et al., 2004), καθώς και με μια απόλυτη αύξηση (g/dl) της HbF κατά τη θεραπεία με HU σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (Ma et al., 2007). Επίσης, το γεγονός ότι η PDE7B εμπλέκεται στην οδό που εξαρτάται από την κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη (camp), η οποία φαίνεται να αυξάνει την έκφραση του γονιδίου της γ-σφαιρίνης και, συνεπώς τα επίπεδα της HbF, σε ενήλικες με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία, συνδέει το γονίδιο PDE7B με την έκφραση της HbF (Bailey et al., 2007). Ακολούθως, η ερευνητική μας ομάδα διερεύνησε τη συσχέτιση πολυμορφισμών στο συγκεκριμένο γονίδιο με τη βαρύτητα της νόσου της β- μεσογειακής αναιμίας και, κατ επέκταση, με τα επίπεδα της HbF, σε Έλληνες ασθενείς από την περιοχή της Δυτικής Ελλάδας (Tafrali et al., 2013). Προκειμένου να διερευνηθεί το κατά πόσο ο ηπιότερος φαινότυπος της νόσου στους Έλληνες ασθενείς με β-μεσογειακή αναιμία συνδέεται με ασυνήθιστα υψηλή HbF, μελετήθηκαν οι γονότυποι τριών SNP στο PDE7B, σε ασθενείς με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία και μείζονα β-μεσογειακή αναιμία σε σχέση με υγιή άτομα. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως ο πολυμορφισμός rs , που βρίσκεται σε εσώνιο του PDE7B, συνδέεται με τα επίπεδα της HbF. Συγκεκριμένα παρατηρήθηκε πλήρης

32 έλλειψη του ομόζυγου μεταλλαγμένου γονότυπου C/C στους ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία σε σύγκριση με τις άλλες δύο ομάδες. Ο ομόζυγος γονότυπος C/C είναι σχετικά συχνός στους Καυκάσιους [18,6% σύμφωνα με το HapMap: ( και στον υγιή Ελληνικό πληθυσμό (12,8%). Συνεπώς, η έλλειψη του γονότυπου C/C για το rs φαίνεται να συνδέεται με ηπιότερο φαινότυπο της νόσου και υψηλότερα επίπεδα της HbF (Tafrali et al., 2013). Εικόνα 1.10: Σχηματική αναπαράσταση του τόπου του MAP3K5 και του PDE7B για τη χρωμοσωματική περιοχή 6q23.3. Τα εξώνια αντιπροσωπεύονται από τους κυλίνδρους, οι ανοιχτόχρωμοι κύλινδροι αντιπροσωπεύουν τη 5 αμετάφραστη περιοχή ενώ οι σκουρόχρωμοι κύλινδροι τα εξώνια που κωδικοποιούνται. Μεγάλες περιοχές του γονιδιώματος έχουν παραλειφθεί για λόγους απλότητας (διακεκομμένες γραμμές). Τα SNP υποδεικνύονται με ένα τρίγωνο, ενώ τα τρία τρίγωνα υποδεικνύουν μία σύντομη διαδοχική επανάληψη (Short Tandem Repeat - STR) στον υποκινητή του γονιδίου MAP3K5. Τα βέλη υποδεικνύουν τον προσανατολισμό του κάθε γονιδίου στο χρωμόσωμα. Επίσης, παρουσιάζονται και οι θέσεις των γονιδίων HBS1L και MYB (Tafrali et al., 2013). Το γονίδιο MAP3K5 Το γονίδιο MAP3K5 καταλαμβάνει 235,47 kb στη χρωμοσωμική περιοχή 6q23, έχει τρία μετάγραφα, με το κύριο να έχει μήκος bp και να αποτελείται από 30 εξώνια. Το MAP3K5 κωδικοποιεί τη μιτογόνο-ενεργοποιημένη πρωτεΐνη

33 κινάση κινάση κινάση πέντε (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 5, MAP3K5) ή, όπως επίσης είναι γνωστή, την κινάση 1 που ρυθμίζει το σήμα απόπτωσης (Apoptosis Signal-regulating Kinase 1, ASK1), η οποία αποτελείται από αμινοξέα [δεδομένα από Ensembl: ( Η MAP3K5, μια πρωτεϊνική κινάση σερίνης/θρεονίνης, είναι ένα μέλος της οικογένειας της MAP3K, και ενεργοποιεί τόσο την οδό της JNK κινάσης, όσο και την οδό της p38 κινάσης (Εικόνα 1.11). Ο καταρράκτης σηματοδότησης της MAP κινάσης ενέχει ουσιαστικό ρόλο σε μια ποικιλία διαδικασιών του κυττάρου επηρεάζοντας τη μεταγραφική ή τη μεταφραστική ρύθμιση. Οι κινάσες JNKs και p38 ΜΑΡ ενεργοποιούνται από περιβαλλοντικά σήματα και εμπλέκονται ενεργά σε διάφορες αποκρίσεις στρες, συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού θανάτου, της επιβίωσης και της διαφοροποίησης. Σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, η MAP3K5 ενεργοποιείται από διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως το οξειδωτικό στρες, και από προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως το ΤΝF-α, οι οποίες συμβάλλουν στην κυτταρική απόπτωση, μέσω της ενεργοποίησης των μονοπατιών MAP3K5 - JNK/p38. Έτσι, η MAP3K5 απαιτείται για την παρατεταμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού JNK/p38 και την απόπτωση, που προκαλούνται από τον παράγοντα ΤΝF και το οξειδωτικό στρες. Επίσης, σε άλλους τύπους κυττάρων που η MAP3K5 επάγει τη διαφοροποίηση και την επιβίωση, τα γεγονότα αυτά λαμβάνουν χώρα, και πάλι, μέσω της ενεργοποιήσης της κινάσης p38 (Matsukawa et al., 2004, Tobiume et al., 2001). Η φαρμακολογική διέγερση της έκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία της β- μεσογειακής αναιμίας και γενικότερα των β-αιμοσφαιρινοπαθειών. Έτσι, διερευνάται η δραστηριότητα της επαγωγής της HbF και οι μοριακοί μηχανισμοί των αναστολέων των ειδικών αποακετυλασών ιστόνης (HDAC) σε ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα Κ562. Η απισιδίνη, η οποία είναι ένας ισχυρός αναστολέας των HDAC, όπως η υδροξυουρία και η 5-αζακυτιδίνη, οδηγεί σε μια δεκαπλάσια διέγερση της έκφρασης της HbF. Η υπερακετυλίωση των ιστονών συσχετίζεται με την ικανότητα των αναστολέων HDAC να διεγείρουν τη σύνθεση της HbF. Επιπλέον, η ανάλυση των διαφορετικών μονοπατιών σηματοδότησης της ΜΑΡ κινάσης αποκάλυψε ότι μόνο το μονοπάτι σηματοδότησης της p38 ΜΑΡ κινάσης ενεργοποιείται μετά από θεραπεία των κυττάρων με απισιδίνη και ότι η αναστολή αυτού του μονοπατιού καταργεί την επίδραση της απισιδίνης στην επαγωγή της HbF. Επιπροσθέτως, η

34 ενεργοποίηση του υποκινητή της A γ-σφαιρίνης με απισιδίνη μπορεί να ανασταλεί με αναστολέα της p38. Έτσι, η ακετυλίωση των ιστονών με ενεργοποίηση του μονοπατιού p38 ΜΑΡ κινάσης συνδέεται με την επαγωγή του γονιδίου της γ- σφαιρίνης από απισιδίνη (Witt et al., 2003). Φαίνεται πιθανό ότι και η HU, ένας αναστολέας της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης, μπορεί να δράσει με ένα παρόμοιο μηχανισμό για την ενεργοποίηση του μονοπατιού της p38 MAP κινάσης. Το μόριο της MAP3K5 συμμετέχει σε έναν καταρράκτη που αρχίζει μετά από το κυτταρικό στρες που προκαλεί η HU. Η επαγωγή της HbF φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένη έκφραση του MAP3K5 και, ενδεχομένως, με μία μεταβολή στην οδό της p38/jnk, στην οποία η MAP3K5 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο (Tafrali et al., 2013). Εικόνα 1.11: Ρυθμιστικοί μηχανισμοί της ASK1 ως απόκριση σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις και από προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες (Matsukawa et al., 2004). Όπως προαναφέρθηκε, το γονίδιο της MAP3K5 ταυτοποιήθηκε, μαζί με άλλα γονίδια, στο QTL της χρωμοσωματικής περιοχής 6q23, μια περιοχή που χαρτογραφήθηκε, αρχικά, με ανάλυση σύνδεσης σε μια εκτεταμένη οικογένεια Ινδών με β-μεσογειακή αναιμία (Craig et al., 1996). Σε μία πρόσφατη μελέτη από την ομάδα μας (Tafrali et al., 2013), με σκοπό την εύρεση γονιδίων με επίπεδα έκφρασης επηρεαζόμενα από τα επίπεδα έκφρασης της HbF, μέσω υβριδισμού του mrna σε

35 μικροσυστοιχίες Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0, πραγματοποιήθηκε κανονικοποίηση των δεδομένων και σύγκριση μεταξύ δειγμάτων από υγιείς ενήλικες Μαλτέζους (χαμηλά επίπεδα HbF) και τεσσάρων δειγμάτων από ασθενείς που φέρουν τη μετάλλαξη KLF1 p.k288x και έχουν υψηλά επίπεδα HbF. Απλοανεπάρκεια για τον ερυθροειδικό μεταγραφικό παράγοντα KLF1 προκαλεί HPFH (Borg et al., 2010). Με τον όρο απλοανεπάρκεια (haploinsufficiency) χαρακτηρίζεται η παρουσία ενός μόνο λειτουργικού αντιγράφου ενός γονιδίου, η έκφραση του οποίου είναι ανεπαρκής για την παραγωγή φυσιολογικών επιπέδων πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα ο προκύπτων φαινότυπος να οφείλεται σε ανεπάρκεια του παραγόμενου προϊόντος. Ένα σύνολο από 244 ανιχνευτές για 182 γονίδια εντοπίστηκαν ως διαφορικά εκφραζόμενοι μεταξύ δειγμάτων με χαμηλά και υψηλά επίπεδα HbF (Εικόνα 1.12α). Υπό την επίδραση HU εντοπίστηκαν κατά τη σύγκριση αυτών των δύο ομάδων δειγμάτων συνολικά 236 ανιχνευτές που εκπροσωπούν 175 γονίδια. Ένα από αυτά τα γονίδια, που είναι σημαντικά υπερεκφρασμένο, με μεγαλύτερη από διπλάσια μεταβολή, στο πλαίσιο υψηλής HbF (HPFH Μαλτέζοι), είναι το MAP3K5, όπως υποδεικνύεται από τους ανιχνευτές _s_at και _s_at. Το ίδιο γονίδιο ξεχωρίζει και ως στόχος της HU, δεδομένης της υπερέκφρασης αυτού σε ερυθροειδή προγονικά κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία HU (Εικόνα 1.12β,γ) (Tafrali et al., 2013). Σε μία μελέτη με 280 Αφρο-αμερικανούς ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, ταυτοποιήθηκαν SNP σε εσώνια τεσσάρων γονιδίων, ανάμεσα στα οποία και το MAP3K5, τα οποία συσχετίσθηκαν με τα επίπεδα της HbF (Wyszynski et al., 2004). Δύο SNP στο γονίδιο της MAP3K5 φαίνεται να συσχετίζονται με την επαγωγή της παραγωγής της HbF, τα rs (Α>C) και rs (T>C) (Patrinos and Grosveld, 2008). Στην πρόσφατη μελέτη μας (Tafrali et al., 2013), αξιολογήθηκε η πιθανή σύνδεση μεταξύ των δύο παραπάνω πολυμορφικών παραλλαγών, rs και rs , που βρίσκονται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου MAP3K5 (IVS-I) (Εικόνα 1.10), με τη βαρύτητα της νόσου της β-μεσογειακής αναιμίας. Συγκεκριμένα, συγκρίθηκαν οι γονοτυπικές συχνότητες σε ασθενείς Ελληνικής καταγωγής με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (ήπιος φαινότυπος) σε σχέση με ασθενείς Ελληνικής καταγωγής με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (βαρύς φαινότυπος) και μη-θαλασσαιμικών ατόμων της ίδιας καταγωγής. Δηλαδή, αξιολογήθηκε κατά πόσο αυτές οι παραλλαγές μπορεί να συσχετίζονται με μια

36 Εικόνα 1.12: Διαφορετική γονιδιακή έκφραση του MAP3K5 σε πρόδρομα ερυθροειδή κύτταρα ατόμων από τη Μάλτα με τη μετάλλαξη KLF1 p.k288x (HPFH) και χωρίς μετάλλαξη (Control). (α) Ένα σύνολο από 244 ανιχνευτές που εκπροσωπούν 182 γονίδια εντοπίστηκαν να έχουν διαφορική έκφραση μεταξύ των δειγμάτων με τα χαμηλά (χωρίς τη μετάλλαξη) και εκείνων με τα υψηλά επίπεδα της HbF (HPFH). Τα γονίδια που υποεκφράζονται εμφανίζονται με πράσινο χρώμα, ενώ με κόκκινο παρουσιάζονται τα γονίδια που υπερεκφράζονται. (β) Διαφορική γονιδιακή έκφραση του MAP3K5 χωρίς (control και HPFH) και με (Control_HU και HPFH_HU) επίδραση της HU (ex vivo), όπως απεικονίζεται από τον ανιχνευτή _s_at. (γ) Διαφορική γονιδιακή έκφραση του MAP3K5 χωρίς (control και HPFH) και με (Control_HU και HPFH_HU) επίδραση της HU (ex vivo), όπως απεικονίζεται από τον ανιχνευτή _at. HU: υδροξυουρία, HPFH: κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (Tafrali et al., 2013)

37 ηπιότερη μορφή της νόσου, που αποδίδεται σε αυξημένα επίπεδα της HbF. Η κατανομή των γονότυπων και των δύο SNP στο MAP3K5 δεν διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και των μηθαλασσαιμικών ατόμων, ενώ αντίθετα παρατηρείται πλήρης έλλειψη του ομόζυγου μεταλλαγμένου γονότυπου C/C και για τα δύο SNP στις περιπτώσεις της ενδιάμεσης β-μεσογειακής αναιμίας. Για το rs , η ομόζυγη μετάλλαξη του γονότυπου C/C δεν είναι σπάνια στους Καυκάσιους, δεδομένου ότι έχει συχνότητα 10% σύμφωνα με το HapMap, και ποικίλλει με συχνότητα 13% στους μη-θαλασσαιμικούς Ελληνικής καταγωγής (όπως προσδιορίζεται από τη συγκεκριμένη μελέτη) και σχεδόν 15% σε Ιταλούς από τη Τοσκάνη (TSI), οι οποίοι αντιπροσωπεύουν έναν άλλο Καυκάσιο πληθυσμό. Για το rs , τα γονοτυπικά δεδομένα για τους Καυκάσιους είναι σε μεγάλο βαθμό ελλειπή από το HapMap και το 1000 G om s proj cts, αλλά σε μη-θαλασσαιμικά άτομα Ελληνικού πληθυσμού, ο ομόζυγος μεταλλαγμένος γονότυπος C/C παρουσιάζεται με συχνότητα 13,8%, σχεδόν ίση με εκείνη του rs Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι παρατηρείται έλλειψη των ομόζυγων μεταλλαγμένων γονοτύπων μεταξύ των δειγμάτων με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία και για τις δύο πολυμορφικές θέσεις του MAP3K5, το οποίο καταδεικνύει συσχέτιση των αλληλομόρφων C με τη μειωμένη HbF και τη βαριά μορφή της νόσου της β-μεσογειακής αναιμίας (Tafrali et al., 2013). Εν συνεχεία, τέθηκε το ερώτημα εάν τα SNP rs και rs θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως εν δυνάμει φαρμακογονιδιωματικοί δείκτες για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με HU σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-μεσογειακή αναιμία. Για το σκοπό αυτό, συγκρίθηκαν οι αλληλικές και γονοτυπικές συχνότητες σε 35 ασθενείς Ελληνικής καταγωγής ετερόζυγους ως προς τη δρεπανοκυτταρική αναιμία και τη β-μεσογειακή αναιμία, οι οποίοι είχαν λάβει συστηματικά HU και καταγράφονται για τις αλλαγές στα επίπεδα HbF πριν και μετά τη θεραπεία με HU. Τα δείγματα ομαδοποιήθηκαν ως «μη-ανταποκριθέντες» (non-responders), όταν τα επίπεδα της HbF μετά από την αγωγή με HU είναι μικρότερα από 20% της ολικής αιμοσφαιρίνης, και «ανταποκριθέντες» (responders), όταν τα επίπεδα της HbF μετά από την αγωγή με HU είναι υψηλότερα από 20%. Στη σύγκριση αυτή παρατηρείται μία πλήρης έλλειψη του ομόζυγου μεταλλαγμένου γονότυπου C/C και για τα δύο SNP στην ομάδα των «μη-ανταποκριθέντων», ενώ ο γονότυπος αυτός είναι παρόν στην ομάδα των «ανταποκριθέντων». Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν μια ισχυρή συσχέτιση του

38 rs (p = 0,026) και του rs (p = 1,4 x 10-4 ) με την ανταπόκριση στη θεραπεία με HU που βασίζεται στην αύξηση των επιπέδων της HbF στους «ανταποκριθέντες». Η συχνότητα του ομόζυγου μεταλλαγμένου γονότυπου C/C, τόσο για το rs , όσο και για το rs , στην ομάδα των «μηανταποκριθέντων» αποκλίνει σημαντικά από τη συχνότητα που παρατηρείται σε μηθαλασσαιμικά άτομα ίδιας καταγωγής (p=0,017 και p=0,01, αντίστοιχα), υποδηλώνοντας ότι αυτή η ομάδα των ασθενών είναι πιθανόν να επωφελείται λιγότερο από τη θεραπεία με HU (Tafrali et al., 2013). 1.7 Αιμοσφαιρινοπάθειες Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, δηλαδή οι κληρονομικές διαταραχές της αιμοσφαιρίνης, είναι οι πιο κοινές μονογονιδιακές ασθένειες παγκοσμίως, αποτελώντας ένα μείζον πρόβλημα υγείας, με υψηλή συχνότητα φορέων, ιδίως σε ορισμένες περιοχές όπου η ελονοσία υπήρξε ενδημική. Αυτές οι διαταραχές χαρακτηρίζονται από μια μεγάλη κλινική και αιματολογική φαινοτυπική ετερογένεια. Πάνω από διαφορετικές γενετικές ανωμαλίες που επηρεάζουν την αλληλουχία του DNA των ανθρώπινων α- (HBZ, HΒA2, HΒA1 και HBQ1) και β-τύπου (HBE, HBG2, HBG1, HBD, και ΗΒΒ) γονιδίων σφαιρίνης είναι κυρίως υπεύθυνες για την παρατηρούμενη κλινική ετερογένεια (Patrinos et al., 2005). Οι αιμοσφαιρινοπάθειες διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, στη μία ανήκουν εκείνες που προκαλούν ποσοτικές, ενώ στην άλλη εκείνες που προκαλούν ποιοτικές διαταραχές της αιμοσφαιρίνης. Στην πρώτη κατηγορία, που συμπεριλαμβάνεται η μεσογειακή αναιμία, σημειώνεται μείωση της παραγωγής της αντίστοιχης αλυσίδας σφαιρίνης, αντίθετα στη δεύτερη κατηγορία, που ανήκει η δρεπανοκυτταρική αναιμία, παράγεται ελαττωματική αλυσίδα σφαιρίνης. Η μεσογειακή αναιμία και η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι οι δύο περισσότερο διαδεδομένες αιμοσφαιρινοπάθειες στον κόσμο (Εικόνα 1.13β). Η μεσογειακή αναιμία, δηλαδή η γενετική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από περιορισμένη βιοσύνθεση ή πλήρη απουσία μίας ή περισσότερων από τις φυσιολογικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης, προέρχεται από χώρες της Μεσογείου, της Μέσης Ανατολής και της Ασίας. Ωστόσο, η γεωγραφική της κατανομή, όπως υποδεικνύεται από τη διακεκομμένη γραμμή στην εικόνα 1.13β, περιλαμβάνει τους πληθυσμούς της Μεσογείου, της Νότιας Ασίας και της Ινδονησίας (Hillman et al., 2005). Αντίθετα, η

39 δρεπανοκυτταρική αναιμία, η οποία οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη που προκαλεί αντικατάσταση του έκτου αμινοξέος της αλυσίδας της β-σφαιρίνης από γλουταμινικό οξύ σε βαλίνη, προέρχεται κυρίως από Αφρικανικές χώρες (Εικόνα 1.13α). Και οι δύο εξαπλώθηκαν τόσο σύντομα σε παγκόσμιο επίπεδο λόγω της μετανάστευσης, αυθόρμητης ή επιβεβλημένης. Η σύγχρονη μετανάστευση, επίσης, προκαλεί την εξάπλωσή τους (Williams and Weatherall, 2012). Εικόνα 1.13: (α) Πολυκεντρική προέλευση της μετάλλαξης που προκαλεί τη δρεπανοκυτταρική αναιμία σε περιοχές της Αφρικής και της Ασίας. Τα βέλη δείχνουν τις διαδρομές μετανάστευσης του κάθε χρωμοσώματος β S σε διάφορους πληθυσμούς της Ευρώπης, Ασίας και Αμερικής (Patrinos and Antonarakis, 2010). (β) Γεωγραφική κατανομή των αιμοσφαιρινοπαθειών. Η κατανομή της β- μεσογειακής αναιμίας ορίζεται από τη διακεκομμένη γραμμή. Η αιμοσφαιρίνη S (στίγμα δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και δρεπανοκυτταρική αναιμία) συγκεντρώνεται στην Αφρική (μπλε περιοχές), ενώ η αιμοσφαιρίνη Ε και η α-μεσογειακή αναιμία είναι πιο διαδεδομένες στη Νοτιοανατολική Ασία (Hillman et al., 2005) β-μεσογειακή αναιμία Τα σύνδρομα της β-μεσογειακής αναιμίας αφορούν μειωμένη σύνθεση ή πλήρη απουσία σύνθεσης της β-σφαιρίνης. Η σχετική περίσσεια των α-αλυσίδων έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό αδιάλυτων συσσωματωμάτων που καθιζάνουν (έγκλειστα), προκαλώντας την πρώιμη καταστροφή των πρόδρομων ερυθροκυττάρων και οδηγούν σε αναποτελεσματική ερυθροποίηση (Nienhuis and Nathan, 2012). Η υπολειπόμενη κληρονομική β-μεσογειακή αναιμία είναι διαδεδομένη σε όλες τις τροπικές και υποτροπικές περιοχές του κόσμου και, πιθανόν η συχνότητά της να οφείλεται σε ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα που προσδίδει έναντι του πρωτόζωου Plasmodium falciparum, το οποίο προκαλεί την ελονοσία (Weatherall,

40 1987). Η φαινομενική προστατευτική δράση της κατά της ελονοσίας μπορεί να συνδέεται με την αυξημένη ανοσολογική αναγνώριση των ερυθροκυττάρων που φέρουν παράσιτα, λόγω των τροποποιημένων αντιγόνων επιφανείας τους. Η ανοσολογική αναγνώριση οδηγεί στην απομάκρυνσή τους από τον οργανισμό (Luzzi et al., 1991). Οι κλινικοί φαινότυποι της β-μεσογειακής αναιμίας διακρίνονται κυρίως σε τρεις ομάδες ασθενών. Ομοζυγώτες με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία. Οι ομοζυγώτες με μείζονα β- μεσογειακή αναιμία επηρεάζονται σοβαρά, έχουν βαριά αναιμία και σε αυτές τις περιπτώσεις απαιτούνται μεταγγίσεις αίματος. Η συχνότητα των μεταγγίσεων είναι ένα από τα κύρια κριτήρια χαρακτηρισμού της βαρύτητας της νόσου. Σε ομοζυγώτες με β 0 -μεσογειακή αναιμία, όπου υπάρχει πλήρης απουσία της β-αλυσίδας σφαιρίνης, η HbΑ είναι εντελώς απούσα, ενώ πολύ μειωμένη είναι σε ομοζυγώτες με β + - μεσογειακή αναιμία, όπου υπάρχει μειωμένη σύνθεση της β-αλυσίδας σφαιρίνης. Η ασθένεια σχετίζεται με τη μη ικανότητα αιμοποίησης που καταλήγει σε αποτυχία της ανάπτυξης και συχνά οδηγεί στο θάνατο κατά την εφηβεία ή νωρίτερα. Ακόμη, η β 0 - μεσογειακή αναιμία και η β + /β 0 -μεσογειακή αναιμία είναι σοβαρές αιμοσφαιρινοπάθειες και αποτελούν σοβαρό πρόβλημα δημόσιας υγείας στις χώρες όπου τα συγκεκριμένα αλληλόμορφα είναι κοινά. Ομοζυγώτες με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. Με τον όρο ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία χαρακτηρίζεται ένα ευρύ κλινικό φάσμα που κυμαίνεται από ήπιες συνθήκες μεσογειακής αναιμίας σε ασυμπτωματικές μορφές, δηλαδή χρήζουν σε αραιά διαστήματα μεταγγίσεις, περιστασιακά ή/και καθόλου και αντιπροσωπεύουν ένα χαμηλό ποσοστό των ασθενών με β-μεσογειακή αναιμία. Συνεπώς, οι ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία χρήζουν ιατρικής φροντίδας αργά στην παιδική ηλικία ή ακόμη και στην ενήλικη ζωή. Επίσης, παρουσιάζουν ήπια έως μέτρια αναιμία και φέρουν επίπεδα αιμοσφαιρίνης που κυμαίνονται μεταξύ 7 και 10 g/dl, το οποίο είναι βιώσιμο χωρίς την ανάγκη για τακτικές μεταγγίσεις αίματος. Οι ομοζυγώτες με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία έχουν έναν ηπιότερο φαινότυπο σε σχέση με εκείνους με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, ο οποίος οφείλεται στη δράση ή/και συνύπαρξη διαφόρων γενετικών παραγόντων και ένας λιγότερο συχνός από αυτούς είναι η ικανότητά τους να

41 παράγουν αυξημένα επίπεδα HbF, χωρίς τη συνύπαρξη HPFH συνδρόμου. Τα άτομα αυτά είναι δυνατόν να έχουν μακρά διαβίωση και εντοπίζονται δύσκολα, ιδιαίτερα στην περίπτωση όπου τα επίπεδα της HbF είναι πολύ αυξημένα. Αυτό συμβαίνει διότι όσο αυξάνεται η ποσότητα της HbF, τόσο μειώνεται η περίσσεια των α- αλυσίδων σφαιρίνης, άρα και η παρουσία εγκλείστων που κυρίως ευθύνονται για τη σοβαρότητα της κλινικής εικόνας του ασθενούς (Musallam et al., 2012). Ετεροζυγώτες της β-μεσογειακής αναιμίας. Οι φορείς, δηλαδή οι ετεροζυγώτες, της β-μεσογειακής αναιμίας εμφανίζουν και αυτοί ένα φάσμα «βαρύτητας» αν και δεν έχουν κλινικά συμπτώματα, αλλά ήπια αναιμία και σε μερικές περιπτώσεις είναι δυνατό να αγνοούν την κατάστασή τους. Η HbA 2 είναι ελαφρώς αυξημένη, ενώ τα ερυθροκύτταρα είναι μικρότερα και περιέχουν μικρότερη ποσότητα αιμοσφαιρίνης. Οι ετεροζυγώτες συνήθως δεν απαιτούν ιατρική προσοχή ή θεραπεία. Η αξιοσημείωτη ετερογένεια των μεταλλάξεων του γονιδίου HBB εξηγεί τη συχνή εύρεση διπλών ετεροζυγωτών για τη β-μεσογειακή αναιμία, όπου οι προσβεβλημένοι ασθενείς έχουν κληρονομήσει μια διαφορετική μετάλλαξη του γονιδίου HBB από κάθε γονέα. Δεδομένου ότι μία συγκεκριμένη μετάλλαξη μεσογειακής αναιμίας σε ομοζυγωτία προκαλεί από ήπια μείωση μέχρι ολοκληρωτική απουσία της σύνθεσης σφαιρίνης, και η ετεροζυγωτία παρατηρείται συχνά, απαντάται ένα ευρύ φάσμα μεσογειακής αναιμίας με ποικίλη κλινική βαρύτητα. Τέλος, η β-μεσογειακή αναιμία μπορεί να συνυπάρχει και με άλλους τύπους αιμοσφαιρινοπαθειών (Patrinos and Antonarakis, 2010) Είδη μεταλλάξεων που οδηγούν στη β-μεσογειακή αναιμία Η απουσία ή η μη λειτουργικότητα των β-σφαιρινικών αλυσίδων, που χαρακτηρίζει τις περιπτώσεις της β-μεσογειακής αναιμίας, είναι αποτέλεσμα μεταλλάξεων που επηρεάζουν όλα τα στάδια βιοσύνθεσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της β-σφαιρίνης. Ο πλήρης κατάλογος όλων των παθογόνων μεταλλάξεων που αναφέρθηκαν για το ανθρώπινο γονίδιο ΗΒΒ μπορεί να βρεθεί στη βάση δεδομένων HbVar ( για τις παραλλαγές της αιμοσφαιρίνης και τις μεταλλάξεις της μεσογειακής αναιμίας. Οι συνηθέστερες μεταλλάξεις που οδηγούν στη β-μεσογειακή αναιμία είναι είτε σημειακές

42 μεταλλάξεις ή προσθήκες ή ελλείμματα (in/dels) μικρού αριθμού βάσεων. Ορισμένοι από τους σημαντικότερους τύπους μεταλλάξεων αναφέρονται παρακάτω: 1. Μεταλλάξεις στον υποκινητή του γονιδίου β-σφαιρίνης. Οι μεταλλάξεις που παρατηρούνται στις 5 αμετάφραστες περιοχές των γονιδίων HBB είναι ρυθμιστικές μεταλλάξεις, οι οποίες επηρεάζουν τη μεταγραφή του γονιδίου. Αυτές οι μεταλλάξεις έχουν βρεθεί στα πλαίσια CACCC και ΤΑΤΑ σε άτομα με ήπιο φαινότυπο της β-μεσογειακής αναιμίας (Antonarakis et al., 1984, Orkin et al., 1984). 2. Μεταλλάξεις στη θέση πολυαδενυλίωσης του γονιδίου β-σφαιρίνης. Οι μεταλλάξεις αυτές επηρεάζουν το σήμα πολυαδενυλίωσης ΑΑΤΑΑΑ στην 3 αμετάφραστη περιοχή του γονιδίου HBB (Orkin et al., 1985). 3. Μη νοηματικές μεταλλάξεις στο γονίδιο β-σφαιρίνης. Αυτές οι μεταλλάξεις έχουν σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός νέου κωδικονίου λήξης και, επομένως, οδηγούν σε πρόωρη λήξη της μετάφρασης, οδηγώντας σε μικρότερου μήκους και, κατά συνέπεια, μη λειτουργική αλυσίδα σφαιρίνης. Τέτοιες μεταλλάξεις, ως εκ τούτου, οδηγούν σε β 0 -μεσογειακή αναιμία. Μία από τις συχνότερες μεταλλάξεις αυτής της κατηγορίας είναι η p.q39x (HBB: c.118c>τ), η οποία ως επί το πλείστον βρίσκεται σε ασθενείς και φορείς μεσογειακής καταγωγή και αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος των μεταλλάξεων της β-μεσογειακής αναιμίας στη Σαρδηνία, ενώ είναι η δεύτερη σε συχνότητα στην Ελλάδα (Patrinos and Antonarakis, 2010, Pirastu et al., 1987). 4. Μεταλλάξεις μετάθεσης πλαισίου στο γονίδιο της β-σφαιρίνης. Σύντομες ενθέσεις ή απαλοιφές νουκλεοτιδίων αριθμού διάφορου του τρία ή των πολλαπλάσιών του προκαλούν αλλαγές στο πλαίσιο ανάγνωσης και, επομένως, παραγωγή πρωτεΐνης με διαφορετική αλληλουχία και μήκος (Patrinos and Antonarakis, 2010). Αυτού του τύπου οι μεταλλάξεις προκαλούν β 0 -μεσογειακή αναιμία

43 5. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη συναρμογή στο γονίδιο β-σφαιρίνης. Οι μεταλλάξεις αυτές επηρεάζουν τη συναρμογή του mrna (splicing), μεταβάλλοντας, κυρίως, τις δινουκλεοτιδικές αλληλουχίες GT ή AG, οι οποίες ορίζουν το 5 -άκρο και το 3 -άκρο, αντίστοιχα, των εσωνίων. Αυτές οι μεταλλάξεις προκαλούν β 0 -μεσογειακή αναιμία. Μεταλλάξεις κοντά σε αυτές τις περιοχές, συνήθως, προκαλούν ήπια β + -μεσογειακή αναιμία. Σε αυτή την κατηγορία ανήκει και η πρώτη σε συχνότητα μετάλλαξη στην Ελλάδα που προκαλεί β-μεσογειακή αναιμία, δηλαδή η IVS-I-110 (HBB:c G>A), κατά την οποία η γουανίνη που βρίσκεται 21 ζεύγη βάσεων ανοδικά από τη θέση συναρμογής (θέση 93 στο cdna) αντικαθίσταται με αδενίνη μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της συναρμογής. Κρυμμένες θέσεις συναρμογής, δηλαδή, αυτές που σπάνια χρησιμοποιούνται φυσιολογικά, ενίοτε ενεργοποιούνται από μεταλλάξεις σε παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες και προκαλούν παρεμβολή με τη φυσιολογική διαδικασία συναρμογής. Τέτοιες κρυμμένες θέσεις συναρμογής μπορεί επίσης να ενεργοποιούνται και εντός των εξωνίων (Patrinos and Antonarakis, 2010). 6. Μεταλλάξεις που προκαλούν ασταθείς β-σφαιρίνες. Η επικρατής β-μεσογειακή αναιμία είναι ετερογενής σε μοριακό επίπεδο και οφείλεται σε μεταλλάξεις που συμβαίνουν στο γονίδιο ΗΒΒ ή κοντά σε αυτό. Οι προκύπτουσες παραλλαγμένες β-αλυσίδες σφαιρίνης είναι πολύ ασταθείς και, σε πολλές περιπτώσεις, δεν είναι ανιχνεύσιμες. Από τις 33 γνωστές επικρατείς μεταλλάξεις β-μεσογειακής αναιμίας, οι 22 βρίσκονται στο εξώνιο 3 του γονιδίου ΗΒΒ, παράγοντας ασταθή σφαιρίνη και ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. Μη νοηματικές μεταλλάξεις ή μεταλλάξεις μετατόπισης αναγνωστικού πλαισίου που παράγουν αλυσίδες β-σφαιρίνης με πάνω από 72 αμινοξικά κατάλοιπα, συνήθως, συνδέονται με έναν ήπιο φαινότυπο σε ετεροζυγώτες. Από την άλλη πλευρά, τα mrna με μεταλλάξεις στο εξώνιο 3 μεταφέρονται και μεταφράζονται κανονικά. Αυτά παράγουν μακρά και εξαιρετικά ασταθή προϊόντα σφαιρίνης που είναι ικανά να δεσμεύουν αίμη, αλλά δεν συνδυάζονται με αλυσίδες α-σφαιρίνης για την παραγωγή κάποιου σταθερού τετραμερούς αιμοσφαιρίνης. Ως εκ τούτου, αυτά τα μεγάλα κατατετμημένα προϊόντα τείνουν να καθιζάνουν στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα, σε συνδυασμό με περίσσεια αλυσίδων α-σφαιρίνης, παράγοντας μεγάλα έγκλειστα (Thein et al., 1990)

44 7. Μεταλλάξεις σε μεταγραφικούς παράγοντες. Εκτός από την πληθώρα μεταλλάξεων στο ΗΒΒ που οδηγούν σε β-μεσογειακή αναιμία, έχουν περιγραφεί μερικοί ασθενείς με β-μεσογειακή αναιμία με φαινότυπο που προκύπτει από μεταλλάξεις σε ρυθμιστικά γονίδια που κωδικοποιούν γενικούς και ερυθροειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Ο Viprakasit απέδειξε ότι η έκφραση του γονιδίου HBB επηρεάζεται από μια μετάλλαξη στην υπομονάδα XPD του γενικού μεταγραφικού παράγοντα TFIIH στο χρωμόσωμα 19 (Viprakasit et al., 2001). Επίσης, έχει αναφερθεί ότι μεταλλάξεις στον ερυθροειδικό παράγοντα μεταγραφής GATA-1 προκαλούν β-μεσογειακή αναιμία (Yu et al., 2002) Διάγνωση και θεραπεία της β-μεσογειακής αναιμίας και άλλων αιμοσφαιρινοπαθειών Οι αιματολογικές και βιοχημικές έρευνες παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τον αιματολογικό φαινότυπο ατόμων, για τα οποία υπάρχουν υπόνοιες ότι πάσχουν από αιμοσφαιρινοπάθεια. Η διάγνωση, επίσης, προκύπτει από μεθοδολογία ανίχνευσης μεταλλάξεων των ανθρώπινων γονιδίων σφαιρίνης που περιλαμβάνει έλεγχο σε γνωστές (ανάλυση περιοριστικών προτύπων και ανίχνευση μετάλλαξης ειδικού αλληλομόρφου ή ενίσχυση) ή άγνωστες μεταλλάξεις (μέθοδοι σάρωσης ολόκληρου του γονιδίου) (Patrinos et al., 2005). Άγνωστες αναδιατάξεις στα συμπλέγματα γονιδίων α- και β-σφαιρίνης, που προκαλούν α- και β-μεσογειακή αναιμία, έχουν προσδιοριστεί με την πολλαπλή ενίσχυση ανιχνευτών εξαρτώμενη από την αντίδραση λιγάσης (multiplex ligation-dependent probe amplification- MPLA) (Harteveld et al., 2005) και με αρκετές βασισμένες στις μικροσυστοιχίες μεθόδους ανίχνευσης γονιδιακής μετάλλαξης των ανθρώπινων σφαιρινών (Cremonesi et al., 2007), ενώ η πυροαλληλούχιση (pyrosequencing) επεκτείνεται με στόχο την εκ νέου ανάλυση της αλληλουχίας των σφαιρινικών περιοχών του γονιδιώματος. Οι προαναφερόμενες διαγνωστικές μέθοδοι, που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της β-μεσογειακής αναιμίας, χρησιμοποιούνται και για την προγεννητική της διάγνωση, ενώ για την προεμφυτευτική διάγνωση, μεταξύ άλλων, πραγματοποιείται η ανάλυση DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), η ανάλυση με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και η ανάλυση SSCP (Single-Stranded Conformation Polymorphism) (Patrinos et al., 2005)

45 Οι τακτικές μεταγγίσεις ερυθρών αιμοσφαιρίων αποτελούν τον ακρογωνιαίο λίθο της θεραπείας για τους ασθενείς με βαριά β-μεσογειακή αναιμία. Παρά τη χρήση της θεραπείας αποσιδήρωσης υπερφόρτωση σιδήρου μοιραία αναπτύσσεται σε πολλούς ασθενείς. Μία άλλη πιθανή συνέπεια των μακροχρόνιων μεταγγίσεων είναι η ανάπτυξη των αντι-ερυθροκυτταρικών αντισωμάτων (Lowrey and Nienhuis, 1993). Λόγω των παραπάνω μειονεκτημάτων η έρευνα για την οριστική θεραπεία της β- μεσογειακής αναιμίας, και γενικότερα των αιμοσφαιρινοπαθειών, έχει ενταθεί. Η σταδιακή διαλεύκανση της παθοφυσιολογίας της μεσογειακής αναιμίας έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη θεραπεία ή τον περιορισμό της ασθένειας. Μέχρι στιγμής η μόνη προσέγγιση που μπορεί να οδηγήσει σε οριστική θεραπεία για τη β-μεσογειακή αναιμία είναι η αλλογενής μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (Lucarelli et al., 2012, Gaziev and Lucarelli, 2003, Gaziev et al., 2005). Μία εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση περιλαμβάνει τη φαρμακολογική αύξηση της έκφρασης των γονιδίων της εμβρυϊκής σφαιρίνης, για παράδειγμα με υδροξυουρία (HU), για να αντισταθμίσει τη μειωμένη ή μηδενική σύνθεση της αλυσίδας της β-σφαιρίνης σε ασθενείς με β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες. Η αποτελεσματικότητα της HU είναι αποδεδειγμένη στη δρεπανοκυτταρική αναιμία, ενώ στη β-μεσογειακή αναιμία είναι αμφιλεγόμενη (Pace and Zein, 2006). Λόγω του γεγονότος ότι η απόκριση της HbF σε ασθενείς με β-αιμοσφαιρινοπάθειες στη θεραπεία με HU είναι μεταβλητή (Pace and Zein, 2006), η ικανότητα πρόβλεψης των επιπέδων της ΗbF του ασθενούς ως απόκριση στη θεραπεία με HU θα βοηθήσει στην επιλογή των ασθενών, στους οποίους η θεραπεία θα είναι αποτελεσματική, και στη μείωση της τοξικότητας από ακατάλληλη δόση. Οι πολυμορφισμοί στα γονίδια που ρυθμίζουν την έκφρασης της HbF, το μεταβολισμό της HU, και τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων ερυθροκυττάρων μπορεί να διαμορφώνουν την ανταπόκριση του ασθενούς σε φαρμακολογικούς παράγοντες που επάγουν την HbF (Yavarian et al., 2004, Ma et al., 2007, Tafrali et al., 2013, Patrinos and Grosveld, 2008). Επίσης, η γονιδιακή θεραπεία στη β-μεσογειακή αναιμία αποσκοπεί στην επίτευξη θεραπευτικών επιπέδων της γονιδιακής έκφρασης του λειτουργικού HBB. Τέλος, υπάρχουν άλλες προσεγγίσεις, οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί μόνο πειραματικά, όπως η παρεμβολή με RNA (RNA interference, RNAi) που παρεμποδίζει την έκφραση των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων του HBB

46 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Τα συμπτώματα της β-μεσογειακής αναιμίας είναι πιο ήπια όταν το ποσοστό της HbF παραμένει σε υψηλά επίπεδα και κατά τη διάρκεια της ενήλικου ζωής. Αυξημένα επίπεδα bf σε υγιείς ενήλικες έχoυν συσχετισθεί με γενετικά στοιχεία που εδράζουν στο ίδιο χρωμόσωμα με το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης, αλλά και με άλλους γενετικούς τόπους που βρίσκονται εκτός του χρωμοσώματος 11 και αλληλεπιδρούν με το σύμπλεγμα της β-σφαιρίνης, όπως το QTL στο χρωμόσωμα 6q23. Στη συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή εντοπίζεται και το γονίδιο ΜΑΡ3Κ5. Πρόσφατα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παρουσία του αλληλομόρφου C σε μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς που εδράζονται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου MAP3K5, και συγκεκριμένα στον rs και στον rs , συσχετίζονται με μειωμένα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF). Επίσης, μία λειτουργική μελέτη έδειξε ότι η παρουσία πέντε αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG (θέση -51 έως -27 από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του ΜΑΡ3Κ5) συνδέεται με μείωση της έκφρασης του γονιδίου. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να ερευνήσει τον υποκινητή του ΜΑΡ3Κ5 ως προς τη συχνότητα παρουσίας τεσσάρων ή πέντε αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG στον ελληνικό πληθυσμό, και με δεδομένο ότι δεν υπήρχαν δεδομένα συχνότητας για τον συγκεκριμένο πολυμορφισμό στους Καυκάσιους. Επίσης, διερευνήθηκε εάν οι μικροδορυφορικές αυτές αλληλουχίες συνδέονται με τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς rs και rs που εδράζουν στο πρώτο εσώνιο του MAP3K5 και, κατ επέκταση, με αυξημένα επίπεδα της bf σε ασθενείς με ενδιάμεση ή μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και σε σχέση με υγιή άτομα. Μελετήθηκαν ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία, καθώς και υγιή άτομα. Ο προσδιορισμός του γονότυπου πραγματοποιήθηκε με αλληλούχισης σε αυτοματοποιημένο αναλυτή με τη μέθοδο Sanger ή με ανάλυση ετεροδιμερών, αφού προηγήθηκε εκλεκτική ενίσχυση τμήματος του MAP3K5 που έφερε το συγκεκριμένο πολυμορφισμό με PCR. Συμπερασματικά, σκοπός της παρούσας μελέτη ήταν ο προσδιορισμός της γονοτυπικής κατανομής μεταξύ των ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και των άλλων δύο ομάδων και τυχόν διαφορές των συχνοτήτων τους μεταξύ των προς μελέτη ατόμων. Επιπροσθέτως, σκοπό αποτελούσε και η τεκμηρίωση της σύνδεσης

47 μεταξύ του εξεταζόμενου πολυμορφισμού και των SNP rs και rs , και ως εκ τούτου και με τα επίπεδα της bf στις ομάδες των ατόμων που αναλύθηκαν. Αυτή η σύνδεση του πολυμορφισμού που εδράζεται επί του υποκινητή, με τους δύο μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς ερμηνεύει τη σύνδεση των τελευταίων με τα επίπεδα της bf. Τέλος, η συγκεκριμένη παραλλαγή ενδέχεται να αποτελέσει ένα φαρμακογονιδιωματικό δείκτη για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με HU σε ασθενείς με β-μεσογειακή αναιμία

48 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Στην παρούσα μελέτη συμπεριλήφθησαν τρεις ομάδες ατόμων: Ασθενείς με Μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia major) Ασθενείς με Ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia intermedia) Υγιή άτομα (non-thalassemic controls). Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά το πλήθος και την προέλευση των δειγμάτων, συλλέχθηκαν 15 δείγματα ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, 60 δείγματα υγιών (μη-θαλασσαιμικών) ατόμων και 11 δείγματα ασθενών με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία. Όλα τα άτομα είχαν καταγωγή από τη δυτική Ελλάδα και τα δείγματα προήλθαν από το Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών. Οι ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία έχουν μακρά επιβίωση, διατηρούν ένα συνολικό ποσό αιμοσφαιρίνης μεταξύ 7,7 και 11,2 g/dl, χωρίς τακτικές μεταγγίσεις ή χωρίς καθόλου μεταγγίσεις, και έτσι, αυτές οι περιπτώσεις είναι συνήθως δύσκολο να εντοπιστούν. Επιπλέον, η αυξημένη ποσότητα της HbF που παράγεται σε αυτούς τους ασθενείς (που κυμαίνεται μεταξύ 22-98% του συνόλου της αιμοσφαιρίνης τους) δεν μπορεί να αποδοθεί ούτε σε μεταλλάξεις που οδηγούν σε α-μεσογειακή αναιμία, ούτε σε μη-ελλειμματική HPFH ή σε ελλειμματική HPFH. Σε αντίθεση, ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία έχουν βαριά αναιμία και εξαρτώνται από μεταγγίσεις αίματος. Τις ίδιες μεταλλάξεις στο γονίδιο HBB ενδέχεται να φέρουν τόσο ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, όσο και ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. 3.2 Απομόνωση ολικού γονιδιωματικού DNA Η απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA από αίμα έγινε με την χρήση του προτυποποιημένου συστήματος QIAamp Blood Midi Kit (Spin Protocol). Απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από 1 ml περιφερικού, ολικού αίματος, στο οποίο είχε προστεθεί EDTA ως αντιπηκτικό. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί στήλες χαλαζία. Ο μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η απομόνωση του DNA βασίζεται στην πρόσδεση (προσρόφηση) των νουκλεϊκών οξέων στη στήλη, σε περιβάλλον υψηλής ιοντικής

49 ισχύος και χαμηλού ph που δημιουργείται από την προσθήκη χαοτροπικού παράγοντα, ενώ η έκλουσή του γίνεται με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (TE) σε ph 8,3. Η διαδικασία απομόνωσης του DNA περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1) Προστίθενται 200 μl του αντιδραστηρίου QIAGEN Protease σε σωλήνα φυγοκέντρησης 15 ml. 2) 1 ml δείγματος αίματος αναμιγνύεται με 1 ml PBS (Phosphate buffered saline) και αναδεύονται στο σωλήνα. 3) Προστίθενται 2,4 ml διαλύματος AL (διάλυμα λύσης) και γίνεται ανάδευση για 1 min. 4) Το μίγμα επωάζεται στο υδατόλουτρο για 10 min στους 70 o C. 5) Προστίθενται 2 ml αιθανόλης (96-100%) στο μίγμα και γίνεται ανάδευση. 6) Μεταφέρεται η μισή ποσότητα του δείγματος στην QIAamp Midi spin στήλη (τοποθετημένη σε σωλήνα φυγοκέντρησης 15 ml). Φυγοκεντρείται για 3 min στα 1850 x g, σε θερμοκρασία δωματίου (25 o C). 7) Απορρίπτεται το διήθημα, τοποθετείται και η υπόλοιπη μισή ποσότητα του δείγματος στη στήλη και επαναλαμβάνεται η φυγοκέντρηση. 8) Ακολουθεί προσθήκη 2 ml διαλύματος AW1 (διάλυμα πλύσης) στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 1 min. 9) Μετά προστίθενται 2 ml διαλύματος AW2 (διάλυμα πλύσης) στη στήλη. Ακολουθεί πάλι φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 15 min. 10) Η QIAamp Midi spin στήλη τοποθετείται έπειτα σε ένα καθαρό σωλήνα φυγοκέντρησης όγκου 15 ml. 11) Προστίθενται 300 μl διαλύματος έκλουσης ΑΕ και γίνεται επώαση, για 5 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 2 min. 12) Για να επιτευχθεί μεγαλύτερη τελική συγκέντρωση DNA, το προηγούμενο βήμα επαναλαμβάνεται, κάνοντας μία δεύτερη έκλουση, περνώντας ξανά το διήθημα από τη στήλη κι επωάζοντας για 5 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 2 min. 13) Το διήθημα που προκύπτει και περιέχει το απομονωμένο γονιδιωματικό DNA, συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -20 o C

50 3.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA στα δείγματα Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων DNA έγινε με τη χρήση της συσκευής NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer, που είναι ένα φασματοφωτόμετρο πλήρους φάσματος, που μετράει τη συγκέντρωση νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα. Τα πλεονεκτήματα της χρήσης της συσκευής αυτής είναι: η ταχύτητα πραγματοποίησης των μετρήσεων, η μικρή ποσότητα του δείγματος που απαιτείται για μία μέτρηση (1μl για δείγματα DNA), η ικανότητα μέτρησης πολύ πυκνών διαλυμάτων (μέχρι 3700 ng/μl για dsdna), η αποφυγή χρήσης κυψελίδων, ο αυτόματος υπολογισμός των τιμών 260 nm/280 nm και 260 nm/230 nm. Όσον αφορά τη χρήση του, έγινε πρώτα μηδενισμός της συσκευής με το διάλυμα έκλουσης του DNA. Έπειτα, όταν ο βραχίονας ήταν ανοιχτός, μία σταγόνα DNA δείγματος (1μl) τοποθετήθηκε στην ειδική βάση. Όταν ο βραχίονας έκλεισε, το δείγμα σχημάτισε μία στήλη. Ο βραχίονας αυτόματα μετακινήθηκε προς τα κάτω και υπολόγισε τη συγκέντρωση του δείγματος με τη βοήθεια οπτικών ινών. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων καταγράφηκαν αυτόματα στον υπολογιστή που βρισκόταν συνδεδεμένος με τη συσκευή, για ευκολότερη ανάλυση. Στο τέλος κάθε μέτρησης, καθαρίστηκαν τα υπολείμματα με χαρτί. Η φωτομέτρηση για το DNA γίνεται σε μήκος κύματος 260nm, όπου το DNA έχει τη μέγιστη απορρόφηση, και από τη τιμή της οπτικής πυκνότητας (optical density, O.D.) το Nanodrop υπολογίζει αυτόματα τη συγκέντρωση του DNA. Ταυτόχρονα εκτελείται και η μέτρηση του ίδιου δείγματος στα 280nm (μήκος κύματος όπου απορροφούν οι πρωτεΐνες) για τον έλεγχο της περιεκτικότητας του δείγματος σε πρωτεΐνες. Ως γνωστόν, ο λόγος της O.D. 260nm /O.D. 280nm εκφράζει την καθαρότητα του δείγματος DNA. Το καθαρό DNA δίνει λόγο 1,8-2,0, ενώ εάν υπάρχουν προσμίξεις πρωτεΐνης στο δείγμα, ο λόγος είναι μικρότερος από 1,8 και το δείγμα DNA δεν είναι πολύ καθαρό. Επίσης, ο λόγος της O.D. 260nm /O.D. 230nm εκφράζει την καθαρότητα του δείγματος από οργανικούς διαλύτες, που προέρχονται από τη μέθοδο απομόνωσης του DNA

51 3.4 Πολυμορφισμός-στόχος της παρούσας μελέτης Ο πολυμορφισμός που μελετήθηκε, στην παρούσα μελέτη, ως προς τη σύνδεσή του με τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς rs και rs και, κατά επέκταση, με τα επίπεδα της HbF σε ασθενείς με ενδιάμεση ή μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και σε υγιή (μη-θαλασσαιμικά) άτομα, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 και συγκεκριμένα στον υποκινητή του γονιδίου MAP3K5 (Εικόνα 3.1). Πρόκειται για σύμπλεγμα διαδοχικών επαναλήψεων (ένα «Short Tandem Repeat» -STR), όπου η αλληλουχία 5 -GCGCG-3 επαναλαμβάνεται, τέσσερις ή πέντε φορές, και βρίσκεται μεταξύ των θέσεων -51 και -27 από το σημείο έναρξης της μεταγραφής. Εικόνα 3.1 : (α) Περιοχή εντοπισμού του γονιδίου MAP3K5 ( (β) Τμήμα του γονιδίου MAP3K5. Θέσεις των SNP rs και rs και του STR του υποκινητή του γονιδίου MAP3K

52 Η ανισορροπία σύνδεσης (Linkage Disequilibrium - LD) μεταξύ των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών rs και rs του MAP3K5 και του STR στον υποκινητή του MAP3K5 μελετήθηκε με τη χρήση της βάσης δεδομένων για τους Καυκάσιους (CEU), HapMap Phase II+III (Release 28, August 2010) ( και οπτικοποιήθηκε στο πρόγραμμα HaploView 4.2 ( programs/medical-and-populationgenetics/haploview/haploview). 3.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) Για το σχεδιασμό του ζεύγους εκκινητών, που απαιτείται για τον πολυμερισμό του τμήματος του γονιδιωματικού DNA που περιέχει το STR, χρησιμοποιήθηκαν υπολογιστικά προγράμματα και ακολουθήθηκαν τα παρακάτω βήματα: 1. Προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA που περιέχει το STR του υποκινητή του γονιδίου MAP3K5. Μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl ( εντοπίστηκε η θέση του STR και μέρος της αλληλουχίας που το περιβάλλει (Εικόνα 3.2). 2. Σχεδιασμός εκκινητών. Με βάση την αλληλουχία από το Ensembl έγινε ο σχεδιασμός των εκκινητών με τη χρήση του προγράμματος Primer3 ( (Εικόνα 3.3). Το προϊόν της PCR σχεδιάστηκε έτσι ώστε ο πολυμορφισμός να εντοπίζεται περίπου στο κέντρο του. Στο Primer3 μπορούν να ελεγχθούν κάποιες βασικές παράμετροι, όπως η θερμοκρασία υβριδισμού (T m ) των εκκινητών και η ποσοστιαία περιεκτικότητά τους σε βάσεις γουανίνη και κυτοσίνη (GC %). Γενικά, θα πρέπει οι T m των εκκινητών να μη διαφέρουν περισσότερο από 5ºC, να είναι όσο το δυνατόν παρόμοιες και μεταξύ 52-62ºC, ώστε να υβριδοποιούνται εξίσου καλά σε μια ειδική θερμοκρασία στο DNA στόχο. Η περιεκτικότητα σε GC πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40-60%, ώστε ο υβριδισμός των εκκινητών να είναι ισχυρός και σταθερός. Επίσης, το μήκος τους να είναι γύρω στα νουκλεοτίδια

53 Εικόνα 3.2: Βάση δεδομένων Ensembl. Εντός του κόκκινου κύκλου βρίσκεται το STR του υποκινητή του γονιδίου MAP3K5 ( Εικόνα 3.3: Primer3 (

54 3. Έλεγχος εκκινητών για ειδικότητα. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε το BLAST (Basic Local Alignment Tool) του Ensembl ( (Εικόνα 3.4). Το BLAST εξετάζει κατά πόσο οι εκκινητές που έχουν σχεδιαστεί είναι ειδικοί μόνο για την αλληλουχία στόχο του ανθρώπινου γονιδιώματος στην οποία στοχεύει το εν λόγω πείραμα. Αν οι δύο εκκινητές στοχεύουν σε περισσότερες από μια περιοχές ο καθένας, ενδεχομένως η αντίδραση PCR στην οποία θα χρησιμοποιηθούν να αποδώσει και μη-ειδικά προϊόντα. Εικόνα 3.4: BLAST (Basic Local Alignment Tool) του Ensembl ( 4. Έλεγχος συμπληρωματικότητας εκκινητών. Με το πρόγραμμα DNAMAN ελέγχθηκε η συμπληρωματικότητα των εκκινητών μεταξύ τους, αλλά και του καθενός με τον εαυτό του (self-complementarity). Είναι σημαντικό να αποκλειστούν ενδεχόμενα σχηματισμού διμερών των εκκινητών (primer dimers) που θα στερήσει από την PCR αντίδραση την απαραίτητη ποσότητα εκκινητών για αυξημένη απόδοση. Επίσης, τα 3 άκρα των εκκινητών δε θα πρέπει να είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους, καθώς ενδέχεται να σχηματίσουν διμερή εκκινητών που πολυμερίζονται πολύ πιο εύκολα κατά την PCR, σε σχέση με το μεγαλύτερο προϊόν-στόχο

55 5. Έλεγχος για δευτεροταγείς δομές του DNA προϊόντος της PCR. Το πρόγραμμα DINAMelt ( αποτελεί εργαλείο πρόβλεψης συμπεριφοράς του PCR προϊόντος κατά τον υβριδισμό των εκκινητών με το DNA-στόχο. Χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής (αναδίπλωσης) της αλληλουχίας του PCR προϊόντος που οριοθετείται από τις αλληλουχίες των εκκινητών. Σημαντικό είναι να μην σχηματίζονται θηλιές και άλλες αναδιπλώσεις στα άκρα της αλληλουχίας, δηλαδή στις περιοχές που υβριδοποιούνται οι εκκινητές, διότι αυτό θα παρεμποδίσει την πρόσδεσή τους και την εξέλιξη της PCR-αντίδρασης. ακόλουθοι: Oι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη γονοτύπηση του STR είναι οι Forward: 5 -GAGGCGATCGAAAGAGAAAC-3 Reverse: 5 -CGGAGCTTCCTTTTCTTGG-3. Το μέγεθος του PCR προϊόντος είναι 352 bp (βρίσκεται μεταξύ των θέσεων έως και +79 από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του ΜΑΡ3Κ5) και η αλληλουχία του είναι η εξής (η επανάληψη επισημαίνεται με κίτρινο, ενώ οι εκκινητές με υπογράμμιση): 5 -GAGGCGATCGAAAGAGAAACGAGGCCAGGCAAGGAGGAGGAAATCC ACCCGATGAAGGCGAGCTGCCGCCTAAGAGGGAGGAGGGTCCTTTCGGC TGCCGCTGCTGCTGTTCCGGGACGCCGCCTGGGGAGCCAGCCCGCTCGTA AGGTGCGCGCCAGGTAGCTCCGCACCCAGGGGGCGCCCTTCCTGGCCCCT CCCAGAGCGGCCGGGACGGAAGGAGCTGCGCGGCGCGGCGCGGCGCGGC GCGGCGGGTGGCGAGGGCGGGCTGCACCCCGAGCGCGGCGCCCTTGAGC TGCACCGCGGCGCAGGTTTGCGAGCCGACTTGTCAGCCGGCCAAGAAAA GGAAGCTCCG Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Η βασικότερη από τις εργαστηριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια της συγκεκριμένης μελέτης είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Η επινόηση της τεχνικής της PCR περιγράφηκε για πρώτη φορά στα μέσα της δεκαετίας του 1980 (Saiki et al., Science, 1985 και

56 Mullis & Faloona, Methods Enzymol, 1987) και το 1993 ο Κ. Mullis τιμήθηκε για την επινόηση της PCR με το βραβείο Nobel Χημείας (Saiki et al., 1985, Mullis and Faloona, 1987). Η PCR αντίδραση βασίζεται στον ενζυμικό πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. Συγκεκριμένα γίνεται εκθετικός πολλαπλασιασμός των μορίων DNA από τη θερμοσταθερή Taq DNA πολυμεράση του βακτηρίου Thermus aquaticus (Εικόνα 3.5) (Saiki et al., 1988). Η συγκεκριμένη αλληλουχία του DNA που πολλαπλασιάζεται εκθετικά κατά την PCR οριοθετείται από το ζεύγος των εκκινητών, δηλαδή από ένα ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων, καθένας από τους οποίους υβριδοποιείται στο συμπληρωματικό του κλώνο στο δίκλωνο μόριο του DNA-στόχου. Οι υβριδοποιημένοι εκκινητές λειτουργούν ως υπόστρωμα για τη θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση κι έτσι για κάθε αλυσίδα του υποστρώματος δημιουργείται ένας συμπληρωματικός κλώνος DNA μέσω της διαδοχικής προσθήκης ελεύθερων δεοξυ-ριβονουκλεοτιδίων (datp, dttp, dctp, dgtp). Η διαδικασία της PCR περιλαμβάνει τρία βήματα που ορίζουν έναν κύκλο: 1. Αποδιάταξη (denaturation) των DNA μορίων σε μονόκλωνα, στους 95 ο C. 2. Υβριδοποίηση (annealing) των εκκινητών με το συμπληρωματικό τους DNA-στόχο, σε θερμοκρασία που εξαρτάται από το μήκος και την αλληλουχία των τμημάτων, στην προκειμένη περίπτωση στους 60 ο C. 3. Επιμήκυνση (elongation) των υβριδοποιημένων εκκινητών από την Taq πολυμεράση, όπου χρησιμοποιώντας ως μήτρα τους εκκινητές επιμηκύνει με κατεύθυνση 5 προς 3 τους θυγατρικούς κλώνους του DNA, στους 72 ο C. Τα τρία αυτά βήματα (αποδιάταξης - υβριδοποίησης - επιμήκυνσης) επαναλήφθηκαν για 40 κύκλους στην παρούσα μελέτη, με αποτέλεσμα τα μόρια που παράγονται από τον προηγούμενο κύκλο σε κάθε περίπτωση να χρησιμεύουν ως εκμαγεία για κάθε επόμενο κύκλο. Η αύξηση του αριθμού των αντιγράφων-κλώνων είναι εκθετική και θεωρητικά ισούται με 2 n, όπου n ο αριθμός των κύκλων, δηλαδή θεωρητικά, στη συγκεκριμένη μελέτη, το πλήθος των αντιγράφων-κλώνων στο τέλος της αντίδρασης PCR είναι Παρόλα αυτά όμως, η απόδοση συνήθως είναι μικρότερη της θεωρητικά αναμενόμενης

57 Εικόνα 3.5: Σχηματική αναπαράσταση της εκθετικής αύξησης των αντιγράφων DNA κατά την PCR. Parental strands: αρχικά μόρια DNA, Melt: αποδιάταξη του DNA, Anneal: υβριδοποίηση εκκινητών με το DNA-στόχο, Extend: επιμήκυνση του προϊόντος ( Τα δείγματα τοποθετούνται στον θερμικό κυκλοποιητή (thermal cycler), ειδικό όργανο σχεδιασμένο να εκτελεί τα βήματα των κύκλων της PCR στους επιθυμητούς χρόνους και θερμοκρασίες. Γενικά, η PCR είναι μια μέθοδος που εμφανίζει ιδιαίτερη ευαισθησία, καθώς μπορεί να εφαρμοστεί με ελάχιστη ποσότητα αρχικού DNA και υψηλή πιστότητα αντιγραφής (Watson et al., 2007). Αντιδραστήρια και διαδικασία της PCR: Για την PCR χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα KAPA2G Fast HotStart ReadyMix της εταιρίας KAPABIOSYSTEMS. Τα KAPA2G Fast HotStart ReadyMix Kits έχουν σχεδιαστεί για ταχεία PCR υψηλής απόδοσης, στην οποία ο ολικός χρόνος αντίδρασης μειώνεται κατά 20-70% σε σχέση με αυτόν των συμβατικών PCR. Το έτοιμο αυτό μίγμα περιλαμβάνει όλα τα αντιδραστήρια για ταχεία PCR, εκτός από τους εκκινητές και το υπόστρωμα. Έτσι, περιλαμβάνει την KAPA2G Fast HotStart DNA πολυμεράση, το KAPA2G Fast HotStart PCR

58 ρυθμιστικό διάλυμα (Buffer), δεοξυ-ριβονουκλεοτίδια (0,2mM από κάθε dntp σε 1X), MgCl 2 (1,5 mm σε 1X) και σταθεροποιητές. Σε αυτή την «έναρξης εν θερμώ» (hot start) αντίδραση το ένζυμο συνδυάζεται με ένα αντίσωμα το οποίο διατηρεί απενεργοποιημένο το ένζυμο έως το πρώτο βήμα αποδιάταξης. Αυτό εξαλείφει τα μη-ειδικά προϊόντα πολυμερισμού που προκύπτουν από μη-ειδικές αλληλεπιδράσεις των εκκινητών (non-specific-priming events) κατά την ανάμιξη των συστατικών της αντίδρασης ή την έναρξη θέρμανσης κατά τον πρώτο κύκλο, και αυξάνει έτσι την συνολική απόδοση της αντίδρασης. Τα αντιδραστήρια αναμιγνύονταν στον αποστειρωμένο χώρο του θαλάμου νηματικής ροής LABCAIRE το δείγμα DNA προσετίθετο τελευταίο, σε θάλαμο υπεριώδους (UV cabinet). Η γενετική στειρότητα του χώρου αποτελεί σημαντική προϋπόθεση για την αποφυγή των επιμολύνσεων των αντιδράσεων από ξένο DNA που πιθανόν να αιωρείται στην ατμόσφαιρα του χώρου προετοιμασίας της PCR ή από άλλο PCR-προϊόν. Όσον αφορά τα ειδικά σωληνάκια για την PCR (PCR-tubes) στα οποία εκτελέστηκε η αντίδραση, χρησιμοποιήθηκαν σειρές 8 σωληναρίων, όγκου 0,2 ml το καθένα, της εταιρίας Kisker. Για την προετοιμασία της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν αποκλειστικά απορριπτόμενα ρύγχη με φίλτρο της εταιρίας Greiner, ώστε να διασφαλιστεί η αποφυγή επιμολύνσεων. 3.7 Πρωτόκολλο PCR-αντίδρασης Γενικά, για κάθε αντίδραση PCR αναμιγνύονται τα αντιδραστήρια με συγκεκριμένη και ίδια πάντα σειρά. Ο πίνακας 3.1 παρουσιάζει τα αντιδραστήρια με τη σειρά που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του τμήματος DNA που φέρει το STR του υποκινητή του γονιδίου MAP3K5. Στον πίνακα 3.2 παρουσιάζονται οι συνθήκες της αντίδρασης

59 Πίνακας 3.1: Πρωτόκολλο μίξης αντιδραστηριών για την αντίδραση PCR, για τον πολυμερισμό του τμήματος DNA που φέρει το STR του υποκινητή του γονιδίου MAP3K5. Αντιδραστήριο Αρχική Συγκέντρωση Τελική Συγκέντρωση Όγκος (μl) ανά αντίδραση Η 2 Ο (PCR-grade) - - 7,7 μ KAPA2G Fast HotStart ReadyMix Ευθύς εκκινητής (Forward primer) Αντίστροφος εκκινητής (Reverse primer) ,5 μ 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μ 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μ Δείγμα DNA 38,5 g/μ 50 g/αντίδραση 1,3 μ Τελικός όγκος αντίδρασης μ Πίνακας 3.2: Πρόγραμμα της αντίδρασης PCR στον αυτόματο θερμοκυκλοποιητή. Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95º C 2 min 2 ο : Αποδιάταξη 95º C 15 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 60 º C 15 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72º C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72º C 30 sec 7 ο : Συντήρηση της αντίδρασης 4º C 3.8 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού, χαρακτηρισμού και απομόνωσης τμημάτων DNA και αυτό γιατί είναι απλή, γρήγορη στην εφαρμογή και αρκετά ευαίσθητη στο διαχωρισμό τμημάτων DNA. Eίναι μια διαδικασία κατά την οποία το αρνητικά φορτισμένο μόριο του DNA κινείται μέσα σε ένα πορώδες πήκτωμα αγαρόζης υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Ωστόσο, για τον διαχωρισμό τμημάτων DNA με διαφορά

60 μεγέθους μιας βάσης προτιμάται η χρήση πηκτωμάτων ενός άλλου πολυμερούς, της πολυακρυλαμίδης. Καθώς μετακινούνται, τα διαφορετικά μόρια DNA σχηματίζουν χαρακτηριστικές ζώνες σε διαφορετικές περιοχές του πηκτώματος, ανάλογα με την ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA. Οι ζώνες γίνονται ορατές με προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο πήκτωμα και έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Το βρωμιούχο αιθίδιο ενσωματώνεται στις αύλακες του δίκλωνου μορίου DNA και φθορίζει όταν διεγείρεται με UV. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης εξαρτάται κυρίως από τους παρακάτω παράγοντες: 1. Το μέγεθος του τμήματος DNA που ηλεκτροφορείται. Όσο μεγαλύτερα είναι τα μόρια, τόσο μικρότερη είναι η κινητικότητά τους, διότι δυσκολεύονται να διέλθουν μέσα από τους πόρους του πηκτώματος. 2. Η στερεοδιάταξη του DNA. Αυτή η παράμετρος είναι σημαντική διότι DNA με κλειστή και υπερελικωμένη κυκλική μορφή, ανοιχτή κυκλική μορφή και το γραμμικό DNA έχουν διαφορετική κινητικότητα ακόμα και αν έχουν το ίδιο μέγεθος. 3. Η επί τοις εκατό περιεκτικότητα της πηκτής σε αγαρόζη. Γενικότερα ισχύει μια γραμμική σχέση μεταξύ του λογαρίθμου της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του DNA (μ) και της συγκέντρωσης του πηκτώματος (τ) που περιγράφεται από τον τύπο: log μ = log μ 0 -K r τ όπου μ 0 είναι η ελεύθερη κινητικότητα του DNA και Κ r ο συντελεστής καθυστέρησης που έχει σχέση με τις ιδιότητες του πηκτώματος, το μέγεθος και το σχήμα των κινούμενων μορίων. 4. Η παρεχόμενη τάση ηλεκτρικού ρεύματος (Volts). Σε χαμηλές τάσεις η κινητικότητα των μορίων είναι ανάλογη της τάσης που εφαρμόζεται. Αντίθετα σε αυξημένη τάση παρατηρείται μείωση της ικανότητας διαχωρισμού των μεγαλύτερων σε μέγεθος τμημάτων DNA. 5. Η ιοντική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης, όπως του TAE buffer, που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιείται και για τον εμπειρικό υπολογισμό της συγκέντρωσης του DNA σε ένα διάλυμα και γίνεται

61 ουσιαστικά μέσω της σύγκρισης της έντασης της ζώνης του υπό εξέταση μορίου DNA σε σχέση με την ένταση των ζωνών του DNA αναφοράς, δείκτη (ladder, marker) του οποίου η συγκέντρωση είναι γνωστή για την κάθε ζώνη. Για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: 1) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (1x) Σύσταση 1000 m διαλύματος (50 ): 242 g Tris 100 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) 57,1 ml Glacial acetic acid Δις απεσταγμένο Η 2 Ο (dd Η 2 Ο) έως τελικού όγκου 1000 ml 2) Αγαρόζη της εταιρίας Biora (Mo cu ar Bio ogy Agaros ) 3) Βρωμιούχο αιθίδιο (10 mg/ml) Το πήκτωμα αγαρόζης που χρησιμοποιήθηκε είχε διαφορετική περιεκτικότητα ανάλογα με το σκοπό της χρήσης του. Έτσι για απλή ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων, είτε πριν είτε μετά τον καθαρισμό, παρασκευάστηκε συνήθως πήκτωμα με περιεκτικότητα σε αγαρόζη 1% w/v (Εικόνα 3.6, οι ζώνες βρίσκονται στα 352 bp). Στην περίπτωση που ήταν επιθυμητή η διάκριση των ετεροζυγωτών, όπου σε αυτή την περίπτωση με τη λήξη της αντίδραση PCR σχηματίζονται ετεροδιμερή που έχουν διαφορετική, και συγκεκριμένα μειωμένη ηλεκτροφορητική ικανότητα, σε σχέση με τα ομοδιμερή, χρησιμοποιήθηκε πήκτωμα υψηλότερης περιεκτικότητας σε αγαρόζη, δηλαδή 3,5% w/v, ώστε να διακριθούν οι δύο ζώνες (Εικόνα 3.7). Ο όγκος του πηκτώματος που παρασκευαζόταν κάθε φορά ήταν ανάλογος με τον αριθμό των δειγμάτων, δηλαδή για μέχρι 13 δείγματα ο όγκος ήταν 70 ml, ενώ για περισσότερα δείγματα ή για τη διάκριση των ετεροδιμερών 120 ml

62 Εικόνα 3.6: Πήκτωμα με περιεκτικότητα σε αγαρόζη 1% w/v. Οι ζώνες που αντιστοιχούν στο PCR προϊόν βρίσκονται στα 352bp. Εικόνα 3.7: Αποτέλεσμα ανάλυσης ετεροδιμερών μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα περιεκτικότητας 3,5% w/v σε αγαρόζη, με σκοπό τη γονοτύπηση με διάκριση των ετεροζυγωτών (φυσικών ή τεχνητών). Σε αυτή την περίπτωση με τη λήξη της αντίδρασης PCR σχηματίζονται ετεροδιμερή που έχουν μειωμένη ηλεκτροφορητική κινητικότητα, σε σχέση με τα ομοδιμερή. Το πήκτωμα της αγαρόζης παρασκευάστηκε με τον παρακάτω τρόπο: Α) Διαλυτοποιήθηκε με θέρμανση η ποσότητα αγαρόζης στον αντίστοιχο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ΤΑΕ 1x, σύμφωνα με τον πίνακα

63 Πίνακας 3.3: Ποσότητες συστατικών για την παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης ποικίλης περιεκτικότητας. Όγκος-Περιεκτικότητα ΤΑΕ 1x (ml) Αγαρόζη (g) EtBr (μl) 70 ml - 1% 70 0, ml - 1% 120 1, ml - 3,5% 120 4,2 12 Β) Στο ρευστό ακόμα πήκτωμα, σε θερμοκρασία περίπου ο C, δηλαδή πριν τον πολυμερισμό της αγαρόζης, προστέθηκε ο αντίστοιχος όγκος (σύμφωνα με τον πίνακα 3.3) βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr). Γ) Το υγρό πήκτωμα αγαρόζης μεταφέρθηκε σε καλούπι, για να αποκτήσει το κατάλληλο σχήμα, αφού προηγουμένως είχε τοποθετηθεί σε απόσταση περίπου 2 cm από την άκρη του καλουπιού και κάθετα σε αυτό μία πλαστική «χτένα». Η «χτένα» είναι βυθισμένη στο πήκτωμα, έτσι ώστε μετά τον πολυμερισμό της αγαρόζης, να δημιουργηθούν τα κατάλληλα «πηγάδια ή φρεάτια» στο πήκτωμα, σημεία στα οποία θα τοποθετηθούν τα προς διαχωρισμό δείγματα DNA. Για τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκαν: 1) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (1x) (Running buffer) 2) 6 Orange G διάλυμα φόρτωσης (Loading Buffer) Σύσταση: 30 ml γλυκερόλη 70 ml νερό 0,25g orange G 3) 50 bp ή 100 bp DNA Ladder της εταιρίας New England Biolabs (NEB) Μετά τον πολυμερισμό της αγαρόζης, το πήκτωμα τοποθετήθηκε στη δεξαμενή της ηλεκτροφορητικής συσκευής και εμβαπτίστηκε σε διάλυμα TAE 1x (Running buffer). Πριν φορτωθούν τα δείγματα DNA στα πηγάδια, προστέθηκαν 3μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (loading buffer) σε κάθε δείγμα. Το διάλυμα φόρτωσης περιέχει γλυκερόλη, η οποία έχει μοριακό βάρος μεγαλύτερο του ρυθμιστικού διαλύματος ΤΑΕ (1x) και συντελεί στην καθίζηση των δειγμάτων εντός των πηγαδιών. Επίσης, λόγω του orange G που περιέχει, το μίγμα καθίσταται ορατό

64 τόσο κατά τη διαδικασία της φόρτωσης, όσο και κατά την πορεία της ηλεκτροφόρησης. Στη συνέχεια: Α) Φορτώθηκαν τα δείγματα με μικροπιπέττα στα πηγάδια της πηκτής, εκτός του πρώτου, που παρέμενε κενό. Β) Στο πρώτο πηγάδι, προστέθηκαν 3 μl από το μάρτυρα μοριακών μεγεθών (DNA Ladder), ο οποίος φέρει μείγμα κομματιών DNA γνωστού μεγέθους. Γ) Εφαρμόστηκε τάση (ΔV, διαφορά δυναμικού) στα δύο άκρα της δεξαμενής ηλεκτροφόρησης, με τη βοήθεια κατάλληλου τροφοδοτικού, το οποίο διακόπτεται περίπου μετά από min ανάλογα με τη τάση που έχει εφαρμοστεί (συνήθως V). Στην περίπτωση που ήταν επιθυμητή η διάκριση των ετεροζυγωτών, εφαρμόστηκε τάση 80V για τρεις ώρες (3h). Δ) Για την παρατήρηση του αποτελέσματος, τοποθετήθηκε το πήκτωμα πάνω σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας (UV Transilluminator) και φωτογραφήθηκε. 3.9 Καθαρισμός των PCR-προϊόντων Πριν την εκτέλεση της αλληλούχιση είναι απαραίτητο τα προϊόντα της PCR να καθαριστούν από υπολείμματα εκκινητών, δεοξυριβονουκλεοτιδίων και ρυθμιστικού διαλύματος, προκειμένου το χρωμόγραμμα αλληλούχισης DNA που προκύπτει από τον αυτόματο γενετικό αναλυτή (sequencer) να είναι όσο το δυνατόν πιο ποιοτικό, με μειωμένο θόρυβο υποβάθρου. Για τον καθαρισμό χρησιμοποιήθηκε το σύστημα αντιδραστηρίων PCR and DNA Fragment Purification Kit της εταιρείας Dongsheng Biotech. Η διαδικασία καθαρισμού εκτελέστηκε σε θερμοκρασία δωματίου ως εξής: 1. Προστέθηκε αποστειρωμένο H 2 O στα δείγματα μέχρι τελικού όγκου 50 μl

65 2. Αμέσως μετά προστέθηκαν 50 μl διαλύματος πρόσδεσης (Binding Buffer), όπου ακολουθήθηκε καλή ανάδευση. 3. Το μίγμα μεταφέρθηκε στη στήλη (Spin Column), όπου παρέμεινε για 2 min. 4. Φυγοκέντρηση της στήλης, σε ταχύτητα rpm (round per minutes), για 1 min και στη συνέχεια απόρριψη του διηθήματος. Έτσι το DNA συγκρατήθηκε στη στήλη με τη βοήθεια του διαλύματος πρόσδεσης. 5. Προσθήκη στη στήλη 500 μl διαλύματος πλύσης (Wash Buffer PE), στο οποίο είχε προστεθεί εξαρχής αιθανόλη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η στήλη φυγοκεντρήθηκε πάλι, με ταχύτητα rpm, για 1 min και το διήθημα απορρίφθηκε. Αυτό το βήμα επαναλαμβάνεται άλλη μία φορά, ώστε να απομακρυνθούν όλα τα υπολείμματα από τη στήλη και να παραμείνει προσδεμένο μόνο το επιθυμητό τμήμα DNA. 6. Επαναφυγοκέντρηση της στήλης με ταχύτητα rpm για 3 min και απόρριψη του διηθήματος, προκειμένου να απομακρυνθεί όλη η ποσότητα του διαλύματος πλύσης. Αυτό το βήμα είναι απαραίτητο καθώς η παρουσία υπολειμμάτων αιθανόλης στο DNA δείγμα μπορεί να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. 7. Φυγοκέντρηση του δείγματος με ταχύτητα rpm για 1 min με ανοικτό το καπάκι, ώστε να εξατμιστούν τυχόν υπολείμματα αιθανόλης. 8. Τοποθέτηση της στήλης σε καθαρό σωληνάκι Eppendorf του 1,5 ml και προσθήκη 30 μl από το διάλυμα έκλουσης (Elution Buffer TE) που ήταν προθερμασμένο στους 60 ο C ώστε να αυξήσει την απόδοση σε γονιδιωματικό DNA. 9. Επώαση της στήλης για 2 min, σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκέντρηση της στήλης για 1 min, σε ταχύτητα rpm

66 10. Το τελικό διήθημα περιελάμβανε το καθαρό προϊόν PCR και αποθηκεύτηκε στους -20 ο C Αλληλούχιση: προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας μορίων DNA (DNA Sequencing) Η τεχνική της αλληλούχισης ξεκίνησε με την αλληλούχιση του RNA, με σημαντικό επίτευγμα τον προσδιορισμό της αλληλουχίας ολόκληρου του μορίου του μεταφορικού RNA της αλανίνης του Ζυμομύκητα από τον Robert Holley και τους συνεργάτες του, τo Επίσης, αξιοσημείωτη ήταν η πλήρης αλληλούχιση δύο γονιδίων του RNA βακτηριοφάγου MS2 από τον Walter Fiers και τους συνεργάτες του, το 1976, καθώς και ολόκληρου του γονιδιώματος του βακτηριοφάγου από άλλες ερευνητικές ομάδες. Αλλά ορόσημο αποτελεί η επινόηση της μεθόδου αλληλούχισης DNA κατά Sanger, ο οποίος το 1977 ανέφερε την πρώτη πλήρη αλληλουχία γονιδιώματος από DNA (Watson et al., 2007). Η μεγάλη ταχύτητα με την οποία επιτελείται η σύγχρονη, πλέον, μέθοδος αλληλούχισης αποδείχθηκε καθοριστικός παράγοντας στην αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος κατά τη διεξαγωγή του «Human Genome Project». Η αλληλούχιση ενός μορίου DNA, δηλαδή η μέθοδος ταυτοποίησης της σειράς των νουκλεοτιδικών βάσεων, αδενίνης, γουανίνης, κυτοσίνης και θυμίνης, στο μόριο του DNA, με τη μέθοδο «τερματισμού της επιμήκυνσης της αλυσίδας» (chain termination) που επινόησε ο Sanger έγινε σύντομα μέθοδος επιλογής, λόγω της αξιοπιστίας και ευκολίας στη χρήση της για την αλληλούχιση του DNA (Sanger et al., 1992). Η βασική αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στη χρήση τριφωσφορικών 2', 3'-διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntp), ως μόρια τερματισμού της DNA-αλληλουχίας. Για την εφαρμογή της μεθόδου αυτής απαιτείται ένα μονόκλωνο DNA υπόστρωμα, ένας DNA-εκκινητής (είτε ευθύς ή forward είτε αντίστροφος ή reverse εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε στην PCR), μια DNA-πολυμεράση, δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntp) και τα τροποποιημένα τριφωσφορικά 2',3'- διδεοξυνουκλεοτίδια (ddntp). Τα τροποποιημένα τριφωσφορικά 2',3'-διδεοξυνουκλεοτίδια (ddntp) τερματίζουν το σχηματισμό της αλυσίδας DNA, διότι δεν διαθέτουν 3 -ΟΗ ομάδα που απαιτείται για τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ δύο

67 νουκλεοτιδίων, τερματίζοντας την επιμήκυνση και καταλήγοντας στο σχηματισμό τμημάτων DNA ποικίλου μήκους. Καθένα από τα τέσσερα ddntp είναι επισημασμένο με διαφορετική φθορίζουσα ομάδα, που εκπέμπει φως σε διαφορετικό μήκος κύματος, ώστε να καταστεί δυνατή η ανίχνευσή τους σε αυτόματους αναλυτές. Σε όλες τις σύγχρονες μεθόδους τα αποτελέσματα αναλύονται σε υπολογιστή με ειδικά software. Με την εναλλακτική μέθοδο της «αλληλούχισης με τερματισμό της επιμήκυνσης με χρώση» (dye-terminator sequencing), λόγω του γεγονότος ότι τα φωτεινά σήματα που εκπέμπονται από κάθε μία χρωστική διακρίνονται μεταξύ τους από κάμερα φθορισμού του αναλυτή, οι τέσσερις αντιδράσεις τερματισμού των αλυσίδων γίνονται ταυτόχρονα σε μία αντίδραση και διαχωρίζονται σε μία μόνο διαδρομή ενός πηκτώματος ηλεκτροφόρησης ή σε τριχοειδή σωλήνα (Εικόνα 3.8) (Watson et al., 2007). Εικόνα 3.8: Εικονική αναπαράσταση των αποτελεσμάτων από ένα πείραμα αλληλούχισης (α) με ραδιενεργή σήμανση που χρησιμοποιούνταν παλαιότερα, και (β) με αυτοματοποιημένη «αλληλούχιση με τερματισμό της επιμήκυνσης με χρώση» (dye-terminator sequencing) όπως παράγεται από έναν αυτοματοποιημένο αναλυτή αλληλουχίας ( Στη συσκευή αλληλούχισης με τριχοειδείς σωλήνες (κοινώς γνωστά ως «τριχοειδή»), τα φθοροσημασμένα DNA προϊόντα αλληλούχισης ηλεκτροφορούνται μέσα σε τριχοειδή σωληνάρια διαμέτρου μικρότερης των 0,5 mm και μήκους περίπου 48 cm, ενώ το υλικό που περιέχουν είναι παρόμοιο με το πολυακρυλαμίδιο που χρησιμοποιείται στα κοινά πηκτώματα, μαζί με ουρία. Η συσκευή αυτή έχει πολύ

68 μεγάλο βαθμό αυτοματοποίησης, έτσι ώστε να αναρροφά αυτόματα έναν πολύ μικρό όγκο δείγματος και να το φορτώνει στο τριχοειδές, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί διαδοχικά πολλές φορές (Watson et al., 2007). Ο πολυμερισμός, που εκτελείται σε θερμοκυκλοποιητή, ο καθαρισμός και η αναδιάλυση σε ρυθμιστικό διάλυμα πριν την φόρτωση του δείγματος στη συσκευή αλληλούχισης εκτελούνται ξεχωριστά. Τα επισημασμένα με φθορίζουσα ομάδα τμήματα εντοπίζονται αυτόματα σε πραγματικό χρόνο κατά την ηλεκτροφόρηση σε «τριχοειδή», καθώς κάθε διαδοχικό τμήμα, το οποίο είναι κατά μία βάση μεγαλύτερο από το προηγούμενο, διέρχεται από το σύστημα ανίχνευσης της συσκευής αλληλούχισης. Αυτό το σύστημα ανίχνευσης λειτουργεί με λέιζερ, το οποίο διεγείρει τη χρωστική που είναι προσδεδεμένη σε κάθε ddntp, στο άκρο κάθε τμήματος DNA, η οποία εκπέμπει ένα σήμα που είναι χαρακτηριστικό για την κάθε χρωστική. Ευαίσθητοι ανιχνευτές συλλέγουν αυτά τα σήματα, τα οποία στέλνονται για ανάλυση σε έναν υπολογιστή που με τη βοήθεια κατάλληλου αλγορίθμου αναγνωρίζει τη βάση που βρίσκεται στο 3 άκρο του τμήματος (Εικόνα 3.9). Ο υπολογιστής αποδίδει τα δεδομένα σε ένα χρωμόγραμμα, όπου αναπαριστάται η ένταση καθενός από τα φθορίζοντα σήματα ως συνάρτηση του χρόνου ηλεκτροφόρησης (Εικόνα 4.2) (Watson et al., 2007). Λόγω της ταχύτητάς της, η μέθοδος με τους τριχοειδείς σωλήνες αποτελεί μέθοδο επιλογής στην αυτοματοποιημένη αλληλούχιση. Οι περιορισμοί της μεθόδου αφορούν την ανίχνευση της χρωστικής και τις διαφορές στην ενσωμάτωση των ddntp στο νεοσυντιθέμενο DNA τμήμα, οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ανομοιόμορφων κορυφών στο χρωμόγραμμα που λαμβάνεται μετά την ηλεκτροφόρηση σε «τριχοειδή». Τα τελευταία χρόνια, ιδιαίτερος λόγος γίνεται για την «αλληλούχιση υψηλής ταχύτητας διεκπεραίωσης ή αλληλούχιση επόμενης γενεάς» (High-throughput sequencing/next generation sequencing), κατά την οποία εκτελείται παράλληλα η διαδικασία της αλληλούχισης σε πολλαπλούς στόχους, παράγοντας χιλιάδες ή εκατομμύρια αλληλουχίες, ενώ το κόστος της αλληλούχισης μειώνεται (Hall, 2007)

69 Εικόνα 3.9: Αυτοματοποιημένη αλληλούχιση. (α) Σύνθετη αντίδραση αλληλούχισης με τερματισμό της επιμήκυνσης με χρώση. (β) Σχηματική παρουσίαση του συστήματος ανίχνευσης μιας συσκευής αυτόματης αλληλούχισης φθορισμού τεσσάρων χρωμάτων (Watson et al., 2007) Ανάλυση ετεροδιμερών (heteroduplex analysis) Στα πρώτα 38 δείγματα (15 από ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, 11 από ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία και 12 από υγιή άτομα) ο προσδιορισμός του γονότυπου πραγματοποιήθηκε με αλληλούχιση PCR προϊόντων. Στα υπόλοιπα δείγματα ο προσδιορισμός του γονότυπου πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ανάλυσης ετεροδιμερών. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι με ηλεκτροφόρηση σε χαμηλή τάση για αρκετές ώρες σε πήκτωμα αγαρόζης οι ετεροζυγώτες εμφανίζουν δύο ζώνες: Σε αυτή που αντιστοιχεί στο μεγαλύτερο μοριακό βάρος αντιστοιχούν τα ετεροδιμερή που σχηματίζονται με την πτώση της θερμοκρασίας στο τέλος της αντίδρασης PCR και έχουν μειωμένη ηλεκτροφορητική ικανότητα, σε σχέση με τα ομοδιμερή (είτε με τις πέντε, είτε με τις τέσσερις

70 επαναλήψεις) που συνιστούν τη δεύτερη, ειδική για το γονότυπο, ζώνη. Έτσι, έχοντας ένα δείγμα με γνωστό γονότυπο, ομόζυγο ως προς το αλληλόμορφο με τις πέντε επαναλήψεις, μετά το πέρας της αντίδρασης PCR όλα τα προς προσδιορισμό του γονότυπού τους δείγματα υπέστησαν την ακόλουθη διεργασία: Σε ένα PCR-tube τοποθετήθηκαν 10 μl από το άγνωστο δείγμα, ενώ σε ένα δεύτερο τοποθετήθηκαν 5 μl από το ίδιο άγνωστο δείγμα και 5 μl από το γνωστό δείγμα (ομόζυγο ως προς το αλληλόμορφο με τις πέντε επαναλήψεις). Έπειτα, εισήλθαν στο θερμοκυκλοποιητή, και πραγματοποιήθηκε το εξής πρόγραμμα: Θερμοκρασία Χρόνος 95 ο C 5min 68 ο C 1h 4 ο C Τέλος, τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν στα 80 V για περίπου τέσσερις ώρες σε πήκτωμα αγαρόζης 3,5%, έτσι ώστε στην πρώτη θέση του πηκτώματος να βρίσκονται πάντα τα 10 μl από το άγνωστο δείγμα ενώ στη δεύτερη το μείγμα του άγνωστου και του γνωστού δείγματος. Με τη μέθοδο αυτή παρατηρώντας το πήκτωμα κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία προσδιορίσαμε το γονότυπο: Στην περίπτωση του ετεροζυγώτη και στις δύο θέσεις εμφανίζονται δύο ζώνες, στην περίπτωση του ομόζυγου ως προς τις τέσσερις επαναλήψεις, στην πρώτη θέση εμφανίζεται μία ζώνη, ενώ στη δεύτερη δύο διότι έχουν σχηματιστεί «τεχνητά» ετερόζυγα, και στην περίπτωση του ομόζυγου ως προς τις πέντε επαναλήψεις και στις δύο θέσεις εμφανίζεται μία ζώνη, καθώς άγνωστο δείγμα και «τεχνητό» δείγμα, δε διέφεραν ως προς το πρότυπο ηλεκτροφόρησης (Εικόνα 3.7) Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκε στατιστική επεξεργασία της συχνότητας αλληλομόρφου με τη δοκιμασία χ 2 (chi-square) και της συχνότητας γονοτύπου με τη δοκιμασία χ 2 ή τη Fish r Exact (μη παραμετρικές), όπου σαν επίπεδο σημαντικότητας (p-value) ορίστηκε το 5% και συνεπώς, μία τιμή p <

71 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η τιμή αυτή δείχνει ότι υπάρχει μια πιθανότητα 5% η σχέση μεταξύ των μεταβλητών που βρίσκονται στο δείγμα μας να είναι "ψευδής" και είναι συνήθως η διαχωριστική γραμμή ως αποδεκτό "επίπεδο λάθους". Η δοκιμασία χ 2 χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της απόκλισης ανάμεσα σε θεωρητικά αναμενόμενες συχνότητες και στις παρατηρούμενες. Το χ 2 υπολογίζεται από την εξίσωση: χ 2 = (Π-Α) 2 Α όπου Π είναι οι παρατηρούμενες τιμές και Α οι θεωρητικά αναμενόμενες τιμές. Ουσιαστικά, αυτό που υπολογίζεται μέσω του χ 2, είναι η πιθανότητα (P) συμφωνίας των θεωρητικά αναμενόμενων τιμών με τις τιμές που παρατηρήθηκαν, για συγκεκριμένους βαθμούς ελευθερίας (Β.Ε.) κάθε φορά. Όταν η τιμή p < 0,05, αυτό σημαίνει πως υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά των θεωρητικών και πραγματικών τιμών. Όμως, για την εφαρμογή της δοκιμασίας χ 2 πρέπει να πληρούνται ορισμένες προϋποθέσεις: το λιγότερο το 80% των κελιών να έχουν μία αναμενόμενη συχνότητα πέντε (5) ή μεγαλύτερη και κανένα κελί να μην έχει αναμενόμενη συχνότητα μικρότερη του 1. Όταν οι παραπάνω προϋποθέσεις δεν πληρούνταν, τότε δεν εφαρμοζόταν η δοκιμασίας χ 2. Στις περιπτώσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε το Fisher exact test, το οποίο επίσης χρησιμοποιείται για τον έλεγχο ανεξαρτησίας για έναν πίνακα ενδεχομένων, αλλά είναι ιδανικό στις περιπτώσεις που στον πίνακα ενδεχομένων υπάρχουν πολύ μικρά μεγέθη (δηλαδή υπάρχει αριθμός μικρότερος του 5). Με τη χρήση του Fisher exact test λαμβάνουμε πιο ακριβές p-value σε σχέση με τη δοκιμασία χ 2, η οποία έχει απλούστερους υπολογισμούς, αλλά καταλήγει σε ένα μόνο προσεγγιστικό p-value. Όταν οι αριθμοί είναι μεγάλοι τα p-value που προκύπτουν από τις δύο δοκιμασίες είναι σχεδόν παρόμοια. Ωστόσο, το Fisher exact test δε

72 χρησιμοποιείται όταν το μέγεθος του Ν είναι μεγαλύτερο του 200 ( Στην παρούσα μελέτη, όπως προαναφέρθηκε, οι παραπάνω μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση της συχνότητας των γονοτύπων και των αλληλομόρφων μεταξύ δύο ομάδων ατόμων. Για παράδειγμα, η σύγκριση της συχνότητας των τριών γονοτύπων όσον αφορά το πλήθος των αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG στον υποκινητή του γονιδίου MAP3K5 (ομοζυγωτία για το αλληλόμορφο των πέντε επαναλήψεων, ομοζυγωτία για το αλληλόμορφο των τεσσάρων επαναλήψεων, ή ετεροζυγωτία) πραγματοποιήθηκε ανάμεσα σε δύο ομάδες ατόμων, δηλαδή σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia major) και σε υγιή άτομα (controls). Στην περίπτωση αυτή, οι αντίστοιχες τιμές κατατάχθηκαν σε πίνακα 2 3 ( Αντίστοιχα, για σύγκριση της συχνότητας των δύο αλληλομόρφων όσον αφορά το πλήθος των αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG στον υποκινητή του γονιδίου MAP3K5 (αλληλόμορφο των πέντε επαναλήψεων και αλληλόμορφο των τεσσάρων επαναλήψεων) ανάμεσα σε δύο ομάδες ατόμων, για παράδειγμα σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (βthalassemia major) και σε υγιή άτομα (controls), οι αντίστοιχες τιμές κατατάχθηκαν σε πίνακα 2 2 ( Οι τιμές p προσδιορίστηκαν σε κάθε περίπτωση με τη δοκιμασία η οποία πληρούσε τα αντίστοιχα κριτήρια

73 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1 Συσχέτιση της STR του υποκινητή του MAP3K5 με υψηλά επίπεδα της HbF Αρχικά, διερευνήθηκε η συχνότητα του πλήθους των αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG στον Ελληνικό πληθυσμό, δεδομένου ότι, επί του παρόντος, δεν υπάρχουν δεδομένα συχνότητας της παραλλαγής αυτής για τους Καυκάσιους. Ο προσδιορισμός του πλήθους των διαδοχικών αντιγράφων έδειξε ότι η επανάληψη προσδιορίστηκε είτε σε τέσσερα είτε σε πέντε διαδοχικά αντίγραφα (Εικόνα 4.1), ενώ δεν εντοπίστηκαν αλληλόμορφα που να φέρουν λιγότερες από τέσσερις ή περισσότερες από πέντε επαναλήψεις στα δείγματα της παρούσας μελέτης. Οι συχνότητες των αλληλομόρφων με τις τέσσερις και τις πέντε επαναλήψεις προσδιορίστηκαν σε ποσοστό 62,2% και 37,8% στο σύνολο των δειγμάτων, αντίστοιχα. Από την ανωτέρω ανάλυση φαίνεται: Η πλήρης απουσία ομοζυγωτίας του αλληλομόρφου με τις πέντε επαναλήψεις στην ομάδα των ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία, όπως παρουσιάζεται στο ραβδόγραμμα της εικόνας 4.2. Οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές (p=0,03) στην κατανομή του γονότυπου μεταξύ ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και ασθενών με ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία. Ομοίως, οι στατιστικώς σημαντικές (p=0,011) διαφορές στην κατανομή του γονότυπου μεταξύ ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και υγιών ατόμων. Έτσι, φαίνεται να υπάρχει συσχέτιση του ομόζυγου ως προς τις πέντε επαναλήψεις γονότυπου με τη σοβαρή μορφή της β-μεσογειακής αναιμίας

74 Εικόνα 4.1: Χρωμογράμματα που δείχνουν το αποτέλεσμα του προσδιορισμού του πλήθους των διαδοχικών αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG στον υποκινητή του γονιδίου MAP3K5 με τη μέθοδο Sanger. (α) Χρωμόγραμμα από ομόζυγο ως προς τις τέσσερις επαναλήψεις άτομο. (β) Χρωμόγραμμα από ομόζυγο ως προς τις πέντε επαναλήψεις άτομο. (γ) Χρωμόγραμμα από ετερόζυγο άτομο ως προς το πλήθος των επαναλήψεων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας GCGCG (το ένα αλληλόμορφο φέρει τέσσερις ενώ το άλλο πέντε επαναλήψεις). 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MAJOR CONTROLS B-INTERMEDIA 5/5 REPEATS 4/5 REPEATS 4/4 REPEATS Εικόνα 4.2: Ραβδόγραμμα της εκατοστιαίας γονοτυπικής συχνότητας για τον αριθμό των επαναλήψεων GCGCG στις τρεις ομάδες ατόμων που αναλύθηκαν

75 4.2 Σύνδεση της STR με τα SNP του γονιδίου MAP3K5 rs και rs Σε ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία, η STR του υποκινητή του MAP3K5 φαίνεται να είναι σε τέλεια σύνδεση με τους πολυμορφισμούς που εξετάστηκαν στο πρώτο εσώνιο του MAP3K5, δηλαδή τους rs και rs (Εικόνα 4.3). Το αλληλόμορφο με τις πέντε επαναλήψεις συνδέεται με το σπάνιο αλληλόμορφο C του rs και το σπάνιο αλληλόμορφο C του rs , σχηματίζοντας έναν απλότυπο [(GCGCG) 5 - C - C], ο οποίος είναι παρόν μόνο σε ετεροζυγωτία (η πλήρης απουσία του συγκεκριμένου απλότυπου σε ομοζυγωτία στην ομάδα των ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία παρουσιάζεται στον πίνακα 4.1), με συχνότητα 31,8%, ενώ ο άγριου τύπου απλότυπος [(GCGCG) 4 - Τ - Α] είναι παρών με συχνότητα 68,2% στη συγκεκριμένη ομάδα ασθενών (Πίνακας 4.2, Εικόνα 4.5). Πίνακας 4.1: Γονοτυπική συχνότητα στην αντίστοιχη ομάδα ατόμων. Συχνότητα γονότυπου μείζονος β- μεσογειακής αναιμίας Συχνότητα γονότυπου ενδιάμεσης β- μεσογειακής αναιμίας Συχνότητα γονότυπου υγειών STR MAP3K5- rs MAP3K5- rs ,0% 36,4% 45,0% 4/4 A/Α T/T 40,0% 0,0% 13,3% 5/5 C/C C/C 33,3% 63,6% 35,0% 4/5 A/C T/C 0,0% 0,0% 1,7% 4/4 A/C T/C 0,0% 0,0% 1,7% 4/5 A/A T/T 0,0% 0,0% 1,7% 4/4 A/C T/T 6,7% 0,0% 0,0% 5/5 C/C T/C 0,0% 0,0% 1,7% 4/5 A/C T/T Γενικά, το αλληλόμορφο με τις πέντε επαναλήψεις στον υποκινητή βρίσκεται σε σχεδόν τέλεια σύνδεση με το σπάνιο αλληλόμορφο C του rs (Εικόνα 4.4Α) και το σπάνιο αλληλόμορφο C του rs (Εικόνα 4.4Β), σχηματίζοντας τον σπάνιο απλότυπο [(GCGCG) 5 - C - C] που η συχνότητά του σε ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία βρίσκεται σε συμφωνία με τη συχνότητα αυτού μεταξύ των υγιών μαρτύρων (30,8%). Ωστόσο, σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, ο απλότυπος [(GCGCG) 5 - C - C] είναι πολύ πιο συχνός, με συχνότητα 60% (Πίνακας 4.1), η οποία στατιστικά αποκλίνει σημαντικά από τους ασθενείς με

76 ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (p = 0,04) και τα μη-θαλασσαιμικά άτομα (p = 0,003) (Εικόνα 4.5). Έτσι, ο συγκεκριμένος απλότυπος φαίνεται να συνδέεται με χαμηλά επίπεδα της HbF και το φαινότυπο της βαριάς β-μεσογειακής αναιμίας. Εικόνα 4.3: Η ανάλυση μπλοκ απλότυπου, όπως δημιουργήθηκε από το HaploView 4.2 ( δείχνει την ανισορροπία σύνδεσης (LD) μεταξύ των εξεταζόμενων πολυμορφισμών στο MAP3K5 που σχετίζονται με χαμηλά επίπεδα της HbF. Ο πολυμορφισμός rs δεν θα μπορούσε να απεικονίζεται στην ανάλυση LD, δεδομένου ότι δεν υπάρχουν δεδομένα γονότυπου στο HapMap ( Αυτή η παραλλαγή βρίσκεται 3 kb ανοδικά του rs και αυτά τα δύο SNP είναι γνωστό ότι είναι σε τέλεια σύνδεση [1000GENOMES: phase_1_ceu ( Ο STR πολυμορφισμός στον υποκινητή του MAP3K5 δεν θα μπορούσε να απεικονίζεται στην ανάλυση LD, δεδομένου ότι δεν υπάρχουν δεδομένα γονότυπου στο HapMap. Ωστόσο, η περισσότερο γειτονική παραλλαγή του STR, το rs που βρίσκεται 1,07 kb καθοδικά της επανάληψης, απεικονίζεται στην ανάλυση LD. Η τιμή σε κάθε κόκκινο τετράγωνο αντιπροσωπεύει το βαθμό της LD μεταξύ των πολυμορφισμών [μετράται σε D' (α) ή r 2 (β)], ενώ το γκρι αντιπροσωπεύει έλλειψη LD. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι οι πολυμορφισμοί rs και rs συσχετίζονται με τη μικροδορυφορική αλληλουχία του υποκινητή, η οποία έχει πιθανότατα λειτουργικό ρόλο στην έκφραση του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5. Έτσι, ακόμη και αν τα SNP που βρίσκονται στο πρώτο εσώνιο του MAP3K5 δεν συνδέονται στενά με τη βαρύτητα της νόσου όταν είναι μεμονωμένα, φαίνεται να