ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ CSRP2 ΠΡΩΤΕÏΝΗΣ ΣΤΟΝ ΛΙΠΩΔΗ ΙΣΤΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΑΝΕΥΡΥΣΜΑ ΚΟΙΛΙΑΚΗΣ ΑΟΡΤΗΣ

Transcript

1 ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ CSRP2 ΠΡΩΤΕÏΝΗΣ ΣΤΟΝ ΛΙΠΩΔΗ ΙΣΤΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΑΝΕΥΡΥΣΜΑ ΚΟΙΛΙΑΚΗΣ ΑΟΡΤΗΣ ΜΟΥΛΑ ΜΙΧΑΗΛΙΑ Επιβλέποντες: Κωνσταντινίδης Σταύρος, MD Παυλάκη Μαρία, PhD ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΕΛΕΤΗΣ ΑΘΗΡΟΣΚΛΗΡΩΣΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΥΠΟΛΗ ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2018

2 Πρόλογος Ευχαριστίες Τα καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελούν την πρώτη αιτία θανάτου στον δυτικό κόσμο. Το πρόβλημα αυτό είναι αναγκαίο να αντιμετωπιστεί και να περιοριστεί. Σε αυτόν τον σκοπό συμβάλει δραματικά η μεταφραστική έρευνα, η οποία στοχεύει στην κατανόηση του μηχανισμού αυτών των ασθενειών έτσι ώστε να αναπτυχτούν μέθοδοι θεραπείας και πρόληψης. Με την εξέλιξη της τεχνολογίας, νέες ερευνητικές τεχνικές έγιναν διαθέσιμες και αυτό οδήγησε σε μία εκπληκτική ανάπτυξη κυρίως στον τομέα της πρόληψης τα τελευταία χρόνια. Όμως, παρά τις σημαντικές ανακαλύψεις και τη συνεχή συσσώρευση γνώσεων σχετικά με το καρδιαγγειακό σύστημα, η πλήρης κατανόηση της λειτουργίας των ασθενειών του παραμένει ένα αναπάντητο ερώτημα. Η έρευνα πάνω στο καρδιαγγειακό σύστημα κρίνεται επιτακτική για την καταπολέμηση αυτών των ασθενειών. Με την παρούσα διπλωματική εργασία προσπαθώ να συμβάλω και εγώ σε αυτήν την έρευνα. Κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της εργασίας στο Εργαστήριο Μελέτης της Αθηροσκλήρωσης εκπαιδεύθηκα σε τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του καρδιαγγειακού συστήματος, έμαθα τις πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα της καρδιολογίας αλλά, κυρίως, γνώρισα το καρδιαγγειακό σύστημα. Θέλω να ευχαριστήσω την κυρία Παυλάκη Μαρία και τον κύριο Κωνσταντινίδη Σταύρο που με δέχτηκαν σε αυτό το εργαστήριο και για το χρόνο που μου αφιέρωσαν. Η εμπειρία τους και οι γνώσεις τους με βοήθησαν στην προσπάθεια μου να γίνω μία σωστή ερευνήτρια και επιστήμονας. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την Κουρκούλη Αδριανή για την πολύτιμη στήριξή της κατά την διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων στο εργαστήριο και τη βοήθεια της όποτε και αν την είχα ανάγκη. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω την Μυγδαλιά Δήμητρα και την Τσαλίκη Βασιλική για την άψογη συνεργασία που είχα μαζί τους και το ευχάριστο κλίμα που επικρατούσε στο εργαστήριο. Ακόμη οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Σοφία, τον Δημήτρη, τον Παναγιώτη, την Αγγελιάννα που στάθηκαν δίπλα μου καθ όλη την διάρκεια της φοιτητικής μου ζωής και κυρίως για τα αξέχαστα και ανέμελα χρόνια που περάσαμε. 2

3 Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στην οικογένεια μου. Σας ευχαριστώ για όλα. Μουλά Μιχαηλία 3

4 Πίνακας περιεχομένων Περίληψη 7 1. Εισαγωγή Αγγειακό σύστημα Ιστολογία Αγγειακού Συστήματος Σύγκριση Μεσαίου και Μεγάλου Μεγέθους Αρτηριών Χαρακτηριστικά Αορτής Παράγοντες Παθογένειας των Αγγείων Ανεύρυσμα Κοιλιακής Αορτής Παθολογία Ανευρύσματος Κοιλιακής Αορτής Αιτιολογία Ανευρύσματος Κλινική Εικόνα Ανευρύσματος Κοιλιακής Αορτής και Διάγνωση Θεραπεία και Διαχείριση Ασθένειας Η πρωτεΐνη CSRP Σκοπός της Διπλωματικής Εργασίας Υλικά και Μέθοδοι Βιολογικό Υλικό Συλλογή δειγμάτων Λιπώδους Ιστού Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Κυτταροκαλλιέργεια ανθρωπίνων λείων μυϊκών κυττάρων αορτής (Aortic Smooth Muscle Cells, AoSMCs) Αρχή της Μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Oμογενοποίηση ιστού (λιπώδους και κυττάρων AoSMCs) για απομόνωση πρωτεϊνών Αρχή μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών με τη μέθοδο BCA Αρχή της μεθόδου Υλικά και Διαλύματα 32 4

5 2.3.3 Πειραματική Διαδικασία Προσδιορισμός της συγκέντρωσης CSRP-2 με τη μέθοδο ELISA Αρχή της Μεθόδου Υλικά Πειραματική Διαδικασία Ομογενοποίηση λιπώδους ιστού για απομόνωση κυτταρικού κλάσματος Stromal Vascular Fraction (SVF) και λύση Αρχή μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδηςμε SDS (SDS-PAGE) και ανάλυση Western Blot Αρχή μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Ομογενοποίηση λιπώδους ιστού για απομόνωση RNA Αρχή μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Απομόνωση RNA Αρχή Μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Σύνθεση cdna (Αντίστροφη Μεταγραφή) Αρχή μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική Διαδικασία Real- time PCR Αρχή της μεθόδου Υλικά και Διαλύματα Πειραματική διαδικασία Αποτελέσματα Ποσοτικοποίηση της CSRP2 σε κυτταρικό εκχύλισμα λιπώδους ιστού με ανταγωνιστική ELISA Μετρήσεις BCA για την μέθοδο ELISA 46 5

6 3.1.2 Ανάλυση ELISA Ανίχνευση CSRP2 σε εκχυλίσματα λιπώδους ιστού με ανοσοαποτύπωση Western Blot Μετρήσεις BCA των δειγμάτων του Western Blot Ανάλυση Western Blot Ποσοτικοποίηση CSRP2 μεταγράφων (mrna) με real-time PCR Απομόνωση RNA Real-time PCR Συζήτηση 53 Βιβλιογραφία 56 6

7 Περίληψη Η CSRP2 πρωτεΐνη εκφράζεται κυρίως στα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων και εμπλέκεται σε διαδικασίες μετανάστευσης και διαφοροποίησης αυτών. Τα αγγεία περιβάλλονται από τον περιαγγειακό λιπώδη ιστό, ο οποίος φαίνεται να έχει ενεργό ρυθμιστικό ρόλο ως προς το αγγείο μέσω έκκρισης αδιποκινών. Το ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής είναι μία ασθένεια κατά την οποία προκαλείται διάταση κοιλιακής αορτής (Abdominal Aortic Aneurysm, AAA) και χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη πρωτεόλυση του εξωκυττάριου υλικού των τοιχωμάτων της αορτής, φλεγμονή και απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων του αγγείου. Στην παρούσα διπλωματική εργασία εντοπίστηκε η έκφραση της CSRP2 στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό ασθενών που πάσχουν από ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής. Πράγματι, μέσα από τεχνικές ELISA, Western Blot και real-time PCR προσδιορίστηκε η έκφραση της CSRP2 στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό. Ακόμη, σε σύγκριση με τον σπλαχνικό και τον υποδόριο λιπώδη ιστό η συγκέντρωση και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης τείνουν να είναι υψηλότερα στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά μέχρι στιγμής για την συμβολή της CSRP2 στο ανεύρυσμα της κοιλιακής αορτής και συνεπώς είναι σημαντική η περεταίρω διερεύνηση του ρόλου της. Abstract CSRP2 protein is mainly expressed in vascular smooth muscle cells and is involved in migration and differentiation processes. Human vessels are surrounded by perivascular adipose tissue, which appears to have an active regulatory role on the vessel through adipokines secretion. Abdominal aortic aneurysm (A.A.A) is a disease in which a localized dilation of aorta occurs. This is induced and characterized by extensive proteolysis of the extracellular matrix of the aortic wall, inflammation and apoptosis of the vascular smooth muscle cells. In this diploma thesis, expression of CSRP2 was detected in perivascular adipose tissue of patients suffering from abdominal aortic aneurysm. Indeed, by the implementation of techniques such as ELISA, Western blot analysis and real-time PCR, we determined the location of CSRP2 s expression to be in perivascular adipose tissue. Moreover, compared to visceral and subcutaneous adipose tissue, the protein s concentration and expression levels tend to be higher in perivascular adipose tissue. However, little is known so far for the involvement of CSRP2 in the abdominal aortic aneurysm; therefore, it is important to further investigate its role in AAA. 7

8 1. Εισαγωγή 8

9 1.1 Αγγειακό σύστημα Το Αγγειακό ή Κυκλοφορικό σύστημα αποτελείται από τα αιμοφόρα αγγεία και τα λεμφαγγεία. Τα αιμοφόρα αγγεία περιλαμβάνουν τις Αρτηρίες, τα Τριχοειδή αγγεία και τις Φλέβες. Οι Αρτηρίες είναι τα απαγωγά αγγεία του κυκλοφορικού συστήματος, η διάμετρος των οποίων συνεχώς μικραίνει καθώς διακλαδίζονται και η λειτουργία τους είναι η μεταφορά αίματος στους ιστούς, πλούσιο σε οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά. Τα Τριχοειδή αγγεία είναι τα μικρότερα αιμοφόρα αγγεία του κυκλοφορικού συστήματος και μέσω των τοιχωμάτων τους επιτελείται η ανταλλαγή ουσιών μεταξύ αίματος και ιστών. Τέλος οι Φλέβες σχηματίζονται από τα τριχοειδή αγγεία και κατατάσσονται στα προσαγωγά αγγεία, η διάμετρός τους αυξάνεται προοδευτικά καθώς προσεγγίζουν την καρδία όπου επαναφέρουν το αίμα ώστε να προωθηθεί και πάλι την περιφέρεια. Το Λεμφικό αγγειακό σύστημα αποτελείται από τα λεμφαγγεία, τα οποία ξεκινούν από τα λεμφικά Εικόνα1.1: Το αιμοφόρο αγγειακό σύστημα. Δεξιά: Αρτηρίες, Αριστερά: Φλέβες (πηγή: ascular_diseases/overview_of_the_vascular_system_85,p08 254) τριχοειδή και σχηματίζουν αγγεία μεγαλύτερης διαμέτρου. Το σύστημα αυτό είναι υπεύθυνο για την συλλογή και τη μεταφορά του μεσοκυττάριου υγρού που ονομάζεται λέμφος όταν εισέλθει στα λεμφαγγεία. Η λέμφος που έχει συλλεχθεί καταλήγει στα αιμοφόρα αγγεία, συγκεκριμένα στο φλεβικό σύστημα κοντά στην καρδιά. Έτσι επιτελείται η βασικότερη λειτουργία του λεμφικού συστήματος, δηλαδή η επιστροφή του υγρού των ιστών στην κυκλοφορία του αίματος. [1][LJu04] Ιστολογία Αγγειακού Συστήματος Στο αγγειακό σύστημα υπάρχουν αιμοφόρα αγγεία που διαφέρουν ως προς την διάμετρό τους και κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες με βάση το αν η διάμετρος ξεπερνά ή είναι μικρότερη από 0.1mm. Στα αγγεία με διάμετρο μεγαλύτερη από 0.1 mm συγκαταλέγονται τα μεγάλα αρτηρίδια, οι μυϊκού και ελαστικού τύπου αρτηρίες και οι μυϊκού τύπου φλέβες, ενώ τα αρτηρίδια, τα τριχοειδή και τα μετατριχοειδή φλεβίδια είναι αγγεία με διάμετρο μικρότερη από 0.1mm.[LJu04] 9

10 Τα παραπάνω αγγεία έχουν κοινή εμβρυολογική προέλευση και ιστολογία, καθώς προέρχονται από το μεσόδερμα. Τα αιμοφόρα αγγεία συγκροτούνται από τρείς χιτώνες τον έξω, τον μέσο και τον έσω χιτώνα. Έσω χιτώνα διαθέτουν όλα τα αιμοφόρα αγγεία, ενώ μέσο και έξω χιτώνα δεν διαθέτουν τα τριχοειδή αγγεία Ο έσω χιτώνας αποτελείται από μία μόνο λεπτή στοιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων που βρίσκεται πάνω στον βασικό υμένα. Στο μέσο χιτώνα που βρίσκεται αμέσως κάτω από τον έσω, ο κυτταρικός τύπος που απαντάται είναι τα λεία μυϊκά κύτταρα τα οποία διατάσσονται σε περισσότερες της μιας στιβάδας. Ενδιάμεσα στον έσω χιτώνα και τον μέσο χιτώνα παρεμβάλλεται το έσω ελαστικό πέταλο, το οποίο οριοθετεί τον έσω χιτώνα και αποτελείται κυρίως από ελαστίνη. Ακόμη φέρει θυρίδες που επιτρέπουν την διάχυση ουσιών στο εσωτερικό του αγγείου.. Ο μέσος χιτώνας αποτελεί το μεγαλύτερο σε διαστάσεις τμήμα του αγγειακού τοιχώματος. Μεταξύ των λείων μυϊκών κυττάρων παρεμβάλλεται εξωκυττάριο υλικό αποτελούμενο από ελαστικές ίνες, δικτυωτές ίνες κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, πρωτεογλυκάνες και γλυκοπρωτεΐνες. Στις αρτηρίες ο μέσος χιτώνας διαχωρίζεται από τον έξω χιτώνα με το έξω ελαστικό πέταλο, που αποτελείται από ελαστίνη. Εικόνα1.2: Οι χιτώνες των αγγείων. Miao et al. British Journal of Pharmacology 2012 Το τελευταίο στρώμα του αγγειακού τοιχώματος είναι ο έξω χιτώνας, που έχει το σημαντικότερο ρόλο στην στήριξη του αγγείου. Αποτελείται κυρίως από συνδετικό ιστό και περιέχει ίνες ελαστίνης, κολλαγόνου τύπου Ι και ινοβλάστες. Ο έξω χιτώνας έρχεται σε επαφή με το περιβάλλον εξωτερικά του αγγείου, δηλαδή τον εκάστοτε υποκείμενο ιστό. Τέλος τα μεγάλα αγγεία διαθέτουν μικρότερα αγγεία, τα επονομαζόμενα αγγεία των αγγείων. Αυτά διοχετεύουν στον έξω και στον μέσο χιτώνα θρεπτικά συστατικά και μεταβολίτες. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμα καθώς καλύπτουν τις επιπλέον ανάγκες θρέψης των χιτώνων αυτών αφού το πάχος του τοιχώματος είναι ιδιαίτερα μεγάλο ώστε το αγγείο να τραφεί αποκλειστικά μέσω διάχυσης από το αίμα του αυλού. Ακόμη όλα τα αγγεία περιβάλλονται από ένα στρώμα λιπώδους ιστού, ο οποίος έχει σημαντικό ρόλο στην φυσιολογική τους λειτουργία. Ο λιπώδης 10

11 ιστός πλέον δεν θεωρείται απλά ένα όργανο το οποίο αποθηκεύει ενέργεια σε μορφή λίπους αλλά έχει δειχτεί ότι διαθέτει ενδοκρινή δράση και ενέχεται στις φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού. Διαθέτει την ικανότητα να εκκρίνει διάφορα πεπτίδια και μεταβολίτες που ονομάζονται αδιποκίνες και συμβάλουν στην ρύθμιση της αγγειακής λειτουργίας. 1,2 Ο τύπος του περιαγγειακού λιπώδους ιστού εξαρτάται από την τοποθεσία του μέσα στον οργανισμό και από τον τύπο του αγγείου που περιβάλλει. Διακρίνονται οι λευκός και καφέ τύποι λιπώδους ιστού μπορεί όμως να συναντηθεί και συνδυασμός των δύο. 3 Επίσης τα λιποκύτταρα ταξινομούνται σε λευκά και καφέ αλλά πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα κύτταρα περιαγγειακού λιπώδους ιστού έχουν διαφορετική εμβρυολογική προέλευση σε σχέση με τα υπόλοιπα. 4 Τέλος η διαφοροποίηση του περιαγγειακού λίπους σε φαινοτυπικό επίπεδο δεν περιορίζεται μόνο στην μορφολογία των κυττάρων αλλά και στην έκφραση αδιποκινών, καθώς τα περιαγγειακά λιποκύτταρα εκφράζουν διαφορετικούς παράγοντες σε σχέση με τα κύτταρα σπλαχνικού και υποδόριου λιπώδους ιστού. Συγκεκριμένα στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό συναντώνται χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης αδιποκινών και δεικτών διαφοροποίησης λιποκυττάρων ενώ υπάρχει υψηλή έκφραση αγγειογόνων και προφλεγμονόδων παραγόντων. 5 Ο περιαγγειακός λιπώδης ιστός διαφέρει από τον σπλαχνικό και υποδόριο λιπώδη ιστό. Ο σπλαχνικός λιπώδης ιστός εντοπίζεται στο εσωτερικό των οργάνων και αποτελείται από καφέ λιποκύτταρα. Ο υποδόριος λιπώδης ιστός είναι τύπος λευκού λιπώδους ιστού και εντοπίζεται στον συνδετικό ιστό κάτω από το δέρμα. Βασικός του ρόλος είναι η παρεμπόδιση απώλειας θερμότητας από τον οργανισμό. 6 Η σύσπαση των αγγείων ρυθμίζεται από την δράση του περιαγγειακού λιπώδους ιστού. Έχει δειχτεί ότι το λίπος που περιβάλλει τα αγγεία είναι ρυθμιστής των νευροδιαβιβαστών που ευθύνονται για την σύσπαση αυτών. Ειδικότερα η παρουσία του λίπους μειώνει την ευαισθησία στην νορεπινεφρίνη κατά την συστολή του αγγείου, προσδίδοντας έτσι αντισυσταλτικό ρόλο στο περιαγγειακό λίπος. 7 Ο παράγοντας που ρυθμίζει αυτό το φαινόμενο προέρχεται από τα λιποκύτταρα και η απελευθέρωση του εξαρτάται από ασβέστιο, την πρωτεϊνική κινάση Α και μία κινάση τυροσίνης. 8 Μέχρι στιγμής η επικρατούσα άποψη υποστηρίζει ότι δεν είναι ένα το μόριο που ρυθμίζει το αντισυσταλτικό ρόλο του αγγείου αλλά διάφορα μόρια προερχόμενα από το λίπος ενέχονται σε αυτή την διαδικασία. 9 Τέλος οι αδιποκίνες και οι κυτοκίνες που εκκρίνονται φυσιολογικά από το λίπος επιτελούν μία σειρά από σημαντικές λειτουργίες. Αρχικά διαθέτουν παρακρινή δράση και ρυθμίζουν έτσι την έκκριση αγγειοδιασταλικών και αγγειοσυσταλτικών παραγόντων από το ενδοθήλιο του αγγειακού τοιχώματος. Έπειτα συμβάλλουν στην μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των λείων 11

12 μυϊκών κυττάρων, γεγονός που οδηγεί στην αύξηση του μεγέθους του αγγείου και στην σκλήρυνση αυτού. Παράλληλα οι παράγοντες αυτοί προσελκύουν κύτταρα φλεγμονής στην περιοχή όπου εκκρίνονται με αποτέλεσμα να οδηγούν σε δυσλειτουργία του αγγείου. 9, Σύγκριση Μεσαίου και Μεγάλου Μεγέθους Αρτηριών Οι αρτηρίες διακρίνονται σε μεσαίου μεγέθους μυϊκού τύπου και μεγάλου μεγέθους ελαστικού τύπου και μεταξύ τους παρουσιάζουν ιστολογικές διαφορές. Η βασικότερη διαφορά αυτών έγκειται στο ότι οι μυϊκού τύπου αρτηρίες είναι πλούσιες σε μυϊκά κύτταρα ενώ οι ελαστικού τύπου χαρακτηρίζονται από ελαστίνη. Οι μεσαίου μεγέθους αρτηρίες συμβάλουν κατά κύριο λόγο στην αιμάτωση οργάνων. Ο έσω χιτώνας διαχωρίζεται από τον μέσο με το έσω ελαστικό πέταλο το οποίο είναι καλά σχηματισμένο. Ο μέσος χιτώνας είναι χαρακτηριστικός των μυϊκού τύπου αγγείων, διότι αποτελείται από περίπου 40 στοιβάδες λείων μυϊκών κυττάρων μεταξύ των οποίων βρίσκονται ελαστικά πέταλα, δικτυωτές ίνες και πρωτεογλυκάνες. Ο έξω χιτώνας συγκροτείται από συνδετικό ιστό και φέρει όλα τα απαραίτητα αγγεία και νεύρα για την φυσιολογική λειτουργία του αγγείου. Εικόνα1.3: : Μεσαίου μεγέθους αρτηρία. (πηγή: Οι ελαστικού τύπου μεγάλου μεγέθους αρτηρίες, στις οποίες εντάσσεται και η αορτή, διαθέτουν έσω χιτώνα με παχύτερη στοιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων από τον αντίστοιχο μιας μυϊκού τύπου αρτηρίας, καθώς και δυσδιάκριτο έσω ελαστικό πέταλο. Ο μέσος χιτώνας είναι πλούσιος σε ελαστίνη καθώς χαρακτηρίζεται από μεγάλο αριθμό συγκεντρικά διατεταγμένων ελαστικών πετάλων, μεταξύ των οποίων συναντώνται λεία μυϊκά κύτταρα, δικτυωτές ίνες κολλαγόνου, γλυκοπρωτεΐνες και πρωτεογλυκάνες. Ο αριθμός των ελαστικών πετάλων αυξάνει με την ηλικία. Τέλος ο έξω χιτώνας δεν είναι ιδιαίτερα ανεπτυγμένος. [LJu04] 12

13 Εικόνα1.4: Μεγάλου μεγέθους αγγείο. (πηγή: Χαρακτηριστικά Αορτής Η αορτή κατατάσσεται στην κατηγορία των αρτηριών μεγάλου μεγέθους και είναι το μεγαλύτερο αγγείο του ανθρώπινου οργανισμού. Η λειτουργία της είναι η προώθηση του αίματος από την καρδία στην συστηματική κυκλοφορία και διαθέτει υψηλή ελαστικότητα προκειμένου να το επιτύχει αυτό. 11 Η αορτή συνήθως διαχωρίζεται σε θωρακικό και κοιλιακό μέρος και με βάση αυτόν τον διαχωρισμό προσδιορίζεται η εκάστοτε ασθένεια. Εφόσον η αορτή είναι αρτηρία διαθέτει όλα τα χαρακτηριστικά ενός μεγάλου αγγείου, δηλαδή το τοίχωμά της αποτελείται από έσω, μέσο και έξω χιτώνα και περιβάλλεται από περιαγγειακό λιπώδη ιστό. Ο έσω χιτώνας είναι ιδιαίτερα παχυλός και διαθέτει υποενδοθηλικό στρώμα πλούσιο σε κολλαγόνο και ελαστίνη. Ακόμη στον ίδιο χιτώνα εντοπίζονται λεία μυϊκά κύτταρα και ινοβλάστες και ο διαχωρισμός από τον μέσο χιτώνα γίνεται με το έσω ελαστικό πέταλο. 6 Η αορτή δεν διαφέρει ιστολογικά από τα αγγεία μεγάλου μεγέθους στον μέσο και έξω χιτώνα. Παρόλα αυτά εντοπίζεται μία διαφορά στον μέσο χιτώνα που αποτελείται κυρίως από πλήθος ελαστικών πετάλων, ίνες κολλαγόνου και λιγότερα λεία μυϊκά κύτταρα σε σύγκριση με τα υπόλοιπα αγγεία. Ο έξω χιτώνας συνίσταται κυρίως από ιδιαίτερα πυκνές ίνες κολλαγόνου και φέρει τα απαραίτητα αγγεία και νεύρα που χρειάζεται η αορτή. 6 Παρόλο που δεν εντοπίζονται σημαντικές διαφορές μεταξύ της αορτής και των υπόλοιπων αγγείων, υπάρχουν διαφορές μεταξύ της θωρακικής και της κοιλιακής αορτής. Οι διαφοροποιήσεις αυτές εντοπίζονται σε δομικό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο. Η θωρακική αορτή έχει πιο λεπτό έσω και μέσο χιτώνα και περισσότερα ελαστικά πέταλα από την κοιλιακή αορτή. Ακόμη στην θωρακική περιοχή υπάρχει υψηλότερη έκφραση ελαστίνης και κολλαγόνου σε σύγκριση με την κοιλιακή. 12 Σε κυτταρικό επίπεδο τα λεία μυϊκά κύτταρα της θωρακικής αορτής προέρχονται από την νευρική ακρολοφία ενώ στην κοιλιακή αορτή προέρχονται από το μεσόδερμα

14 1.2 Παράγοντες Παθογένειας των Αγγείων Οι παράγοντες παθογένειας των αγγείων οδηγούν σε παθολογικές καταστάσεις των αρτηριών και των φλεβών και αποτελούν τις σημαντικότερες αιτίες θνησιμότητας στον δυτικό κόσμο. Επηρεάζουν άμεσα την ροή του αίματος και έμμεσα περιφερικά όργανα. Σε αυτούς συγκαταλέγονται οι παρακάτω: Η θρόμβωση κατά την οποία σχηματίζεται ένας θρόμβος εντός του αγγειακού αυλού και είναι δυνατόν να οδηγήσει σε απόφραξη αυτού. [1] Η αθηροσκλήρωση που είναι μία εκφυλιστική διεργασία του τοιχώματος του αυλού των αγγείων και οδηγεί σε μερική η πλήρη απόφραξη του αυλού. Οι μεταβολές του τοιχώματος περιλαμβάνουν την συσσώρευση διαφόρων παραγόντων, όπως λιπιδίων και πολυσακχαριτών, που προκαλούν την δημιουργία της αθηρωματικής πλάκας. Αυτή ευθύνεται για την απόφραξη του αυλού με αποτέλεσμα την αιμάτωση της αιματικής ροής και την μείωση της οξυγόνωσης των οργάνων. Η οξεία αρτηριακή θρομβοεμβολική νόσος, εκδηλώνεται με οξεία ισχαιμία δηλαδή την αιφνίδια και ταυτόχρονη σημαντική μείωση της αιμάτωσης ενός οργάνου ή άκρου. [1] Η οξεία φλεβική θρομβοεμβολική νόσος, η ταυτόχρονη συνύπαρξη φλεβικής θρόμβωσης και πνευμονικής εμβολής. Κατά την εξέλιξη της νόσου ο θρόμβος μεταφέρεται μέσω των μεγάλων φλεβών και των καρδιακών κοιλοτήτων στην πνευμονική αρτηρία προκαλώντας πνευμονικές εμβολές. [1] Η ανευρυσματική νόσος που είναι η μόνιμη και εντοπισμένη διάταση ενός αγγείου με αύξηση 50% τουλάχιστον της φυσιολογικής του διαμέτρου. [1] 1.3 Ανεύρυσμα Κοιλιακής Αορτής 1.4 Ως ανεύρυσμα Κοιλιακής Αορτής χαρακτηρίζεται περιοχή της κοιλιακής αορτής στην οποία παρατηρείται τοπική διαστολή περισσότερο από το 50% της διαμέτρου της ή περισσότερο από 3cm. 14 Τα περισσότερα ανευρύσματα κοιλιακής αορτής δεν εμφανίζουν κάποιο σύμπτωμα, αλλά παραμένουν σιωπηλά μέχρι να επέλθει η ρήξη. Η συχνότητα ρήξης υπολογίζεται σε 5-10 περιπτώσεις ανά

15 περιστατικά. Στις σύγχρονες κοινωνίες το ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής ευθύνεται για το 1.5-2% των θανάτων στους άνδρες και για το % στις γυναίκες.[1] Συνήθως η διάγνωση γίνεται τυχαία κατά την διάρκεια μιας εξέτασης ρουτίνας, για παράδειγμα την λήψη μια ακτινογραφίας Παθολογία Ανευρύσματος Κοιλιακής Αορτής Πρόκειται για μία δυναμική παθολογική διαδικασία και όχι για ένα στατικό φαινόμενο. Συγκεκριμένα κατά την δημιουργία του ανευρύσματος πραγματοποιείται εκτεταμένη αναδιαμόρφωση της δομής του αγγείου που οδηγεί σε προοδευτική εξασθένιση και διαστολή του αορτικού τοιχώματος Η παθολογική κατάσταση του ανευρύσματος περιγράφεται στην εικόνα 1.5 και χαρακτηρίζεται από τρείς βασικές διαδικασίες, οι οποίες είναι η έντονη πρωτεόλυση του εξωκυττάριου υλικού, η φλεγμονή και η απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων της αορτής Το εξωκυττάριο υλικό του αορτικού τοιχώματος αποτελείται κυρίως από μακρομόρια όπως το κολλαγόνο και η ελαστίνη, τα οποία επιτελούν πληθώρα λειτουργιών και είναι απαραίτητα για την διατήρηση της ομοιόστασης του αγγείου. 17 Η απώλεια της ελαστίνης και η αποικοδόμηση του κολλαγόνου εξαιτίας εκτεταμένης πρωτεόλυσης είναι οι δύο διεργασίες που έχουν σαν αποτέλεσμα την αναδιαμόρφωση του τοιχώματος. 18 (Εικόνα 1.5, Progression) Κατά την πρωτεόλυση σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν πρωτεάσες που ανήκουν στην οικογένειες Μεταλλοπρωτεασών του Εξωκυττάριου Υλικού (Matrix Metaloproteinase, MMP), πρωτεάσων Κυστεΐνης και πρωτεάσων Σερίνης

16 Εικόνα1.5: : Εξέλιξη ανευρύσματος κοιλιακής αορτής. Hellenthal FA et al. Nature Reviews Cardiology Φυσιολογικά η ελαστίνη καθορίζει τις μηχανικές ιδιότητες του αορτικού τοιχώματος, καθώς προσδίδει ελαστικότητα στο αγγείο και διατηρεί την μηχανική πίεση του παλμού. 20 Με το πέρας του χρόνου η ελαστίνη 16

17 κατακερματίζεται από την ελαστάση, η οποία είναι πρωτεάση σερίνης, και τα τμήματα που προκύπτουν ονομάζονται Πεπτίδια Ελαστίνης. Στην ανάπτυξη ανευρύσματος κοιλιακής αορτής παρατηρούνται αυξημένα επίπεδα ελαστάσης και αλλαγή της δομής και της ποσότητας της ελαστίνης στον εξωκυττάριο χώρο Η ελαστάση, που παράγεται από τα λεία μυϊκά κύτταρα, έχει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο της νόσου. Η δράση της τερματίζεται από την α1- αντιθρυψίνη (a1- antitrypsin, A1AT), ένζυμο με ενεργότητα α1- αναστολέα πρωτεασών. 22 Αρχικά έχει δειχτεί ότι η εκτεταμένη πρωτεόλυση της ελαστίνης οδηγεί στην εκδήλωση φλεγμονώδους απόκρισης στην περιοχή του ανευρύσματος. Τα λεία μυϊκά κύτταρα της αορτής εκκρίνουν χημειοκίνες, διαδικασία που φαίνεται να πυροδοτείται από την ελαστάση. Οι χημειοκίνες προσελκύουν λευκοκύτταρα στην περιοχή δράσης του ενζύμου. Έτσι η ελαστάση ίσως είναι ο συνδετικός κρίκος μεταξύ του προοδευτικού εκφυλισμού του αορτικού τοιχώματος μέσω πρωτεόλυσης του εξωκυττάριου υλικού και της φλεγμονώδους απόκρισης. 23 Επιπρόσθετα η υψηλή ενεργότητα ελαστάσης παρεμποδίζει την είσοδο του Ca στα λεία μυϊκά κύτταρα και οδηγεί σε μη φυσιολογική συστολή του αγγείου και χαλάρωση αυτού Η εκτεταμένη πρωτεόλυση και ο σχηματισμός συσσωματωμάτων κολλαγόνου έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη και την ρήξη του ανευρύσματος. 16 Παράλληλα με την ελαστίνη στο αορτικό τοίχωμα υπάρχουν και ίνες κολλαγόνου, οι οποίες προσδίδουν σταθερότητα στον ιστό. 24 Το μεγαλύτερο μέρος του συνολικού κολλαγόνου αποτελείται από κολλαγόνο τύπου Ι και εντοπίζεται στον έσω και έξω χιτώνα αλλά και μεταξύ των λείων μυϊκών κυττάρων του μέσου χιτώνα της αορτής. Ακόμη το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ απαρτίζει μεγάλο μέρος του συνολικού κολλαγόνου και εντοπίζεται κυρίως στον μέσο χιτώνα και σε πυκνά αποθέματα κατά μήκος του ελαστικού πετάλου. 25 Τα δύο παραπάνω κολλαγόνα χαρακτηρίζονται από υψηλή ανθεκτικότητα σε πρωτάσες λόγω της τριτοταγούς δομής τους. Παρ όλα αυτά οι πρωτεάσες Κυστεϊνης και οι μεταλλοπρωτεάσες MMP έχουν την δυνατότητα να τα αποικοδομούν. Έπειτα τα κολλαγόνα κατακερματίζονται περεταίρω από μικρότερης ειδικότητας πρωτεάσες και σχηματίζουν συσσωματώματα Οι μεταλλοπρωτεάσες MMP, που συντίθενται από τα λεία μυϊκά κύτταρα, είναι ενδοπεπτιδάσες εξαρτώμενες από ψευδάργυρο και ασβέστιο που συντίθενται ως ζυμογόνα, δηλαδή πρόδρομα μόρια που ενεργοποιούνται κατόπιν διάσπασης. Στη φυσιολογική κατάσταση βρίσκονται σε ισορροπία με τους ενδογενείς ιστικούς αναστολείς τους, TIMP, διαδικασία που ρυθμίζεται σε μεταφραστικό επίπεδο. Συνεπώς η ενεργότητα των MMPs εξαρτάται άμεσα τόσο από την σύνθεση και την ενεργοποίηση αυτών όσο και των TIMPs. 26 H ανάπτυξη του ανευρύσματος κοιλιακής αορτής έχει συσχετιστεί με την 17

18 ανισορροπία μεταξύ των MMPs και TIMPs Στην δημιουργία του ανευρύσματος συμβάλουν και οι πρωτεάσες Κυστεΐνης. Πρόκειται για μεγάλη οικογένεια πρωτεασών που περιλαμβάνει μεταξύ άλλων καθεψίνες και κασπάσες. Στην παθολογία του ανευρύσματος συμβάλουν οι καθεψίνες K, L και S, οι οποίες συντίθενται σαν ζυμογόνα και παίρνουν την ενεργή ενζυματική τους μορφή μετά από διάσπαση. Η καθεψίνη K διασπά κολλαγόνο ενώ η καθεψίνη S δρα προκαλώντας την απελευθέρωση μορίων προσκόλλησης από την επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων. 28 Σε in vitro πειράματα κυτταροκαλλιεργειών έχουν εντοπιστεί ενεργές πρωτεάσες Κυστεΐνης σε λεία μυϊκά κύτταρα αορτής, ενδοθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα. Συγκεκριμένα εκκρινόμενα πρόδρομά και ώριμα μόρια καθεψινών προέρχονται από μονοκύτταρα που διαφοροποιούνται σε μακροφάγα (Monocyte- Derived Macrophages, MDMs). Όταν τα MDMs έρθουν σε επαφή με το εξωκυττάριο υλικό το τοπικό περιβάλλον γίνεται όξινο γεγονός που ευνοεί την δράση των καθεψινών και τους επιτρέπει να ξεκινήσουν την πρωτεόλυση του κολλαγόνου. Επίσης τα λεία μυϊκά κύτταρα, όταν λάβουν διεγερτικό σήμα από διάφορες κυτοκίνες της περιοχής, εκκρίνουν ενεργές καθεψίνες που διασπούν την ελαστίνη Η δράση των πρωτεασών Κυστεΐνης αναστέλλεται από την Κυστατίνη C. Φυσιολογικά η Κυστατίνη C εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα προκειμένου να διατηρεί σε φυσιολογικά επίπεδα τις καθεψίνες. 29 Όταν δημιουργείται ανεύρυσμα στην κοιλιακή αορτή συνυπάρχουν δύο διαδικασίες υπερέκφραση καθεψινών που λύουν την ελαστίνη και μειωμένη έκφραση κυστατίνης C. 30 Οι διαδικασίες αυτές είναι αποτέλεσμα διαφορικής ρύθμισης της έκφρασης και της έκκρισης πρωτεασών Κυστεΐνης και των αναστολέων τους ως απόκριση στις κυτοκίνες φλεγμονής Επίσης οι πρωτεάσες σερίνης έχουν συσχετιστεί με την παθολογία του ανευρύσματος κοιλιακής αορτής. Πρόκειται για ενδοπεπτιδάσες που συμβάλουν σε πολλές διεργασίες του οργανισμού, όπως στην πήξη του αίματος, στην ανοσία και στην φλεγμονή. Μία πρωτεάση σερίνης σχετιζόμενη με το ανεύρυσμα είναι η Πλασμίνη, η οποία παράγεται σε ανενεργή μορφή πλασμινογόνου. Το πλασμινογόνο διασπάται από διάφορους παράγοντες όπως ο ιστικού τύπου ενεργοποιητής πλασμινογόνου (Tissue Plasminogen Activator, tpa), ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (Urokinase Plasminogen Activator, upa) και η θρομβίνη. Η πλασμίνη όταν βρίσκεται σε ενεργή μορφή στο αίμα αναστέλλεται από την α 2 - αντιπλασμίνη, με αποτέλεσμα την δημιουργία συμπλόκων πλασμίνηςαντιπλασμίνης (Plasmin- AntiPlasmin, PAPs). 32 Σημαντική λειτουργία της πλασμίνης είναι η ενεργοποίηση του μονοπατιού αποικοδόμησης ινώδους θρομβου (Fibrin Clot). 33 Το μονοπάτι αυτό συμβάλει στην παθολογία του ανευρύσματος κοιλιακής αορτής, στοιχείο που προκύπτει από συσχέτιση του tpa με την ασθένεια. 34,35 18

19 Όπως προαναφέρθηκε βασικό στοιχείο της παθολογίας του ανευρύσματος κοιλιακής αορτής είναι η φλεγμονή του αγγειακού τοιχώματος. Αυτή είναι αποτέλεσμα εκτεταμένης διείσδυσης κυττάρων φλεγμονής στον μέσο και έξω χιτώνα του αγγείου. 36 Σε ιστούς ανευρυσματικών τοιχωμάτων αορτής έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών και σε ασθενείς με ανεύρυσμα έχουν προσδιοριστεί υψηλά επίπεδα φλεγμονωδών κυτοκινών στην περιφερική κυκλοφορία. 37 Οι κυτοκίνες με την σειρά τους ρυθμίζουν την έκφραση μεταλλοπρωτεασών MMPs, πρωτεασών σερίνης και τις καθεψίνες και έτσι όταν οι κυτοκίνες βρεθούν στην ίδια περιοχή σε μεγάλη συγκέντρωση οδηγούν στον σχηματισμό ανευρύσματος. 38 Δεν είναι ακόμα ξεκάθαρο το αν η φλεγμονή επάγει την πρωτεόλυση στο εξωκυττάριο υλικό και με αυτόν τον τρόπο συμβάλει στην δημιουργία του ανευρύσματος Τα κυρίαρχα κύτταρα της φλεγμονής στο ανεύρυσμα είναι τα Τ λεμφοκύτταρα, συγκεκριμένα τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα τύπου 2 (T H 2). 40 Τα T H 2 εκκρίνουν κυρίως ιντερφερόνη- γ (INF-γ) και ιντερλευκίνη- 4 (IL-4). Άλλα κύτταρα που βρίσκονται στην περιοχή της φλεγμονής είναι τα CD4 βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα τύπου 1 (T H 1) και τα CD8 κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα τύπου 1 (T c 1), που παράγουν INF-γ, IL-2 και παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF). Ακόμη τα T H 2 μαζί με τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα τύπου 2 (T c 2) εκκρίνουν IL-4, IL-5, IL-10 και IL Τέλος τα υπόλοιπα κύτταρα του ανοσοποιητικού που συναντώνται στο φλεγμονώδες τοίχωμα είναι Β λεμφοκύτταρα, φυσικά φονικά κύτταρα, βασεόφιλα, μακροφάγα και ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία εκκρίνουν κυτοκίνες των T H Στην ανάπτυξη της νόσου σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι κυτοκίνες που εκκρίνονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Συγκεκριμένα ο TNF συμβάλει στην διαδικασία διάτασης της αορτής προκαλώντας κυτταρικό θάνατο των λείων μυϊκών κυττάρων και επάγοντας την απελευθέρωση των πρωτεασών που ευθύνονται για την εξασθένηση του τοιχώματος. 42 Ο TNF που εκκρίνεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα ή από T H 1 παρεμποδίζει την σύνθεση κολλαγόνου. 43 Ακόμη τα επίπεδα TNF στην κυκλοφορία σε ασθενείς που πάσχουν από ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής είναι αυξημένα σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα Η INF-γ εκκρίνεται από τα T H 1 και τα φυσικά φονικά κύτταρα και μία από τις διεργασίες που παίρνει μέρος είναι η παρεμπόδιση σύνθεσης κολλαγόνου από τα λεία μυϊκά κύτταρα του τοιχώματος της αορτής. Με αυτόν τον τρόπο συμβάλει στην ανάπτυξη ανευρύσματος. 41 Επίσης τα περιφερικά επίπεδα της INF-γ είναι αυξημένα σε άτομα που πάσχουν, όπως και τα επίπεδα TNF, στοιχείο που αποδεικνύει την συσχέτιση μεταξύ κυτοκινών και της ασθένειας. 37 Στα περισσότερα ανευρύσματα κοιλιακής αορτής υπάρχει η INF-γ που εκκρίνεται από τα CD28 - Τ λεμφοκύτταρα Μία ιδιαίτερα σημαντική κυτοκίνη για την δημιουργία 19

20 ανευρύσματος είναι ο Μετασχηματιστικός Αυξητικός Παράγοντας 1β ( Transforming Growth Factor 1β, TGF-1β). Ο TGF- 1β ελέγχει τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση και επάγει την απόπτωση σε πολλούς τύπους κυττάρων. Θεωρείται ότι πιθανά επάγει την έκκριση της κυστατίνης C από τα λεία μυϊκά κύτταρα αορτής. 30 Σε έλλειψη του TGF- 1β παρατηρείται εκτεταμένη αναδιαμόρφωση του αγγειακού τοιχώματος και σε ασθενείς ο TGF- 1β έχει μειωμένη ενεργότητα, γεγονότα που αποτελούν πιθανές αιτίες για τα χαμηλά επίπεδα κυστατίνης C στο τοίχωμα αορτής με ανεύρυσμα Στην παθολογία του ανευρύσματος της κοιλιακής αορτής συμβάλει και η απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων του μέσου χιτώνα. Κατά τον εκφυλισμό των τοιχωμάτων της αορτής παρατηρούνται λεία μυϊκά κύτταρα που διαθέτουν όλα τα χαρακτηριστικά του φυσιολογικού κυτταρικού θανάτου. Περισσότερα τέτοια κύτταρα συναντώνται σε αθηροσκληρωματικό ανεύρυσμα Έχουν προταθεί διάφοροι μηχανισμοί που προκαλούν την απόπτωση, ένας από τους οποίους είναι η τοπικά υψηλή συγκέντρωση μονοξείδιου του αζώτου (NO) και της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (Low Density Lipoprotein, LDL). 46 Τα δύο αυτά στοιχεία αυξάνουν την συγκέντρωση των p53 και p21, πρωτεΐνες που ενέχονται στον μηχανισμό της απόπτωσης. 47 Ακόμη τα λεία μυϊκά κύτταρα εισέρχονται σε απόπτωση λόγω των παραγόντων της φλεγμονής που συμβαίνει κατά το ανεύρυσμα. Κυτοκίνες όπως ο TNF-a, η INF-γ και η IL-1 έχει αποδειχτεί ότι επάγουν την απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων Αιτιολογία Ανευρύσματος Το ανεύρυσμα είναι μία πολυπαραγοντική νόσος. Οι σημαντικότεροι παράγοντες που συμβάλουν στην ανάπτυξη του διακρίνονται σε ενδογενείς περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες εκτός των δύο κατηγοριών Στα ενδογενή αίτια που οδηγούν σε ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής συγκαταλέγονται γενετικές μεταλλάξεις στα γονίδια της ελαστίνης και του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, δημιουργούνται ελαττωματικές πρωτεΐνες και έτσι υπάρχει εξασθένηση του τοιχώματος και διάταση του αγγείου. Ακόμη τα ένζυμα MMPs προκαλούν πρωτεολυτικές και φλεγμονώδεις διεργασίες αλλοιώνοντας έτσι τo εξωκυττάριο υλικό. Ένας ακόμη παράγοντας νοσηρότητας είναι η ανεπαρκής αιμάτωση της αορτής που συμβάλει σε περαιτέρω εξασθένηση του τοιχώματος, ενώ και χρόνιες λοιμώξεις είναι πιθανό να οδηγήσουν στο ίδιο αποτέλεσμα. [1] Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που έχουν συσχετιστεί με το 20

21 ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής περιλαμβάνουν την ηλικία, το φύλο και το κάπνισμα. Τα περιστατικά ανευρύσματος αυξάνουν με την ηλικία και είναι έξι φορές υψηλότερα σε άνδρες άνω των 65 ετών απ ότι σε γυναίκες. 49 Γενικά οι άνδρες εμφανίζουν ανεύρυσμα με μεγαλύτερη συχνότητα σε σχέση με τις γυναίκες. Τα ανευρύσματα στα αρσενικά άτομα έχουν συσχετιστεί με γενετική προδιάθεση και ορμονικούς παράγοντες ενώ στα θηλυκά συνήθως προϋπάρχει οικογενειακό ιστορικό της νόσου Το κάπνισμα είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες επικινδυνότητας του ανευρύσματος. Η εμφάνιση της νόσου σχετίζεται με τα χρόνια όπου ένα άτομο είναι καπνιστής και η σχέση αυτή μειώνεται μετά την παύση του καπνίσματος. 51 Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί συμβολής στην παθογένεια είναι η παρεμπόδιση της σύνθεσης κολλαγόνου, αλλαγή στην έκφραση μεταλλοπρωτεασών και η αντίδραση στο οξειδωτικό στρες Άλλοι παράγοντες που ευθύνονται για δημιουργία ανευρύσματος είναι η αθηροσκλήρωση και η στεφανιαία νόσος. 53,54 Ακόμη έχει βρεθεί μία συσχέτιση του ανευρύσματος με την υπέρταση. 51 Επίσης ένας πιθανός παράγοντας φαίνεται να είναι το οικογενειακό ιστορικό καθώς ασθενείς που πάσχουν συνήθως έχουν συγγενείς που έχουν νοσήσει από την συγκεκριμένη ασθένεια Κλινική Εικόνα Ανευρύσματος Κοιλιακής Αορτής και Διάγνωση Η πλειονότητα των ανευρυσμάτων αορτής δεν παρουσιάζουν συμπτώματα και η διάγνωση γίνεται τυχαία με απεικονιστικές μεθόδους, συγκεκριμένα με υπερηχογράφημα και αξονική ή μαγνητική τομογραφία στην κοιλιακή περιοχή. Παρ όλα αυτά υπάρχουν περιπτώσεις ασθενών που εμφανίζουν συμπτώματα κυρίως πόνο και ευαισθησία κατά την ψηλάφηση, υποδηλώνοντας κίνδυνο για ρήξη, μία ιδιαίτερα επικίνδυνη κατάσταση υπεύθυνη για αιφνίδιο θάνατο. Τα συμπτώματα προκαλούνται από την πίεση που υφίστανται παρακείμενα όργανα, περιφερικούς εμβολισμούς, θρόμβωση αορτής και ρήξη του ανευρύσματος Η πιο διαδεδομένη διαγνωστική μέθοδος είναι το υπερηχογράφημα στην κοιλιακή αορτή. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι η υψηλή ευαισθησία (95%- 100%) και ειδικότητα (~100%) σε συνδυασμό με ασφαλή εφαρμογή και χαμηλό κόστος ανά εξέταση. 56 Από την άλλη πλευρά η ακρίβεια των αποτελεσμάτων εξαρτάται άμεσα από τον ανθρώπινο παράγοντα Η αξονική τομογραφία φανερώνει περισσότερες λεπτομέρειες της κοιλιακής αορτής σε σχέση με το υπερηχογράφημα. Η τεχνική αυτή 21

22 αξιολογεί το σχήμα του ανευρύσματος προσδιορίζοντας περισσότερες ανατομικές λεπτομέρειες και έχει ευρεία εφαρμογή στην παρακολούθηση του μεγέθους του ανευρύσματος. Όμως το μεγάλο κόστος ανά εξέταση και η επαναλαμβανόμενη έκθεση σε ακτινοβολία περιορίζουν την χρήση της. 58 Επίσης διάγνωση γίνεται και με μαγνητική τομογραφία η οποία είναι πιο ακριβής μέθοδος από τις υπόλοιπες αλλά δεν προτιμάται λόγω υψηλού κόστους Θεραπεία και Διαχείριση Ασθένειας Οι ασθενείς που έχουν διαγνωσθεί με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής ακολουθούν κατάλληλες οδηγίες διαχείρισης της νόσου στις οποίες περιλαμβάνονται παρακολούθηση του ανευρύσματος με απεικονιστικές τεχνικές, φαρμακευτική θεραπεία, χειρουργική επέμβαση και ενδαγγειακή αποκατάσταση Τα μικρά και μεσαίου μεγέθους ανευρύσματα, που δεν απαιτούν εγχείρηση, διαχειρίζονται με φαρμακευτική αγωγή και συνεχή παρακολούθηση. 58 Η αγωγή που ακολουθούν οι ασθενείς περιλαμβάνει Β- Αναστολείς, διότι έχει δειχτεί πως μειώνουν σημαντικά τον ρυθμό επέκτασης του ανευρύσματος. 60 Ακόμη υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την χρήση αντιβιοτικών στον έλεγχο του ανευρύσματος, καθώς στοιχεία από μία έρευνα φανερώνουν ότι ο ετήσιος ρυθμός επέκτασης του ανευρύσματος μειώνεται σε ασθενείς που λαμβάνουν ένα αντιβιοτικό. 61 Αλλά προκειμένου τα αντιβιοτικά να χορηγούνται σε κανονική βάση απαιτούνται περισσότερα στοιχεία για την δράση τους. Τέλος η χρήση στατίνης συμβάλει στην μείωση παραγόντων επικινδυνότητας της ασθένειας και μείωση της θνητότητας ασθενών που είχαν υποβληθεί σε χειρουργική επέμβαση για την θεραπεία του ανευρύσματος Η αντιμετώπιση του ανευρύσματος κοιλιακής αορτής γίνεται κατά βάση με επεμβατικές μεθόδους, την ανοιχτή επεμβατική αποκατάσταση και την ενδαγγειακή αποκατάσταση. Η μέθοδος που πραγματοποιείται στις περισσότερες περιπτώσεις είναι η ενδαγγειακή αποκατάσταση καθώς είναι λιγότερο επεμβατική, ασφαλέστερη και φθηνότερη επιλογή από την ανοιχτή επέμβαση. Βασίζεται στην είσοδο ενός στεντ στον αυλό του αγγείου μειώνοντας έτσι την περίπτωση ρήξης. 62 Σε αντίθεση η χειρουργική επέμβαση παρουσιάζει μακροχρόνια πλεονεκτήματα επιδιόρθωσης Η πρωτεΐνη CSRP Η Cysteine and Glycine Rich Protein 2, CSRP2, είναι μια πρωτεΐνη πλούσια σε κυστεΐνη και γλυκίνη και ανήκει στην οικογένεια των 22

23 CRP πρωτεϊνών. Κωδικοποιείται από το γονίδιο csrp2 και εκφράζεται κυρίως στα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων. Διαθέτει δομικό ρόλο αλληλεπιδρώντας με πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού καθώς επίσης και ρυθμιστικό ρόλο, διότι ελέγχει την έκφραση γονιδίων στον πυρήνα. 64,65 Ακόμη εμπλέκεται στην μετανάστευση και την διαφοροποίηση των λείων μυϊκών κυττάρων Εικόνα1.6: 3D δομή της CSRP2. Διακρίνονται οι LIM περιοχές που προσδένουν ψευδάργυρο (πηγή: Τα μέλη οικογένεια των CRP (Cystein Rich Proteins) πρωτεϊνών είναι εξελικτικά συντηρημένες πρωτεΐνες με κοινά δομικά χαρακτηριστικά. Οι πρωτεΐνες αυτές διαθέτουν δύο LIM δομικές επικράτειες την μία πίσω από την άλλη. 66 Οι LIM περιοχές χαρακτηρίζονται από την συντηρημένη αλληλουχία CX2CX16 23HX2CX2CX2CX16 21CX2 3(C/H/D) στην οποία προσδένονται δύο μόρια ψευδαργύρου και δημιουργείται μία δομή που ονομάζεται δάκτυλος ψευδαργύρου (Zing Finger). (Εικόνα 1.7) 67 Η δομή αυτή στην CSRP2 ακολουθείται από μία περιοχή πλούσια σε επαναλήψεις γλυκίνης Εικόνα 1.7: LIM δομική επικράτεια. Kadrmas et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology

24 Αυτός ο σχηματισμός επιτρέπει την αρθρωτή αλληλεπίδραση πρωτεϊνών και οι πρωτεΐνες που τον φέρουν δρουν ως μεσολαβητές σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα Στην οικογένεια CRP ανήκουν τρείς πρωτεΐνες οι CRP1, CRP2 (CSRP2) και CRP Η CRP1 εκφράζεται κυρίως στους ινοβλάστες και στα λεία μυϊκά κύτταρα και ήταν η πρώτη CRP πρωτεΐνη που προσδιορίστηκε. Η CSRP2 εντοπίζεται τόσο στον κυτταροσκελετό όσο και στον πυρήνα των λείων μυϊκών κυττάρων. Και οι δύο πρωτεΐνες εντοπίζονται στις προσκολλητικές πλάκες (adhesion plaques) και στα νημάτια ακτίνης, αλληλεπιδρώντας απευθείας με την πρωτεΐνη προσκολλητικής πλάκας zyxin (adhesion plaque protein zyxin) και με την α- ακτίνη. 64 Οι δύο αυτές πρωτεΐνες διαθέτουν LIM δομική επικράτεια μέσω της οποίας γίνεται η αλληλεπίδραση με τις CRPs και είναι σημαντικοί ρυθμιστές της οργάνωσης του κυτταροσκελετού Η τελευταία πρωτεΐνη της οικογένειας CRP που προσδιορίστηκε ήταν η CRP3. Η CRP3 βρίσκεται στα μυϊκά κύτταρα της καρδίας και των σκελετικών μυών. Βασικός της ρόλος είναι η αλληλεπίδραση με τον μεταγραφικό παράγοντα MyoD ο οποίος πυροδοτεί την μυογένεση Η γονιδιακή έκφραση της CSRP2 ρυθμίζεται από τον TGFβ. Ο TGFβ είναι ένας βασικός ρυθμιστής της μεταγραφής στο αγγειακό τοίχωμα και δρα κατά τα πρώτα στάδια απόκρισης σε αγγειακό τραύμα. Η απουσία της CSRP2 ενισχύει την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων και την δημιουργία νέου χιτώνα κατά την επούλωση του τοιχώματος που έπεται του τραυματισμου του αγγείου από την ασθένεια Έχει δειχτεί ότι ο TGFβ επάγει την μεταγραφή mrna και συνεπώς την πρωτεϊνική έκφραση της CSRP2. 71 Η επαγωγή της μεταγραφής της CSRP2 από τον TGFβ γίνεται μέσω ενός CRE στοιχείου του υποκινητή. Το στοιχείο αυτό βρίσκεται στην περιοχή -480 έως -438 bp ανοδικά του γονιδίου csrp2 και είναι η περιοχή αλληλεπίδρασης με τον TGFβ. Έτσι ενεργοποιείται ο υποκινητής και ξεκινά η μεταγραφή στα λεία μυϊκά κύτταρα Μία από τις βασικές λειτουργίες της CSRP2, όπως αναφέρθηκε είναι η παρεμπόδιση της μετανάστευσης των λείων μυϊκών κυττάρων που συμβαίνει κυρίως κατά τον αγγειακό τραυματισμό. Ο ρόλος αυτός έχει μελετηθεί στην αθηροσκλήρωση. Η παρεμπόδιση γίνεται μέσω αλληλεπιδράσεων της CSRP2 με την p130cas. Το σηματοδοτικό μονοπάτι της p130cas οδηγεί στην ενεργοποίηση της Rac1, μιας Rho GTPase που ξεκινά τις κυτταρικές διαδικασίες που είναι απαραίτητες για την δημιουργία 24

25 λαμελιποδίων ώστε τα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων να μεταναστεύσουν. Η CSRP2 δρα απομονώνοντας την p130cas στις προσκολλητικές πλάκες (adhesion plaques) και έτσι αποτρέπει την κυτταρική μετανάστευση Ακόμη η CSRP2 συμβάλει στην κυτταρική διαφοροποίηση των λείων μυϊκών κυττάρων των αγγείων αλληλεπιδρώντας με μεταγραφικούς παράγοντες στον πυρήνα. Συγκεκριμένα επάγει την μεταγραφή των γονιδίων SMaA, SM22a και SM γ-actin δημιουργώντας σύμπλοκα με μεταγραφικούς παράγοντες. Τα παραπάνω γονίδια εκφράζουν πρωτεΐνες σχετικές με τον κυτταροσκελετό, συγκεκριμένα την ακτίνη-α2, την πρωτεΐνη που προσδένει ακτίνη TAGLN και την γ-ακτινη. Η CSRP2 αλληλεπιδρά με τις LIM δομικές επικράτειες των μεταγραφικών παραγόντων GATA. Στην συνέχεια ο μεταγραφικός παράγοντας ενεργοποιεί τους υποκινητές μέσω SMA στοιχείων και το αποτέλεσμα είναι η έναρξη της μεταγραφής των γονιδίων Σκοπός της Διπλωματικής Εργασίας Η CSRP2 πρωτεΐνη εκφράζεται κυρίως στα λεία μυϊκά κύτταρα αορτής όπως προαναφέρθηκε. Από συνεργαζόμενο ερευνητικό γκρουπ υπάρχουν ενδείξεις ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται και στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό σε πειραματικά μοντέλα ποντικών αγγειακού τραύματος (αδημοσίευτα αποτελέσματα). Ο περιαγγειακός λιπώδης ιστός (Perivascular Adipose Tissue, PVAT) φαίνεται να έχει ενεργή δράση σε διαδικασίες τραυματισμού των αγγείων. Έτσι πρωτεΐνες που εκφράζονται σε αυτόν θα ήταν σκόπιμο να διερευνηθούν περαιτέρω Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της έκφρασης της CSRP2 πρωτεΐνης στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό ασθενών με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής, σε σύγκριση με αυτή του υποδόριου (Subcutaneous Adipose Tissue, SUB) και σπλαγχνικού λιπώδους ιστού (Visceral Adipose Tissue, VAT) έτσι ώστε να διερευνηθεί η ενεργότητα του ιστού αυτού στην επούλωση του αγγείου. Ο σπλαχνικός και ο υποδόριος λιπώδης ιστός επιλέχτηκαν για τα παρακάτω πειράματα διότι θεωρούνται λιγότερο ενεργοί σηματοδοτικά λιπώδεις ιστοί. Ακόμη πρέπει να διερευνηθεί η πιθανή δράση και ο ρόλος της πρωτεΐνης στο ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής καθώς δεν υπάρχουν αρκετές πληροφορίες για αυτήν στην βιβλιογραφία

26 Υλικά και Μέθοδοι 26

27 Βιολογικό Υλικό Συλλογή δειγμάτων Λιπώδους Ιστού Τα δείγματα λιπώδους ιστού συλλέχθηκαν κατά την διάρκεια χειρουργικής επέμβασης ασθενών με Ανεύρυσμα Κοιλιακής Αορτής. Η συλλογή αφορά τρείς τύπους λιπώδους ιστού, τον Περιαγγειακό Λιπώδη Ιστό (Perivascular Adipose Tissue, PVAT), τον Σπλαχνικό Λιπώδη Ιστό (Visceral Adipose Tissue, VAT) και τον Υποδόριο Λιπώδη Ιστό (Subcutaneous Adipose Tissue, SUB) από κάθε ασθενή Η συλλογή έγινε κατόπιν συγκατάθεσης των ασθενών και τα δεδομένα τους προστατεύονται μέσω κωδικοποίησης των δειγμάτων Στo πείραμα ELISA ομογενοποιήθηκαν και αναλύθηκαν δείγματα PVAT, VAT και SUB για 10 ασθενείς Ανοσοαποτύπωση με Western Blot έγινε σε SVF κλάσμα που απομονώθηκε από PVAT και SUB για 1 ασθενή Απομόνωση RNA, σύνθεση cdna και με real- time PCR πραγματοποιήθηκε για PVAT και VAT ιστούς από 11 ασθενείς Έγινε BCA Protein Assay για τα δείγματα της ELISA και του western blot Υλικά και Διαλύματα Για την επεξεργασία των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω υλικά: Τρυβλίο, Λαβίδα, Νυστέρι, Πιπέτες ακριβείας, 3-1Χ PBS (Phosphate Buffered Saline, 10mM PO 4 και 150mM NaCl ph=7.4), διάλυμα Trizol (TriΖol Reagent ), microtubes 1.5 ml Πειραματική Διαδικασία 27

28 Αρχικά έγινε πλύση του ιστού με 1Χ PBS και υπολογίστηκε το βάρος του. Στη συνέχεια το δείγμα καθαρίστηκε από τυχόν καυτηριασμούς και τον συνδετικό ιστό που τον περιβάλλει. Τέλος ο ιστός κόπηκε σε τρία τμήματα και αποθηκεύτηκε σε βαθιά κατάψυξη (-80 ο C) μέχρι να χρησιμοποιηθεί στα πειράματα Κυτταροκαλλιέργεια ανθρωπίνων λείων μυϊκών κυττάρων αορτής (Aortic Smooth Muscle Cells, AoSMCs) Αρχή της Μεθόδου Στα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω έχουν χρησιμοποιηθεί ανθρώπινα λεία μυϊκά κύτταρα αορτής, ως θετικός μάρτυρας στα πειράματα ELISA και Western Blot. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο έτσι ώστε να βρίσκονται σε επαρκή αριθμό και σε κατάλληλες συνθήκες για την διεκπεραίωση των πειραμάτων Υλικά και Διαλύματα Για την διατήρηση της κυτταροκαλλιέργειας Primary Aortic Smooth Muscles Cells, Normal, Human (ATCC PCS ) ήταν απαραίτητος ο παρακάτω εργαστηριακός εξοπλισμός: απαγωγός εστία διαρροής class II, μικροσκόπιο, τρυβλία, πιπέτες ακριβείας 200 και 1000 μl, γυάλινες πιπέτες 5, 10 και 25 ml, ρύγχη πιπετων, πιπεταδόρος, θρεπτικό μέσο: Vascular Cell Basal Medium (ATCC PCS ) το οποίο παρασκευάστηκε αναμιγνύοντας τα επιμέρους υλικά του κιτ: Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit (ATCC PCS ) και περιείχε: - Recombinant Human FGF-basic 5 ng/ml - Recombinant Human Insulin 5 μg/ml - Recombinant Human EGF 5 ng/ml - Ascorbic Acid 50 μg/ml - L-Glutamine 10 mm - Fetal Bovine Serum (FBS) 5% 28

29 - Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη-Αμφοτερισίνη Β (10 Units/ml-10 μg/ml- 25 ng/ml) Επιπλέον, για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιήθηκαν: διάλυμα θρυψίνης- EDTA (0.05%- 0.02%, ATCC PCS ), διάλυμα PBS 1X, HyClone Trypan Blue Solution 0.4% (Thermo Scientific), πλάκα Neubauer Πειραματική Διαδικασία Τα κύτταρα βρίσκονταν σε μορφή ιζήματος αποθηκευμένα σε βαθιά κατάψυξη (-80 o C) Η ανάπτυξη των κυττάρων έγινε σε επωαστήρα στους 37 o C. Προκειμένου τα κύτταρα να χρησιμοποιηθούν στα πειράματα είχαν ανακαλλιεργηθεί 8 φορές έως ότου η καλλιέργεια είχε φτάσει σε πλατό. Από μέτρηση των κυττάρων προέκυψε ότι χρησιμοποιήθηκαν 3*10 6 κύτταρα σε 2 ml. Μετά από συλλογή των κυττάρων και φυγοκέντρηση (200g, 25 o C, 5 λεπτά) προέκυψε ίζημα κυττάρων το οποίο αποθηκεύτηκε σε βαθιά κατάψυξη (-80 o C) μέχρι να χρησιμοποιηθεί Oμογενοποίηση ιστού (λιπώδους και κυττάρων AoSMCs) για απομόνωση πρωτεϊνών Αρχή μεθόδου Απαραίτητη για την απομόνωση πρωτεϊνών από τα κύτταρα του λιπώδους ιστού ήταν η διάσπασή τους. Αυτή επετεύχθη μηχανικά με : - χρήση ομογενοποιητή (κατακερματισμός ιστού), - χρήση υποτονικού διαλύματος κατά την ομογενοποίηση (τα κύτταρα διαρρηγνύονται λόγω όσμωσης) - πραγματοποίηση κύκλων ψύξης/απόψυξης σε υγρό άζωτο. Κατά την διαδικασία αυτή, η απότομη ψύξη κρυσταλλοποιεί το εσωτερικό των κυττάρων με αποτέλεσμα την ρήξη της μεμβράνης τους. - με χρήση ηχητικών κυμάτων υψηλής συχνότητας (sonication) Για τα κύτταρα AoSMCs, αφού επαναιωρήθηκαν σε υποτονικό διάλυμα πραγματοποιήθηκαν μόνο κύκλοι ψύξης/απόψυξης και επώαση με ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας. 29

30 Υλικά και Διαλύματα Χρησιμοποιήθηκε ο παρακάτω εργαστηριακός εξοπλισμός: γυάλινο τρυβλίο, νυστέρι, λαβίδα, ομογενοποιητής (MICCRA D1), σωληνάρια 2ml τύπου Εppendorf, φυγόκεντρος, υγρό άζωτο, 10Χ (Phosphate Buffered Solution, PBS): NaF Na3VO4 PMSF EDTA aprotinin leupeptin pepstatin Επίσης, παρασκευάστηκε το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Lysis Buffer), PBS 1X - 20 mm NaF - 1 mm Na 3 VO 4-1 mm PMSF - 5 mm EDTA mg/ml Aprotinin mg/ml Leupeptin mg/ml Pepstatin - ddh 2 O 2.2.3Πειραματική Διαδικασία Αρχικά ο λιπώδης ιστός ομογενοποιήθηκε σε όγκο Lysis Buffer διπλάσιο από την μάζα του. Έπειτα έγιναν τρείς κύκλοι ψύξης/απόψυξης σε υγρό άζωτο και έγινε επιπλέον διάσπαση των κυττάρων με ηχητικά κύματα για 10 λεπτά. Τέλος έγινε φυγοκέντρηση των ομογενοποιημάτων στα 1500g, 15 λεπτά,4 ο C. Μετά την φυγοκέντρηση έγινε συλλογή της μεσαίας φάσης, στην οποία περιέχονταν οι πρωτεΐνες. 30

31 Το ίζημα των AoSMCs επαναιωρήθηκε σε 1ml Lysis Buffer και ακολούθησαν τρείς κύκλοι ψύξης/ απόψυξης σε υγρό άζωτο. Τέλος, έγινε φυγοκέντρηση στα 1000g, 15 λεπτά, 4 ο C. Μετά την φυγοκέντρηση συλλέχθηκε το υπερκείμενο που περιείχε όλες τις πρωτεΐνες Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ο C Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών με τη μέθοδο BCA Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της συνολικής πρωτεΐνης ήταν απαραίτητος για την διεξαγωγή των πειραμάτων ELISΑ και Western Blot, όπου από κάθε δείγμα πρέπει να χρησιμοποιηθεί ίδια συγκέντρωση συνολικής πρωτεΐνης προκειμένου να είναι εφικτή η σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε με το kit Pierce BCA Protein Assay kit Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος BCA αποτελεί μια φασματοφωτομετρική μέθοδο, η οποία βασίζεται στην αντίδραση διουρίας. Οι πρωτεΐνες (συγκεκριμένα οι πεπτιδικοί τους δεσμοί και τα αμινοξέα κυστεϊνη, κυστίνη, τρυπτοφάνη και τυροσίνη) ανάγουν το δισθενή χαλκό (παρέχεται από το αντιδραστήριο) σε μονοσθενή (Εικόνα 2.1Α). Ο μονοσθενής χαλκός στη συνέχεια σχηματίζει χηλική ένωση με δύο μόρια BCA (παρέχεται από το αντιδραστήριο) (Εικόνα 2.1Β). Το υδατοδιαλυτό αυτό σύμπλοκο απορροφά στα 562 nm και προσδίδει χαρακτηριστικό μωβ χρώμα στο διάλυμα Εικόνα2.1: Επιμέρους αντιδράσεις που πραγματοποιούνται κατά τη δοκιμή BCA. (πηγή: Πρότυπη καμπύλη Για τον προσδιορισμό των αγνώστων συγκεντρώσεων πρωτεΐνης των δειγμάτων ήταν απαραίτητη η κατασκευή μιας πρότυπης 31

32 καμπύλης, η οποία συσχέτιζε γνωστές συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης BSA (Bovine Serum Albumin) με την οπτική πυκνότητα. Αυτές οι συγκεντρώσεις προέκυψαν από διαδοχικές αραιώσεις διαλύματος BSA 2 mg/ml με 1Χ PBS Υλικά και Διαλύματα Για τον προσδιορισμό συνολικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε το Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Scientific), το οποίο περιείχε: BCA Reagent A 500ml, (Na 2 CO 3, NaHCO 3, BCA και C 4 NaHO 4 σε 0.1Μ NaOH). BCA Reagent Β 25ml, (4% CuSO 4 ) Αμπούλες Αλβουμίνης Ορού Βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) συγκέντρωσης 2mg/ml, σε 0.9% φυσιολογικού ορού και 0.05% αζίδιο του Νατρίου Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε ο παρακάτω εξοπλισμός: Microplate Σωληνάρια τύπου eppendorf 1.5ml PBS 1X Lysis Buffer Επωαστήρας στους 37 o C ddh 2 O Microplate reader Πειραματική Διαδικασία Αρχικά παρασκευάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα BSA σε τελικό όγκο 10μl, εις διπλούν. Αυτό επετεύχθη με επτά διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού διαλύματος BSA (2mg/ml) με 1Χ PBS (εύρoς συγκεντρώσεων 0, έως 2 mg/ml). Έπειτα, τα δείγματα πρωτεΐνης του λιπώδους ιστού αραιώθηκαν 3 φορές με 1Χ PBS, ενώ των AoSMCs 6 φορές 1Χ PBS, προκειμένου να είναι οι συγκεντρώσεις εντός του παραπάνω εύρους. Έτσι, 10μl κάθε αραιωμένου δείγματος προστέθηκαν στο microplate, εις διπλούν. Παρασκευάστηκε το αντιδραστήριο BCA (50:1, Α:Β) σύμφωνα με τις οδηγίες προστέθηκαν 200μl αυτού σε κάθε δείγμα και επωάστηκαν για 30 λεπτά, στους 37 ο C. Με το πέρας της επώασης, μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στο μήκος κύματος 562nm. 32

33 2.4 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης CSRP-2 με τη μέθοδο ELISA H ποσότητα της πρωτεΐνης CSRP2 των δειγμάτων προσδιορίστηκε με την μέθοδο ELISA χρησιμοποιώντας το CSRP2 ELISA kit (MyBioSource) Αρχή της Μεθόδου Οι πάτοι των βοθρίων του microplate (παρέχεται από το kit) καλύπτονται από πολυκλωνικά αντισώματα (anti-csrp2) ειδικά έναντι της CSRP2. Μέσα σε αυτά τοποθετείται ποσότητα των αγνώστων δείγματων μαζί με ποσότητα ενζυμικού συμπλόκου CSRP2-HRP (Horse Radish Peroxidase). Το σύμπλοκο συναγωνίζεται την CSRP2 των δειγμάτων για τις μεταβλητές περιοχές των πολυκλωνικών αντισωμάτων (συναγωνιστική ELISA). Όσο περισσότερη πρωτεΐνη υπάρχει στο δείγμα τόσο λιγότερο σύμπλοκο προσδένεται στα anti-csrp2. Στη συνέχεια, προστίθεται υπόστρωμα ειδικό για την υπομονάδα HRP του συμπλόκου, με την οποία και αντιδρά, παράγοντας το χαρακτηριστικό μπλε χρώμα. Τέλος, προστίθεται ειδικό διάλυμα τερματισμού της αντίδρασης μετατρέποντας το μπλε χρώμα σε κίτρινο και η οπτική πυκνότητα μετράται σε μήκος κύματος 450 nm. Συνεπώς, όσο χαμηλότερη είναι η οπτική πυκνότητα που προκύπτει από την μέτρηση, τόσο μικρότερη είναι η συγκέντρωση του συμπλόκου που προσδέθηκε, άρα τόσο μεγαλύτερη η συγκέντρωση της πρωτεΐνης CSRP2 στο δείγμα (Εικόνα 2.2) Όπως και στην BCA, η ποσοτικοποιήση βασίστηκε στην κατασκευή μιας πρότυπης καμπύλης. Η πρότυπη καμπύλη κατασκευάστηκε με πρότυπα διαλύματα γνωστών συγκεντρώσεων (παρεχόμενα από το κιτ). Όπως προβλέπεται για μια συναγωνιστική ELISA, η οπτική πυκνότητα είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της CSRP2 (Εικόνα 2.2)

34 Εικόνα 2.2: Σχηματική απεικόνιση της συναγωνιστικής ELISA. (πηγή: uo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html) Υλικά Χρησιμοποιήθηκε το CSRP2 Elisa Kit της MyBioSource, το οποίο περιείχε: Microtiter Plate με 96 βοθρία Ενζυμικό σύμπλοκο (CSRP2-HRP) πρότυπα διαλύματα CSRP-2 με εύρος συγκεντρώσεων από 0 ng/ml 25 ng/ml Υπόστρωμα Α Υπόστρωμα Β Διάλυμα τερματισμού αντίδρασης Διάλυμα πλύσεων (100X) Διάλυμα εξισορρόπησης Επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν: PBS 10X, σωληνάρια 1,5 ml τύπου Eppendorf, Lysis Buffer ddh 2 O, οκτακάναλη πιπέτα, Επωαστήρας στους 37 ο C, Microplate reader Πειραματική Διαδικασία Aρχικά, στο microtiter plate, προστέθηκαν 100 μl από κάθε πρότυπο διάλυμα εις διπλούν. Για κάθε δείγμα (ομογενοποιημένου λιπώδους ιστού ή ομογενοποιημένων κυττάρων AoSMCs), προστέθηκαν 100 μg συνολικής πρωτεΐνης σε τελικό όγκο 100μl ανά βοθρίο και εις διπλούν. Ως τυφλό χρησιμοποιήθηκαν 100μl PBS. Σε όλα τα βοθρία προστέθηκαν 10μl διαλύματος εξισορρόπησης. Σε όλα τα βοθρία, εκτός του μάρτυρα, προστέθηκαν 50μl του ενζυμικού συμπλόκου CSRP2-HRP. Ακολούθησε καλή ανάδευση και επώαση για 1 ώρα, στους 37 ο C. Το microplate ξεπλύθηκε πέντε φορές με 200μl διαλύματος πλύσης. Με οκτακάναλη πιπέτα, προστέθηκαν 50μl υποστρώματος Α και 50μl υποστρώματος Β σε όλα τα βοθρία. Το microplate επωάστηκε για 15 λεπτά στους 37 ο C και αμέσως μετά προστέθηκαν 50μl διάλυμα τερματισμού. Ακολούθησε καλή ανάδευση και 34

35 πραγματοποιήθηκε μέτρηση της οπτικής πυκνότητας σε μήκος κύματος 450 nm Ομογενοποίηση λιπώδους ιστού για απομόνωση SVF κυτταρικού κλάσματος Stromal Vascular Fraction (SVF) και λύση Αρχή μεθόδου Από δείγματα περιαγγειακού λιπώδους ιστού (PVAT) και υποδόριου λιπώδους ιστού (SUB) απομονώθηκε το κυτταρικό κλάσμα SVF (Stromal Vascular Fraction), το οποίο περιέχει προλιποκύτταρα, μεσενχυματικά βλαστοκύτταρα, προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα, Τ λεμφοκύτταρα, Β λεμφοκύτταρα, μαστοκύτταρα και μακροφάγα. Η απομόνωση βασίζεται στη διάσπαση του λιπώδους ιστού με κολλαγενάση Ι. Τα δείγματα αυτά θα χρησιμοποιηθούν για πείραμα western blot που αφορά τον εντοπισμό της CSRP Υλικά και Διαλύματα Χρησιμοποιήθηκε ο παρακάτω εργαστηριακός εξοπλισμός: Τρυβλίο Λαβίδα Ξυράφι Διηθητικό χαρτί Σωληνάρια τύπου Falcon Πιπέτα 1000μl Φίλτρο διαχωρισμού κυττάρων μεγέθους 70μm (FALCON) Σωληνάρια τύπου eppendorf PBS-Triton 0.33% Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω διαλύματα: PBS Μείγμα κολλαγενάσης Buffer κολλαγενάσης (1% BSA σε PBS) Διάλυμα Κολλαγενάσης I Διάλυμα λύσης RIPA με τις παρακάτω συγκεντρώσεις - RIPA 2X ph=7.4 35

36 - 100mM Tris - 300mM NaCl - 2% NP % SDS - 1% DOC - ddh 2 O Διάλυμα λύσης RIPA με αναστολείς - RIPA 1X - 20mM NaF - 1 mm Na3VO4-1 mm PMSF - 5 mm EDTA mg/ml Aprotinin mg/ml Leupeptin mg/ml Pepstatin - ddh2o Πειραματική Διαδικασία Αρχικά ο φρέσκος λιπώδης ιστός τοποθετήθηκε σε τρυβλίο που περιείχε buffer κολλαγενάσης και με τη χρήση ξυραφιού τεμαχίστηκε σε μικρότερα τμήματα. Ο ομογενοποίημα μεταφέρθηκε σε ένα σωληνάριο τύπου Falcon 15ml που περιείχε διαλύματος κολλαγενάσης I. Ακολούθησε επώαση για 60 λεπτά υπό ανάδευση στους 37 o C, προκειμένου να γίνει ενζυματική διάσπαση του ιστού. Με το πέρας της επώασης, πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός των κυττάρων του ιστού με φίλτρο διαχωρισμού (cell strainer, FALCON) μεγέθους 70 μm. Το φίλτρο τοποθετήθηκε σε falcon 50ml και ο ομογενοποιημένος ιστός πέρασε από αυτό. Η διαδικασία επαναλήφθηκε άλλες δύο φορές και πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση στα 500g, 4 o C, για 5 λεπτά. Το ίζημα που περιείχε το κλάσμα SVF επαναιωρήθηκε 100μl διαλύματος RIPA ενώ τα ΑoSMCs σε 250μl διαλύματος PBS-Triton 0.33%. Στην συνέχεια ακολούθησε επώαση στον πάγο (4 o C) για 60 λεπτά και φυγοκέντρηση στα g για 20 λεπτά στους 4 o C. Τέλος συλλέχθηκε το υπερκείμενο που περιείχε τις πρωτεΐνες που προέρχονται από προλιποκύτταρα, μεσενχυματικά βλαστοκύτταρα, προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα, Τ λεμφοκύτταρα, Β λεμφοκύτταρα, μαστοκύτταρα και μακροφάγα του SVF κλάσματος Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης με SDS (SDS-PAGE) και ανάλυση Western Blot

37 2.6.1 Αρχή μεθόδου Αρχικά αποδιατάχθηκαν οι πρωτεΐνες των δειγμάτων και ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης με SDS. Το SDS περιβάλλει τις πρωτεΐνες και προσδίδει σε αυτές αρνητικό φορτίο προκειμένου να διαχωριστούν στο πήκτωμα με βάση το μοριακό τους βάρος. Έπειτα έγινε μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και επωάσεις με τα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα Πρόκειται για μία τεχνική ημιποσοτικοποίησης πρωτεϊνών κατά την οποία η πρωτεΐνη ενδιαφέροντος αναγνωρίζεται ειδικά από ένα πρωτογενές αντίσωμα. Στην συνέχεια ένα δευτερογενές αντίσωμα αναγνωρίζει το πρώτο. Το δευτερογενές αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (HRP), η οποία μετατρέπει το κατάλληλο υπόστρωμα παρουσία H 2 O 2 σε φώς που ανιχνεύεται Για να ποσοτικοποιηθεί μία πρωτεΐνη με την τεχνική western blot είναι αναγκαίος ο προσδιορισμός μιας πρωτεΐνης που εκφράζεται ιδιοστατικά στο κύτταρο. Στο συγκεκριμένο πείραμα η ποσοτικοποίηση της CSRP2 βασίστηκε στον προσδιορισμό της GAPDH, μιας πρωτεΐνης που εκφράζεται ιδιοστατικά στα δείγματα PVAT, SUB και AoSMCs, διότι είναι ένζυμο της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης Υλικά και Διαλύματα Προετοιμασία δειγμάτων Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω υλικά: Σωληνάρια τύπου eppendorf Πιπέτα Loading Buffer - 5% Μερκαπτοαιθανόλη - 1Χ Sample Buffer - BBP χρωστική Ηλεκτροφόρηση Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω υλικά: Separating Gel 12% w/v - ddh2o - 4X Separating Buffer - 40% Ακρυλαμίδη - 10% SDS - TEMED - APS

38 Stacking Gel 4% w/v - ddh2o - 4X Stacking Buffer - 40% Ακρυλαμίδη - 10% SDS - TEMED - APS Σε κατάλληλη διάταξη πρώτα εισάγεται το Separating Gel, ο πολυμερισμός του οποίου διαρκεί ~30 λεπτά. Στη συνέχεια, εισάγεται το Stacking Gel, το οποίο πολυμερίζεται για ~20 λεπτά Running Buffer 1X - ddh2o mm Tris Base mm Glycine - 0.1% SDS Μεταφορά Πρωτεϊνών σε Μεμβράνη Νιτροκυτταρίνης Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω υλικά: Μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (MACHEREY NAGEL) Transfer Buffer 1X - 25 mm Tris Base - 20% Methanol mm Glycine TBS Buffer 10Χ - 200mM Tris Base - 9% NaCl - ddh2o TBS-T Buffer - Αραίωση 1:10 του TBS 10X και προσθήκη tween 20 για τελική συγκέντρωση 0.1% Ανίχνευση CSRP2 και GAPDH Blocking Buffer 5% καζεΐνη σε TBS-T Anti-CSRP2 πολυκλωνικό αντίσωμα που έχει παρασκευαστεί σε αίγα. (Novus Biological) Anti-GAPDH μονοκλωνικό αντίσωμα που έχε αναπτυχθεί σε ποντικό. (Tech Notes) Anti-Goat IgG- HRP που αναπτύχθηκε σε Ποντικό (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIES) 38

39 Αnti-Mouse IgG-HRP που αναπτύχθηκε σε Booειδές (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIES) Luminol Reagents (IMMUNOCRUZ) Διάλυμα 1-0.1% Luminol % Cumaric Acid - 1% Tris-HCl - ddh2o Διάλυμα % H 2 O 2-1% Tris-HCl - ddh 2 O Πειραματική Διαδικασία Προετοιμασία δειγμάτων Προκειμένου να είναι εφικτή η σύγκριση των αποτελεσμάτων έπρεπε να χρησιμοποιηθούν δείγματα με ίση συγκέντρωση συνολικής πρωτεΐνης. Έτσι το πρώτο βήμα ήταν ο υπολογισμός της συγκέντρωσης συνολικής πρωτεΐνης των δειγμάτων με τη μέθοδο BCA Από κάθε δείγμα λήφθηκε κατάλληλη ποσότητα ώστε να περιέχει 18.6 μg συνολικής πρωτεΐνης. Σε αυτήν προστέθηκε ποσότητα Loading Buffer μέχρι τελικό όγκο 28μl. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 100 o C για 5 λεπτά, προκειμένου να αποδιαταχθούν οι πρωτεΐνες που περιέχουν Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα Πολυακρυλαμίδης 12% w/v με SDS Στην συνέχεια ακολούθησε ηλεκτροφόρηση στα 180V για ~45 λεπτά Μεταφορά Πρωτεϊνών σε Μεμβράνη Νιτροκυτταρίνης Οι πρωτεΐνες των δειγμάτων που διαχωριστήκαν με ηλεκτροφόρηση μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεταφορά πραγματοποιήθηκε σε κατάλληλη διάταξη μέσα σε Transfer Buffer και πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση για 150 λεπτά σε 0.30A

40 Ανίχνευση CSRP2 και GAPDH με ειδικό αντίσωμα Μετά τη μεταφορά των πρωτεϊνών στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η μεμβράνη επωάστηκε σε blocking buffer για 60 λεπτά στους 25 o C υπό ανάδευση. Το βήμα αυτό ήταν ιδιαίτερα σημαντικό για την ειδική αναγνώριση της CSRP2 από το αντίσωμα αφού ήταν απαραίτητο να καλυφτούν οι μη ειδικές θέσεις της μεμβράνης από την καζεΐνη Με το πέρας της επώασης, η μεμβράνη επωάστηκε εκ νέου σε blocking buffer που περιείχε το πρωτογενές αντίσωμα έναντι της CSRP2 (anti-csrp2) σε συγκέντρωση 1:1000, ολονυκτί υπό ανάδευση στους 4 o C. Ακολούθησαν πλύσεις με TBS-T και επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα anti-goat σε συγκέντρωση 1:3000 σε blocking buffer για 60 λεπτά υπό ανάδευση στους 25 o C. Μετά την επώαση ακολούθησαν πλύσεις με TBS-T, επώαση για 1 λεπτό με μίγμα διαλυμάτων 1 και 2 του Luminol Reagent και εμφανίστηκε στο Chemidoc (BIORAD). Η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε για την πρωτεΐνη μάρτυρα GAPDH Ομογενοποίηση λιπώδους ιστού για απομόνωση RNA Αρχή μεθόδου Η διαδικασία ομογενοποίησης του λιπώδους ιστού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ομογενοποιητή και σε διάλυμα Trizol όγκου 1ml. Το εκχύλισμα που προκύπτει περιέχει τα νουκλεϊκά οξέα του ιστού και το Trizol προστατεύει το RNA από την δράση RNAσών Υλικά και Διαλύματα Χρησιμοποιήθηκε ο παρακάτω εργαστηριακός εξοπλισμός: Τρυβλίο, Νυστέρι, Λαβίδα, διάλυμα Trizol, Ομογενοποιητής, Φυγόκεντρος, Σωληνάρια 2ml τύπου Eppendorf 40

41 ddh 2 O Πειραματική Διαδικασία Αρχικά, ο λιπώδης ιστός ομογενοποιήθηκε σε 1ml trizol. Έπειτα, τα ομογενοποίηματα φυγοκεντρήθηκαν στα g, για 10 λεπτά και στους 4 ο C. Μετά την φυγοκέντρηση έγινε συλλογή της μεσαίας φάσης, η οποία περιείχε τα νουκλεϊκά οξέα Απομόνωση RNA Αρχή Μεθόδου Πρόκειται για απομόνωση ολικού RNA από λιπώδη ιστό, PVAT και VISC από ασθενείς με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής (ΑΑΑ) Υλικά και Διαλύματα Χρησιμοποιήθηκαν δύο kit το TRIzol Reagent και το NucleoSpin RNA set Για το TRIzol Reagent χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω υλικά: Χλωροφόρμιο 70% Αιθανόλη σωληνάρια τύπου Eppendorf Φυγόκεντρος Για το NucleoSpin RNA set χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω: NucleoSpin Filter 70% Αιθανόλη Membrane Desalting Buffer rdnase Reaction Mixture Buffer RAW2 Buffer RA3 Collection tubes Πειραματική Διαδικασία 41

42 Τα ομογενοποιήματα επωάστηκαν για 5 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου και σε αυτά προστέθηκαν 200λ Χλωροφορμίου. Έπειτα από έντονη ανάδευση και επώαση για 2-3 λεπτά τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 12000g, 15 λεπτά, 4 ο C. Με το πέρας της φυγοκέντρησης συλλέχθηκε το υπερκείμενο και προστέθηκε σε αυτό 1ml 70% αιθανόλης Στη συνέχεια ακολούθησε περεταίρω καθαρισμός του RNA με NucleoSpin RNA Set. Τα δείγματα πέρασαν από τη στήλη NucleoSpin Filter το οποίο συγκρατεί το RNA. Έπειτα πραγματοποιήθηκαν οι κατάλληλες πλύσεις με τα διαλύματα του kit και οι απαραίτητες φυγοκεντρήσεις. Τέλος, το RNA κατακρημνίστηκε με MN H 2 O Σύνθεση cdna (Αντίστροφη Μεταγραφή) Αρχή μεθόδου Συντέθηκε cdna από το ολικό RNA που απομονώθηκε. Χρησιμοποιήθηκαν oligo-dt εκκινητές που υβριδοποιούν τις poly-a ουρές των mrna ενός μείγματος συνολικού RNA. Την σύνθεση καταλύει το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, που συνθέτει DNA με μήτρα RNA. Το cdna χρησιμοποιήθηκε για την διεξαγωγή real-time PCR Υλικά και Διαλύματα Χρησιμοποιήθηκε το kit PrimeScript III Reverse Transcriptase (INVITROGEN), το οποίο περιείχε τα παρακάτω αντιδραστήρια: 200 u/μl PrimeScript III αντίστροφη μεταγραφάση (INVITROGEN) 5X First-Strand Buffer 250 mm Tris-HCl 375 mm KCl 15 mm MgCl Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν: Oligo-dT primers50 μm dntps10 μm αναστολείς RNAse 40 u/μl MN H2O Πιπέτα ακριβείας 10μl RNAse free σωληνάρια τύπου Εppendorf 42

43 Πειραματική Διαδικασία Οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων σε ng/ml προσδιορίστηκαν μέσω του Nanodrop. Σύμφωνα με αυτές, υπολογίσθηκαν και οι κατάλληλες ποσότητες ώστε η σε κάθε αντίδραση να περιέχονται 300 ng RNA Για κάθε αντίδραση τελικού όγκου 20μl, οι τελικές συγκεντρώσεις των επιμέρους συστατικών ήταν: ng RNA - Oligo(dT) 2.5μM - dntp Mix0.5mM - RNase Inhibitor 20 Units - Primescript Enzyme 200 Units πραγματοποίηθηκε σε 20 μl τελικό όγκο. Οι τελικές συγκεντρώσεις των επιμέρους συστατικών ήταν: Τέλος, όλες οι αντιδράσεις τοποθετήθηκαν στο θερμοκυκλοποιητή και επωάστηκαν σύμφωνα με το παρακάτω πρόγραμμα: ος κύκλος αντιδράσεων 65 o C, 5 λεπτά ος κύκλος αντιδράσεων 4 ο C, 2 λεπτά ος κύκλος αντιδράσεων 25 ο C, 5 λεπτά ος κύκλος αντιδράσεων 50 ο C, 50 λεπτά ος κύκλος αντιδράσεων 70 ο C, 15 λεπτά ος κύκλος αντιδράσεων 8 ο C, 4 λεπτά Από κάθε δείγμα παρήχθησαν 300 ng συνολικού cdna Real- time PCR Αρχή της μεθόδου Με την μέθοδο της real- time PCR γίνεται σχετική ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης των δειγμάτων. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την in vitro σύνθεση τμημάτων DNA από την DNA πολυμεράση με την χρήση DNA η cdna μήτρας και ειδικών αλληλουχιών των εκκινητών, που υβριδίζονται με ένα τμήμα νουκλεοτιδίων της μήτρας. Η real time PCR 43

44 πολλαπλασιάζει ή ενισχύει εκθετικά το τμήμα DNA δημιουργώντας έως και χιλιάδες αντίγραφα και δίνει την δυνατότητα παρακολούθησης της ενίσχυσης σε πραγματικό χρόνο Σε κάθε κύκλο αντιγραφής πραγματοποιείται αποδιάταξη της διπλής έλικας, υβριδισμός υποκινητών και σύνθεση νέου κλώνου από την DNA πολυμεράση. Οι διαδικασίες αυτές γίνονται με αύξηση και μείωση της θερμοκρασίας και η DNA πολυμεράση πρέπει να είναι ανθεκτική σε υψηλές θερμοκρασίες. Ακόμη σε κάθε κύκλο προσδιορίζεται η ποσότητα DNA που συντίθεται. Γι αυτόν το σκοπό, χρησιμοποιούνται μόρια που μέσω αντιδράσεων εκπέμπουν φθορίζον σήμα το οποίο ανιχνεύεται από τον θερμοκυκλοποιητή Στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκε το KAPPA SYBR FAST qpcr kit. Το kit βασίζεται στην ανίχνευση φθορισμού που προέρχεται από την SYBR Green I. Η χρωστική αυτή προσδένεται μη ειδικά στη διπλή έλικα του DNA και εκπέμπει φθορισμό, με αποτέλεσμα η ανίχνευση των νέων κλώνων γίνεται μετά το πέρας κάθε κύκλου αντιγραφής. Ως μήτρα χρησιμοποιήθηκε ολικό cdna που απομονώθηκε από κύτταρα λιπώδους ιστού και σε αυτό ενισχύθηκε τμήμα του γονιδίου csrp2 με κατάλληλους εκκινητές Υλικά και Διαλύματα Όλα τα υλικά και τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν RNAse free: MN H 2 O 2X KAPPA SYBR FAST qpcr master mix 10μM forward εκκινιτής 10μM reverse εκκινιτής Strip eppendorfs Πιπέτα 10μl Θερμοκυκλοποιητής Πειραματική διαδικασία Για κάθε αντίδραση τελικού όγκου 20μl, οι τελικές συγκεντρώσεις των επιμέρους συστατικών τους ήταν: - 30 ng cdna - forward εκκινητής 0.25μM - reverse εκκινητής 0.25μM 44

45 Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στον θερμοκυκλοποιητή σύμφωνα με το παρακάτω πρόγραμμα: 1. Ενεργοποίηση DNA πολυμεράσης 95 ο C, 10 λεπτά 2. Αποδιάταξη δίκλωνου DNA 95 ο C, 15 λεπτά 3. Υβριδοποίηση εκκινητών και σύνθεση νέου κλώνου DNA 60 ο C, 1 λεπτό Τα βήματα 2 και 3 επαναλήφθηκαν 40 φορές Αποτελέσματα 45

46 Ποσοτικοποίηση της CSRP2 σε κυτταρικό εκχύλισμα λιπώδους ιστού με ανταγωνιστική ELISA Μετρήσεις BCA για την μέθοδο ELISA Για την μέθοδο ELISA χρησιμοποιήθηκαν δείγματα περιαγγειακού λιπώδους ιστού(pvat), σπλαχνικού λιπώδους ιστού (VAT) και υποδόριου λιπώδους ιστού (SUB), από τον ίδιο ασθενή τα οποία λήφθηκαν από χειρουργεία ασθενών με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε για 10 ασθενείς. Έγινε κατάλληλη επεξεργασία κατά την οποία πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση των ιστών και λύση των κυττάρων προκειμένου να προκύψει κυτταρικό εκχύλισμα στο οποίο και έγινε ο προσδιορισμός της συνολικής πρωτεΐνης Ανάλυση ELISA Η ποσοτικοποίση που γίνεται με την μέθοδο ELISA βασίζεται στην πρότυπη καμπύλη που προκύπτει από τα standards του kit. Έγινε ανάλυση και προσδιορισμός της συγκέντρωσης CSRP2 στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό (PVAT), σπλαχνικό λιπώδη ιστό (VAT) και υποδόριο λιπώδη ιστό (SUB) για 10 ασθενείς που πάσχουν από ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής (Abdominal Aortic Aneurysm, AAA). 46

47 Διάγραμμα 1: Σύγκριση αποτελεσμάτων ELISA μεταξύ των ιστών PVAT και VAT Στο Διάγραμμα 1 γίνεται σύγκριση της συγκέντρωσης της CSRP2 μεταξύ των ιστών PVAT και VAT. Δεν συμπεριλήφθηκαν 3 ασθενείς λόγω ελλιπών τιμών. Οι γραμμές ενώνουν τους δύο τύπους ιστών του ίδιου ασθενή. Στον άξονα των y φαίνεται η συγκέντρωση της CSRP2 εκφρασμένη σε ng ανά mg συνολικής πρωτεΐνης του ιστού. Στον x άξονα παρατίθενται οι δύο τύποι ιστών των 7 ασθενών Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στο GraphPad Prism 5 th Edition και έγινε στατιστική ανάλυση t-test (non parametric test) κατά ζεύγη και η διαπίστωση ότι δεν υπάρχει στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων καθώς είναι r 2 <1 και p> Παρόλα αυτά φαίνεται μια τάση ότι η συγκέντρωση CSRP2 είναι υψηλότερη στον PVAT ιστό. 47

48 Διάγραμμα 2: Σύγκριση μετρήσεων ELISA για τους ιστούς PVAT και SUB Στο Διάγραμμα 2 γίνεται η σύγκριση μεταξύ των ιστών PVAT και SUB σε 8 δείγματα. Δεν συμπεριλήφθηκαν 2 ασθενείς λόγω ελλιπών τιμών. Και σε αυτό το διάγραμμα οι γραμμές ενώνουν τους δύο τύπους ιστών του ίδιου ασθενή. Στον άξονα των y φαίνεται η συγκέντρωση της CSRP2 εκφρασμένη σε ng ανά mg συνολικής πρωτεΐνης του ιστού. Στον x άξονα παρατίθενται οι δύο τύποι ιστών των 8 ασθενών Έπειτα από ανάλυση t-test κατά ζεύγη στο GraphPad Prism παρατηρείται ότι τα αποτελέσματα δεν έχουν στατιστική σημαντικότητα (r 2 <1 και p> 0.01) αλλά φαίνεται να υπάρχει μία τάση υψηλότερης συγκέντρωσης CSRP2 στον PVAT ιστό Ανίχνευση CSRP2 σε εκχυλίσματα λιπώδους ιστού με ανοσοαποτύπωση Western Blot Μετρήσεις BCA των δειγμάτων του Western Blot Στο πείραμα του Western Blot χρησιμοποιήθηκαν τα δείγματα περιαγγειακού λιπώδους ιστού (PVAT) και υποδόριου λιπώδους ιστού (SUB) για 1 ασθενή. Από τους ιστούς απομονώθηκε το κλάσμα SVF, το οποίο περιέχει προλιποκύτταρα, μεσενχυματικά βλαστοκύτταρα, προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα, Τ λεμφοκύτταρα, Β λεμφοκύτταρα, μαστοκύτταρα και μακροφάγα και δεν περιέχει λιποκύτταρα και συνδετικό ιστό. Έγινε 48

49 απομόνωση και λύση των παραπάνω κυττάρων προκειμένου να μετρηθεί η συνολική τους συγκέντρωση με BCA. Ακόμη μετρήθηκε και η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματος κυττάρων AoSMCs από καλλιέργεια, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός μάρτυρας διότι σε αυτά πάντα εντοπίζεται η CSRP Ανάλυση Western Blot Με τη ανάλυση Western Blot διερευνήθηκε η ύπαρξη της CSRP2 στο κλάσμα SVF των δειγμάτων PVAT και SUB του ασθενή Εικόνα 3.1: Αποτελέσματα ανάλυσης Western Blot Αρχικά έγινε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πήκτωμα πολυκαριλαμίδης με SDS με την ακόλουθη σειρά: - Well 1: περιείχε τον μάρτυρα (BenchMark Protein Ladder, INVITROGEN) - Well 2: περιείχε το κυτταρικό εκχύλισμα του δείγματος AoSMCs, - Well 4: περιείχε αραιωμένο κυτταρικό εκχύλισμα του δείγματος PVAT - Well 6: περιείχε κυτταρικό εκχύλισμα του δείγματος SUB - Well 8: περιείχε το κυτταρικό εκχύλισμα του δείγματος PVAT 49