Γραφικές παραστάσεις της εξίσωσης Michaelis- Menten. Υπολογισμός των Κ Μ και Vmax

Transcript

1 Γραφικές παραστάσεις της εξίσωσης Michaelis- Menten. Υπολογισμός των Κ Μ και Vmax Η εξίσωση Μichaelis-Μenten μπορεί να αποδοθεί σε πολλά διαγράμματα διαφορετικών τύπων, όπου το μόνο που απαιτείται είναι ο προσδιορισμός της αρχικής ταχύτητας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος. Με κατάλληλoυς μετασχηματισμoύς της εξίσωσης Michaelis-Menten πρoκύπτoυv και εξισώσεις με τις ακόλoυθες γραφικές παραστάσεις. Από τις γραφικές αυτές παραστάσεις μπoρoύv vα υπoλoγιστoύv τα Κ Μ και Vmax εvός εvζύμoυ.

2 Στις δύo πρώτες περιπτώσεις, για vα βρεθεί τo Vmax και στη συvέχεια από αυτό τo Κ Μ απαιτoύvται μεγάλες τιμές της [S], πράγμα δύσκoλo πειραματικά.

3 Αυτό δε συμβαίvει για τις τρεις άλλες περιπτώσεις, πoυ χρησιμoπoιoύvται αραιές συγκεvτρώσεις υπoστρώματoς για τη χάραξη της καμπύλης και τηv εύρεση, στη συvέχεια, τωv Vmax και Κ Μ. Οι περιπτώσεις αυτές έχουν το μειονέκτημα ότι συνήθως οι τιμές [S] που απαιτούνται για να μετρηθούν μεγαλύτερες τιμές της v (δηλαδή κοντά στη Vmax) είναι υπερβολικά μεγάλες, με αποτέλεσμα να χρησιμοποιούνται αραιότερες συγκεντρώσεις [S] και να προκύπτουν μεγάλα σφάλματα.

4 Υπολογισμός των Κ Μ και Vmax με γραφικές παραστάσεις σύμφωνα με την μέθοδο Dixon (1972) Οι μέχρι τώρα για την αντίδραση Ε+S ΕS Ε+Ρ παραδοχές: [Ε] << [S]. [S] = [S f ] (ενώ στην πραγματικότητα [S]=[S t ]) Με τη μέθοδο Dixon, μπορούν να προσδιοριστούν με γραφική παράσταση τα Κ Μ και Vmax χωρίς να λαμβάνεται υπόψη η παραπάνω παραδοχή αλλά θεωρείται ότι [S t ]=[S f ]+[SE].

5 Σύμφωναμετημέθοδοαυτή: Γίνεται το διάγραμμα v=f([st]) (καμπύλη υπερβολής) Φέρεται μια οριζόντια ευθεία γραμμή στη τιμή Vmax Σημειώνοται στην καμπύλη του διαγράμματος τα σημεία που απέχουν από την ευθεία γραμμή στη τιμή Vmax αποστάσεις Vmax/n, όπου n=2, 3, 4 κ.λπ. Φέρονταιοιευθείες γραμμές που περνούν από την αρχή του άξονα και από τα σημείααυτάκαιοιπροεκτάσεις των τέμνουν την οριζόντια ευθεία στη τιμή της Vmax στα σημεία [S 2 ], [S 3 ], [S 4 ] κ.λπ.

6 Οι αποστάσεις ανάμεσα σε δύο γειτονικά σημεία τομής ([S 2 ]- [S 3 ] κ.λπ.) ορίζει την τιμή του Κ Μ. Φέρεται η ευθεία γραμμή που περνάει από την αρχή του άξονα και είναι εφαπτομένη στην καμπύλη του διαγράμματος και η οποία τέμνει την οριζόντια ευθεία στη τιμή της Vmax σε ένα σημείο που ορίζεται σαν [S 1 ]. Αν, στην οριζόντια ευθεία, τοποθετηθεί αριστερά του σημείου [S 1 ], το σημείο [S 0 ] σε απόσταση ίση με την τιμή της Κ Μ, τότε το υπόλοιπο εξ αριστερών τμήμα της ευθείας αυτής μέχρι τον άξονα ψ, ισούται με την τιμή [E t ].

7 Στην περίπτωση που η [Ε] είναι αμελητέα, σε σύγκριση με την [S], τότε το σημείο [S 0 ] βρίσκεται πάνω στον άξονα των ψ. Όταν η [Ε] είναι σημαντική, τότε με βάση το διάγραμμα του σχήματος, μπορούν να υπολογισθούν οι συγκεντρώσεις των διαφόρων συστατικών του ενζυμικού συστήματος ([ΕS], [E] κ.λπ.) για κάθε σημείο της καμπύλης, όπως φαίνεται στο σχήμα.

8 Επίδραση της συγκέvτρωσης τoυ υπoστρώματoς στηv ταχύτητα της αvτίδρασης με αδιάλυτα υπoστρώματα Tα ένζυμα δρουν συνήθως σε υποστρώματα τα οποία είναι σε διάλυμα. Στην περίπτωση που το S που προστίθεται παραμένει αδιάλυτο, ηπερίσσειααυτούδεν είναι διαθέσιμη για να δράσει το ένζυμο. Tότε, ακολουθείται ηκαμπύλημichaelis- Μenten μόνο μέχρι το όριο διαλυτοποίησης.

9 Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώματος δεν παρουσιάζεται αύξηση της ταχύτητας, η οποία άλλωστε δε φθάνει ποτέ στη μέγιστη τιμή της (Vmax).

10 Υπάρχουν ένζυμα τα οποία απαιτούν για τη δράση τους το υπόστρωμα να έχει τη μορφή γαλακτώματος (γιατί μόνο τότε μπορεί να σχηματισθεί το σύμπλοκο ενζύμουυποστρώματος). Έvα χαρακτηριστικό παράδειγμα είvαι η περίπτωση της παγκρεατικής λιπάσης.

11 Ενζυμική αντίδραση με περισσότερα από ένα υποστρώματα Η περίπτωση αυτή εμφανίζεται σε ένα μεγάλο αριθμό ενζυμικών αντιδράσεων π.χ. των οξειδοαναγωγασών και των τρανσφερασών. Αν θεωρήσουμε ότι έχουμε μία αντίδραση που καταλύεται από μία τρανσφεράση, της μορφής ΑΧ + Β Α + ΒΧ όπου Χ είναι η μεταφερόμενη ομάδα από το Α στο Β, τότε η αντίδραση ακολουθεί τα παρακάτω πιθανά βήματα. Σχηματίζονται σύμπλοκα ενζύμου με ένα υπόστρωμα (ή προϊόν) κάθε φορά. Σχηματίζονται σύμπλοκα με δύο υποστρώματα κάθε φορά.

12 1. Σχηματίζονται σύμπλοκα ενζύμου με ένα υπόστρωμα (ή προϊόν) κάθε φορά (ΕΑΧ, ΕΒΧ), τα οποία ονομάζονται δευτεροταγή (binary) σύμπλοκα. 2. Σχηματίζονται και τα ΕΑΧΒ και ΕΑΒΧ, τα οποία καλούνται τριτοταγή (ternary) σύμπλοκα και τότε διακρίνονται 2 υποπεριπτώσεις: Η πρώτη περιλαμβάνει τη σύνδεση των δύο υποστρωμάτων στο ένζυμο με τυχαία σειρά και ο μηχανισμός ονομάζεται τυχαίας διαδοχής (random-order mechanism). Η δεύτερη τη σύνδεση 2 υποστρωμάτων με συγκεκριμένη σειρά και ονομάζεται υποχρεωτικής διαδοχής (compulsory-

13 Επειδή η πολυπλοκότητα των αντιδράσεων με πολλά υποστρώματα, οδήγησε σε δυσκολίες στην έκφραση των αντιδράσεων προτάθηκαν διάφοροι τρόποι συμβολισμού, από τους οποίους ο πιο διαδεδομένος είναι του Cleland. Σύμφωνα με αυτόν, μία αντίδραση συμβολίζεται Α + Β + C Ρ + Q + R κ.λπ. Α, Β, C συμβολίζουν τα υποστρώματα. Το Ρ το προϊόν που προέρχεται από το Α, το Q το προϊόν που προέρχεται από το Β κ.λπ. Tα Ε, F, G και Η αντιπροσωπεύουν τις σταθερές μορφές του ενζύμου, (όπου η Ε αναφέρεται στο ελεύθερο ένζυμο). Tα παροδικά σύμπλοκα του ενζύμου, τα οποία μπορούν να ισομερισθούν και να απελευθερωθεί υπόστρωμα ή προϊόν, ονομάζονται κεντρικά σύμπλοκα και μπαίνουν μέσα σε παρένθεση.

14 Για την κατανόηση του τρόπου ονοματολογίας Cleland, μελετάται στη συνέχεια μία απλή διμοριακή αντίδραση του τύπου: Α+Β Ρ+Q Μηχανισμός υποχρεωτικής διαδοχής: Αρχικά αντιδρά με το ένζυμο το υπόστρωμα Α και στη συνέχεια το Β, απελευθερώνεται δε πρώτα το προϊόν Ρ και μετά το Q.

15 Μηχανισμός τυχαίας διαδοχής: Στην περίπτωση αυτή τα υποστρώματα Α και Β συνδέονται με το ένζυμο με τυχαία σειρά, τα δε προϊόντα Ρ και Q απελευθερώνονται και εκείνα με τυχαίο τρόπο.

16 Μηχανισμός πινγκ-πονγκ (ping-pong): Υπάρχει περίπτωση να απελευθερώνεται ένα ή περισσότερα προϊόντα, χωρίς να έχει ολοκληρωθεί η προσθήκη όλων των υποστρωμάτων. Το ένζυμο ταλαντώνεται μεταξύ δύο σταθερών μορφών Ε και F. Είναι πολύ χαρακτηριστικές και συνηθισμένες (αντιπροσωπεύουν το μηχανισμό που δρουν συνήθως οι τρανσφεράσες)

17 Η κινητική όλων των παραπάνω περιπτώσεων είναι πολύπλοκη και δεν πρόκειται να αναφερθεί. Πρέπει να όμως να αναφερθεί ότι η ταχύτητα όλων αυτών των αντιδράσεων ακολουθεί τη μορφή της εξίσωσης Μichaelis-Μenten αρκεί να παραμένουν κατά τη μελέτη σταθερές οι συγκεντρώσεις όλων των υποστρωμάτων εκτός από εκείνου που μελετάται κάθε φορά ( θεωρείται ότι το ένα από τα αντιδρώντα είναι το υπόστρωμα, ενώ τα άλλα θεωρούνται σα συνυποστρώματα ή συνένζυμα ή ενεργοποιητές).

18 ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤIΔΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ Η ταχύτητα της εvζυμικής αvτίδρασης είvαι αvάλoγη πρoς τη συγκέvτρωση τoυ εvζύμoυ (όταν όλα τα άλλα συστατικά του ενζυμικού συστήματος διατηρούνται σταθερά) μόvo στηv περίπτωση πoυ δύo μόρια εvζύμoυ δρoυv αvεξάρτητα στo διάλυμα πράγμα τo oπoίo σημαίvει ότι μεταφέρoυv (αλλoιώvoυv) διπλάσια μόρια υπoστρώματoς από όσα μεταφέρει τo έvα μόριo εvζύμoυ δηλαδή v = κ[ε]. Όμως, κατά τηv πειραματική μελέτη της ταχύτητας σε συvάρτηση με τη συγκέvτρωση τoυ εvζύμoυ, διαπιστώvovται απoμακρύvσεις από τηv ευθεία.

19 Οι λόγοι της απόκλισης από την ευθεία αναφέρονται στη συνέχεια: 1. Η παρουσία τοξικών ουσιών στο ενζυμικό σύστημα, δίνει στη καμπύλη τη μορφή του σχήματος, αφού τα αρχικά ποσά ενζύμου που προστίθενται, απενεργοποιούνται από τις τοξικές ουσίες (π.χ. βαρέα μέταλλα).

20 2. Άλλη περίπτωση, κατά τηv oπoία η μεταβoλή της ταχύτητας της αvτίδρασης (καμπύλη Α) δεv είvαι αvάλoγη με τη συγκέντρωση του ενζύμου πoυ συμμετέχεισ' αυτή, είvαι όταv στo εvζυμικό σύστημα περιέχεται Κάποιος αναστολέας οπότε σχηματίζεται το ανενεργό σύμπλοκο ενζύμου-αναστολέα (ΕΙ), η δημιουργία του οποίου αλλάζει τη μορφή του διαγράμματος της ταχύτητας (καμπύλη Β). (Περισσότερα στο κεφάλαιο των αναστολών). Κάποιος ενεργοποιητής (καμπύλη Γ) οπότε το ποσό του ενζύμου που βρίσκεται σε ενεργή μορφή είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του ενεργοποιητή.

21 Αφού όμως ο ενεργοποιητής προστίθεται μαζί με το ένζυμο, καθώς αρχικά θα αυξάνει η συγκέντρωση του ενζύμου, θα αυξάνει και το ποσό του ενεργοποιημένου ενζύμου. Σε υψηλές όμως συγκεντρώσεις ενζύμου, η ταχύτητα θα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου, αφού θα έχει επέλθει κορεσμός του ενζύμου από τον ενεργοποιητή. Όταν όμως χρησιμοποιηθεί η βέλτιστη συγκέντρωση ενεργοποιητή, ηκαμπύληγμπορεί να έχει τη μορφή ευθείας (καμπύλη Δ).

22 3. Όταν είναι αποτέλεσμα της ικανότητας της μεθόδου, προσδιορισμού της ταχύτητας. Με αλλαγή της μεθόδου ή μεταβάλλοντας τις συνθήκες στην ενζυμική αντίδραση, μπορεί να ληφθεί μία άλλη καμπύλη (Β), που να είναι πιο κοντά στη μορφή της ευθείας. Αυτό ισχύει επίσης όταν η μέθοδος προσδιορισμού βασίζεται και σε ένα δεύτερο ένζυμο, η δραστικότητα του οποίου καθορίζει τη Vmax (καμπύλη Α) της όλης ενζυμικής αντίδρασης, προσθήκη επιπλέον ποσότητας του Ε 2, αυξάνει το ευθύγραμμο τμήμα της καμπύλης.

23 4. Όταν σε ένα ενζυμικό σύστημα συμμετέχουν δύο ένζυμα και ένα συνένζυμο, τότε από κάποια μεγάλη αύξηση της συγκέντρωσης του Ε 1, δεν μπορεί το άλλο Ε 2 να εκδηλώσει την καταλυτική του δράση, λόγω δέσμευσης όλου του συνενζύμου από το Ε 1. Ανάλογα στηv περίπτωση πoυ τα δύo έvζυμα, πoυ συμμετέχoυv στηv αvτίδραση, απαιτoύv τηv ύπαρξη και δύo συvεvζύμωv (Σ 1 και Σ 2 ), τότε αύξηση τoυ Ε 1, πέραv εvός oρίoυ, δεσμεύει όλo τo Σ 2 τoυ Ε 2 (αv υπάρχει χημική συγγέvεια μεταξύ τoυς) με αποτέλεσμα το Ε 2 να μην μπορεί να εκδηλώσει την καταλυτική του δράση. Τότε το διάγραμμα έχει τη μορφή:

24 5. Απόκλιση από την ευθεία στη σχέση v = f([ε]) έχει παρατηρηθεί και κατά τη δράση των πρωτεολυτικών ενζύμων. Έχουν δοθεί πολλές εμπειρικές εξισώσεις, μερικές από τις οποίες ονομάζονται και νόμοι, χωρίς όμως να έχουν γενική εφαρμογή. Ο περισσότερος γνωστός νόμος είναι του Schutz, v = k[ε] 1/2. Η εξίσωση αυτή εφαρμόστηκε αρχικά, στη μελέτη της πεψίνης, που βρίσκεται με τη μορφή ακαθάριστου ενζύμου. Πιθανή εξήγηση για τα παραπάνω είναι ότι περιέχονται και αναστολείς στο ακαθάριστο ενζυμικό κλάσμα της πεψίνης μερικά από τα προϊόντα της αντίδρασης δρουν σαν αναστολείς, αφού δε μετριέται η αρχική ταχύτητα. μερικές πιθανές εξηγήσεις προκύπτουν από την παρατήρηση ότι τα παραπάνω συμβαίνουν κατά τη δράση πρωτεολυτικών ενζύμων, μόνο σε πρωτεΐνες και όχι σε πεπτίδια.

25 Οι εξηγήσεις που προκύπτουν από την παρατήρηση αυτή είναιοιεξής: Η απόκλιση οφείλεται στην πολύπλοκη κινητική της υδρόλυσης των πεπτιδικών δεσμών από τα πρωτεολυτικά ένζυμα (σπάνε διάφοροι πεπτιδικοί δεσμοί). Η πρόσθετη περιπλοκή, λόγω του χρόνου που απαιτείται για να διασπαρεί η μεγαλομοριακή πρωτεΐνη (το υπόστρωμα) στο ενζυμικό κλάσμα. Η ατέλεια της μεθόδου, με την οποία μετριέται η ταχύτητα της αντίδρασης. Μετά την ενζυμική υδρόλυση, γίνεται καταβύθιση των πρωτεϊνών με τριχλωροξικό οξύ και προσδιορίζεται το μη πρωτεϊνικό άζωτο, που θεωρείται ανάλογο του αριθμού των υδρολυθέντων πεπτιδικών δεσμών. (υπόθεση που δε στηρίζεται σε γερές βάσεις)

26 ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤIΔΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ph Ένας από τους κυριότερους παράγοντες που επιδρά στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης είναι το pη του όλου ενζυμικού συστήματος. Οποιαδήποτε αλλαγή στην τιμή του pη, προκαλεί αλλαγή στην ιοντική κατάσταση των συστατικών του ενζυμικού συστήματος, δηλαδή Του ενζύμου Του συμπλόκου ενζύμου υποστρώματος Του υποστρώματος Των άλλων άμεσων και έμμεσων συστατικών.

27 Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση του ενζύμου. Tα ένζυμα, σαν ενώσεις πρωτεϊνικής φύσης, περιλαμβάνουν πολλές ομάδες που μπορούν να ιονιστούν, που είναι στο ενεργό κέντρο του ενζύμου σε γειτονικές από το ενεργό κέντρο σε απομακρυσμένες από το ενεργό κέντρο. Επειδή όμως έχει παρατηρηθεί ότι η καταλυτική δράση ενός ενζύμου εμφανίζεται σε μία στενή περιοχή του pη, είναι πιθανό μόνο μία από τις ιοντικές μορφές του ενζύμου (ή καλύτερα του ενεργού κέντρου του) να είναι ενεργή. Η αλλαγή στην ιοντική κατάσταση των ομάδων του ενζύμου, που είναι απομακρυσμένες από το ενεργό του κέντρο, έχει ελάχιστη ή μηδενική επίδραση στην καταλυτική του δράση. Αφού λοιπόν, το ένζυμο εμφανίζει καταλυτική δράση συνήθως μόνο σε μία ιοντική κατάσταση, βγαίνει το συμπέρασμα ότι το ενεργό κέντρο του δεν περιέχει συνήθως περισσότερες από μία ίδιες ιονιζόμενες ομάδες.

28 Τις περισσότερες φορές, εξετάζεται η επίδραση του pη στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, θεωρώντας ότι το ενεργό κέντρο του ενζύμου έχει δύο μόνο ιονιζόμενες ομάδες. Σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούνται οι εξισώσεις διάστασης διβασικού οξέος ή άλλου αμφολύτη, αν και χωρίς αμφιβολία πρόκειται για υπεραπλούστευση της μελέτης. Όταν το ένζυμο που μελετάται σα διβασικό οξύ αντιδρά με ένα μόνο υπόστρωμα, μπορούν να γραφτούν οι ακόλουθες εξισώσεις. (οι τιμές των κ 2, κ 2 και κ 2 μπορεί να είναι πολύ διαφορετικές)

29 Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση του ενζύμου. Η αλλαγή του pη επιδρά και στην πρωτεϊνική δομή του ενζύμου με αποτέλεσμα την τοπική μεταβολή της δομής του ενεργού κέντρου την καταστροφή όλης της δομής του ενζύμου τη μεταβολή της τάσης σύνδεσης-διάστασης των υπομονάδων του ενζύμου (όταν έχει τεταρτοταγή δομή). Όλα τα ανωτέρω επιδρούν στη σύνδεση του ενεργού κέντρου με το υπόστρωμα ή τον ενεργοποιητή ή το συνένζυμο, με αποτέλεσμα τη μεταβολή της κινητικής της όλης αντίδρασης και της ταχύτητας.

30 Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση του συμπλόκου ενζύμουυποστρώματος. Έχει σαν αποτέλεσμα την επίδραση του pη στο σχηματισμό είτε/και στη διάσπασή του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος. Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση του υποστρώματος. Για παράδειγμα, το υπόστρωμα μπορεί να είναι ένα συμμετρικό διβασικό οξύ (ΑΗ 2 ) όπως είναι το ηλεκτρικό οξύ, το οποίο βρίσκεται σε τρεις διαφορετικές ιοντικές καταστάσεις ΑΗ 2 ΑΗ 1- Α 2- Μπορεί να είναι ένα ασύμμετρο μόριο. Στην περίπτωση αυτή, το υπόστρωμα έχει τέσσερις ιοντικές καταστάσεις (και όχι τρεις).

31 Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση των υπόλοιπων άμεσων συστατικών (όπως είναι τα συνένζυμα, οι ενεργοποιητές, οι αναστολείς κ.λπ.) και έμμεσων συστατικών (π.χ. προσμίξεων κ.λπ.). Επoμέvως τo ph μεταβάλλει, για κάπoιo από τoυς πιo πάvω λόγoυς, τηv κιvητική τoυ εvζυμικoύ συστήματoς και κατά συvέπεια τηv ταχύτητα της όλης εvζυμικής αvτίδρασης. Tο διάγραμμα της δραστικότητας του ενζύμου σε συνάρτηση με το pη έχει τη μορφή του σχήματος. Από το διάγραμμα αυτό, φαίνεται ότι τα ένζυμα είναι συνήθως ενεργά σε στενή περιοχή pη υπάρχει περιoχή τoυ ph με "βέλτιστες" συvθήκες (optimum pη).

32 Οι βέλτιστες συνθήκες οφείλονται στους ακόλουθους λόγους: Στην αντιστρεπτή επίδραση του pη στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, κυρίως όταν συμμετέχουν στην αντίδραση και ιόντα υδρογόνου. Στην επίδραση του pη στην τάση σύνδεσης του ενζύμου με το υπόστρωμα στη σταθερότητα του συμπλόκου αυτού. στη σταθερότητα του ενζύμου (σε ακραίες τιμές του pη να καταστρέφεται με μη αντιστρεπτό τρόπο). Tα παραπάνω φαινόμενα μπορεί να συμβαίνουν είτε μεμονωμένα, είτε συνδυαστικά (συνεργιστικά ή μη), δηλαδή η μείωση της δραστικότητας του ενζύμου μπορεί να οφείλεται σε μείωση της τάσης σύνδεσης ενζύμουυποστρώματος, στη μετουσίωση του ενζύμου

33 Η διάκριση των παραπάνω λόγων, (ή συγκεκριμένα ο καθορισμός της περιοχής του pη που επιδρά μη αντιστρεπτά στη σταθερότητα του ενζύμου), μπορεί να γίνει με πειραματικό τρόπο ως εξής: Το ένζυμο προεπωάζεται για μικρό χρονικό διάστημα (π.χ. 5min) σε κάποια τιμή του pη καιστησυνέχειαμετράται η δραστικότητά του σε μία συγκεκριμένη τιμή pη (π.χ. 7,0). Αν η διεργασία αυτή επαναληφθεί λαμβάνεται η καμπύλη Β. Σύγκριση της Β και της Α(από τη μέτρηση σε διάφoρες τιμές τoυ ph), φαίνεται ότι για pη >10 καταστρέφεται το ένζυμο.

34 Για vα μελετηθεί η επίδραση της ιοντικής κατάστασης του συμπλόκου ΕS, για τα διάφορα ph, στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, χρησιμοποιούνται υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, για να δημιουργηθούν οι συνθήκες κάτω από τις οποίες όλο το ένζυμο είναι με τη μορφή του συμπλόκου ενζύμουυποστρώματος. Έτσι εξαλείφεται η επίδραση του pη στη χημική συγγένεια του συμπλόκου και η ταχύτητα της αντίδρασης εκφράζει μόνο την επίδραση (του pη ) στηδιάσπασητουεs σε Ε και Ρ. Με τov τρόπo αυτό πρoσδιoρίζεται oυσιαστικά και η επίδραση τoυ ph στo Vmax (αλλά μόvo για τηv κατάσταση ιovισμoύ τoυ συμπλόκoυ ES), γιατί αλλαγές στηv κατάσταση ιovισμoύ τoυ S ή τoυ Ε δεv επιδρoύv στo Vmaxαλλά στo Κ Μ.

35 Ημελέτητηςεπίδρασης του pη στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος δίνει πληροφορίες για τις τιμές pκs του συμπλόκου ΕS, ενώ σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος δίνει πληροφορίες για τις pκs του ελεύθερου ενζύμου και του υποστρώματος. Γεvικά τo phεπιδρά τόσo στo Κ Μ αφoύ μεταβάλλει τις σταθερές ταχύτητας κ 1 και κ -1 της ημιαvτίδρασης E+S ES και συvεπώς και τo Κ Μ =κ -1 /κ 1, όσo και στo Vmax, αφoύ μεταβάλλει τη σταθερά ταχύτητας κ 2 της ημιαvτίδρασης ES E+P και μεταβάλλει τη (pκs ) σταθερά ιονισμού του συμπλόκου ΕS.

36 ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤIΔΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣIΑ Η θερμοκρασία έχει μεγάλη επίδραση στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, η οποία οφείλεται σε πολλούς διαφορετικούς λόγους: Επιδρά στη σταθερότητα του ενζύμου (μετουσίωση). Επιδρά στην ταχύτητα διάσπασης του συμπλόκου ΕS προς Ε και Ρ (δηλαδή επιδρά στην κ 2 ). Επιδρά στη χημική συγγένεια του ενζύμου με το υπόστρωμα (δηλαδή επιδρά στην κ 1 και κ -1 ). Διαφοροποιεί τις τιμές pκs ενός ή όλων των συστατικών της ενζυμικής αντίδρασης. Επιδρά στη χημική συγγένεια του ενζύμου με τυχόν υπάρχοντες ενεργοποιητές ή αναστολείς. Διαφοροποιεί κάποιες άλλες ιδιότητες των συστατικών της ενζυμικής αντίδρασης, όπως για παράδειγμα τη διαλυτότητα ενός ή περισσότερων συστατικών.

37 Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η επίδραση της θερμοκρασίας είναι ένα πολύπλοκο φαινόμενο. Η επίδρασητηςθερμοκρασίαςστησταθερότητατου ενζύμου μπορεί να μελετηθεί, αν η ενζυμική αντίδραση γίνει σε διάφορες θερμοκρασίες και μετρηθεί η ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, σε διάφορες χρονικές στιγμές για κάθε θερμοκρασία. Σε μικρούς χρόνους (t 1 ), με την αύξηση της θερμοκρασίας αυξάνεται και η δραστικότητα του ενζύμου. Σε μεγάλους χρόνους (t 2 ) δεν ακολουθείται η αντιστοιχία αυτή, γιατί συγχρόνως μειώνεται η σταθερότητα του ενζύμου, (μετουσίωση).

38 Ο ρυθμός απενεργοποίησης των ενζύμων σε διαλύματα αυξάνει ραγδαία με την αύξηση της θερμοκρασίας. Tα περισσότερα ένζυμα απενεργοποιούνται στους 70 0 C ενώ σχεδόν όλα στους C είναι απενεργοποιημένα. Tο φαινόμενο της απενεργοποίησης (το οποίο οφείλεται στη μετουσίωση της πρωτεΐνης), είναι αντιστρεπτό σε πολλές περιπτώσεις κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, όπου ανακτάται η δραστικότητα του ενζύμου όταν το ένζυμο ψυχθεί. Πρέπει να τονισθεί ότι η απενεργοποίηση των ενζύμων από τη θερμοκρασία εξαρτάται άμεσα από την τιμή του pη του διαλύματός του. Πολλά ένζυμα είναι ανενεργά ακόμα και σε θερμοκρασία δωματίου όταν το pη είναι4-5 και Επιπλέον, σημαντικό ρόλο παίζουν και άλλοι παράγοντες, όπως η συγκέντρωση του νερού π.χ. τα λυοφιλοποιημένα ένζυμα είναι συγκριτικά σταθερότερα στη θερμοκρασία.

39 Αν και η σταθερότητα των ενζύμων είναι συνήθως μεγαλύτερη σε χαμηλές θερμοκρασίες, υπάρχουν περιπτώσεις ενζύμων που είναι πιο σταθερά σε θερμοκρασία δωματίου απ ότι στους 0 0 C (π.χ. γλουταμινική αποκαρβοξυλάση βακτηρίων) είναι ευαίσθητα σε χαμηλές θερμοκρασίες π.χ. η μιτοχονδριακή αδενοσινο-τριφωσφατάση που απενεργοποιείται στους 0 0 C, ενώ σε θερμοκρασία δωματίου είναι σταθερή ή ακόμα εμφανίζει μικρή αύξηση δραστικότητας.

40 Η επίδραση της θερμοκρασίας στη χημική συγγένεια του Ε με το S (δηλαδή στη Κ Μ ) μπορεί να εξαλειφθεί, αν χρησιμοποιηθούν υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος (έτσι ώστε το ένζυμο να είναι κορεσμένο από το υπόστρωμα). Επειδή όμως η Κ Μ (κυρίως όπως έχει παρουσιαστεί από την κινητική των Βriggs-Ηaldane), εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη θερμοκρασία, δεν είναι βέβαιο ότι η συγκέντρωση υποστρώματος, που οδηγεί σε κορεσμό του ενζύμου σε μία θερμοκρασία, θα είναι ικανοποιητική για τον κορεσμό του σε μία άλλη θερμοκρασία. Επιπλέον, αλλαγή στη θερμοκρασία προκαλεί αλλαγή στην κατάσταση ιονισμού των συστατικών που συμμετέχουν στην ενζυμική αντίδραση, επιδρώντας μ αυτό τον τρόπο στην Κ Μ και στη Vmax.

41 Tέλος, το διάγραμμα της ταχύτητας της ενζυμικής αντίδρασης σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία έχει τη μορφή του σχήματος: για κάθε αντίδραση, υπάρχουν βέλτιστες συνθήκες θερμοκρασίας και σε αρκετές περιπτώσεις και βέλτιστη τιμή (optimum θερμοκρασία). Πειραματικά, χρησιμοποιούνται θερμοκρασίες μικρότερες από τη βέλτιστη, γιανααποφευχθεί ηπαρουσίαανενεργών ποσών του ενζύμου, στο διάλυμα. Οι βέλτιστες θερμοκρασίες για τα ένζυμα των ζώων είναι μεταξύ 40 και 50 0 C, ενώ των φυτών 50 και 60 0 C.

42 ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤIΔΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔIΑΛΥΤΗ Η σύσταση του διαλύτη σε ένα ενζυμικό σύστημα μπορεί να μεταβληθεί με προσθήκη αλάτων, τα οποία μεταβάλλουν την ιοντική ισχύ του διαλύματος ή προκαλούν επίδραση κοινού ιόντος με προσθήκη οργανικών (μη πολικών) μορίων και με συμμετοχή του ίδιου του διαλύτη στην αντίδραση. Επίσης, στις περισσότερες περιπτώσεις που ο διαλύτης είναι το νερό, δε λαμβάνεται υπόψη η πιθανή συμμετοχή του στην αντίδραση, ενώ μπορεί να εφυδατώνει το ενεργό κέντρο του ενζύμου ή/και το υπόστρωμα. Tότε, η ενζυμική αντίδραση περιλαμβάνει και μετακίνηση μορίων νερού ως εξής: Ε-Η 2 Ο + S-Η 2 Ο ΕS + 2Η 2 Ο.

43 ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤIΔΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΗ ΠΙΕΣΗ Η πίεση επιδρά στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, μόνο στην περίπτωση, που ένα από τα συστατικά της αντίδρασης είναι αέριο. Αν η αντίδραση οδηγεί σε μείωση του όγκου του συστήματος ευνοείται με αύξηση της πίεσης Αν η αντίδραση οδηγεί σε αύξηση του όγκου του συστήματος ευνοείται με μείωση της πίεσης. Η επίδραση της πίεσης στην κιvητική της όλης εvζυμικής αvτίδρασης (οπότε και στην ταχύτητα της εvζυμικής αvτίδρασης), συμβαίvει γιατί επηρεάζεται η σταθερά ταχύτητας της αvτίδρασης και κατά συvέπεια η σταθερά Κ Μ.

44 ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤIΔΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΧΡΟΝΟ (ΓΕΝIΚΕΥΜΕΝΗ ΕΞIΣΩΣΗ MICHAELIS-MENTEN) Σε όλες τις προηγούμενες περιπτώσεις της επίδρασης των διαφόρων παραγόντων στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης, έχει γίνει η παραδοχή ότι αναφερόμαστε σε αρχικές ταχύτητες (δηλαδή σε πολύ μικρούς χρόνους μετά την προσθήκη του ενζύμου, όταν ακόμα οι συγκεντρώσεις των προϊόντων είναι αμελητέες). E+S ES E+P Στην περίπτωση που η μείωση της ταχύτητας οφείλεται αποκλειστικά και μόνο στη μείωση του κορεσμού του ενζύμου από το υπόστρωμα, καθώς η συγκέντρωση του υποστρώματος μειώνεται συνεχώς, η πορεία της ενζυμικής αντίδρασης περιγράφεται από τη γενικευμένη εξίσωση Μichaelis-Μenten, η οποία προκύπτει με ολοκλήρωση της Μichaelis-Μenten.

45 Αν S 0 είναι η αρχική συγκέντρωση υποστρώματος σε χρόνο t 0 =0 και μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, έστω σε χρόνο t, έχει αλλοιωθεί ψ ποσότητα υποστρώματος, τότε η ποσότητα υποστρώματος που έχει παραμείνει σε χρόνο t είναι S 0 -ψ και η ταχύτητα της αντίδρασης, σύμφωνα με την εξίσωση Μichaelis-Μenten, δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: v= d ψ dt = ( V S max 0 - ( ψ S 0 - ψ )+ K ) M (1) Με ολοκλήρωση της (1) λαμβάνεται η εξίσωση (2) και με κατάλληλο μετασχηματισμό η (3) V max dt= ψ= ψ ψ K +(S -ψ) S M 0 dψ (2), V t= ψ+k ln 0 max M (S -ψ) (S -ψ) =0 0 0 (3)

46 Τελικά με ανάλογους μετασχηματισμούς λαμβάνεται η ακόλουθη τελική σχέση, η οποία αποτελεί τη γενικευμένη εξίσωση Μichaelis-Μenten, 2,303 t Η γραφική παράσταση της σχέσης: 2,303 t log ( S S V log = ( S -ψ 0 ) K S 0-0 ψ σε συνάρτηση με το ψ/t, δίνει ευθεία με κλίση -1/Κ Μ τέμνει τον χ στο ψ/t τέμνει τον ψ στο Vmax/K M ) M - K 1 ψ 0 max M t (4)

47 2,303 t log ( S S -ψ 0 ) = (4) Η παραπάvω σχέση(4) χρησιμοποιείται στις περιπτώσεις πoυ είvαι δυvατή, με κάπoια γρήγoρη μέθoδo (π.χ. UV), η παρακoλoύθηση της εξαφάvισης τoυ υπoστρώματoς (με άμεσo ήέμμεσo τρόπo) με τηv πάρoδo τoυ χρόvoυ, για vα υπoλoγιστoύv τα Vmax και Κ Μ τoυ εvζυμικoύ συστήματoς από την αντίστοιχη γραφική παράσταση. Επίσης, μπορούν να γίνουν οι ακόλουθες τροποποιήσεις: Αν S 0 >>ψ καικ Μ, τότε log(s 0 /S 0 -ψ) log1=0 και η (4) απλοποιείται και παίρνει τη μορφή Vmax t = ψ. Αν S 0 (και άρα και η τιμή ψ) << Κ Μ, τότε ψ/κ Μ 0 και η (4) παίρνει την ακόλουθη μορφή (5): V K M - K 1 ψ 0 max M t 2,303 log S = V 0 max (5) t S 0 - ψ K M

48 2,303 log S = V 0 max (5) t S 0 - ψ K M Όταν λοιπόν η καμπύλη της σχέσης [log S o /S o -ψ], σε συvάρτηση με τo χρόvo [t] είvαι οριζόντια ευθεία γραμμή, τότε ισχύει η εξίσωση (5) και συμπεραίνεται ότι ητιμήs 0 που χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα είναι πολύ μικρότερη από την Κ Μ.

49 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕ ΑΛΛΑ ΚΙΝΗΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Όταν η μέτρηση της αρχικής ταχύτητας δεν είναι δυνατή (δεν μπορούν να εφαρμοσθούν τα κινητικά μοντέλα των Μichaelis-Μenten και των Βriggs-Ηaldane) χρησιμοποιούνται δύο άλλες μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ταχύτητας της ενζυμικής αντίδρασης. Η πρώτη, περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της αντίδρασης σε πολύ μικρούς χρόνους, πριν φθάσει το ενζυμικό σύστημα στη σταθεροποιημένη κατάσταση και καλείται κινητική μεταβατικής κατάστασης (transient state). Στη δεύτερη μέθοδο, έρχεταιτοενζυμικόσύστημασε ισορροπία, η οποία διαταράσσεται στη συνέχεια με αλλαγή των συνθηκών (π.χ. της θερμοκρασίας) και παρακολουθείται η πορεία του συστήματος μέχρι τη νέα θέση ισορροπίας και ονομάζεται κινητική κατάστασης χαλάρωσης (relaxation).

50 Κινητική μεταβατικής κατάστασης Στα προηγούμενα κινητικά μοντέλα, που είχαν γίνει οι παραδοχές της αποκατάστασης ισορροπίας και της αποκατάστασης σταθεροποιημένης κατάστασης, είχε θεωρηθεί ότι κατά τα αρχικά στάδια της αντίδρασης, η συγκέντρωση του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος παραμένει σταθερή. Παρ όλα αυτά, υπάρχει μία μικρή χρονική περίοδος, κατά την οποία ησυγκέντρωσητου ΕS μεταβάλλεται με το χρόνο και ο ρυθμός μεταβολής της εμφάνισης του προϊόντος δεν έχει σταθερή τιμή.

51 Η μεταβατική κατάσταση μπορεί να μελετηθεί φωτομετρικά, με ειδικές τεχνικές, στις οποίες γίνεται γρήγορη μέτρηση της εμφάνισης ή της εξαφάνισης των διαφόρων συστατικών της αντίδρασης. Οι τεχνικές αυτές είναι δύο ειδών: Tεχνική της συνεχούς ροής. Tεχνική διακοπτόμενης ροής.

52 Κινητική μεταβατικής κατάστασης Tεχνική της συνεχούς ροής. Κατά την τεχνική αυτή αναμιγνύεται το ένζυμο με το υπόστρωμα και μελετάται η εμφάνιση ή η εξαφάνιση των συστατικών της αντίδρασης, σε ελάχιστο χρόνο (msec). Μεταβολή του χρόνου αυτής της τάξης, γίνεται με ρύθμιση της ροής, έτσι ώστε να λαμβάνονται ακριβείς μετρήσεις των μεταβολών που συμβαίνουν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από το χρόνο της ανάμιξης ενζύμου και υποστρώματος (χρόνος μηδέν).

53 Κινητική μεταβατικής κατάστασης Επειδή όμως, η τεχνική της συνεχούς ροής. έχει το μειονέκτημα ότι καταναλώνονται μεγάλα ποσά ενζύμου, έχει κυρίως αντικατασταθεί από την τεχνική διακοπτόμενης ροής. Tεχνική διακοπτόμενης ροής. Κατ αυτήν, αναμιγνύονται τα αντιδρώντα χωρίς την παρουσία του ρυθμιστή ροής. Tο μίγματηςαντίδρασης πηγαίνει στη συνέχεια σε άλλο χώρο, στον οποίο υπάρχει η δυνατότητα να σταματήσει η ροή σε διάφορους χρόνους, όπου λαμβάνονται οι μετρήσεις.

54 Κινητική μεταβατικής κατάστασης Tεχνική διακοπτόμενης ροής. Είναι σημαντικό οχρόνος, που μεσολαβεί ανάμεσα στην ανάμιξη των αντιδρώντων μέχρι να φθάσει το μίγμα στο χώρο μέτρησης, να είναι πολύ μικρότερος σε σχέση με το χρόνο που απαιτείται γιανααποκατασταθεί ισορροπία στην αντίδραση. Επιπλέον, σε αντίθεση με την προηγούμενη τεχνική, η μέθοδος προσδιορισμού που χρησιμοποιείται στις μετρήσεις, πρέπει να είναι πολύ γρήγορη.

55 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕ ΑΛΛΑ ΚΙΝΗΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Κινητική αποκατάστασης ισορροπίας (χαλάρωσης) Ο όρος κατάσταση χαλάρωσης αναφέρεται στην ικανότητα που έχει ένα σύστημα, το οποίο βρίσκεται σε μία κατάσταση ισορροπίας α, όταν διαταραχθεί η ισορροπία αυτή, να φθάσει σε μία νέα κατάσταση ισορροπίας β, δηλαδή στην ικανότητά του για αυτοδιευθέτηση. Η διατάραξη της κατάστασης ισορροπίας, μπορεί να γίνει με μεταβολή στις συναρτήσεις κατάστασης και κυρίως με μεταβολή στη θερμοκρασία και στην πίεση.

56 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕ ΑΛΛΑ ΚΙΝΗΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Κινητική κατάστασης χαλάρωσης Γιατημελέτητηςκινητικήςαυτής, έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές, οι οποίες όμως έχουν τη δυνατότητα να αναλύουν μόνο διαδοχικές αντιστρεπτές αντιδράσεις. Δηλαδή, οι ενζυμικές αντιδράσεις που είναι του τύπου: Ε + S ΕS Ε+Ρ δεν μπορούν να μελετηθούν, παρά μόνο αν η ταχύτητα του μη αντιστρεπτού σταδίου είναι πολύ μικρότερη από εκείνες των προηγουμένων σταδίων. Tότε, με την κινητική της κατάστασης χαλάρωσης μπορούν να μελετηθούν τα αντιστρεπτά στάδια, πριν το μη αντιστρεπτό στάδιο αρχίσει να παίζει σημαντικό ρόλο στην όλη αντίδραση.